DNA-Polymerase für die Reverse Transkriptase PCR

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DNA-Polymerase für die Reverse Transkriptase PCR
Anwendungsgebiet
Stand der Technik
Für die Reverse Transkriptase PCR (RT-PCR) werden
üblicherweise zwei verschiedene Enzyme eingesetzt, die
zunächst die RNA auf cDNA umschreiben, welche dann im
Folgeschritt amplifiziert wird.
Es gibt auch ein Beispiel für eine Polymerase, die ebenfalls
eine reverse Transkriptase Funktion besitzt. Dieses Enzym
2+
arbeitet allerdings nur in Gegenwart von Mn -Ionen. Um
eine PCR-Amplifikation mit diesem Enzym zu ermöglichen,
muss nach der RT-Reaktion eine weitere Probenmanipulation folgen, bei der das Probengefäß geöffnet
werden muss. Diese Vorgehensweise ist zu aufwändig für
Hochdurchsatz-Verfahren und kann auch zu Kontaminationen führen.
Innovation
Wissenschaftler der Universität Konstanz haben eine
Mutante der Polymerase aus Thermus aquaticus (Taq)
entwickelt, die erstens Reverse Transkriptase Aktivität
2+
besitzt und zweitens einwandfrei mit Mg -Kationen
arbeitet. Diese Polymerase ist für RT PCR in Echtzeit und
Hochdurchsatz bestens geeignet. Anspruchsvolle RNATemplate können damit einfach nachgewiesen werden und
hervorragend kloniert werden.
Patent-Portfolio
Eine deutsche Patentanmeldung sowie eine internationale
Anmeldungen sind anhängig.
wt
Mutante
PCR Zyklen 40 30 40
40 30 40
DN
A
RN
A
R
NA
Nt 100
75
50
DN
A
R
NA
R
NA
Bekannte Methoden für den Nachweis von Pathogenen
haben Verbesserungspotential hinsichtlich ihrer Verlässlichkeit, der Breite des Einsatzspektrums und der
Schnelligkeit, mit der die Resultate verfügbar werden. In
diesem Zusammenhang finden Methoden, die einen
unerwünschten Organismus durch den Nachweis der DNA
detektieren, eine immer breitere Anwendung, da schon
kleinste Mengen dieser Organismen durch die spezifische
Vervielfältigung der DNA mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) nachweisbar sind.
Auch diese sog. genotypisierenden Verfahren haben
Schwächen, insbesondere was die Spezifität der PCR
betrifft. Häufig werden bei sehr geringen Mengen an
Pathogen-DNA in einer Probe Fehlamplifikationen
beobachtet, die zu falsch-positiven Signalen führen.
Darüber hinaus kann nicht zwischen lebenden und
abgestorbenen Organismen unterschieden werden. Diese
Probleme können überwunden werden, wenn als TemplatNukleinsäure die mRNA verwendet wird und durch eine mit
reverser Transkription gekoppelte PCR nachgewiesen wird.
Wie in der Abbildung zu erkennen ist, sind sowohl die
Wildtyp-Variante (wt) als auch die Mutante PCR-aktiv,
wenn DNA als Templat angeboten wird. Hingegen wird das
RNA-Templat lediglich von der erfindungsgemäßen
Mutante vollständig amplifiziert, was eine effiziente RTAktivität belegt.
Ihre Vorteile auf einen Blick:
 Thermostabile DNA-Polymerasen mit Reverse
Transkriptase Aktivität
 Reaktivität der Polymerase ist unabhängig von Mn2+
 Einfacher Nachweis von RNA in Echtzeit und im
Hochdurchsatz
 RT PCR mit einem Enzym für Klonierungen
anspruchsvoller RNA-Template
Technologietransfer
Die Technologie-Lizenz-Büro GmbH ist mit der
Verwertung beauftragt und bietet Unternehmen
die Möglichkeit der Lizenznahme.
Weitere Informationen:
„Taq-Polymerase“
Dr. Uta Weirich
[email protected]
Technologie-Lizenz-Büro (TLB)
der Baden-Württembergischen Hochschulen GmbH
Ettlinger Straße 25, D-76137 Karlsruhe
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