Skript Gene_Knockout_Revision_1.2

Herstellung einer Null-Mutation durch homologe Rekombination
Version 1.2.
Jörg Kämper (Tel: 178630), Björn Sandrock (Tel: 2827080)
Andrea Hlubek, Chetsada Pothiratana
Hintergrund
Der phytopathogene Basidiomycet Ustilago maydis ist der Erreger des Maisbeulenbrands, einer
weltweit verbreiteten Pflanzenkrankheit. Ustilago maydis hat sich in den letzten Jahren zu einem
der wenigen Modellorganismen für phytopathogene Pilze entwickelt. Der Pilz kann, im Gegensatz
zu vielen anderen phytopathogenen Pilzen, problemlos auf artifiziellen Medien kultiviert werden
und ist dabei, ähnlich wie die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, für eine Vielzahl von
molekularen Techniken zugänglich. So lässt sich U. maydis leicht transformieren, und über das
Einbringen von modifizierten Genen lassen sich endogene Gene durch homologe Rekombination
spezifisch ausschalten oder gezielt verändern.
Ähnlich wie andere pflanzen- oder humanpathogene Pilze durchläuft U. maydis während seines
Lebenszyklus verschiedene morphologisch unterscheidbare Phasen. Seine haploiden, Sporidien
genannten Zellen vermehren sich hefeartig durch Sprossung und wachsen ausschließlich
saprophytisch, d.h. sie können die Wirtspflanze nicht infizieren. Nach der Fusion zweier Sporidien
kommt es zur Bildung eines Dikaryons, das nun filamentös wächst. Im Gegensatz zu den
Sporidien ist das Dikaryon in der Lage, Maispflanzen zu infizieren; mehr noch, für die
Vermehrung ist es sogar auf die Wirtspflanze angewiesen.
Die Fusion der Sporidien, die zur Bildung des infektiösen Dikaryons führt, wird genetisch durch
zwei verschiedene Kreuzungstyp-Loci, die a und b genannt werden, kontrolliert. Zur Etablierung
eines stabilen Dikaryons müssen die Sporidien sowohl verschiedene Allele des biallelischen aLocus als auch verschiedene Allele des multiallelischen b-Locus tragen. Deshalb ist eine a1b1
Sporidie kompatibel mit einer a2b2 Sporidie, nicht aber mit a1b12 oder a2b1 Sporidien. Der aLocus kontrolliert die Zellerkennung und Zellfusion über ein Pheromon-Rezeptor System. Nach
der Zellfusion wird über ein vom b-Locus kodiertes intrazelluläres Selbst-Nichtselbst
Erkennungssystem entschieden, ob es zu den beschriebenen morphologischen Veränderungen, d.h.
dem Wechsel von hefeartigem Wachstum zum typischen Spitzenwachstum des Filaments kommt
und ob die weiteren Schritte für die sexuelle und pathogene Entwicklung initiiert werden. Da diese
Prozesse erwiesenermaßen unabhängig vom a-Locus ablaufen, kommt dem b-Locus die Rolle
eines zentralen molekularen Schalters für die Pathogenese zu.
Der b-Locus kodiert für zwei unterschiedliche Homeodomänenproteine, bE und bW. Die beiden
Proteine zeigen, mit Ausnahme der Homeodomänen, einem konservierten DNA-Binde-Motiv,
1
keine Ähnlichkeiten zueinander auf. Vergleicht man die bE Proteine verschiedener b-Allele, zeigt
sich, dass der C-terminale Bereich der Proteine hoch konserviert ist, während sich die allelischen
Unterschiede in den N-terminalen Bereichen häufen. Diese Unterscheidung in eine N-terminale,
variable Domäne und eine C-terminale konstante Domäne findet man in ähnlicher Form auch bei
den bW-Proteinen.
rb2.1n
rb2.2n
Abb.1: a) Aufbau des b-Locus in U. maydis. b) Homologie der rb-Flanke (b2) mit dem
entsprechenden Bereich in b1.
2
Die molekulare Grundlage für die Selbst-Nichtselbst-Erkennung der verschieden Allele liegt auf
der Ebene der Protein-Dimerisierung. Die bE-und bW-Proteine können über die variablen
Domänen ein Heterodimer bilden, allerdings nur, wenn sie von verschiedenen Allelen stammen.
Gene können in U. maydis über homologe Rekombinationsereignisse ausgetauscht werden. In der
Regel wird dazu ein Resistenzgen verwendet, das auf beiden Seiten von zum Intergrationsort
homologen Bereichen flankiert wird. Diese Bereiche sind so gewählt, dass das auszuschaltende
Gen durch das Resistenzgen ersetzt wird. In den meisten Fällen werden Flanken verwendet, die ca.
1000 bp lang sind.
In diesem Praktikumsversuch werden wir das bW Gen in U. maydis deletieren.
Wir verwenden ein Hygromycin-Resistenzgen, das von Sequenzen des b2-Locus flankiert wird
(Abb. 1a). Die lb-Flanke (left border) liegt 3´ vom bW2-Gen, die rb-Flanke umfasst den 5´Bereich
des bW2 Gens und den 5´Bereich des bE2 Gens (Abb. 1a). Da bW2 und bE2 divergent angeordnet
sind, wird im Falle einer homologen Rekombination in den b2 Locus des Stammes FB2 (a2b2) ein
Großteil des bW2-Gens deletiert, während das bE2 Gen funktionell erhalten bleiben sollte.
Bei Transformation in den Stamm FB1 (a1b1), der statt des b2 Locus den b1 Locus trägt, sollte es
ebenfalls zu homologen Integrations-Ereignissen kommen. Dabei ist die lb-Flanke 100% homolog
zu dem Bereich 3´ des bW1-Gens; außerhalb der bE und bW Gene unterschieden sich b1 und b2
nur in wenigen Nukleotiden. Die rb-Flanke liegt hingegen im variablen Bereich des bE Gens; in
Folge ist die rb-Flanke nur zu 73% identisch zum entsprechenden Bereich in b1 (Abb. 1b). Dabei
verwenden wir zwei verschiedene Konstrukte, die sich geringfügig in der Länge der rb-Flanke
unterscheiden: in einem Fall sind die letzten Nukleotide am Ende des linearen Konstrukts
homolog zum Rekombinationsort in bE1, im anderen Fall fehlt dieser kurze homologe Bereich
(Abb. 1b).
Die Spezifität der bE Gene kann durch die Rekombiantion verändert werden. Speziell bei
Rekombination des bE2 Konstrukts in den bE1 Hintergrund können chimäre Allele entstehen.
Abhängig davon, an welcher Stelle die Rekombination erfolgt, könnte die Spezifität der bE Gene
verändert werden.
3
Fragestellungen:
1: Ist die homologe Rekombinationsfrequenz des b2-KO-Konstrukts im b1 und b2
Hintergrund unterschiedlich?
2: Hat das "homologe" Ende der rb-Flanke einen Einfluss auf die homologe
Rekombinationsfrequenz im b1 Hintergrund?
3: Wie (und wo) findet die Rekombination im "heterologen" bE Bereich im b1 Hintergrund
statt? An den Enden? Innerhalb des Fragments?
4: Kommt es zur Bildung von chimären bE Allelen? Was ist die Spezifität solcher chimären
Allele?
Generell: Die mit * markierten Puffer/Lösungen erhalten Sie von den Betreuern. ALLE
ANDEREN LÖSUNGEN MÜSSEN SIE SELBST ANSETZEN! PLANEN SIE DESHALB 12 TAGE VORAUS!
1. Praktikumstag
1. PCR-Amplifikation des KO-Konstrukts
2. Test der PCR-Amplifikation auf Agarosegel
3. Herstellen der Protoplasten von Ustilago maydis
4. Transformation von Ustilago maydis
1. PCR-Amplifikation des KO-Konstrukts
283 Eco RI •
597 Pst I •
Abb. 2: Plasmidkarte
pCR-b-ko-neu(+)
lb
129 6 Sfi I •
158 4 Pst I •
159 4 Not I •
pCR-b-ko-neu(+)
hph
• Nco I 5 785
7837 bp
227 1 Nco I •
229 0 Pst I •
238 0 Eco RI •
• Pst I 5 402
262 5 Nco I •
318 0 Sfi I •
• Not I 4 256
• Pst I 4 235
• Eco RI 4 230
• Sna BI 4 121
rb
376 7 Eco RI •
4
Das Plasmid pCR-b-ko-neu(+) (Abb. 2) enthält das bakterielle Hygromycin-PhosphotransferaseGen (hph) unter Kontrolle des U. maydis hsp70-Promotors und terminiert durch den
Agrobakterium Nos-Terminator. Flankiert wird dieses Gen von zwei ca. 1 kb DNA Fragmenten,
die eine Integration der DNA über ein homologes Rekombinationsereignis ermöglichen sollen.
Wir verwenden für die Amplifikation des KO-Konstrukts zwei verschiedene PrimerKombinationen. Der Primer auf der Seite der lb-Flanke (lb1) wird konstant gehalten, auf der Seite
der rb-Flanke verwenden wir die Primer rb2.1n und, alternativ, rb2.2n. Die
Amplifikationsprodukte unterscheiden sich, wie in Abb. 1b dargestellt, durch einen kurzen
Bereich homologer Nukleotide am Ende der rb-Flanke.
Aufgabe ist es, die zwei verschiedenen PCR Produkte jeweils in Protoplasten der Stämme FB1
und FB2 zu transformieren (4 Transformationen). Als zusätzliche Kontrolle für die
Transformationskompetenz der Protoplasten transformieren Sie 1g des autonom replizierenden
Plasmids pNEBUH (2 Transformationen)
Praktischer Teil:
PCR-Amplifikation mit Phusion-DNA-Polymerase
Primer-Kombinationen:
A) lb1, b-rb2.2n
B) lb1, b-rb2.1n
1 l
20 l
1 l
1 l
1 l
3 l
0.5 l
ad 100 l
Plasmid-Template (10 ng/l)
5 x Phusion-Puffer*
10 mM dNTP*
Primer 1 (50 pmol/l)
Primer 2 (50 pmol/l)
DMSO*
Phusion Polymerase (2U/l)
ddH2O
Cycling:
1x
30x
1x
30 sec 98C
10 sec 98C
15 sec 65C
75 sec 72
10 min 72C
b-rb2.1n
GAAGCATCGGCTTTCTTCAAGGCT
5
b-rb2.2n
lb1
CGACACCCTACAACAGGACTTGAA
GAAGCTAGCGGAAAAGTGGGTGAG
EtOH Präzipitation der PCR-Produkte
(siehe Material und Methoden)
Aufnehmen des Pellets in 25 l TE Puffer
Transformation von Ustilago maydis mit linearer DNA
Herstellung von Protoplasten von U. maydis
50 ml Kultur in YEPS Medium bei 28°C bis zu einer Zelldichte von ca. 5x107/ml (OD 0.6 bis 1.0)
angezogen (stationäre Vorkultur 1:100, 1:300, 1:1000 verdünnen, über Nacht bei 28°C, 200 rpm in
Schikanekolben inkubieren)
7 min. bei 2500g (Hereaus, 3500 rpm) in 50 ml Falkonröhrchen abzentrifugieren
Zellpellet wird in 25 ml SCS-Puffer resuspendiert
erneut 7 min. bei 2500 g (3500 rpm) zentrifugieren
Pellet in 2 ml SCS mit 5 mg/ml Novozym 234 (steril filtriert durch 0.2 m Filter)
resuspendieren
Protoplastierung erfolgt bei Raumtemperatur und wird mikroskopisch alle 5 min. verfolgt
Protoplasten werden mit 10 ml SCS-Puffer gemischt und bei 1100 g (2300 rpm) 10 min.
zentrifugiert, der Überstand wird verworfen
Pellet wird vorsichtig in 10 ml SCS Puffer resuspendiert (auf und ab-pipettieren mit 10 ml
Pipette) und erneut zentrifugiert
Waschvorgang mit SCS-Puffer 2 X wiederholen
Pellet in 10 ml STC-Puffer vorsichtig resuspendieren, 10 min. zentrifugieren, der Überstand wird
verworfen
Pellet in 500 µl kaltem STC-Puffer resuspendieren und auf Eis gehalten
Aliquots können mehrere Monate bei -80°C gelagert werden (Vorsichtig auf Eis auftauen)
SCS-Puffer*
20 mM NaCitrat pH 5.8
1.0 M Sorbit
(20 mM NaCitrat/ 1.0 M Sorbit
und 20 mM Zitronensäure/ 1.0 M Sorbit
mischen und mit pH-Meter auf pH 5.8
einstellen)
STC-Puffer*
10 mM Tris/HCL pH 7.5
1.0 M Sorbit
100 mM CaCl2
6
Transformation von U. maydis Protoplasten
Max 10 µl linearisierte DNA (optimal 3-5 µg) wird in ein 2 ml Eppendorfröhrchen übertragen
1 µl Heparin (15 µg/µl) werden zugesetzt (SIGMA H3125)
50 µl Protoplasten werden zugesetzt, 10 min. auf Eis lassen
500 µl 40% (w/w) PEG3350 (SIGMA P3640) in STC (steril filtriert, wird gestellt) werden
zugesetzt, und VORSICHTIG mit der Protoplastensuspension gemischt
15 min. Inkubation auf Eis
Ausplattieren auf Gradienten-Platten: 1 ml Glaspipette wird zum Verteilen benutzt
(Unterer Agar: 10 ml YEPS-1,5% Agar-1M Sorbitol mit Antibiotikum (siehe unten).
Kurz vor dem Ausplattieren wird diese Agarschicht mit 10 ml YEPS- 1,5% Agar-1M
Sorbitol überschichtet. Medium für Gradientenplatten wird gestellt!
Die Platten werden 3-4 Tage bei 28°C inkubiert
Stammlösung
Phleomycin 8 mg/ml
Carboxin
5 mg/ml (in MethOH)
Hygromycin 50 mg/ml
Flüssigmedium
40 µg/ml
2 µg/ml
200 µg/ml
Festmedium
40 µg/ml *
2 µg/ml
200 µg/ml
Bottom-Agar
80 µg/ml
4 µg/ml
400 µg/ml
ClonNAT
150 µg/ml
150 µg/ml
300 µg/ml
200 mg/ml
* Phleomycin-Festmedium muß pH-stabilisiert werden:
:
2.4% (w/v)Potatoe Dextroe Broth (Bacto)
10% (w/v) 1 M Tris/HCl pH 7.5
2% (w/v) Agar (Difco)
2. Praktikumstag
1. Isolierung von Transformanden
2. Kreuzung mit kompatiblen Stämmen
Die Transformanden werden phänotypisch auf homologe Rekombinationsereignisse im b-Locus
untersucht. Dazu werden die FB1 Transformanden mit dem Stamm RK1661 (a2bE2) und die FB2
Transformanden mit dem Stamm RK1607 (a1bE1) gekreuzt, um zu untersuchen, ob das bW1-Gen
(in FB1) bzw. bW2-Gen (in FB2) inaktiviert wurde. Die Funktionalität der bE Gene wird durch
7
Kreuzung der FB1 Transformanden mit den Stämmen RK1724 (a2bW1) und RK1722 (a2bW2),
und der FB2 Transformanden mit RK1725 (a1bW1) und RK1723 (a1bW2) untersucht.
Die Spezifität der bE Gene kann durch die Rekombiantion verändert werden. Speziell bei
Rekombination des bE2 Konstrukts in den bE1 Hintergrund können chimäre Allele entstehen.
Abhängig davon, an welcher Stelle die Rekombination erfolgt, könnte die Spezifität der bE Gene
verändert sein (b1, b2, bNull, oder b1+b2 oder ????)
Von interessanten Transformanten soll in der Folge DNA präpariert werden, um die
Rekombinationsereignisse genauer zu charakterisieren.
Praktischer Teil:
Von den Transformationsplatten werden pro Transformation 10 Transformanden mit flachen
Zahnstochern in 100 l YEPS Medium transferiert und resuspendiert.
Von den resuspendierten Transformanden werden ZUERST je 10 µl Zellsuspension auf eine PDPlatte mit 200 µg/ml Hygromycin getropft (MÖGLICHST STERIL ARBEITEN!). Danach werden
von jeder Transformante und, als Kontrolle, von den wt-Stämmen FB1 und FB2 jeweils 15 l mit
15 l der entsprechenden Kreuzungspartner in einer Mikrotiterplatte gemischt. Von der Mischung
werden 3 auf der Oberfläche einer PD-Aktivkohleplatte getropft. Die Oberfläche der Platte sollte
dabei möglichst nicht beschädigt werden.
Die PD-hyg Platten werden bei 28°C, die PD-Aktivkohle Platten bei Raumtemperatur inkubiert.
3. Praktikumstag
1. Auswertung der Kreuzungen
2. Ansetzen von 3 ml Kulturen
3. PCR Amplifikation der Sonde (siehe auch 4. Praktikumstag)
Praktischer Teil:
Von insgesamt 10 Transformanden, die einen interessanten Phänotyp zeigen (siehe Seite 4)
werden 3 ml Kulturen in YEPS-Medium mit 100 µg/ml Hygromycin von den getropften PD-hyg
Platten angesetzt. Als Kontrollen werden FB1 und FB2 in Medium ohne Hygromycin angezogen.
8
PCR-Amplifikation der Sonde:
10 l
1 l
1l
1 l
0.01 g
2U
10x PCR-Puffer (100 mM Tris/HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 20 mM
MgCl2)
Primer 1 (50 pmol/l): b-rb2.2n
Primer 2 (50 pmol/l): b-rb1n
dNTP (10 mM)
pCR-b-ko-neu(+)
Taq-Polymerase
ad 100 l mit dH2O
1x
30 x
1x
10 min 94°C
1 min 94°C
1 min 60°C
1.5 min 72°C
10 min 72°C
b-rb2.2n
b-rb1n
CGACACCCTACAACAGGACTTGAA
gtgggccatctaggccACTGCTTCGGAGTCGTGTCCACGA
4. Praktikumstag
1. Präparation genomischer DNA aus Ustilago maydis Transformanden
2. Restriktion und Gelelektrophorese der genomischen DNA mit SalI
3. PCR-Amplifikation der Integrationsstellen
4. Aufreinigung der Sonde mit PCR-Purification Columns
5. Markierung der Sonde
6. Übertragung der DNA auf einen Nylonfilter (Southern blot)
Ziel ist es, die Transformanden näher zu charakterisieren, um die auf S. 3 gestellten Fragen
beantworten zu könnnen. Die homologe Integration kann zum einen durch einen Southern-Blot
verifiziert werden. Die DNA wird dazu mit SalI geschnitten, gelelektrophoretisch aufgetrennt, und
auf eine Nylonmembran übertragen. Durch Hybridisierung mit einer markierten Sonde (der rbFlanke) kann ein definiertes Fragment im Wildtyp detektiert werden, das sich durch die homologe
Rekombination verändert. Das KO-Konstrukt hat keine SalI Schnittstelle. Sie können die
erwarteten Banden aus der genomischen Karte errechnen; Orientierungspunkte sind die PstI und
SnaBI Schnittstellen.
9
103 7 Sal I •
339 2 Sal I •
244 8 Pst I •
375 2 Sal I •
b1 total.strider
103 7 Sal I •
674 3 Sal I •
655 0 Sal I •
7969 bp
Mode: Global
655 3 Sal I •
579 3 Sna BI •
544 0 Eco RI •
339 2 Sal I •
244 8 Pst I •
375 5 Sal I •
b2 total.strider
766 2 Eco RI •
7968 bp
766 1 Eco RI •
Mode: Global
bW1-Gen: 5360 - 3155
bW2-Gen: 5362 - 3155
bE1- Gen: 5564 - 7059
bE2- Gen: 5561 - 7059
Sonde (rb): 4866 - 5895
lb: 2147 - 3132
Eine alternative Methodik, homologe Integrationsereignisse zu charakterisieren (NICHT
GLEICHBEDEUTEND MIT SOUTHERN-BLOT! WARUM?) ist es, eine diagnostische PCR
Reaktion durchzuführen. Dabei wird ein Primer aus der KO-Kassette gewählt, der andere Primer
in einem Bereich der genomischen DNA, der kurz ausserhalb des für die Rekombination
verwendeten Bereichs liegt. Eine Amplifikation ist demnach nur möglich, wenn das KO-Konstrukt
homolog integriert ist. Wir verwenden die Primer hhn5n (liegt am 5´-Ende der HygromycinKassette, gerichtet auf die rb-Flanke; Position 2985 - 3006 in pCR-b-KO-neu(+), und bE_171-164,
Position 6078 - 6057 in der Sequenz b2 total.strider.
Die Primerkombinationen können sowohl für eine PCR im b1 als auch im b2 Hintergrund
verwendet werden, bE_171-164, liegt im konstanten Bereich der bE-Gene. Durch die beiden
Primer wird der variable Bereich der bE-Gene amplifiziert. Dieser Bereich kann durch
charakteristische HaeIII und TaqI Restriktionsmuster typisiert werden. Aus den Abweichungen
des bE1 bzw bE2 typischen Restriktionsmusters kann auf Rekombinationsereignisse innerhalb
dieses Bereichs geschlossen werden.
10
31 Hae III •
22 Hae III •
490 Hae III •
385 Hae III •
b1-PCRn2
149 Taq I •
127 Taq I •
691 Hae III •
1143 bp
Mode: Global
366 Taq I •
340 Taq I •
329 Taq I •
787 Taq I •
b1-PCRn2
1143 bp
112 0 Taq I •
106 1 Taq I •
967 Taq I •
Mode: Global
Ende b-rb2.1n entspricht Position 1044
Ende b-rb2.2n entspricht Position 1064
Digested Sequence: b1-PCRn2
Enzymes selected
----------------------------------1
HaeIII
gg/cc
Sites
----5
Digestion generates 6 fragments:
Upstream cut site
------------------------------------------Site
Enzyme
Site orientation
position name
Recognition sequence |
-------- ---------- -------------------- 691
31
490
385
1
22
HaeIII
HaeIII
HaeIII
HaeIII
=
HaeIII
gg/cc
gg/cc
gg/cc
gg/cc
1
TaqI
|
|
|
|
|
|
gg/cc
Enzymes selected
----------------------------------t/cga
DNA fragment
----------------------------------------Upstream
True DS
Downstream
overhang
Order length
overhang
------------ --- -------- ----------------------------------------------------
6
3
5
4
1
2
451
354
201
105
23
9
-----------------------------------------
|
|
|
|
|
|
Downstream cut site
------------------------------------------Site orientation
Enzyme
Site
| Recognition sequence name
position
- -------------------- ---------- -------gg/cc
gg/cc
gg/cc
gg/cc
gg/cc
=
HaeIII
HaeIII
HaeIII
HaeIII
HaeIII
1143
385
691
490
22
31
Sites
----9
Digestion generates 10 fragments:
Upstream cut site
------------------------------------------Site
Enzyme
Site orientation
position name
Recognition sequence |
-------- ---------- -------------------- 366
149
787
1
967
1061
340
1120
127
329
TaqI
TaqI
TaqI
=
TaqI
TaqI
TaqI
TaqI
TaqI
TaqI
t/cga
t/cga
t/cga
t/cga
t/cga
t/cga
t/cga
t/cga
t/cga
DNA fragment
----------------------------------------Upstream
True DS
Downstream
overhang
Order length
overhang
------------ --- -------- -----------5’
5’
5’
|
5’
5’
5’
5’
5’
5’
-------CG
-------CG
-------CG
-------CG
-------CG
-------CG
-------CG
-------CG
-------CG
6
3
7
1
8
9
5
10
2
4
419
178
178
127
92
57
24
21
20
9
11
gc------gc------gc------gc------gc------gc------gc-------
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
|
gc------- 5’
gc------- 5’
Downstream cut site
------------------------------------------Site orientation
Enzyme
Site
| Recognition sequence name
position
- -------------------- ---------- -------t/cga
t/cga
t/cga
t/cga
t/cga
t/cga
t/cga
t/cga
t/cga
TaqI
TaqI
TaqI
TaqI
TaqI
TaqI
TaqI
=
TaqI
TaqI
787
329
967
127
1061
1120
366
1143
149
340
31 Hae III •
22 Hae III •
363 Hae III •
605 Hae III •
b2-PCRn2
955 Hae III •
1145 bp
Mode: Global
789 Taq I •
b2-PCRn2
1145 bp
969 Taq I •
112 2 Taq I •
Mode: Global
Ende b-rb2.1n entspricht Position 1044
Ende b-rb2.2n entspricht Position 1064
Digested Sequence: b2-PCRn2
Enzymes selected
----------------------------------1
HaeIII
gg/cc
Sites
----5
Digestion generates 6 fragments:
Upstream cut site
------------------------------------------Site
Enzyme
Site orientation
position name
Recognition sequence |
-------- ---------- -------------------- 605
31
363
955
1
22
HaeIII
HaeIII
HaeIII
HaeIII
=
HaeIII
gg/cc
gg/cc
gg/cc
gg/cc
DNA fragment
----------------------------------------Upstream
True DS
Downstream
overhang
Order length
overhang
------------ --- -------- -----------|
|
|
|
|
|
gg/cc
-----------------------------------------
5
3
4
6
1
2
350
332
242
189
23
9
--------- |
--------- |
--------- |
|
--------- |
--------- |
Downstream cut site
------------------------------------------Site orientation
Enzyme
Site
| Recognition sequence name
position
- -------------------- ---------- -------gg/cc
gg/cc
gg/cc
gg/cc
gg/cc
HaeIII
HaeIII
HaeIII
=
HaeIII
HaeIII
955
363
605
1145
22
31
Digested Sequence: b2-PCRn2
Enzymes selected
----------------------------------1
TaqI
t/cga
Sites
----3
Digestion generates 4 fragments:
Upstream cut site
------------------------------------------Site
Enzyme
Site orientation
position name
Recognition sequence |
-------- ---------- -------------------- 1
789
969
1122
=
TaqI
TaqI
TaqI
t/cga
t/cga
t/cga
DNA fragment
----------------------------------------Upstream
True DS
Downstream
overhang
Order length
overhang
------------ --- -------- -----------|
5’ -------CG
5’ -------CG
5’ -------CG
1
2
3
4
789
178
151
21
gc------- 5’
gc------- 5’
gc------- 5’
|
Downstream cut site
------------------------------------------Site orientation
Enzyme
Site
| Recognition sequence name
position
- -------------------- ---------- -------t/cga
t/cga
t/cga
TaqI
TaqI
TaqI
=
Am Vortag haben Sie bereits eine PCR durchgeführt, um die Sonde für die Hybridisierung zu
generieren. Die PCR Reaktion wird über eine PCR-Purification Column (Quiagen) aufgereinigt,
durch die die Primermoleküle entfernt und die DNA generell aufreinigt.
12
789
969
1122
1145
Die aufgereinigte DNA (1 l ) wird auf einem Gel überprüft. Die vier besten DNA-Präparationen
des Kurses werden nach Vorschrift (Dig-DNA labelling kit) über Nacht mit Digoxygenin markiert.
Praktischer Teil:
DNA-Präparation aus U. maydis
2 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße werden mit 0.3 g Glasperlen (425-600 Micron, mit Säure
gewaschen) versetzt;
1,8 ml der Kultur zugeben
2 min bei 13000 U/m abzentrifugieren; Überstand verwerfen.
400 µl Usti-Lysis-Puffer zugeben
500 µl Phenol/Chloroform (1:1) zugeben (Handschuhe, Schutzbrille, Abzug!)
6 - 10 min auf Vibrax schütteln (Handschuhe, Schutzbrille, Abzug!)
15 min bei 13000 U/m abzentrifugieren.
400 µl Überstand in neues Eppendorfgefäß überführen (Handschuhe, Schutzbrille, Abzug!), 1
ml EtOH zugeben , gut schütteln!
5 min bei Raumtemperatur stehen lassen.
5 min bei 13000 U/m abzentrifugieren, Überstand verwerfen
1 ml 70% EtOH zugeben, ohne das Pellet von der Wand zu lösen
5 min bei 13000 U/m abzentrifugieren, darauf achten, das das Pellet aussen zu liegen kommt.
Überstand verwerfen, erneut anzentrifugieren, EtOH-Reste entfernen, evtl, erneut anzentrifugieren,
um EtOH Reste vollständig zu entfernen.
Bei RT 5-10 min trocken lassen. NICHT ÜBERTROCKNEN!
Pellet in 50 µl TE/RNAse aufnehmen und mind. 30 min bei 60° C lösen.
TE/RNAse:
10 mM Tris/HCl pH 8.0
1 mM EDTA
20 µg/ml RNAseA
Lysis-Puffer: 2% Triton X-100
1% SDS
100 mM NaCl
10 mM Tris-HCl pH 8.0
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1 mM EDTA
Restriktion der genomischen DNA:
10 µl der Gesamt-DNA werden mit SalI geschnitten, als Kontrolle dient DNA der Stämme FB1
und FB2. Der Restriktionsansatz besteht in einem Gesamtvolumen von 20 µl aus
10 µl DNA
2.0 µl 10 x SalI Puffer
1 µl BSA (1mg/ml)
1 µl RNaseA (1mg/ml)
1 µl SalI (20 U/µl)
Die Inkubation erfolgt für 2 Stunden bei 37°C. Die Fragmente werden auf einem 0.8%igen
Agarosegel aufgetrennt (siehe Material und Methoden). Als Standard wird 10 µl eines 1 kb-LeiterGrößenmarkers aufgetragen.
Alkalischer Transfer von DNA auf Nylonmembranen
- Das Agarosegel wird für 15 Min. in 0,25 N HCl auf dem Schüttler inkubiert. Dies dient dazu,
einen Teil der Purine abzuspalten, um den Transfer großer DNA-Moleküle zu erleichtern.
- Anschließend wird das Gel für 15 Min. in DENAT (Denaturierungslösung: 1,5 M NaCl, 0,4 M
NaOH) inkubiert.
- Der Transfer erfolgt mit 0,4 M NaOH durch Kapillarblot. Auf einer Glasplatte wird das Gel auf
Blottingpapier, das auf beiden Seiten in 0,4 M NaOH eintaucht, gelegt. Um das Gel herum
werden Streifen von Parafilm gelegt.
- Auf das Gel wird ein passendes Stück Nylonfilter gelegt und anschließend drei Lagen
zugeschnittenes Blottingpapier. Darüber kommt ein Stapel (ca. 10 cm hoch) Einmalhandtücher.
Auf diesen Stapel wird noch eine Glasplatte zur Beschwerung gelegt.
PCR-Amplifikation der Insertionsstelle:
10 l
10x PCR-Puffer (100 mM Tris/HCl pH 8.3, 500 mM KCl,
20 mM MgCl2)
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1 l
1l
1 l
0.1 g
2U
Primer 1 (50 pmol/l): hhn5n
Primer 2 (50 pmol/l): bE_171-164
dNTP (10 mM)
genomische DNA
Taq-Polymerase
ad 100 l mit dH2O
Cycling:
1x
30 x
1x
2 min 95°C
45 sec 95°C
60 sec 60°C
60 sec 72°C
10 min 72°C
Primer:
hhn3neu2
bE_const1
TCGCTGGTAGTTACCACGTTCGGC
CTTGAGTCGGATAAGGGTTGTCGAG
Aufreinigung von PCR-Produkten:
siehe Quiagen-Manual
Gelelektrophorese:
siehe Material und Methoden
Digoxygenin-Markierung der Sonde:
siehe Roche-Digoxygenin-Manual
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5. Praktikumstag
1. Überprüfung der DIG-Sonde
2. RFLP Analyse der PCR-Amplifikate vom Vortag mit TaqI und HaeIII
3. Auftrennung der Amplifikate auf Agarosegel
4. Hybridisierung des Nylonfilters mit der DNA-Sonde
Praktischer Teil:
Überprüfung der Sonde:
Siehe Original-Vorschrift von Roche.
Hybridisierung von Nylonfiltern
- Nach dem Blot wird der Filter kurz an der Luft getrocknet und anschließend wird die DNA durch
UV-crosslinking an die Membran gebunden (Stratalinker Auto-crosslink).
- Die Hybridisierung erfolgt bei 35°C in Dig-Easy-Hyb-Puffer (Roche) in einem Hybridisierungsofen. Nach einer Vorhybridisierung (siehe Vorschrift) wird die denaturierte (siehe Vorschrift)
digoxigenin-markierte Probe direkt in die Hybridisierungslösung gegeben.
RFLP-Analyse der PCR-Amplifikate
17 l PCR-Produkt
2 l 10 x HaeIII-Extra -Puffer bzw. 10 x TaqI-Extra-Puffer
1 l HaeIII bzw. TaqI Restriktionsenzym
Inkubation für 1.5 h bei 37°C (HaeIII) oder 65°C (TaqI)
Auftrennung auf einem 3% 0,5x TBE Agarosegel (Material und Methoden)
Marker: 100 bp Leiter (NEB)
10 x HaeIII-Extra*
10 x TaqI-Extra*
10 mM Tris/HCl pH 8.3
50 mM KCl
82 mM MgCl2
10 mM DTT
1 mg/ml BSA
10 mM Tris/HCl pH 8.3
550 mM KCl
82 mM MgCl2
1 mg/ml BSA
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6. Praktikumstag
1. Nachweis der markierten DNA mit Hilfe spezifischer Antikörper und
Chemilumineszenz
2. Auswertung der Hybridisierung
3. Gesamtauswertung
Die Hybridisierungslösung (ca. 30 ml) wird aus der Hybridisierungsröhre in ein Sarstedt–röhrchen
abgekippt und aufbewahrt, da sie mehrmals verwendet werden kann. Die Filter werden gewaschen
(siehe Vorschrift, Waschtemperatur: 55°C) und die gebundene Digoxigenin-markierte DNA wird
durch monoklonale Digoxigenin-spezifische Antikörper, die mit alkalischer Phosphatase
gekoppelt sind, nachgewiesen. Der Nachweis erfolgt durch ein Leuchtreagenz, das durch die
alkalische Phosphatase umgesetzt wird. Während der katalysierten Reaktion wird Licht erzeugt,
das auf einem Röntgenfilm eine Schwärzung hervorruft. Mit dieser Methode können noch etwa
0,1 pg homologer DNA nachgewiesen werden.
Praktischer Teil:
Waschen des Nylon-Filters nach dem Southern-Blot
Siehe Roche Protokoll
Lumineszenz Nachweis von Digoxigenin-markierten Nukleinsäuren auf Nylonmembranen:
Siehe Roche- Protokoll
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Material und Methoden
Medien
dYT
18 g Bacto Tryptone
10 g Bacto Yeast Extract
5 g NaCl
1 l H2O dest.
YEPS
10 g Yeast Extract (Difco)
4 g Bacto Peptone (Difco)
20 g Saccharose (für Mikrobiologie,
Merck) ad 1 l
für Platten werden 1.5% Agar vor dem Autoklavieren zugegeben.
PD-Aktivkohle-Platten
24 g Potato Dextrose Broth (Difco)
20 g Bacto Agar (Difco)
10 g Aktivkohle (Sigma Nr. 9157)
ad 1 l dH2O, autoklavieren bei 117°C
Häufig verwendete Puffer und Lösungen
TE-Puffer
10 mM Tris-HCl pH 7,9
1 mM Na2EDTA
Puffer für Restriktionsenzyme
10 x NEB 1
100 mM Bis Tris Propane/HCl pH 7.0
100 mM MgCl2
10 x NEB 2
100 mM Tris/HCl pH 7.9
100 mM MgCl2
10 mM DTT
500 mMNaCl
10 mM DTE
10 x NEB 3
500 mM Tris/HCl pH 7.9
100 mM MgCl2
1 M NaCl
10 mM DTE
10 x NEB 4
200 mM Tris/Acetate pH 7.9
100 mM MgCl2
500 mM K-Acetate
10 mM DTT
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10 x SalI-Puffer
100 mM Tris/Hcl pH 7.9
100 mM MgCl22
1.5 M NaCl
10 mM DTT
Methoden
Auftrennung von DNA auf Agarosegelen
Die Seiten der Gelform werden mit Klebeband verschlossen, der Kamm in die dafür vorgesehenen
Aussparungen eingesetzt und das Gel mit Agarose in TAE-Puffer gegossen (0.4% bis 4.0%
Agarose in TAE, durch Kochen in einer Mikrowelle gelöst und auf ca. 60 °C temperiert) (enthält
0.5 µg/ml Ethidiumbromid) Achtung! Handschuhe und Schutzbrille tragen! EtBr ist ein
starkes Cancerogen! Nach dem Erkalten der Agarose wird das Klebeband vorsichtig entfernt und
das Gel mit der Gelform in die Gelapparatur eigebracht und mit 1 x TAE-Puffer versehen, so daß
das Gel ca. 1-2 mm bedeckt ist. Die DNA wird mit 1/5 Vol. Auftragspuffer versetzt und auf das
Gel aufgetragen. Nach dem Beladen des Gels wird der Deckel geschlossen und die Spannung
angelegt. Pluspol (rot) an der den Taschen abgewandten Seite!!! Sicherheitshalber wird das
Einwandern der blauen Front (Bromphenolblau) nach 2 Min kontrolliert. Nach Beendigung des
Laufes wird das Gel auf der Form zu einem Transilluminator mit Videosystem gebracht und unter
UV-Licht (302 nm) photographiert. Schutzbrille und Schutzschirm benutzen!!!
1 x TAE-Puffer (Agarosegele):
40 mM Tris-Acetat pH 7,9
2 mM Na2EDTA
Auftragspuffer (6x)
0.25 % Bromphenolblau
40 % (w/v) Saccharose in H2O
0.5 x TBE-Puffer (Agarosegele)
50 mM Tris/Borat , pH 7.9
1 mM EDTA
Phenolextraktion und Fällung von DNA
Phenolextraktion
Die DNA sollte in einem Mindestvolumen von 100 µl H2O oder TE vorliegen. Zur DNA wird ein
gleiches Volumen Phenol/Chloroform gegeben (Unter dem Abzug arbeiten! Schutzbrille und
Handschuhe Tragen! Phenol führt zu starken Verbrennungen auf der Haut! Beim Einatmen
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kann es zu irreversiblen Schädigungen kommen!). Die beiden Phasen werden auf dem Vortex
gründlich (ca 20 sec) vermischt und anschließend für 2 bis 5 min bei 13000 Upm zentrifugiert. Die
obere, wässerige Phase mit der DNA wird vorsichtig, ohne die Interphase oder die Phenolphase
mitzunehmen (EXTREM WICHTIG!!!), mit einer Gilson-Pipette in ein neues Eppendorfgefäß
überführt. Phenolextrahierte DNA wird in der Regel mit EtOH gefällt.
Fällung von DNA
Zu einer DNA Lösung wird 1/10 Vol 3 M Na Acetat gegeben. Dann werden 2 Volumina Ethanol
zugegeben und gemischt. Nach 10 min Inkubation bei Raumtemperatur wird die DNA durch 5 - 15
Min. Zentrifugation bei 13000 Upm pelletiert; bei sehr geringen DNA-Mengen sollte die
Zentrifugation länger erfolgen. Die Gefäße werden so in der Zentrifuge angeordnet, daß das
"Scharnier" des Gefäßes nach außen zeigt. Dies erleichtert es, das Pellet wiederzufinden. Der
Überstand wird vorsichtig entfernt (z.B. mit einer Pipette oder durch vorsichtiges ausgießen), bitte
darauf achten, daß das Pellet nicht verlorengeht. Das Pellet wird mit ca 1 ml 70% Ethanol
gewaschen, um überschüssige Salze zu entfernen: der Alkohol wird auf das Pellet pipettiert, nach
Mischen wird erneut für 2 - 5 Min. bei 13000 Upm zentrifugiert. Der Überstand wird wie oben
entfernt; letzte Alkoholreste können vorsichtig nach erneutem Anzentrifugieren (wenige
Sekunden) mit einer gelben Spitze an der dem Pellet abgewandten Seite entfernt werden. Dieser
Schrittsollte wiederholt werden, bis kein Alkohol mehr sichtbar ist. Das Pellet wird dann an der
Luft getrocknet. Danach wird das Pellet in Wasser oder TE gelöst; für kleine DNAs wie Plasmide
geht dies innerhalb weniger Minuten, bei chromosomaler DNA braucht dieser Prozeß in der Regel
mehrere Stunden. Die DNA kann dabei auf 60 -65° erwärmt werden.
Restriktion von Plasmid-DNA
Dazu werden pro Eppendorfgefäß
ca. 1 µg DNA,
2 µl 10 x Restriktionspuffer
1 µl BSA (1 mg/ml)
1 µl RNaseA (1 mg/ml)
2 - 10 U Restriktionsenzym (meist ca 10 U/µl)
in einem Gesamtvolumen von 20 µl gemischt und 60 Min. bei 37°C inkubiert.
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