Kurs Anaerobier / Serologie
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Kurs Anaerobier / Serologie Themen: I. Sporenbildner und Anaerobier II. Treponemen Leptospiren Borrelien Aufgabe: 1. Betrachten Sie die von Ihnen angefertigten Resistenz-Testungen aus der vorherigen Woche. Messen Sie den Durchmesser des Hemmhofes. Tragen Sie das Ergebnis in den Protokollbogen ein. Auswertung des Blättchen – Diffusionstest: gram neg. Stäbchen Staphylokokken S S R R Penicillin Vancomycin Cefazolin Cefotaxim Wirkstoff Menge Penicillin Vancomycin Cefazolin Cefotaxim ( µg ) 10 30 30 30 1 2 3 4 Hemmhof nach gram neg. Stäbchen S R > 24 <12 >12 <9 >24 <18 >30 <20 5 6 7 8 9 10 cm DIN u.a. (mm) S >29 >12 >24 >30 Staphylokokken R <28 <9 <18 <20 I. Sporenbildner & Anaerobier In diesem Praktikum sollen zwei sich überlappende Gruppen von Bakterien besprochen werden, die sog. Anaerobier (Bakterien, die nur in der Abwesenheit von Sauerstoff wachsen können) sowie die Sporenbildner, die Dauerformen ausbilden und dadurch extrem gut haltbar (oder, aus medizinisch-hygienischer Sicht, schwer zu beseitigen) sind. Die Überlappung besteht in der Gattung der Clostridien, das sind anaerobe Sporenbildner. I. Sporenbildner Sporen sind Zellformen mit extrem herabgesetztem Stoffwechsel (hypometabolische Zellformen), die sich bei manchen Bakterien, eben den sogenannten Sporenbildnern, aus der teilungsfähigen Form der Bakterienzelle (der vegetativen Form) entwickelt. Sporen sind im Vergleich zu den vegetativen Formen gegen Austrocknung, Hitze, Chemikalien und Strahlen sehr widerstandsfähig (wenn auch nur mässig resistent gegen UV-Bestrahlung). Aus hygienischer Sicht ist diese Resistenz offensichtlich bedeutsam: Methoden der Desinfektion und Sterilisation müssen diese Bakterienformen in Betracht ziehen (beispielsweise sind Alkohole, die gängigen Mittel zur Händedesinfektion, nicht ausreichend wirksam gegen Bakteriensporen). Sporen lassen sich als Dauer- und Überlebensformen der Bakterienzelle ansehen. Die Überlebensfähigkeit dieser Formen ist beachtlich; das hohe Potenzial des Bacillus anthracis, des Erregers des Milzbrands, als biologischer Kampfstoff liegt u.a. in dieser Fähigkeit begründet. Nach experimenteller Ausbringung von Milzbrandsporen ist der Boden für mehrere Jahrzehnte infektiös. Für die medizinische Mikrobiologie sind zwei Gruppen sporenbildender Bakterien bedeutsam. Beide gehören zu den grampositiven Stäbchen: Es sind einmal die als Bazillen bezeichneten aeroben Sporenbildner und zum anderen die als Clostridien bezeichneten obligat anaeroben Sporenbildner. Merke: Pilzsporen sind keine Dauerformen sondern Fortpflanzungsformen. II. Anaerobier Die unterschiedliche Fähigkeit der Bakterien, O2 als Elektronenakzeptor zu gebrauchen, dient zur Einteilung der Bakterien in: Obligat aerobe Bakterien Mikroaerophile Bakterien Obligat anaerobe Bakterien Fakultativ anaerobe Bakterien O2 ist essentiell für das Wachstum Beispiel: Pseudomonaden, Mykobakterien Wachstum nur bei reduziertem O2 Partialdruck (5% CO2) Beispiel: Gonokokken, Mycoplasmen, Campylobacter O2 ist toxisch, Wachstum nur in O2-freiem Milieu Beispiel: Clostridien, Bacteroides, Peptokokken Wachstum sowohl in Gegenwart von O2 als auch im O2freien Milieu Beispiel: Enterobacteriaceae, Streptokokken, Staphylokokken Die obligat anaeroben Keime werden aufgrund ihrer Morphologie und ihres Färbeverhaltens weiterhin eingeteilt: Vorkommen 1 obligat anaerobe grampositive sporenbildende Stäbchen - Clostridien 2 obligat anaerobe gramnegative Stäbchen - Bacteroides spp. - Fusobakterien 3 obligat anaerobe grampositive Kokken - Peptokokken - Peptostreptokokken 4 obligat anaerobe gramnegative Kokken - Veillonellen ubiquitär (Gastrointestinaltrakt) Bestandteile der physiologischen Flora (Schleimhaut, Gastrointestinaltrakt) Infektionen mit Anaerobiern (Ausnahme Clostridien) sind überwiegend endogene Misch-Infektionen (reduzierte O2-Spannung nach Trauma, Stase).( Veillonellen besitzen klinisch keine Bedeutung.) Clostridien sind für eine Reihe schwerer Krankheitsbilder Virulenzfaktoren sind Toxine, die von Clostridien gebildet werden. Erkrankung Keim - Gasbrand C. perfringens verantwortlich. C. novyi C. septicum C. histolyticum - Tetanus C. tetani - Botulismus C. botulinum - Enterale Toxininfektionen C. perfringens C. botulinum C. difficile (pseudomembranöse Kolitis) Aufgaben: 1. Betrachten Sie die Kulturen : - Bacillus cereus auf Nähagar - Clostridium perfringens - Clostridium difficile 2. Betrachten Sie den Clost – Test. 3. Fertigen Sie ein Grampräparat von Bacillus cereus an. 4. Mikroskopieren Sie die ausgeteilten Präparate: - Gasbrand – Wundabstrich - Clostridium tetani – Sporenpräparat - Clostridium difficile – subterminale Spore - Fusobakterien ( Angina Plaut – Vincent ) 5. Zur Ansicht sind in Ihrer Reihe und vorne verschiedene anaerobe Kulturverfahren ausgeteilt. Clostridium perfringens Kultur: Farbe, Form, Grösse Geruch Mikroskopie: Gramverhalten Spore: ja / nein Lage Clostridium tetani Clostridium difficile Bacillus cereus Fusobakterium Anaerobiermedien enthalten sauerstoffbindene Reduktionsmittel, wie z.B. Cystein Natriumthioglykolat, Glucose, Ascorbinsäure. Durch Autoklavieren wird den Nährmedien der gelöste Sauerstoff ausgetrieben. Da jedoch durch Diffusionsprozesse aus der Raumluft wieder ein langsamer Sauerstoffanstieg im Medium stattfindet, sollten Anaerobiermedien unter anaeroben Bedingungen gelagert werden. Anaerobe Kuturverfahren: Fortner – Platte: Auf einer Hälfte einer Nähragarplatte werden sauerstoffzehrende Bakterien ( z.B. Serratia marcescens ) ausgestrichen; auf die andere Hälfte das Untersuchungsmaterial, aus dem anaerobe Keime Atmosphäre hergestellt angezüchtet werden sollen. Danach wird der Deckel aufgelegt und die Petri – Schale mit Klebeband verschlossen. Serratia marcescens vebraucht bei ihrem raschen Wachstum den Luftsauerstoff und schafft damit die Grundlage für das Wachstum der obligat anaeroben Mikroorganismen. Anaerobiertöpfe:Hier handelt es sich meist um durchsichtige Kunststoffbehälter mit abgedichtetem Deckelaufsatz, in die jeweils eine ganze Anzahl von Plattenkulturen eingebracht werden können. In den Topf kommt ein Reduktionsmittel, dass den Luftsauerstoff bindet, sowie ein Sauerstoff – Indikatorstreifen, der kontrolliert, ob auch tatsächlich ein anaerobe Milieu wird. Clost – Test: = revers CAMP – Test Der Test beruht auf der Lyse von Erythrozyten bei gleichzeitiger Einwirkung von Faktoren, die von den Streptokokken und von dem zu untersuchenden Clostridien perfringens Stamm gebildet werden. Auf eine Columbia – Agarplatte wird mit einer sterilen Öse, strichförmig ein Streptococcus agalactiae Stamm geimpft. Senkrecht dazu wird der zu untersuchende Stamm geimpft, wobei sich die Impfstriche nicht berühren dürfen. Der Agar wird anaerob bei 36° C über Nacht bebrütet. Erscheint eine pfeilförmige Hämolysezone, mit der Pfeilspitze zum Ammenstrich weisend, so handelt es sich um C. perfringens. Für Ihre Notizen: II. Spirochäten Humanpathogen Erreger in der Familie der Spirochaetaceae: Genus Species Krankheitsbild Treponema T. pallidum subsp. pallidum venerische Syphilis subsp. endemicum endemische Syphilis subsp. per tenue Frambösie T. carateum Pinta T. vincenti Angina – Plaut - Vincent Leptospira L. interrogans M. Weil Borrelia B. recurrentis Läuserückfallfieber B. duttoni u.a. Zeckenrückfallfieber B. burgdorferi Lyme - Borreliose Aufgaben: 1. Diskutieren Sie den TPHA - Test im Team. 2. Betrachten Sie die Präparate: - Treponemen, Kabolfuchsinfärbung - Borrelia recurrentis Blutausstrich, Giemsafärbung 3. Im hinteren Laborraum ist ein Fluoreszenzmikroskop mit einem FTA - Abs - Test aufgebaut. 4. In der letzten Reihe finden Sie eine Zecke und eine Kleiderlaus im Lichtmikroskop. 5. KBR Reaktion Komplementbindungsreaktion Die Komplement-Bindungsreaktion (KBR) ist ein zweistufiges Reaktionssystem zur Bestimmung von Antigen-spezifischen Komplement-bindenden Antikörpern im Serum. In der 1. Stufe läuft die eigentliche Antigen-Antikörper-Reaktion (Ag-Ak-Reaktion) ab. Sind Antikörper vorhanden, bilden diese mit einer bekannten Menge Antigen einen AntigenAntikörper-Komplex. Liegen keine Antikörper vor, so bildet sich auch kein AntigenAntikörper-Komplex. Um den Ag-Ak-Komplex "sichtbar" zu machen, nutzt man die Eigenschaft des Komplexes aus, Komplement zu binden und zu verbrauchen. Hierzu wird dem Reaktionsgemisch eine definierte Menge Komplement zugesetzt. (Das in dem zu untersuchenden Serum vorhandene Komplement muß natürlich vorher bei 56 C inaktiviert werden). Am Ende der 1. Stufe der KBR ergeben sich nun folgende Möglichkeiten: A. Im Serum waren Ak vorhanden, es bildete sich ein Ag-Ak-Komplex, der das zugegebene Komplement gebunden und verbraucht hat. B. Im Serum waren keine Ak vorhanden, es bildete sich kein Ag-Ak-Komplex, Komplement wurde nicht gebunden und nicht verbraucht. In der 2. Stufe der KBR wird nun festgestellt, ob Komplement verbraucht wurde. Dazu verwendet man als Indikatorsystem Schafserythrozyten, die mit Antikörpern (Ambozeptor) beladen sind. Ist noch Komplement vorhanden, werden die Schafserythrozyten lysiert, die KBR ist negativ. Ist das Komplement in der 1. Stufe verbraucht worden, werden die Schafserythrozyten nicht lysiert, die KBR ist positiv. In der Serologie dient die Komplementbindungsreaktion der Bestimmung komplementbindender Ag-Ak-Komplex im Patientenserum. Bei der Untersuchung der Titer zweier Seren macht ein 4-facher Titeranstieg eine frische Infektion wahrscheinlich. KBR: pos. Kontrolle neg. Kontrolle Pat. Pat. Pat. 1 2 3 SK 1:5 1:10 1:20 1:40 1:80 1: 160 1: 320 Ak im Pat.serum? Antigen ja ja Reaktion Ergebnis [Ag + Ak] + C → [ Ery + AK] Knöpchenbildung nein ja Ag + - + C → [ Ery + Ak ] Lysis ja / nein nein - + +/- + C → [ Ery + Ak] Lysis = SK SK = Serumkontrolle: Ohne Vorlage von Antigen: es muss zur Lyse der Erythrozyten kommen. Bei Knöpfchenbildung verbrauchen AK des Patienten unspezifisch Komplement, ohne einen Komplex mit einem Antigen eingegangen zusein. weitere Antigen-Antikörper-Reaktionen Treffen ein Antigen und ein gegen dieses Antigen gerichteter Antikörper in gelöster Form aufeinander, so bildet sich ein Antigen-Antikörper-Komplex (Immunkomplexe). Die Art der dabei entstehenden Komplexe wird weitgehend durch das Verhältnis von Antigen und Antikörper bestimmt. Sind die Reaktionspartner nahezu äquimolar vorhanden, bilden sich große, netzwerkartige Komplexe, die ausfallen: Es entsteht ein vom bloßen Auge erkennbares Präzipitat. Im Gegensatz dazu bilden sich im Antigen- oder Antikörperüberschuß kleine Immunkomplexe mit nur geringer oder ohne erkennbare Präzipitatbildung. Mit der quantitativen Präzipitationsreaktion (Heidelberger, 1930) wird die Folge der Interaktion verschiedener Mengenverhältnisse von Antigen und Antikörper quantitativ erfaßt. Nur wenn Antigen und Antikörper in einem ausgewogenen Verhältnis vorliegen (Äquivalenz), führen die Bindungen zwischen Antigen und Antikörpermolekülen zu großen, netzartigen Immunkomplexen. Heidelberger Kurve: - + + - + + freies AG - - freier AK Präzipitate - Antigen Bei Ag–Unterschuss oder -Überschuss entstehen nur kleine, nicht sichtbare Präzipitate. Grössere Präzipitate entstehen erst bei äquimolaren Mengen von AG und AK. Doppeldiffussion nach Ouchterlony Prinzip: Bei dieser Methode diffundieren Antigen und Antikörper aus zwei Vertiefungen aufeinander zu. In der Äquivalenzzone kommt es zur Präzipitation des Antigens durch den Antikörpekomplexr. Die Methode dient zur Charakterisierung von Antigenen (bei gegebenen Antikörpern) oder von Antikörpern (bei gegebenem Antigen). Man weist eine Identität, Nicht-Identität oder Teil-Identität der Antigene bzw. Antikörper nach. Immundiffusion nach Mancini: = radiale Immundiffusion in Antiseren-haltigen (monospezifischen) Agar- oder Agarosegelen. 1964 von Mancini et al. beschrieben und zur quantitativen Bestimmung von Serumproteinen angewandt. Die quantitativ eingefüllte Ag–Probe diffundiert radial aus einer Vertiefung in eine gleichmässig dicke, monospezifisches Antiserum enthaltende Agar- oder Agarosegelschicht unter Bildung kreisförmiger Präzipitationshöfe. Zwischen der von Präzipitat bedeckten Fläche und der Ag–Konzentration besteht eine lineare Beziehung; gemessen wird der Durchmesser des Präzipitationshofes. Durch Mitführen von Proben mit bekannten Ag– Konzentrationen ( Standard ), kann eine Eichkurve angefertigt werden, aus der sich die Antigenkonzentration der unbekannten Probe ablesen lässt. Immunelektrophorese Die Immunelektrophorese dient zur Diagnostik von z.B. der Agammaglobulinämie oder der monoklonalen Gammopathie. Prinzip: Die Immunelektrophorese ist ein zweidimensionales Verfahren. Im ersten Schritt werden Serumproteine in einem Agarosegel entsprechend ihrer Eigenladung elektrophoretisch getrennt. Im zweiten Schritt diffundiert in vertikaler Richtung dazu ein Antiserum, das korrespondierende Antikörper gegen diejenigen Proteine enthält, die dargestellt werden sollen. Wo Proteine auf gegen sie gerichtete Antikörper treffen, bilden sich Präzipitationslinien. Formen sich bei Darstellung der Immunglobuline Präzipitationslinien gleichmässiger Krümmung, so ist das ein Zeichen der homogenen Antikörperverteilung innerhalb der IgKlasse. Liegt vermehrt Immunglobulin einer Klasse und eines Types vor, also eine monoklonale Gammopathie, so bildet sich eine Verformung der Präzipitationslinie in Richtung des Antiserums aus. Sie ist kennzeichnend für monoklonale Gammopathien. TPHA - Test = Treponema pallidum - Häm – Agglutinationstest Vorbereitung und Arbeitsmaterial: 1. Antigen: Schaferythrozyten werden mit Formalin und Tannin - Gerbsäure behandelt. Dies bewirkt eine Aufrauhung der Erythrozytenoberfläche und somit Freilegung von Bindungsstellen. An diese Rezeptoren werden jetzt Antigene angelagert, den Nichols - Stamm. Dies ist ein hochspezifisches Antigen, aus dem Hoden infizierter Kanninchen gewonnen. Diese sensibilisierten Schaferythrozyten bilden die Grundlage des TPHA - Test. 2. Serum: Unverdünntes Patientenserum wird 30 Minuten bei 56° C inaktiviert. 3. Zur Verdünnung wird ein Absorptionsmedium eingesetzt, der den Reiterstamm enthält. Dies ist kein echter Treponemen - Stamm. Er entfernt unspezifische Antikörper, die sich gegen alle Treponemen richten. Weiterhin enthält es Zellmembran von Schaferythrozyten, um heterophile Antikörper zu absorbieren, die in fast jedem Patientenserum sind. 4. Negativ Kontrolle: nicht sensibilisierte Schaferythrozyten Bei Bildung einer Zellmatte, hat der Patient immer noch heterophile Antikörper. 5. Positiv Kontrolle: reaktives Kontrollserum Reaktionsablauf: Sind im Patientenserum Antikörper gegen Treponema pallidum, agglutinieren diese die Schaferythrozyten. Es bildet sich eine Zellmatte. Wenn keine Antikörper im Serum vorhanden sind, sedimentieren die Erythrozyten zu einem Knöpfchen. Der TPHA gilt als Suchtest in der Syphilis Diagnostik. Er kann als qualitativer und quantitativer Test in Verdünnungsstufen durchgeführt werden. Er weist IgG und IgM nach, kann jedoch nicht zwischen IgG und IgM unterscheiden. 2 - 3 Wochen nach Primärinfekt ist der TPHA - Test positiv. Ein Titer ab 1: 80 gilt als positiv. Aufgrund des echtem Treponemen Stamm ist der Test hoch spezifisch. Syphyilis, Frambösie und Pinta sind serologisch nicht unterscheidbar. +K -K 1 2 3 1:40 NS 1:80 S 1:160 S S = sensibilisierte Erythrozyten NS = nicht sensibilisierte Erythrozyten Direkte und indirekte Immunfluoreszenz Hierbei werden Antigen - Antikörper - Reaktionen dadurch sichtbar gemacht, dass einer der Reaktionspartner mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert ist. Das meist benutzte Fluorochrom heisst Fluorescein ( FITC ). Die Reaktion ist im UV – Mikroskop beurteilbar. Trift weisses kurzwelliges energiereichesn Licht von Halogen- oder Quecksilberlampen auf diese Fluorochrome, nehmen sie Energie auf und strahlen sie in Form von langwelligem grünen Licht wieder ab. Die direkte Immunfluoreszenz dient zum direkten Nachweis von Bakterien, Viren, Parasiten im Untersuchungsmaterial. Durchführung: Untersuchungsmaterial wird auf einen Objektträger fixiert ( Hitze, Trocknung, chemisch ) . Anschliessend wird der fluoreszenzmarkierte Antikörper, der gegen das gesuchte Antigen gerichtet ist, auf die Auftragsstelle gegeben. Nach einem Waschprozess legt man den Objektträger unter ein UV - Mikroskop. Im positiven Falle sind die gesuchten Antigene durch den Antikörper markiert und erscheine leuchtend grün. Entsteht keine Fluoreszenz, sind die Antikörper nicht spezifisch gewesen und ausgewaschen worden. Mit der indirekten Methode weist man Antikörper nach. Dazu gehört der FTA Abs. Test. FTA Abs. Test: Fluoreszenz - Treponema - Antikörper Absorptiosnstest. Bestätigungstest, wenn TPHA positiv oder zweifelhaft positiv ausfällt. Er ist spezifischer und empfindlicher als der TPHA -Test: Vorbereitung: Absorptionsschritt:Kreuzreagierende Antikörper im Patientenserum werden mit apathogenen ( Reiter- ) Spirochäten absorbiert. Das Patientenserum wird in einer Verdünnungsreihe auf einen Objektträger gebracht, der mit abgetöteten pathogenen Treponemen beladen ist. Reaktionsablauf: Positive Reaktion: Ak im Patientenserum binden an die Treponemen und lassen sich dann nicht mehr durch Waschen entfernen. Negative Reaktionen: AK im Patientenserum erkennen die Treponemen nicht und lassen sich abwaschen. Detektionstreaktion: Es soll nachgewiesen werden, ob die Treponemen auf dem Objektträger mit Antikörpern beladen sind. Dazu werden AK verwendet, die gegen humane Immunglobuline gerichtet sind, und mit einem fluoreszierenden Farbstoff gekoppelt sind. Werden Treponemen markiert, leuchten diese im fluoreszierenden Licht auf. Bei einem unklaren Reaktionsausfall wird ein Western - Blot angeschlossen. Enzymimmunoassay Eine Reaktionakomponente ist mit einem Enzym markiert, welches nach Ablauf der immunologischen Reaktionen mit einem geeigneten Substrat zusammen gebracht wird. Die durch das Enzym hervorgerufene Umsetzng des Substrates ist proportional zur Enzymmenge sowie zur Reaktionszeit. Die enzymisch entstandenen Produkte können mittels Spektrometrie gemessen werden. ELISA = enzyme linked immunosorbent assay: Mit der ELISA – Technik kann man sowohl die Konzentration von Antikörpern als auch von Antigenen quantitativ erfassen. Dazu gibt es verschiedene Methoden: Antigen – Nachweis: Bei der Sandwich _Methode werden spezifische Antikörper als feste Phase in Mikrotiterplatten, Reagenzgläser oder an Kunststoffkugeln gebunden. Dieser festen Phase wird das Untersuchungsmaterial zugegeben. Sind die gesuchten Antigene vorhanden, so binden sie sich an die Antikörper der Festphase ( z.B. am Boden einer Mikrotiterplatte ). Nach einem Waschvorgang ( Entfernung des Untersuchungsmateriales aus dem Näpfchen ) werden enzymmarkierte Antikörper hinzugefügt ( Konjugat ), die gegen das gleiche Antigen gerichtet sind wie die Festphasenantikörper und die sich nun an die vorhandenen Antikörper - Antigen - Komplexe binden. Nach einem zweiten Waschvorgang ( Entfernung des überschüssigen Konjugats ) wird ein Substrat zugegeben, das von den konjugierten Enzymen abgebaut werden kann. Der enzymatische Abbau des Substrates wird nach einer festgelegten Zeit durch Zugabe einer Säure oder Lauge gestoppt. Die entstandenen farbigen Produkte können photometrisch gemessen werden; die Farbintensität entspricht dem Antigengehalt. Bei der kompetitiven Methode wird die Lösung mit dem nachzuweisenden Antigen vor dem Test mit einer standardisierten Menge an gleichen, aber enzymmarkierten Antigenen gemischt. Markierte und nichtmarkierte Antigen konkurrieren um die Bindungsstellen der Antikörper an der festen Phase. Das Verhältnis von markierten zu nichtmarkierten ( also nachzuweisenden ) Antigenen in der Lösung gleicht dem Verhältnis von markierten und nichtmarkierten Antigenen, die später an der festen Phase gebunden sind. Werden mehr unmarkiete Antigene gebunden, so wird weniger Substrat abgebaut ( geringe Farbbildung ). Je grösser die Antigenkonzentration der zu untersuchenden Probe ist, desto geringer ist also die Farbintensität. Zum Antikörpernachweis mittels ELISA wird die indirekte Methode angewendet. Hier besteht die feste Phase aus dem Antigen. Nach Zufügen der fraglichen antikörperhaltigen Lösung werden - vergleichbar dem IIFT - enzymmarkiertes AHG zugegeben. „ Medizinische Mikrobiologie für MTA „ V. Mersch - Sundermann RIA = Radioimmunoassay Beim Radioimmunoassay werden Antikörper oder Antigene durch das homologe Antigen bzw. den homologen Antikörper nachgewiesen, wobei jeweils einer der Reaktionspartner mit einem radioaktiven Isotop ( z.B. 125 J ) markiert ist. Nach Bindung des markierten Antigens bzw. Antikörpers mit dem homologen, an der Festphase gebundenen Reaktionspartner und Entfernung der Radioaktivität im Reaktionsüberstand durch Waschvorgänge, wird die Radioaktivität an der Festphase mit einem Strahlenmessgerät gemessen . Für Ihre Notizen:
