Protokoll zum Versuch 6 - Ihre Homepage bei Arcor

Technisches
Biochemie- Praktikum
SS 2006:
Protokoll zum Versuch 6:
Biochemische Charakterisierung von
P450-Monooxygenasen
von Gruppe 7:
Bettina Huck
Christian Katzenwadel
Marko Kirtz
1 Einleitung:
Ziel des Versuchs war es, den Umgang mit P450 Monooxygenasen (Wildtyp und
Mutante) zu erlernen.
Dafür wurde mit der bakteriellen Monooxygenase P450 BM-3 sowie der NADHabhängigen fünffach- Mutante gearbeitet.
Zu Beginn des Versuches bestand die Aufgabe darin, die P450- Konzentration beider
Enzyme (Wildtyp und Mutante) durch die CO-Differenzspektroskopiemethode sowie
im Anschluss daran ihre spezifischen Aktivitäten mit Hilfe des pNCA- Assays zu
bestimmen. Daraus sollten dann die kinetischen Konstanten der Reaktion bestimmt
werden.
Des weiteren folgte die Durchführung einer P450- katalysierten Reaktion mit
Naphtalin als Substrat.
Die Monooxygenasen besitzen eine Schlüsselfunktion im Metabolismus exogener
und endogener Verbindungen und gehören zur Klasse der Oxidoreduktasen . Dieser
Klasse gehören allgemein Enzyme an, die Kohlenstoffatome oxygenieren können.
Monooxygenasen übertragen einen Sauerstoff aus einem O 2-Molekül auf das
Substrat, der andere Sauerstoff wird dabei zu Wasser reduziert. Diese Enzyme
enthalten ein Hämsystem, welches als Besonderheit ein Cysteinat als Liganden
beinhaltet und dadurch ein Absorpionsmaximum von 450 nm anstatt der 420 nm bei
histidin- gebundenen Monooxygenasen im Co- Differenzspektrum aufweist (daher
auch die Namensgebung) .
Unser Augenmerk im Versuch war auf die P450-Monooxygenasen gerichtet, sie
wurden erstmals aus Rattenleber isoliert, finden sich jedoch in vielen Organismen bis
hin zum Menschen, sind also in der Natur weit verbreitet.
P450- Enzyme gehören zu den sogenannten Phase 1 Enzymen, die mittels
Oxygenierungen wasserunlösliche oder schwer lösliche Verbindungen zur weiteren
Metabolisierung vorbereiten.
Da die meisten P450 Monooxygenasen für die von ihnen katalysierten Reaktionen
Cofaktoren wie NADPH oder NADH benötigen, werden sie je nach Art des
Elektronentransfersystems in vier verschiedene Klassen unterteilt: Klasse I Enzyme
erhalten Elektronen von NAD(P)H über eine FAD-Reduktase und ein Fe-SFerredoxin. Diese Enzyme sind meistens in Bakterien oder in Mitochondrien zu
finden. Bei den Klasse II Enzymen handelt es sich zumeist um mikrosomale P450Enzyme, die ihre Elektronenäquivalente über FAD und FMN erhalten. Zu den Klasse
III werden solche P450-Enzyme gerechnet, die keinerlei weiteren Reduktionsäquivalente benötigen und peroxygenierte Substrate umsetzen können. Enzyme aus
Klasse IV sind völlig unabhängig von einem Transfersystem, da sie direkt von NADH
mit Reduktionsäquivalenten versorgt werden.
P450- Monooxygenasen katalysieren zahlreiche Reaktionen wie aliphatische und
aromatische Hydroxylierungen, Alken-Epoxidierung, N- und O-Dealkylierungen,
Desulfurylierungen, Dealkylierungen, Desaminierungen. Sie dienen in Organismen
z.B. der Egosterol- Synthese, der Biosynthese von Gluko- und Mineralkortikoiden,
der Ausbildung von Fruchtreife bei Pflanzen und vielen anderen Vorgängen.
Limitierender Faktor der industriellen Nutzung sind bisher jedoch die hohen Kosten
des Cofaktors NADPH, weshalb nach Mutanten geforscht wird, die NADH als
Cofaktor akzeptieren.
In dem Versuch wurde mit P450 BM-3 Monooxygenase, einer bakteriellen
Monooxygenase, gearbeitet. Hierbei handelte es sich um eine Fettsäurehydroxylase,
die ausschließlich Fettsäuren einer Länge von 12-22 C-Atomen umsetzt. Größere
Verbindungen können durch gezielte Mutationen ebenfalls von der Monooxygenase
als Substrat erkannt und umgesetzt werden.
Aktivitätsbestimmungen werden häufig über optische Verfahren ermittelt. Im Falle der
Monooxygenasen wird diese oft über den NADPH- Verbrauch gemessen. Da dieser
nicht sehr spezifisch für P450- Monooxygenasen ist, wurde der pNCA-Assay
entwickelt. Dieser Assay beruht auf der Spaltung von paraNitrophenoxycarbonsäuren. Die P450- Monooxygenasen hydroxylieren den
Fettsäurerest des Moleküls und veranlassen dadurch die Dissoziation des
entstehenden Halbacetals in Oxofettsäure und Nitrophenolat. Das Nitrophenolat
kann dabei photometrisch bei einer Wellenlänge von 410 nm detektiert werden.
2 Durchführung:
2.1 Bestimmung der P450-Konzentration
Zu Beginn des Versuches wurden die Konzentrationen der ausgegebenen
Enzymlösungen (Wildtyp P450 BM-3 und 5-fach Mutante) mithilfe der CODifferenzspektroskopiemethode bestimmt.
Bei dieser Methode werden nicht erwünschter Spektren anderer Stoffe und
Hintergrundrauschen durch Subtraktion zweier Absorptionsmessungen
herausgenommen und das Differenzspektrum zwischen reduziertem P450- COKomplex und reduziertem P450 aufgenommen.
Für die Messung wurden von jeder Enzymlösung (Wildtyp und Mutante) 200 µl in
jeweils ein Eppendorfgefäß überführt und mit 1,8 ml 50 mM Kaliumphosphatpuffer
(pH 7,5) aufgefüllt. Anschließend wurde für die Reduktion des Häm-Eisens zu
Eisen(II) eine Spatelspitze Natriumdithionit hinzugegeben und beide Proben auf
zwei Eppendorfgefäße aufgeteilt. Jeweils eine der Proben wurde dann für eine
Minute mit CO begast, die andere diente als Referenz für die Messung der
Absorption.
Das Photo- Spektrometer gab die Absorptionen bei 450 und 490 nm an. Daraus
konnte über die Absorptionsdifferenz (A450-490) die Konzentration der
Enzymlösungen mit Hilfe des Lambert-Beerschen bestimmt werden.
2.2 Bestimmung der kinetischen Konstanten
Die kinetischen Konstanten von BM3 sollten mit Hilfe des pNCA- Assays bestimmt
werden.
Hierfür wurden die benötigten Enzymlösungen ( ungefähr 2 μM P450 WildtypEnzymlösung und 2 μM Mutanten-Enzymlösung) aus den Enzym-Stammlösungen
hergestellt.
Dazu wurde für die Mutante 600 l der Stammlösung zu 300 l Kaliumphosphatpuffer pipettiert und für den Wildtyp 500 l der Stammlösung zu 500 l Puffer.
Als Substrat für die Bestimmung der spezifischen Aktivität des P450 BM-3 Wildtypes
sowie der NADH- abhängigen 5-fach Mutante (A74G, F87V, L188Q, R966D,
W1046S) verwendete man para- Nitrophenoxycarbonsäuren.
Dazu wurde eine Verdünnungsreihe mit den Substratkonzentrationen 0,5mM, 1mM,
2mM, 4mM, 5mM, 7,5mM und 10 mM aus einer 15 mM Stammlösung hergestellt.
Tab. 1: Verdünnungsreihe der Substratlösung
Substratkonzentration
Verwendete
[mM]
Stammlösung
[mM]
0,5
10
1,0
10
2,0
10
4,0
10
5,0
15
7,5
15
10,0
15
Stammlösung
V
[μl]
5
10
20
40
40
50
140
DMSO
v
[μl]
95
90
80
60
80
50
70
Das Substrat und die Enzymlösung wurden zusammen mit dem Testpuffer in eine
Küvette gegeben. Als Testpuffer wurde 50mM Kaliumphosphatpuffer mit einem pH
von 8,1 verwendet. Mit Zugabe von 50 μl der 6 mM NADPH-Lösung zu dem WildtypAnsatz bzw 6 mM NADH-Lösung zum Mutanten-Ansatz wurde die Reaktion
gestartet. Mittels Absorptionsmessung bei 410 nm konnte der Anstieg der
Nitrophenolatkonzentration verfolgt werden und aus der Steigung die Absorption/min
(E/t) entnommen werden. Die Messungen wurde als Doppelbestimmung
ausgeführt und die Auswertung über Lineweaver-Burke-Plots erstellt.
Tab. 2: Messansatz für den pNCA-Assay
Substratkonzentration
Substratlösung
[mM]
[μl]
0,5
20
1,0
20
2,0
20
4,0
20
5,0
20
7,5
20
10,0
20
Testpuffer
[μl]
880
880
880
880
880
880
880
Enzymlösung
[μl]
50
50
50
50
50
50
50
2.3 Umsetzung von Naphthalin und Nachweis der Produkte über
Dünnschichtchromatographie (DC)
Das Substrat Naphtalin kann an zwei Positionen hydroxyliert werden, dabei
entstehen die Produkte 1-Naphtol bzw 2-Naphtol.
In diesem Versuchsteil sollte die Naphtalin- Umsetzung durch den Wildtyp sowie
durch die Mutante katalysiert werden und anschließend die gebildeten Produkte
mittels DC aufgetrennt und nachgewiesen werden.
Dazu wurden jeweils 10 μl einer 30 mM Naphtalin- Lösung in Aceton mit 40 μl der
Enzymlösung sowie mit 900 μl Puffer vermischt, die beiden Ansätze fünf Minuten bei
Raumtemperatur inkubiert, die Reaktion durch Zugabe von 50 μl NADPH/ NADHLösung (6 mM) gestartet und der Cosubstratverbrauch über Absorptionsmessung bei
340 nm verfolgt.
Nach abgeschlossener Reaktion wurde die Reaktionslösung zweimal mit Diethylether
extrahiert, die vereinigten Lösungsmittelphasen mithilfe von Magnesiumsulfat
getrocknet, in ein neues Eppi überführt und durch Stehenlassen der Diethylether
verdampft. Anschließend wurde der Rückstand in 10 μl Aceton gelöst.
Die Proben wurden nun zusammen mit Referenzen aus reinem 1- und 2-Naphtol
mittels einer Kapillare auf eine beschriftete Kieselgelplatte aufgetragen. Als Laufmittel
wurde ein Toluol/Triethylamin (3:1)-Gemisch verwendet. Dieses wurde in eine DCKammer gegeben, worauf es verdampfte und die Luft absättigte. Nach dem
Hineinstellen der DC-Platte wurde das Fließmittel bis etwa 1 cm unterhalb der oberen
Kante laufen gelassen und dann die Laufmittelfront markiert.. Nach dem Trocknen
der DC-Platte im Warmluftstrom und der Abkühlung wurde diese in eine
Echtblausalz-Lösung (1 Spatelspitze in 20 ml) getaucht und wieder getrocknet.
Das Chromatogramm wurde im Anschluss ausgewertet.
3. Ergebnisse:
3.1 Bestimmung der P450-Konzentration
Die Berechnung der Konzentration an P450 BM-3 mittels CO-Differenzspektroskopie
erfolgte mithilfe des Lambert- Beerschen- Gesetzt (nachstehend aufgeführt). Für den
Wildtyp wurde eine Absorptionsdifferenz von 0,039 ermittelt und für die Mutante ein
Wert von 0,028. Dies ergibt eine P450-Konzentration des Wildtyps von 4,29 µM bzw.
3,08 µM für die Mutante.
c(P450) =
c(P450):
A450-490:
Verdf:
d:
:
A450-490 x Verdf
 * 1000
 x d
Konzentration von P450 [nmol/ml]
Differenz der Absorptionen bei 450 nm und 490 nm
Verdünnungsfaktor (1:10)
Schichtdicke (1 cm)
Extinktionskoeffizient von P450 bei 450 nm (91 mM-1cm-1)
3.2 Bestimmung der kinetischen Konstanten:
Für die Bestimmung der kinetischen Konstanten wurden folgende Steigungswerte
(E/t) der Absorptionsmessung als Doppelbestimmung für den Wildtyp
(Tabelle 3) sowie für die Mutante (Tabelle 4) gemessen:
Tab. 3: Messwerte P450 BM-3 (Wildtyp)
Substratkonz.
1. Messung
im 1000 µl Ansatz
E/t
[µM]
[1/min]
10
0,0846
20
0,1290
40
0,1884
80
0,1892
100
0,2462
150
0,2214
200
0,1746
2. Messung
E/t
[1/min]
0,1042
0,1928
0,2622
0,3790
0,3740
0,4050
0,4556
Tab. 4: Messwerte P450 BM-3 (5-fach Mutante)
Substratkonz.
1. Messung
im 1000 µl Ansatz
E/t
[µM]
[1/min]
10
0,0622
20
0,1556
40
0,1972
80
0,1736
100
0,1640
150
0,1566
200
0,1380
2. Messung
E/t
[1/min]
0,1028
0,1742
0,2460
0,3822
0,3634
0,3754
0,3844
3.2.1 Berechnung der Reaktionsgeschwindigkeit
Die Berechnung der Reaktionsgeschwindigkeit v erfolgte mit folgender Formel:
v
v:
E:
t:
:
d:
E /t
= 
 x d
Reaktionsgeschwindigkeit [1 µmol/ml Substratumsatz / min]
Extinktionsänderung
Zeitänderung [min]
13,2 ml / (µmol x cm)
Lichtweg durch die Küvette (1 cm)
Die sich daraus ergebenden Geschwindigkeits- Werte sind für beide Messungen in
folgenden Tabellen zusammengefasst (Tab. 5:Wildtyp Messung 1; Tab. 6:Wildtyp
Messung 2; Tab. 7:Mutante, Messung 1; Tab. 8 :Mutante, Messung 2).
Zusätzlich enthalten diese Tabellen gleichzeitig die für die Lineweaver- BurkDarstellung benötigten reziproken Substratkonzentrationen und
Reaktionsgeschwindigkeiten.
Tabelle 5: Werte Wildtyp, Messung 1
Substratkonz.
Messwert
Reaktions-
1 / Substratkonz.
1 / Reaktions-
im 1000 µl Ansatz
1
geschwindigkeit v
in 1000 µl Probe
geschwindigkeit v
[µM]
E/t [1/min]
[M /min]
[1/µM]
[1/M · min]
10
0,0846
6,4091
0,1000
0,1560
20
0,1290
9,7727
0,0500
0,1023
40
0,1884
14,2727
0,0250
0,0701
80
0,1892
14,3333
0,0125
0,0698
100
0,2462
18,6515
0,0100
0,0536
150
0,2214
16,7727
0,0067
0,0596
200
0,1746
13,2273
(0,0050)
(0,0756)
Tabelle 6: Werte für Wildtyp, Messung 2
Substratkonz.
Messwert
Reaktions-
1 / Substratkonz.
1 / Reaktions-
im 1000 µl Ansatz
2
geschwindigkeit v
in 1000 µl Probe
geschwindigkeit v
[µM]
E/t [1/min]
[M /min]
[1/µM]
[1/M · min]
10
0,1042
7,8939
0,1000
0,1267
20
0,1928
14,6061
0,0500
0,0685
40
0,2622
19,8636
0,0250
0,0503
80
0,3790
28,7121
0,0125
0,0348
100
0,3740
28,3333
0,0100
0,0353
150
0,4050
30,6818
0,0067
0,0326
200
0,4556
34,5152
(0,0050)
(0,0290)
Tabelle 7: Werte für Mutante, Messung 1
Substratkonz.
Messwert
Reaktions-
1 / Substratkonz.
1 / Reaktions-
im 1000 µl Ansatz
1
geschwindigkeit v
in 1000 µl Probe
geschwindigkeit v
[µM]
E/t [1/min]
[M /min]
[1/µM]
[1/M · min]
10
0,0622
4,7121
0,1000
0,2122
20
0,1556
11,7879
0,0500
0,0848
40
0,1972
14,9394
0,0250
0,0669
80
0,1736
13,1515
0,0125
0,0760
100
0,1640
12,4242
0,0100
0,0805
150
0,1566
11,8636
0,0067
0,0843
200
0,1380
10,4545
(0,0050)
(0,0957)
Tabelle 8: Werte für Mutante, Messung 2
Substratkonz.
Messwert
Reaktions-
1 / Substratkonz.
1 / Reaktions-
im 1000 µl Ansatz
2
geschwindigkeit v
in 1000 µl Probe
geschwindigkeit v
[µM]
E/t [1/min]
[M /min]
[l1/µM]
[1/M · min]
10
0,1028
7,7879
0,1000
0,1284
20
0,1742
13,1970
0,0500
0,0758
40
0,2460
18,6364
0,0250
0,0537
80
0,3822
28,9545
0,0125
0,0345
100
0,3634
27,5303
0,0100
0,0363
150
0,3754
28,4394
0,0067
0,0352
200
0,3844
29,1212
(0,0050)
(0,0343)
Anschließend wurden die Standardabweichungen der Messergebnisse (1/v) beider
Enzyme von den jeweiligen Mittelwerten berechnet, Tabelle 9 und 10 fassen die
Ergebnisse zusammen:
Tabelle 9: Standardabweichung für den Wildtyp
Mittelwert
Abweichung
Abweichung
1/v
der Messung 1 der Messung 2
0,1414
-0,0147
0,0147
0,0854
-0,0169
0,0169
0,0602
-0,0099
0,0099
0,0523
-0,0175
0,0175
0,0445
-0,0092
0,0092
0,0461
-0,0135
0,0135
(0,0523)
(-0,0233)
(0,0233)
Tabelle 10: Standardabweichung für die Mutante
Mittelwert
Abweichung
Abweichung
1/v
der Messung 1 der Messung 2
0,1703
-0,0419
0,0419
0,0803
-0,0045
0,0045
0,0603
-0,0066
0,0066
0,0553
-0,0207
0,0207
0,0584
-0,0221
0,0221
0,0597
-0,0246
0,0246
(0,0650)
(-0,0307)
(0,0307)
3.2.2 Auftragung nach Lineweaver- Burk (LB):
Für die Erstellung der LB- Diagramme wurden die Mittelwerte von 1/v verwendet.
Dazu wurden für jeden Messpunkt (mit Ausnahme des letzten Messpunktes beider
Messungen) die Werte von 1 / v gegen 1 / [S] aufgetragen, und aus dem
Ordinateabschnitt 1 / Vmax sowie aus dem Abszissenabschnitt -1 / KM die
Maximalgeschwindigkeit bzw. die Michaeliskonstante berechnet.
Abbildung 1 zeigt die LB- Kinetik für den Wildtyp, Abbildung 2 für die Mutante.
Substratumsetzung Wildtyp
0,20
0,17
y = 1,0327x + 0,0365
1/Geschwindigkeit [1/uM*min]
0,14
0,11
0,08
0,05
0,02
-0,12
-0,10
-0,08
-0,06
-0,04
-0,01
-0,02 0,00
-0,04
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
-0,07
-0,10
-0,13
-0,16
1/Substratkonzentration [1/uM]
Abbildung 1: LB-Diagramm des Wildtyps zur Bestimmung der kinetischen
Konstanten der Umsetzung des Substrates pNCA in Gegenwart von NADPH
Substratumsetzung Mutante
0,24
0,21
1/Geschwindigkeit [1/uM*min]
0,18
y = 1,1957x + 0,04
0,15
0,12
0,09
0,06
0,03
-0,12
-0,10
-0,08
-0,06
-0,04
0,00
-0,02
-0,030,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
-0,06
-0,09
-0,12
-0,15
-0,18
1/ Substratkonzentraion [1/uM]
Abbildung 2: LB- Diagramm der Mutante zur Bestimmung der kinetischen
Konstanten der Umsetzung des Substrates pNCA in Gegenwart von NADH
Aus der Abbildung 1 ließ sich für den Wildtyp eine Reaktionsgeschwindigkeit vmax von
27,4 µM/min sowie eine Michaeliskonstante KM von 28,6 µM ableiten.
Für die Mutante betrugen die Werte vmax = 25,0 µM/min und KM = 30,3 µM.
3.2.3 Ermittlung der katalytischen Konstante kcat
Zur Berechnung der katalytischen Konstante kcat ( gibt die Anzahl der
Reaktionszyklen eines Enzyms pro Zeiteinheit an) wurde folgende Formel
verwendet:
kcat
Vmax [µM x min]
= 
Enzymkonzentration in der Testküvette [µM]
Die Enzymkonzentration [ET] der eingesetzten Lösungen betrugen bei dem
Wildtypenzym 2,15 µM und bei der Mutante 2,05 µmol/l .
Für das Testvolumen von 50 µl entsprach dies
bei dem Wildtyp:
2,15 µM / 20 = 0,1075 µM
und bei der Mutante : 2,05 µM / 20 = 0,1025 µM
Für das P450 BM-3 Wildtypenzym erhielt man somit:
kcat = 27,4 µM/min / 0,1075 µM = 256 min-1
Für das P450 BM-3 Mutantenenzym errechnete sich:
kcat = 25,0 µMmin / 0,1025 µM = 244 min-1
3.3 Umsetzung von Naphthalin und Nachweis der Produkte über
Dünnschichtchromatographie
Die Abbildung 3 zeigt die Kieselgelplatte, die man nach der Durchführung der
Dünnschichtchromatographie erhalten hat.
Abbildung 3: DC-Platte im Laufmittel Toluol/ Triethylamin (3:1)
(Spur1: WT; Spur2: Mutante; Spur3: 1-Naphtol;
Spur 4: 2- Naphtol; Spur5: Naphtalin)
4. Diskussion:
Tabelle 11 fasst die ermittelten kinetischen Parameter zusammen:
Tabelle 11: ermittelte kinetische Parameter
Enzym
Vmax [µM/min]
P450 BM-3 Wildtyp
27,4
5-fach Mutante
25,0
KM [µM]
28,6
30,3
kcat [min-1]
256
244
Vergleicht man nun die Michaelis- Menten- Konstanten KM aus Tabelle 11, fällt auf,
dass die Affinität des Wildtyps zu dem Substrat pNCA fast genauso groß ist wie die
Affinität der Mutante zu dem Substrat pNCA (28,6 µM im Vergleich zu 30,3 µM ).
Dies lässt darauf schließen, dass es mithilfe der fünffachen Mutation gelungen ist,
dass Enzym so zu verändern, dass es erstens das Substrat pNCA mit einer etwas
besseren Affinität bindet als der Wildtyp, zweitens den wesentlich billigeren Cofaktor
NADH akzeptierte.
Jedoch muss man die erhaltenen Werte kritisch betrachten, denn innerhalb der
Doppelmessungen traten große Schwankungen auf (siehe Tabelle 5-8). Bei dem
ersten Durchgang der Absorptionsmessung (Wildtyp sowie Mutante) erhielt man vor
allem bei den hohen Substratkonzentrationen (ab 100 µM) wesentlich niedrigere
Werte als erwartet, dies lässt sich eventuell durch die Tatsache einer
Sustratüberschusshemmung erklären. Weiterhin wäre auch ein Pippetierfehler beim
Ansetzen der Substratverdünnungsreihe denkbar.
Weiterhin lagen die Werte des ersten Messdurchgangs der Doppelbestimmung bei
beiden Enzymen deutlich unter den Werten des zweiten Durchgangs.
Eventuell lagt die Ursache darin, dass die beiden Enzyme und Cofaktoren NADPH
und NADH vor der Messung auf Eis gehalten wurden und es dadurch zu
Anlaufschwierigkeiten der Reaktion kam.
Vergleicht man die Umsatzzahlen der beiden Enzyme, so lag der Wert des Wildtyps
höher als der Wert der Mutante (256 min-1 zu 244 min-1).
Dies bedeutet, dass der Wildtyp in gleicher Zeit mehr Substrat umgesetzt hat als die
Mutante.
Eigentlich widersprach dieses Ergebnis der Annahme, dass durch die Mutationen
(Austausch von drei Aminosäuren am aktiven Zentrum des Enzyms) dem Substrat
ein besserer Zugang zum aktiven Zentrum ermöglicht wurde und es leichter binden
konnte. Begründet wurde diese Annahme durch die Tatsache, dass es sich z.B. um
den Austausch von Phenylalanin gegen das kleinere Valin oder um den Austausch
von Alanin durch das kleiner Glycin handelte. Dadurch wurde die Substrattasche
vergrößert.
Auch hier könnte man einen Pippetierfehler als mögliche Ursache nennen.
Bei der Auswertung der DC- Platte (Abbildung 3) fiel auf, dass sowohl die Mutante
(Spur 2) als auch der Wildtyp (Spur) Naphtalin in 1- Naphtol umgesetzt haben,
jedoch die Mutante in einem viel größeren Umfang als der Wildtyp (erkennbar an der
viel stärkeren Färbung).
Dies ist möglicherweise darauf zurückzuführen, dass der Aminosäurenaustausch zu
einer besseren Zugänglichkeit des relativ großen Substrats Naphtalin zum aktiven
Zentrum der Mutante geführt hat, so dass Naphtalin besser akzeptiert wurde und
eine schnellere Umsetzung des Substrats erfolgen konnte.
Im Versuch konnte nur für die Mutante eine geringe Umsetzung zu 2-Naphtol
nachgewiesen werden (sehr schwache Färbung in Spur 2, Abb3 auf Höhe von Spur
4), der Wildtyp wies keine Umsetzung zu 2- Naphtol auf (keine Bande in Spur 1 auf
Höhe der Referenzspur 4 zu erkennen)
Dies könnte möglicherweise daran liegen, dass 2-Naphtol in geringeren Mengen als
1-Naphtol gebildet wurde, so dass in diesem Fall die Konzentration zum Nachweis zu
gering ausfiel oder dass es im Falle des Wildtyps zu gar keiner Bildung an 2-Naphtol
kam.
Spur 5 (Naphtalin) wies überhaupt keine Färbung auf, dies lässt sich dadurch
erklären, dass Naphtalin aufgrund nicht vorhandener OH- Gruppen gar nicht
angefärbt werden konnte.