2 Verantwortliche(r)
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Universitätsklinikum Tübingen Universitäts-Hautklinik Labore für Spezielle Dermatologie Datum: 14.01.2014 SOP-UV-MY-011-03 Seite 1 von 8 SOP-UV-MY-011-03 Gramfärbung- nach Hans Christian Joachim Gram 1853-1938 Verteiler: 1. QMB 2. Labor ( laut Verteilerschlüssel QM Arbeitsplatz) Erstellt Geprüft Freigegeben am 14.01.2014 15.01.2014 16.01.2014 von Sybille Schmidt Prof. M. Schaller Prof. A. Strölin Unterschrift gez.: Schmidt gez.: Schaller gez.: Strölin Für die Übereinstimmung mit der im QM-Arbeitsplatz hinterlegten Kopie trägt jeder Mitarbeiter selbst die Verantwortung Erstellt am: 14.01.2014 D:\68620170.doc von: S. Schmidt Geprüft von: Prof. M. Schaller Freigegeben am: 16.01.2014 von: Prof. A. Strölin Universitätsklinikum Tübingen Universitäts-Hautklinik Labore für Spezielle Dermatologie Datum: 14.01.2014 1 SOP-UV-MY-011-03 Seite 2 von 8 Medizinische Relevanz / Indikation Die Gramfärbung dient zur Darstellung von Bakterien in der Lichtmikroskopie. Sie teilt die Bakterien einfach und schnell in zwei große Gruppen, grampositiv und gramnegativ. Dies ist ein wichtiges Kriterium für die Unterscheidung verschiedener Bakterien, z.B. bei der Diagnostik von Infektionskrankheiten. Grampositive und gramnegative Bakterien reagieren unterschiedlich auf Antibiotika. Mit dieser schnellen diagnostischen Methode kann man in kurzer Zeit (ca. 5 Minuten) anhand eines Abstriches das „Gramverhalten" der Bakterien bestimmen. Damit hat man die Möglichkeit sofort mit einer wirksamen antibiotischen Therapie zu beginnen bevor das Ergebnis der oft mehrere Tage dauernden definitiven Keimbestimmung mittels Bakterienkultur vorliegt. Bevorzugt wird die Färbung im Labor für Mykologie und spezielle Erreger der Haut zur Darstellung von gramnegativen Diplokokken, Erreger ist Neisseria gonorrhoeae und als Differenzialnachweis von gramnegativen Stäben/Sprosspilzen im definierten Untersuchungsmaterial. Die Gramfärbung ist sehr einfach und kostengünstig durchzuführen. 2 Verantwortliche(r) Der Laborleiter und den MTAs im Labor für Mykologie und spezielle Erreger 3 Prinzip Gramnegative Mikroorganismen werden durch das Differenzieren entfärbt und stellen sich nach Gegenfärbung rot dar, grampositive Strukturen behalten den schwarzblauen Farbstoff Differentialfärbungen arbeiten mit mindestens 2 Farbstoffen Die Gramfärbung stellt eine Lipoproteidreaktion dar. Der positive geladene Anilinfarbstoff Kristallviolett bildet mit dem Jod (Lugol’sche Lösung) in den Mureinschichten der Bakterienzellwand einen stabilen Farbstoff-Jod-Komplex. Dieser Komplex kann mit Alkohol aus der bakteriellen Zellwand mit einer Mureinschicht (Peptidoglykan) wieder herausgewaschen werden. Enthält die Zellwand eines Bakteriums hingegen mehrere Schichten Peptidoglykan, (Vorhandensein von Lipoproteiden) so kann der Farbstoffkomplex nicht mehr aus der Zellwand gelöst, bzw. nicht so leicht entfärbt werden. Der blaue Farbstoff aus den ersten beiden Färbeschritten sitzt zwischen den PeptidoglykanSchichten fest. Diese Bakterien sind grampositiv. Bakterien mit einer Schicht Peptidoglykan in ihrer Zellwand, die im zuvor durchgeführten Arbeitsschritt entfärbt wurden, werden durch die Behandlung mit Fuchsin erneut gefärbt und erscheinen rot. Es handelt sich also um gramnegative Bakterien. Für die Übereinstimmung mit der im QM-Arbeitsplatz hinterlegten Kopie trägt jeder Mitarbeiter selbst die Verantwortung Erstellt am: 14.01.2014 D:\68620170.doc von: S. Schmidt Geprüft von: Prof. M. Schaller Freigegeben am: 16.01.2014 von: Prof. A. Strölin Universitätsklinikum Tübingen Universitäts-Hautklinik Labore für Spezielle Dermatologie Datum: 14.01.2014 4 SOP-UV-MY-011-03 Seite 3 von 8 Spezifikation Verschiedene Bakterien reagieren auf diese Färbung unterschiedlich. Eine Vielzahl der Bakterien ist spezifisch grampositiv oder gramnegativ. Daraus folgt eine Einteilung in grampositive Bakterien die blau erscheinen und gramnegative Bakterien die rot gefärbt werden. Kulturelle Bestätigung ist üblich. 5 Untersuchungsmaterial, einschließlich Behälter und Zusätze 1. Ausstriche von Pustelinhalt, Sekret oder Material der Randsektion von einem Ulcus auf Objektträger ausstreichen. 2. Auch Urin oder Ejakulat kann nativ ausgestrichen und nach Gram gefärbt werden. Nativmaterial dünn ausstreichen (Ausstrich im Z-Verfahren). 3. Kulturpräparat Von einer auf Kultur gewachsenen Kolonie etwas Material in 1 Tropfen NaCl einrühren und lufttrocknen lassen. 6 6.1 Ausrüstung und Reagenzien Geräte Mikroskop, Bunsenbrenner 6.2 Ausrüstung Färbebank, Trichter mit Filter, Küvetten, Objektträger, bzw. das Ausstrichpräparat, Messzylinder, Stoppuhr, Pinzette, Trockenfließpapier 6.3 Reagenzien und Medien Färbung mit originaler oder modifizierter Gramscher Kristallviolett-Lösung Karbol-Gentianaviolett * Chroma 2E 028 Lösung vor jedem Gebrauch filtrieren Lugolscher Lösung Merck 1.00567 Ethylalkohol 96%ig Merck Karbol-Fuchsin (1: 10 verdünnt) Chroma 2E 016 Aqua dest (bzw. entmineralisiertes Wasser) *Karbol Gentianaviolett in einer Verdünnung 1:10 eignet sich besser als die konzentrierte Farblösung Für die Übereinstimmung mit der im QM-Arbeitsplatz hinterlegten Kopie trägt jeder Mitarbeiter selbst die Verantwortung Erstellt am: 14.01.2014 D:\68620170.doc von: S. Schmidt Geprüft von: Prof. M. Schaller Freigegeben am: 16.01.2014 von: Prof. A. Strölin Universitätsklinikum Tübingen Universitäts-Hautklinik Labore für Spezielle Dermatologie Datum: 14.01.2014 6.4 SOP-UV-MY-011-03 Seite 4 von 8 Referenzmaterial Arbeitstäglich wird bei jeder Färbung ein Referenzpräparat mitgeführt. (Kontrolle der Farblösungen und des Färbeverfahren) Das gramnegative Färbeverhalten wird mit einem kontrollierten E.coli-Stamm überprüft. Dazu wird auf einen Objektträger Kulturmaterial eines Stammes in der gleichen Technik wie das Untersuchungsmaterial ausgestrichen, fixiert und mitgefärbt. (Die Präparate (beschriftet) können im Vorrat hergestellt werden und in einem dafür vorgesehenen Präparatekasten bei Raumtemperatur aufbewahrt werden. 7 Sicherheitsmaßnahmen Pinzette, ev. Handschuhe 8 8.1 Methodendurchführung Probenvorbereitung Ausstrichpräparate: Man breitet eine möglichst kleine Menge Untersuchungsmaterial mit Hilfe einer geglühten Platinöse oder eines Skalpells in möglichst dünner und gleichmäßiger Schicht auf dem Objektträger aus. Reinkulturen oder schwer ausstreichbares Material wird zweckmäßig vorher mit einem Tropfen Wasser verdünnt. Dann lässt man den Ausstrich völlig lufttrocken werden. Das Trocknen an der Luft wird durch mehrfaches Hin- und Herschwenken der Präparate beschleunigt. Jedes dem lebenden Organismus entnommene Material beginnt sehr bald sich zu verändern. Man versucht deshalb durch verschiedene Mittel den ursprünglichen Zustand zu erhalten, zu fixieren. Für Ausstriche von Blut, Gewebesaft und Bakterienkulturen bedient man sich meist des Alkohols oder der Hitzefixierung. Den mit einer Cornetschen Pinzette gehaltenen Objektträger, Schichtseite nach oben, zieht man dreimal durch die Flamme. Die Fixierung der lufttrockenen Präparate kann statt durch Hitze auch durch etwa zehn Minuten währenden Einlegens in Alkohol absolut oder ein Gemisch aus Alkohol absolut und Äther zu gleichen Teilen erfolgen. 8.2 Reagenzvorbereitung Vedünnen der Färbelösungen: Karbol- Gentianaviolett 1:10 (filtrieren) Karbol-Fuchsin 1:10 96 %iger Alkohol (Ethanol) herstellen Für die Übereinstimmung mit der im QM-Arbeitsplatz hinterlegten Kopie trägt jeder Mitarbeiter selbst die Verantwortung Erstellt am: 14.01.2014 D:\68620170.doc von: S. Schmidt Geprüft von: Prof. M. Schaller Freigegeben am: 16.01.2014 von: Prof. A. Strölin Universitätsklinikum Tübingen Universitäts-Hautklinik Labore für Spezielle Dermatologie Datum: 14.01.2014 8.3 SOP-UV-MY-011-03 Seite 5 von 8 Durchführung Arbeitstägliche Kontrollfärbung, parallel zum Untersuchungsmaterial! 1. Gramfärbung als Schnellfärbung Präparat hitzefixieren Färbung mit Karbol Gentianaviolett (Karbol- Methylviolett) Komplexierung mit Lugol’sche Lösung Entfärbung mit 96 %igem Alkohol -Differenzieren bis keine Farbwolken mehr abgehen Mit Wasser gründlich abspülen Gegenfärbung mit Karbol-Fuchsin (1: 10 verdünnt) Abflammen 45 sec abspülen und 30 sec ~15 sec. in der Färbeküvette 40 sec Mit Wasser gründlich abspülen Trocknen zwischen 2 Filterblättern 2. Gramfärbung histologischer Schnitte Schnitte in Methanol fixieren Karbol Gentianaviolett (Karbol- Methylviolett) Lugol’sche Lösung Lugol’sche Lösung 96 %iger Alkohol - Differenzieren bis keine Farbwolken mehr abgehen 3 min abspülen 2 min ~1 min mit Wasser in der Küvette abspülen Karbol-Fuchsin 2-3 min mit Wasser gründlich abspülen Trocknen: stehend in der Küvette oder zwischen Fließpapier Die Farben kommen direkt auf den Objektträger. Das Differenzieren und Wässern sollte in den Küvetten erfolgen; nicht mit fließendem Wasserstrahl. Die Dauer der Färbung richtet sich nach der Art der Präparate und ist bei den einzelnen Farblösungen verschieden. Im Allgemeinen kommt man mit 15 Sekunden bis1 Minute aus. Schwaches Erwärmen beschleunigt die Färbung. Nach beendeter Färbung werden die Ausstrichpräparate sorgfältig mit Wasser abgespült, und mit Fließpapier abgetupft und getrocknet. Das Präparat wird dann mit einem Tropfen Mikroskopieröl versehen und ohne Deckglas betrachtet. Soll ein Dauerpräparat hergestellt werden, so wird mit Permount ein Deckglas aufgekittet. Für die Übereinstimmung mit der im QM-Arbeitsplatz hinterlegten Kopie trägt jeder Mitarbeiter selbst die Verantwortung Erstellt am: 14.01.2014 D:\68620170.doc von: S. Schmidt Geprüft von: Prof. M. Schaller Freigegeben am: 16.01.2014 von: Prof. A. Strölin Universitätsklinikum Tübingen Universitäts-Hautklinik Labore für Spezielle Dermatologie Datum: 14.01.2014 SOP-UV-MY-011-03 Seite 6 von 8 Permount, Fisher Scientific SP 15 –500 8.4 Auswertung Die MTA beurteilt das Referenz- und Untersuchungspräparat und erstellt den Befund Die Präparate unter 100-er Öl-Immersion untersuchen. Interpretation Grampositiv: blau gefärbte Bakterien Gramnegativ: rot gefärbte Bakterien Durch das Lichtmikroskop kann ebenfalls eine Aussage über die Morphologie(Kokken / Stäbchen) der vorliegenden Bakterien gemacht werden. So kann in vielen Fällen bereits eine Verdachtsdiagnose erstellt werden, die wegweisend für eine antibiotische Therapie sein kann. Auch die Lagerung der Bakterien, z.B. intrazellulär und extrazelluär und das Vorhandensein von reichlich Leukozyten unterstützt die Beurteilung des Präparates. z.B. bei einer Gonorrhoe : gramnegative Diplokokken (semmelförmig), Lagerung intra- und extrazellulär), meist innerhalb der reichlichen Leukozyten (liegt in Haufen - typ. Straßennetz von New York Neisseria gonorrhoeae 8.5 C. albicans, Pseudomycel Dokumentation Der Befund erfolgt online im Swisslab, als Einzelbefund (Färbung) oder zusammen mit anderen Untersuchungsanforderungen (z.B. mit Kulturanforderung) im selben Untersuchungsauftrag. Eine telefonische Mitteilung erfolgt an den Arzt. Die arbeitstägliche Referenzfärbung wird im Protokollbuch unter dem aktuellen Datum und mit Kürzel von der ausführenden Mitarbeiterin dokumentiert. Für die Übereinstimmung mit der im QM-Arbeitsplatz hinterlegten Kopie trägt jeder Mitarbeiter selbst die Verantwortung Erstellt am: 14.01.2014 D:\68620170.doc von: S. Schmidt Geprüft von: Prof. M. Schaller Freigegeben am: 16.01.2014 von: Prof. A. Strölin Universitätsklinikum Tübingen Universitäts-Hautklinik Labore für Spezielle Dermatologie Datum: 14.01.2014 SOP-UV-MY-011-03 Seite 7 von 8 Bei Neisseria gonorrhoeae wird der Befund, positiver Nachweis oder kein Nachweis, grundsätzlich an den Arzt telefoniert. Endgültige Befunde werden vom Laborleiter validiert. 9 Störungen, Kreuzreaktionen, Ursachen von Variabilität 1. Karbol-Gentianaviolett Farbstoff ist nur beschränkte Zeit haltbar. 2. Vor Gebrauch immer filtrieren 3. Man darf die Präparate vor der Alkohol-Entfärbung nicht mit Wasser abspülen (gibt man auf wassernasse Präparate Alkohol, so können auch grampositive Keime entfärbt werden) 4. Verdünnte Fuchsinlösung ist weniger haltbar; sie ist unbrauchbar, sobald sich Farbniederschläge bilden (frische Lösung wird noch nicht verdünnt). 5. Jodlösungen zersetzen sich bei Licht- und Wärmeeinwirkung und lassen dann gram-positive Bakterien weniger GRAMfest erscheinen 6. Die richtige Entfärbezeit zu bestimmen, ist mitunter schwierig 7. Massenhafte Kontamination von Anflug- bzw. Begleiterreger erschweren die Befundung 10 Qualitätssicherung Zur Prüfung einer richtig durchgeführten Gramfärbung ist eine grampositive Kontrolle (Staphylokokken) und eine gramnegative Kontrolle (E. coli) mitzufärben. 10.1 Interne Kontrollen Kontrollfärbung mit bekanntem Teststamm 10.2 Externe Kontrollen Keine 11 Referenzbereich Nicht belegt Für die Übereinstimmung mit der im QM-Arbeitsplatz hinterlegten Kopie trägt jeder Mitarbeiter selbst die Verantwortung Erstellt am: 14.01.2014 D:\68620170.doc von: S. Schmidt Geprüft von: Prof. M. Schaller Freigegeben am: 16.01.2014 von: Prof. A. Strölin Universitätsklinikum Tübingen Universitäts-Hautklinik Labore für Spezielle Dermatologie Datum: 14.01.2014 SOP-UV-MY-011-03 Seite 8 von 8 12 Verfahrensweise bei auffälligen Ergebnissen Bestätigung durch kulturelle Untersuchung veranlassen. 13 Mitgeltende Unterlagen VA-AS-MY-001 Umgang mit humanpathogenen Erregern der Klasse S2 Datensicherheitsblätter der benötigten Chemikalien Primärprobenhandbuch 14 Literatur Bakteriologie und Serologie von Dr. Lothar Hallmann Georg Thieme Verlag Stuttgart Ausgewählte Färbemethoden – PDF Broschüre der Firma Waldeck, Division Chroma Für die Übereinstimmung mit der im QM-Arbeitsplatz hinterlegten Kopie trägt jeder Mitarbeiter selbst die Verantwortung Erstellt am: 14.01.2014 D:\68620170.doc von: S. Schmidt Geprüft von: Prof. M. Schaller Freigegeben am: 16.01.2014 von: Prof. A. Strölin
