protokoll - Nippon

Gruppe 12: Christopher Rose, Florian Binder, Stefan Weiß
Protokoll zu Versuch5 : Biologische Oxidation und
Energiestoffwechsel
Ziel des Versuchs:
Im ersten Teil des Versuchs wird das periphere Membranprotein Cytochrom c in oxidierter
und reduzierter Form untersucht. Dazu wird die Absorbanz des vollständig oxidierten und des
vollständig reduzierten Cytochrom c gemessen.
Dann wird die Kinetik der Oxidation/Reduktion von Cytochrom c mit verschiedenen
Substraten festgestellt.
Der zweite Teil des Versuchs behandelt die H2O2 Spaltung durch das Enzym Katalase. Die
Aktivität des Enzyms wird bei verschiedenen pH Werten bestimmt, um das pH Optimum zu
ermitteln. Dann wird der Einfluss von Hemmstoffen auf die Aktivität der Katalase ermittelt.
Der Gehalt an H2O2 nach der Reaktion wird mit Titration mit KMnO4 bestimmt.
Teil 1 Cytochrom c:
Cytochrom c besitzt besitzt eine Redoxaktive Hämgruppe. In reduzierter Form liegt Fe(II)
vor, in oxidierter Form Fe(III). Beim oxidierten Cytochrom C fehlt das Absorbanzmaximum
bei 550 nm. Daher kann durch die Messung der Absorbanz bei dieser Wellenlänge das
Verhältnis an oxidiertem und reduziertem Cytochrom C bestimmt werden. Das Protein liegt
zu Beginn in oxidierter Form vor und wird im Photometer nach Nullwertabgleich vermessen1.
Aus dem Experiment ergibt sich:
Absorbanz oxidierte Form: 0,0687
Absorbanz reduzierte Form: 0,1960
Der differentielle Extinktionkoeffizient2  beträgt: 15245 L/[mol*cm]
Kinetik der Oxidation/Reduktion von Cytcochrom c:
Zu Beginn liegt vollständig oxidiertes Cytochrom c vor. 1mL der oxidierten Cytochrom c
Lösung wird in die Küvette pipettiert. Nullabgleich erfolgt mit 1mL Phosphatpuffer + L
Ascorbatlösung. s erfolgen nacheinander Zugaben von Ascorbat, Cytochromoxidase, KCN
und Kaliumhexacyanoferrat(III)3.
Zugabe:
Volumen4:
t Zugabe5:
t GGW:
Absorbanz
Im GGW:
1
1000
0,329
Ascorbat
13
0
1620
0,888
Cyt.oxid.
10
1740
2460
0,505
Ascorb.
12
2580
3060
0,692
KCN
10
3210
4560
0,934
KHCF
10
4950
5700
0,915
KHCF
10
5790
6960
0,885
KHCF
10
7020
10920
0,884
Referenz: 2,5mL Phosphatpuffer + 0,5mL Wasser; Probe: 2,5mL Phosphatpuffer + 0,5mL Cyt.c. Lsg. (ox.)
Berechnet sich aus =[E(red.)-E(ox.)]/[c(Cyt)*d] = [0,1960-0,0687]/[50*10 –6 mol/L*0,167*1,0cm] = 15245
3
In Tabelle bezeichnet als KHCF
4
Alle Angaben in L
5
Alle Angaben in Sekunden
2
Bewertung der Ergebnisse:
Das vollständig oxidierte Cytochrom c wird durch Zugabe des Ascorbats reduziert. Das
Fließgleichgewicht wird bei einer Absorbanz von 0,888 in etwa erreicht. Der exakte Wert
liegt etwas höher, da die Konzentration des oxidierten Cytochrom c bei der Reaktion abnimmt
und der Endwert so nur sehr langsam erreicht wird. (Die Reaktionsgeschwindigkeit sinkt mit
abnehmender Konzentration).
Bei Zugabe der Cytochromoxidase kann nun das Cytochrom c durch Luftsauerstoff oxidiert
werden. Das vorhandene Ascorbat reduziert das oxidierte Cytochrom wieder. Laufen
Oxidation und Reduktion mit gleicher Geschwindigkeit ab, ist das Fließgleichgewicht
erreicht. Das ist bei einer Absorbanz von 0,505 der Fall.
Zugabe von weiterem Ascorbat erhöht die Reaktionsgeschwindigkeit der Reduktion, so dass
die Absorbanz bis auf einen Wert von 0,692 steigen kann.
Der Zusatz von Kaliumcyanid blockiert die Cytochromoxidase wegen Komplexierung des
Fe(III). Dadurch kann die Oxidationsreaktion nicht mehr ablaufen und es findet nur noch die
Reduktionsreaktion statt. (Die toxische Wirkung von Cyanid auf den menschlichen Körper ist
darauf zurückzuführen). Das Ascorbat kann nun das Cytochrom c annähernd vollständig
reduzieren. (maximale Absorbanz von 0,934).
Die Zugabe von Kaliumhexacyanofferat(III) führt nun wieder zu einer Oxidation, da das rote
Blutlaugensalz das Bestreben hat in Kaliumhexacyanoferrat(II) überzugehen, da dieses
stabiler ist.
Die Absorbanz nimmt nun zuerst stark ab, steigt aber schnell wieder an, da das Ascorbat noch
im Überschuß vorliegt. Das Gleichgewicht stellt sich bei einer Adsorbanz von 0,915 ein, die
nahe am vorherigen Wert liegt. Bei entsprechend langer Reaktion würde sich der selbe Wert
einstellen.
Bei der nächsten und übernächsten Zugabe erreicht die Absorbanz ähnlich hohe Werte, jedoch
sinkt die Reaktionsgeschwindigkeit der Reduktion. (Hier gilt das selbe wie zuvor: durch
geringere Konzentration an Ascorbat sinkt die Reaktionsgeschwindigkeit).
Die Stoffmenge von Ascorbat ist größer als die Eingesetzte Stoffmenge an
Hexacxanoferrat(III), so dass am Ende der Reaktion das Cytochrom c überwiegend in der
reduzierten Form vorliegt.
Das Kaliumhexacyanoferrat(III) ist in der Lage die prosthetische Fe(II) Gruppe direkt zu
Fe(III) zu oxidieren, was mit molekularem Sauerstoff allein nicht möglich ist.
Die Cytochromoxidase oxidiert das Cytochrom c in 4 aufeinander folgenden Ein-ElektronenÜbertragungen. Am Ende dient molekularer Sauerstoff als Elektronenakzeptor.
Bei Zugabe von Cytochromoxidase stellt sich ein Fließgleichgewicht mit relativ hohem Anteil
an oxidiertem Cytochrom c ein, da die Aktivität der Oxidase groß ist.
Die Zugabe von rotem Blutlaugensalz führt zunächst zu einem starken Anstieg der oxidierten
Form, jedoch reduziert das im Überschuß vorhandene Ascorbat das gesamte Blutlaugensalz
und es bildet sich die reduzierte Form des Cytochrom c.
Konzentrationen an reduziertem Cytochrom c6:
Zugabe:
Ascorbat Cyt.oxid. Ascorb. KCN
KHCF KHCF KHCF
Absorbanz
Im GGW
0,329
0,888
0,505
0,692
0,934
0,915
0,885
0,884
= E(red.):
Konzentration
0
36,7
11,5
23,8
39,7
38,4
36,5
36,4
reduziertes
mol/L mol/L mol/L mol/L mol/L mol/L mol/L mol/L
Cytochrom c
Prozent
reduziertes
Cytochrom an
0%
73,4%
23,0%
47,6% 79,4% 76,8% 73,0% 72,8%
Gesamt
Cytochrom
Wenn das Gesamte Cytochrom reduziert wird, ergibt sich ein Extinktionswert7 von 1,091
Fließgleichgewicht zwischen Ascorbat und Sauerstoff
Die Reaktion von Ascorbat mit Sauerstoff findet nicht direkt statt, sondern der Sauerstoff
wird mit Hilfe der Cytochromoxidase zu Wasser reduziert. Dazu werden 4 Elektronen und 4
Protonen benötigt. Die Elektronen werden in 1-Elektronen-Übertragungen vom Cytochrom c
bereitgestellt. Dieses wird dabei oxidiert.
Durch das Ascorbat wird es jedoch in jedem Zyklus reduziert. Ascorbat geht dabei in
Dehydroascorbat über. Bei dieser Reaktion werden zwei Protonen gebildet sowie zwei
Elektronen, die das Cytochrom reduzieren.
6
7
Berechnet sich aus: c = [E(red.)-E(ox.)]/[*d]; E(ox.) = 0,329
Ergibt sich aus Umformung: E(red.) = *(c*d) + E(ox.)
4 * Cyt.c(red.)
4 * Cyt.c(ox.)
CuB2+ Fe3+a3
2H+ -> H2O
e- von
Cyt.c(red.)
e- von
Cyt.c(red.
)
2 *Ascorbat
CuB2+ O=Fe4+a3
+
2H -> H2O
4H+ + 4e-
2 * Dehydroascorbat
Cu+B Fe3+a3
e- von
Cyt.c(red.
)
e- von
Cyt.c(red.
)
O2
CuB2+-O-O-Fe3+a3
Teil 2 Bildung und Verwertung von Wasserstoffperoxid - Katalase:
Um die Aktivität der Katalase untersuchen zu können, wird eine Wasserstoffperoxid
Stammlösung hergestellt8. Die Stammlösung wird mit Kaliumpermanganat titriert9.
Konzentrationsbestimmung der Stammlösung:
10mL der ca. 0,06%igen Stammlösung von H2O2 werden mit 4mL 10%iger H2SO4 versetzt
und mit KMnO4 (5 mmol/L) titriert, bis der Farbumschlag von farblos nach rosa erfolgt.
Verbrauch: 16,6 mL
Daraus errechnet sich eine Stoffmenge von 0,208 mmol H2O2 in 10mL der verd. Lösung.
Bestimmung des pH-Optimums und Auswirkung von Hemmstoffen:
Es werden jeweils 10mL der Wasserstoffperoxid Stammlösung mit 10mL Puffer und 1mL
Katalasesuspension zusammengegeben und 60 Sekunden gewartet. Dann wird die Reaktion
mit 4 mL 10%iger H2SO4 beendet und mit KMnO4 titriert.
8
1 mL Wasserstoffperoxid (ca.30%) in 500mL Messkolben mit Wasser auffüllen. Entspricht ca. 0,06%
Kaliumpermanganat reagiert im sauren mit H2O2 zu Mn2+, H2O und O2. KMnO4 + H2O2 + H+ -> 5 H2O2 + 2
KMnO4 + 6H+ -> 5 O2 + 2 Mn2+ + 8 H2O. Die Stoffmenge an H2O2 berechnet sich also zu 2,5 * n(KMnO4)
Daraus folgt: n(H2O2) = 2,5 * c(Permanganat) * V(Permanganat)
Der zu erwartende Verbrauch wäre: (Dichte H2O2 = 1,11g/mL) -> n(H2O2) in 1mL 30% H2O2 =
(1,11g*0,3)/34g/mol = 9,794 mmol. In 10mL der verd. Lsg. n(H2O2) = 0,02*9,794mmol = 0,196 mmol.
Verbrauch KMnO4 = 15,7mL
9
Probe
pH Wert
Verbrauch an
KMnO4 in mL
Hemmstoff:
Vol. Hemmstoff
Übrige
Stoffmenge
H2O2 nach
Katalase
Reaktion
[mmol]
Umgesetzte
Stoffmenge
[mmol]
Katalaseaktivität
in [umol/s]
Katalaseaktivität
in U
1
5
2
6
3
6,8
4
7,2
5
7,5
15,7 15,35 14,5 14,25 10,45
-
-
-
-
-
6
8,0
7
8,5
8
8,7
9
9
10
7,5
11
7,5
8,2
6,85
8,55
14,1
15,5
16,5
-
-
-
-
Azid Cyanid
0,5mL 0,5mL
0,196 0,192 0,181 0,178 0,131 0,103 0,086 0,107 0,176 0,194
0,206
0,012 0,016 0,027 0,030 0,077 0,105 0,122 0,101 0,032 0,0140 0,002
0,17
0,27
0,45
0,5
1,28
1,75
2,03
1,68
0,53
0,23
0,03
10,2
16,2
26,9
30,0
76,6 104,8 121,6 100,6 31,7
13,8
1,8
Aktivität der Katalase
140
120
U
100
Aktivität der Katalase
80
Azid
60
Cyanid
40
20
0
5
6
7
8
9
pH
Das pH Optimum der Katalase befindet sich bei einem pH Wert von 8,5.
Der Zusatz von Azidionen hemmt die Wirkung der Katalase stark. Cyanid-Ionen bewirken
eine fast vollständige Hemmung der Aktivität.
Aktivität der Katalaselösung am pH Optimum: 2,03 mol/s
Molare Aktivität der Katalase:
Der Proteingehalt der unverdünnten Katalase Suspension beträgt 22,1mg/mL. Die Masse der
Katalase beträgt ca. 240000 g/mol. 12,5 L der Katalase Suspension werden mit Wasser auf
100mL aufgefüllt. Das entspricht einem Gehalt an Katalase von 276,25g in der verdünnten
Lösung. In jeder Probe wird 1mL dieser verd. Lösung verwendet. 1mL enthält 2,76g
Katalase. Das entspricht einer Stoffmenge von 11,5 * 10-6 mol. Am pH Optimum werden
2,03 mol/s H2O2 abgebaut.
Die molekulare Aktivität beträgt damit 177 * 103 Umsetzungen10 pro Katalasemolekül und
Sekunde.
Der experimentell erhaltene Wert liegt um mehr als das zehnfache darunter. Das kann daher
kommen, dass die Katalase im Körper bei einer Temperatur von 37°C arbeitet, bei diesem
Versuch aber bei ca. 10°C. Bei niedriger Temperatur ist die Reaktionsgeschwindigkeit
geringer.
Flavinenzyme die Sauerstoff als Elektronenakzeptor verwenden:
Flavinenzyme sind Oxidoreduktasen, die FAD als Coenzym benutzen.
Wichtige Beispiele sind die Flavin-Monooxygenasen, die Luftsauerstoff und FAD als
Coenzym benutzen um C-H Bindungen in C-OH Bindungen zu überführen.
Die Flavin Oxidasen oxidieren Substrate unter Bildung von H2O2. Dioxygenasen verwenden
ebenfalls FAD und molekularen Sauerstoff, wobei hier jedoch beide Sauerstoffatome in das
Molekül eingebaut werden11.
Ein weitere wichtige Gruppe der Flavinenzyme sind die Aminooxidasen, vor allem die
Monoaminoxidase12. Mit Hilfe der MAO können im Körper biogene Amine abgebaut werden.
Sie verwendet ebenfalls molekularen Sauerstoff als Elektronenakzeptor.
Die molekulare Aktivität der Katalase beträgt ca. 107 s-1. (Quelle: „Lehrbuch der Biochemie; D.Voet,
J.G.Voet,C.W.Pratt; dt.Ausgabe (2002); S.349“)
11
Quelle: http://www.gdch.de/taetigkeiten/nch/inhalt/jg2004/biokatalyse.pdf
12
Quele: http://www.leb.chemie.tu-muenchen.de/tum/downloads/Vitamin%20B2.pdf
10