Material und Methoden

2. Material und Methoden
2.
Material und Methoden
Molekularbiologische Versuche erfolgten, soweit nicht anders angegeben, nach
Standardprotokollen von Maniatis et al. (1982) oder Aushubel et al. (1989).
2.1
Chemikalien und Enzyme
Die verwendeten Chemikalien wurden, soweit nicht anders beschrieben, in analytischer
Qualität von den Firmen Amersham-Buchler (Braunschweig), Biorad (München),
Biozym (Hameln), Boehringer (Mannheim), Difco (Detroit), Eurogentec (Seraing),
Fluka (Neu-Ulm), Gibco (Eggenstein), Invitrogen (Leek), MBI Fermentas (Vilnius),
Merck (Darmstadt), MWG Biotech (Ebersberg), New England Biolabs (Schwalbach)
Pharmacia (Freiburg), Quiagen (Hilden), Riedel de Haën (Seelze), Roth (Karlsruhe),
Serva (Heidelberg), Sigma (München) und Stratagene (La Jolla) bezogen.
2.2
Nr.
1
Oligonukleotide
Sequenz (5‘3‘)
Restriktionsschnittstellen
GCG GCC GCA AGC TTA TGA
NotI, HindIII
GCC GCC CGT CCT CT
2
CCG GCG CCT CTA GAT TAT
GGA CAA CAT GTG GAA A
XbaI, ApaI
3
GCT CTA GAG CTC AGT CAA
CAG CAC CGG GC
XbaI
4
GGA GCT GAC GTC GCT GGC
CTC CCT CAC CCC G
_
5
CGG GGT GAG GGA GGC CAG
CGA CGT CAG CGT CAG CTC
C
AAG CGG CCG CAA GCT TTG
ATG AGC CGC CCG TCC TCT
_
6
7
TCT AGA GGG CCC TTA TGG
ACA ACA TGT GGA A
NotI, HindIII
ApaI, XbaI
Verwendungszweck
Sense Primer zur
Amplifikation von
XSiah-2-wt
Antisense Primer
zur Amplifikation
von XSiah-2-wt
Antisense Primer
zur Amplifikation
von XSiah-2C
Sense Primer zur
Amplifikation von
XSiah-2R
Antisense Primer
zur Amplifikation
von XSiah-2R
Sense Primer zur
Herstellung von
His-XSiah-2-wt
Antisense Primer
zur Herstellung von
His-XSiah-2-wt
12
2. Material und Methoden
8
ATG AGC CGC CCG TCC TCT
GCC GGA CCC TCG
_
9
TTA TGG ACA ACA TGT GGA
AAT GGT TAC ATT
_
10 TAC CAC TAC AAT GGA TG
_
11 AAT GGA TTT CAG AGA CCA
_
12 CCA AGG CTA AAG TTG CAG
_
2.3
Sense Primer
zur RT-PCR von
XSiah-2-wt
Antisense Primer
zur RT-PCR von
XSiah-2-wt
Sense Primer zur
Sequenzierung von
pGAD10
Sense Primer
zur RT-PCR von
ODC
Antisense Primer
zur RT-PCR von
ODC
Isolierung der cDNA von Xenopus Siah-2
Zur Isolierung der XSiah-2 cDNA aus Xenopus laevis wurde eine gt11 5‘-STRETCH
cDNA-Bank
aus
Xenopus
Oocyten
(Clontech,
Palo
Alto)
verwendet.
Als
Hybridisierungssonde wurde ein 1200 bp großes EcoRI-Fragment aus dem PlasmidKonstrukt SK/XSiah-C (Pogge von Strandmann et al., unveröffentlicht) eingesetzt, das
189 bp der kodierenden Region von XSiah-2 enthält. Dieses Fragment wurde nach
Agarosegel-Extraktion mit dem QiaexII Kit (Qiagen, Hilden) unter Verwendung des
Rediprime Labeling Kit (Stratagene, San Diego) mit -32CTP radioaktiv markiert. Die
Hybridisierungssonde wurde anschließend mit dem Nucleotide Removal Kit (Qiagen,
Hilden) aufgereinigt. Die Anzucht und die Filter-Plaque-Hybridisierung erfolgten nach
den Empfehlungen des Herstellers. Pro Phagenfilter (Nitrozellulose-Membran Hybond
C, Amersham, Braunschweig) wurden 1x106 cpm der markierten Probe eingesetzt. Die
Hybridisierung wurde über Nacht bei 68°C durchgeführt.
Nach Beendigung der Hybridisierung wurden die Filter bei 68°C je 30 min in 1x SSC,
0,1% SDS; 0,1x SSC, 0,1% SDS; 0,1x SSC und 0,5% SDS gewaschen. Die Detektion
der Signale erfolgte mit dem Autoradiographie-Film X-OMAT (Kodak, Rochester, New
York). Inserts positiver Phagenklone wurden mittels Polymerase-Kettenreaktionen
(PCR) mit gt11-spezifischen Oligonukleotiden (Clontech, Palo Alto) amplifiziert. Für
die PCR wurde ausschließlich der TRIOthermoblock (Biometra, Göttingen) verwendet.
Es wurde folgender Reaktionsansatz (50 µl) und folgendes PCR-Zyklusprofil genutzt:
13
2. Material und Methoden
PCR-Ansatz
PCR-Zyklusprofil
je 50 pg Oligonukleotid-Primer gt11
je 1,25 mM dNTPs (N = A, G, C, T)
1 mM MgCl2
0,3 U Taq-DNA-Polymerase
(Goldstar-RED, Eurogentec, Seraing)
75 mM Tris/HCl pH 9.0
20 mM (NH4)2SO4
0,01 % (w/v) Tween 20
Denaturierung
Denaturierung
Hybridisierung
Amplifikation
3 min
1 min
1 min
2 min
Elongation
Ende
7 min 72°C
 04°C
94°C
94°C 3050°C 40 x
72°C
Die Reaktionsansätze wurden mit Mineralöl überschichtet. Für nachfolgende
Restriktionen wurden die PCR-Amplifikationsprodukte mit dem QIAquick PCR
Purification
Kit
(Qiagen,
Hilden)
nach
Herstellerangaben
aufgereinigt.
Die
Amplifikationsprodukte wurden mit einer Southern Blot Analyse überprüft. Hierzu
wurden die DNA-Fragmente gelektrophoretisch aufgetrennt. Das Agarosegel wurde
anschließend 15 min mit 0,25 M HCl, dann je 30 min mit Denaturierungspuffer (0,5 M
NaOH, 1,5 M NaCl) und Neutralisierungspuffer (1,5 M NaCl, 1 M Tris/HCl pH 7,5)
gespült. Der Transfer der Nukleinsäuren auf eine Nitrozellulose-Membran (Hybond N,
Amersham, Braunschweig) erfolgte unter Verwendung einer Kapillarblotvorrichtung
mit 20x SSC (3 M NaCl; 0,3 M Natrium-Citrat, pH 7,0) nach Southern (1979).
Die Fixierung der DNA auf die Membran wurde mit einem UV-Crosslinkers
(Stratagene, La Jolla) mit 120 mJ/cm2 durchgeführt. Nach zweimaligem Waschen in
10x SSC wurde die Membran zunächst mit Hybridisierungspuffer (nach dem Protokoll
der Fa. Clontech, Palo Alto) 4 h bei 65°C vorhybridisiert. Die Hybridisierung mit einer
spezifischen XSiah-2 Sonde (1-2 x 106 cpm / ml), die mit dem Rediprime Labeling Kit
(Stratagene, San Diego) mit -32CTP radioaktiv markiert wurde, erfolgte über Nacht bei
65°C. Nachfolgend wurde die Membran bei 68°C je 30 min in 1x SSC, 0,1% SDS; 0,1x
SSC, 0,1% SDS und 0,1x SSC, 0,5% SDS gewaschen. Die Detektion der Signale
erfolgte mit dem Autoradiographie-Film X-OMAT (Kodak, Rochester, New York).
Nach der Southern Analyse wurden die cDNA-Fragmente (Phagenklon 9 und 11) unter
Verwendung der Oligonukleotide -gt11 mittels PCR amplifiziert und dann über die
Restriktionsschnittstelle EcoRI in den Vektor pBluescriptSK+ (Statagene, San Diego)
kloniert (SK-Konstrukte). Die nachfolgende Sequenzierung der SK-Konstrukte wurde
mit doppelsträngiger DNA aus Qiagen-tip500-Präparationen (Qiagen, Hilden), T3/T7Primern und mit fluoreszenzmarkierten ddNTP nach dem BigDye-Primer-CycleSequencing Protokoll (Applied Biosystem, Weiterstadt) vom DNA-Sequenzier-Service
14
2. Material und Methoden
der Medizinischen Fakultät in Essen durchgeführt. Die automatische Analyse der
Sequenz fand mit dem ABI-377-Systems (Applied Biosystem, Weiterstadt) statt.
2.4
Hergestellte Plasmidkonstrukte
Die Inserts aller im folgenden aufgeführten Plasmidkonstrukte wurden sequenziert:
(A) SK/XSiah-2: Die 2200 Nukleotide große cDNA des Phagenklons 11 wurde unter
Verwendung der Oligonukleotide -gt11 (Clonetech, Palo Alto) mittels PCR
amplifiziert. Nach Restriktion des PCR-Produktes mit EcoRI wurde das Fragment mit
dem ebenfalls EcoRI restringierten Vektor pBluescriptSK+ (Stratagene, San Diego)
ligiert.
(B) Rc/XSiah-2: Mit Hilfe der Oligonukleotide 1 und 2 (Sequenzen unter 2.2) wurde
die kodierende Region der XSiah-2 cDNA (Position 1 bis 942) unter Verwendung des
Vektors
SK/XSiah-2
als
DNA-Matrize
amplifiziert.
Über
die
angehängten
Restriktionsschnittstellen HindIII und XbaI wurde das cDNA-Fragment mit dem
ebenfalls HindIII/XbaI restringierten Vektor RcCMV (Invitrogen, Leek) ligiert.
(C) Rc/XSiah-2-Mut: Zur Herstellung einer Rasterschubmutation wurde der Vektor
Rc/XSiah-2 mit NheI (Position 32 relativ zum ATG Startcodon) restringiert,
anschließend mit Klenow-Polymerase aufgefüllt und religiert. Dies führt zur Insertion
von vier Nukleotiden und es kommt nach einem Rasterschub zu einem vorzeitigen Stop
in Position 37 relativ zum ATG Startcodon.
(D) Rc/XSiah-2C: Unter Verwendung der Oligonukleotide 1 und 3 (Sequenzen unter
2.2) wurden die ersten 618 Nukleotide der kodierenden Region von XSiah-2 aus dem
Vektor Rc/XSiah-2 amplifiziert und über die angehängten Restriktionsschnittstellen
HindIII und XbaI mit dem ebenfalls HindIII/XbaI restringierten Vektor RcCMV
(Invitrogen, Leek) ligiert.
(E) Rc/XSiah-2R: Mit einem Mutagenese-Kit (Stratagene, San Diego) und den
Oligonukleotiden 4 und 5 (Sequenzen unter 2.2) wurde die Deletion XSiah-2-204-312
in den Vektor Rc/XSiah-2 eingefügt.
(F) Rc/His-XSiah-2: Mit Hilfe der Oligonukleotide 6 und 7 (Sequenzen unter 2.2)
wurde die kodierende Region von XSiah-2 (Position 1 bis 942) aus dem Vektor
15
2. Material und Methoden
Rc/XSiah-2 amplifiziert und nach Restriktion mit HindIII und ApaI mit dem ebenfalls
HindIII/ApaI restringierten Vektor Rc/His-HNF4 (Pogge von Strandmann et al., 1995)
ligiert.
(G) Rc/His-XSiah-2C: Nach Restriktion des Vektors Rc/XSiah-2-C mit HindIII und
ApaI wurden das HindIII/ApaI-Fragment (Position 1-163 von XSiah-2) und das ApaIFragment (Position 164-618 von XSiah-2 relativ zum ATG Startcodon) isoliert.
Zunächst wurde das HindIII/ApaI-Fragment (Position 1-163 von XSiah-2) mit dem
HindIII/ApaI restringierten Vektor Rc/His-XSiah-2 ligiert. Nach erneuter Restriktion
dieses Zwischenkonstruktes mit ApaI wurde das ApaI-Fragment (Position 164 –618 von
XSiah-2) eingefügt.
(H) pGAD/XSiah-2-wt: Ein 2200 Nukleotide großes SalI-Fragment der XSiah-2 cDNA
(Position –63-2132 relativ zum ATG Startcodon)) wurde aus dem Vektor SK/XSiah-2
restringiert und in den XhoI-restringierten Vektor pGAD10 (Clonetech, Palo Alto)
eingefügt, wobei die SalI-Schnittstelle kompatibel zu XhoI ist.
(I) pGAD/XSiah-2-C: Ein 460 Nukleotide großes ApaI-Fragment der XSiah-2 cDNA
(Position 164-618 relativ zum ATG Startcodon) aus dem Vektor Rc/XSiah-2-C wurde
mit dem ApaI restringierten Vektor pGAD/XSiah-wt ligiert.
(J) pGAD/XSiah-2-R: Ein 570 Nukleotide großes ApaI/PstI-Fragment aus dem
Vektor Rc/XSiah-2R (Position 164-835 relativ zum ATG Startcodon mit Deletion
204-312) wurde in den ApaI/PstI restringierten Vektor pGAD/XSiah-wt eingefügt.
Die angegebenen Positionen der Nukleotide der XSiah-2-cDNA beziehen sich auf die in
der Abb. 7 dargestellten Sequenz (S. 27), die unter der Zugangsnummer AF 155509 in
der NCBI-Genbank hinterlegt wurde.
2.5
Gekoppelte in vitro Transkription / Translation von XSiah-2
Die Synthese von [35S]-Methionin radioaktiv markierten Proteinen wurde im TNT
gekoppelten Retikulocytenlysat-System (Promega, Madison) nach den Angaben des
Herstellers durchgeführt. Die Synthese des rekombinanten XSiah-2 Proteins fand unter
Verwendung des Vektors SK/XSiah-2 und der T7-RNA-Polymerase statt. Nach der
Synthese wurden 10 µl Retikulocytenlysat mit 1/5 Volumen SDS-Probenpuffer (5x)
16
2. Material und Methoden
versetzt und die enthaltenen Proteine unter denaturierenden Bedingungen in einem
diskontinuierlichen SDS-Polyacrylamidgel nach Lämmli (1970) elektrophoretisch
aufgetrennt. Der Nachweis des XSiah-2 Proteins erfolgte autoradiographisch.
SDS-Probenpuffer (1x)
10 % Glyzerin
5 % -Mercaptoethanol
3 % SDS
1 % Bromphenolblau
63,5 mM Tris-HCl pH 6,8
2.6
10x Laufpuffer
0,5 M Tris/HCl pH 7,5
3,8 M Glycin
1,0 % SDS
Two Hybrid Analysen in Hefe
Der Nachweis einer physikalischen Interaktion zwischen XSiah-2 und DCoH/PCD mit
Hilfe des Two Hybrid Systems wurde mit Hilfe des Matchmaker Two hybrid Systems
(Clontech, Palo Alto) nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Für diese
Experimente wurde der Hefestamm HF7c verwendet. Zur Sequenzierung der
pGAD/XSiah-2 Expressionsvektoren (2.4) wurde das Oligonukleotid 10 (2.2)
verwendet.
2.7
Reverse Transkription-PCR (RT-PCR) aus der Gesamt-RNA
von Xenopus Embryonen
Die Isolierung der Gesamt-RNA aus Xenopus Embryonen erfolgte mittels
Phenol/Chloroform Extraktion unter Verwendung von RNA-Clean (AGS, Heidelberg)
nach den Angaben des Herstellers. Zur Präparation von RNA aus vier Embryonen
wurden jeweils 300 µl der RNA-Clean-Lösung verwendet. Die Menge der isolierten
RNA wurde photometrisch bestimmt und unmittelbar zur reversen Transkription
eingesetzt. Zur reversen Transkription wurde ausschließlich die SuperscriptII-reverse
Transkriptase (Gibco BRL, Eggenstein) eingesetzt.
Die reverse Transkription von 1 µg RNA wurde wie folgt durchgeführt:
17
2. Material und Methoden
RT-Ansatz
12 µ1 (= 1µg ) RNA
1 µl
0,1M Hexanukleotide
10 min 70°C
4 µl
Transkriptionspuffer (Gibco)
2 µl
0,1M DTT
1 µl
1,25 mM dNTP
10 min 25°C
1 µl
SuperscriptII-reverse Transkriptase
(Gibco)
50 min 42°C
15 min 70°C
Es wurde stets ein Ansatz ohne SuperscriptII-reverse Transkriptase durchgeführt, um
später DNA-Kontaminationen ausschließen zu können. Die anschließende PCR zur
Amplifikation von XSiah-2 wurde mit den Oligonukleotiden 8 und 9 (2.2) durchgeführt.
Zur Amplifikation der ODC (Ornithin-Decarboxylase) wurden die Oligonukleotide 11
und 12 (2.2) verwendet. Folgender RT-PCR Ansatz wurde zur Amplifikation von
XSiah-2 und ODC gewählt:
2 µ1
5 µl
1 µl
1 µl
1 µl
5 µl
1 µl
1 µl
ad 50 µl
Phase
Denaturierung
Denaturierung
Hybridisierung
Amplifikation
Elongation
Ende
Zyklenanzahl
PCR-Produkt
RT-PCR-Ansatz
RT-Ansatz (oder –RT-Ansatz)
10 x Goldstar-Reaktionspuffer (Eurogentec, Seraing)
25 mM MgCl2
5‘- Oligonukleotid-Primer (0,25µg/µl)
3‘- Oligonukleotid-Primer (0,25µg/µl)
1,25 mM dNTP
0,1 µCi/µl [-32P]-dCTP
Goldstar-RED-Taq-Polymerase (Eurogentec, Seraing)
A.dest
RT-PCR-Profil
XSiah-2
2 min 94°C
1 min 94°C
1 min 55°C
2 min 72°C
7 min 72°C

4°C
30
1000 bp
ODC
2 min 94°C
1 min 94°C
1 min 44°C
1,5 min 72°C
7 min 72°C

4°C
30
234 bp
18
2. Material und Methoden
Zur Auftrennung der PCR-Produkte wurden 20 µl der RT-PCR-Ansätze auf ein 6 % iges Polyacrylamidgel aufgetragen. Nach 15 minütiger Fixierung des Gels in 10 %
Essigsäure und anschließender Geltrocknung erfolgte die Detektion der PCR-Produkte
autoradiographisch.
2.8
Transiente Transfektion und indirekte ImmunfluoreszenzMikroskopie von 293-Zellen
Die Kultivierung der 293-Zellen (humane, embryonale Niere, E1A transformiert) fand
in nach Dulbecco modifizierten Eagles Medium (DMEM) mit 10 % hitzeinaktiviertem,
fötalem Kälberserum, 100 U/ml Penicillin/Streptomycin und 1mM Glutamin bei 37°C,
7,0 – 7,8 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit statt. Zur transienten Transfektion von 293Zellen mit den Expressionsvektoren Rc-His-XSiah-2, Rc-His-XSiah-2C (diese Arbeit,
2.4) und pCS-Myc-DCoH/PCD (Pogge von Strandmann, unveröffentlicht) wurde
entweder die Kalziumphosphat-Kopräzipitation nach Zapp et al. (1993) oder die
Effectene-Methode (Qiagen, Hilden) verwendet. Zur Transfektion von 5x104 Zellen
wurden je 1 µg DNA, 7,5 µl Effectene-Reagenz sowie 5 µl Enhancer eingesetzt. Bei
beiden Transfektionsmethoden wurden Kulturschalen mit 1cm Ø verwendet. Der
Immunfluoreszenzmikroskopische Nachweis von Myc-DCoH/PCD, His-XSiah-2 und
His-XSiah-2C in transient transfizierten 293-Zellen erfolgte nach dem Protokoll von
Pogge von Strandmann et al. (1995). Die ersten Antikörper Anti-Myc- und Anti-6xHisAntikörper wurden in einer Verdünnung von 1:5 in DMEM verwendet. Als sekundärer
Antikörper
diente
ein
Cy3-gekoppelter
Anti-Maus-IgG-Antikörper
(Dianova,
Hamburg), 1:200 verdünnt in PBS-Puffer / 10 % Ziegenserum. Die Analysen wurden
mit einem Auflicht-Fluoreszenzmikroskop (Zeiss, Oberkochen) durchgeführt.
2.9
Western-Blotting und Immundetektion von His-XSiah-2 und
Myc-DCoH/PCD
Zum immunologischen Nachweis von His-XSiah-2 und Myc-DCoH/PCD aus transient
transfizierten 293-Zellen wurden die Zellen zunächst in eiskaltem NP-40-Puffer (50
µl/105 Zellen) lysiert. Nach Zentrifugation (5 min., 14000 rpm, 4 °C) der Lysate wurden
die Überstände mit 1/5 Volumen SDS-Probenpuffer (5x) versetzt und die enthaltenen
Proteine (je 20 µg) unter denaturierenden Bedingungen in einem diskontinuierlichen
SDS-Polyacrylamidgel nach Lämmli (1970) elektrophoretisch aufgetrennt. Der
19
2. Material und Methoden
anschließende elektrophoretische Transfer der aufgetrennten Proteine auf Nitrozellulose
wurde mit Hilfe einer Trans-Blot SD-Transferkammer (Biorad, München) bei 2
mA/cm2 für 1 h durchgeführt. Nach Waschen mit PBS-Puffer wurde die NitrozelluloseMembran mit 0,5 % Blockingreagenz (Boehringer, Mannheim) in PBS 1 h bei RT
abgesättigt. Die Inkubation des spezifischen, ersten Antikörpers erfolgte in der
jeweiligen Verdünnung über Nacht bei 4°C.
Antikörper
gerichtet gegen
Myc-Epitop
6xHistidin
eingesetzte Verdünnung
Quelle
1 : 5 in DMEM
1 : 10 in 1x PBS/0,05 %
Tween20
Evan et al., 1985
Pogge von Strandmann et al.,
1995
Nach Waschen mit PBS / 0,05 % Tween20 (5x je 20 min) wurde der Membran mit
Meerretich-Peroxidase gekoppelten anti-Maus-Antikörpern (1: 5000 verdünnt in 0,2 %
Blockingreagenz) 1 h bei RT inkubiert. Nach wiederholtem Waschen mit PBS / 0,05 %
Tween20 (5x je 20 min) wurde zur Immundetektion das ECL-Western-BlotingDetektionssystem (Amersham, Braunschweig) nach Herstellerangaben eingesetzt.
NP-40-Puffer
0,5 % (v/v) NP-40
20 % (v/v)) Glyzerin
50 mM Tris, pH7,5
150 mM NaCl
1 mM DTT
0,1 mM PMSF
2.10
Transferpuffer
48 mM Tris
39 mM Glycin
0,375 % (w/v) SDS
20 % (v/v) Methanol
PBS-Puffer
140 mM NaCl
2,7 mM KCl
10 mM Na2HPO4
1,8 mM KH2PO4
pH 7,3
Haltung von Xenopus laevis und in vitro Befruchtung und
Kultur der Embryonen
Der südafrikanische Krallenfrosch Xenopus laevis wurde von der Fa. Xenopus (USA)
bezogen. Die Frösche wurden unter Standardbedingungen (Kay and Peng, 1991)
gehalten. Die Eiablage geschlechtsreifer Weibchen wurde durch subcutane Injektion
von 600 bis 800 Einheiten des humanen Chorion-Gonadotropins Pregnesin (Serono,
Unterschleißheim) in den dorsalen Lymphsack induziert. Zur Befruchtung der Eier
wurde einem männlichen Tier der Hoden unter Betäubung mit 0,5 % MS 222
entnommen. Der Hoden wurde in Holfreter-Lösung bei 4°C bis zu einer Woche
gelagert. Frisch gelegte Eier wurden in Petrischalen durch Überstreifen des intakten
Hodens befruchtet und nach fünf Minuten mit 0,1x MBS überschichtet. Eine
20
2. Material und Methoden
erfolgreiche Befruchtung ist anhand der nach 20 Minuten einsetzenden Kortikalreaktion
sichtbar, bei der sich der pigmentierte animale Pol nach oben dreht. Nach ca. 45
Minuten wurde die Gallerthülle durch eine 1-2 minütige Inkubation in 2 % (w/v)
Cystein, pH 8 entfernt. Nach mehrmaligem Waschen der enthüllten Eier mit 0,1x MBS
fand die Kultivierung der Embryonen in 0,1x MBS bei 14 - 23 °C statt. Die
Bestimmung der Entwicklungsstadien erfolgte nach Nieuwkoop and Faber (1975).
1x MBS
88 mM NaCl
1 mM KCl
0,41 mM CaCl2
0,33 mM Ca (NO3)2
2.11
Holfreter-Lösung
60 mM NaCl
0,6 mM KCl
0,9 mM CaCl2
0,2 mM NaHCO3
0,82 mM MgSO4
2,4 mM NaHCO3
10 mM HEPES, pH 7,4
Whole mount in situ Hybridisierung
Die Whole Mount in situ Hybridisierung wurde nach dem Protokoll von Harland (1990)
durchgeführt. Die Synthese aller Digoxygenin markierten RNA-Proben erfolgte mit
dem DIG-RNA-Labeling-Kit (Boehringer, Mannheim). Die als Matrize dienenden
Vektoren wurden zuvor unter Verwendung eines Restriktionsenzyms linearisiert und
wie folgt zur Synthese der Sense- bzw. Antisense RNA verwendet:
Probe
DCoH/PCD
Antisense
RNA
DCoH/PCD
Sense RNA
XSiah-2
Antisense
RNA
XSiah-2
Sense RNA
XPax-6
Antisense
RNA
Vektor
Restriktionsenzym RNAQuelle
Polymerase
BamHI
T7
Pogge
von
SK/DCoH/PCD
Strandmann
et al., 1995
HindIII
T3
BamHI
T7
HindIII
T3
EcoRI
T3
SK/XSiah-2
n.b.
diese Arbeit
Krieg
P.
(Austin)
In Abweichung zum Protokoll von Harland wurden die RNA-Proben nicht hydrolysiert.
Zur
Verbesserung des
Signal/Hintergrund-Verhältnisses
wurde die alkalische
Phosphatase-Reaktion über Nacht ohne Schütteln bei 4 °C durchgeführt.
21
2. Material und Methoden
2.12
In vitro Synthese von mRNA und RNA-Mikroinjektion in
Xenopus
Die in vitro RNA Synthese erfolgte nach dem Protokoll von Nielsen und Shapiro
(1986). Zur Synthese wurden stets 3 µg linearisierter Vektor und 100 U RNAPolymerase verwendet. RcCMV-Derivate wurden mit dem Restriktionsenzym NaeI
linearisiert und mit der T7-RNA-Polymerase transkribiert; pCS-Derivate hingegen mit
dem Restriktionsenzym PvuII und mit der SP6-RNA-Polymerase. Der Reaktionsansatz
wurde nach Synthese und enzymatischen Abbau der DNA (Nielsen und Shapiro, 1986)
einer Phenol/Chloroform/Isoamykalkohol- (24:24:1) Extraktion unterzogen und
nachfolgend mit Ethanol p.A. gefällt. Jeder gefällte Ansatz wurde auf 4 Aliquots
verteilt. Die Bestimmung der RNA-Menge erfolgte photometrisch. Zur qualitativen
Bewertung der RNA wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt. Die
synthetische mRNA wurde nach Ethanol-Präzipitation in DEPC-behandelten Aqua dest.
aufgenommen. Zur Injektion befruchteter Eier wurden Mikrokapillaren (Ø 0,58 mm,
World Precision Instruments, Sarasota) unter Verwendung der Injektionsapparatur
PicospritzerII (General Valve Corporation, Fairfield) benutzt. In eine Blastomere eines
Zwei-Zell Embryos wurde maximal 1ng RNA in einem Volumen von 10-20 nl injiziert.
Um ein Auslaufen der injizierten Embryonen zu verhindern, wurden alle Injektionen in
4 %-Ficoll-Lösungen (nach 2 h Wechsel mit 0,1x MBS) durchgeführt.
2.13
Histologische Analyse von Xenopus Larven
Zur histologischen Analyse wurden Xenopus Larven (Stadium 39-42) nach folgendem
Protokoll fixiert und eingebettet:
Dauer
Lösung
1 x 1h
24 h
2 x 2h
2 x 2h
2 x 2h
2 x 2h
2 x 2h
2 x 2h
48 h
4 % Paraformaldehyd in PBS
PBS
70 % Ethanol
80 % Ethanol
90 % Ethanol
96 % Ethanol
100 % Isopropanol
Histoclear
100 % Parafin
22
2. Material und Methoden
Nach Einbettung der Larven in Paraffin wurden 7 µm dicke Schnitte hergestellt. Zum
Entparaffinieren und zur anschließenden Übersichtsfärbung wurden die Schnitte nach
folgendem Protokoll behandelt:
Dauer
Lösung
2 x 10 min
1 x 1 min
1 x 1 min
1 x 1 min
1 x 1 min
1 x 1 min
Histoclear
100 % Isopropanol
96 % Ethanol
90 % Ethanol
80 % Ethanol
70 % Ethanol
1 x 5min
1 x 10 min
1 x 5 min
4 x 1 min
2 x 5 min
Hematoxylin
Leitungswasser
Eosin
100 % Ethanol
Histoclear
Zur Konservierung wurden die gefärbten Schnitte in Kunstharz eingedeckelt.
23