Schiller-Schule Bochum
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Schiller-Schule Bochum Jahrgangsstufe Q1/1 Schuljahr 2014/15 FACHARBEIT im Leistungskurs Biologie Thema: Nachweis von Fischspezies in Lebensmittelprodukten mittels spezifischer Polymerasekettenreaktion und Überprüfung der Verfahren nach Brinkert et al. Verfasserin: Lea Schölmerich Kursleiter: Herr Dr. Schaller Bearbeitungszeit: 03.11.2014 – 15.12.2014 Abgabetermin: 15.12.2014 – 12.00 Uhr Inhaltsverzeichnis 1 2 3 4 5 6 7 8 Einleitung .................................................................................................................... 3 Methoden .................................................................................................................... 4 2.1 Eingesetzte Materialien ........................................................................................ 5 2.1.1 Geräte ............................................................................................................. 5 2.1.2 Chemikalien ................................................................................................... 5 2.2 Bestandteile des Master-Mixes ............................................................................. 6 2.3 DNA-Isolierungen ................................................................................................ 6 2.3.1 DNA-Isolierung der Firma Peqlab ................................................................. 6 2.3.2 DNA-Isolierung nach Brinkert et al. [5] ........................................................ 7 2.4 Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ................................................................ 7 2.4.1 Primerverdünnung .......................................................................................... 7 2.4.2 Zusammensetzung der PCR Proben ............................................................... 8 2.5 PCR-Programme ................................................................................................... 8 2.5.1 PCR nach Brinkert et al.................................................................................. 8 2.5.2 2. PCR-Programm .......................................................................................... 9 2.6 Agarosegelherstellung und Agarosegelelektrophorese ........................................ 9 Ergebnisse ................................................................................................................. 10 3.1 Lesen/ Deuten des Agarosegels .......................................................................... 10 3.2 Versuche ............................................................................................................. 11 3.2.1 Versuch I ...................................................................................................... 11 3.2.2 Versuch II ..................................................................................................... 12 3.2.3 Versuch III ................................................................................................... 13 3.3 Nachweis von Kabeljau in Fischstäbchen .......................................................... 13 Diskussion ................................................................................................................. 14 Literaturverzeichnis .................................................................................................. 17 Glossar ...................................................................................................................... 18 Praktikumsvorschrift ..................................................................................................... Erklärung ....................................................................................................................... Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Gewählte Variante für die Einstellung des Programms für die PCR .......... 9 Abbildung 2: Beispiel zur Deutung einer Agarosegelelektrophorese ............................. 10 Abbildung 3: Gel mit zwei Proben (Isolierung der Firma peqlab und 2. PCR-Programm) .......................................................................................................... 12 Abbildung 4: Gel mit acht Proben (Isolierung nach Brinkert et al. und 2. PCRProgramm) ...................................................................................................................... 12 Abbildung 5: Gel mit acht Proben (Isolierung sowie PCR-Programm nach Brinkert et al.).................................................................................................................................... 13 Abbildung 6: Gel mit acht Proben (Isolierung der Firma peqlab und dem 2. PCRProgramm) ...................................................................................................................... 14 3 1 Einleitung Kabeljau ist ein beliebter Speisefisch. Sein Verbreitungsgebiet erstreckt sich vom Nordatlantik bis hin zur Arktis [1]. Auf der roten Liste der IUCN (International Union for Conservation of Nature and Natural Resources) [2] wird sein Bestand als vulnerabel eingeschätzt. „Vulnarable“ bedeutet in der Taxonomie der Roten Liste, dass eine Art nicht kritisch gefährdet („critically endagered“) oder gefährdet („endagered“) ist, dass sie jedoch ein hohes Risiko der Ausrottung in der mittleren Zukunft („medium-term future“) hat. Insbesondere in der Nordsee gilt er als völlig überfischt. In einem Bericht der „Zeit Online“ vom 26. Januar 2010 [3] wird über eine Studie des Fischereibiologen Rainer Froese vom Kieler Leibnitz-Institut für Meereswissenschaften berichtet. Demzufolge haben von 54 untersuchten Fischarten im Nordost-Atlantik nur 3 Fischarten eine ausreichende Bestandgröße. Hierbei handelt es sich um die Ostsee-Sprotte, den Stöcker sowie den Seelachs. In dem Artikel von Zeit Online wird Rainer Froese auf S. 1 mit folgender Aussage zitiert: „Der Zustand von zwölf Fischarten – darunter Kabeljau, Scholle und Heilbutt – ist so schlecht, dass sie sich selbst bei einem kompletten Fischereistopp bis 2015 nicht mehr erholen könnten“. Mittlerweile haben wir das Jahr 2015 erreicht und der Kabeljau gehört nach wie vor zu den gefährdeten Fischarten. Fischhandel, der auf Nachhaltigkeit ausgelegt ist, sollte deswegen keinen Kabeljau verkaufen und den Kunden empfehlen, auf andere Fischarten auszuweichen. In Fischstäbchen, die zu knapp 2/3 aus Fisch bestehen (der Rest ist Panade), sollte dementsprechend kein Kabeljau enthalten sein. Ein sogenanntes MSC Siegel, dass sich mittlerweile auf sehr vielen Packungen mit tiefgekühltem Fisch findet, soll gewährleisten, dass dies auch tatsächlich der Fall ist. Das MSC (Marine Stewardship Council) bezeichnet sich selber auf seiner Homepage [4] als eine internationale, unabhängige und gemeinnützige Organisation. Nach den Angaben auf der Homepage ist das Ziel des MSC die Förderung von verantwortungsvoller Fischerei, die erlaubt, dass Fischbestände erhalten bzw. wieder aufgebaut werden. Das Siegel des MSC auf einer Packung mit Fischen soll dementsprechend gewährleisten, dass diese Fische aus zertifizierter, nachhaltiger Fischerei stammen. Kabeljau dürfte deshalb in Fischstäbchen, die dieses Siegel auf ihrer Packung haben, nicht enthalten sein. Verbraucher können jedoch weder durch Aussehen noch durch den Geschmack der Fischstäbchen erkennen, ob dies auch wirklich der Fall ist. Deswegen war das Ziel dieses in den Herbstferien 2014 an der Schiller-Schule durchgeführten Projektes, mit 4 Hilfe von Gen-Analysen zu überprüfen, ob zwei Hersteller von Fischstäbchen, die beide das MSC Siegel auf ihrer Packung haben, dies auch einhalten, oder ob sich doch Kabeljau in den Fischstäbchen befindet. Da wir nur kleine Proben entnehmen können, ist zwar eine Verallgemeinerung kaum möglich, denn es wäre ja theoretisch möglich, dass nur in der einen Probe zufällig Kabeljau enthalten ist. Falls wir jedoch in unseren Proben Kabeljau finden, wäre es ein Hinweis darauf, dass zumindest auch in MSC zertifizierten Packungen mit Fischen nicht gesichert ist, dass hierin keine gefährdeten Arten enthalten sind. Das hier vorgestellt Projekt entstand im Rahmen des Molekularbiologischen Labors der Schiller-Schule Bochum unter Leitung von Herrn Dr. F. Schaller. Auf einem Projekttag über Molekularbiologie für die Biologiekurse der Schiller-Schule im Herbst 2014 haben wir einen ersten Einblick in die Molekularbiologie bekommen und es wurden uns fünf verschiedene Projekte hierzu vorgestellt. Mich hat das Thema mit der Fragestellung „Enthalten Fischstäbchen von Iglo bzw. vom Discounter Kabeljau?“ besonders angesprochen. Im Rahmen einer Projektwoche in den ersten 5 Tagen der Herbstferien haben wir die Gelegenheit bekommen mittels spezifischer Polymerasekettenreaktion zu überprüfen, ob in Proben aus 2 Packungen von unterschiedlichen Herstellern Kabeljau enthalten ist. Kabeljau ist überfischt und sollte deshalb nicht in Fischstäbchen wiederzufinden sein. Anstatt des Kabeljaus sollten die Fischstäbchen aus Lachs, welcher nicht zu den gefährdeten Arten gehört, bestehen. Diese Facharbeit, für die wir im Rahmen der Projektwoche Daten sammeln konnten, verfolgte deshalb die Fragestellung, ob sich in je einer Probe von zwei unterschiedlichen Herstellern von Fischstäbchen Kabeljau enthalten ist. Hierbei orientierten wir uns primär an dem Verfahren und den Methoden von Brinkert et al. [5]. Um den anderen Schülern und Schülerinnen einen Einblick in die Molekularbiologie im Rahmen eines Projekttages zu ermöglichen, wurde zusätzlich eine Praktikumsvorschrift erstellt. 2 Methoden Die Daten zu dieser Facharbeit wurden im Herbst 2014 im Rahmen eines fünftägigen Projektes erhoben. Die Proben entstammten aus zwei Packungen von Fischstäbchen, der Marke Eskimo (Aldi) sowie von der relativ bekannten Marke Iglo. Auf beiden Packungen war das oben beschriebene MSC Siegel angegeben. Im Folgenden werden 5 die Vorarbeiten und die eingesetzten Methoden, die wir zur Überprüfung unserer Fragestellung eingesetzt haben, beschrieben. 2.1 Eingesetzte Materialien Tabelle 1 enthält einen Überblick über die eingesetzten Geräte und Materialien. Zusätzliche wurden noch folgende Verbrauchsmaterialien eingesetzt: Handschuhe der Firmen Semper Guard und Gen-X, Eppendorfgefäße verschiedener Größen sowie 3 verschiedene Mikropipetten-Spitzengrößen. 2.1.1 Geräte Elektrophoresekammer Mikropistill peQ Petten ( Pipetten) + 3 verschiedene Spitzengrößen (0-10µL, 20-200µL, 100100µL) pH-Wert Messgerät Hanna HI 208 Thermocycler peQStar 96 Universal Gradient Thermomixer 5433 Eppendorf Waage Kern PCB Wasserbad WinLab Magnet Rührer Hotplate Stripper Zentrifuge Perfect Spin 24 Plus (peQlab) Zentrifuge Perfect Spin Mini ( peQlab) 2.1.2 Chemikalien EP (Elutionspuffer) aus eigener Herstellung Ethanol FS1 Puffer (Tris) aus eigener Herstellung FS2 Puffer aus eigener Herstellung FS3 Puffer aus eigener Herstellung Lysis Puffer (Tris, EDTA, NaCl, SDS) aus eigener Herstellung Proteinase K Rote Säule TE Puffer (Tris, EDTA, NaCl, SDS) aus eigener Herstellung WP1 Waschpuffer aus eigener Herstellung WP2 Waschpuffer aus eigener Herstellung 6 2.2 Bestandteile des Master-Mixes Die im folgenden genannten Komponenten befinden sich auf Eis. Der Master-Mix besteht aus Taq-Puffer, MgCl2, dNTPs und forward sowie reverse Primern. 2.3 DNA-Isolierungen Für unsere Versuche haben wir zwei verschiedene Verfahren zur DNA-Isolierung eingesetzt, die DNA-Isolierung der Firma Peqlab (blood-DNA-Kit) sowie die DNAIslolierung nach Brinkert et al. [5]. 2.3.1 DNA-Isolierung der Firma Peqlab Ziel unseres ersten Schrittes ist die Lyse, also der Aufschluss der Zellen um an die DNA der zwei Fischproben zu gelangen. Hierzu ist es notwendig, die Zellen von unerwünschten Gewebeteilen zu befreien und sie zu homogenisieren. Um die Fisch-DNA von dem tierischen Gewebe zu isolieren, werden als erstes die abgemessenen Fischstücke (0,5cm x 0,5cm) von der Panade befreit und mittels eines Mikropistill homogen zerkleinert. Der zweite Schritt besteht darin, 200µl des Puffers FS1 und 10µl Proteinase K zu dem Eppendorfgefäß (Eppi) hinzuzugeben, in welchem schon das zerriebene Fischgewebe vorhanden ist. Danach folgt erneutes Homogenisieren mit dem Pistill. Der nächste Schritt beinhaltet die Zugabe von 200µl Puffer FS2. Um den Inhalt der Eppis zu vermischen, werden diese kurz in den Eppendorf Thermomixer 5443 gestellt. Anschließend werden die Eppis mit den Fischproben sowie die Eppis mit Elutionspuffer in ein 60°C heißes Wasserbad gestellt. Nach dem 10 minütigem Wasserbad folgt die Bindung der DNA an die Silikamembran. Diese befindet sich in den roten Säulen. Zunächst wird dem Eppi 360µl Puffer FS3 hinzugegen und kräftig geschüttelt. Danach wird der gesamten Ansatz auf die rote Säule, in einem 2mL Eppi, pipettiert. Anschließend werden die Eppis für 1 Minute bei 11.000g in der Zentrifuge Perfect Spin 24plus zentrifugiert. Danach wird der Säulendurchlauf im Abfall entleert. Ziel des nächsten Schrittes ist die Entfernung zellularer Bestandteile und anderer Kontaminationen durch 3 Waschdurchgänge. Als erstes wäscht man mit 400µL Waschpuffer 1 (WP1), danach noch 2x mit 600µL Waschpuffer 2 (WP2). Nach jedem der 3 Waschvorgänge wird das Eppi für 1 Minute bei 11.000g in die Zentrifuge gestellt und anschließend entleert. 7 Wenn die 3 Waschvorgänge, das Zentrifugieren sowie das Entleeren des Eppis abgeschlossen sind, wird die Säule im Eppi für 3 Minuten bei 11.000g trocken zentrifugiert. Danach folgt der Schritt der Elution, in dem die Säule in ein neues, beschriftetes 1,5 ml Eppi überführt wird und 200µL Elutionspuffer EP hinzugegeben wird, der vorher auf 60°C erhitzt wurde. Anschließend wurde das Eppi 2min bei Raumtemperatur stehen gelassen. Der letzte Schritt besteht darin, den Eppi (inklusive der Säule) für 1min bei 6.000g zu zentrifugieren. Nach der Zentrifugation wird die Säule verworfen und das Eppi beschriftet. 2.3.2 DNA-Isolierung nach Brinkert et al. [5] Als erstes werden die vier verschiedenen Fischproben (0,5cm x 0,5cm unbehandelter Lachs und Kabeljau sowie Iglo Lachs-Fischstäbchen und Discounterfischstäbchen) in beschriftete 2ml Eppendorfgefäße gefüllt. In dem zweitem Schritt werden alle Proben mit 600µL Lysispuffer und 1,4µL Proteinase K überschichtet. Anschließend werden die Proben für 12 Stunden in einen Heizblock bei 50°C inkubiert. Danach werden zu jeder Probe 600µL Natriumchlorid gegeben. Die Proben werden dann in die Zentrifuge bei 12.000 rpm für 10 Minuten gestellt. Die durch die Zentrifugation entstandenen Überstände werden in ein neues 2ml Eppendorfgefäß überführt und mit 700µL eiskaltem 100% Ethanol überschichtet. Anschließend bleiben die Proben für 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen und werden danach für 2 Stunden bei -20°C eingefroren. Danach folgt eine erneute Zentrifugation für 10 Minuten bei 12.000 rpm. Der daraus entstandene Überstand wird verworfen. Folgend werden die Pellets mit 700µL 70% Ethanol resusupendiert und für 10 min bei 12.000 rmp zentrifugiert. Der nächste Schritt besteht daraus, den Überstand erneut zu verwerfen und das trockene DNA-Pellet in 80µL TE-Puffer mit 0,2µL RNAse aufzunehmen. In dem letzten Schritt werden die Proben bei 37°C für 40 Minuten im Heizblock inkubiert. 2.4 Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Der theoretische Hintergrund zu Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wird in der Praktikumsvorschrift dargestellt (s. Anhang). 2.4.1 Primerverdünnung Die Primer werden in Wasser gelöst, sodass die Endkonzentration pro Primer 250nM beträgt. 8 2.4.2 Zusammensetzung der PCR Proben Alle für die PCR notwendigen Stoffe sollten sich am Boden des Eppendorfgefäßes befinden. Das Endvolumen für jeden PCR-Ansatz liegt bei 20µl. 10µl Master Mix (BioRad) (s. 2.2) 4µl Wasser 2µl forward Primer 20µl 2µl reverse Primer 2µl DNA-Template Eine Ausnahme bildeten die letzten Versuche, dort wurden zur Erzielung eines besseren Ergebnisses die DNA-Template um jeweils 4µl auf insgesamt 6µl erhöht. Das Endvolumen betrug dann 24µl. Desweiteren wurden dNTP’s, Puffer und TaqPolymerase der Firma Peqlab eingesetzt. 2.5 PCR-Programme 2.5.1 PCR nach Brinkert et al. Als erstes werden die Eppis zentral in den Thermocycler gestellt. In diesem wird folgendes Programm eingestellt: Der erste Schritt ist die Initiale Denaturierung welche bei 94°C für 5 Minuten erfolgt. Danach folgt die Denaturierung bei 94°C für 50 Sekunden. Bei der Denaturierung werden die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den DNA-Doppelsträngen zertrennt, sodass zwei Einzelstränge vorliegen. Anschließend folgt die Hybridisierung bzw. das Primer-Annealing für ebenfalls 50 Sekunden bei einer Temperatur von 58°C. In dieser Phase binden die Primer, an die in der Denaturierung getrennten, DNA-Einzelstränge. Bei der Elongation findet eine Temperaturerhöhung auf 72°C statt, diese Phase dauert weitere 2 Minuten. Dabei verlängert die Taq-Polymerase die Primer mit den komplementären Nukleotiden. Die drei Schritte Denaturierung, Primer-Annealing und Elongation stellen einen Zyklus dar, der 30 Mal während der PCR wiederholt wird. Dieser führt zur exponentiellen Vermehrung der DNA. Danach folgt die Finale Elongation für 5 Minuten bei derselben Temperatur von 72°C. 9 2.5.2 2. PCR-Programm Abbildung 1: Gewählte Variante für die Einstellung des Programms für die PCR Als erstes liegt die Initiale Denaturierung bei einer Temperatur von 95°C für 2 Minuten an. Die zweite Phase stellt die Denaturierung dar, welche bei 95°C für 30 Minuten abläuft. Hierbei wird der DNA-Doppelstrang durch die Trennung der Wasserstoffbrückenbindungen zu jeweils zwei Einzelsträngen aufgetrennt. Bei 53°C erfolgt die Hybridisierung bzw. das Primer-Annealing für 1 Minute und 30 Sekunden. In diesem Schritt binden die Primer an das 3´-Ende der Einzelstränge. Darauf folgt die Elongation, bei der die Taq-Polymerase die Primer an den Einzelsträngen mit komplementären Nukleotiden verlängert. Die Elongationstemperatur liegt bei 72°C und dauert 1 Minute und 30 Sekunden an. Die drei Schritte Denaturierung, Primer-Annealing und Elongation stellen einen Zyklus dar, der 35 Mal während der PCR wiederholt wird. Dieser führt zur exponentiellen Vermehrung der DNA. Danach folgt die Finale Elongation für 10 Minuten bei 72°C. In dieser langen Phase der Elongation wird sichergestellt, dass die Fragmente vollständig fertig polymerisiert werden. 2.6 Agarosegelherstellung und Agarosegelelektrophorese Das zweiprozentige Agarosegel wird für die Agarosegelelktrophorese entsprechend der Praktikumsvorschrift [6] hergestellt. Die Elektrophorese verläuft in TAE-Puffer für 10 ca. 45 Minuten bei 120mV konstanter Spannung. Bei der Agarosegelektrophorese werden die DNA-Fragmente ihrer Größe (Anzahl der Basenpaare) nach aufgetrennt, dies erlaubt den Vergleich von DNA (s. Praktikumsvorschrift). 3 3.1 Ergebnisse Lesen/ Deuten des Agarosegels 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 bp 1500 1000 500 250 50 Abbildung 2: Beispiel zur Deutung einer Agarosegelelektrophorese Um die Agarosegele richtig zu deuten, ist hier in Abbildung 2 ein Beispiel anhand eines unserer Versuche. Zu berücksichtigen sind einige Ausnahmen, die dann aber bei dem jeweiligen Bild genannt werden. Das Bild zeigt insgesamt zehn Taschen (dunklere Spalten im oberen Teil des Bildes). Unter jeder Tasche in der Laufbahn sind entweder deutlich erkennbare Striche (Banden) oder nur leichte Andeutungen zu sehen. Die folgende Tabelle zeigt in welcher Gel-Tasche sich welcher PCR-Ansatz befindet. Tasche 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Inhalt Marker (entweder 1000bp DNA-Leiter oder 500bp DNA-Leiter) PCR mit Lachs-DNA und Lachs-Primer PCR mit Kabeljau-DNA und Kabeljau-Primer PCR mit Eskimo-DNA und Kabeljau-Primer PCR mit Iglo-DNA und Kabeljau-Primer PCR mit Eskimo-DNA und Lachs-Primer PCR mit Iglo-DNA Lachs-Primer PCR mit Lachs-DNA und Kabeljau-Primer PCR mit Kabeljau-DNA und Lachs-Primer Marker (entweder 1000bp DNA-Leiter oder 500bp DNA-Leiter) 11 Tabelle 1 : Zuordnung der PCR-Ansätze zu den Taschen Die Marker dienen zur Orientierung. Mithilfe von ihnen ist ein Vergleich zu den anderen Proben möglich. Mit Lachs-/ Kabeljau-/ Eskimo-/ und Iglo-DNA ist die DNA aus dem jeweiligem Fisch (Kabeljau und Lachs) oder aus dem jeweiligem Fischstäbchen (der Marke Iglo oder Eskimo gemeint). Mit Lachs-/ oder KabeljauPrimer sind sowohl die forward als auch die reverse Primer gemeint. Das via PCR amplifizierte Lachs-DNA-Fragment sollte eine Länge von 1000 Basenpaaren (bp) und das Kabeljau-DNA-Fragment eine Länge von 1500bp haben. 3.2 Versuche In der Woche im Mikrobiologielabor der Schiller-Schule Bochum haben wir mehrere Versuche durchgeführt. Die drei wichtigsten dieser Versuche werden unten beschrieben. 3.2.1 Versuch I Der erste Versuch diente der Überprüfung der angewandten Methoden (s. 2.2.1 DNAIsolierung der Firma Peqlab und 2.4.2 2. PCR-Programm). Das Gel zeigt in der ersten Laufkammer einen Marker mit 500 Basenpaaren. Dieser dient zur Orientierung. Dieser Versuch ist eine Positiv-Kontrolle um zu testen ob die verwendeten Methoden generell funktionieren. 1 2 3 bp 1500 1000 500 250 Abbildung 3: Gel mit zwei Proben (Isolierung der Firma peqlab und 2.PCR-Pogramm) 12 Durch einen Fehler bei der Isolierung war nicht mehr zu erkennen welches Eppendorfgefäß welche DNA enthielt. Jedoch lässt sich anhand der Banden der zweiten und dritten Tasche erkennen, dass die erste Probe in der zweiten Tasche via PCR amplifizierte Lachs-DNA enthielt und die zweite Probe Kabeljau-DNA. LachsDNA-Fragmente sollten nämlich eine Länge von 1000bp aufweisen und KabeljauDNA-Fragmente 1500bp, das heißt die Bande der Kabeljau-DNA-Fragmente liegt etwas oberhalb im Gel als die der Lachs-DNA-Fragmente. 3.2.2 Versuch II Die Proben (Taschen 2-9) sind mit der Isolierung nach Brinkert et. al und dem 2. PCRProgramm ausgeführt worden. (s. Abb. 4). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 bp 1000 500 Abbildung 4: Gel mit acht Proben (Isolierung nach Brinkert et al. und dem 2. PCR-Programm) Das Bild zeigt zwei Marker, deren Fragmente eine Länge von 1000 Basenpaaren haben, in der ersten und in der achten Tasche. Aus diesem Gel ist jedoch kein sinnvolles oder eindeutiges Ergebnis zu entnehmen. In der fünften Tasche müsste der via PCR amplifizierte Iglo-DNA-Ansatz kombiniert mit dem Kabeljau-Primer enthalten sein. Die Bande des Kabeljau-DNA-Fragmentes sollte jedoch eine Länge von 1500 Basenpaaren besitzen, und müsste somit oberhalb des Markers (1000bp) liegen. Stattdessen befindet sie sich auf gleicher Höhe zu dem Marker was auf Lachs-DNA hindeuten würde. Allerdings ist zu beachten, dass die Kabeljau-Primer natürlich nicht bei Lachs-DNA ansetzen und man deswegen diese Hypothese ausschließen kann. 13 3.2.3 Versuch III Wie auf Abb. 5 Bild zu erkennen, ist bei diesem PCR-Versuch keine DNA amplifiziert worden. Die Isolierung sowie die PCR der acht Proben erfolgte nach Brinkert et al. [5]. Die Vermutung, dass die Isolierung der DNA und/oder die PCR der DNA fehlerhaft abgelaufen sind ist wahrscheinlich. Die Primer sind nicht zu erkennen, dar diese aus dem Gel gelaufen sind, aufgrund ihrer kurzen Länge (20-28 Basenpaare). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 bp bp 1000 500 500 250 Abbildung 5: Gel mit acht Proben (Isolierung sowie PCR-Programm nach Brinkert et al.) 3.3 Nachweis von Kabeljau in Fischstäbchen Im Folgenden werden die Ergebnisse unserer Versuche beschrieben und interpretiert . 1 bp 1500 1000 500 250 2 3 4 5 6 7 8 9 10 14 Abbildung 6: Gel mit acht Proben (Isolierung der Firma peqlab und dem 2. PCR-Programm) Das Foto zeigt das Agarosegel unter UV-Bestrahlung zur Visualisierung nach der Gelelektrophorese. Das Gel enthält 8 verschiedene PCR-Ansätze (Taschen 2-9) und 2 Marker (Tasche 1 und 10). Die Proben sind mit der Isolierung der Firma peqlab (s. 2.3.1) und dem 2. PCR-Pogramm (s. 2.5.2) entstanden. In der ersten sowie in der zehnten Kammer ist ein Marker mit 500 Basenpaaren (bp). Die zweite und dritte Kammer dienen zur Überprüfung, ob die angewandten Methoden generell funktioniert haben. Die Bande der Lachs-DNA sollte etwas oberhalb zu der des Markers (Tasche 1) liegen, bei 1000 bp. Die via PCR amplifizierten Kabeljau-DNA-Fragmente sollten bei 1500bp liegen und die Bande befindet sich somit etwas oberhalb als die der LachsDNA. Die vierte Tasche enthält einen PCR-Ansatz mit Eskimo-Fischstäbchen-DNA als Matrize kombiniert mit Kabeljau-Primer. Wie in der Abbildung zu erkennen, liegt diese Probe bei 1500 bp. Daraus lässt sich das eindeutige Ergebnis entnehmen, dass die von uns untersuchten Fischstäbchen der Marke Eskimo Kabeljau enthalten. Dazukommend weist die sechste Tasche (welche einen PCR-Ansatz mit EskimoFischstäbchen-DNA und Lachs Primer beinhaltet) kein Ergebnis auf. Die fünfte Tasche enthält Iglo-DNA kombiniert mit Kabeljau Primern. Dort ist keine Bande erkennbar, das heißt, es wurde keine DNA amplifiziert. In der siebten und achten Tasche des Gels befinden sich die Negativkontrollen, das heißt in der siebten ist Lachs-DNA mit Kabeljau-Primern und in der achten Kabeljau-DNA mit LachsPrimern. Diese weisen wie zu erwarten keine amplifizierten DNA-Fragmente auf. Die Erzielung des verbesserten Ergebnisses erfolgte durch die Erhöhung der Menge der DNA-Template. Anstatt 2 wurden 6µl verwendet. Außerdem wurde der Master-Mix, welchen man zu den PCR-Ansätzen hinzufügt, selber zusammengesetzt. Aus diesem Versuch ist also eindeutig zu entnehmen, dass die Fischstäbchen der Marke Eskimo Kabeljaufleisch enthalten wohingegen die Fischstäbchen der Marke Iglo laut unserer Probe keinen Kabeljau enthalten sondern aus Lachs bestehen. 4 Diskussion Bei dem Versuch zu überprüfen, ob in Fischstäbchen Kabeljau (Gadus morhua) oder Lachs (Salmo solar) enthalten ist, haben wir mehrere Versuche gemacht. Ziel des ersten Vorversuches war die Überprüfung angewandten Methoden. Dieser Versuch zeigte, 15 dass die Isolierungsmethode mit dem Kit der Firma Peqlab (beschrieben unter 2.3.1) sowie das 2. PCR-Programm (beschrieben unter 2.5.2) funktionieren. Der zweite Versuch ergab, dass die Isolierungsmethode nach Brinkert et al. [5] mit dem zweiten PCR-Programm kein nachvollziehbares Ergebnis zeigte. Der dritte Versuch wurde sowohl nach der Isolierungsmethode als auch nach dem PCR-Programm von Brinkert et al. [5] durchgeführt. Wie auf der Abb. 5 zu erkennen ist, verlief auch diese PCR negativ. Die Isolierungsmethode nach Brinkert et al. [5] erbrachte im Vergleich zu der Isolierungsmethode der Firma Peqlab keine Ergebnisse. Außerdem ist anzumerken, dass die Isolierungsmethode nach Brinkert et al. [5] wesentlich länger dauert. Daher ist diese Methode für einen Praktikumstag an der Schule eher ungeeignet. Das PCR-Programm von Brinkert et al. erbrachte bei unseren Versuchen ebenfalls keine Ergebnisse. Erfreulicherweise konnten wir mit unserem letzten Versuch nachweisen, dass in den Proben der Fischstäbchen der Marke Iglo nur Lachs, in den Fischstäbchen der Marke Eskimo jedoch Kabeljau enthalten war. Bei diesem Versuch wurde das bessere Ergebnis durch eine mengenmäßige Erhöhung der DNA-Template von 2µl auf 6µl erreicht. Hinzu kommt, dass wir mittlerweile durch die vorangegangen Tage mehr Erfahrung hatten und die Wahrscheinlichkeit, dass wir fehlerfrei arbeiten konnten, erhöht war. Dies bedeutet aber auch, dass die Methoden der oben beschriebenen Fehlversuche zwar bei uns nicht erfolgreich waren, dass dies aber unter Umständen auf unsere Unerfahrenheit und nicht auf die Methoden selber zurückgeführt werden kann. Unser Ergebnis, dass die Fischstäbchen der Marke Eskimo Kabeljau enthalten, ist einerseits mit Vorsicht zu interpretieren, denn das Ergebnis beruht nur auf einer einzigen Stichprobe. Andererseits kann man auch argumentieren, dass es besorgniserregend ist, dass schon eine einzige Stichprobe zeigt, dass in Fischstäbchen Kabeljau enthalten sein kann. Dies impliziert, trotz MSC Siegel gefährdete Fischarten in den Fischpackungen enthalten sein können und das so das Ziel, den Bestand des vom Aussterben bedrohten Kabeljaus zu stabilisieren, verfehlt wird. Hier wäre es wünschenswert, wenn beispielsweise das Marine Stewardship Council, das dieses Siegel vergibt, seiner Aufgabe nachkommt und ebenfalls Stichproben durchführen würde. Unsere Befunde legen hingegen nahe, dass das Vertrauen der Verbraucher in das MSC Siegel möglicherweise nicht gerechtfertigt ist. Ein häufig in Fischstäbchen verarbeiteter Fisch ist der Seelachs (Pollachius virens), dessen Verarbeitung laut MSC Siegel auch unkritisch ist, da er nicht zu den gefährdeten Fischarten gehört. Um bei weiteren Untersuchungen sicherzustellen, dass die 16 Kabeljauprimer nicht auch z. B. an Seelachs-DNA binden und somit beim Test auf Kabeljaufleisch ein falsch-positives Testergebnis liefern, sollten in weiteren Versuchen die Spezifität der Kabeljauprimer und der Lachsprimer untersucht werden. Die Fragestellung einer zukünftigen Arbeit im Rahmen des Schiller-Mobils ließe sich dann auch erweitern auf den Nachweis einer potenziellen Verbrauchertäuschung, da man so z. B. lachsfarben eingefärbten und geschmacksmodulierten günstigen Fisch (wie z. B. Seelachs), der als Lachs (Salmo solar) verkauft wird, so eindeutig vom teuren „Original“ Lachsfleisch unterscheiden könnte. 17 5 1. 2. 3. 4. 5. 6. Literaturverzeichnis FishBase. 2014 20.11.2014]; Available from: http://www.fishbase.org/Summary/SpeciesSummary.php?ID=69&AT=Kabeljau. IUCN.org. The ICUN Red List of Threatened Species. 19.11.2014]; Available from: http://www.iucnredlist.org/search. Fische in Not. Die Zeit 2014 19.11.2014; Available from: http://www.zeit.de/2010/07/GSP-Ueberfischung/seite2&h=304&w=540&tbnid=06YT5aPwj7ztDM:&zoom=1&tbnh=90&tbnw=160&usg=__N XiWYXazxJFtvfGWNuQEGFJvFeg=&docid=LxdhkUntnBSafM&client=firefoxa&sa=X&ei=U9BtVI7FH4TmOLakgYAD&ved=0CDcQ9QEwAw&dur=771. Marine Stewardship Council. 20.11.2014]; Available from: http://www.msc.org/de. Brinkert, K., S.V. Bergner, and M. Hippler, Vertrauen ist gut, Kontrolle ist besser! Unterricht Biologie, 2013(390): p. 35-39. Schaller, F. Molekularbiologisches Labor der Schiller-Schule Bochum, Identifizierung von Lebensmittelskandalen – Ist Pferdefleisch im Döner?, in Praktikumsvorschrift für Schülerinnen und Schüler. o.J. 18 6 Glossar Agarosegelelektrophorese Methode, bei der in einem Agarose-Gel (Gel aus Polysacchariden einer Alge) eine Auftrennung von Biomolekülen anhand ihrer Größe stattfinden kann. Annealing «Bindung», gemeint ist hierbei die Phase der PCR, bei der nach vorausgegangener Denaturierung bei 94-96 °C, bei ca. 50-65 °C die Primer an die denaturierten DNAEinzelstränge binden. Die Primer sind dabei die Startpunkte für die DNA Polymerase, welche die Amplifizierung der DNA Sequenzen durchführt. Bande Strich auf der Gelelektrophorese. Nach der PCR laufen die unterschiedlich großen DNA-Fragmente unterschiedlich weit und sind als Banden sichtbar. Denaturierung Phase der PCR, in der die DNA auf 95 °C erhitzt wird, was dazu führt, dass sich die Wasserstoffbrücken zwischen den Basen lösen und der DNA-Doppelstrang zu zwei Einzelsträngen wird. Elongation Phase der PCR, in der das Tube und sein Inhalt auf 72 °C erhitzt wird. Bei dieser Temperatur handelt es sich um das Optimum der DNA Polymerase, die die freien Nukleotide mit dem DNA Einzelstrang verknüpft. Ethidiumbromid Ist ein Fluoreszenz-Farbstoff, der in der Molekularbiologie verwendet wird, um Nukleinsäuren (DNA und RNA) nachzuweisen. Das Farbmolekül lagert sich in die Doppelhelix der Nukleinsäuren und ist durch die UVBestrahlung der Wellenlänge 254 - 366 nm anregbar. Aufgrund der Tatsache, dass sich Ethidiumbromid in die DNA einbauen und diese somit verändern kann, gilt dieser Farbstoff als krebserregend. Eppi Reaktionsgefäß, siehe auch Tube. Hiermit wird ein Standard-Reaktionsgefäß der Firma Eppendorf bezeichneit, welches für unterschiedliche Volumina oder Zwecke erworben werden kann, z.B. 1,5 ml oder 2 ml oder eben auch als Tube für einen PCR-Ansatz. Hybridisierung Bezeichnet die Anlagerung von komplementärer DNA an einen DNA-Einzelstrang, z.B. das Anlagern der Primer an den in der Denaturierung hergestellten DNA Einzelstrang. Lyse Unter einer versteht man allgemein die Zersetzung oder den Verfall von organischem Material. In diesem Experiment wurde die Lyse künstlich unter Verwendung des Lysepuffers bei einer bestimmten Temperatur herbeigeführt, so dass sich die organischen Zellbestandteile der Proben zersetzen und die gewünschte DNA aus den Zellen befreit und somit abtrennbar wird, siehe auch Präzipitation der DNA. 19 Matrize siehe auch Template; Die Matrize ist die Vorlage oder Schablone, die zur Vervielfältigung von etwas benötigt wird – während einer PCR fungiert eine bestimmte DNA Sequenz als Matrize oder Template. Marker (Größenstandard) Um in der Agarose-Gelelektrophorese die Größen der in der PCR entstandenen Fragmente bestimmen zu können, wird ein Größenstandard mitgeführt. Er enthält DNAFragmente verschiedener Basenpaar-Größen und wird bei jeder Gelelektrophorese auf das Gel aufgetragen. Die verschieden großen DNA-Fragmente erscheinen als Banden und können so mit den Fragmenten aus der PCR verglichen werden. Negativ-Kontrolle Ein wichtiger Kontrollansatz, der in allen Punkten mit dem experimentellen Ansatz identisch ist bis auf das Fehlen eines Faktors, der Gegenstand oder essentiell für die Untersuchung ist (z.B. in diesem Experiment: PCRAnsatz ohne DNA). Mit der Negativ-Kontrolle soll der Hintergrundwert oder Fehler des Experiments ermittelt werden. Nukleotid Grundbaustein der Nukleinsäuren, der immer aus drei Bestandteilen aufgebaut ist: 1) einer Phosphorsäure, 2) einem Pentose-Zucker und 3) einer der fünf Nukleobasen: Adenin, Guanin, Thymin, Cytosin in der DNA– und Uracil statt Thymin in der RNA. PCR Ist eine molekularbiologische Methode, um DNA in vitro zu vervielfältigen. Dazu wird ein Enzym verwendet, die DNA Polymerase. Der Begriff Kettenreaktion beschreibt in diesem Zusammenhang die Tatsache, dass die Produkte vorheriger Zyklen als Matrizen für den nächsten Zyklus dienen und somit eine exponentielle Vervielfältigung ermöglichen. Positiv-Kontrolle Ein weiterer, wichtiger Kontrollansatz in einem Experiment, bei dem eine bekannte Substanz eingesetzt wird, um ein bestimmtes Ergebnis hervorzurufen (z.B. in diesem Experiment: PCR-Ansatz mit Fisch-DNA). Damit wird sichergestellt, dass das angewendete Testverfahren richtig funktioniert. Gegensatz dazu ist die NegativKontrolle, in der keine Wirkung hervorrufen wird. Primer (Oligonukleotid) kurze (zwischen 20 und 28 Basenpaaren), einzelsträngige DNA-Stücke, die als Startpunkte der DNA Polymerase bei der Amplifizierung einer DNA Sequenz dienen. Die DNA Polymerase benötigt für ihre Arbeit eine freie Hydroxylgruppe als Startpunkt für ihre erste Verknüpfung – dies wird durch die Primer zur Verfügung gestellt. Für die Amplifizierung eines bestimmten DNA Fragmentes werden zwei Primer benötigt – für den Start- und den Endpunkt der DNA Polymerase Aktivität. Die Primer müssen dabei so gewählt werden, dass sie reverskomplementär zur gewünschten DNA Sequenz sind. 20 Tasche Template Tube Wasserstoffbrücken eine Art Kammer in dem Gel der AgaroseGelelektrophorese. In die Taschen werden die PCRAnsätze gegeben. siehe auch Matrize; Das Template ist die Vorlage oder Schablone, die zur Vervielfältigung von etwas benötigt wird – während einer PCR fungiert eine bestimmte DNA Sequenz als Matrize oder Template. Reaktionsgefäß, siehe auch Eppi. Hiermit wird ein Standard-Reaktionsgefäß der Firma Eppendorf bezeichneit, welches für unterschiedliche Volumina oder Zwecke erworben werden kann, z.B. 1,5 ml oder 2 ml oder eben auch als Tube für einen PCR-Ansatz. elektrostatische Bindung zwischen Wasserstoff und Sauerstoffatomen. Es handelt sich dabei um eine reversible und recht schwache Bindung, welche beispielsweise durch Wärme/Hitze getrennt und durch Abkühlung erneut geschlossen werden kann. 7 Erklärung Ich erkläre, dass ich die Facharbeit ohne fremde Hilfe angefertigt und nur die im Literaturverzeichnis angeführten Quellen und Hilfsmittel benutzt habe. ________________________ _______________________________ Ort, Datum Unterschrift
