2.3 Methoden

Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
1.1 Das Herz
1.2 Entwicklung des Herzen
1.3 Einteilung der angeborenen Herzfehler
1.4 Ätiologie
1.5 Häufigkeit und Wiederholungsrisiko der Herzfehler
1.6 Methoden der Untersuchung chr. Veränderungen
1.6.1 Entwicklung von Array CGH
1.6.2 Vergleich Array CGH und mol.-cyt. Methoden
1
1
2
2
5
7
8
8
12
1.7 Ziel der Diplomarbeit
13
2 Material und Methoden
14
14
16
17
17
19
19
21
22
24
25
25
27
28
30
30
30
30
31
33
34
34
35
37
38
38
39
40
2.1 Chemikalien
2.2 Geräte und Software
2.3 Methoden
2.3.1 Array CGH
2.3.2 Präparation der BAC/PAC Klone
2.3.2.1 Ampl. der Klon-Inserts mittels Linker Adapter PCR
2.3.2.2 Ligation
2.3.2.3 Ligation vermittelte PCR 1
2.3.2.4 PCR 2
2.3.2.5 Agarosegelelektrophorese zur Kontrolle der PCR Produkte
2.3.2.6 Ethanolpräzipitation der DNA
2.3.3 Produktion der DNA Arrays
2.3.4 Patienten DNA
2.3.5 DNA Isolierung
2.3.6 DNA Sonification
2.3.7 Agarosegelelektroph. zur Kontrolle der sonific. Proben
2.3.8 DNA Aufreinigung
2.3.9 Labelling
2.3.10 Proben Aufreinigung
2.3.11 DNA Fällung
2.3.12 Slidebehandlung
2.3.13 Hybridisierung
2.3.14 Waschen der Slides
2.3.15 Auswertung
2.3.15.1 Scannen der Slides
2.3.15.2 Bildverarbeitung
2.3.15.3 Datenverarbeitung
3 Ergebnisse
43
4 Diskussion
65
5 Literaturverzeichnis
69
6 Anhang
Hybridisierungsergebnisse (Übersicht)
Danksagung
Eidesstattliche Erklärung
75
76-94
95
96
1
1. Einleitung
1.1 Das Herz
Das Herz (Abb.1) dient als Pumpe für das Blut und die darin gelösten Nährund Abfallstoffe. Das Herz setzt sich aus zwei Hälften zusammen, welche in Vorhof
(Atrium) und Hauptkammer (Ventrikel) unterteilt sind; diese vier Kammern arbeiten
in einem fein abgestimmten Rhythmus. Die zwei Vorhöfe (rechtes und linkes Atrium)
nehmen das Blut auf und Pumpen es zu den zwei Hauptkammern (rechtes und linkes
Ventrikel). Klappen zwischen den Vorhöfen und Hauptkammern (AV-Klappen; auf
der linken Seite Mitralklappe, auf der rechten Seite Trikuspidalklappe) wirken als
Ventile und stellen sicher, daß das Blut nur in Richtung Hauptkammer und nicht
zurück in den Vorhof fließt. Aus der linken Hauptkammer gelangt das Blut durch die
Aortenklappe in die Körperschlagader (Aorta). Aus der rechten Hauptkammer wird
das Blut durch die Pulmonalklappe in die Lungenschlagader (Arteria Pulmonalis)
gepumpt. Die AV-Klappen zwischen Vorhöfen und Kammern bestehen aus feinen
Segeln, welche von Papillarmuskeln in den Hauptkammern gehalten und bewegt
werden. Die Klappen in den Arterien (Aortenklappe und Pulmonalklappe) bestehen
aus Taschen, die sich passiv durch das von den Kammern gepumpte Blut öffnen. Fällt
der Druck in den Hauptkammern wieder ab, so bläht die zurückfallende Blutsäule in
den Arterien die Taschen auf und verschließt damit den Klappenapparat.
Abbildung 1 Herzaufbau (Wort und Bild Verlag GmbH und Co http://www.gesundheitpro.de)
2
1.2 Entwicklung des Herzen
Die Entwicklung des Herzen beginnt am 12 Tag nach der Befruchtung und
erfolgt während der ersten neun Schwangerschaftswochen. Das Herz entwickelt sich
aus einer kleinen Zellgruppe im oberen Abschnitt des Brustraumes. Diese Zellen
gruppieren sich weiter zu zwei seitlich im Embryo gelegenen dünnen Kanälen, welche
sich schließlich in der Mitte des Körpers zum Herzschlauch vereinigen. Da dieser
Schlauch in der Länge sehr viel schneller wächst als der übrige Embryo, dreht und
windet er sich schließlich um sich selbst und bildet die Form eines „S’’. Verläuft
diese Drehung unvollständig oder falsch herum, kann dies zu Herzfehlern führen. Es
bilden sich weiterhin Ausbuchtungen, aus denen sich die Kammern entwickeln.
Zwischen diesen Ausbuchtungen liegen Einengungen und Zellnester, aus denen sich
die Klappen formen. Schließlich entwickeln sich die Trennwände, die Septen. Sie
trennen nicht
nur die Kammern voneinander, sondern auch
Aorta und
Lungenschlagader. Störungen dieser fetalen Herzentwicklung sind die Ursache der
angeborenen Herzfehler (1, 2).
1.3 Einteilung der angeborenen Herzfehler
Die Störung der Entwicklung in der sensiblen Phase der Schwangerschaft (1.
und 2. Schwangerschaftsmonat) kann zu Fehlbildungen am Herzgefäßsystem führen.
In 75-82% der Fälle treten die Herzfehlbildungen isoliert auf, ansonsten sind sie mit
zusätzlichen extrakardialen Fehlbildungen kombiniert (2).
Es gibt eine Vielfalt anatomisch bzw. morphologisch verschiedener
Herzfehler, deren Klassifikation zum Teil sehr schwer ist (3). Im Rahmen dieser
Arbeit wird nur eine sehr vereinfachte Einteilung dargestellt.
3
Drei Grundstörungen können auftreten (Linus Geisler: INNERE MEDIZIN © 1969/1999 ):
• Es bestehen abnorme Verbindungen zwischen kleinem und großem Kreislauf (z.B.
Vorhof- oder Kammerseptumdefekt, offener Ductus Botalli).
• Es entstehen Stenosen (z.B. Pulmonalstenose, Aortenisthmusstenose).
• Es liegt eine Transposition, d.h. eine Verlagerung der großen Gefäße vor (z.B.
Abgang der Aorta aus der rechten, der Arteria pulmonalis aus der linken Herzkammer).
Die oben genannten
Störungen können sowohl einzeln als auch in
Kombination auftreten. Die am häufigsten auftretenden Herzfehler sind in der
Abbildung 2 dargestellt.
Abbildung 2 . Angeborene Herzfehler (Linus Geisler: INNERE MEDIZIN © 1969/1999)
1. Pulmonalstenose:
Bei etwa 7% aller angeborenen Herzfehler tritt eine Verengung der
Pulmonalklappe, der Herzklappe durch die das Blut von der rechten Herzkammer
in Richtung Lunge fließt, auf (Abb.2).
2. Der persistierende (fortbestehende) Ductus Arteriosus Botalli :
Diese Anomalie (Abb.2) tritt bei ca. 10% aller angeborenen Fehlbildungen auf.
Der Ductus arteriosus ist eine Kurzschlussverbindung zwischen Lungenarterie und
dem Anfangsteil der Aorta. Normalerweise bildet sich diese Verbindung nach der
4
Geburt zurück. Falls sie jedoch bestehen bleibt, begünstigt sie den Blutstrom von
der linken (sauerstoffreichen) in die rechte (sauerstoffarme) Herzhälfte (LinksRechts-Shunt), was zur Rechtsherzbelastung führt.
3. Aortenisthmusstenose:
Bei der Aortenisthmusstenose (Abb.2) weist die Aorta am Übergang vom
Aortenbogen bis zu dem in den Körper absteigenden Teil, eine deutliche
Verengung auf. Diese Verengung führt zu Stauung des Blutes bei jedem Auswurf
aus dem Herzen (Systole) und zur Behinderung des Blutflusses vor und hinter der
Stauung.
4. Vorhofseptumdefekt:
Die Vorhofscheidewand (Abb.2) besteht beim Fötus und beim Neugeborenen aus
zwei Gewebslappen, die bald von den Seiten aufeinander zuwachsen und sich
übereinander legen. Hierbei kommt es jedoch manchmal nicht zu einem
vollständigen Verschluß und Verwachsen der Vorhofscheidewand.
5. Ventrikelseptumdefekt:
Der Ventrikelseptumdefekt (Abb.2) ist mit 30% der am häufigsten
vorkommende angeborene Herzfehler. Beim Ventrikelseptumdefekt handelt es
sich um einen Defekt (Loch) in der Kammerscheidewand. Dieser Defekt
verursacht das Austreten des Blutes aus der linken in die rechte Herzhälfte.
6. Fallotsche Tetralogie:
Die angeborenen Herzfehler mit Rechts-Links-Shunt (Vermischung des
sauerstoffarmen mit dem sauerstoffreichen Blut im Körperkreislauf) wurden
erstmals 1888 von dem französischen Arzt FALLOT ausführlich beschrieben,
weshalb sie unter dem Sammelbegriff Fallot-Syndrom zusammengefaßt werden.
Je nachdem, ob sich 3, 4 oder 5 Fehler kombinieren, spricht man von Fallotscher
Trilogie, Tetralogie (Abb.2) bzw. Pentalogie. Zwei immer vorhandene Fehler
werden mit zwei anderen kombiniert. Die Kombination besteht immer aus einer
Pulmonalstenose und einer Wandverdickung der rechten Herzkammer. Diese
Fehler können mit einem Vorhofseptumdefekt, einem Kammerseptumdefekt oder
einer Aorta assoziiert sein, die nach rechts verlagert ist und über dem
Kammerseptum "reitet" (reitende Aorta) und dabei Blut aus beiden Kammern
bekommt. (Linus Geisler: INNERE MEDIZIN © 1969/1999)
5
1.4 Ätiologie
Die Ätiologie ist sehr vielfältig und reicht von umweltbedingten Störungen
(ca. 3%) über genetische Defekte (10%) bis zu Kombination dieser zwei Faktoren
bei etwa 87% aller Herzgefäßfehlbildungen (3).
Bei
genetisch bedingten Herzfehlern unterscheidet man zwischen
chromosomalen Anomalien (Tab.1), welche bei 4-13% aller Patienten mit
angeborenen Herzfehlern (AHF) z. B. Trisomie 21 auftreten (5) und den
polygenetischen Defekten (Tab.2), welche bei 3-4,6% aller Patienten mit AHF (5),
Nora 1983) assoziiert sind, wobei hier vor allem die Deletion 22q11 bzw. Di-GeorgeSyndrom (Scambler 1999), das Marfan-, das Noonan-Syndrom und das autosomaldominant vererbbare familiäre Vorhofseptumdefekt (Chromosom 5p, Bonnet et al.
1999) zu nennen sind.
Umweltbedingte Ursachen (Tab. 3) sind z.B. Medikamente (Antiepileptika
wie Diphenylhydantoin), Chemikalien, Strahlenexposition, bakterielle und virale
Infektionen
(Rötelnvirus)
während
der
Schwangerschaft
oder
Stoffwechselerkrankungen der Mutter, v.a. ein Diabetes mellitus, wobei sich hier das
Risiko einer Fehlbildung sogar vervierfachen kann.
Tabelle 1. Chromosomale Anomalien und prozentuale Häufigkeit angeborener Herzfehlern (AHF)
(Lewin, Martin A.G. 1994).
Chrom. Anomalie
Patienten mit AHF
Trisomie 13
90%
Trisomie 18
90-99%
Trisomie 21
50%
Trisomie 22
75%
Partielle Trisomie 22
50%
47 XXY
50%
XO-Turner Syndrom
40%
4p-Wolf-Syndrom
60%
5p-Cri-du-chat-Syndrom
15%
8p-Deletion
75%
6
Tabelle 2. Genetische Syndrome und prozentuale Häufigkeit AHF (Lewin, Martin A.G. 1994).
Single Gen Syndrom
Marfan Syndrom 15q 5.23
Williams-Beuren Syndrom 7q11.23
Noonan-Syndrom 12q24.1
Kartagener Syndrom 5p15-p14
Patienten mit AHF
60-80%
75-100%
50%
100%
Mikrodelet. 20p11-12
85%
Deletion 22q11 Di-GeorgeSyndrom
90%
Holt-Oram-Syndrom 12q24.1
100%
Tabelle 3. Umweltbedingte Ursachen und prozentuale Häufigkeit AHF (Lewin, Martin A.G. 1994).
Umweltbedingte Störungen
Patienten mit AHF
Rötelnembryopathie
35-50%
Trimethadionembryopathie
15-30%
Fetale Alkoholembryopathie
25-55%
Phenylketonurie bei Mutter
25-30%
Isoretinoidembryopathie
Diabetische Embryopathie
25%
3-5%
1.5 Häufigkeit und Wiederholungsrisiko der Herzfehler
Von 1000 lebend geborenen Kindern sind im Mittel 8-10 (5) mit einer
angeborenen Herzgefäßmissbildung belastet. In Deutschland kommen 7000-8000
neugeborene Kinder pro Jahr mit einem Herzfehler zur Welt (3).
Für das Auftreten einer Herzgefäßmissbildung spielt, abgesehen von
genetischen Defekten und Umweltfaktoren, die familiäre Belastung eine wichtige
Rolle. So z.B. steigt die Wahrscheinlichkeit für das Auftreten eines angeborenen
Herzfehlers von 0,8 auf bis zu 4% beim Vorliegen eines elterlichen oder
7
geschwisterlichen Herzfehlers.
Sind zwei Geschwister betroffen erhöht sich die
Wahrscheinlichkeit einer Herzgefäßmissbildung schon auf 10%. (2, 4)
1.6 Methoden der Untersuchung von Chromosomenveränderungen
1.6.1
Entwicklung von Array CGH
Die Methode der komparativen genomischen Hybridisierung (CGH), die erstmals im
Jahre 1992 vorgestellt wurde (6) erlaubt eine schnelle und umfassende Analyse eines
Genoms auf über- und unterrepräsentierte DNA-Abschnitte . Bei der CGH wird die
genomische DNA des zu untersuchenden Patienten Test-DNA mit einer ReferenzDNA eines gesunden Spenders verglichen und das Verhältnis der DNA-Kopienzahl
für die einzelnen chromosomalen Regionen ermittelt. Test- und Referenz-DNA
werden mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert, zu gleichen Teilen
gemischt
und
mit
einem
Überschuß
an
Cot-DNA
auf
normalen
Metaphasenchromosomen hybridisiert. Die Zugabe von Cot-DNA dient der
Supression von hochrepetitiven Sequenzen, welche zum Eingehen der unspezifischen
Bindungen neigen (Abb. 3 )
Abbildung 3. Prinzip der konventionellen CGH (mit freundlicher Genehmigung von Dr. R. Ullmann)
Test
und Referenz-DNA konkurrieren um homologe Bindungsstellen auf den
Chromosomen. Ist eine Sequenz in der Test DNA unterrepräsentiert, so bindet die
Referenz-DNA in Relation häufiger an den homologen Chromosomenabschnitt. Die
Farbe der Referenz-DNA dominiert deshalb in dieser chromosomalen Region. Ist eine
Sequenz in der Test DNA überrepräsentiert, dann erfolgt überwiegend die Test-DNA
8
Bindung an den homologen Chromosomenabschnitt, die Farbe der Test-DNA wird
dominieren.
Anhand eines Lungentumors zeigt (Abb.4) wie sich das Hybridisierungsergebnis im
Fluoreszenzmikroskop darstellt. Gewinne werden als grüne Balken rechts der
Chromosomenidiograme, Verluste links davon gezeigt. Der Karyotyp, üblicherweise
eine
Zusammenfassung
von
5-8
untersuchten
Metaphasen,
kann
mittels
Spezialsoftware dargestellt werden (Abb.5)
Abbildung 4. Chromosomen einer Lungentumor Probe (mit freundlicher Genehmigung von Dr. R.
Ullmann)
Abbildung 5. Chromosomale Aberrationen bei einem Tumor (mit freundlicher Genehmigung von Dr.
R. Ullmann)
Nachteil dieser Methode ist, daß sie aufgrund ihrer Ausrichtung auf Chromosomen
nur limitierte Auflösung liefern kann, je nach Art der Dateninterpretation 3-10Mb (7,
31, 33, 37).
9
Mit dem Fortschreiten der Entwicklung der DNA-Chiptechnologie wurde 1997/1998
eine
massive
Erhöhung
des
Auflösungsvermögens
erreicht.
Die
Metaphasechromosomen, Hybridisierungsziel bei der konventionellen CGH , wurden
durch Arrays von DNA Spots ersetzt, wo jeder Spot (Target) DNA eines bestimmten
chromosomalen Abschnittes entspricht. Von den beiden ursprünglichen Namen dieser
Variante der CGH, Matrix CGH und Array CGH, konnte sich nur letzterer
durchsetzen. (8, 14).
Bei der Array CGH Technologie besteht die Wahl zwischen drei Arten von Targets,
welche entsprechend der Fragestellung eingesetzt werden können: cDNA, Oligos oder
BAC (Bacterial Artificial Chromosome) Fragmente.
Die cDNA Arrays wurden ursprünglich für die Analyse der Genexpression
verwendet und nur wenige Gruppen setzen sie für Array CGH Experimente ein.
Vorteil, und gleichzeitiger Nachteil ist, daß diese Arrays gen-fokusiert sind, da sie
durch reverse Transkription von mRNA und nachfolgender PCR hergestellt werden.
Die Länge der Fragmente, welche auf den Slide gespottet sind, liegt zwischen 0.5kb
und 2.5kb. Rein theoretisch ermöglichen sie daher einen schnellen Vergleich der
Genexpression mit der DNA Kopienzahl, da Genexpressionsanalyse und Array CGH
auf baugleichen Chips durchgeführt werden können. In der Praxis müssen allerdings
zur Reduktion von Signalrauschen oft mehrere cDNA Spots zu einem einzigen
Datenpunkt integriert werden, so daß dieser Vorteil wegfällt.
Für die Oligo Arrays werden synthetische Oligonukleotide mit einer Länge von ca.
20-70 Nukleotide auf eine Glasoberfläche gebracht (35,36). Dies kann auf zwei
Weisen geschehen. Einerseits über photolithographische Masken oder Spiegeltechnik
direkt auf dem Array (http://www.affymetrix.com) andererseits durch Spotten von
synthetischen Oligonukleotiden auf die Slideoberfläche (http://www.amersham.com/,
http://www.home.agilent.com)
Es gibt eine Reihe von Problemen, welche bei der Benutzung von Oligo-Arrays
auftreten können. Es sind vor allem die schwachen Signalintensitäten.
Mit der Abnahme der Nukleotidenlänge steigt die Gefahr der Fehlhybridisierungen.
Das ist besonders bei der Verwendung von sehr kurzen Oligonukleotiden (12-25
Nukleotide) der Fall . Um diese Gefahr bei der Auswertung der Oligo Arrays zu
minimieren wird für jedes perfect-match-Oligonukleotid (PM) ein zweites
sogenanntes mismatch-Oligonukleotid (MM), bei welchem in der Mitte der
Oligonukleotidsequenz eine einzelne Base ausgetauscht ist, auf den Chip aufgebracht.
10
Signale, die an Stellen mit mismatch- Oligonukleotiden auftreten, werden als
unspezifisch definiert und bei der Auswertung mit der PM Signalintensität
verglichen. Durch den Vergleich der Signalintensitäten kann entschieden werden, ob
die Hybridisierung an die PM Sequenz spezifisch ist.
Derzeit am weitesten verbreitet sind Large Insert Clone Arrays.
Die Auflösung von solchen Arrays wird durch die Größe, Zahl und den genomischen
Abstand der DNA-Fragmente bestimmt, welche auf den Slide gespottet werden. Als
Fragmente werden meistens BAC (Bacterial Artificial Chromosom) -Klone verwendet
(Abb.6).
Abbildung 6. BAC mit einem klonierten Insert (mit freundlicher Genehmigung von Dr. R. Ullmann)
BAC Klone beinhalten im Schnitt ~180 kb große Fragmente genomischer DNA (11,
39). Der derzeit am weitesten verbreitete Chip hat eine genomweite Auflösung
von ~ 1 Mb. (9,10, 15,31,40) (16). Dabei das Genom mit Restriktionsenzymen
fragmentiert und anschließend kloniert (Abb. 6) (11). Aus dieser Library selektiert
man dann die Klone mit entsprechenden Inserts.
Die Auflösung
der BAC Arrays kann
durch die Verwendung von Sets sich
überlappender Klone noch deutlich erhöht werden (12, 13,). Solche sogenannte
Tiling Path Arrays erlauben einen Detektion chromosomaler Imbalancen 80kb.
(17,18). Die Klone für den tiling Path (Human BAC Minimal Tiling Set) wurden
vom BACPAC Resources Center
http://bacpac.chori.org/pHumanMinSet.htm
käuflich erworben . Insgesamt handelt es sich dabei um 32,450 BAC Klone. Die
meisten Klone dieses Sets (ca. 30000) stammen von den Rosewell Park Centre
Libraries RPCI-11 und -13 (11). Die anderen ~2000 Klone kommen von einer am
Caltech etablierten Klonbibliothek. (39).
11
In dieser Arbeit wurde ein BAC-Array benutzt, auf welchem 15 Chromosomen mit
1Mb Auflösung und neun Chromosomen (4, 7, 9, 11, 16, 17, 21, 22, X) mit tiling
path Resolution vorhanden sind. Die methodischen Schritte der Array CGH-Analyse
sind in Abbildung 7 dargestellt.
1.6.2 Vergleich
zwischen Array CGH und molekular-cytogenetischen
Methoden
Der Vergleich CGH mit Methoden der klassischen Cytogenetik oder FISH
zeigt einige Vorteile der CGH. Bei der klassischen Cytogenetik werden
Metaphasechromosomen mit Hilfe der unterschiedlichen Bänderungsfärbungen
lichtmikroskopisch
dargestellt
und
analysiert.
Die
spezifische
Chromosomenbänderung erlaubt dann die Identifizierung einzelner Chromosomen.
Die Abweichungen im Bänderungsmuster sind ein Zeichen
für chromosomale
Veränderungen wie Deletionen, Inversionen oder Translokationen. Der Nachteil
dieser Methode gegenüber der CGH liegt in der Notwendigkeit immer teilungsfähige
Zellen für die Gewinnung von Metaphasechromosomen zu haben. Außerdem kann es
schwierig
sein,
Metaphasenspreitung,
aufgrund
einzelne
schlechter
Chromosomenmorphologie
Chromosomen
zu
identifizieren
oder
oder
die
Veränderungen zu erkennen.
Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) erlaubt das Detektieren bestimmter
DNA Sequenzen in einem Zellpräparat. Dabei wird die Sonde
mit einem
Fluoreszenzfarbstoff markiert und auf ein Objektträger mit Zellkernen (InterphaseFISH) oder Chromosomen hybridisiert. Anschließend kann man unter dem
Fluoreszenzmikroskop die Position der Sonde und der gesuchten Zielsequenz
erkennen. Wie bei der klassischen Cytogenetik ist es mit FISH möglich, im Gegensatz
zur CGH, sowohl balancierte als auch unbalancierte Veränderungen zu erkennen. Der
Nachteil der FISH Methode besteht darin, daß vor dem Experiment die Wahl einer
geeigneten Sonde erfolgen muß und es nicht möglich ist, das gesamte Genom nach
neuen nicht bekannten Veränderungen zu untersuchen. Aus diesem Grund ist die
Kombination der Techniken, z.B. FISH und Array-CGH, sehr vielversprechend, da
mit Array-CGH geeignete Proben definiert werden könnten, um dann mit FISH
Aussagen über deren wirkliche Lokalisation am aberranten Chromosom zu treffen.
12
1.7 Ziel der Diplomarbeit
Das Ziel dieser Diplom Arbeit ist die Detektion von chromosomalen Gewinnen
bzw. Verlusten in einer Gruppe von Patienten mit angeborenen Herzfehlern.
Durch genaue Definition der chromosomalen Lokalisation und Größe der
Veränderungen sollen mögliche Kandidatengene und diagnostische Marker definiert
werden.
13
2. Material und Methoden
2.1 Chemikalien
BAC Verdau:
BSA
[New England Biolabs]
Msel hich conc. [New England Biolabs]
BFA
[New England Biolabs]
NEB1
[New England Biolabs]
Aqua ad iniectabile [Baxter]
Ligation:
Pr12 100 m
[MWG Biotech AG]
(5′-TAA CTA GCA TGC-3′)
Pr21 100 m
[MWG Biotech AG]
(5′-AGT GGG ATT CCG CAT GCT AGT-3′)
Ligase Buffer [Roche]
Ligase (5U/l) [Roche]
Aqua ad iniectabile [Baxter]
Linker Adapter PCR1 :
10Puffer mit MgCl [Roche]
2Puffer mit MgCl [Roche]
dNTPs 1mM
[Roche]
Primer 21 100 m
[Roche]
Aqua ad iniectabile [Baxter]
Mineralöl
[Sigma]
Polymerase MPI Taq
PCR2 :
10Puffer mit MgCl
[Roche]
dNTPs 1mM
[Roche]
Primer 21 amino
[MWG Biotech AG]
Polymerase MPI Taq
14
DNA Sonification:
Aqua ad iniectabile
[Baxter]
DNA Labelling:
2,5 Random Primers [Bioprime labelling Kit- Invitrogen]
dNTP-Mix:
(Roche – Ansatz für 200ul: je 4ul dGTP, dCTP, dATP (100mM) + 2ul dTTP (100mM) +
2ul 1M Tris pH8 + 0,4ul 0,5M EDTA pH8 +183,6ul H2O)
Cy3-dUTP (1nmol /ul)
[Amersham]
Cy5-dUTP (1nmol /ul)
[Amersham]
Klenow-Fragment (40 U/ul)
Aqua ad iniectabile
[Bioprime labelling Kit- Invitrogen]
[Baxter]
DNA Aufreinigung :
QIAquick PCR Purification Kit (250) [Qiagen]
Aqua ad iniectabile [Baxter]
DNA Fällung :
Stop Puffer
[Bioprime labelling Kit- Invitrogen]
Human-Cot 1DNA (1mg/ml) [Invitrogen]
Natrium Acetat 3M
[Merck]
Ethanol 100%
[Merck]
CGH Hybridisierung:
Yeast tRNA (100mg/ml)
[Invitrogen]
SDS 10%
[Merck]
FDST mit 8% Dextransulfat:
(0,8g Dextransulfat (Serva 18705) in 5ml Formamid + 1ml 20xSSC
add to 7ml (H2O), pH 7,0 (HCL/NaOH)
Advason
[Advalytix]
Fixogum Rubber cement
[Marabu]
15
Slidebehandlung:
Prehybridisierungslösung: 25% Formamid [Merck]
4x SSC pH 7,0
0,1% SDS [Merck]
Hering Sperm DNA (10mg/ml) [Invitrogen]
BSA
[Sigma]
H2O Millipore mit 0,05% Tween 20 [Sigma]
SlideWäsche:
Waschlösung:
50% Formamid [Merck]
2xSSC pH7
0,1% SDS
PN-Buffer:
(473,5ml 0,2M Na2HPO4 mit 0,2M NaH2PO4 pH 8 Millipore-H2O bis 1L)
1x PBS mit 0, 05% Tween:
0,22g KCl
[Merck]
(1,42g Na2HPO4 x 2H2O + 0,2g KH2PO4 + 8,18g NaCl +
Millipore-H2O bis 1L pH 7,2-7,4 +500l Tween 20 [Sigma])
Millipore-H2O mit 0,05% Tween 20 [Sigma]
2.2 Geräte und Software
BAC Verdau, Ligation , Linker Adapter PCR1, PCR2:
Clene Cab
[Herolab]
Primus HT Cycler
[MWG Biotech AG]
5810 R Zentrifuge
[Eppendorf]
5413
Zentrifuge [Eppendorf]
Sonification:
Branson –Sonifier
Modell 450
16
Agarose Gel:
Agarose electrophoresis Grade [Invitrogen]
1TAE Puffer (Tris-Acetat-Puffer) pH 8,3
HyperLadder I 100 Lanes
[Bioline]
DNA Labelling- Hybridisierung:
GeneAmp PCR System 9700 [AB]
Primus HT Cycler
[MWG Biotech AG]
5810 R Zentrifuge
[Eppendorf]
5413
Zentrifuge [Eppendorf]
Reax top Vortexer
[Heidolph]
Wasserbäder:
Innova 3000
[New Brunswick]
Grant J84
[Grant Instruments]
Grant JB1
[Grant Instruments]
Digsi Therm Präzisionsheizplatte
Slide Booster
[Advalytix]
Schüttler GFL 3005
Scanner GenePix 4000B
[Axon Instruments]
Software
Slide Auswertungsprogramm GenePix Pro 5,0
CGH PRO (Wei Chen)
2.3 Methoden
2.3.1 Array CGH
Auf Abbildung ist der Prinzip und die einzelnen Methodischen Schritte
zusammenfassend dargestellt.
17
Test DNA
Control DNA
Preparation: BAC/PAC clones
Alkaline
Lyses
Sonication
BAC/PAC-DNA
MseI/BfaI
digest
Cy3
Labelling
Cy5
Ligation of
Adapter-Linker
Amplification:
BAC/PAC-DNA
(Adapter-Linker PCR
)
Cot 1 DNA
........................
........................
........................
............
........................
............
washing
........................
............
........................
........................
............
........................
........................
........................
............
........................
........................
............
........................
scanning
........................
............
= material gained in test
genome
........................
............
= material lost in test
........................
........................
genome
............
........................
equal
=
........................
............
........................
abundance
........................
........................
............
Abbildung 7. Prinzip der Array CGH (mit freundlicher Genehmigung von Dr. F. Erdogan)
........................
............
........................
............
........................
............
........................
............
........................
............ MTP
............
............
............
............
............
............
............
18
2.3.2 Präparation der BAC/PAC Klone
Für die Herstellung der Arrays wurde DNA des kompletten 32k human ReArray
Set
vom
BACPAC
Ressourcen
(http://bacpac.chori.org/genomicRearrays.php)
Center
(BPRC)
bezogen. Die 32450 BAC Klone
kamen in 417 96-well Platten in einem Volumen von ca. 10µl a.d. gelöst und wurden
bis zur weiteren Verarbeitung bei –80°C gelagert.
2.3.2.1 Amplifikation der Klon-Inserts mittels Linker Adapter PCR
Die Linker Adapter PCR besteht aus drei Schritten, dem Verdau, der Ligation und
der PCR. Abbildung 8 zeigt ein Schema dieser Methode.
Abbildung 8 . Linker Adapter PCR (aus Klein et al. 1999)
Diese Sonderform der „whole genome amplification“ , welche zuerst von Saunders et
al. 1989 (44) beschrieben und von Klein et al. 1999 (19) für die CGH adaptiert wurde,
erlaubt eine effektive Amplifikation der genomischen Fragmente, welche dann auf die
Slideoberfläche aufgebracht werden können (Abb.4) Für die Verwendung bei der
Array CGH in unserer Arbeitsgruppe wurde der Protokoll erheblich verändert.
Die
modifizierte
Version
ist
http://www.molgen.mpg.de/~abt_rop/molecular_cytogenetics/LinkerPCR.html
unter:
zu
sehen. Die Modifizierung des Protokolls war erforderlich um die Komplexität der
19
PCR Produkte zu erhöhen (Verdau mit 2 Enzymen), Kompatibilität der einzelnen
Schritte zu ermöglichen (keine Aufreinigung zwischen den einzelnen Teilschritten
notwendig), und um den Anforderungen des Hochdurchsatzes im 96-well Format
gerecht zu werden. Um die DNA Ausbeute zu erhöhen und einen Vorrat an PCR
Produkten zu schaffen, wurde nach der primären PCR (Ligation vermittelte PCR1)
eine sekundäre PCR (PCR2) durchgeführt und erst diese Amplikons zum Spotten
auf die Slides verwendet.
Während
des
Verdaus
mit
MseI/BfaI
BAC-DNA
geschnitten.
Das
Restriktionsenzym MseI (New England Biolabs) schneidet die Sequenz TTAA nach
dem ersten Thymin mit Produktion von kohäsiven Enden. Das Enzym BfaI (New
England Biolabs) schneidet die Sequenz CTAG vor dem Thymin. In beiden Fällen
entstehen dadurch AT-Überhänge, an die in der darauf folgenden Reaktion Oligos
(12mer und 21mer) ligiert werden. Der Restriktionsverdau-Mix wurde für je 4-96er
Well Platten vorbereitet
Restriktionsverdauansatz (erstellt mit Microsoft Excel Protokollformular):
Einzelprobe l
Ins. Pro je 4 Platten l
BSA
0,0750
36,00
MseI high conc.
0,0120
5,76
Bfa
0,1500
72,00
NEB 1
0,7500
360,00
a.d.
1,5130
726,24
Summe:
2,5000
1200,00
Je 2,5 l dieses Restriktionsverdauansatzes wurden mit 5l der BAC-DNA mittels
Multi-channelpipette gemischt. Die Platten wurden mit Adhesive PCR Film
(Abgene) abgedeckt und kurz abzentrifugiert (5810 R Zentrifuge, Eppendorf). Zur
Verhinderung übermäßiger Evaporation wurde die Reaktion selbst
in einem einem
Thermocycler mit beheizbarem Deckel durchgeführt (Primus HT Cycler). Dabei
wurde das folgende PCR Programm benutzt: 37°C 3h, 80°C 20min, 4°C
.
Nach
dem Verdau wurden die Platten bei -20°C gelagert.
20
2.3.2.2 Ligation
Bei der Ligation dient das 12mer (5′-TAA CTA GCA TGC-3′) über seine Bindung an
den im MseI/BfaI Verdau generierten AT-Überhang als Gerüst für das 21mer (5′-AGT
GGG ATT CCG CAT GCT AGT-3′), welches durch die Ligase kovalent an die DNA
gebunden wird.
Reaktionsansatz für Ligation (erstellt mit Microsoft Excel Protokollformular):
Einzelprobe l
Ins. Pro je 4 Platten l
Pr12 100µm
0,5
240
Pr21 100µm
0,5
240
Ligase Buffer
0,8
384
a.d
5,2
2496
7
3360
Summe
Je 7µl dieses Reaktionsansatzes wurden mittels Multi-Channelpipette in 96
Well Platten vorgelegt und anschließend je 1 l Restriktionsansatz aus MseI/Bfa
Verdau pro Well zugegeben. Die Platten wurden mit Adhesive PCR Film (Abgene)
abgedeckt und für 30 sec abzentrifugiert (Eppendorf 5810 R). Wie der
Restriktionsverdau fand auch die Ligation
ebenfalls in Thermocyclern mit
beheizbarem Deckel statt (Primus HT Cycler MWG Biotech AG) .
Programm :
65°C 2min1°C/min auf 15°C
15°C

Die 65°C dienen der Denaturierung der Oligo-dimere, die sich dann während der
schrittweisen Reduktion der Temperatur an die DNA-Fragmente anlagern. Nach dem
Abkühlen auf 15 Grad wurde der PCR Film (Abgene) entfernt, ohne die Platten aus
dem Cycler zu nehmen, und mit der Multichannel Pipette (Brand) pro Well 2 µl
Ligase Mix zugegeben, anschließend wurden die Platten wieder mit PCR Film
(Abgene) versiegelt.
21
Ligasemix (erstellt mit Microsoft Excel Protokollformular):
Einzelprobe l
Ligasemix
Ins. Pro je 4 Platten l
Ligase Buffer
0,2
96
Ligase high conc. (5U/µl)
0,2
96
a.d
1,6
768
2
960
Summe
Die Ligation fand bei 15°C über Nacht statt.
2.3.2.3 Ligation vermittelte PCR 1
Bei der PCR 1 findet die eigentliche Amplifikation der DNA statt. Nach dem
Abspalten des unligierten 12-mers durch Erwärmung auf 68°C findet eine
Auffüllreaktion statt und die Sequenz des 21-mers kann als universelle primerAndockstelle für alle DNA Fragmente genutzt werden.
PCR1 Mix (erstellt mit Microsoft Excel Protokollformular):
Einzelprobe l
10x Puffer mit MgCl
Ins. Pro je 4 Platten l
5
2400
dNTPs 1mM
10
4800
Primer 21 100µM
0,5
240
32,5
15600
48
23040
a.d.
Summe
Je 48 l vom PCR 1 Mix wurden mittels Multichanel Pipette in PCR-Platten
vorgelegt.
Danach wurde 1l
vom Ligationsansatz dazu pipettiert. Die Proben
22
wurden anschließend mit Mineralöl (PCR grade) überschichtet und die Platten mit
Adhesive PCR Film (Abgene) abgedeckt. Als Negativkontrollen wurden drei PCR
Tubes (Eppendorf) mit PCR Mix ohne DNA benutzt.
PCR Programm:
68°C 3min
PAUSE
Während der Pause wurde der Adhesive PCR Film entfernt und je 1 l Polymerase
Mix pro Well mit der Multichannel Pipette zugegeben. Anschließend wurden die
Platten mit einem neuen Adhesive PCR Film abgedeckt
Reaktionsansatz für Pol. Mix (erstellt mit Microsoft Excel Protokollformular):
Polymerase-Mix
Einzelprobe l
Ins. Pro je 4 Platten l
2x Puffer mit MgCl
0,5
500
Polymerase
0,5
500
1
1000
Summe
Danach wurde das PCR Programm fortgesetzt:
68°C 4min,
35x (94°C40sec 59°C30sec 72°C90sec+2/cycle)
94°C40sec
59°C30sec
72°C 7min
4° 
23
2.3.2.4 PCR 2
Ein Aliquot der PCR1 wurde als Template für die PCR2 genutzt. In der
zweiten PCR wurden amino-modifizierte 21-mere eingesetzt. Die Amino Gruppe
verbessert die Bindungsrate der DNA an die Epoxy-Slides.
Reaktionsmix für PCR2 (erstellt mit Microsoft Excel Protokollformular):
PCR2 Mix
Einzelprobe l
Ins. Pro je 4 Platten l
Puffer mit Mgcl
7,5
3600
dNTPs 1mM
15
7200
Primer 21amino
1,5
720
Pol MPI unverd.
0,75
360
49,25
23640
74
35520
a.d.
Summe
Je 74 l vom PCR2 Mix wurden mittels Multichannel Pipette vorgelegt in
PCR Platten vorgelegt. Danach 1l aus der Linker Adapter PCR 1 dazu pipettiert.
Die Platten wurden mit Adhesive PCR Film (Abgene) abgedeckt und für 30 sec
abzentrifugiert (Eppendorf 5810 R). Als Negativ-Kontrollen wurden auch hier wieder
drei einzelne Reaktionsnsätze ohne DNA-Template mitgefahren.
Im PCR Block (Primus HT Cycler MWG Biotech AG) mit Programm:
94°C2min
35x (94°C40sec 59°C30sec 72°C90sec+2/cycle)
94°C40sec
59°C30sec 72°C 7min
4° 
24
2.3.2.5 Agarosegelelektrophorese zur Kontrolle der PCR Produkte
Zur Kontrolle der PCR Produkte und Beurteilung dessen Qualität wurde
sowohl nach der PCR 1 als auch PCR 2 eine Agarosegelelektrophorese durchgeführt.
Bei der Gelelektrophorese wandern die PCR Produkte von Kathode zu Anode in
einem elektrischen Feld. Da die größeren Fragmente pro Zeiteinheit langsamer als die
kleineren PCR Fragmente laufen,
werden sie der Größe nach im Agarose Gel
aufgetrennt. Durch die anschließende Inkubation in Ethidiumbromid Lösung können
die DNA Fragmente im UV-Licht sichtbar gemacht. Marker (HyperLadder I 100
Lanes
von Bioline) wurde zur Fragmentgrößebestimmung
auf das Gel
mitaufgetragen.
Gel: 1% Agarose (1g Agarose (Invitrogen) + 100ml 1TAE Puffer
Pro 96-well Platte wurden aus Kostengründen nur jeweils vier Proben auf das
Gel aufgetragen. Dafür wurden je 8µl des PCR Produktes mit 2µl Loading Buffer
gemischt und in die
Geltaschen pippetiert. Zur Bestimmung der Fragmentgröße
wurden 7µl Marker (HyperLadder I 100 Lanes von Bioline) mitaufgetragen. Die
Auftrennung der Fragmente erfolgte bei 100 V für 30 min (Consort E425 von Fröbel)
Nach der Färbung des Gels in einer Ethidiumbromidlösung für 10min wurde das
Ergebnis im Geldokumentationssystem photographiert.
2.3.2.6 Ethanolpräzipitation der DNA
Zur Reduktion des Volumens und einer teilweisen Aufreinigung (Elimination der
freien Nukleotide etc.) wurde die PCR 2 Reaktion gefällt, in 70% Ethanol gewaschen.
Nach dem Trocknen wurden die Pellets in 14µl Spottingpuffer (3xSSC/1,5M Betain)
aufgenommen.
Reaktionsansatz für Fällungsmix (erstellt mit Microsoft Excel Protokollformular):
25
Fällungsmix Einzelprobe l
1 -96 Well Platte l
Ethanol
165
85800
NaAC
7,5
3900
172,5
89700
Summe
Der Fällungsmix wurde mit einer Multichannel Pipette
in
96-well
Fällungsplatten vorgelegt. Anschließend wurden die PCR 2 Produkte zugegeben und
für mind. 24h bei –20 °C gefällt. Nach der Fällung wurden die Platten für 60 min bei
maximaler g-Zahl abzentrifugiert mit 70% Alkohol gewaschen und anschließend
getrocknet.
Dann wurden die PCR Produkte resuspendiert (3SSC, 1.5M Betaine) und mit einem
Pipettierroboter (Beckmann) in 384-well Platten transferiert.
26
2.3.3 Produktion der DNA Arrays
Die Vorbereitungen zum Spotten der DNA Arrays (durchgeführt von AG
Hultschig/Abt.Lehrach) umfassen mehrere Punkte. Zuerst werden die unter 2.3.2.6
beschriebenen 384-well Platten mit einem Barcode versehen und eine
„Erwartungsliste“ erstellt, die sowohl Reihenfolge der Platten als auch deren
Belegung wiedergibt. Diese Liste dient in weiterer Folge der Steuersoftware zur
Erstellung des sogenannten „gal-files“, dessen Verwendung im Punkt 2.3.15:
Auswertung noch näher beschrieben wird.
Als Spotting-Substrate verwendeten wir Epoxy beschichtete Objektträger von den
Firmen NUNC (http://www.nunc.de/ und Advalytix (http://www.advalytix.de/) .
Beim Spotten taucht ein Set von 48 „split pins“, das sind Nadeln mit einem Spalt an
der Spitze, in die Flüssigkeit ein und nimmt bedingt durch Kapillarkräfte eine gewisse
Flüssigkeitsmenge auf. Abbildung 9 zeigt einen „48 pin printhead“ und einen Spotter
der Firma Biorobotics.
Abbildung 9. Spotter (rechtes Bild), Nadel-Set (unteres Bild) und Array Slide (das linke mittlere Bild)
CGH (mit freundlicher Genehmigung von Dr. R. Ullmann)
27
Durch physikalischen Kontakt der Nadeln mit der Slideoberfläche wird eine
geringe Menge Flüssigkeit auf dem Slide deponiert. In dieser Studie war jeder der
14182 Klone in zweifacher Ausführung (Duplikat) gespottet. Diese Redundanz
ermöglicht das Erkennen und das Ausgleichen räumlicher Effekte und erlaubt auch im
Falle des Verlustes eines Spots eine Aussage über die betreffende Region.
Das Array besteht aus mehreren Subgrids (Abb.9).
Jeder Subgrid
(Spotsblock) ist mit einer einzigen Nadel gespottet. Es können Unterschiede in der
Nadelabnutzung oder Nadelspalten zwischen einzelnen Spottnadeln in einem Set
auftreten. Diese Variationen können auf dem Slide räumliche Effekte verursachen.
2.3.4 Patienten DNA .
Die 38 DNA Proben der Patienten mit congenitalen Herzfehlern wurden von
Frau Dr. Sperling (Abt. Prof. Dr. Hans Lehrach) für diesen Projekt zur Verfügung
gestellt.
In der Tabelle 4 sind die Patienten DNA Proben und die entsprechenden
Isolierungsmethoden aufgelistet.
28
Tabelle 4. DNA Material von Patienten mit congenitalen Herz Fehlern.
Nummer
Probe
Conc µg/µl Geschlecht Methode der DNA Isolierung
µl
µg
1
113E
0,131 F
Qiagen
38,11
5
2
071E
0,093 M
Qiagen
53,76
5
3
208E
0,192 F
TritonX
26,11
5
4
328E
0,364 F
NP40
13,74
5
5
111E
0,135 F
Qiagen
36,98
5
6
067E
0,226 F
Qiagen
22,09
5
7
133E
0,473 M
TritonX
10,58
5
8
281E
0,077 F
Qiagen clean up
64,94
5
9
350E
0,252 M
NP40
19,84
5
11
340E
0,351 M
NP40
14,26
5
12
082E
0,185 F
Qiagen
26,97
5
13
349E
0,414 M
NP40
12,07
5
14
056E
0,25 F
Qiagen
20
5
15
186E
0,363 F
TritonX
13,79
5
16
142E
0,121 M
Qiagen clean up
41,32
5
17
386E
0,189 M
NP40
26,46
5
18
206E
0,167 M
Qiagen clean up
29,94
5
19
373E
0,508 M
NP40
9,84
5
20
091E
0,21 F
Qiagen
23,87
5
21
162E
0,398 F
TritonX
12,58
5
22
079E
0,115 M
Qiagen
43,55
5
23
139E
0,445 F
TritonX
11,25
5
24
368E
0,392 M
NP40
12,76
5
25
011E
0,164 F
Qiagen
30,49
5
26
010E
0,108 M
Qiagen
46,51
5
28
007E
0,104 M
Qiagen
48,31
5
29
261E
0,079 M
Qiagen clean up
63,29
5
30
137E
0,551 M
TritonX
9,08
5
31
077E
0,183 F
Qiagen
27,32
5
32
127E
0,157 F
Qiagen
31,91
5
33
174E
0,418 F
TritonX
11,96
5
34
210E
0,485 F
TritonX
10,32
5
35
284E
0,477 F
TritonX
10,49
5
36
351E
0,462 M
NP40
10,83
5
37
399E
0,321 M
NP40
15,58
5
38
400E
0,642 F
NP40
7,79
5
29
2.3.4.1. DNA Isolierung.
Für die Array-CGH wird genomische Test-DNA und Referenz-DNA
(Kontroll-DNA) benötigt. Test- und Referenz-DNA wurden aus Lymphozyten des
peripheren
Vollbluts
isoliert.
Um
die
Effekte
unterschiedlicher
DNA-
Isolierungsprotokolle auf die Qualität der array CGH Untersuchungen zu bestimmen
wurde DNA nach drei verschiedenen Protokollen isoliert (Tab.4)
2.3.4.2 DNA Sonification.
Die genomische DNA wird bei der Sonification durch Ultraschall in Stücke
mit einer durchschnittlichen Länge von 200-1200bp fragmentiert. Diese Länge erlaubt
einerseits durch Reduktion der Sekundärstrukturen in der Random Priming Reaktion
die optimale Markierung. Gleichzeitig verringert die geringere Fragmentlänge den
DNA-Verlust bei der anschließenden Aufreinigung
Das Design des Branson-Sonifiers erforderte die Aufnahme der DNA in 200µl
a.d.. Die Fragmentierung erfolgte bei einer konstanten Intensität (Stufe 4) für vier
Sekunden. Die Proben wurden anschließend auf Eis gelagert.
2.3.4.5 Agarosegelelektrophorese zur Kontrolle der sonificierten Proben.
Nach dem Sonificieren wurden
je 7 µl
des sonificierten Volumens
entnommen, mit 3µl Loading Buffergemischt und auf ein 1%-iges Agarosegel
(1g Agarose (Invitrogen) + 100ml 1TAE
Puffer)
aufgetragen und die DNA-
Fragmente auf ihre Längenverteilung hin überprüft.
2.3.4.6 DNA Aufreinigung.
30
Um sicherzugehen, daß die in die Random Priming Reaktion eingesetzte DNA
frei von jeglicher die Kontamination ist, wurde die DNA vorher mit dem QIAquick
PCR Purification Kit (Qiagen) aufgereinigt .
Der QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) erlaubt die Aufreinigung von
Einzel- und Doppelsträngiger DNA mit einer Größe von 100 bp bis 10 kb über eine
Säule. Die Bindungskapazität der Säule beträgt bis zu 10 µg DNA.
Bei der Aufreinigung wird die selektive Bindung von DNA in Gegenwart
hoher Salzkonzentrationen und bei neutralem pH-Wert (pH  7.5) an eine Silika-GelMembran ausgenutzt. Während kurze DNA Fragmente, Nukleotide und Salze die
Membran ungehindert passieren und durch mehrere aufeinanderfolgende Wasch- und
Zentrifugationsschritte entfernt werden, bleiben längere DNA Stücke in der
Membran. Die gereinigte DNA kann anschließend mit einem kleinen Volumina
(240µl) Aqua ad iniectabile (Baxter) eluiert werden.
Die DNA Aufreinigung erfolgte nach dem Protokoll QIAquick Spin Purification
Procedure (Qiagen).
Nach der Aufreinigung wurde die Konzentration der DNA im Spectrometer
(Perkin Elmer) gemessen und die DNA anschließend bei –20°C gelagert.
2.3.9 Labelling
Es gibt mehrere Methoden um DNA zu markieren. Man kann prinzipiell
zwischen einer indirekten enzymatischen Markierung, einer chemischen Markierung
und einer direkten enzymatischen Markierung unterscheiden. Bei der indirekten
Markierung wird ährend der Neusynthese eines Nukleinsäure-Strangs Amino-AllyldNTPs miteingebaut. In einem zweiten Schritt (Postlabeling-Schritt) wird über eine
Esterbindung das Fluorchrome an die an die Aminoallygruppe der DNA gekoppelt
Die Amino-Allyl-dNTPs unterscheiden sich kaum in ihrer Größe von den nicht
modifizierten dNTPs, was einen Vorteil beim enzymatischen Einbau mit sich bringt.
Bei einer chemischen Markierung (z.B. Universal Linkage System ULS von
Amersham) wird ein Cis-Platinum Komplex für die DNA Markierung benutzt. Dieser
Komplex hat zwei Bindungstellen: die erste für die Bindung an ein Fluorophore, z.B.
Cy3 oder Cy5, und die zweite für die Bindung an einen Guanin-???Rest??? in der
31
DNA (45). Der Vorteil dieser Methode liegt in der Einfachheit des Protokolls, der
kurzen Markierungsdauer von nur 15min (Amersham ULS-Kit) und der Möglichkeit,
auch sehr kurze DNA Fragmente markieren zu können.
Für die direkte enzymatische Markierung gibt es mehrere Verfahren.
(Abb.10) Eine davon ist Nick Translation (Rigby et al. 1977). Bei dieser Methode
werden durch Behandlung mit DNase DNA-Einzelstrangbrüche, sogenannte Nicks
generiert.
Bei der darauf folgenden „Reparatur“ mit DNA-Polymerase werden
modifizierte Nukleotide eingebaut. Die für die Array CGH am häufigsten verwendete
Makierungsmethode ist das „random priming“ (Feinberg und Vogelstein 1983 (20)).
Hierbei wird die zu markierende doppelsträngige DNA denaturiert und mit
Zufallshexameren bzw. –nonameren (random primer) hybridisiert, die dann als Primer
für eine DNA Polymerase (Klenow Fragment) dienen. Auch hier
erfolgt die
Markierung durch Einbau von Cy3-dUTP (Abb.11) bzw. Cy5-dUTP (Abb.12)
Abbildung 10. Methoden der DNA Markierung.
32
Abbildung 11. Struktur von Cy3 (Amersham Biosciences)
Abbildung 12. Struktur von Cy5 (Amersham Biosciences)
In dieser Studie wurde die fragmentierte genomische DNA mittels RandomPriming
fluoreszenzmarkiert.
Jeweils
3x1µg
wurden
entsprechend
dem
Herstellerprotkoll markiert und später wieder gepoolt. Dafür wurde 1µg DNA in ein
Volumen von 32,4µl a.d aufgenommen und mit 32µl Primermix vermischt. Danach
erfolgt die Denaturierung bei 98°C für 10 min und, damit die DNA-Stränge nicht
sofort renaturieren, für 5 min auf Eis gelegt,
Reaktionsansatz für 1µg DNA:
dNTP-Mix für CGH
Aqua ad injectabile
Cy3-bzw. Cy5-dUTP
Klenow -Enzym
Summe
8µl
4,6µl
2µl
1µl
15,5µl
Die Markierung fand über Nacht bei 37 °C im Wasserbad statt.
2.3.10 Proben Aufreinigung
33
Die Markierungsreaktion
wurde durch Zugabe von 15µl Stop Puffer
(Invitrogen) unterbrochen.
Danach erfolgte die Aufreinigung der Proben mittels Qiaquick PCR
Purification Kit (Qiagen) nach dem Herstellerprotokoll. Die Vorgehensweise ist
bereits im Punkt 2.3.8 (DNA Aufreinigung) beschrieben worden. .
Die Aufreinigung ist notwendig um Proteine und nicht eingebaute modifizierte
Nukleotide zu entfernen.
2.3.11 DNA Fällung
In Gegenwart von einwertigen Kationen lassen sich unter Zugabe von absolutem
Ethanol und bei Temperaturen  -20°C DNA Fragmente aus wäßrigen Lösungen
ausfällen.
Die mit Cy3 dUTP und Cy5 dUTP gelabelte Proben werden vereinigt, gemischt und
in 2 Volumen von je 240µl aufgeteilt.
Zu je 240µl gelabelter Proben wurden zugegeben:
Human Cot 1 DNA (Roche) 250µg
Natriumacetat 3M
29µl
Ethanol 100%
800µl
Zur Reduktion des Volumens wurden
500µl (1mg/ml)Human Cot 1 DNA
(Roche) im Eppendorf Concentrator auf ein Volumen von 100µl eingeengt . Die
Zugegebene Menge von 250µg war folglich im Volumen von 50µl vorhanden.
Die Fällung fand über Nacht bei –20°C statt.
2.3.12 Slidebehandlung.
Die Slidebehandlung wurde durchgeführt um die unspezifische DNA Bindung an die
Slideoberfläche zu minimieren. Zu diesem Zweck werden die Slides in einer Lösung
mit Hering Sperm DNA und BSA (Bovine Serum Albumin) inkubiert.
Prähybridisierungslösung:
34
25% Formamid (Merck)
4x SSC pH 7,0
0,1% SDS (Merck)
Die Slides wurden in 60 ml Prähybridisierungslösung mit 0,3g BSA (Sigma) und 200µl
Hering Sperm DNA (10mg/ml, Invitrogen) im Wasserbad bei 42°C für 1 Stunde inkubiert. Diese
Prähybridisierungslösung wurde in einem Waschschritt mit a.d./0,05%Tween 20 (Sigma) entfernt
und die Slides durch Zentrifugation getrocknet.
Bis zur Verwendung wurden Array-Slides in einer speziellen Slidebox bei RT gelagert.
2.3.13 Hybridisierung
Als Hybridisierung bezeichnet man die nichtkovalente Bindung zweier zueinander
komplementärer, einzelsträngiger Nukleinsäuren unter Ausbildung von
Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den heterozyklischen Basen der
Nukleinsäuremoleküle. Um die Hybridisierung zu ermöglichen müssen Nukleinsäuren
zuerst durch Erwärmung über den Schmelzpunkt Tm hinaus denaturiert werden. Bei
der Denaturierung werden die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den beiden
Strängen zerstört und die Bindung der Doppelstränge aufgehoben Die Stabilität von
DNA-Doppelsträngen wird von verschiedenen Faktoren beeinflußt, wie z.B. der
Basenzusammensetzung (GC Gehalt), der Konzentration monovalenter Kationen
(wie Na+), Sequenzlänge und der Anwesenheit von, den Doppelstrang
destabilisierenden Agenzien (z.B. Formamid). Der Zusammenhang aller genannten
Faktoren wird durch folgende Formel beschrieben.
Schmelztemperatur (Tm) nach (Meinkoth und Wahl 1984)
Tm = 81,5°C + 0,41 (%GC) + 16,6 log [Na+] - 500/n - 0,61(%Formamid)
Die Temperatur ist ein wichtiger die Stringenz beeinflussender Faktor der
Hybridisierung. Hohe Hybridisierungstemperaturen erhöhen die Spezifität der
Doppelstrangbindung in dem die Wärmezufuhr der Ausbildung und der Stabilität der
Wasserstoffbrückenbindungen entgegen wirkt. Niedrige
Hybridisierungstemperaturen dagegen fördern unspezifische Doppelstrangpaarungen.
35
Die Stabilität der Doppelstrangbindung kann zusätzlich durch die Erhöhung der
Salzkonzentartion in der Hybridisierungslösung erhöht werden.
Die Hybridisierungstemperatur (Th) (nach Britten und Kohne 1968) wird wie folgt
berechnet :
Th.= Tm-25°C
Die optimale Hybridisierungstemperatur für DNA/DNA Doppelstrang mit einer
Länge bis ~ 5kb liegt etwa 25°C unter der Schmelztemperatur.
Die Hybridisierung erfolgt nach der Denaturierung. Der entscheidende Schritt bei der
Hybridisierung ist die Bildungshäufigkeit der ersten Basenpaarungen (Nucleation).
Von diesem Punkt aus erfolgt die Ausbildung des Doppelstrangs nach dem
Reißverschlussprinzip in beide Richtungen (Zippering).
Die gefällten DNA Proben wurden bei -4°C, für 30 min zentrifugiert
(
Eppendorf 5417R). Der Überstand wurde verworfen und mit 100µl Ethanol 70%
gewaschen. Danach wurden die DNA-Pellets bei 37°C für 10min im Thermomixer
(Eppendorf) getrocknet. Bei jeder Hybridisierung (2 Pellets) wurde der erste Pellet in
3,375µl Yeast tRNA (100mg/ml Invitrogen), 6,75 SDS 10% ( Merck) gelöst und
anschließend mit dem Zweiten vereinigt. Danach wurde durch Zugabe von 23,625µl
FDST (0,8g Dextransulfat (Serva 18705) in 5ml Formamid + 1ml 20xSSC add to 7ml
(H2O), pH 7,0 (HCL/NaOH) ) der Hybridisierungsmix komplettiert. Die Proben
wurden für 15 min bei 70°C im Wasserbad (Grant J84) denaturiert. Danach folgte die
Inkubation für 2 Stunden bei 42°C im Wasserbad (Grant J84). Während der
Inkubation suppremiert
die im Überschuß zugegebene ungelabete Cot 1 DNA
(Roche) die hoch repetitiven Sequenzen der Proben- und Target-DNA. Die DNA
hoch repetitiver Abschnitte, wie z.B. im Zentromerbereich der Chromosomen, weisen
eine andere Hybridisierungskinetik auf (sie reassoziieren schneller) als die einmalig
vorkommenden Sequenzen und würden außerdem aufgrund Ihrer Sequenz
unspezifisch an vielen Stellen im Genom binden. Nach dem Präannealing wurden die
Proben auf einer auf 42°C vorgewärmten Heizplatte (Digsi Therm) auf die
behandelten Slides aufgetragen, mit einem Deckglas eingedeckt und für 24 Stunden
im Slide-Booster (Advalytix) hybridisiert. Der Slide Booster (Abb.13) besteht aus vier
Hybridisierungskammern für je einen Slide. Die Temperatur und Mischparameter
können über das Steuergerät für jede Kammer separat eingestellt werden. Unter der
36
Metallplatte sind Nanopumpen installiert. Diese Pumpen produzieren in einstellbaren
Abständen akustische Oberflächewellen. Die Wellenbewegung wird von einer
Flüssigkeit (Advason von Advalytix), welche zwischen die Pumpe und den Slide
pipettiert wurde, durch den Slide auf Hybridisierungslösung übertragen. Diese
Wellen fördern die Durchmischung der Hybridisierungslösung und führen dadurch zu
einer Verbessserung der Reaktionskinetik.
Abbildung 13. Slide Booster von Advalytix
2.3.14 Waschen der Slides
37
Die Slides wurden stringent gewaschen um die falsch gebundene bzw. nicht
gebundene DNA zu entfernen. Die Stringenz der einzelnen Waschschritte wird durch
den Formamid Gehalt (je höher die Formamid Konzentration ist, desto instabiler
werden die Wasserstoffbrückenbindungen), die Temperatur (hohe Temperatur fördert
die Einzelstrangbildung), pH, Probenlänge, Salzgehalt der Waschlösungen und die
Inkubationszeit bestimmt. Je stringenter die Bedingungen gewählt werden, desto
größer die Reduktion des unspezifischen Hintergrunds. Bei zu hoher Stringenz
können aber auch spezifische Bindungen gelöst werden. Die Balance zwischen der
Hintergrundminimierung
und
Spotsintensität
wird
durch
Optimierung
der
Waschbedingungen erreicht und braucht mehrere Versuchsreihen.
Die Deckgläser wurden bei Raumtemperatur in 2xSSC pH7 vom
hybridisierten Slide gelöst. Slides wurden dann im Wasserbad 15 min. bei 42 in
Waschlösung: 50% Formamid (Merck), 2xSSC pH7, 0,1% SDS (Merck). Nach der
Behandlung mit Waschlösung die Slides wurden in PN Puffer (473,5ml 0,2M
Na2HPO4 mit 0,2M NaH2PO4 pH 8 Millipore-H2O bis 1L) für 10 min bei
Raumtemperatur auf dem Schüttler (GFL3005) inkubiert um die Reste von
Waschlösung abzublocken und zu entfernen. Nach PN Puffer die Slides wurden in
1x PBS mit 0, 05% Tween:
(1,42g Na2HPO4 x 2H2O + 0,2g KH2PO4 + 8,18g NaCl + 0,22g KCl
Millipore-H2O bis 1L pH
7,2-7,4 +500l Tween 20 [Sigma]) für 30 sec bei Raumtemperatur gewaschen.
Anschließend wurden die Slides kurz in Millipore-H2O mit
0,05% Tween 20 [Sigma]
eingetaucht und bei 900 Upm für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert
(5810 R Zentrifuge von Eppendorf).
2.3.15 Auswertung
2.3.15.1 Scannen der Slides
38
Für das Einlesen der Slides wurde ein ein Zweifarben-Laserscanner GenePix
4000B (Axon Instruments) verwendet. Die Slideoberfläche wird mit Laser abgetastet
und die Fluorochrome, Cy3 bei 532nm und Cy5 bei 635nm, simultan angeregt. die
emittierten Signale werden über Strahlenleitsystem dann getrennt detektiert. Zur
Verstärkung der Signale verwendet dieser Scanner ein Photomultiplier-Tube (PMT).
Vor dem Scannvorgang wurde der Level der Signalverstärkung (PMT-Gain) so
eingestellt, daß die durchschnittliche Signalintensität der beiden Farbkanäle ungefähr
gleich war. Die mit einer Auflösung von 5µm gescannten Signale wurden, für jeden
Farbkanal getrennt, als 16bit schwarz/weiß TIFF-Bilder auf einem zentralen UnixServer abgespeichert.
2.3.15.2 Bildverarbeitung
Die gespeicherten Bilder wurden mit GenePix Pro (Version 5.0) bearbeitet.
Die Die Bildbearbeitung umfasste die Segmentierung der Bilder, die Zuordnung der
Kloninformation zu jedem Spots und das Eliminieren von Spots bzw. Arealen mit
morphologisch unzureichender Qualität.
Bei der Segmentierung wird ein dem Layout des Arrays entsprechendes Raster
eingeblendet. Durch exaktes Positionieren dieses Rasters legt man fest, welche Pixel
einem spezifischen Spot zugerechnet werden. Gleichzeitig wird die Identität jedes
Spots durch Import des vom Spotter generierten „gal-file“ festgelegt. In diesem „galfile hat die Steuersoftware des Spotters die Information abgelegt, an welcher Stelle sie
welche Probe gespottet hat. (Abbildung 14)
39
Abbildung 14. Interface von GenePix Pro (Version 5.0). Ein Raster ist über die Spots gelegt worden
(screenshot)
2.3.15.3 Datenverarbeitung
Die eigentliche Analyse der chromosomalen Imbalancen passierte mittels spezieller
Array CGH Auswertesoftware. Für diese Arbeit wurde die in dieser Abteilung
geschriebene Software CGHPRO verwendet. Nach Überprüfung der
Hybridisierungseigenschaften, wie z.B. Verteilung der Ratios im Scatterplot und der
Ratioverteilungen zwischen den einzelnen Subgrids (Boxplot), wurden die
Signalintensitäten normalisiert . Ziel der Normalisierung ist es, die Signalintensitäten
der beiden Farbkanäle vergleichbar zu machen, um eine systematische Dominanz
einer Farbe zu verhindern. Solche systematischen Ungleichgewichte können z.B.
durch unterschiedliche Konzentrationen eingesetzter DNA, unterschiedliche
Labellingeffizienz und Scanningparameter entstehen. Basierend auf dem Median der
Signalintensitäten der zwei Farbkanäle wurde die Normalisierung für jeden Subgrid
separat durchgeführt. Danach wurden die errechneten Ratios jedes Klons
entsprechend ihrer chromosomalen Lokalisation entlang der
40
Chromosomenidiogramme dargestellt. (im Anhang). Damit Verluste eines
Chromosoms genauso gut erkennbar sind wie Gewinne, wurden die Ratios als
Logarithmus zur Basis2 dargestellt (log2 Ratio von 2=1; log2 Ratio von 0,5=-1).
Verluste in der Test-DNA sind links, Gewinne rechts einer gelben Linie angezeigt, die
den balancierten Staus repräsentiert. Die grüne und rote Linie markieren die
Schwellenwerte für Gewinne und Verluste. Die Bestimmung der geeigneten
Schwellenwerte ist unter dem Aspekt „Sensitivität versus Spezifität“ zu sehen und
wird von verschiedensten Punkten beeinflußt, wie z.B. Qualität der Hybridisierung,
dem zu erwartenden Anteil an Zellen mit der Veränderung
(Normalzellkontamination/Mosaik), Polyklonalität, Ploidie etc. Glücklicherweise
wirken sich einige dieser Punkte bei konstitionellen Chromosomenanomalie nicht aus,
weswegen für alle Fälle dieser Arbeit die Schwellenwerte mit log2 =0,3 bzw –0,3
festgelegt wurden. Dies entspricht in etwa den in der chromosomalen CGH
mehrheitlich verwendeten Schwellenwerten (0,8 und 1,2; nicht log Darstellung).
Nach Visualisierung der Ergebnisse wurden diese in einer Mysql Datenbank auf dem
zentralen UNIX Server abgelegt, um für die weitere Meta-analyse zur Verfügung zu
stehen.
Abbildung 15. Eiteilung der einzelnen Klone nach ihrem Inhalt an segmentalen Duplikationen
In CGHPRO wird den einzelnen Klonen, entsprechend ihres Gehalts an segmentalen
Duplikationen, eine bestimmte Farbe zugeordnet (Abb.15) Dazu errechnet das
Programm für jeden Klon einen Faktor, aufgrund dessen dieser einer von sieben
Kategorien zugeordnet wird.
Die der Berechnung zugrunde liegende Formel
41
(Längen der Duplikation  Anzahl der Kopien)/ Klon Länge) berücksichtigt sowohl
den relativen Anteil der segmentalen Duplikation an der Gesamtsequenz als auch die
Kopienzahl.
Das Genom des Menschen enthält viele Sequenzfolgen, die mehr als einmal
im haploiden Genom auftreten und folglich keine „Unikate“ sind. „Single copy“
Sequenzen, repräsentieren nur einen kleinen Teil des Genoms. Den größten Anteil
stellen die mittel- und hochrepetitiven Sequenzen etwa 70% des Gesamtgenoms. Zu
den hochrepetitiven Sequenzen gehören Satelliten-DNA, LINEs und SINEs.
Mittelrepetitive
Sequenzen
sind
rRNA-
und
tRNA-Gene
sowie
auch
Retrotransposons.
Low-Copy Repeats (LCR) sind definiert als DNA Sequenzen von mindestens
1- bis mehr als 200kb Länge und einer Sequenzsimilarität von mindestens 90%. Bei
LCRs handelt es sich keineswegs um selten vorkommende Ausnahmeerscheinungen,
vielmehr machen LCRs ca. 5% des gesamten humanen Genoms aus. Positionen
vieler dieser “duplizierten ” Sequenzen sind auf der Genom-Datenbankresourceseite
(http://genome.ucsc.edu/) zu sehen.
Bereits mehrfach konnte das Auftreten von Chromosomen-Brüchen mit dem
Vorhandensein von LCRs an der jeweiligen Bruchstelle assoziiert werden (22, 41,
42). Low Copy Repeats sind hoch dynamische Regionen im Genom und gelten daher
als Hot Spots für Rekombinationsereignisse (43). Abgesehen von der biologischen
Bedeutung dieser Sequenzen sprechen auch technische Aspekte für eine Kolorierung
der Klone entsprechend ihres LCR-Gehalt: Einerseits zeigt ein Ratioshift immer nur
einen Durchshschnittswert, der über alle chromosomalen Positionen mit dieser
Sequenz mittelt, andererseits entspricht der Ratioshift nicht dem einer „single copy“
Sequenz, da der Verlust einer Kopie keiner Kopienzahländerung um 50% entspricht.
42
3. Ergebnisse
Probe NR. 1 (113E)
Bei der DNA Probe NR. 1 (113E) wurden folgende chromosomalen
Imbalancen detektiert:
Duplikation auf Chromosom 9q34.3 (Abb. 16 und Anhang)
Die Klone N0159B03, N0514D14 sind von der Duplikation betroffen. Sie weisen
einen minimalen Anteil an low copy Repeats auf.
Die Duplikation ist ~ 300 kb groß.
Abbildung 16 . Duplikation auf Chr. 9 q34.3
Probe NR.4(328E)
43
Nach der Analyse der Hybridisierungsdaten wurden folgende DNA
Zugewinne bzw. Verluste beobachtet:
Mögliche Duplikation auf Chromosom 19q13.42 (Abb.17 und Anhang). Zwei Klone
dj1060P11 und bK2337j16 sind davon betroffen.
Der Klon dj1060P11liegt kurz über den Schwellenwert für eine Duplikation und Klon
bK2337j16, welcher einen hohen Anteil an low copy Repeats aufweist, deutlich über
den Schwellenwert hinaus. Das ist ein Indiz für die Duplikation in diesem
chromosomalen Bereich der Test DNA. Die minimale Streuung bei der Probe 328E
bekräftigt diese Vermutung.
Auf dem Chromosom 19 sind die einzelnen Klone nicht überlappend wie z.B. auf
Chromosom 22, X, 4 usw. sondern im Abstand von ~1mb voneinander positioniert.
Dadurch ist es teilweise schwierig die genaue Ausdehnung der Aberration zu
bestimmen.
Abbildung 17. Duplikation auf Chromosom 19q13.42
Probe NR.11 (340E)
Bei der probe 340E sind folgende chromosomalen Imbalancen detektiert:
Mögliche Duplikation auf Chromosom 8q24.3 (Abb.18 und Anhang). Es sind Klone
dj1118A7, bA472K18 und bA349C2 von der Aberration betroffen. die Probe zeigt
eine Streuung in Intensitäten. Da es aber nicht nur ein Klon sondern drei Klone,
welche zum Teil überlappend sind, über den Schwellenwert liegen, ist die
44
Wahrscheinlichkeit groß, daß es sich in diesem Fall um eine Duplikation handelt,.
Die Duplikation ist in diesem Fall mind. 1.2 Mb. groß.
Abbildung 18. Duplikation auf Chromosom 8q24.3
Mögliche Duplikation auf Chromosom 11p15.5 (Abb.19 und Anhang).
Duplikation ist auf Klone N0596I23, N0652C03, N0412M116, N0326C03 begrenzt.
Obwohl Klone der Probe streuen, liegt die Wahrscheinlichkeit hoch, daß es sich um
eine Duplikation handelt.
Abbildung 19. Duplikation auf 11p15.5
Probe NR.14(056E)
45
Bei der Probe 056E wurden folgende Auffälligkeit beobachtet:
Auf Chromosom 4 sind drei Deletionen vorhanden (Abb.20 und Anhang).
Abbildung 20. Deletionen auf Chromosom 4
Die erste Deletion (oben in der Abb.20) ist im chromosomalen Bereich q32.1q32.3 (Abb.21). Die Deletion grenzen die BAC Klone N0749I11 bei 4q32.1 und
N0313O15 bei 4q32.3 ab. Die Deletion ist ~ 9 Mb groß.
Abbildung 21. Deletion auf 4q32.1-q32.3
46
Die zweite Deletion (Mitte in der Abb. 20) ist n der chromosomalen Region
q33-q35.1 (Abb.22). An den Grenzen dieser Deletion liegen die BAC Klone
N0440K12 bei q33 und N0714G18 bei q35.1. Diese Deletion ist ~ 15,5 Mb.
Abbildung 22. Deletion 4q33-q35.1
Die dritte Deletion, welche auch die kleinste ist, liegt im Bereich q35.2
(Abb.23) Dabei ist der Klon N0321G19 betroffen.
Abbildung 23. Deletion 4q35.
Probe NR.15 (186E)
47
Bei der Analyse der Hybridisierungsergebnisse Probe 186E wurden folgende
Auffälligkeiten festgestellt:
Chromosom 7. Deletion im Bereich q11.23 (Abb.24 Anhang). Es sind sechs BAC
Klone : N0101D02, N0100D10, N0011L22, N0137E08, N0091L07, dj771P14,
welche deutlich außerhalb der Toleranzgrenze liegen. Die Deletion ist ~1.5 Mb groß.
Bei der Betrachtung der Bruchpunkten dieser Deletion kann man feststellen, daß die
Deletion flankierten Klone einen sehr hohen Anteil an low copy Repeats aufweisen.
Die Literatur Recherchen können diese Beobachtung bestätigen (42).
Abbildung 24. Deletion auf 7q11.2
Probe NR. 16(142E)
Die Analyse der Hybridisierungsergebnissen zeigen folgende Auffälligkeiten
bei der Probe 142E:
Chromosom 11. Duplikation in der Region p15.5 (Abb.25 und Anhang). Wie auch in
der Probe 340E Abb.31 sind es 4 BAC Klone N0596I23, N0652C03, N0412M116,
N0326C03 auf welche die Duplikation begrenzt ist.
48
Abbildung 25. Duplikation auf Chromosom 11p15.5
Probe NR.22 (079E)
In der Probe 079E wurden folgende chromosomalen Veränderungen
detektiert:
Chromosom 9. Duplikation in der Region p24.1-p24.2 (Abb.26 und Anhang). Die
BAC Klone N0006j24, N0567O02, N0410L03, N0043B01, N0778P24 grenzen die
Duplikation deutlich ab. Die Klone N0778P24 (oberste umrandete Klon) und
N0442A08 (links der grünen Linie liegende Klon, überlappend mit N0778P24)
markieren anscheinend den Duplikation Breakpoint. Der Breakpoint befindet sich
wahrscheinlich innerhalb des Überlappungsbereichs von dieser beiden Klone. Die
Duplikation ist ~ 600 kb groß.
Abbildung 26. Duplikation auf 9p24.1-p24.2
49
Probe NR.24 (368E)
Bei der Probe 368E wurden folgende chromosomalen Veränderungen
beobachtet:
Chromosom 4. Deletion in der Region q13.3 (Abb.27 und Anhang). Klone
N0719M16 und N0151j20 sind umrandet und von der Deletion betroffen.
Abbildung 27. Deletion auf Chromosom 4q13.
Probe NR.26 (010E)
Die Analyse der Hybridisierungsergebnisse zeigt folgende chromosomalen
Veränderungen:
Chromosom Y. Im Region q11.223-q11.23 liegen Auffällig viele Klone über den
Schwellenwert für eine Duplikation (Abb.28 und Anhang). Klone bA140H23,
bA506M9, bA245K4, bA270H4 sind in der Abbildung 28 markiert. Die markierte
Klone besitzen entsprechend der Abbildung 15 einen hohen Anteil an low copy
Repeats
50
Abbildung 28. mögliche Duplikation auf ChromosomYq223-q22.3.
Probe NR.28 (007E)
Bei der Probe 007E wurden folgende chromosomalen Anomalien beobachtet:
Chromosom 8. Duplikation im Region q12.1–q13.1(Abb.29 und Anhang). Die Klone
bA114M5, bA414L17, dj491L6, bA227F6, bA45K10, bA115G12, bA89A16,
dj252K6, bA366K18 liegen innerhalb der duplizierten Region, welche ~ 7Mb groß
ist. In der Abbildung sieht man in der Mitte der Duplikation einen Klon, welcher unter
dem Schwellenwert liegt. Es ist nicht feststellbar, ob dieser Klon möglicherweise
mismappt ist. Außerdem sind die Klone in dem fraglichen Bereich des Chromosoms
nicht überlappend. Deshalb bleibt die Frage offen, ob es sich hier möglicherweise
auch um eine diskontinuierliche Duplikationen handeln kann. In einem solchen Fall
würde die erste Duplikation in der Region q12.1-q12.3 auftreten und durch vier
entsprechenden Klonen bA114M5, bA414L17, dj491L6, bA227F6 markiert.
Die
zweite Duplikation q12.3-q13.1 würde die fünf andere Klone bA45K10, bA115G12,
bA89A16, dj252K6, bA366K18 beinhalten.
Abbildung 29. Duplikation auf Chromosom 8q12.1–q13.1
51
Chromosom 9. Duplikation im Centromer Bereich (Abb.30).
In dem oberen Teil der Abbildung (umrandete Klone ) ist eine große Duplikation im
Centromer Region p11.2-p13.1 zu sehen. Alle Klone in diesem Bereich weisen starke
Involvierung in segmentale Duplikationen auf.
Abbildung 30. Duplikation auf Chromosom 9p11.2 -p13.1 in der nähe des Centromer Bereichs.
Probe NR.30 (137E)
Bei der Probe 137E wurden folgende chromosomalen Veränderungen
beobachtet:
Chromosom 7. Deletion im Region q11.23 (Abb.31 und Anhang). In der Abbildung
31 sind Klone involvierte in die Duplikation N0100D10, N0011I22, N0041F22
schwarz umrandet. Die Deletion ist ~ 1,3 Mb groß.
52
Abbildung 31. Deletion auf 7q11.23
Die Test DNA wurde für die Hybridisierung mit Cy5, Kontroll DNA mit Cy3
markiert, sonst werden die Proben umgekehrt markiert. Deshalb sind in diesem Fall
die Klone als eine Deletion anstatt als eine Duplikation interpretiert (Anhang).
Probe NR.31 (077E)
Bei der Probe 077E wurden folgende chromosomale Veränderungen
detektiert:
Duplikation des Chromosoms 21. Trisomie 21 (Abb.32 und Anhang).
.
Abbildung 32. Duplikation des Chromosoms 21
Probe NR.32 (127E)
Bei der Probe 127 wurden folgende Auffälligkeiten beobachtet:
53
Duplikation des Chromosoms 21(Trisomie 21, Abb.33 und Anhang)
Abbildung 33. Duplikation des Chromosoms 21
Das Geschlecht der Test DNA wurde falsch bestimmt. Dies kann man an
Chromosomen X und Y sehen. Alle Klone des Chromosoms X liegen im
Deletionsbereich, Klone des Chromosoms Y dagegen im Duplikationsbereich (siehe
Anhang).
Probe NR.33 (174E)
Die Ergebnisse der Hybridisierung zeigen folgende Auffälligkeiten:
Duplikation des Chromosoms 21 (Trisomie 21, Abb.34 und Anhang)
Abbildung 34. Duplikation des Chromosoms 21
54
Probe NR. 34(210E)
Bei der Probe 210E wurden folgende Auffälligkeiten beobachtet:
Duplikation des Chromosoms 21 (Trisomie 21, Abb. 35), (Anhang).
Abbildung 35. Duplikation des Chromosoms 21
Bei der Probe 210E wurden die Test DNA mit Cy5 anstatt mit Cy3 markiert.
Deshalb befinden sich die Klone links der roten Linie und nicht rechts der grünen, wie
bei anderen Proben mit einer Duplikation. Zusätzlich dazu wurde das Geschlecht der
Test DNA verwechselt und anstelle männlicher Referenz-DNA weibliche benutzt.
Dies erklärt warum die Klone der X und Y Chromosomen dupliziert erscheinen (siehe
Anhang).
Probe NR. 35 (284E)
Die Probe 284E zeigt folgende chromosomalen Auffälligkeiten:
Duplikation auf Chromosom 21(Trisomie 21 Abb.36 und Anhang).
Abbildung 36. Duplikation des Chromosom 21
55
Probe NR.36 (351E)
Bei der Probe 351E wurden folgende chromosomalen Anomalien beobachtet:
Duplikation des Chromosoms 21 (Trisomie 21 Abb.37 und Anhang).
Abbildung 37. Duplikation des Chromosoms 21
Probe NR.38 (400E)
Bei der Probe 400E sind folgende chromosomalen Veränderungen auffällig:
Chromosom 4. Deletion im Region q28.3 (Abb.38 und Anhang). Es sind die Klone
N0619K10, N0671A13, N0625A06, N0781A13, bA400D2, M2145F16, N0352L20
welche in die Deletion involviert sind. Diese Deletion ist ~811 kb groß.
Abbildung 38. Deletion auf Chromosom 4q28.3
56
Kontrolle S
Die Probe ist eine Kontrolle. Bei dieser Hybridisierung wurde Test DNA wie
auch Kontroll DNA von gesunder weiblicher Personen benutzt. Die Test DNA und
Kontroll DNA wurden von unterschiedlichen Personen genommen. Die Test DNA
wurde bei dieser Probe mit Cy5 anstatt mit Cy3 markiert. Die Klone liegen deshalb
im Falle einer Deletionen rechts von der grünen Linie und im Falle einer Duplikation
links der roten Linie. Verteilung der Klone entlang aller Chromosomen zeigt eine
breite Streuung (Anhang).
In der Tabelle 5 sind die Ergebnisse aller Hybridisierungen noch mal
zusammengefaßt.
Die häufigste chromosomale Anomalie ist Trisomie 21.
Sie wurde bei 6 Proben beobachtet. Bei zwei Proben 142E und 340E wurden eine
Duplikation auf Chromosom 11p15.5 beobachtet. Bei anderen zwei Proben 186E und
137E wurde eine Deletion auf 7q11.23. Die Proben 368E, 056E und 400E zeigten
Deletionen in verschiedenen Regionen (siehe Tabelle 5) des Chromosom 4. Bei der
Probe 056E ist die Deletion besonders ausgedehnt.
Chromosom Y ist bei der Probe 010E von einer großen Duplikation (Yq223-q22.3)
betroffen.
Die Probe 340E zeigt Duplikationen auf Chromosom 8q24.3 und Chromosom
11p15.5. Probe 007E zeigt sogar zwei Duplikationen. Die erste ist auf Chromosom
Chr.8p12.1–p13.1 und die zweite auf Chromosom
Chr.9p11.2 -p13.1. Das
Chromosom 9q34.3 ist auch bei der Probe 113E von einer Duplikation betroffen.
Bei Proben NR: 2(071E), NR. 3 (208E), NR. 5(111E), NR. 6 (067E), NR.7(133E),
8(281E), 9(350E), NR.12 (082E), NR.13 (349E), NR.17(386E), NR.18(206E)
57
NR.19(373E), NR.20(091E), NR.21(162E), NR.23 (139E), 25 (011E), 29 (261E),
NR.37 (399E), LQT414 wurden keine chromosomalen Veränderungen detektiert.
Bei den orange gefärbten Proben (Tabelle 5, Proben 082E, 349E, 127E, 210E)
wurde bei der Hybridisierung falsches Geschlecht der Referenz DNA verwendet. Das
kann man auf Array Bildern anhand der Klone auf X und Y Chromosomen erkennen.
Die Klone des X Chromosoms erscheinen dupliziert und Klone des Y Chromosoms
deletiert. Bei den grün markierten Proben (Tabelle 5) sollte , wegen der Streuung der
Klone, die Hybridisierung noch ein mal wiederholt werden.
58
Tabelle 5. Ergebnisse der Hybridisierungen mit Patienten DNA
Number SAMPLE Hybridisation
Deletion
Duplication
µg/µl
Gender
Chr.9q34.3
0,131
F
0,093
M
0,192
F
1
113E
MC_733/734
2
071E
MC_737/738
3
208E
MC_739/740
4
328E
MC_749/750
0,364
F
5
111E
MC_751/752
0,135
F
6
067E
MC_713/714
0,226
F
7
133E
MC_753/754
0,473
M
8
281E
MC_755/756
0,077
F
9
350E
MC_777/778
0,252
M
0,351
M
0,185
F
11
340E
MC_779/780
12
082E
MC_781/782
13
349E
MC_783/784
Chr.19q13.42
Chr.8q24.3
Chr.11p15.5
0,414
M
0,250
F
0,363
F
0,121
M
14
056E
MC_785/786
Chr.4q32.1-q32.3, q33-q35.1
Chr.4q35.2
15
186E
MC_791b/792b
Chr.7q11.23
16
142E
MC_787a/788a
17
386E
MC_789/790
0,189
M
18
206E
MC_807/808
0,167
M
19
373E
MC_801/802
0,508
M
20
091E
MC_653/654
0,210
F
21
162E
MC_803/804
0,398
F
22
079E
MC_805/806
0,115
M
23
139E
MC_819/820
24
368E
MC_821/822
25
011E
MC_651a/652a
26
010E
MC_825/826
28
007E
MC_823/824
29
261E
MC_827/828
30
137E
MC_655/656
31
077E
MC_829/830
Trisomie 21
32
127E
MC_715/716
33
174E
34
Chr.11p15.5
Chr.9p24.1- p24.2
0,445
F
0,392
M
0,164
F
Chr.Yq223-q22.3
0,108
M
Chr.8p12.1–p13.1
Chr.9p11.2 -p13.1
0,104
M
0,079
M
0,551
M
0,183
F
Trisomie 21
0,157
F
MC_717/718
Trisomie 21
0,418
F
210E
MC_657a/658a
Trisomie 21
0,485
F
35
284E
MC_831/832
Trisomie 21
0,477
F
36
351E
MC_833/834
Trisomie 21
0,462
M
37
399E
MC_835/836
0,321
M
38
400E
MC_837/838
0,642
F
Chr.4q13.3
Chr.7q11.23
Chr.4q28.3
LQT414 MC_659/660
Kontr_S MC_661/662
59
Zusätzlich zu den chromosomalen Veränderungen in Patienten DNA (Tab.5)
wurden einige Polymorphismen in Referenz DNA (Kontroll DNA) beobachtet.
Chromosom 4. Polymorphism in der Region p16.1 (Abb.39). Die Klone N0193D10,
F0980j16, M2205P10 sind involviert, wobei es ist fraglich ist ob 2 unten umrandete
Klone dazu gehöhren, weil unter dem umrandeten Klonen noch 2 Klone zu sehen
sind. Diese ``Ausreißer`` sind möglicherweise mismapped. Alle Klone (Abb.15)
haben einen sehr hohen Anteil an low copy Repeats.
Abbildung 39. Polymorphism in der Region 4p16.1
Im Centromer Bereich des Chromosom 9 (Abb.40) sind zwei Regione p11.2
(Klon N0229K20) mit benachbarten überlappenden Klonen und q13 (Klon
N0429L11) mit benachbarten überlappenden Klonen vom Polymorphism betroffen.
Abbildung 40. Polymorphe Regionen im Centromer Bereich 9p11.2 und 9q13
60
Auf dem Chromosom 17q12 ist eine weitere polymorphe Region lokalisiert
(Abb. 41). Dabei sind die BAC Klone N0355O04, N0600K04, N1330O06 (obere drei
umrandeten Klone) und die BAC Klone N0722D15, N0072I20, N0121G16,
N0678G07 (untere umrandeten Klone) involviert.
Abbildung 41. Polymorpism auf Chromosom 17q12
Die häufigsten Polymorphismen befinden sich auf Chromosom 22. Es sind
drei betroffen Regionen: 22q11.1, 22q11.21 und 22q11.22(Abb.42) zu nennen. In der
nähe des Centromers liegt die Region 22q11.1 (obere umrandeten Klone in der
Abbildung 42 ) Alle Klone, entsprechend der Abb.15 haben einen hohen Anteil an
low Copy repeats.
Die zweite Region, in welcher Polymorphismen auftreten können, ist
22q11.21. Dabei sind meistens nur 2 Klone N0444L07, N0818K20 betroffen (zwei
umrandete Klone in der Abb.42 ). In der Region 22q11.22 sind es dagegen 5 Klone
N0432M13, N0757F24, N0281O23, N005L23 und bA50L23 ( in der Abb.42 untere
nicht umrandeten Klone)
61
Abbildung 42. Chromosom 22 Polymorphe Regionen q11.1, q11.21 und q11.22
Polymorphe Region auf Chromosom Xq28 (Abb.43). BAC Klone N0330B02,
N0333O06 und M2149G05 liegen außerhalb der Toleranzgrenze. Die Klone , wie aus
der Abb.15 sichtbar ist, haben nur einen geringen bis keinen Anteil an low copy
Repeats.
Abbildung 43. Polymorphe Region auf Chromosom X.q28.
62
In der Tabelle 6 sind die Polymorpismen noch mal zusammengefaßt
Tabelle 6. Mögliche Polymorphismen in Referenz DNA
number SAMPLE Hybridisation
Deletion
1
2
113E
071E
MC_733/734
MC_737/738
3
208E
MC_739/740
4
328E
MC_749/750
5
111E
MC_751/752
6
067E
MC_713/714
Chr.17q12
7
8
9
133E
281E
350E
MC_753/754
MC_755/756
MC_777/778
Chr.22q11.21
11
12
340E
082E
MC_779/780
MC_781/782
13
349E
MC_783/784
14
056E
MC_785/786
15
Chr.17q21.31
186E MC_791b/792b Chr.Xq28
16
17
18
142E
386E
206E
MC_787a/788a
MC_789/790
MC_807/808
19
20
21
373E
091E
162E
MC_801/802
MC_653/654
MC_803/804
22
079E
MC_805/806
23
139E
MC_819/820
24
25
368E
011E
MC_821/822
MC_651a/652a
26
010E
MC_825/826
28
29
007E
261E
MC_823/824
MC_827/828
Chr.17q12
Chr.17p11.2,
Chr.4p16.1
Duplication
Gender
Chr.4p16.1
Chr.17q12
Chr.22q11.1,
22q11.21; 22q11.22
Chr. 22q11.1
Chr.9q13;
Chr.17q12,
Chr.22q11.22
Chr.9p11.2, 9q13
Chr.22q11.1;22q11.22
Chr.9p11.2, 9q13;
Chr.22q11.22
Chr.9p11.2, 9q13;
Chr.17q12
Chr.22q11.22
Chr.9p11.2 ; Chr. 9q13
Chr.17q12 ;
Chr. 22q11.1
Chr.Xq28
Chr.22 q11.1, q11.21, q11.22
F
M
F
F
F
F
M
F
M
Chr.22q11.1;
Chr.Xq28
M
F
Chr.9p11.2 ; Chr. 9q13
Chr. 22 q11.1, q11.22
Chr.4p11;
Chr.22q11.22
Chr.9p11.2, 9q13
Chr. 22 q11.1, q11.22
M
F
F
M
M
M
Chr.17q12
Chr.17q12 ;
Chr.22q11.1, q11.22
M
F
F
Chr.22 q11.1, q11.21, q11.22
Chr.9p11.2
Chr.17q21.31
Chr.22q11.21
Chr.9p11.2, 9q13
Chr. 22 q11.1, q11.22
Chr.9p11.2, 9q13
Chr. 22 q11.1
Chr.22 q11.1, q11.22
Chr.9p11.2-p12
M
F
M
F
M
Chr.4p16.1
Chr.17q12
Chr.Xq28
Chr. 22q11.1, q11.21
M
M
63
30
137E
MC_655/656
31
32
077E
127E
MC_829/830
MC_715/716
33
34
35
36
37
38
174E
210E
284E
351E
399E
400E
LQT414
MC_717/718
MC_657a/658a
MC_831/832
MC_833/834
MC_835/836
MC_837/838
MC_659/660
Kontr_S MC_661/662
M
Chr. 22q11.1
Chr.9p11.2, 9q13
Chr. 22 q11.1, q11.21, q11.22
F
F
Chr.9p11.2, 9q13
Chr. 22 q11.1, q11.22
F
F
F
M
M
F
Chr.22 q11.21, q11.22
Chr.22 q11.1, q11.22
Chr.9p11.2, 9q13
Chr.22 q11.1, q11.22
64
4. Diskussion
Diese Arbeit ist die erste Array CGH Studie, abgesehen von
einem
Einzelfallbericht (49), über die chromosomalen Gewinne und Verluste bei Patienten
mit congenitalen Herzfehlern.
Es besteht die Möglichkeit
genetische Veränderungen und deren
Auswirkungen auch auf RNA und/oder Proteinebene studieren, allerdings können
diese Untersuchungen nur einen Einblick in die gegenwärtige Situation zum Zeitpunkt
der Untersuchung geben. Rückschlüsse auf die Situation in den kritischen Phasen der
Herzentwicklungen sind daher oft unmöglich. Aus diesem Grund bleibt, obwohl eine
Studie fortbestehende Veränderungen der Genexpressionsmuster in Patienten mit
congenitalen Herzfehlern nachweisen konnte (21), Ursache und Wirkung, d.h. die
Unterscheidung zwischen dem auslösenden Defekt und den daraus resultierenden
Genexpressionsänderungen, immer noch unklar. Dasselbe gilt für die Analyse von
Proteinexpressionsmustern. Ein weiteres Problem ist die Zugänglichkeit des
Probenmaterials, will man nicht auf formalin-fixiertes Autopsiematerial mit meist
degradierter RNA und kreuzvernetzten Proteinen aus den Archiven der Pathologen
zurückgreifen.
All diese Nachteile kann man bei der Untersuchung der DNA Ebene umgehen.
Wenn die chromosomalen Veränderungen schon am Beginn der Embryogenese
vorhanden sind, so kann man diese in allen Zellen des daraus entstandenen
Organismus nachweisen. Dabei ist es egal, ob die DNA in der kritischen Phase der
Herzentwicklung oder lange danach untersucht wird. Der Defekt wird bis zum
Lebensende des Patienten zu jeder Zeit in dessen DNA nachweisbar sein, egal aus
welchem Gewebe die DNA isoliert wird.
Diese Studie mit 38 ausgesuchten Patienten galt als Vorversuch für ein groß
angelegtes Herzprojekt. Das Ziel war , sowohl die Zuverlässigkeit als auch das
Potential der Methode für die Untersuchungen der congenitalen Herzmißbildungen zu
testen. Die Patienten Gruppe
in dieser Studie umfaßte Fälle mit bereits
diagnostizierten Syndromen, aber auch Fälle mit unbekannter Ätiologie. Wie später
noch detaillierter besprochen, dienten die Syndrompatienten nicht nur der
Überprüfung der Methode (z.B. Trisomie 21/Downsyndrome), sondern auch der
exakten Definition der chromosomalen Bruchpunkte und der genotypische
65
Zuordnung, wie am Beispiel des William-Beuren-Syndromes noch genauer diskutiert
wird.
Die Array CGH erkannte alle Veränderungen, die bereits aufgrund der
humangenetischen Analyse bekannt waren oder erwartet wurden, wie z.B. die einfach
zu diagnostizierenden Trisomien 21 oder ein Fall mit William Beurens Syndrom.
Jedoch bereits beim zweiten Fall mit William Beurens Syndrom, die genetische
Diagnose sprach hier lediglich von einem Verdacht auf William Beurens Syndrom,
konnte die Array CGH den Befund durch Detektion der typischen Deletion auf 7q
bestätigen.
Numerische Aberrationen von Chromosomen entstehen meistens als Resultat
einer "non-disjunction" in der Meiose. Aus bestimmten Gründen trennen sich in einer
der beiden meiotischen Teilungen die homologen Chromosomen gelegentlich nicht,
so daß beide Chromosomenhomologe in die Keimzelle gelangen. Die "nondisjunction" kann während der Entstehung der mütterlichen oder väterlichen
Geschlechtszellen auftreten. Bei der Trisomie 21 beruhen z.B. 80% der Fälle auf
"non-disjunction" in der mütterlichen und 20% in der väterlichen Meiose (23, 24).
Trisomie 21 war als erste numerische Chromosomenaberration bei Patienten mit
Down-Syndrom 1959 von Lejeune entdeckt worden. Die Personen mit Trisomie 21
haben gewöhnlich ein charakteristisches Erscheinungsbild und weisen multiple
Mißbildungen, unter anderem auch angeborene Herzfehler, auf (2, 26).
Die häufigste numerische Veränderung in unserer Patienten Liste war die
Trisomie 21. Das ist auch nicht weiter verwunderlich, da, wie oben beschrieben,
Herzfehler ein häufiger Bestandteil des klinischen Erscheinungsbildes des Down
Syndroms sind und außerdem die Trisomie 21 die einzige autosomale Trisomie ist,
die längere Zeit überlebt werden kann. Neuere molekular- zytogenetische Befunde
haben allerdings gezeigt, daß für die volle Ausprägung des Down Syndroms nur Teile
von Chromosom 21 unbalanziert sein müssen. Nichtsdestotrotz wurde in allen Proben
unserer Gruppe mit Down Syndrom, den Patienten 077E, 127E, 174E, 210E, 284E
und 351E, mittels Array CGH eine vollständige Trisomie 21 nachgewiesen.
Strukturelle Chromosomenaberrationen entstehen durch Umbauten innerhalb
eines Chromosoms (intrachromosomal) oder zwischen verschiedenen Chromosomen
(interchromosomal).
Der
Entstehung
struktureller
Aberrationen
gehen
Chromosomenbrüche voraus, die durch verschiedene Umweltfaktoren hervorgerufen
66
werden können, wie z.B. Radioaktivität, Drogen, Chemikalien oder Viren (25).
Verluste oder Zugewinne von Chromosomensegmenten führen zu unbalancierten
Genverhältnissen (Gene dosage). Strukturumbauten ohne Verlust oder Zugewinn
chromosomalen Materials werden als balanciert bezeichnet.
Tabelle 5 fast die jeweiligen Gewinne und Verluste zusammen. Um die
problematischen Auswirkungen von Artefakten zu minimieren, wurden nur solche
Veränderungen mit in die Tabelle aufgenommen, die mindestens zwei Klone
umfaßten. Durch diese Einschränkung reduzierte sich zwar die Auflösung der
Methode auf ca. 150-200kb, je nach chromosomaler Region, gleichzeitig sank aber
auch die Wahrscheinlichkeit, falsch positive Resultate zu generieren.
Unklar bleibt derzeit, inwieweit jede einzelne Veränderung mit dem Phänotyp
in kausalem Zusammenhang steht. Erst aufgrund der wachsenden Array CGH Daten
hat man erkannt, daß zwischen einzelnen Individuen beträchtliche Unterschiede im
DNA Gehalt vorkommen können. Diese Unterschiede können mehrere hundert kb
ausmachen (48) und liegen somit im Detektionsbereich der hochauflösenden Array
CGH. DNA Kopienzahl-Polymorphismen liegen oft in Regionen mit Häufung von
segmentalen Duplikation(28, 42). Es handelt sich dabei um „hot spots“ der
Genomentwicklung. Noch ist aber unklar, ob die Polymorphismen Ursache oder
Resultat der großen Dynamik dieser chromosomalen Abschnitte sind.
Erst der Abgleich der unserer Daten mit speziellen, derzeit aber erst in der
Entstehung befindlichen Datenbanken und vor allem die Analyse der Eltern kann
Klarheit bringen, ob es sich bei einem Unterschied in der DNA Kopienzahl um einen
phänotypisch neutralen DNA Kopiezahl-Polymorphismus oder möglicherweise doch
um eine de Novo Aberration handelt.
Die Möglichkeiten der Array CGH zeigt auch der Fall 113E. Bei dieser Probe
wurde eine kleine Duplikation auf 9q43.3 festgestellt, welche bei der konventionellen
CGH wegen der Auflösungsgrenze bei weitem nicht sichtbar gewesen wäre. In dem
Duplikationsbereich liegt das Gen für Collagen Type V COL5A1 (COLLAGEN
TYPE V ALPHA-1, OMIM: 120215). Ein Defekt in diesem Gen kann mit EhlersDanlos Syndrom (46) und Mitralklappenprolaps
(Defekt an der
zweizipfeligen
Segelklappe zwischen linkem Vorhof und linker Herzkammer) assoziiert sein.
67
Bei den Proben 340E und 142E wurde eine Duplikation auf Chromosom
11p15.5 beobachtet, dabei sind in beiden Fällen die gleichen Klone betroffen. Hier ist
eine neuerliche klinische Untersuchung angezeigt, die verdeutlichen soll, inwieweit
der überlappende Genotyp seine phänotypische Entsprechung findet.
Bei 5 von 36 Patienten Proben wurden DNA-Verluste beobachtet (Tab.5). Bei
den Proben 056E, 186E, 137E und 400E sind die Deletionen besonders deutlich
sichtbar. Die Probe 056E zeigt
eine diskontinuierliche, aus drei Abschnitten
bestehende Deletionen auf 4q. Zwei der Abschnitte (4q32.1-q32.3, 4q33-q35.1) sind
groß, der dritte ist sehr klein, liegt aber in der besonders genreichen subtelomeren
Region 4q35.2 Innerhalb des deletierten Bereiches liegen Gene wie Tolloid-Like 1;
TLL1(OMIM: 606742), welche für die normale Herzentwicklung essentiell sind.
Bei der Analyse der Proben 137E und 186E wurde eine Deletion auf 7q11.23
detektiert. In beiden Fällen liegen die Klone N0100D10, N0011I22, N0041F22 in der
deletierten Region.
Datenbanken
Ein Abgleich der Klonpositionen mit den entsprechenden
(http://bacpac.chori.org/genomicRearrays.php,
http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks?db=hg15&position=chr7:7198705673137391) zeigt, daß in dieser Region mehrere, mit dem Williams Beuren Syndrom
assoziierte Gene lokalisiert sind.(14, 30).
Die Patienten mit Williams-Beuren-Syndrom zeigen körperliche und geistige
Entwicklungsverzögerungen, die in einem charakteristisches Erscheinungsbild mit
angeborenen Fehlbildungen resultieren, unter anderem einem angeborenen Herzfehler
(Tab.2) (OMIM #194050 WILLIAMS-BEUREN SYNDROME; WBS). Die WBS
Deletionsregion wird von drei low-copy-Repeats-reichen Blöcke (A, B, C) flankiert .
Die überwiegende Anzahl der Patienten (95%) mit WBS weisen eine 7q11.23
Deletion in der Größe von 1,5 Mb auf. (47). Nur eine Minderheit der Patienten (5%)
zeigt eine Deletion von 1,8 Mb in dem entsprechenden Bereich. Die Lage der
Bruchpunkte bestimmt die Größe der Deletion. Wenn die Bruchpunkte in dem lowcopy-Repeats-reichen Block B liegen, umfaßt die Deletion ~1,55 Mb. Wenn aber die
Bruchpunkte im Block A liegen, so ist die Deletion ~1,8 Mb groß. (47). Bei der
Deletion im Fall 137E war die Bruchpunktbestimmung erschwert, da die Klone an
diesen Punkten nicht überlappend waren und etwas weiter auseinander lagen. In
beiden Fällen beträgt die Größe der Deletion ca. 1,5 Mb. Damit gehören beide Fälle
mit Williams Beuren zu jenen 95%, in denen der Bruchpunkt im low-copy repeat
reichen B-block liegt.
68
Diese Studie hat deutlich gezeigt , daß eine große Zahl von Herzfehlbildungen
mit chromosomalen Veränderungen assoziiert ist und von diesen mit großer
Wahrscheinlichkeit verursacht werden. Die Ergebnisse dieser Studie ermutigen zu
Projekten mit einer größeren Patientengruppe. Dabei sollte das Ziel sein, trotz der zu
erwartenden
Bandbreite
der
chromosomalen
Veränderungen,
genotypische
Subklassifizierungen durchzuführen, diagnostische Marker zu entwickeln (z.B. für
klinische Test auf FISH Basis) und schließlich, die für die Herzentwicklung
bedeutsamsten Gene zu identifizieren.
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73
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6. Anhang
75
Nr.1 (113E)
Nr. 2 (071E)
76
Nr.3 (208E)
Nr.4 (328E)
77
Nr.5 (111E)
Nr.6 (067E)
78
Nr.7 (133E)
Nr.8 (281E)
79
Nr.9 (350E)
Nr.11 (340E)
80
Nr. 12 (082E)
Nr.13 (349E)
81
Nr.14 (056E)
Nr. 15 (186E)
82
Nr.16 (142E)
Nr. 17 (386E)
83
Nr. 18 (206E)
Nr. 19 (373E)
84
Nr. 20 (091E)
Nr.21 (162E)
85
Nr.22 (079E)
Nr.23 (139E)
86
Nr.24 (368E)
Nr.25 (011E)
87
Nr. 26 (010E)
Nr. 28 (007E)
88
Nr. 29 (261E)
Nr 30 (137E)
89
Nr. 31 (077E)
Nr. 32 (127E)
m/
w
90
Nr. 33 (174E)
Nr. 34 (210E)
91
Nr. 35 (284E)
Nr. 36 (351E)
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Nr. 37 (399E)
Nr.38 (400E)
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Kontrolle S
94
Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich bei
- Prof. Dr. H.-Hilger Ropers MPI für molekulare Genetik und PD Dr. W. Schuster
FU Berlin , Institut für Biologie/ An. Genetik für die Möglichkeit am MPI meine
Diplomarbeit zu machen und freundliche persönliche Betreuung.
- Dr. R. Ullmann und Dr. F. Erdogan für die praktische Einarbeitung und zahlreiche
wertvollen Ratschläge bei der Durchführung meiner Arbeit.
95
Eidesstattliche Erklärung:
Hiermit erkläre ich, daß die Diplomarbeit von mir selbst und ohne die Hilfe Dritter
verfaßt wurde, auch in Teilen keine Kopie anderer Arbeiten darstellt und die
benutzten Hilfsmittel sowie die Literatur vollständig angegeben sind.
Berlin 03.03.2005
Drozdenko Gennadiy
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