Protokoll

ADH-Kinetik
Protokoll
Melanie Thompson
Inhalt
I.
Einleitung ............................................................................................................. 2
II. Material und Methoden ........................................................................................ 8
III.
Ergebnisse ...................................................................................................... 10
1. Versuch A - Basistest ......................................................................................... 10
2. Versuch B - Substrat-/Coenzymspezifität........................................................... 15
3. Versuch C - km-Wert Bestimmung für Ethanol und NAD+ .................................. 21
4. Versuch D - Reversible/irreversible Hemmung .................................................. 34
5. Versuch E - Bestimmung des Hemmtyps von verschiedenen Hemmstoffen ..... 37
6. Versuch F - Bestimmung der ADH-Aktivität in zellfreien Extrakten .................... 45
IV.
Diskussion ...................................................................................................... 48
1. Versuch A - Basistest ......................................................................................... 48
2. Versuch B - Substrat-/Coenzymspezifität........................................................... 50
3. Versuch C - km-Wert Bestimmung für Ethanol und NAD+.................................. 52
4. Versuch D - Reversible/irreversible Hemmung .................................................. 54
5. Versuch E - Bestimmung des Hemmtyps von verschiedenen Hemmstoffen ..... 55
6. Versuch F - Bestimmung der ADH-Aktivität in zellfreien Extrakten .................... 56
V. Quellen............................................................................................................... 58
1
I. Einleitung
Chemische Reaktionen verlaufen, so sie exergon1 sind, von den Reaktionspartnern
auf einem energetischen Gefälle zu den Produkten. Es muss keine zusätzliche
Energie investiert werden, weshalb exergone Reaktionen auch selbstständig
ablaufen. Der Ablauf einer solchen Reaktion ist jedoch nicht zwangsläufig schnell, da
zwischen den Edukten und den Produkten meist eine energetische Barriere, die sog.
Aktivierungsenergie liegt (Abb. 1).
Die
Aktivierungsbarriere
beschreibt
einen
Übergangszustand zwischen Ausgangssubstanz
und Produkt, bei dem bestehende Bindungen der
Reaktionspartner gelockert und neue geknüpft
werden
müssen.
Die
Überwindung
dieser
energetischen Hürde vollzieht sich von selbst nur
Abbildung 1: Darstellung des energetischen
Verlaufes einer Reaktion, der "Berg"
markiert die sog. Aktivierungsbarriere
relativ langsam, kann jedoch durch Katalysatoren
beschleunigt werden. Als sog. Biokatalysatoren
wirken
Enzyme.
Mit
Ausnahme
weniger
katalytischer RNA-Moleküle sind Enzyme zum großen Teil Proteine bestehend aus
Aminosäuren. Sie sind in der Lage durch herabsetzen der Aktivierungsenergie
chemische Reaktionen zu beschleunigen ohne selbst dabei verbraucht zu werden.
Das
Absenken
der
Aktivierungsenergie
erfolgt,
indem
das
Enzym
die
Reaktionspartner dicht beieinander in seinem aktiven Zentrum bindet und durch
Ausrichtung selbiger die Reaktion begünstigt. Dieser Zusammenschluss wird als
Enzym-Substrat-Komplex bezeichnet und bildet den ersten reversiblen, relativ
schnellen Schritt. Die räumliche Nähe kombiniert mit der spezifischen Ausrichtung
der
Reaktionspartner
erhöht
die
Wahrscheinlichkeit,
dass
die
beiden
zusammentreffen und das Produkt bilden. Der Enzym-Substrat-Komplex zerfällt in
einem zweiten reversiblen, langsameren Schritt in das freie Enzym und das
1
Reaktionen, die spontan ablaufen, werden als exergon bezeichnet, hierbei nimmt die freie Enthalpie
G ab. Diese stehen im Gegensatz zu endergonen Reaktionen, hierbei findet ein energetischer
Anstieg von Edukten zu Produkten statt, es muss demnach Energie eingesetzt werden, damit diese
Reaktionen ablaufen können.
2
Reaktionsprodukt. Enzymatische Reaktionen können folgendermaßen dargestellt
werden:
E = Enzym; S = Substrat; P = Produkt
Hierbei stehen die freien Enzym- sowie Substratmoleküle im Gleichgewicht mit dem
Enzym-Substrat-Komplex sowie den freien Enzym- und Produktmolekülen. Wichtig
hierbei zu beachten ist, dass Enzyme nicht das Gleichgewicht der katalysierten
Reaktion beeinflussen, sondern ihren Ablauf beschleunigen, indem sie
Reaktionswege niedrigerer Aktivierungsenergie ermöglichen. Da der zweite Schritt,
der Zerfall des Enzym-Substrat-Komplexes in freies Enzym und Produkt, der
langsamere ist, wird er als geschwindigkeitsbegrenzender Schritt angesehen. Die
Geschwindigkeit einer Enzym-katalysierten Reaktion ist weiterhin durch die
Substratkonzentration beeinflussbar. Dies lässt sich ganz einfach nachvollziehen, bei
Betrachtung des Reaktionsablaufs: Der Zerfall des Enzym-Substrat-Komplexes ist
der geschwindigkeitsbestimmende Schritt. Logisch folgert sich hieraus, dass die
Geschwindigkeit einer Reaktion umso größer ist, je mehr Enzym-Substrat-Komplexe
vorhanden sind, die anschließend zerfallen um erneut freies Enzym für weitere
Substratmoleküle frei zu geben. Um das Gleichgewicht in Richtung der EnzymSubstrat-Komplexe zu verschieben ist es bei konstanter Enzymmenge nötig die
Substratkonzentration zu erhöhen, da sich hierdurch gleichfalls die
Wahrscheinlichkeit des Zusammentreffens von freiem Enzym und Substrat und damit
die Bildung des Enzym-Substrat-Komplexes erhöht. Die maximale Geschwindigkeit
der katalysierten Reaktion (Vmax) ist dann erreicht, wenn praktisch alle
Enzymmoleküle als Enzym-Substrat-Komplexe vorliegen und damit die
Konzentration an freiem Enzym verschwindend gering ist. Da hier eine weitere
Erhöhung der Substratkonzentration keinen Einfluss auf die
Reaktionsgeschwindigkeit nehmen würde (weil bereits nahezu 100% des Enzyms als
Enzym-Substrat-Komplex vorliegt) wird dieser Zustand als Substratsättigung
bezeichnet. Um den Sättigungsbereich eines Enzyms und damit die maximale
Reaktionsgeschwindigkeit zu bestimmen wird die Reaktionsgeschwindigkeit der
3
enzymatischen Reaktion bei
verschiedenen
Substratkonzentrationen ermittelt (Abb.
2).
Die ermittelten
Reaktionsgeschwindigkeiten bei
verschiedenen
Substratkonzentrationen wären dann
Punkte auf dieser annähernd rechtwinkligen Hyperbel (Abb. 2). Das Plateau zeigt
hierbei den Bereich der Sättigung, in dem die Reaktionsgeschwindigkeit nicht mehr
nennenswert steigt. Vmax beschreibt die maximale Reaktionsgeschwindigkeit und km
die Substratkonzentration, bei der halbmaximale Geschwindigkeit (also ½ Vmax)
erreicht wird.
Abbildung 2: Darstellung nach Michaelis-Menten
Diese für ein Enzym charakteristischen
Parameter lassen sich nicht nur graphisch, sondern auch mathematisch anhand der
Michaelis-Menten-Gleichung herleiten:
Diese stellt gleichzeitig die Geschwindigkeitsgleichung einer enzymatischen Reaktion
mit nur einem Substrat dar. Ist die Reaktionsgeschwindigkeit (V0) genau die Hälfte
der Maximalgeschwindigkeit (Vmax), so ergibt sich daraus folgender Spezialfall:
4
Damit ist km definiert als die Substratkonzentration, bei der die
Reaktionsgeschwindigkeit V0 der halben maximalen Geschwindigkeit Vmax/2
entspricht.
Es gibt verschiedene Abwandlungen der Michaelis-Menten-Gleichung, genannt sein
hier nur die zwei wichtigsten: Lineweaver-Burk und Hanes.
Bei der Darstellung nach Lineweaver-Burk handelt es sich um eine Inversion beider
Seiten der Michaelis-Menten-Gleichung, vereinfacht zu:
Graphisch entspricht dies der doppelt-reziproken
Form von Michaelis-Menten, also: 1/V0 gegen
1/[S] (Abb. 3).
Die Gerade hat die Steigung km/Vmax, den Achsenabschnitt 1/Vmax auf der y-Achse
sowie -1/km auf der x-Achse.
Abbildung 3: Darstellung nach LineweaverBurk
Die Darstellung nach Hanes ist eine weitere
Abwandlung der Michaelis-Menten-Darstellung. Hierbei wird [S]/V als Funktion von
[S] angegeben. Die Gleichung für das Hanes-Diagramm ergibt sich aus der
Multiplikation der reziproken Michaelis-Menten-Gleichung mit der
Substratkonzentration zu:
5
Graphisch wird [S]/V0 gegen [S]
aufgetragen (Abb. 4):
Die Gerade hat die Steigung 1/V0, sie schneidet die x-Achse bei 1/km und die yAchse bei km/V0.
Abbildung 4: Darstellung nach Hanes
Charakteristisch für ein Enzym sind neben den Parametern Vmax und km auch so
Dinge wie die Substratspezifität. Ein Enzym bindet ein Substrat in seinem aktiven
Zentrum. Die Oberfläche des aktiven Zentrums ist mit Aminosäureresten
ausgekleidet, die die Bindung zum Substrat vermitteln und dessen chemische
Umwandlung katalysieren. Die Substratspezifität eines Enzyms gibt nun darüber
Auskunft, ob es in der Lage ist mehr als nur ein spezifisches Substrat zu binden und
dessen chemische Umwandlung zu charakterisieren. Über die Substratspezifität
lassen sich so Aussagen über den Aufbau der Bindetasche des Enzyms treffen.
Viele Enzyme brauchen „Hilfsmittel“ um die für sie charakteristischen Reaktionen zu
katalysieren. Dies können entweder freie Cofaktoren (wie NAD+/NADH) sein oder
aber kovalent gebundene prosthetische Gruppen (wie das Häm, ein Porphyrinring mit
einem Eisen-Ion als Zentralatom). Das Enzym ohne Cofaktor wird hierbei als
Apoenzym, das mit Cofaktor als Holoenzym bezeichnet. Welche Cofaktoren ein
Enzym nutzen kann, und wie Spezifisch diese Interaktion ist, gibt ebenfalls Auskunft
über die Beschaffenheit des Enzyms.
Die Aktivität von Enzymen lässt sich durch bestimmte Substanzen, sog. Inhibitoren,
hemmen. Ein Enzym kann auf zwei Arten gehemmt werden: reversibel oder
irreversibel. Ein irreversibler Inhibitor bindet oder zerstört die funktionelle Gruppe
eines Enzyms. Typischerweise ist diese Bindung zwischen Enzym und irreversiblem
Inhibitor kovalent, gelegentlich kann auch eine sehr stabile, nicht-kovalente
6
Verknüpfung vorliegen. Unter den reversiblen
Inhibitoren gibt es drei Klassen: kompetitive,
unkompetitive und nicht-kompetitive/gemischte
Inhibitoren. Ein kompetitiver Inhibitor konkurriert mit
dem Substrat um das aktive Zentrum des Enzyms.
Der Inhibitor bindet (meist aufgrund seiner
Ähnlichkeit zum Substrat) an das aktive Zentrum
des Enzyms und bildet mit ihm einen sog. EnzymInhibitor-Komplex, der nicht zur Katalyse der
Ausgangsreaktion führt. Da es sich bei dieser
Abbildung 5: Kompetitive Hemmung
Hemmung jedoch um eine Konkurrenz zwischen
Substrat und Inhibitor handelt, kann der Wettbewerb um das Enzym zugunsten des
Substrates entschieden werden, wenn seine Konzentration angehoben wird. Dies
erhöht die Wahrscheinlichkeit das Enzym und Substrat aufeinander treffen statt
Enzym und Inhibitor. Charakteristisch für die kompetitive Hemmung sind das
Gleichbleiben von Vmax und der Anstieg von km (Abb. 5).
Bei der unkompetitiven Hemmung bindet der Inhibitor
nicht an das aktive Zentrum des Enzyms, sondern an
den bereits entstandenen Enzym-Substrat-Komplex.
Dadurch wird weniger Substrat benötigt um alle EnzymSubstrat-Komplexe zu vervollständigen.
Charakteristisch für die unkompetitive Hemmung ist das
Absinken von Vmax und km um den gleichen Faktor.
(Abb. 6)
Abbildung 6: Unkompetitive Hemmung
Bei der nicht-kompetitiven oder gemischten
Hemmung bindet der Inhibitor zum einen das
freie Enzym (jedoch nicht am aktiven Zentrum)
und zum anderen den Enzym-Substrat-Komplex.
Charakteristisch für diesen Hemmtyp sind das
Absinken von Vmax (vergl. unkompetitive
7
Abbildung 7: Gemischte Hemmung
Hemmung) sowie das Ansteigen von km (vergl. kompetitive Hemmung) (Abb. 7).
In diesem Versuch wurde das Enzym Alkohol-Dehydrogenase (ADH) aus
Saccharomyces cerevisiae untersucht. Die ADH katalysiert die Oxidation von Ethanol
durch NAD+ (Abb. 8).
Abbildung 8: Enzymatische Reaktion der Alkohol-Dehydrogenase
Das Absorptionsmaximum des hier entstehenden NADH liegt bei ca. 366 nm. Auf
diesem Weg kann die enzymatische Reaktion bzw. die Produkt-Entstehung und
damit die Substrat-Abnahme photometrisch verfolgt werden. Anhand der ADH sollen
die enzymatischen Parameter Vmax und km, sowie die Substrat- und
Coenzymspezifität überprüft werden. Durch Einsatz verschiedener Inhibitoren soll
zum einen die irreversible und die reversible bzw. hier genauer die kompetitive,
unkompetitive bzw. nicht-kompetitive/gemischte Hemmung gezeigt werden. Die ADH
in S. cerevisiae liegt nicht als alleiniges Enzym, sondern in drei Isoformen: ADH1,
ADH2 sowie ADH3 vor. Anhand verschiedener Mutanten soll die Aufgabenteilung
bzw. die jeweiligen Eigenschaften und Aktivitäten der einzelnen Isoformen bestimmt
werden.
II. Material und Methoden
Die hier betrachtete enzymatische Reaktion ist die Oxidation von Ethanol durch die
Alkohol-Dehydrogenase mit Hilfe von NAD+.
8
Abbildung 9: Reaktion der Alkohol-Dehydrogenase
Das Gleichgewicht dieser Reaktion liegt unter natürlichen Bedingungen auf Seiten
des Ethanols. Damit diese enzymatische Reaktion in vitro genauso ablaufen kann
wie in situ bedarf es den gleichen zellulär vorkommenden Reaktionskomponenten,
diese sind: Ethanol als Substrat, NAD+ als Coenzym sowie die ADH selbst. Für die
Stabilität der ADH unter in vitro Bedingungen wird dem Reaktionsansatz GSH
hinzugefügt, was das Enzym vor freien Radikalen schützen soll. Der verwendete
Puffer enthält u.a. Semicarbazid, dieses sorgt dafür, dass das aus dem Ethanol
gebildete Acetaldehyd aus dem Gleichgewicht der Reaktion entfernt wird, und sich
dieses somit auf die rechte Seite verschiebt. Ferner sorgt der basische pH-Wert des
Puffers auch für den Abzug der Protonen aus dem Gleichgewicht. Ein Ansatz aus
diesen Komponenten bildete den sog. Basistest, dieser setzte sich wie folgt
zusammen:
Tabelle 1: Zusammensetzung des Basistest, dieser wurde im Laufe der Versuche vielfach variiert, jedoch nie
grundlegend verändert
Menge [µl] Komponente
480
Puffer
200
H2O
40
GSH
40
NAD+
200
Alkohol
40
ADH
Der Basistest wurde im Laufe der Versuchsreihe in seinen Bestandteilen vielfach
variiert. Der Start der enzymatischen Reaktion erfolgte durch die Zugabe von NAD+;
der Reaktionsverlauf fand bei 30°C statt, wobei die Extinktion des entstehenden
NADH bei 366 nm verfolgt wurde. Jede Messung fand in Doppelbestimmung statt
9
und wurde gegen einen Leerwert mit den gleichen Komponenten, abgesehen der
ADH (wurde ersetzt durch Wasser), genullt.
III.
Ergebnisse
1. Versuch A - Basistest
Der erste Teil der Versuchsreihe beinhaltete die Ermittlung der geeigneten
Enzymverdünnung der käuflich erworbenen ADH. Hierzu wurde der Basistest (Tab.
1) mit unterschiedlichen Verdünnungen der ADH mehrfach durchgeführt. Ziel war es,
eine gut auswertbare Verdünnung zu ermitteln, deren Extinktionsänderung pro
Minute zwischen 0,05 und 0,1 liegt und über einen Zeitraum von mindestens zwei
Minuten linear verläuft. Die gestellte ADH-Stammlösung wies bereits eine
Verdünnung von 1:50 auf und wurde anschließend weiter verdünnt.
Zunächst wurde die ADH-Stammlösung (1:50) einer weiteren 1:4 Verdünnung
unterzogen, sodass es sich anschließend um eine 1:200 verdünnte ADHStammlösung handelte. 40 µl dieser Stammlösung gingen in den Basistest ein, was
einer weiteren Verdünnung von 1:25 entspricht. Effektiv handelte es sich also im Test
um eine 1:5000 verdünnte ADH. Der Ablauf der Reaktion stellte sich photometrisch
wie folgt dar:
10
Abbildung 10: Reaktionsablauf der ADH-Reaktion mit 1:5000 fach verdünnter ADH
Eine geeignete Enzymverdünnung ist dann erreicht, wenn der lineare Bereich über
einen Zeitraum von zwei Minuten konstant gehalten wird. Damit war eine 1:5000
Verdünnung der ADH nicht ausreichend (Abb. 10) und weitere Verdünnungen
mussten erfolgen. Daraufhin wurden Verdünnungen der Stammlösung von 1:200
bzw. 1:400 auf ihre Aktivität hin untersucht, dies entspricht einer effektiven ADHVerdünnung im Test von 1:10000 bzw. 1:20000. Aufgrund technischer
Schwierigkeiten können die Graphen dieser Messungen nicht wiedergegeben
werden. Dennoch kann die Extinktionsänderung bzw. die Produkt-Zunahme pro
Minute und die daraus berechneten Enzymparameter Auskunft über hinlängliche
Verdünnung geben:
Tabelle 2: Ermittlung einer ausreichenden Verdünnung der ADH
ΔE/min
Substratkonz.
Enzym-
100mM
Verd.
1.Messung
1:5000
---
2.Messung
1:10000
3.Messung
1:20000
R2
Stand.ab-
Mittelwert
Va
Spez.Akt.
weichung
ΔE/min
[µmol/min·ml]
[µmol/min·mg]
---
---
---
---
---
0,1379
1
0,0001
0,138
10454,55
285,6
0,1381
1
0,0001
0,0692
1
0,0001
0,0685
10378,79
283,54
0,0678
1
0,0001
Zu erkennen ist, dass erst eine Verdünnung von 1:20000 eine Steigung im
angestrebten Bereich von 0,05 - 0,1 aufwies (Tab. 2). Die Volumenaktivität dieses
Ansatzes betrug 10378,79 µmol/min∙ml und die spezifische Aktivität 283,54
µmol/min∙mg Protein.
11
Des Weiteren wurden Kontrollen durchgeführt um zum einen zu überprüfen, ob das
im Enzymtest verwendete Substrat/Coenzym in sättigender Konzentration vorliegt,
und zum anderen um zu kontrollieren, ob die verwendete Enzymlösung frei von
Substrat/Coenzym ist. Im ersten Fall wurde die doppelte Menge Substrat (also 400 µl
Ethanol) bzw. die 2,5fache Menge an Coenzym (also 100 µl NAD+) eingesetzt, im
zweiten Fall wurde jeweils ein Ansatz ohne Substrat bzw. ohne Coenzym hergestellt
(die fehlende Menge wurde mit Wasser aufgefüllt). Auch hier kann aufgrund
technischer Probleme nur ein Teil der Graphen exemplarisch gezeigt werden:
Abbildung 11: Enzymatische Reaktion der ADH mit Substrat im Überschuss
Abbildung 12: Enzymatische Reaktion der ADH mit Coenzym im Überschuss
12
Anhand der Extinktionsänderung pro Minute kann auch hier erneut Auskunft über die
enzymatische Reaktion gegeben werden:
Tabelle 3: Enzymatische Aktivitäten der Kontrollen
Substratkonz.
Enzym-
100mM
Verd.
1.Kontrolle
1:20000
ohne Substrat
2.Kontrolle
1:20000
ohne Coenzym
Doppelte
1:20000
Substratmenge
ΔE/min
R2
Stand.ab-
Mittelwert
Va
Spez.Akt.
weichung
ΔE/min
[µmol/min·ml]
[µmol/min·mg]
0,00015
22,73
0,621
0,0001
15,15
0,414
0,06935
10507,58
287,05
0,07245
10977,27
299,89
0,0001
0,5656
0
0,0002
0,9357
0
0
0,0177
0
0,0001
0,3367
0
0,0702
0,9996
0,0002
0,0685
0,9995
0,0003
0,074
0,9999
0,0002
0,0709
0,9998
0,0002
400µl
Coenzym im
1:20000
Überschuss
100µl
Die Auswertung der Kontrollen zeigt, dass die Kontrollen ohne Substrat bzw. ohne
Coenzym eine sehr niedrige Volumen- als auch spezifische Aktivität zeigen. Die
Extinktionsänderung bewegte sich in einem Rahmen von 0 - 0,0002 E/min. Bei der
Kontrolle mit Substrat im Überschuss ist, im Vergleich zum Basistest gleicher
Enzymverdünnung (Tab. 2) zu erkennen, dass die Extinktionsänderung pro Zeit
unwesentlich zugenommen hat (von 0,0685 E/min [Tab. 2] auf 0,06935 E/min
[Tab. 3]). Die Kontrolle mit Coenzym im Überschuss zeigt eine etwas deutlichere
Zunahme der Extinktionsänderung im Vergleich zum Basistest gleicher
Enzymverdünnung (von 0,0685 E/min [Tab. 2] auf 0,07245 E/min [Tab. 3]). Durch
die Zunahme der Extinktionsänderung nahm auch die Volumen- bzw. spezifische
Aktivität bei der Kontrolle mit doppelter Substratmenge unwesentlich, bei der
Kontrolle mit 2,5facher Coenzymmenge deutlich zu (Vergl. Tab. 2 und Tab. 3).
Die Berechnung der Volumen- bzw. spezifischen Aktivität erfolgte anhand des
Lambert-Beer’schen Gesetzes:
VA = Volumenaktivität
13
E/t = Extinktionsänderung pro Zeit [1/min]
V = Volumen des gesamten Ansatzes (1000 µl)
Verdünnungsfaktor = Verdünnung der ADH
 = Extinktionskoeffizient von NADH bei 366 nm: 3300 1/M·cm
d = Schichtdicke der Küvette (1cm)
v = Volumen der Probe
Anhand des Basistests mit einer ADH-Verdünnung von 1:20000 sei diese Rechnung
exemplarisch gezeigt:
Folgende Umformungen müssen vorgenommen werden um auf die Einheit
µmol/min∙ml zu gelangen:
Die spezifische Aktivität berechnet sich anschließend anhand dieser Formel:
Die Proteinkonzentration der ADH wurde vom Hersteller mit 29,41 mg/ml angegeben.
Anhand des Mikrobiuret-Assays wurde dieser Wert mit der 1:50 verdünnten ADHStammlösung jedoch erneut bestimmt.
14
Tabelle 4: Mikrobiuret-Assay der 1:50 verdünnten ADH-Stammlösung
E1
E
E2
Verdünnung
Proteinkonzentration
[mg/ml]
0,751914
0,712335
0,7321245
1:50
36,606
Die anhand des Mikrobiuret-Assays ermittelte Proteinkonzentration von 36,606
mg/ml weicht deutlich von der durch den Hersteller angegebenen
Proteinkonzentration von 29,41 mg/ml ab. Für alle weiteren Berechnungen wurde die
hier ermittelte Proteinkonzentration angenommen.
Damit berechnet sich die spezifische Aktivität des Basistest mit einer 1:20000 fach
verdünnten ADH wie folgt:
Die im Basistest ermittelte spezifische Aktivität beträgt somit 283,54 µmol/min·mg.
2. Versuch B - Substrat-/Coenzymspezifität
Der zweite Teil des Versuches drehte sich um die Substrat- bzw. Coenzymspezifität
der Alkohol-Dehydrogenase. Hierzu wurde der oben beschriebene Basistest mit
verschiedenen Substraten bzw. mit einem weiteren Coenzym durchgeführt.
Zunächst kamen verschiedene Alkohole zum Einsatz. Als Referenz diente Ethanol
und wurde deshalb bei der Aktivitätsbestimmung mit 100 % festgelegt. Folgende
Alkohole wurden verwendet:
Tabelle 5: Zusammenfassung der alternativ angebotenen Alkohole
Substrat
MW [g/mol]
Dichte[g/ml]
Reinheit[%]
Molarität[mol/l]
Löslichkeit in H2O
Methanol
32,04
0,786
99,9
24,5
Gut mischbar
Ethanol
46,07
0,7894
99,8
17,14
Gut mischbar
1-Propanol
60,1
0,8035
99
13,37
Gut mischbar
2-Propanol
60,1
0,785
99,9
13,06
Gut mischbar
15
1-Butanol
74,12
0,81
99
10,93
90g/l
2-Butanol
74,12
0,8027
99,5
10,83
125g/l
1-Pentanol
88,15
0,811
98
9,2
21,9g/l
1-Hexanol
102,18
0,814
98
7,97
7,06g/l
Ethanolamin
61,08
1,02
98
16,7
Gut mischbar
Ethylenglykol
62,07
1,11
99,5
17,88
Gut mischbar
Hydroxessigsäure
76,05
1,25
98
16,44
Gut mischbar
Der Vergleich der Löslichkeiten dieser Alkohole lässt ermessen, ob sie in 100 mM
Konzentration in den Test eingebracht werden können (Tab. 5). Dies ist für alle bis
auf zwei der verwendeten Alkohole der Fall: 1-Pentanol sowie 1-Hexanol können
nicht in 100 mM Konzentration verwendet werden. Die Berechnung war folgende: Die
Löslichkeit des z.B. von 1-Pentanol wurde durch das Molekulargewicht geteilt:
Für 1-Pentanol kann damit maximal eine Lösung mit der Molarität 248,4 mM erzeugt
werden. Für 1-Hexanol wurde die gleiche Rechnung angewandt, hierbei kann
maximal eine 68 mM Lösung erstellt werden. Sollte die Konzentration im Test 100
mM betragen, wäre es nötig eine 500 mM Stammlösung zu erzeugen, da das
Substrat beim Einbringen in den Test 1:5 verdünnt wird (200 µl Alkohol auf 1000 µl
Gesamtansatz). Bei 1-Pentanol bzw. 1-Hexanol ist dies jedoch nicht möglich,
weshalb sich für niedermolekulare Stammlösungen entschieden wurde. Für 1Pentanol wurde eine 200 mM Stammlösung verwendet, sodass die Konzentration im
Test an 1-Pentanol 40 mM betrug. Für 1-Hexanol kam eine 50 mM Stammlösung
zum Einsatz, sodass die minimale Konzentration von 10 mM im Test erreicht wurde.
Da Ethanol als Referenz gesetzt werden sollte, müssen Vergleichswerte in derselben
Molarität (also 40 mM und 10 mM) mitgeführt werden. Für 1-Pentanol wurde
gleichzeitig die Enzymverdünnung geändert, diese betrug nun 1:25000. Die
enzymatischen Tests wurden erneut am Photometer durchgeführt. Exemplarisch
seien hier einige Beobachtungen gezeigt:
16
Abbildung 13: Substratspezifität - Referenz Ethanol 100 mM
Die höchste Aktivität zeigte erwartungsgemäß Ethanol in einer Konzentration von
100 mM. Gleichzeitig diente dieser Wert als Referenz für alle Alkohole, die in der
Konzentration 100 mM im Test eingesetzt wurden, und wurde als 100 % Aktivität
gesetzt.
Abbildung 14: Substratspezifität - 1-Propanol 100 mM
17
Die zweit-höchste Aktivität nach Ethanol zeigte 1-Propanol. Zu erkennen ist, dass die
Produktzunahme nach gleicher Zeit (ca. 6 Minuten) etwas weniger als halb so groß
war. Die relative Reaktionsgeschwindigkeit lag bei 41,1 %.
Abbildung 15: Substratspezifität - Hydroxyessigsäure 100 mM
Die zweit-schwächste Aktivität aller verwendeter Substrate zeigte Hydroxyessigsäure
(schwächste Aktivität durch Methanol gezeigt, dieser Graph kann jedoch aufgrund
technischer Probleme nicht wiedergegeben werden). Es ist rein optisch keine
Produktzunahme zu verzeichnen. Die relative Reaktionsgeschwindigkeit betrug 0,43
%.
Die Messungen erfolgten für alle Substrate in gleicher Weise. Die Berechnung der
Volumen- bzw. spezifischen Aktivität erfolgte erneut anhand des Lambert-Beer’schen
Gesetzes. Folgende Geschwindigkeiten konnten für die einzelnen Substrate
gemessen werden:
18
Tabelle 6: Überprüfung der Substratspezifität der Alkohol-Dehydrogenase anhand verschiedener Substrate
Substrat
Konz.
ΔE/min
R2
[mM]
Methanol
Ethanol
Ethanol
Ethanol
1-Propanol
2-Propanol
1-Butanol
2-Butanol
1-Pentanol
1-Hexanol
Ethanolamin
Ethylenglykol
Hydroxyessigsäure
100
100
40
10
100
100
100
100
40
10
100
100
100
Stand.-
Ø
Verd.
Va
Spez. A.
Relative
abw.
ΔE/min
Enzym
[µmol/minml]
[µmol/minmg]
Rkt.geschw.
0,0003
1:20000
45,45
1,242
0,36%
0,08235
1:20000
12477,27
340,86
100%
0,0558
1:25000
10568,18
288,71
100%
0,04655
1:20000
7053,03
192,68
100%
0,03385
1:20000
5128,79
140,11
41,1%
0,00335
1:20000
507,58
13,87
4,1%
0,02005
1:20000
3037,88
82,99
24,35%
0,00105
1:20000
159,1
4,35
1,28%
0,0045
1:25000
852,27
23,28
8,06%
0,0032
1:20000
484,85
13,25
6,88%
0,00105
1:20000
159,1
4,35
1,28%
0,00095
1:20000
143,94
3,93
1,15%
0,00035
1:20000
53,03
1,45
0,43%
0,0003
0,8187
0
0,0003
0,8924
0
0,0841
1
0,0001
0,0806
0,9999
0,0001
0,0563
0,9999
0,0001
0,0553
0,9999
0,0001
0,0486
0,9999
0,0001
0,0445
0,9999
0,0001
0,0342
0,9999
0,0001
0,0335
0,9999
0,0001
0,0033
0,9873
0,0001
0,0034
0,9792
0,0001
0,0202
0,9998
0
0,0199
0,9998
0,0001
0,0011
0,9641
0
0,0010
0,9794
0
0,0046
0,9950
0,0001
0,0044
0,9969
0
0,0031
0,9987
0
0,0033
0,9994
0
0,0011
0,9704
0
0,0010
0,98
0
0,0009
0,9875
0
0,0010
09933
0
0,0004
0,8408
0
0,0003
0,5304
0
Zu erkennen ist, dass keines der alternativen Substrate eine ähnlich hohe
Reaktionsgeschwindigkeit aufweist wie das native Substrat Ethanol (Tab. 6). Nach
Ethanol sind mögliche nutzbare Substrate für die Alkohol-Dehydrogenase, die eine
einigermaßen sichtbare Aktivität aufweisen 1-Propanol (41,1 %), 1-Butanol (24,35 %)
sowie 1-Pentanol (8,06 %) und 1-Hexanol (6,88 %), alle weiteren Substrate besitzen
eine relative Reaktionsgeschwindigkeit von unter 5 %. Methanol besitzt die kleinste
relative Reaktionsgeschwindigkeit (0,36 %), obwohl es nur eine Methyl-Gruppe
kürzer ist als das native Substrat Ethanol.
19
Im nächsten Schritt wurde die Coenzymspezifität der Alkhohol-Dehydrogenase
untersucht. Hierzu wurden statt 40 µl 5 mM NAD+ die gleiche Menge 5 mM NADP in
den Basistest eingebracht. Folgende Reaktionsgeschwindigkeit konnte gemessen
werden:
Abbildung 16: Coenzymspezifität - NADP 5 mM
Zu erkennen ist, dass die Produkt-Zunahme sehr gering ist (Abb. 16). Rechnerisch
wurden folgende Werte ermittelt:
Tabelle 7: Überprüfung der Coenzymspezifität anhand von NADP
ΔE/min
Coenzym
5mM NAD
+
+
5mM NADP
R2
Standabw.
0,0692
1
0,0001
0,0678
1
0,0001
0,0015
0,9571
0,0001
0,0015
0,9860
0
Ø
Va
spez.Akt
Rktgeschw.
ΔE/min
[µmol/min·ml]
[µmol/min·mg]
[%]
0,0685
10378,79
283,54
100
0,0015
227,27
6,209
2,19
Unter Einsatz von NADP statt NAD+ weist die Reaktion eine relative
Reaktionsgeschwindigkeit von 2,19 % auf.
20
3. Versuch C - km-Wert Bestimmung für Ethanol und NAD+
Der dritte Teil des Versuches umfasste die Bestimmung der Substratkonzentration,
bei der halbmaximale Geschwindigkeit erreicht ist - den km-Wert. Die km-Wert
Bestimmung fand zum einen anhand mind. 15 verschiedener
Substratkonzentrationen, zum anderen anhand mind. 15 verschiedener CoenzymKonzentrationen statt.
Ermittlung von km anhand verschiedener Substratkonzentrationen
Die verschiedenen Ethanol-Konzentrationen brachten folgende Ergebnisse:
Tabelle 8: Verschiedene Ethanol-Konzentrationen und die daraus ermittelten Reaktionsgeschwindigkeiten dienten
der km-Wert Bestimmung für Ethanol
Ethanolkonz.
ΔE/min
R2
[mM]
2
2,5
3
3,5
4
6
8
10
12
14
0,0153
0,9997
0,0153
0,9999
0,0186
0,9999
0,0189
0,9999
0,0197
0,9996
0,0196
0,9997
0,0216
0,9998
0,0226
0,9999
0,0278
0,9999
0,0270
0,9999
0,0313
0,9996
0,0310
0,9997
0,0371
0,9999
0,0371
0,9999
0,041
0,9999
0,415
0,9999
0,0415
1
0,0414
0,9999
0,0456
0,9999
0,0449
0,9999
Ø
Va
Spez.Akt.
1/S
1/V
S/V
ΔE/min
[µmol/min·ml]
[µmol/min·mg]
[1/mM]
[min/µmol]
[mM·min/µmol]
69·10-5
0,0153
2897,73
79,16
0,5
34,5·10-5
0,01875
3551,14
97
0,4
28,16·10-5
70,4·10-5
0,01965
3721,59
101,67
0,286
26,87·10-5
80,6·10-5
0,0221
4185,61
114,34
0,333
23,9·10-5
83,62·10-5
0,0274
5189,39
141,77
0,25
19,27·10-5
77,1·10-5
0,03115
5899,62
161,17
0,167
16,95·10-5
101,7·10-5
0,0371
7026,52
191,96
0,125
14,23·10-5
102,4·10-5
0,04125
7812,5
213,43
0,1
12,8·10-5
128·10-5
0,04145
7850,4
214,5
0,0833
12,7·10-5
152,9·10-5
0,04525
8570,08
234,12
0,0714
11,67·10-5
163,4·10-5
21
16
18
20
30
40
60
80
100
0,0455
0,9998
0,0437
0,9999
0,0496
0,9999
0,0482
0,9999
0,054
0,9999
0,0532
0,9999
0,0616
0,9999
0,0648
0,9999
0,0621
1
0,0612
1
0,0682
0,9999
0,0671
1
0,0724
0,9999
0,0762
0,9998
0,0754
0,9999
0,0762
0,9999
0,0446
8446,97
230,76
0,0625
11,83·10-5
189,4·10-5
0,0489
9261,36
253,01
0,0556
10,8·10-5
194,4·10-5
0,0536
10151,52
277,33
0,05
9,85·10-5
197·10-5
0,0632
11969,7
327
0,033
8,35·10-5
250,6·10-5
0,06165
11676,14
318,98
0,025
8,56·10-5
342,6·10-5
0,06765
12812,5
350,02
0,0167
7,8·10-5
468·10-5
0,07215
13644,77
373,3
0,0125
7,32·10-5
624,4·10-5
0,0758
14356,1
392,2
0,01
6,97·10-5
696,6·10-5
Diese ermittelten Werte (Tab. 8) wurden anschließend graphisch nach MichaelisMenten, Lineweaver-Burk und Hanes aufgetragen, um die enzymatischen Parameter
Vmax sowie km ermitteln zu können.
Auftragung nach Michaelis-Menten
Bei der Darstellung nach Michaelis-Menten wird die Reaktionsgeschwindigkeit (hier:
VA) gegen die Substratkonzentration (hier: Ethanolkonzentration in mM) aufgetragen,
dies führte zu folgendem Ergebnis:
22
Abbildung 17: Auftragung nach Michaelis-Menten und Bestimmung des km-Wertes bei verschiedenen EthanolKonzentrationen
Diese hyperbole Kurve ist typisch für die Auftragung nach Michaelis-Menten, wobei
das angedeutete Plateau den Sättigungsbereich darstellt, in dem die
Reaktionsgeschwindigkeit maximal ist.
Auftragung nach Lineweaver-Burk
Die Auftragung nach Lineweaver-Burk entspricht der doppelt-reziproken Darstellung
von Michaelis-Menten, wobei hier der Kehrwert der Reaktionsgeschwindigkeit (also
1/VA) gegen den Kehrwert der Substratkonzentration (also 1/Ethanolkonzentration in
mM) aufgetragen wird. Dies führte zu folgendem Ergebnis:
23
Abbildung 18: Auftragung nach Lineweaver-Burk und Bestimmung des km-Wertes bei verschiedenen EthanolKonzentrationen
Die Geradengleichung ist mit
angegeben, der Schnittpunkt
der Geraden mit der y-Achse beschreibt die reziproke Maximalgeschwindigkeit (also
1/Vmax) und der Schnittpunkt mit der x-Achse den negativen reziproken Wert für km
(also -1/km). Die Werte für Vmax und km können nun entweder abgelesen, oder
anhand der Geradengleichung berechnet werden.
Da der Wert für km im Schnittpunkt der x-Achsen steckt, muss für die Bestimmung
dieses Wertes der y-Wert der Geradengleichung Null entsprechen:
Daraus ergibt sich:
Da die Lineweaver-Burk Darstellung jedoch eine reziproke Auftragung ist, muss
anschließend der Kehrwert dieses Ergebnisses genommen werden:
24
Da der Wert für Vmax im Schnittpunkt der y-Achse steckt, muss der x-Wert der
Geradengleichung Null gesetzt werden:
Daraus ergibt sich:
Auch von dem hier erhaltenen Ergebnis muss anschließend der Kehrwert genommen
werden:
Nach Lineweaver-Burk ergibt sich ein km-Wert von 10 mM; die
Maximalgeschwindigkeit Vmax hat einen Wert von 14285,71 µmol/min.
Auftragung nach Hanes
Bei der Darstellung nach Hanes wird der Quotient aus Substratkonzentration und
Reaktionsgeschwindigkeit (also Ethanolkonzentration in mM/VA) gegen die
Reaktionsgeschwindigkeit (hier: VA) aufgetragen. Dies führt zu folgendem Ergebnis:
25
Abbildung 19: Auftragung nach Hanes und Bestimmung des k m-Wertes anhand verschiedener EthanolKonzentrationen
Die Geradengleichung ist mit
angegeben, der Schnittpunkt
der Geraden mit der y-Achse beschreibt den Quotienten aus km und der
Reaktionsgeschwindigkeit (also km/VA) und der Schnittpunkt mit der x-Achse den
negativen Wert für km (also -km). Auch hier können die gesuchten Parameter
entweder abgelesen, oder anhand der Geradengleichung berechnet werden.
Da der Wert für km im Schnittpunkt mit der x-Achse liegt, muss der y-Wert der
Geradengleichung Null gesetzt werden:
Der Schnittpunkt der Geraden mit der y-Achse entspricht dem Quotienten km/Vmax, so
kann anhand des hier berechneten Wertes für km durch sachgemäße Umformung
Vmax berechnet werden:
26
Dieser Wert entspricht dem Schnittpunkt der Geraden mit der y-Achse, weshalb der
x-Wert der Geradengleichung auf Null gesetzt werden muss:
Nach Hanes ergaben sich damit ein km-Wert von 0,429 mM und eine
Maximalgeschwindigkeit von 8571 µmol/min.
Ermittlung von km anhand verschiedener Coenzym-Konzentrationen
Im Prinzip wurde nun der gleiche Vorgang wiederholt, diesmal jedoch unter
Veränderung der Coenzym-Konzentration. Dies führte zunächst zu folgenden
Ergebnissen:
Tabelle 9: Verschiedene Coenzym-Konzentrationen und die daraus ermittelten Reaktionsgeschwindigkeiten
dienten der km-Wert Bestimmung für NAD+
NAD+- Konz.
ΔE/min
R2
[mM]
0,05
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,0057
0,9948
0,0055
0,9942
0,0128
0,9970
0,0105
09966
0,0189
0,9976
0,0202
0,9986
0,0263
0,9988
0,0241
0,9987
0,0345
0,9985
0,0301
0,9988
0,0355
0,9990
0,0350
0,9988
0,0357
0,9996
Ø
Va
Spez.Akt.
1/S
1/V
S/V
ΔE/min
[µmol/min·ml]
[µmol/min·mg]
[1/mM]
[min/µmol]
[mM·min/µmol]
0,0056
1060,6
28,97
20
94,29·10-
4,7·10-5
5
0,01165
2206,44
60,27
10
45,32·10-
4,5·10-5
5
0,01955
3702,65
101,15
5
27,01·10-
5,4·10-5
5
0,0252
4772,73
130,38
3,33
20,95·10-
6,29·10-5
5
0,0323
6117,42
167,12
2,5
16,35·10-
6,54·10-5
5
0,03525
6676,14
182,38
2
14,98·10-
7,49·10-5
5
0,03575
6770,83
184,97
1,667
14,77·10-
8,87·10-5
27
0,7
0,8
0,9
1
1,5
2
3
4
4,5
5
0,0358
0,9994
0,0428
0,9992
0,0409
0,9992
0,0436
0,9997
0,0395
0,9997
0,0432
0,9993
0,0445
0,9994
0,0467
0,9998
0,0471
0,9997
0,0561
0,9999
0,0555
0,9999
0,0514
0,9999
0,0565
0,9999
0,0683
1
0,0698
1
0,0716
1
0,0735
1
0,0732
1
0,0732
1
0,0714
0,9997
0,0694
0,9998
5
0,04185
7926,14
216,53
1,43
12,62·10-
8,83·10-5
5
0,04155
7869,32
214,97
1,25
12,71·10-
10,2·10-5
5
0,04385
8304,92
226,87
1,111
12,04·10-
10,84·10-5
5
0,0469
8882,58
242,65
1
11,3·10-5
11,3·10-5
0,0558
10568,18
288,7
0,667
9,46·10-5
14,19·10-5
0,05395
10217,8
279,13
0,5
9,79·10-5
19,57·10-5
0,06905
13077,65
357,25
0,333
7,65·10-5
22,94·10-5
0,07255
12740,53
348,05
0,25
7,28·10-5
29,1·10-5
0,0732
13863,64
378,73
0,222
7,21·10-5
32,46·10-5
0,0704
13333,33
364,24
0,2
7,5·10-5
37,5·10-5
Diese ermittelten Werte (Tab. 9) wurden anschließend graphisch nach MichaelisMenten, Lineweaver-Burk und Hanes aufgetragen, um die enzymatischen Parameter
Vmax sowie km ermitteln zu können.
Auftragung nach Michaelis-Menten
Bei der Darstellung nach Michaelis-Menten wurde erneut die
Reaktionsgeschwindigkeit (hier: VA) jetzt jedoch gegen die Coenzym-Konzentration
(also NAD+ in mM) aufgetragen. Die Werte 2 mM und 5 mM wurden nicht
berücksichtigt, da sie zu stark von der Tendenz der restlichen Werte abwichen:
28
Abbildung 20: Auftragung nach Michaelis-Menten und Bestimmung des km-Wertes bei verschiedenen NADKonzentrationen
Auch hier ist die typische hyperbole Kurve zu erkennen. Die Abflachung der Kurve
stellt auch hier wieder den Sättigungsbereich dar. Im Sättigungsbereich ändert sich
die Geschwindigkeit der Reaktion kaum bis gar nicht, da bereits
Maximalgeschwindigkeit erreicht wurde.
Auftragung nach Lineweaver-Burk
Wie beschrieben ist die Darstellung nach Lineweaver-Burk die reziproke Auftragung
nach Michaelis-Menten. Damit ergibt sich für die verschiedenen NADKonzentrationen folgendes Ergebnis:
29
Abbildung 21: Auftragung nach Lineweaver-Burk und Bestimmung des km-Wertes bei verschiedenen NADKonzentrationen
Die Geradengleichung lautet:
. Der Schnittpunkt der
Geraden mit der y-Achse beschreibt die reziproke Maximalgeschwindigkeit (also
1/Vmax) und der Schnittpunkt mit der x-Achse den negativen reziproken Wert für km
(also -1/km). Die Werte für Vmax und km wurden anschließend anhand der
Geradengleichung berechnet:
Da der Wert für km im Schnittpunkt der x-Achsen steckt, muss für die Bestimmung
dieses Wertes der y-Wert der Geradengleichung Null entsprechen:
Daraus ergibt sich:
Da die Lineweaver-Burk Darstellung jedoch eine reziproke Auftragung ist, muss
anschließend der Kehrwert dieses Ergebnisses genommen werden:
30
Da der Wert für Vmax im Schnittpunkt der y-Achse steckt, muss der x-Wert der
Geradengleichung Null gesetzt werden:
Daraus folgt:
Auch von dem hier erhaltenen Ergebnis muss anschließend der Kehrwert genommen
werden:
Nach Lineweaver-Burk ergibt sich ein km-Wert von 0,6667 mM; die
Maximalgeschwindigkeit Vmax hat einen Wert von 16666,67 µmol/min.
Auftragung nach Hanes
Bei der Darstellung nach Hanes wird wie oben beschrieben der Quotient aus jetzt
Coenzym-Konzentration und Reaktionsgeschwindigkeit gegen die CoenzymKonzentration aufgetragen. Dies führte zu folgendem Ergebnis:
31
Abbildung 22: Auftragung nach Hanes und Bestimmung des km-Wertes bei verschiedenen NAD-Konzentrationen
Die Geradengleichung ist mit
angegeben, der Schnittpunkt
der Geraden mit der y-Achse beschreibt den Quotienten aus km und der
Reaktionsgeschwindigkeit (also km/VA) und der Schnittpunkt mit der x-Achse den
negativen Wert für km (also -km). Auch hier können die gesuchten Parameter
entweder abgelesen, oder anhand der Geradengleichung berechnet werden.
Da der Wert für km im Schnittpunkt mit der x-Achse liegt, muss der y-Wert der
Geradengleichung Null gesetzt werden:
Der Schnittpunkt der Geraden mit der y-Achse entspricht dem Quotienten km/Vmax, so
kann anhand des hier berechneten Wertes für km durch sachgemäße Umformung
Vmax berechnet werden:
32
Dieser Wert entspricht dem Schnittpunkt der Geraden mit der y-Achse, weshalb der
x-Wert der Geradengleichung auf Null gesetzt werden muss:
Nach Hanes ergaben sich damit ein km-Wert von 0,8333 mM und eine
Maximalgeschwindigkeit von 16666,67 µmol/min.
Bestimmung der Wechselzahl
Im letzten Schritt soll die Wechselzahl des Enzyms bestimmt werden. Als
Wechselzahl (oder Turn over number, kurz: TON) wird die Anzahl der je
Enzymmolekül pro Sekunde umgesetzten Substratmoleküle bei Sättigung
bezeichnet. Die Wechselzahl ist ein Maß für die Leistungsfähigkeit eines Enzyms.
Die Berechnung der Wechselzahl erfolgt zum einen anhand des Molekulargewichts
des jeweiligen Enzyms (hier: ADH mit 35 kDa) und der eingesetzten Enzymmenge in
mg/ml (hier: laut Hersteller 29,41 mg/ml) anhand folgender Formel:
Für Vmax wird der ermittelte Wert von 16666,67 µmol/min∙ml verwendet. Dieser Wert
muss jedoch noch in mol/sec∙L umgerechnet werden, was sich auf Vmax = 0,27778
mol/sec∙L beläuft. Nach Avogadro entspricht ein Mol eines Stoffes 6,023 ∙ 1023
Teilchen. Diese Zahl wird benötigt, um berechnen zu können, wie viel Teilchen in
dem pro Sekunde und Enzymmolekül umgesetzten Mol stecken:
33
In einem Liter werden demnach pro Sekunde 1,673 ∙ 1023 Moleküle Ethanol/NAD
umgesetzt.
Die totale Enzymkonzentration wiederum wird aus dem Quotienten der Enzymmenge
und dem Molekulargewicht gewonnen:
Mit Hilfe der Avogadro’schen Zahl kann auch hier die Anzahl der Moleküle berechnet
werden:
Die ADH-Lösung besitzt damit 5,06 ∙ 1020 Moleküle in einem Liter.
Die ermittelten Werte wurden anschließend in die Formel zur Berechnung der
Wechselzahl eingesetzt, was zu folgendem Ergebnis führte:
Die Wechselzahl der ADH lautet:
.
Die ADH hat damit in Sättigung einen Umsatz von ca. 330 Substratmolekülen pro
Enzym und Sekunde.
4. Versuch D - Reversible/irreversible Hemmung
Im vierten Teil des Versuches wurde die Art der Hemmung zweier Hemmstoffe
ermittelt. Zunächst wurde in einem Kontrollansatz mit 80 mM Ethanol die
34
Reaktionsgeschwindigkeit bestimmt. Im Anschluss daran wurde der Ansatz mit
Hemmstoff vermessen, dies geschah wie folgt: Zunächst wurde die Reaktion ohne
Hemmstoff gestartet (hierzu wurden die 200 µl Wasser aus dem Basistest entfernt
und durch Hemmstoff ersetzt) und ca. 1 Minute lang die Reaktionsgeschwindigkeit
registriert. Anschließend wurde der Hemmstoff hinzugegeben, hierbei handelte es
sich zum einen um 0,1 ml 0,4 M Hydroxylamin, zum anderen um 0,1 ml 0,1 M 1,10Phenantrolin-Hydrochlorid. Nach Zugabe des Hemmstoffs wurde die Geschwindigkeit
über weitere 2-3 Minuten registriert und die Steigung bestimmt. Im Anschluss daran
wurde 0,1ml 8,5 M Ethanol hinzugegeben, und die Geschwindigkeit registriert. Bei
der Unterscheidung, ob es sich um einen reversiblen oder einen irreversiblen
Inhibitor handelt ist der letzte Schritt ausschlaggebend, steigt die
Reaktionsgeschwindigkeit nach Zugabe des Ethanols wieder an, handelt es sich um
einen reversiblen, bleibt sie gleich oder fällt gar, handelt es sich um einen
irreversiblen Inhibitor.
Zunächst erfolgte die Auswertung des Kontrollansatzes mit 80 mM, dieser förderte
folgendes Ergebnis zutage:
Tabelle 10: Auswertung des Kontrollansatzes mit 80 mM Ethanol
EtOH- Konz.
ΔE/min
R2
[mM]
80
0,0759
0,9994
0,0744
0,9995
Ø
Enzym-
Va
1/S
1/V
S/V
ΔE/min
Verd.
[µmol/min·ml]
[1/mM]
[min/µmol]
[mM·min/µmol]
0,07515
1:25000
14232,96
0,0125
7,03·10-5
562,1·10-5
Die gemessene Volumenaktivität ist ungefähr vergleichbar zu den bisher
gemessenen Aktivitäten.
Der Einsatz der Inhibitoren führte zu folgendem Ergebnis:
35
Abbildung 23: Ablauf der Basisreaktion mit Inhibitoren verschiedener Hemmart
Das Diagramm zeigt deutlich, dass sich die beiden Reaktionen nach Zugabe der
verschiedenen Hemmstoffe unterschiedlich verhalten (Abb. 23). Bei beiden
Hemmstoff-Graphen beschreibt der erste zu erkennende Peak die Zugabe des
Inhibitors, der zweite Peak bezeichnet die Zugabe des 8,5 M Ethanols. Zu erkennen
ist, dass die Steigung des Hydroxylamin beschreibenden Graphen (rot) nach Zugabe
des Ethanols deutlich stärker ansteigt, als es beim 1,10-Phenantrolin-Hydrochlorid
beschreibenden Graphen (grün) der Fall ist. Wird die Extinktionsänderung pro Minute
aller drei Zeiträume (Z1-3) anhand der Steigung verglichen, so ergibt sich folgendes:
Tabelle 11: Vergleich der eingesetzten Inhibitoren zu allen drei Zeitpunkten
Kontrolle 1
Hydroxylami
Kontrolle 2
1,10-Phenantrolin-
ohne
n (0,4 M)
ohne Hemmstoff
Hydrochlorid
(80 mM EtOH)
(0,1 M)
Hemmstoff
(80 mM EtOH)
E
1
min
ohne
0,0757
0,1009
0,0737
0,1167
0,0742
0,1009
0,0755
0,1130
14195
15288
11303
13921
Hemmstoff
VA 1 [
µmol
]
min ml
36
E
2
min
-
0,0098
-
0,023
+100µl
-
0,0112
-
0,023
-
1790
-
3136
-
0,0625
-
0,0188
-
0,0701
-
0,0171
-
12557
-
2720
Hemmstoff
VA 2 [
µmol
]
min ml
E
3
min
+100µl 8,5 M
Ethanol
VA 3 [
µmol
]
min ml
Zu erkennen ist, dass vor der Zugabe des Inhibitors (Z1) der Ansatz mit
Hydroxylamin eine Volumenaktivität von 15288 µmol/min∙ml, der Ansatz mit 1,10Phenantrolin-Hydrochlorid eine Volumenaktivität von 13921 µmol/min∙ml hat. Nach
Zugabe des Inhibitors (Z2) sinkt die Volumenaktivität beider Ansätze auf 1790
µmol/min∙ml bei Hydroxylamin bzw. 3136 µmol/min∙ml bei 1,10-PhenantrolinHydrochlorid. Zum letzten Zeitpunkt (Z3), also der Zugabe von 8,5 M Ethanol, lässt
sich nun der Unterschied beider Ansätze deutlich erkennen und damit die Hemmart
festmachen. Beim Ansatz mit 0,4 M Hydroxylamin lässt sich erkennen, dass die
Volumenaktivität nach Zugabe des Ethanols wieder deutlich ansteigt auf 12557
µmol/min∙ml. Dieser Anstieg ist beim zweiten Ansatz, mit 1,10-PhenantrolinHydrochlorid nicht erkennbar. Stattdessen fällt die Volumenaktivität weiter ab auf
2720 µmol/min∙ml.
5. Versuch E - Bestimmung des Hemmtyps von verschiedenen Hemmstoffen
Der vorletzte Teil der Versuchsreihe befasste sich erneut mit Inhibitoren. Diesmal
jedoch wurde ein reversibler Inhibitor - hier: Hydroxylamin - zur Verfügung gestellt,
dessen genauer Hemmtyp, also: kompetitiv, unkompetitiv oder nicht-kompetitiv,
bestimmt werden sollte. Hierzu wurde unter Einsatz verschiedener Konzentrationen
37
des Inhibitors (0 mM, 1 mM und 4 mM) die Reaktionsgeschwindigkeit bei
verschiedenen Substrat-Konzentrationen bestimmt, ähnlich wie in Versuch 7C
beschrieben.
Zunächst wurde die Reaktion ohne Inhibitor mit verschiedenen EthanolKonzentrationen durchgeführt:
Tabelle 12: Ermittlung der Reaktionsgeschwindigkeit bei verschiedenen Ethanol-Konzentrationen
EtOH- Konz.
ΔE/min
R2
[mM]
Ø
Va
Enzym-
1/S
1/V
S/V
ΔE/min
[µmol/min·ml]
Verd.
[1/mM]
[min/µmol]
[mM·min/µmol
58,5·10-5
]
2
4
8
12
16
20
30
60
80
100
0,0183
0,9999
0,0178
0,9999
0,0274
0,9999
0,0274
0,9999
0,0398
0,9999
0,3999
0,9999
0,0447
0,9999
0,0459
0,9999
0,0547
1
0,0529
1
0,0568
1
0,0561
1
0,057
1
0,0581
1
0,0689
0,9999
0,0714
1
0,074
1
0,0735
0,9999
0,0779
0,9999
0,0753
0,9999
0,01805
3418,56
1:25000
0,5
29,25·10-5
0,0274
5189,39
1:25000
0,25
19,27·10-5
77,08·10-5
0,03985
7547,35
1:25000
0,125
13,25·10-5
106·10-5
0,0453
8579,55
1:25000
0,085
11,66·10-5
140·10-5
0,0538
10189,39
1:25000
0,0625
9,81·10-5
157,7·10-5
0,05645
10691,29
1:25000
0,05
9,35·10-5
187,1·10-5
0,05655
10710,23
1:25000
0,0333
9,33·10-5
280,1·10-5
0,07015
13285,99
1:25000
0,0167
7,53·10-5
451,6·10-5
0,07375
13967,8
1:25000
0,0125
7,16·10-5
572,8·10-5
0,0766
14507,6
1:25000
0,01
6,89·10-5
689,3·10-5
Zu erkennen ist, dass die Volumenaktivität bei 2 mM Ethanol mit 3418,56
µmol/min∙ml am kleinsten, und bei 100 mM mit 14507,6 µmol/min∙ml am größten ist
(Tab. 12).
Als nächstes wurde dieser Ablauf wiederholt, nun jedoch mit 1 mM Hydroxylamin im
Test.
38
Tabelle 13: Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit bei verschiedenen Ethanol-Konzentrationen und 1 mM
Hydroxylamin im Test
EtOH- Konz.
ΔE/min
R2
[mM]
2
4
8
12
16
20
30
60
80
100
0,0057
0,9991
0,0058
0,996
0,0111
0,9979
0,0113
0,9993
0,0189
0,9992
0,019
0,999
0,0252
0,9992
0,0258
0,9992
0,0311
0,9991
0,0298
0,9991
0,0347
0,9998
0,0349
0,9998
0,0448
0,9997
0,0445
0,9998
0,0593
0,9999
0,0582
0,9999
0,0645
0,9998
0,0645
0,9996
0,0652
0,9999
0,0677
0,9999
Ø
Va
Enzym-
1/S
1/V
S/V
ΔE/min
[µmol/min·ml]
Verd.
[1/mM]
[min/µmol]
[mM·min/µmol]
0,00575
1089,02
1:25000
0,5
91,83·10-
183,7·10-5
5
0,0112
2121,21
1:25000
0,25
47,14·10-
188,6·10-5
5
0,01895
3589,02
1:25000
0,125
27,8·10-5
222,9·10-5
0,0255
4829,55
1:25000
0,0833
20,71·10-
248,5·10-5
5
0,03045
5769,05
1:25000
0,0625
17,34·10-
277,4·10-5
5
0,0348
6590,91
1:25000
0,05
15,17·10-
303,5·10-5
5
0,04465
8456,44
1:25000
0,0333
11,82·10-
354,8·10-5
5
0,05875
11126,9
1:25000
0,0167
8,99·10-5
539,2·10-5
0,0645
12215,91
1:25000
0,0125
8,17·10-5
654,8·10-5
0,06645
12585,23
1:25000
0,01
7,95·10-5
794,6·10-5
Zu erkennen ist, dass die Reaktionsgeschwindigkeit wieder am kleinsten bei 2 mM
Ethanol und am größten bei 100 mM Ethanol ist. Diesmal liegt sie bei 2 mM Ethanol
jedoch bei 1089,02 µmol/min∙ml und bei 100 mM Ethanol bei 12585,23 µmol/min∙ml.
Die Aktivität ist damit um durchschnittlich um 2000 µmol/min∙ml (2329,54
µmol/min∙ml bei 2 mM Ethanol sowie 1922,37 µmol/min∙ml bei 100 mM Ethanol)
gesunken (Tab. 13).
Als nächstes wurde die Reaktion mit 4 mM Hydroxylamin wiederholt, und erneut die
Reaktionsgeschwindigkeiten betrachtet:
Tabelle 14: Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit bei verschiedenen Ethanol-Konzentrationen und 4 mM
Hydroxylamin im Test
EtOH - Konz.
[mM]
ΔE/min
R2
Ø
Va
Enzym-
1/S
1/V
S/V
ΔE/min
[µmol/min·ml]
Verd.
[1/mM]
[min/µmol]
[mM·min/µmol]
39
2
4
8
12
16
20
30
60
80
100
0,0021
0,9918
0,0016
0,8953
0,0041
0,9935
0,0040
0,9969
0,0076
0,9935
0,0079
0,9970
0,0111
0,9935
0,0111
0,9933
0,0147
0,9977
0,0145
0,9983
0,0172
0,9979
0,0176
0,9981
0,0241
0,9988
0,0227
0,9992
0,0374
0,9995
0,0374
0,9992
0,0434
0,9996
0,0427
0,9996
0,0495
0,9998
0,0493
0,9997
0,00185
350,38
1:25000
0,5
285,4·10-5
570,8·10-5
0,00405
767,05
1:25000
0,25
130,4·10-5
521,2·10-5
0,00775
1467,8
1:25000
0,125
68,13·10-5
545·10-5
0,0111
2102,27
1:25000
0,0833
47,57·10-5
570,8·10-5
0,0146
2765,15
1:25000
0,0625
36,16·10-5
578,6·10-5
0,0174
3295,46
1:25000
0,05
30,35·10-5
606,9·10-5
0,0234
4431,82
1:25000
0,0333
22,56·10-5
676,9·10-5
0,0374
7083,33
1:25000
0,01667
14,12·10-5
847,1·10-5
0,04305
8153,41
1:25000
0,0125
12,27·10-5
981,2·10-5
0,0494
9356,1
1:25000
0,01
10,69·10-5
1069·10-5
Auch hier ist ein deutlicher Abfall der Volumenaktivität zu beobachten. Die
Volumenaktivität des Ansatzes mit 2 mM Ethanol fällt, im Vergleich zur Kontrolle, um
ungefähr 1/10 ab auf 350,38 µmol/min∙ml. Die Volumenaktivität der Probe mit 100
mM Ethanol fällt um über 5000 µmol/min∙ml von 14507,6 µmol/min∙ml auf 9356,1
µmol/min∙ml ab (Tab. 14).
Im Anschluss daran wurden diese Ergebnisse nach Michaelis-Menten, LineweaverBurk und Hanes aufgetragen. Dies diente der Ermittlung der Enzymparameter km und
Vmax und weiterführend der Bestimmung des Hemmtyps des Inhibitors.
Auftragung nach Michaelis-Menten
Zunächst wurden die ermittelten Ergebnisse nach Michaelis-Menten dargestellt.
Hierzu wurde die Volumenaktivität gegen die Substratkonzentration aufgetragen:
40
Abbildung 24: Auftragung der im Versuch gewonnenen Daten (Tab. 12, 13, 14) nach Michaelis-Menten
Zu erkennen ist, dass die Maximalgeschwindigkeit nach Michaelis-Menten bei
Zunehmender Inhibitor-Konzentration abzufallen scheint (Abb. 24).
Auftragung nach Lineweaver-Burk
Wie erwähnt handelt es sich bei der Auftragung nach Lineweaver-Burk um die
doppelt-reziproke Darstellung von Michaelis-Menten. Es wird demnach 1/VA gegen
1/[S] aufgetragen:
41
Abbildung 25: Auftragung der im Versuch gewonnenen Daten (Tab. 12, 13, 14) nach Lineweaver-Burk
Anhand der Geradengleichungen (Abb. 25) wurden anschließend die
Enzymparameter km und Vmax für die verschiedenen Inhibitor-Konzentrationen
berechnet.
Exemplarisch sei dies anhand der Werte ohne Inhibitor (also 0 mM Hydroxylamin)
gezeigt:
Die Geradengleichung lautet:
.
Der Schnittpunkt der Geraden mit der y-Achse beschreibt den reziproken Wert für die
Maximalgeschwindigkeit, also 1/Vmax. Um dies nun berechnen zu können, muss der
x-Wert der Geradengleichung Null gesetzt werden, daraus ergibt sich:
Daraus folgt:
Der Schnittpunkt der Geraden mit der x-Achse beschreibt den negativen reziproken
Wert für km, also -1/km. Zur Berechnung dieses Wertes muss der y-Wert der
Geradengleichung Null gesetzt werden, daraus folgt:
42
Somit ergibt sich:
Daraus folgt für km:
So ergibt sich nach Lineweaver-Burk für 0 mM Hydroxylamin eine
Maximalgeschwindigkeit von 14286 µmol/min und ein KM-Wert von 7 mM.
Die enzymatischen Parameter km und Vmax wurden für die InhibitorKonzentrationen 1 mM und 4 mM Hydroxylamin in gleicher Weise berechnet. Es
ergaben sich folgende Werte:
Tabelle 15: Veränderung der enzymatischen Paramter Vmax und km bei verschiedenen Inhibitor-Konzentrationen
nach Lineweaver-Burk lässt Rückschlüsse auf den Typ der Hemmung zu
Hydroxylaminkonz.
0 mM
1 mM
4 mM
Vmax [µmol/min]
14285,714
16666,67
50000
km [mM]
7,143
28,57
275
Zu erkennen ist, dass sowohl Vmax, als auch km bei steigender Inhibitor-Konzentration
ansteigen (Tab. 15).
Auftragung nach Hanes
Bei der Auftragung nach Hanes wird der Quotient aus Substratkonzentration und
Volumenaktivität, also [S]/VA, gegen die Substratkonzentration aufgetragen. Dies
führte zu folgendem Ergebnis:
43
Abbildung 26: Auftragung der im Versuch gewonnenen Daten (Tab. 12, 13, 14) nach Hanes
Die Berechnung der enzymatischen Parameter Vmax und km fand erneut anhand der
Geradengleichungen statt (Abb. 26). Exemplarisch sei dies für die InhibitorKonzentration 1 mM Hydroxylamin gezeigt.
Die Geradengleichung lautet:
.
Der Schnittpunkt der Geraden mit der x-Achse beschreibt den negativen Wert für km,
also -km. Um diesen berechnen zu können, muss der y-Wert der Geradengleichung
Null gesetzt werden:
Nach x aufgelöst:
Der Schnittpunkt der Geraden mit der y-Achse entspricht dem Quotienten km/Vmax, so
kann anhand des hier berechneten Wertes für km durch sachgemäße Umformung
Vmax berechnet werden:
44
Dieser Wert entspricht dem Schnittpunkt der Geraden mit der y-Achse, weshalb der
x-Wert der Geradengleichung auf Null gesetzt werden muss:
So ergeben sich bei einer 1 mM Hydroxylamin-Konzentration ein km-Wert von 28 mM
und eine Maximalgeschwindigkeit von 16666,67 µmol/min.
Diese Berechnung wird nun für die verbleibenden Inhibitor-Konzentrationen (0 mM
und 4 mM) in gleicher Weise durchgeführt, was schlussendlich zu folgendem
Ergebnis führt:
Tabelle 16: Veränderung der enzymatischen Paramter Vmax und km bei verschiedenen Inhibitor-Konzentrationen
nach Hanes lässt Rückschlüsse auf den Typ der Hemmung zu
Hydroxylaminkonz.
0 mM
1 mM
4 mM
Vmax [µmol/min]
16666,67
16666,67
16666,67
KM [mM]
10
28,333
85
Zu erkennen ist, dass Vmax bei steigender Inhibitor-Konzentration konstant bleibt,
während km bei steigender Inhibitor-Konzentration ansteigt (Tab. 16).
6. Versuch F - Bestimmung der ADH-Aktivität in zellfreien Extrakten
Der letzte Versuch dieser Reihe drehte sich um die Bestimmung der ADH-Aktivität in
zellfreien Extrakten sieben verschiedener Saccharomyces cerevisiae Stämme. Sechs
45
dieser Stämme weisen eine Deletion entweder in einem, oder in zwei der jeweiligen
für die ADH1, ADH2 bzw. ADH3 kodierenden Gene auf. Die jeweilige Mutation findet
sich in folgender Tabelle (Tab. 17) wieder:
Tabelle 17: Die sieben verwendeten Stämme und ihre jeweilige/n Mutation/en
Stamm
Name
Deletion(en)
K43
CEN.PK113-7D
----
K1649
CEN.PK483-1A
Adh1(5,1024)::loxP-Kan-loxP
K1659
CEN.PK485-1C
Adh2(5,1024)::loxP-Kan-loxP
K364
CEN.PK226-1D
Adh3(41,1100)::loxP-Kan-loxP
K1732
CEN.PK499-6D
Adh1(5,1024)::loxP-Kan-loxP Adh2(5,1024)::loxP-Kan-loxP
K4161
CEN.PK502-2B
Adh1(5,1024)::loxP-Kan-loxP Adh3(41,1100)::loxP-Kan-loxP
K3844
CEN.PK803-2C
Adh2(5,1024)::loxP-Kan-loxP Adh3(41,1100)::loxP-Kan-loxP
Diese Stämme wurden über Nacht zum einen in Glucose-haltigem (4 % - YEPD4),
zum anderen in Glucose-freiem, Ethanol- und Glycerin-haltigem (je 3 % - YEPE/GLY)
Medium angezogen. Die Kulturen wurden auf eine optische Dichte von OD600 = 1-4
angezogen und anschließend durch Zentrifugation (5 Minuten, 4000 upm, 4°C)
geerntet. Die Zellen wurden anschließend mit eiskaltem Kaliumphosphatpuffer
gewaschen und dann mit Hilfe von Glasperlen aufgeschlossen. Nach weiterem
Zentrifugieren wurde der Überstand bei -20°C über Nacht gelagert. Am nächsten
Morgen wurde die Proteinkonzentration mit Hilfe des Mikrobiuret-Assays ermittelt.
Anschließend wurden die einzelnen Proben dem Basistest (Tab. 1) unterzogen,
wobei statt der käuflich erworbenen ADH nun 40 µl des Rohextraktes in
unterschiedlichen Verdünnungen eingesetzt wurde. Die Ergebnisse der
Proteinbestimmung nach Mikrobiuret sowie die des Enzymtests sind in folgender
Tabelle wiedergegeben:
Tabelle 18: Ergebnisse des Mikrobiuret-Assays sowie des Enzymtest der einzelnen S. cerevisiae Stämme
Stamm
Medium
Proteinkonz.
ΔE/min
[mg/ml]
K43
YEPD
1,287
0,0653
Ø
Verdünnung
Va
Spez.Akt.
ΔE/min
Rohextrakte
[µmol/min·ml]
[µmol/min·mg]
0,0656
1:4
1,99
1,545
0,0184
unverd.
0,1394
0,3256
0,0659
YEPEGly
0,428
0,0182
46
0,0186
K1649
YEPD
0,598
0,0003
0,00055
unverd.
0,0042
0,007
0,0237
unverd.
0,18
0,488
0,001
unverd.
0,0076
0,0111
0,0012
unverd.
0,0091
0,0129
0,08675
1:4
2,629
1,776
0,02285
unverd.
0,1731
0,3415
0,0003
unverd.
0,0023
0,0032
0,0017
unverd.
0,0129
0,02133
0
unverd.
0
0
0,0005
unverd.
0,0038
0,0182
0,0722
1:4
2,188
1,515
0,01925
unverd.
0,1458
0,28
0,0008
YEPEGly
0,368
0,0244
0,0230
K1659
YEPD
0,682
0,0011
0,0009
YEPEGly
0,706
0,0011
0,0013
K364
YEPD
1,48
0,0875
0,086
YEPEGly
0,507
0,0231
0,0226
K1732
YEPD
0,704
0,0002
0,0004
YEPEGly
0,604
0,0016
0,0018
K4161
YEPD
0,594
0
0
YEPEGly
0,209
0,0005
0,0005
K3844
YEPD
1,444
0,073
0,0714
YEPEGly
0,522
0,0193
0,0192
Zu erkennen ist, dass der Wildtyp (K43) auf YEPD-Medium mit 1,545 µmol/min∙mg
die höchste Aktivität zeigt, gefolgt von der ADH2/ADH3-Mutante K3844 mit 1,515
µmol/min∙mg. Auf YEPE/Gly-Medium zeigt die ADH1-Mutante K1649 mit 0,488
µmol/min∙mg die höchste Aktivität, gefolgt von der ADH3-Mutante K364 mit 0,3415
µmol/min∙mg. Die ADH1/ADH3-Mutante K4161 zeigt auf YEPD die geringste Aktivität
mit 0 µmol/min∙mg, gefolgt von der ADH1/ADH2-Mutante K1732 mit 0,0032
µmol/min∙mg. Auf YEPE/Gly zeigt die ADH2-Mutante K1659 die geringste Aktivität
mit 0,0129 µmol/min∙mg, gefolgt von der ADH1/ADH3-Mutante K4161 mit 0,0182
µmol/min∙mg. Bei den Mutanten K43, K364 und K3844 ist zu beobachten, dass sie
eine höhere Aktivität auf YEPD-Medium als auf YEPE/Gly-Medium zeigen. Bei den
Mutanten K1649, K1659, K1732 und K4161 ist genau der umgekehrte Fall
47
festzustellen, sie zeigen eine höhere Aktivität auf YEPE/Gly- im Vergleich zum
YEPD-Medium.
IV.
Diskussion
Ziel dieser Versuchsreihe war es, die Wirkungsweise und Spezifität von Enzymen
anhand der Alkoholdehydrogenase kennen zu lernen, charakteristische Parameter
(Vmax und km) eigenständig zu ermitteln und den Mechanismus der Hemmung
enzymatischer Aktivität anhand verschiedener Inhibitoren zu veranschaulichen.
1. Versuch A - Basistest
Ziel des ersten Versuches war es, eine geeignete Enzymverdünnung zu ermitteln,
unter der während des Enzymtest die Extinktionsänderung pro Minute, und damit die
Steigung der Geraden, in einem Bereich von 0,05 - 0,1 lag. Dies ist wichtig, da bei
einer zu flachen Steigung im Basistest bei späteren Versuchsteilen eine weitere
Abflachung bei Verminderung des Substrates zu erwarten ist. Die Steigung wäre,
läge sie im Basistest bereits unter 0,05, bei weiterer Reduktion nicht mehr
ausreichend auswertbar. Wäre die Steigung wiederum zu steil, würde dies einen zu
schnellen Substratumsatz und daher eine baldige Linearität der Steigung bedeuten.
Auch dies würde zur nicht-Auswertbarkeit der Steigung führen. Wäre die
Extinktionsänderung pro Minute nicht auswertbar, könnte wiederum die
Volumenakvität, sowie die spezifische Aktivität und in letzter Konsequenz die Enzymcharakteristischen Parameter Vmax und km nicht berechnet werden.
So wurde die geeignete ADH-Verdünnung anhand des Enzymtest durch Versuch
und Irrtum ermittelt. Die zunächst angestrebte Verdünnung von 1:5000 zeigte eine zu
starke Steigung und wurde von daher nicht näher betrachtet (Abb. 10). Die als
nächstes getestete Verdünnung 1:10000 zeigte bereits gute Tendenzen, war
48
dennoch mit einer Extinktionsänderung pro Minute von über 0,1 zu steil (Tab. 2). Erst
eine Verdünnung von 1:20000 brachte ein zufriedenstellendes Ergebnis mit einer
Steigung von 0,069 (Tab. 2). Diese Verdünnung sollte dann auch im weiteren
angewandt werden.
Der nächste Teil des Basistests umfasste die Kontrollen. Als erstes wurde der Ansatz
auf Substrat- bzw. Coenzym-Freiheit hin untersucht. Würden diese Ansätze, trotz des
Herauslassens von Substrat bzw. Coenzym eine nennenswerte Aktivität zeigen, so
kann davon ausgegangen werden, dass eine der Reaktionskomponenten (Puffer,
GSH-Lösung, ADH-Lösung) Verunreinigungen aufweist. Eine hier gemessene
Aktivität, so sie signifikant wäre, müsste im weiteren Verlauf von allen gemessenen
Aktivitäten abgezogen werden, weil sie als Schwankung anzusehen wäre. Wie an
den sehr geringen Volumenaktivitäten - ca. 23 µmol/min∙ml ohne Substrat bzw. ca.
15 µmol/min∙ml ohne Coenzym zu erkennen ist (Tab. 3), kann im Vergleich zur
Volumenaktivität mit allen Komponenten von ca. 10400 µmol/min∙ml davon
ausgegangen werden, dass keine Verunreinigungen der Komponenten vorliegen. Die
gemessenen Aktivitäten der Kontrollen befinden sich in einem Rahmen von 0,14 %
(ohne Coenzym) - 0,22 % (ohne Substrat) und können vernachlässigt werden. Die
zweite Kontrolle war, ob Substrat und Coenzym in sättigender Konzentration
vorliegen. Ist dies der Fall, ist die Maximalgeschwindigkeit der Reaktion erreicht und
die Volumenaktivität sollte konstant bleiben. Wird die Volumenaktivität bei Einsatz
der doppelten Substratmenge betrachtet, so lässt sich nur ein minimaler Anstieg im
Vergleich zum Basistest erkennen - von 10400 µmol/min∙ml auf 10500 µmol/min∙ml
(Abb. 11, Tab. 3). Hierbei handelt es sich um einen Anstieg von 0,95 %, der ebenfalls
als vernachlässigbar einzustufen ist. Bei der Kontrolle, die Coenzym im Überschuss
aufwies, ist ein etwas anderes Bild zu erkennen (Abb. 12). Hier steigt die
Volumenaktivität doch deutlich im Vergleich zum Basistest an - von 10400
µmol/min∙ml auf ca. 11000 µmol/min∙ml (Tab. 3). Es handelt sich um einen Anstieg
von 5,8 %, der darauf hindeutet, dass die Coenzym-Konzentration nicht in Sättigung
vorliegt. Da die Messungen im Großen und Ganzen dennoch gut auswertbar waren,
wurde die Coenzym-Konzentration in den Folgetest nicht erhöht.
Als letztes wurde die Proteinkonzentration der verwendeten ADH-Lösung anhand
des Mikrobiuret-Assays überprüft. Hier weicht die vom Hersteller angegebene
Konzentration mit 29,41 mg/ml deutlich von der gemessenen Konzentration mit
49
36,606 mg/ml ab (Tab. 4). Dies lässt sich vermutlich auf Pipetierfehler bei der
Durchführung des Tests zurückführen.
Alles in allem zeigt dieser Versuch anschaulich, was bei der Veränderung der
verschiedenen Parameter während des Enzymtests passiert. So hat eine Erhöhung
der Enzymkonzentration einen stärkeren Umsatz der vorhandenen Substratmoleküle
zum Produkt zur Folge, was sich in der stärkeren Steigung der Extinktionsänderung
pro Minute erkennen lässt. Eine Verringerung der Enzymkonzentration hat daher
eine Abflachung der Steigung zur Folge, da das Einzelenzym zwar seine
Geschwindigkeit beibehält, sich Enzym- und Substratmolekül jedoch mit einer
geringeren Wahrscheinlichkeit begegnen. Auch die Veränderung der
Substratkonzentration hat Einfluss auf Produktzunahme und damit der Steigung der
Geraden. So hat viel Substrat eine starke Steigung zur Folge, da sich Enzym- und
Substratmoleküle häufig begegnen. Ist jedoch ein bestimmter Punkt erreicht, die sog.
Sättigung, kann selbst durch Anheben der Substratkonzentration die
Geschwindigkeit der Reaktion nicht gesteigert werden, da alle Enzymmoleküle als
Enzym-Substrat-Komplexe vorliegen und erst durch die Produktfreigabe wieder in
freies Enzym und Produkt zerfallen müssen, bevor weitere Substratmoleküle
umgesetzt werden können. Sehr wenig Substrat hat nicht nur eine flache Steigung
zur Folge, da sich Enzym- und Substratmolekül nur noch mit einer sehr geringen
Wahrscheinlichkeit begegnen, sondern auch, dass die Produktzunahme nicht mehr
linear erfolgt. Enzym und Substrat begegnen sich dann nur noch so selten, dass
nicht von einer kontinuierlichen Produktzunahme ausgegangen werden kann.
2. Versuch B - Substrat-/Coenzymspezifität
Im zweiten Versuchsteil wurde die Substrat- bzw. die Coenzymspezifität der
Alkoholdehydrogenase untersucht.
Die Substratspezifität wurde untersucht, indem der ADH statt Ethanol alternative
Substrate zur Verfügung gestellt und die Aktivitäten während deren Umsetzung
verglichen wurden. Die Akzeptanz der ADH gegenüber den alternativen Substraten
lässt Rückschlüsse über die Bindetasche der ADH aber auch die von statten
50
gehenden Wechselwirkungen der ADH mit dem Substrat zu. Wie bereits erwähnt
bindet ein Enzym das Substrat über Wechselwirkungen der Seitenketten seiner
Aminosäuren im aktiven Zentrum. Werden verschiedene Substrate durch ein Enzym
angenommen, kann anhand struktureller Vergleiche dieser Substrate Auskunft über
das Enzym gewonnen werden. Die hier getesteten Alkohole bzw. die
Volumenaktivität während ihrer Umsetzung zeigen, dass nur strukturell ähnliche
Substrate von der ADH erkannt und prozessiert werden (Tab. 6). Das native Substrat
der ADH ist Ethanol, eine Kohlenstoffkette mit zwei Kohlenstoffatomen und einer
endständigen OH-Gruppe. Wurde der ADH Ethanol als Substrat angeboten, zeigte
sie die höchsten Aktivitäten, die dann willkürlich als 100 % angenommen wurden.
Nach Ethanol werden eigentlich nur 1-Propanol (mit 41,1 % relative
Reaktionsgeschwindigkeit) und 1-Butanol (mit 24,35 % relative
Reaktionsgeschwindigkeit) einigermaßen vom Enzym angenommen. Bei 1-Propanol
handelt es sich um eine Kohlenstoffkette mit drei Kohlenstoffatomen und einer
endständigen OH-Gruppe, 1-Butanol weist ein Kohlenstoffatom mehr auf, trägt seine
OH-Gruppe jedoch ebenfalls am C1-Atom. Erstaunlich ist, das Methanol, ein
einzelnes Kohlenstoffatom mit einer OH-Gruppe, nicht von der ADH angenommen
wird. All diese Ergebnisse lassen die Überlegung zu, dass das Substrat der ADH
zum einen eine gewisse länge (ein Kohlenstoffatom ist zu kurz, alles über 4 wird so
gut wie gar nicht erkannt), zum anderen die OH-Gruppe an dem endständigen C1Atom aufweisen muss. Diese Einschränkungen lassen wiederum Spekulationen über
die Bindetasche und die Wechselwirkungen der ADH zu. Die Wechselwirkung mit
dem Substrat könnte über die OH-Gruppe stattfinden, weshalb es wichtig ist, dass
diese endständig vorliegt. Die Größe der Bindetasche scheint eher klein zu sein, da
nur Kohlenstoffketten im Rahmen von zwei bis maximal vier C-Atomen vernünftig
erkannt werden. Gleichzeitig scheint die Bindetasche eine gewisse Größe des
Substrats vorauszusetzen, weshalb das kleine Methanol gar nicht als Substrat
erkannt wird. Ethanolamin trägt eine endständige OH-Gruppe, dennoch weist diese
Reaktion nur eine relative Geschwindigkeit von 1,28 % auf. Dies lässt sich vermutlich
auf die zusätzlich vorhandene Amidgruppe (NH2) zurückführen, die für sterische
Hinderung sorgt. Ethylenglycol weist zwei OH-Gruppen auf. Auch hier ist nur eine
relative Reaktionsgeschwindigkeit von 1,15 % festzustellen. Die zusätzliche OHGruppe scheint für unzulängliche Wechselwirkungen zu sorgen, oder könnte sogar
eine Umsetzung dieses Substrates durch sterische Hinderung ganz verbieten.
51
Hydroxyessigsäure ist eher als eine Säure mit zusätzlicher OH-Gruppe als ein
Alkohol anzusehen, und wird daher von der ADH nicht umgesetzt.
Die Coenzymspezifität der ADH wurde anhand des Austauschs von NAD mit NADP
überprüft. Dieses alternative Coenzym wurde in der gleichen Konzentration und
Molarität der ADH angeboten. Die relative Reaktionsgeschwindigkeit von 2,19 %
zeigt jedoch, dass NADP durch die ADH nicht als Coenzym genutzt werden kann.
Hier scheint der zusätzliche Phosphat-Rest den Ausschlag zu geben, weshalb NADP
als Coenzym für die ADH unbrauchbar ist. Eventuell besteht auch ein
Redoxpotential-Unterschied zwischen NAD und NADP weshalb der Elektronenfluss
gestört und die Reaktion verhindert ist.
Alles in allem weist die ADH eine relativ starke Substrat- und Coenzymspezifität auf,
weshalb die Reaktion nur mit maximaler Geschwindigkeit abläuft, wenn das native
Substrat und das native Coenzym zur Verfügung stehen.
3. Versuch C - km-Wert Bestimmung für Ethanol und NAD+
Im dritten Teil des Versuches wurde die Bestimmung der enzymatischen Parameter
Vmax und km vorgenommen. Vmax beschreibt die Maximalgeschwindigkeit auftretend
bei Substratsättigung. Km wiederum ist die Substratkonzentration bei der
halbmaximale Geschwindigkeit erreicht ist.
Zunächst wurde die Bestimmung durch Variation der Substratkonzentration
angestrebt. Die hier erhaltenen Ergebnisse (Tab. 8) wurden anschließend nach
Michaelis-Menten, Lineweaver-Burk und Hanes aufgetragen. Die Bestimmung der
Parameter durch Variation der Coenzymkonzentration verliefen in ähnlicher Weise.
Auch die hier erhaltenen Ergebnisse (Tab. 9) wurden anschließend nach MichaelisMenten, Lineweaver-Burk und Hanes aufgetragen.
Zunächst sei erwähnt, dass die Auftragung nach Michaelis-Menten für beide
Verfahrensweisen durchaus durchgeführt wurde (Vergl. Abb. 17 und Abb. 20). Die
Bestimmung der enzymatischen Parameter anhand dieser Auftragung ist jedoch
nicht ohne weiteres möglich. Die typischerweise bei der Michaelis-Menten
52
Auftragung erhaltene hyperbole Kurve nähert sich asymptotisch dem
Sättigungsbereich und damit der Maximalgeschwindigkeit Vmax. Durch dieses
langsame Nähern ist ein einfaches Ablesen von Vmax nicht ohne weiteres möglich
und selbst kleine Ungenauigkeiten könnten einen großen Effekt auf das Endergebnis
haben. Die Michaelis-Menten Darstellung ermöglicht das Abschätzen, ob einzelne
Werte aus dem Rahmen fallen, und diese ggf. wiederholt werden müssen. Die
Berechnungen der Enzymparameter wurden dann anhand der Darstellung nach
Lineweaver-Burk und Hanes vollzogen.
Für die Bestimmung der Enzymatischen Parameter Vmax und km ergab sich bei der
Variation der Substratkonzentration folgende Ergebnisse: Die Auftragung nach
Lineweaver-Burk liefert für Vmax den Wert 14285,71 µMol/min und km 10 mM. Die
Auftragung nach Hanes wiederum ergibt einen Wert von 8571 µmol/min für Vmax und
0,429 mM für km. Diese doch sehr unterschiedlichen Werte lassen sich auf
Messfehler zurückführen. So machen schon minimale Pipetierfehler beim Ansetzen
der Substrat-Verdünnungen einen großen Effekt auf die späteren Ergebnisse aus. Im
Vergleich mit anderen Messwerten spricht hier eher das Ergebnis der LineweaverBurk Auftragung für Richtigkeit, da ein Vmax um 15000 µmol/min deutlich häufiger
erhalten wurde, als ein Vmax von 8000 µmol/min, wie es bei Hanes der Fall wäre.
Die Variation der Coenzym-Konzentration brachte im Bezug auf die enzymatischen
Parameter folgendes Ergebnis: Die Auftragung nach Lineweaver-Burk brachte für
Vmax den Wert 16666,67 µmol/min und 0,6667 mM für km. Die Auftragung nach
Hanes lieferte den gleichen Wert für Vmax nämlich 16666,67 µmol/min, jedoch einen
etwas anderen für km, dieser betrug 0,8333 mM. Welcher der hier erhaltenen Werte
für km eher dem tatsächlichen Wert entspricht ist schlecht auszumachen, da der
Unterschied nicht signifikant genug ist, um einen eindeutigen Fehler festmachen zu
können.
Die z.T. zueinander sehr unterschiedlichen Ergebnise für Vmax und km bei der
Auftragung nach Lineweaver-Burk im Vergleich zur Auftragung nach Hanes zeigen,
dass auch diese Darstellungs-Wege Fehlerquellen besitzen. So handelt es sich bei
der Lineweaver-Burk Darstellung wie erwähnt um die doppelt-reziproke Auftragung
der Michaelis-Menten Darstellung. Diese reziproke Auftragung bietet zwei
Fehlerquellen, zum einen werden die Messpunkte im vorderen Teil der Geraden sehr
stark gestaucht was das Erkennen der einzelnen Messpunkte erschwert. Zum
53
anderen ist das Ende der Geraden eine deutliche Fehlerquelle. Hier sind, durch die
reziproke Auftragung, die kleinen Substratkonzentrationen zu finden. Da diese
häufiger Fehlern beim Pipetieren unterlegen sind, können vor allem im hinteren
Bereich der Geraden sehr große Ungenauigkeiten auftreten. Zusammengenommen
egal ob im vorderen Teil oder im hinteren Teil, sobald kleine Abweichungen
auftreten, verändert dies die Steigung der Geraden dramatisch und damit auch die
Werte für Vmax und km. Die Auftragung nach Hanes ist nicht reziprok, weshalb hier
keine Stauchung der Messpunkte stattfindet, dennoch sind hier andere Fehlerquellen
zu erwarten. So geht die Substratkonzentration in beide Achsen ein. Dies bedeutet,
sobald Pipetierfehler aufgetreten sind, sind die Fehler in beiden Achsen zu finden
und liefern ebenfalls ungenaue Ergebnisse.
Generell lässt sich über die Ermittlung der enzymatischen Parameter Vmax und km
sagen, dass ein genaues und möglichst fehlerfreies arbeiten unabdingbar sind, um
vertrauenswürdige Ergebnisse zu erzielen.
So geht z.B. der für Vmax ermittelte Wert auch in die Bestimmung der Wechselzahl
mit ein. Hierzu wurde für Vmax das zweimal erzielte Ergebnis 16666,67 µmol/minml
gewählt, da dies als hinlänglich zutreffend anzusehen ist. Die Wechselzahl der
Alkoholdehydrogenase betrug 330 Substratmoleküle pro Sekunde in einem Liter.
4. Versuch D - Reversible/irreversible Hemmung
Im vierten Versuch sollte die Art der Hemmung - reversibel oder irreversibel - zweier
Inhibitoren ermittelt werden. Bei der reversiblen Hemmung bindet der Inhibitor an das
Enzym oder den Enzym-Substrat-Komplex, jedoch nur so, dass er sich wieder
ablösen lässt, die Hemmung also umkehrbar ist. Bei der irreversiblen Hemmung
bindet der Inhibitor unwiderruflich an das Enzym, sodass dieses nicht mehr
katalytisch aktiv sein kann.
Untersucht wurden die Inhibitoren Hydroxylamin und 1,10-Phenantrolin-Hydrochlorid.
Diese wurden nach ca. 1 Minute normalem Reaktionsverlauf dem Reaktionsgemisch
zugeführt. Nach Aufnahme der Steigung über einen Zeitraum von 2-3 Minuten
hinweg wurde 8,5 M Ethanol dem Ansatz beigemischt, und die Reaktion beobachtet.
54
Anschließend wurde die Produkt-Zunahme beider Inhibitor-Ansätze mit der
ungehemmten Kontrolle verglichen (Abb. 23). Es ist deutlich zu erkennen, dass die
Extinktionsänderung pro Minute beim Hydroxylamin-Ansatz nach Zugabe des
Ethanols wieder deutlich zunahm, dies jedoch nicht beim 1,10-PhenantrolinHydrochlorid-Ansatz tat, wo die Steigung eher konstant blieb, wenn nicht sogar
abnahm.
Anhand dieses Ergebnisses lässt sich darauf schließen, dass es sich bei
Hydroxylamin um einen reversiblen Inhibitor, bei 1,10-Phenantrolin-Hydrochlorid um
einen irreversiblen Inhibitor handelt.
5. Versuch E - Bestimmung des Hemmtyps von verschiedenen Hemmstoffen
Der vorletzte Teil des Versuches drehte sich um die Bestimmung des Hemmtyps des
Inhibitors Hydroxylamin. Hierzu wurden die Parameter Vmax sowie km bei
unterschiedlichen Substratkonzentrationen bestimmt, zum einen unter Abwesenheit,
zum anderen unter Anwesenheit zweier verschiedener Inhibitor-Konzentrationen (1
mM und 4 mM). Die hier erzielten Ergebnisse (Tab. 12, 13 und 14) wurden
anschließend nach Michaelis-Menten, Lineweaver-Burk und Hanes aufgetragen, um
so eine mögliche Aussage über den Hemmtyp treffen zu können.
Der Vergleich der für die enzymatischen Parameter ermittelten Werte zeigt, dass bei
der Auftragung nach Lineweaver-Burk die Werte für Vmax und km bei steigender
Inhibitor-Konzentration auf den ersten Blick steigen. Bei Betrachtung der graphischen
Auftragung (Abb. 25) sieht es jedoch so aus, als ob der Schnittpunkt mit der y-Achse,
der den reziproken Wert für die Maximalgeschwindigkeit (also 1/Vmax) charakterisiert,
konstant bleibt, und sich höchstens minimal unterscheidet. Letzteres würde für das
konstant-bleiben von Vmax sprechen. Dies ist bei der Auftragung nach Hanes
ebenfalls zu beobachten, hier bleibt der Wert für Vmax konstant, nur der für km
ermittelte Wert steigt bei höherer Inhibitor-Konzentration.
Wird nun davon ausgegangen, dass Vmax konstant bleibt, und km steigt, so handelt es
sich bei diesem Typ der Hemmung um eine kompetitive Hemmung.
55
Bei der kompetitiven Hemmung konkurrieren Inhibitor und Substrat um das aktive
Zentrum des Enzyms. Da nun mehr Enzym notwendig ist, um alle Enzym-SubstratKompexe zu sättigen steigt der Wert für km, der Wert für Vmax bleibt jedoch konstant.
6. Versuch F - Bestimmung der ADH-Aktivität in zellfreien Extrakten
Im letzten Teil der Versuchsreihe sollte die ADH-Aktivität in zellfreien Extrakten von
sieben Saccharomyces cerevisiae Stämmen bestimmt werden. Diese Stämme
wiesen unterschiedliche Mutationen innerhalb der drei Isoformen der
Alkoholdehydrogenase - ADH1, ADH2 bzw. ADH3 - auf (Tab. 17). Die Bestimmung
dieser Aktivitäten bzw. auch vorangehend der Proteinkonzentration war nur
unzulänglich möglich, da aufgrund vorhergegangenem Einfrieren der Proben ein
Großteil der ADH bereits unbrauchbar geworden war. Die hier gewonnenen Werte für
Proteinkonzentration und Volumen- bzw. spezifische Aktivität (Tab. 18) sind sehr
niedrig und liefern zudem z.T. noch widersprüchliche Ergebnisse. Es können zwar
grob Tendenzen erkannt werden, dennoch wird im folgenden auf gestellte
Ergebnisse des letztjährigen Kurses eingegangen, die im Anhang zu finden sind.
Grundsätzlich sei zu den drei Isoformen gesagt, dass alle drei die Hin- und
Rückreaktion, d.h. die Oxidation von Ethanol, aber auch die Oxidation von
Acetaldehyd katalysieren. Die ADH1 stellt das Hauptenzym dar und hat daher die
höchste Aktivität. Der ADH2 zeigt eine etwas geringere Aktivität, sie ist jedoch unter
Glucose-Anwesenheit reprimiert und wird nur beim Vorhandensein von Ethanol
aktiviert. Die ADH3 weist die geringste Aktivität auf und ist in den Mitochondrien
lokalisiert.
Mit diesem Wissen werden nun die spezifischen Aktivitäten des Wildtyps und der
unterschiedlichen Mutanten verglichen und auf zutreffende Ergebnisse hin
untersucht.
So weist der Wildtyp, angezogen auf YEPD eine spezifische Aktivität von 2,58
µmol/minmg auf und dient quasi als Referenz für die Mutanten, die auf diesem
Medium angezogen wurden. So lässt sich anhand dieses Wertes die Aktivität der
einzelnen ADH-Isoformen ermitteln. So weist die Mutante K1732 auf YEPD
56
angezogen eine spezifische Aktivität von 0,2 µmol/minmg auf, was der reinen
Aktivität der ADH3 entspricht, da die diese Mutante eine Deletion in den Genen der
ADH1 und der ADH2 aufweist.
Die Mutante K4161 weist keine spezifische Aktivität auf, wenn sie auf YEPD-Medium
angezogen wurde. Dies ist mit dem Wissen, dass die ADH2, die einzige funktionelle
ADH-Isoform die diese Mutante besitzt ist, mehr als nachvollziehbar. Auf YEPE/GlyMedium weist diese Mutante eine spezifische Aktivität von 0,84 µmol/minmg auf, was
somit der reinen Aktivität der ADH2 entspricht.
Die Mutante K3844 zeigt, auf YEPD-Medium angezogen, eine spezifische Aktivität
von 2,54 µmol/minmg. Dies entspricht der reinen Aktivität der ADH1, da diese
Mutante Deletionen in den Genen der ADH-Isoformen 2 und 3 besitzt.
Werden diese Aktivitäten nun zusammengenomme, so sollte der Wildtyp auf YEPDMedium eine spezifische Aktivität von ca. 2,74 µmol/minmg zusammengenommen
aus den Aktivitäten der ADH-Isoformen 1 und 3 (ADH2 ist bekanntlich unter GlucoseAnwesenheit reprimiert). Auf YEPE/Gly angezogen sollte der Wildtyp demnach eine
Aktivität von 3,58 µmol/minmg zeigen, zusammengesetzt aus den Aktivitäten aller
drei Isoformen. Dies ist jedoch augenscheinlich nicht der Fall, da der Wildtyp bei
diesem Ergebnis (siehe Anhang) angezogen auf YEPE/Gly eine Aktivität von nur
1,58 µmol/minmg zeigt.
Auch die Aktivitäten der Mutanten untereinander kann auf diese Weise verglichen
werden. So weist die Mutante K1649 auf YEPD-Medium eine Aktivität von 0,11
µmol/minmg und auf YEPE/Gly-Medium eine Aktivität von 0,85 µmol/minmg auf.
Erstere sollte sich aus der Aktivität der ADH3 ergeben, da die ADH1 bei dieser
Mutante deletiert, und die ADH2 reprimiert ist. Dies kommt auch ungefähr mit dem
aus der ADH1/2-Mutante gewonnenen Ergebnis von 0,2 µmol/minmg Aktivität für die
ADH3 hin. Die Aktivität auf dem YEPE/Gly-Medium setzt sich zusammen aus der
Aktivität der ADH2 sowie der ADH3. Dieses Ergebnis stimmt absolut mit dem bereits
gewonnenen Wert von 0,84 µmol/minmg Aktivität für die ADH3 überein.
Die Mutante K1659 weist auf YEPD-Medium eine Aktivität von 1,45 µmol/minmg, auf
YEPE/Gly-Medium eine Aktivität von 0,96 µmol/minmg auf. Auf beiden Medien
entspricht dies der zusammengenommen Aktivität der ADH-Isoformen 1 und 3. Diese
Ergebnisse weichen doch stark von der erwarteten Aktivität von 2,74 µmol/minmg
57
ab. Erklärbar könnte dies durch mögliche Pipetierfehler beim Erstellen des Ansatzes
für den Enzymtest sein, oder aber durch Fehler beim Verdünnen des Rohextraktes.
Genau kann dies jedoch nicht mit Sicherheit gesagt werden, da dies, wie schon
erwähnt, die Ergebnisse des Kurses vom letzten Jahr darstellen.
Die Mutante K364 weist auf YEPD-Medium eine Aktivität von 2,94 µmol/minmg, und
auf YEPE/Gly-Medium eine Aktivität von 1,63 µmol/minmg auf. Ersteres nur der
Aktivität der ADH1, da die ADH2 unter Glucose-Anwesenheit reprimiert ist. Dies
kommt annähernd mit dem bereits ermittelten Wert von 2,54 µmol/minmg hin. Die
Aktivität auf YEPE/Gly-Medium entspricht den zusammengenommenen Aktivitäten
der ADH1 und ADH2, da letztere nun aktiviert ist. Verwunderlich ist, dass dieses
Ergebnis doch deutlich vom eigentlich ermittelten Wert - 3,38 µmol/minmg abweicht. Auch hier lassen sich nur Pipetierfehler oder Verdünnungsfehler vermuten,
genau belegen lassen sich diese nicht.
Alles in allem weisen die Ergebnisse jedoch eine deutliche Korrelation zu einander
auf, und veranschaulichen auf diesem Weg die Bedeutung der einzelnen ADHIsoformen.
So mag es sein, dass die ADH1 das Hauptenzym ist, dennoch ist auch die Aktivität
der ADH3 nicht zu vernachlässigen. Vor allem die ADH2, die einzig bei
Vorhandensein von Ethanol aktiviert wird, kann einer besonderen Bedeutung
zugemessen werden. Denn auch wenn S. cerevisiae selbst Ethanol durch
Fermentation erzeugt, sind auch für sie hohe Ethanol-Konzentrationen toxisch und
müssen minimiert werden.
Dieser Versuch zeigte sehr anschaulich die Effekte verschiedener Mutationen auf die
Enzymaktivität.
V. Quellen
 Skript „Biochemisches Praktikum im Hauptstudium"
 David Nelson, Michael Fox, Lehninger Biochemie, 3. Auflage, Springer Verlag,
Berlin Heidelberg, 2001/2005
58
VI.
Anhang
 Ergebnisse der ADH-Aktivitätsbestimmung zellfreier Extrakte vom letzten Jahr
(Versuch F)
59