Abb. 1.9 Michaelis-Menten

Schlussbericht Praktikum Biogeochemie Teil Mikrobiologie
Praktikum Biogeochemie: Teil Mikrobiologie
Übersicht:
Der Vorliegende Bericht ist eine Zusammenfassung von drei Experimenten, die im Rahmen des
Biogeochemie-Praktikums im Praktikumsteil Mikrobiologie durchgeführt wurden. Im Folgenden
werden die einzelnen Versuche kurz nacheinander erläutert und abschliessend in einer
Schlussdiskussion miteinander verknüpft.
Versuch 1: Aktivität von Methan oxidierenden Bakterien
Einleitung:
Das Ziel war zwei unterschiedliche Böden anhand ihrer Reaktionskinetiken zu vergleichen. Dazu
analysierte man die Aktivität und Kinetik der Methan-Monooxygenase (MMO), welche von den
Bakterien benötigt wird, um Methan zu Methanol zu oxidieren.
Methoden:
Man hat Bodenproben von Standort HA (high activity: Methankonzentration bei 500-600ppm) und
Standort LA (low activity: Methankonzentration zwischen 2-20ppm) untersucht.
Methan-Gasstandards:
Eine Standard-Reihe von 1-30'000 ppmv wurde hergestellt, um einen möglichst grossen
Konzentrationsbereich der erwarteten Resultate abzudecken. Die Glasfläschchen wurden zuerst mit
N2 gespült (p0) und anschliessend mit unterschiedlichen Methankonzentrationen (pend) gefüllt.
Danach wurde über die Druckdifferenz die effektive Methankonzentration bestimmt (siehe Formel
im Skript).
Gravimetrischer Wassergehalt und Trockengewicht:
Ca. 10g Probe der beiden Böden wurden in eine Aluminiumschale gegeben und bei 60°C im Ofen
getrocknet. Dabei wurde das Gewicht vor und nach dem Trocknen gemessen und anschliessend der
gravimetrische Wassergehalt berechnet (siehe Formel im Skript).
Inkubation:
In 24 Fläschchen wurden je 3g Boden gegeben und mit verschiedenen Methankonzentrationen
versehen. Allerdings wurde nicht die gewünschte Menge berechnet, sondern es wurde Methan
zugefügt und danach der gewünschte Druck von 1300mbar mit Luft über eine Spritze oder ein Ventil
angepasst.
Gaschromatographie:
Mit dem Gaschromatographen konnten die Methankonzentrationsänderungen über die Zeit
bestimmt werden, indem man die Kurven von den unterschiedlich gefüllten Fläschchen mit der
Standardkurve verglich.
1
Anja Tesic / Marc Risi / Jeroen v.d.Wildenberg
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Konzentration CH4 [ppm]
Resultate:
20.00
18.00
16.00
14.00
12.00
10.00
8.00
6.00
4.00
2.00
0.00
y = 5.1026x + 0.1716
Series1
Linear (Series1)
0
2
Area
4
Abb.1.1 Standardkurve
LA0
Relative Abnahme
1
0.8
0.6
y = -0.1045x + 0.9867
1st 3p
0.4
LA0b
0.2
Linear (1st 3p)
0
0.00
1.00
2.00
Zeit [days]
3.00
4.00
Abb.2.2 Oxidationsrate bei einer Anfangskonzentration von 5000ppm Methan ohne Methanoxidierende Bakterien
2
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LA1a
Relative Abnahme
0
-0.01 0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
-0.02
-0.03
LA1a
y = -0.0346x - 0.0006
-0.04
1st 3 pt
-0.05
Linear (1st 3 pt)
-0.06
-0.07
Zeit [days]
Abb.3.3 Oxidationsrate bei einer Anfangskonzentration von 2ppm Methan
LA2
Relative Abnahme
0
-0.01 0.00
-0.02
-0.03
1.00
2.00
3.00
4.00
LA2a
y = -0.0603x - 0.0016
1st 3 pt
-0.04
Linear (1st 3 pt)
-0.05
-0.06
Zeit [days]
Abb.4.4 Oxidationsrate bei einer Anfangskonzentration von 10 ppm Methan
Relative Abnahme
LA3
0
1.00
2.00
-0.02 0.00
-0.04
-0.06
y = -0.0617x - 0.0007
-0.08
-0.1
-0.12
-0.14
Zeit [days]
3.00
4.00
LA3c
1st 3 pt
Linear (1st 3 pt)
Abb.5.5 Oxidationsrate bei einer Anfangskonzentration von 50ppm Methan
3
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ppm
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LA4
180.00
160.00
140.00
120.00
100.00
80.00
60.00
40.00
20.00
0.00
y = -60.765x + 154.13
LA4a
1st 3 pt
Linear (1st 3 pt)
Linear (1st 3 pt)
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
Zeit [days]
Abb.6.6 Oxidationsrate bei einer Anfangskonzentration von 200ppm Methan
ppm
LA5
800.00
700.00
600.00
500.00
400.00
300.00
200.00
100.00
0.00
LA5c
y = -79.578x + 713.59
1st 3 pt
Linear (1st 3 pt)
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
Zeit [days]
Abb.7.2 Oxidationsrate bei einer Anfangskonzentration von 1000ppm Methan
LA6
6000.00
5000.00
y = -1031.5x + 4962.4
ppm
4000.00
LA6a
3000.00
1st 3 pt
2000.00
Linear (1st 3 pt)
1000.00
0.00
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
Zeit [days]
Abb.8.7 Oxidationsrate bei einer Anfangskonzentration von 5000ppm Methan
4
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LA7
19500.00
19000.00
y = -496.57x + 19116
18500.00
LA7c
ppm
18000.00
17500.00
1st 3 pt
17000.00
Linear (1st 3 pt)
16500.00
16000.00
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
Zeit [days]
Abb.9.8 Oxidationsrate bei einer Anfangskonzentration von 20000ppm Methan
Michealis-Menten Funktion:
350
300
Vmax
250
200
Messungen
150
Modell
100
50
0
0
10000
20000
30000
40000
Substrat Konzentration
Abb. 1.9 Michaelis-Menten-Funktion
Tabelle 1.1
Vmax [nmol/g*d] =
Km [ppm] =
Km [nmol/ml] =
5
160.9156
1808.9128
73.01151392
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Diskussion:
Aufgrund eines Problems mit dem Gaschromatografen (Ein Reagenzpfropfen hat den Autosampler
ausser Gefecht gesetzt) gab es einen zweitägigen Unterbruch im Messzyklus. Dies hatte zur Folge,
dass man nur die ersten 3 Punkte für die Datenanalyse verwenden konnte. Aufgrund der somit
gekürzten Datenreihe wurde jedoch trotzdem die Umsatzrate für jede Probe bestimmt und daraus
eine Michaelis-Menten Kurve mit Hilfe der Excel-Funktion Solver geplottet. Die Resultate zeigen wie
erwartet, dass die Umsatzrate mit zunehmender Substratkonzentration (Methan) zunehmen, jedoch
ab einer gewissen Substratkonzentration, etwa bei 7000ppm, abflacht und dann konstant bleibt.
Versuch 2: Bestimmung des Bodenmethangehaltes im Feld
Einleitung:
In diesem Teil ging es darum im Feld Proben von Methan aufzunehmen, vor Ort zu messen und
anschliessend Tiefenprofile und Massenflüsse abzuleiten. Dabei war die Methanoxidation im Fokus.
Methoden:
Es wurde eine Standard-Reihe für den Gaschromatographen hergestellt, um den erwarteten
Konzentrationsbereich von Methan im Boden abzudecken.
Mit einem dünnen Metallstab – auf der einen Seite mit Spitze und Gaslöchern, auf der anderen Seite
mit einer Vorrichtung, um mit einer Spritze Methan aus dem Boden zu entnehmen – wurden
Methanproben aus einem Standort des Versuchbodens genommen. Dabei wurde in 10 cm Schritten
Proben entnommen bis auf eine Tiefe von 70 cm. Danach wurden die Proben via Spritze durch den
Gaschromatographen geschickt, welcher dann die Konzentration in bestimmter Tiefe ermittelte.
Weiterhin haben wir noch den Wassergehalt und die Bodentemperatur gemessen. Die Porosität
wurde aus vorgängigen Studien unseres Bodens übernommen.
Resultate:
Die Daten wurden in ein vorbereitetes Excel-Spreadsheet übertragen. Um die Berechnungen
durchführen zu können, haben wir einige Annahmen getroffen (siehe Skript).
In der untenstehenden Grafik ist die Methankonzentration gegen die Tiefe aufgetragen. Dabei ist
festzustellen, dass die Konzentration mit der Tiefe abnimmt. Dies ist auf die Methanoxidation,
welche durch die Aktivität der methanotrophen Mikroorganismen betrieben wird, zurückzuführen.
Das heisst, der Boden ist also eine Senke in Bezug auf Methan aus der Atmosphäre.
In Tiefen von 70 und 80 cm (zusätzliche Messung) nimmt die Methankonzentration drastisch zu. Dies
kann jedoch nicht mehr mit der Methanoxidation erklärt werden, sondern hat einen anderen Prozess
zur Grundlage. Da bei der letzten Messung auf 70 cm die Methankonzentration schlagartig erhöht
war, wurde noch eine weitere Messung gemacht, um zu sehen, in welche Richtung die Konzentration
verläuft.
6
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0
CH4 conc. (ppmV)
2
3
4
1
5
6
0
10
20
Depth (cm)
30
40
data
50
model
60
70
80
90
Abb. 2.1 Tiefenprofil des Bodenmethans
Bei der Fluxberechnung kamen folgende Werte zustande:
f (0cm)
= 0.281 g m-2 yr-1
f (0-10cm) = 0.192 g m-2 yr-1
T1/2
k1
Deff
= 1.344 h
= 0.516 h-1
= 4.06 cm2/min
Diskussion:
Aus den Resultaten ist ersichtlich, dass unser Versuchsboden bezüglich Methanflux eine Senke ist.
Das bedeutet, dass Methan aus der Atmosphäre in den Boden diffundiert und dort durch die
methanoxidierenden Mikroorganismen verarbeitet wird. Zudem sieht man, dass weiter unten im
Boden anaerobe Bedingungen herrschen müssen unter welchen Methan produziert wird und in den
Oberboden aufsteigt. Somit sorgen die methanoxidierenden Bakterien nicht nur für eine Oxidation
des atmosphärischen Methans, sondern verhindern zudem, dass der Boden durch die
methanproduzierenden Bakterien in einer grösseren, anaeroben Tiefe, nicht zu einer Methanquelle
wird. Würde man nun für ein Klimamodel den totalen Flux des Bodens bezüglich Methan bilanzieren,
würde man nur die halbe Leistung des Bodens bilanzieren und völlig vergessen, dass der Boden ohne
diese methanoxidierenden Bakterien sogar zu einer Methan Quelle wird.
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Versuch 3: Quantifizierung von Methanoxidierenden Bakterien mit PCR
Einleitung:
Die Gemeinsamkeit aller methanotrophen Bakterien besteht in der Nutzung von Methan als Energieund Kohlenstoffquelle, indem es durch die partikuläre Monooxygenase (pMMO) oxidiert wird. Man
bezeichnet sie dehalb auch als methanoxidierende Bakterien (MOB). Das pmoA-Gen, welches für
eine Untereinheit der pMMO kodiert, ist dabei ein geeigneter Marker für das Identifizieren
methanotropher Bakterien in Umweltproben.
Im dritten Versuch wurde anhand des pmoA-Gens untersucht, welcher Einfluss die MOBKonzentration auf die Oxidationsaktivität in zwei unterschiedlichen Bodenproben (low-und highactivity) hat. Hierfür extrahierte man zuerst die DNA aus der Bodenprobe und amplifizierte
quantitativ deren pmoA-Gene.
Methode:
Für die Amplifizierung und Quantifizierung der pmoA-Gene wurde die quantitative PCR-Methode
verwendet. Um die DNA-Konzentration in den Bodenproben zu bestimmen, wurde zu Beginn eine
Standardkurve generiert, indem man in einer Verdünnungsreihe die logaritmierte, zuvor festgelegte
DNA-Konzentration gegen die Anzahl Amplifiktionszyklen plottete. Die Anzahl Amplifikationszyklen
variierte, da für jede Konzentration ein anderer cycle-threshold (Ct) -Wert herauskam.
Um die DNA aus der Bodenprobe zu extrahieren, verwendete man eine ausgeklüftelte Methode, die
auf einer Lysis der Zelle und darauffolgenden Reinigungsschritten beruht:
1. Die Lysis der Zelle wurde mit Glasperlen und des SDS-Detergenz bewerkstelligt
2. Grössere Zellteile und Bodenpartikel wurden mit Hilfe der Zentrifugation und der
Ausscheidung von Proteinen entfernt
3. Reinigung der DNA mit einem Filter und verschiedenen Lösungsmitteln
Als qPCR-Template verwendete man je drei verdünnte Proben beider Bodentypen, um mögliche
mitextrahierte PCR-Inhibitoren zu vermeiden. Zusätzlich zu den 7 Standard- und den 6 Bodenproben,
verwendete man 2 Kontrollproben als negative Kontrolle.
Der qPCR Mastermix bestand aus dem fluoresziereden Farbstoff, zwei verschiedenen Primern, der
DNA und Wasser. Der Rest der Platte wurde mit Wasser gefüllt.
Ob die DNA-Extraktion und die qPCR funktioniert haben, wurde mit der Gel-Elektrophorese
überprüft.
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Resultate:
Tabelle 3.1: Die Konzentration der extrahierten DNA aus der Bodenprobe
Bodentyp
DNAKonzentration
259.5 ng/uL
262.2 ng/uL
LA
HA
Proteine
RNA
8.15
8.32
3.1
3.33
Standardkurve
35
30
CT Values
25
20
15
Series1
10
Linear (Series1)
5
0
0.00
2.00
4.00
6.00
log (Konzenrtation DNA)
8.00
y = -4.0514x + 40.406
Abb. 3.1 Standardkurve
Effizienz: 0.765
Tabelle 3.2 DNA-Konzentrationen der Bodenproben
Samples
HA
LA
9
Ct average
26.7
31
Log No
3.38
2.32
Copy no. Per µl soil D N A
1665.85
145
Copy no. Per gram soil
2.0 * 10^7
1.74 * 10^6
Anja Tesic / Marc Risi / Jeroen v.d.Wildenberg
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Elektrophorese:
Abb.3.2 Elektrophoresebalken
Diskussion:
Die DNA – Isolation hat nicht funktioniert, was man anhand der fehlenden Balken links auf der
Elektrophorese Abbildung sehen kann. Aufgrund der PCR Auswertung, kann man sagen, dass im Low
activity Boden weniger Methanoxidierende Bakterien vorhanden waren als im High activity Boden.
Schlussdiskussion:
Die Resultate des Inkubationsversuches zeigten, dass ein klarer Unterschied in der
Methanumsetzungsrate zwischen High und Low activity Boden besteht. Unklar war jedoch, ob dieser
Unterschied auf einer grösseren Anzahl an Methanoxidierende Bakterien oder einfach auf eine
höhere Aktivität der Bakterien im High activity Boden beruht. Die Resultate des PCR Versuches
zeigten dann jedoch, dass ein klarer Unterschied in der Anzahl an Methanoxidierenden Bakterien
zwischen den zwei Böden besteht.
Der Feldversuch jedoch zeigte einmal mehr, dass es durch die Heterogenität des Bodens sehr schwer
ist, aufgrund der Laborexperimente, grössere Aussagen über die Bilanzierung von Methan zu
machen.
Wir würden uns nicht trauen, nur aufgrund von unseren Experimenten, Gesamtvorhersagen für die
untersuchte Müllhalde zu machen.
10
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