DNA Replikation, Rekombination und Reparatur

Zusammenfassung Biochemie, Kapitel 27
DNA Replikation, Rekombination und Reparatur
1953 veröffentlichten J. Watson und F. Crick das Strukturmodel der DNA. Sie fanden
heraus, dass die DNA in einer rechtsdrehenden Doppelhelix vorliegt. Gleichzeitig
erkannten sie, dass auf Grund der Struktur ein logischer Replikationsmechanismus
vorhanden sein musste.
Wie können DNA Stränge verdoppelt werden? Eine Übersicht:
1) Da die beiden DNA Stränge aufgrund der H-Brücken sehr gut
zusammenhalten, braucht es einen Mechanismus, der die Stränge in einer
bestimmten Region auseinandertrennt. Die Helikase (Enzym) übernimmt
diesen Schritt. Sie benützt freie Energie aus der ATP-Hydrolyse, um an der
Doppelhelix entlang zu wandern und die Stränge zu teilen.
2) Die DNA Helix muss entwunden werden, um in zwei Stränge geteilt werden zu
können. Durch lokale Entwindung, entsteht eine Spannung. Spezielle
Enzyme, die Topoisomerasen führen Supercoils ein, welche die Trennung in
zwei Stränge erleichtern.
3) Die DNA Replikation ist sehr wichtig. Deshalb dürfen möglichst keine Fehler
unterlaufen. Diese wären nämlich fatal. Es braucht folglich auch einen
Korrekturmechanismus, um Fehler zu minimieren.
4) Die DNA Replikation muss schnell ablaufen.
5) Polymerasen (Enzyme, welche komplementäre Basen anlagern), können
DNA nur in 5’ -> 3’ Richtung synthetisieren. Somit muss ein Strang
diskontinuierlich erstellt werden. Zusätzlich braucht es ein kurzes RNA
Stück, um den Start festzulegen (dies übernimmt die Primase, ein Enzym das
den Primer synthetisiert) und einen „genetischen Kleber“ (Ligase) um die
einzelnen Stücke zusammenzufügen.
6) An den Enden einer linearen DNA findet man spezielle Strukturen, die
Telomere. Diese garantieren, dass bei der Replikation keine Stücke verloren
gehen.
7) Um eine optimale Anpassung an die Umwelt zu erreichen, ist es nötig, dass
DNA neu rekombiniert wird. Spezifische Enzyme, die Rekombinasen
erleichtern diesen Prozess.
8) Nach der Replikation ist es möglich, dass die DNA Schäden trägt, welche
ausgelöst werden durch ultraviolettes Licht oder chemische Stoffe (Krebs!).
Alle Organismen haben jedoch Enzyme, die solche Mängel entdecken und
auch reparieren können.
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Aufbau der DNA:
1) DNA besteht aus zwei polynucleotid Ketten, welche gegenläufig sind (5’-> 3’
und 3’ -> 5’). Zusammen formen sie eine rechtshändige Doppelhelix (Bild s.S.
122)
2) Purin (A, G)und Pyrimidin (C, T) Basen befinden sich im Innern der Helix.
Phosphat und Deoxyribose Einheiten bilden aussen das Rückgrat.
3) In der DNA paaren sich A und T (verbunden durch 2 H-Brücken), sowie C und
G (verbunden durch 3 H-Brücken) (Chargaff Regel).
Die DNA Struktur ist variabel:
3 verschiedene Konformationen sind bekannt:
1) B-DNA
2) A-DNA
4) Z-DNA
B-DNA:
- ist die biologisch häufigste Form
- B-Form ist wie auch die A-Form eine rechtsdrehende Doppelhelix, deren beiden
Stränge durch die Basenpaarung zusammengehalten werden
- die glykosidischen Bindungen der C1’ Atome in der Deoxyribose haben eine
übereinstimmende Lage. Dadurch sind die Basenpaare etwa 36 Grad
gegeneinander versetzt (Propeller twist)
- das C2’ Atom liegt ausserhalb der Ebene (C2’-endo).(Unterschied zu A-Form)
- in der Struktur der DNA unterscheidet man zwischen grosser und kleiner Furche
(major and minor groove). Diese entstehen, da sich die glykosidischen Bindungen
der Basenpaare nicht genau diametrisch gegenüber liegen. Somit entstehen eine
grössere und eine kleinere Region
- in der grossen Furche gibt es nun mehr Möglichkeiten für Interaktionen mit
Proteinen, welche spezifische DNA Sequenzen erkennen können
A-DNA:
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- Dehydrierung begünstigt die A-Form der DNA, da in dieser Konformation die
Phosphatgruppe weniger Wasser bindet
- A-DNA ist ebenfalls eine rechtsdrehende Doppelhelix (wie B-Form) mit zwei
antiparallelen Strängen
- das C3’ Atom liegt ausserhalb der Ebene (C3’-endo). Dies hat zur Folge, dass
die Phosphatgruppen näher beieinander liegen, als bei der B-Form
- die A-Form ist im vergleich zur B-Form breiter, aber dafür auch kürzer
- die Basenpaare der A-DNA sind um 19 Grad zur Helixachse gegenüber der
Senkrechten geneigt
Z-DNA:
- treten in GC reichen Teilsequenzen innerhalb von B-DNA auf
- die Doppelhelix ist linksgängig
- das Rückgrat der Z-DNA hat eine charakteristische Zickzack Form
- DNA Abschnitte in der Z- Konformation haben wahrscheinlich physiologische
Bedeutung, Details sind aber noch nicht bekannt.
(Zur Übersicht der 3 Konformationen siehe BC S.750 Table 27.1)
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Replikation:
Helikase:
Um eine DNA Doppelhelix zu replizieren, muss sie zuerst in die Teilstränge
zerlegt werden. Nur so können beide Stränge als Templates dienen. Solche
spontanen Strang-Separationen sind relativ selten. Deshalb gibt es spezifische
Enzyme, die Helikasen, welche die Energie von ATP nützen um die Stränge
auseinander zunehmen.
Der detaillierte Mechanismus der menschlichen Helikase ist noch nicht ganz
bekannt, jedoch konnte die bakterielle Helikase (PcrA) weitgehend erforscht
werden. PcrA besteht aus vier Domänen (A1, A2, B1, B2) und teilt die Stränge in
3’ -> 5’ Richtung auf::
- Die Untereinheit A1 enthält ein „P-loop NTPase fold“, welcher an der Bindung
und Hydrolyse von ATP beteiligt ist.
- Die Untereinheit B1 ist homolog zu A1, enthält jedoch keine P-loop.
- A2 und B2 haben genau den gleichen Aufbau.
(Siehe BC S.753 Figure 27.16)
A1 und B1 können DNA Einzelstränge binden. Wenn ATP fehlt, sind sie an die
DNA gebunden. Lagert sich ATP an, löst dies eine konformelle Änderung der Ploop und denn danebenliegenden Regionen aus. Darauf folgt, dass sich die A1
Untereinheit löst und an der DNA entlang gleitet. Somit nähert sich A1 der B1
Domäne. ATP wird nun hydrolysiert in ADP und Orthophosphat. Dies hat zur
Folge, dass sich wieder ein Spalt zwischen den Untereinheiten bildet. Da aber A1
den besseren Griff hat, wird der DNA Strang durch die B1 Domäne Richtung A1
gestossen. So wird also die DNA in Teilstränge zerlegt.
(Siehe BC S. 753 Figure 27.17)
DNA Supercoils:
Wenn die DNA lokal entwunden wird, hat dies entweder eine Überwindung oder
ein Supercoiling der umliegenden Regionen zur Folge. Um die
Überwindungsspannung zu umgehen, sind spezielle Enzyme vorhanden, welche
DNA Supercoils einführen.
Wichtige topologische Daten der zirkulären DNA sind:
- linking number (Lk): Verwindungszahl der DNA Einzelstränge. Moleküle, die sich
nur in der Lk unterscheiden sind Topoisomere. Topoisomere von DNA können nur
ineinander umgewandelt werden, indem man einen oder beide DNA Stränge
durchschneidet und sie dann wieder zusammensetzt.
- twist (Tw): Anzahl der Helikalen Windungen der DNA Stränge umeinander
- writhe (Wr): Anzahl der Supercoilings (negativ = rechtsdrehend, positiv =
linksdrehend)
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Zusammenhang zwischen diesen Grössen:
Lk = Tw + Wr
Moleküle, welche sich nicht in Lk unterscheiden, können ohne Durchschneidung
eines Stranges ineinander übergeführt werden.
Eine DNA mit Supercoils ist kompakter als eine ungespannte DNA derselben
Länge. Also kondensieren Supercoils die DNA. Viele natürlich vorkommende
DNA’s sind negativ supercoiled. Dies, da es durch das negative Supercoiling
einfacher ist, die Stränge zu entwinden. Positives Supercoiling kondensiert die
DNA effektiv, was die Separation der Stränge schwieriger gestaltet.
Topoisomerase 1:
Diese Enzyme verändern die Linking Number der DNA, um sie während der
Auftrennung in zwei Stränge zu entspannen. Dies tun sie in drei Schritten:
1. Aufschneiden eines DNA Einzelstränges
2. Durchziehen des anderen Stranges durch diese Lücke
3. Wiederzusammenfügen der DNA Bruchstücke
Topo 1 katalysiert also die Relaxation der supercoiled DNA. Dies ist ein
energetisch günstiger Prozess, welcher keine Energie verbraucht!
(Siehe BC S. 757 Figure 27.22)
Die Menschliche Topo 1 besteht aus vier Untereinheiten, welche sich um einen
zentralen Hohlraum anordnen. Dieser besitzt einen Durchmesser von ca. 20 A,
was exakt genügend Platz für eine doppelsträngige DNA bietet.
In diesem Hohlraum befindet sich ein Tyrosinresiduum (siehe BC S.757). Dessen
–OH Gruppe greift die Phosphatgruppe des einen DNA Rückgrades an und formt
dann eine Phosphodiesterbindung zwischen dem Enzym und der DNA. Dies hat
zur Folge, dass die DNA aufgeschnitten wird und eine freie 5’ Hydoxylgruppe
entsteht. Nun rotiert die DNA, kontrolliert vom Enzym, um den anderen Strang.
Dies ist möglich, da Energie frei wird, welche beim Supercoiling gespeichert
wurde.
Durch diese Rotation entwindet sich das Supercoiling.
Darauf greift die Hydroxylgruppe das Phosphotyrosin an und das Tyrosin wird
wieder freigelassen.
Schlussendlich liegt die DNA also ungespannt vor.
Topoisomerase 2 (Gyrase):
Typ 2 Topoisomerasen katalysiert das Supercoiling. Um dies durchführen zu
können, wird Energie von ATP benötigt.
Topo 2 ist ein Dimer und hat die Form eines Herzen. Es besitzt wie Topo 1 einen
grossen Hohlraum in der Mitte (siehe BC S. 758 Figure 27.23).
Die Reaktion beginnt mit der Bindung einer Doppelhelix. Beide Stränge befinden
sich in der Nähe eines Tyrosinresiduums. Diesen ist es möglich eine kovalente
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Bindung mit dem DNA Rückgrat zu formen (G Segment). Dieser Komplex bindet
dann schwach eine zweite Doppelhelix (T Segment). Beide Monomere besitzen
Domänen, welche ATP binden können. Dies löst dann konformelle Änderungen
aus und hat zur Folge, dass die beiden Monomere näher zusammen kommen.
Geschieht dies, wird das T Segment in der Mitte gefangen genommen. Die
konformelle Änderung bewirkt gleichzeitig auch die Separation und
Aufschneidung beider Stränge des G Segments.
Jeder Strang bindet sich nun durch eine tyrosin-phosphodiester Bindung an das
Enzym. Das T Segment passiert dann das gespaltene G Segment und gelangt in
den zentralen Hohlraum. Von dort aus gelangt es wieder aus dem Enzym. ADP
und Pi wird freigesetzt und die ATP Bindungsdomänen gehen wieder
auseinander. Nun kann der ganze Prozess wieder von vorne beginnen.
Gesamthaft gesehen senkt Topo 2 die Lk um 2.
Die Mengen an Topo 1 und Topo 2 werden reguliert, um einen angemessenen
Grad an negativen Supercoilings zu erhalten.
DNA Polymerasen brauchen eine Vorlage und einen Primer:
DNA Polymerasen katalysieren die Formation einer Polynukleotidkette. Diese
Reaktion kann aber nur stattfinden, wenn eine DNA Vorlage (Template) existiert.
Jedes Nukleosid - Triphosphat formt zuerst ein Basenpaar mit der Base auf dem
Template. Erst dann verknüpft die Polymerase die einkommende Base mit der
Vorgängerbase zu einer Kette.
DNA Polymerasen sind also Template abhängige Enzyme.
DNA-Poly. hängt Nukleotide an die 3’ Enden von Polynukleotidketten. Um dies zu
können, braucht es einen Primer mit einer freien 3’-Hydroxylgruppe, welcher
bereits komplementär ist zum Template. DNA-Poly. kann also nicht einfach so
Nukleotide an einen freien DNA Einzelstrang anheften.
Wir unterscheiden zwei verschiedene Arten von Polymerasen:
Poly. I:
Schneidet den Primer aus und lagert die fehlenden Nukleotide dieser
Sequenz wieder an. Zudem besitz Poly. I eine Korrekturuntereinheit.
Poly. III: Lagert die Nukleotide an den Primer an. Diese Poly. ist viel schneller
und effektiver als Poly. I.
Aufbau einer Polymerase:
Alle Polymerasen haben etwa den gleichen Grundaufbau. Die dreidimensionale
Struktur gleicht einer rechten Hand. Wobei die Untereinheiten der Polymerase die
Finger symbolisieren (siehe BC S.750 Figure 27.11). Mit diesen „Fingern“ kann
sich die Polymerase um die DNA winden und so besser agieren.
Um die Aktivität zu garantieren, braucht die Polymerase 2 Metall Ionen im aktiven
Zentrum (Mg 2+). Ein Metall Ion bindet beide, das Deoxynukleotid - Triphosphat
(dNTP) und die 3’Hydroxyl-Gruppe des Primers, während das andere Metall Ion
nur mit der 3’Hydroxyl –Gruppe koordiniert.
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Die Phosphat Gruppe des Nucleosid-Triphosphats bildet die Brücke zwischen den
beiden Metallionen. Die Hydroxyl-Gruppe des Primers attackiert die PhosphatGruppe um eine neue O-P Bindung zu formen.
(genauer: BC S. 751 Abs. 27.2.2)
DNA muss mit grosser Genauigkeit repliziert werden. Die Paarung von G-C und
A-T wird dadurch erreicht, dass in dieser Anordnung die besten Interaktionen
erreicht werden können. Dies ist aber nicht der einzige Mechanismus, um eine
korrekte Replikation zu garantieren. Zwei weitere, jedoch komplizierte, existieren
(BC S. 751f).
Viele Poly. haben zusätzlich noch einen Kontrollmechanismus. Dies minimiert
Fehler in der Replikation. So besitzt z.B. DNA Poly. I eine ExonukleaseUntereinheit, welche nicht direkt am Replikationsvorgang beteiligt ist.
Diese Untereinheit ist dazu da, falsche Nukleotide vom 3’ Ende der DNA zu
entfernen. Dies geschieht durch Hydrolyse.
Die Exonuklease Untereinheit befindet sich etwa 35 A weg vom aktiven Zentrum
der Polymerase. Wird nun ein falsches Nukleotid eingebaut, erhöht sich die
Möglichkeit, dass dieses Nukleotid aus dem aktiven Zentrum der Poly. rutscht und
so in die Exonuklease Untereinheit gelangt.
Wie weiss nun die Poly. ob ein falsches Nukleotid eingebaut wurde?
1) Falls ein falsches Nukleotid eingebaut worden ist, stimmt die Chargaff Regel
nicht mehr. Die H-Brücken sind nicht ideal ausgebaut. Dies hat eine weniger
starke Bindung der Basen zur Folge.
2) Durch ein falsches Nukleotid, ist die Wechselwirkung mit der Minor groove
nicht mehr optimal.
Dieser Korrekturmechanismus verringert Fehler um den Faktor 1000.
(Siehe BC S. 752 Figure 27.15)
DNA Polymerase III:
Um ein gesamtes Genom zu replizieren braucht es schnelle, korrekt arbeitende
Enzyme. Eines davon ist die DNA Poly. III. Dieses Enzym ist verantwortlich für die
Anlagerung der Nukleotide.
Der Trick der Poly. III ist, dass sie das Substrat gebunden hält und
währenddessen mehrere Reaktionen damit durchführt. Anders gesagt hält die
DNA Poly. den Template fest, bis das ganze Teilstück repliziert wurde. So kann
sie bis zu 1000 Nukleotide pro Sekunde anlagern und verliert keine Zeit um
immer wieder an den Template zu binden.
Aufbau DNA Polymerase III:
Um diese Funktion auszuführen braucht das Enzym eine spezielle 3 dimensionale
Form. DNA Poly. III besteht aus 10 verschiedenen Polypeptidketten, und hat eine
Masse von etwa 900 Kd. Der Aufbau ist asymmetrisch, da ja der Leit- und
Folgestrang nicht identisch repliziert werden (Aufbau siehe BC S.763 Figure
27.30, Funktion der Untereinheiten siehe Skript Gruissem DNA Replikation S. 6)).
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Damit die DNA Poly. III aber beide Stränge gleichzeitig replizieren kann, bildet der
Folgestrang eine Schleife. So wird ebenfalls eine 5’ -> 3’ Richtung erreicht. Nach
etwa 1000 Nukleotiden wird der Folgestrang losgelassen und eine neue Schleife
wird gebildet. Nun kann die DNA Poly III beim neuen Primer fortfahren.
Primase:
Auch mit vorhandenem Template ist es der DNA Poly. noch nicht möglich, einen
neuen Strang zu synthetisieren. Ein Primer ist nötig. Dies ist ein kurzes RNA
Stück (etwa 5 Nukleotide), welches von der Primase erzeugt wird (Primosom).
Dieses Stück ist komplementär zum Template. So entsteht ein Anfang (freie
3’Hydroxyl-Gruppe), welche jetzt von DNA Poly. zu einer Kette verlängert werden
kann.
Der Primer bleibt aber nicht erhalten. Er wird von der DNA Poly. I hydrolysiert und
wird später durch DNA ersetzt.
Beide Stränge der DNA dienen als Templates für die Synthese neuer DNA. Da
aber die Polymerase DNA nur in 5’ -> 3’ Richtung synthetisieren kann, können
nicht beide Stränge kontinuierlich aufgebaut werden. Im Folgenden unterscheiden
wir also zwischen Leitstrang und Folgestrang. Der Leitstrang wird kontinuierlich,
der Folgestrang diskontinuierlich synthetisiert.
Replikationsgabel:
Auf dem Folgestrang mussen also mehrere Primer synthetisiert werden. Diese
werden dann von der DNA Poly. III verlängert, bis wieder ein nächster Primer
folgt. Solch ein Stück nennt man Okazaki Fragment. Es besteht zirka aus 1000
Nukleotiden. Später wird der Primer abgebaut (DNA Poly I), durch neue DNA
ersetzt (DNA Poly. II). Die „Schnittstellen“ werden durch die DNA Ligase
verbunden. Somit scheint auch der Folgestrang in dieselbe Richtung synthetisiert
zu werden wie der Leitstrang.
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Telomerase:
Da die menschliche DNA linear vorliegt, ergeben sich einige Probleme bei der
Replikation. Es ist z.B. nicht einfach, die Enden der DNA (Telomere) vollständig
zu replizieren, da die Polymerase ja nur in 5’ -> 3’ Richtung arbeiten kann. Der
Folgestrang würde folglich ein inkomplettes 5’ Ende haben, nachdem der Primer
entfernt wurde. So wäre dieser Strang von Replikation zu Replikation kürzer.
Telomerische DNA besteht aus hunderten sich wiederholenden hexanukleotiden
Sequenzen. Ein Strang ist am 3’ Ende G- reich (AGGGTT) und ein wenig länger
als der andere Strang.
Eine Idee der Wissenschaftler war nun, dass die Telomere eine Art Schleife
bilden, welche durch Telomerbindungsproteine geformt und stabilisiert wird. Solch
eine Struktur würde die Chromosomenenden schön schützen und abdecken.
Wie werden nun die Telomere repliziert? Dies übernehmen die Telomerasen. Sie
besitzen eine zur telomerischen DNA homologe RNA Untereinheit. Diese kann an
die DNA binden und so eine Verlängerung der Telomer- Sequenzeinheit am 3’
Ende der DNA bewirken. Diese verlängerten 3’ Enden können nachher von DNA
Poly. repliziert werden.
(siehe BC S. 766 Figure 27.36)
(Siehe auch www.uni-stuttgart.de/bio/zoologie/telomerase7.htm)
DNA Ligase:
Dieses Enzym katalysiert die Formation einer Phosphodiesterbindung zwischen
der 3’Hydroxyl-Gruppe am Ende der DNA Kette und der 5’Phosphat-Gruppe am
Ende einer anderen Kette.
Um dies durchführen zu können wird Energie benötigt. In Eukaryoten und
Archaea ist dies ATP, in Bakterien NAD+.
(genaue Reaktion BC S. 761f)
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Gesamtablauf der Replikation:
Der Leit- und Folgestrang werden gleichzeitig repliziert. Die Doppelhelix wird
zuerst aufgewunden. Dies übernimmt eine ATP getriebene Helikase.
Einzelstrang-Bindungsproteine lagern sich an den einzelnen Strängen an, um ein
erneutes binden zu verhindern. Nun kann die DNA Poly. III den Primer, welcher
von der Primase hergestellt wurde, verlängern. Das Template wird nicht
losgelassen, bis die Replikation abgeschlossen ist. Topoisomerase II (DNA
Gyrase) führt rechtsdrehende (negative) Supercoils ein, um zu verhindern, dass
eine grosse Spannung eintritt. Da der Folgestrang diskontinuierlich synthetisiert
wird, sind mehrere Primer nötig. Diese werden dann alle zu Okazakifragmenten
verlängert. Die DNA Poly. I schneidet nachher alle Primer aus und lagert die
Nukleotide an. DNA Ligase verbindet die einzelnen Fragmente zu einer ganzen
Kette.
Eukaryoten – Prokaryoten:
Grundsätzlich verläuft die Replikation bei Eu- und Prokaryoten gleich. Es gibt
trotzdem ein paar Änderungen:
- die Länge der DNA ist bei den Eukaryoten viel grösser
- die Information ist auf mehrere Chromosomen verteilt
- die DNA liegt linear vor und nicht als zirkuläre Einheit
Um die DNA trotzdem relativ schnell zu replizieren, findet man bei den
Eukaryoten mehrere Ori’s (origin of replication). Der Ori ist ein ganz bestimmer
Ort auf der DNA, welcher anzeigt, wo die Replikation gestartet wird und wo dann
schlussendlich die Primase den Primer synthetisieren kann. Jeder Ori
repräsentiert also eine eigene Replikationseinheit (genannt Replicon).
Die DNA Sequenz des Oris ist eine „autonomously replicating sequenz“ (ARS)
und ist besonders AT-reich. Diese ARS ist eine Andockstation für den ORC
(origin of replication complex). ORC rekrutiert andere Proteine um den
Prereplikationskomplex zu bilden. Mehrere dieser rekrutierten Proteine nennt man
„licensing factors“, weil sie die Bildung des Initiationskomplexes fördern. Sie
garantieren auch, dass jedes Replicon genau einmal repliziert wird.
(mehr zu den licensing factors siehe BC S. 764f)
Beim Menschen findet man nun ca. 30'000 Ori’s, welche je ca. 30-300 kbp
auseinander liegen.
Dies hat zur Folge, dass die Replikation an mehreren Stellen gleichzeitig
voranschreitet und so natürlich beschleunigt werden kann.
Um sicher zu gehen, dass schlussendlich die ganze DNA repliziert wird, ist dieser
Vorgang an den Zellzyklus (siehe BC S. 764 Figure 27.34) gekoppelt. Dieser
enthält mehrere Checkpoints, welche passiert werden müssen. Ist die DNA also
noch nicht vollständig repliziert, schreitet der Zyklus nicht fort.
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Rekombination:
Wo ist die DNA Rekombination eine wichtige Funktion? (siehe Gruissem Skript
DNA Reparatur und Rekombination S. 10)
Rekomination ist am effizientesten zwischen DNA Molekülen, welche die gleiche
Sequenz tragen (homologe Rekombination).
Rekombinasen katalysieren den Austausch des genetischen Materials in der
Rekombination.
Eine Schlüsselrolle in diesem Mechanismus nehmen die Holliday junctions ein,
welche aus vier Polynukleotidketten geformt werden. Solche Junctions können
sich aber nur formen, wenn die Nukleotidsequenzen in der Region der
Rekombination sehr ähnlich oder identisch sind auf den beiden Doppelsträngen.
Dies ist so, da sich Basenpaare bilden müssen zwischen den beiden parentalen
Doppelsträngen.
Mechanismus: (siehe BC. S. 767 Figure 27.38, 27.39)
Zuerst lagern sich 4 Cre-Rekombinasen an die DNA’s an. So formt sich eine
Rekombinase Synapse.
Die Reaktion beginnt, indem je ein Strang der Doppelhelix aufgeschnitten wird.
Die 5’ Hydroxylgruppen bleiben frei, während die 3’ Phosphorylgruppen sich an
ein spezifisches Tyrosinresiduum in der Rekombinase binden. Die freien 5’ Enden
attackieren die DNA-Tyrosin Einheit der anderen Doppelhelix und formen so eine
neue Phosphodiesterbindung. Das Tyrosinresiduum kommt so wieder frei. Das
Resultat dieses Prozesses ist die Holliday junction. Nun isomerisiert das Ganze
und der Ablauf wird wiederholt. Das Resultat ist dann eine Synapse, welche die
beiden rekombinierten Doppelhelices enthält. Durch Dissoziation dieser
Komplexe entstehen die fertig rekombinierten Produkte.
Mutationen:
1) Substitution (ein Basenpaar wird durch ein anderes ausgetauscht)
2) Deletion (ein oder mehrere Basenpaare gehen verloren)
3) Insertion (ein oder mehrere Basenpaare werden eingefügt)
Punktmutationen:
Zwei Arten von Substitution sind bekannt :
- Transition
A-T
T-A
G-C
C-G
Pyrimidin wird durch Pyrimidin ausgetauscht (Analog mit Purin)
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Basen Analoga (z.B. 5-Bromouracil, 2-Aminopurine) können in die DNA eingebaut
werden. 5-Bromuracil, welches analog zu Thymin ist, würde eigentlich mit Adenin
paaren. Tatsächlich paart es sich aber mit Guanin und wird in Form des Enol
Tautomers sogar noch mit grösserer Wahrscheinlichkeit eingebaut, als Thymin.
Dies, da das Brom Atom des 5-Bromouracil elektronegativer ist als die
Methylgruppe des Thymins (siehe BC S 769 Figure 27.42)
T-A wird also zu C-G.
Andere Mutagene wirken, indem sie die Basen chemisch verändern. Dies ist bei
HNO2 der Fall. Adenin wird zu Hypoxanthin umgewandelt und paart sich folglich
nicht mehr mit Thymin, sondern mit Cytosin.
A-T wird also zu G-C
- Transversion
A-T
T-A
C-G
G-C
Purin wird durch Pyrimidin ausgetauscht (oder umgekehrt)
Watson und Crick erkannten bereits das Problem der Transversion. Sie erklärten
dies so, dass es möglich ist für die Basen, Tautomere auszubilden. So entstehen
folglich aus:
Amino -> Imino
Keto -> Enol.
Die Tautomere können trotzdem H-Brücken ausbilden (nicht genau so wie in der
Normalform), welche auch genau in die Doppelhelix hineinpassen. So würde sich
ein A* mit einem C paaren anstelle eines T’s. Durch die Replikation wird dieser
Fehler nun an die Tochter DNA weitergegeben, falls er nicht korrigiert wird.
Rastermutationen:
Flache aromatische Moleküle (Acridines) lagern sich zwischen den Basen ein.
Dies hat zur Folge, dass ein weiteres Basenpaar eingefügt wird, oder ein Paar
verloren geht. Logischerweise wird durch diese Veränderung das Leseraster der
Translation verschoben. Dies hat krasse Auswirkungen auf den ganzen
Organismus.
Ultraviolettes Licht kann ebenfalls mutationsfördernd wirken. Durch die Strahlung
werden kovalente Bindungen ausgebildet zwischen benachbarten
Pyrimidinresiduen. Solch ein Pyrimidindimer passt nun nicht mehr in die
Doppelhelix und dadurch wird die Replikation und Genexpression blockiert, bis
die Verknüpfung abgebaut wird.
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Reparaturmechanismen der DNA:
3 verschiedene Mechanismen sind bekannt:
- Base-excision repair: die kaputte Base wird herausgeschnitten und ersetzt.
- Repair: Die kaputte Base wird direkt repariert.
-Nucleotide-excision repair: die gesamte Region um die kaputte Base herum wird
herausgeschnitten und ersetzt.
(Wichtig: Beispiele dazu siehe BC S. 770 Punkt 27.6.3)
Einbau von Uracil in die DNA anstelle von Thymin:
Uracil kommt normalerweise nur in der RNA vor und besitzt am C-5 ein H Atom.
Thymin dagegen ist Bestandteil der DNA und trägt eine Mehtylgruppe. Beide
Basen paaren sich mit Adenin.
Cytosin kann nun spontan deaminieren, was zur Folge hat, dass anstelle eines
C’s ein U in der DNA vorkommt. Die Tochterstränge würden dann nicht ein C-G
Basenpaar enthalten, sondern ein U-A. Diese Mutation wird aber vom
Reparatursystem der DNA erkannt (siehe BC S. 772 Figure 27.50). Uracil-DNAGlykosylase erkennt die U’s in der DNA und schneidet sie aus. T-haltige
Nukleotide werden in Ruhe gelassen. Diese garantieren nämlich die Genauigkeit
der genetischen Nachricht. Im Unterschied dazu wird RNA nicht repariert und
Uracil wird benutzt, weil dies ein weniger „teurer“ Baustein ist.
Krebs wird häufig durch Mutationen ausgelöst, weil dort die Wachstumsgene
mutiert werden. So teilen sich die Zellen unkontrolliert und wuchern aus.
Defekte im Reparatursystem der DNA steigern die Frequenz von Mutationen und
somit auch die Wahrscheinlichkeit von Krebs.
Ames Test:
Mutierte Salmonella Bakterien werden in einer Petrischale gezüchtet. Diese
Bakterien sind nicht mehr in der Lage Histidin zu produzieren und können folglich
auch nicht wachsen. Nun wird ein chemisches Mutagen in die Mitte der Platte
gegeben. Dies hat zur Folge, dass einige Bakterien mutieren und wieder in der
Lage sind, Histidin zu produzieren. Somit werden sich diskrete Bakterienkolonien
bilden. Die Grösse dieser Kolonien sagt nun etwas darüber aus, wie mutagen
eine Substanz ist.
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