Einzelmoleküldetektion in lebenden Zellen.

Einzelmolekülspektroskopie
an lebenden Zellen
Vortrag für das physikalische Hauptseminar
von Ulrich Stopper, Januar 2004
Vorteile der Untersuchung einzelner Moleküle:
• Quantitativer Einblick in biologische Prozesse
• Arbeit mit niedrigen Stoffkonzentrationen
 natürliche Vorgänge in der Zelle werden nicht gestört
Schwierigkeiten bei der Untersuchung
einzelner Moleküle:
• empfindliche Detektoren
• hohe Zeitauflösung
• Photobleichen
Photobleichen:
Bei langer Laserbestrahlung, Übergang des
Fluorophors in einen Zustand,
der keine optische Relaxation erlaubt.
Drei Beispiele :
1.) Untersuchung der Endozytose
2.) Erforschung chemotaktischer Zellen
3.) Verfolgung der viralen Infektion
1.) Untersuchung endozytoser Prozesse in lebenden
Zellen mit der Fluoreszenz-Kreuzkorrelations-Analyse
(Bacia et al., MPI für biophysikalische Chemie in Göttingen, 2002)
1. Untersuchung der Endozytose
Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS):
Messung des Fluoreszenzsignals:
F
t
einzelne Fluorophore diffundieren durch den Laserfokus
Anwendung der Autokorrelation (i = j) :
GF
G ( ) 
F
ij
1
 Diffusionszeit der Partikel
Fi (t )  F j (t   )
Fi  F j
... : zeitliches Mittel
τ : zeitliche Verschiebung
τ
Fluoreszenz-Kreuzkorrelations-Spektroskopie (FCCS):
0
Messung zweier Fluoreszenzsignale, von spektral unterscheidbaren Molekülen.
Anwendung der Kreuzkorrelation (i  j).
 Anstieg von GijF(0), wenn zwei unterschiedliche Moleküle aneinander
gebunden sind.
1. Untersuchung der Endozytose
Experimenteller Aufbau für die FCCS:
Fokus
lateraler 1/e²-Radius des
Beobachtungsvolumens:
~0,18μm für grün, 0,25μm für rot
Zellprobe
Objektiv
Laseranregung
Hauptstrahlteiler
488nm & 631nm
(einige μW)
Sekundärstrahlteiler
Fr
Detektor 1
Detektor 2
Fg
G ( ) 
F
rg
Fr (t )  Fg (t   )
Fr  Fg
1. Untersuchung der Endozytose
Experiment :
Bakterielles Cholera-Toxin (CTX) wurde mit Cy2- und Cy5Farbstoffmolekülen an unterschiedlichen Untereinheiten des
Moleküls markiert :
Markiert mit Cy5:
B5-Einheit
(verantwortlich für die Bindung
an die Zelloberfläche durch
Wechselwirkung mit GM1Gangliosid)
Markiert mit Cy2:
A-Einheit
(enzymatisch aktiv)
an eine Zellmembran gebundenes CTX
1. Untersuchung der Endozytose
CTX nutzt vermutlich einen Pfad durch das Endoplasma und den GolgiApparat aus, den es rückwärts durchläuft, um zum endoplasmatischen
Retikulum zu gelangen.
Golgi-Apparat
endoplasmat.
Retikulum
Aufnahme des Choleratoxins
in die Zelle (Endozytose)
Sekretproduktion durch das endoplasmatische
Retikulum und den Golgi-Apparat (Exozytose)
1. Untersuchung der Endozytose
Wie markiert man ein Biomolekül mit zwei verschiedenen Farbstoffen ?
- Cy5 lagert sich ausschließlich an B-Einheit an.
- Cy2-Färbung würde sich nicht nur an A-Einheit, sondern auch an B-Einheit
binden  Experiment wäre nicht durchführbar
Also: B-Einheit muss abgeschirmt werden
 Einsatz von Antikörper gegen die B-Einheit
- Einfärben der A-Einheit
- Entfernen der Antikörper
1. Untersuchung der Endozytose
Beobachtung des doppelt markierten CTX mit FCCS, gleichzeitig LSM-Imaging:
- die ersten Sekunden: Keine Kreuzkorrelation
(KK) und keine Autokorrelation (AK), LSM:
Starkes Photobleichen  CTX ist unbeweglich
 Anbindung an die Membran
LSM-Bild der Zelle in den ersten Sekunden
Pfeil: Photobleichen durch Korrelations-Messung
- Kurz darauf: Nach anfänglichem
Photobleichen, Anstieg von AK und KK
 Erste Vesikel kapseln sich ab und
diffundieren durch den Fokus
Zellmembran und Membrannahe Vesikel mit CTX
1. Untersuchung der Endozytose
- 15 Min. später: Starke KK in den
meisten intrazellulären Messungen
 B- und A-Einheit sind immer
noch an einander gebunden,
diffundieren durch das Plasma
LSM-Aufnahme des
Zytoplasmas nach 15 Minuten
- einige Minuten danach: Abnahme der KK und der
AK, LSM bestätigt Photobleichen  Immobilität
AK Cy2 AK Cy5
KK
gemessen an der markierten
Stelle im linken Bild
 Vesikel werden vom Golgi-Apparat
aufgenommen
- Kurz darauf: leicht erhöhte AK,
immernoch keine KK
 A und B wieder beweglich, aber keine
gemeinsame Bewegung
LSM-Aufnahme des Golgi
keine KK im Golgi
A- und B-Einheit werden erst im Golgi von einander getrennt !
1. Untersuchung der Endozytose
Diffusionszeiten im Zellplasma können aus Fits an die
Korrelationskurven bestimmt werden: τDiff= 20ms
 Diffusionskonstante D  6·10-9 cm2/s (langsame Diffusion)
Stokes-Einstein-Gleichung:
D
kT
η  5 : Viskosität
6Rh Rh : hydrodynamischer Radius
 Durchmesser der diffundierenden Partikel: 2Rh  150nm
 bestätigt Einschluß in Vesikel
Weiterer Beweis für Vesikelbildung:
Anwendung einer Mischung aus unterschiedlich
einfach-markiertem CTX (CTX-Cy2 & CTX-Cy5)
auf eine Zelle.
 Starke KK im Zellplasma, obwohl jedes einzelne
Molekül nur einfach markiert ist!  Mehrere CTXMoleküle führen korrelierte Bewegungen aus.
 Bindung in Vesikel
AK- und KK-Kurven für unterschiedliche Mischungen
1. Untersuchung der Endozytose
Zusammenfassung der Ergebnisse der Korrelations-Analyse von CTX:
- FCCS kann verwendet werden, um herauszufinden, ob unterschiedliche
Moleküle gebundene Bewegungen ausführen.
- A- und B-Einheiten des CTX-Moleküls werden erst nach Erreichen des
Golgi-Apparats voneinander getrennt.
- Mehrere CTX-Moleküle werden in einzelne Vesikel zusammengeschlossen,
die im Plasma diffundieren.
2.) Einzelmolekül-Analyse von chemotaktischen Prozessen
mit der Totalreflexions-Fluoreszenz-Mikroskopie
(Ueda et al., Universität Osaka, 2001)
2. Erforschung chemotaktischer Zellen
TIRFM (Total internal reflection fluorescence microscopy) :
Totalreflexion
dichtes Medium
Intensität
dünnes Medium
Photonen
tunneln in das Fluorophor
evaneszentes
elektromagnetisches Feld
Eindringtiefe
(einige hundert nm) Vorteil: sehr geringe Hintergrundfluoreszenz
Objektiv
2. Erforschung chemotaktischer Zellen
Dictyostelium-Zellen reagieren chemotaktisch auf cAMP
Chemotaxie spielt wichtige Rolle bei:
- Immunsystem
- Ausbildung neuronaler Netze
- Morphogenese
zyklisches Adenosin-Monophosphat (cAMP):
wichtiger Botenstoff, der aus ATP
gebildet wird und zur Steuerung
von Zellfunktionen dient.
der Schleimpilz
Dictyostelium discoideum
2. Erforschung chemotaktischer Zellen
cAMP
Die chemotaktische Reaktion wird durch Rezeptoren an
der Zelloberfläche und durch G-Protein-abhängige
Signalübermittlung ermöglicht:
Zellmembran
Rezeptor
Enzym
Aktivierung
G-Protein
GTP
GDP
GDP
G-Protein
GTP
Umbau des
Zellskeletts
2. Erforschung chemotaktischer Zellen
Experiment:
Echtzeit-Abbildung von einfach
fluorophorisch markierten cAMPMolekülen, die an die Oberfläche einer
Dictyostelium-Zelle gebunden sind.
TIFRM-Bild der
Dictyostelium-Zelle vor
Abwaschen von ungebundenem Cy3-cAMP
Gleich nach Zugabe des cAMP beginnt dieses,
sich an die Membran zu binden und sich lateral
zu bewegen.
einzelne, fluoreszierende Cy3-cAMP-Moleküle
2. Erforschung chemotaktischer Zellen
Verfolgung einzelner Fluoreszenzpunkte über mehrere Minuten:
laterale Beweglichkeit mit
D = (2,7 ± 1,1) · 10-10 cm2/s
Diffusion einzelner cAMP-Rezeptor-Komplexe
letztes Bild: Trajektorien
meistens sehr lineare Bewegungen
mit gelegentlichen Zwischenstopps
 evtl. Wechselwirkung mit
Zellskelett
REM-Aufnahme eines Zellskeletts
2. Erforschung chemotaktischer Zellen
Erzeugung eines cAMPKonzentrationsgradienten
 Zellen bewegen sich linear in
Richtung des Gradienten.
cAMP-Konzentrationsgradient wird mit einer
Mikropipette erzeugt.
Verfolgung der cAMP-Rezeptor-Komplexpositionen:
Pfeil: Konzentrationsgradient
Es befinden sich auf
der Membran im Mittel
mehr Rezeptoren an
der nach vorne
gerichteten Zellhälfte:
Konzentrationsgradient und
Bewegungsrichtung
2. Erforschung chemotaktischer Zellen
Aber: Kein Unterschied im
Diffusionskoeffizienten
vordere Hälfte:
12% mehr Rezeptoren als auf der hinteren Hälfte
Punkte, die seit t=0 an
der Membran haften
Die meisten Cy3-Punkte blieben nur einige Sekunden lang an der Membran haften:
Dissoziationsratenunterschied
zwischen vorderer und
hinterer Hälfte
schneller
cAMP-Austausch
langsamer
cAMP-Austausch
2. Erforschung chemotaktischer Zellen
Wichtige Entdeckung: Dissoziationsratenunterschied zwischen der einen und
der anderen Seite der Zelle existiert auch dann, wenn kein KonzentrationsGradient vorhanden ist !
 zellinterne Polarisation legt die Zellvorderseite fest !
Zwei mögliche Ursachen für
schnelleren cAMP-Austausch:
- Rezeptor-Phosphorylierung
oder
Phosphorylierung:
Chemische Reaktion (Anhängen einer
Phosphatgruppe), die die Rezeptoraffinität
um das 3- bis 6-Fache verringert.
- besondere Wechselwirkung zwischen G-Protein und Rezeptor
selbes Experiment diesmal mit zwei verschiedenen Dictyostelium-Mutationen:
1. Mutation: phosphorylierte Rezeptoren
 keine Veränderung  Phosphorylierung ist nicht die Ursache
2. Mutation: „defektes“ G-Protein  keine Dissoziationsunterschiede mehr !
 Wahrscheinlich ist G-Protein-Rezeptor-Wechselwirkung die Ursache.
2. Erforschung chemotaktischer Zellen
Überprüfen, ob Rezeptor - G-Protein - Wechselwirkung vorliegt:
Beobachtung der Auswirkungen bei
Zugabe von GTP und GDP:
unveränderte
Zelle
1. Mutation
- GTP verursacht Zunahme der cAMPDissoziationsrate
- GDP hat keinen Effekt
2. Mutation
(2 Varianten)
 G-Protein beeinflusst das
Liganden-Bindungsverhalten.
Fragen, die noch zu beantworten sind:
cAMP-Austauschgeschwindigkeit ohne (-) und mit (+)
Zugabe von GTP.
dunkel-/hellgrau/weiß: Zusammensetzung des Fits aus
einer schwach/mittel/stark abklingenden Komponente
Ist die Polarisation des Dissoziationsverhaltens eine spezielle Eigenschaft
der Membran oder des Zellskeletts?
Kann sich die Polarisation, also die Auszeichnung der Vorderseite zeitlich
verändern?
3.) Echt-Zeit-Aufzeichnung des Infektionsvorgangs eines
Adeno-assoziierten Virus mit Single Virus Tracing
(Bräuchle et al., LMU München, 2001)
3. Single Virus Tracing
Detaillierte Kenntnisse über virale Infektionsprozesse
sind von großer Bedeutung für antivirale Medizin und
Gen-Therapie.
Adeno-assoziierter Virus (AAV):
kleiner Virus, der den Adenovirus zur Ausbreitung
benötigt. Verursacht keine Krankheit beim Menschen
 interessant für Gen-Therapie
Adeno-assoziierter Virus
Viren werden mit nur ein oder zwei Cy5-Molekülen markiert, um den
natürlichen Vorgang nicht zu beeinflussen.
 sehr hohe Detektorempfindlichkeit notwendig
Beobachtung mit der Weitfeldmikroskopie
3. Single Virus Tracing
Außerhalb der Zelle:
normale Diffusion mit D = 7,5 μm2/s
In der Nähe der Zellmembran:
- Beschleunigung in Richtung Zellwand
- Wiederholte Berührungsereignisse, unterbrochen
von kurzer Diffusion in Zellnähe
Im Durchschnitt 4,4 Berührungen
Häufigkeit n der
Trajektorien ohne
Penetration mit
nTouch Kontakten
Fits
3. Single Virus Tracing
mittlere Berührungszeit: 62ms
mittlere Kontaktdauer: 3,2s (erster ... letzter Kontakt)
Häufigkeit n der Trajektorien ohne Penetration mit
der mittleren Berührungszeit t
Fit
Eindringen in die Zelle:
mittlere, zum Eindringen
benötigte, Kontaktzeit: 1,2s
Eindringeffizienz: 13%
Membran ist eine wichtige
Barriere gegen Viren.
Trajektorien mit Penetration:
Im Zellplasma:
3. Single Virus Tracing
47% normale Diffusion (<r2> ~ t)
D = 0,6 μm2/s
D = 1,3 μm2/s
zwei verschiedene Komponenten:
- freies Virus
- Virus in Endosom (Stokes-Einstein: 2R  50 nm)
Jedes Endosom enthielt stets nur ein AAV.
0,3μm2/s < D < 1,5μm2/s
0,5 < α < 0,9
45% anomale Diffusion (<r2> ~ Dt α)
 Behinderung der
Diffusion durch feste
Bestandteile des Plasmas
MSD-Plots von Partikel im Plasma:
normale Diffusion, freies AAV
normale Diffusion
anomale Diffusion
endosomal
8% gerichtete Bewegung! (<r2> = 4Dt + (vt)2)
Behandlung mit Nocodazol
 gerichtete Bewegung verschwindet
 Mikrotubuli-Transport durch
Ausnutzen von Motorproteinen wie
Kinesin oder Dynein.
1,8μm/s < v < 3,7μm/s
Nocodazol:
wird zum Depolymerisieren von
Mikrotubuli verwendet.
Im Zellkern:
57% normale Diffusion
0,4μm2/s < D < 1,3μm2/s
<D> = 0,85μm2/s
17% anomale Diffusion
0,25μm2/s < D < 0,9μm2/s
0,6 < α < 0,9
26% gerichtete Bewegung!
Einige Virusmoleküle bewegen sich nacheinander auf dem
selben Pfad. Alle Pfade waren regional gleich orientiert.
0,2μm/s < v < 2,8μm/s
Behandlung mit Nocodazol
 gerichtete Bewegung im
Zellkern verschwindet
 Aktiver Transport in der
Kernregion, obwohl dort
bisher keine Mikrotubuli und Motorproteine
nachgewiesen werden konnten!
3. Single Virus Tracing
3. Single Virus Tracing
Die wichtigsten Ergebnisse des Single Virus Tracing:
Unterschiedliche Bewegungsarten und -Phasen:
I.) Beschleunigung in Richtung Zellwand (1),
mehrere aufeinanderfolgende VirusMembran-Kontakte (2)
und schnelle Endozytose (3)
II.) freie und anomale Diffusion des Endosoms
mit dem Virus im Plasma und im Kern (3, 4)
III.) gerichtete Bewegung durch Ausnutzung
von Motorproteinen im Plasma und in
Röhrchenstrukturen des Kerns (4)
15 Minuten nach jeder Behandlung waren
50% der Zellen von mindestens einem
Virusmolekül befallen!
Quellen:
[1] Bacia et al. (2002): Probing the Endocytic Pathway in Live Cells Using
Dual-Color Fluorescence Cross-Corelation Analysis. Biophysical Journal 83(2)
1184-1193.
[2] Ueda et al. (2001): Single-Molecule Analysis of Chemotactic Signaling in
Dictyostelium Cells. Science Vol 294 864-867.
[3] Bräuchle et al. (2001): Real-Time Single-Molecule Imaging of the Infection
Pathway of an Adeno-Associated Virus. Science Vol 294 1929-1932.
Bildmaterial:
Folien-Nr.
Bildbeschreibung
Quelle
6
Zelle im Querschnitt
www.art4science.de/bsp_right.html
7
CTX-Molekül
www.cvm.uiuc.edu/courses/vp331/ToxinsGposBact/
7
CTB-Einheit
bio.winona.msus.edu/berg/308s01/ Lec-note/10-new.htm
8
Modell der Exozytose
www.schoolwork.de/cytologie/golgiapparat.php
8
Endozytose von CTX
research.chem.psu.edu/brpgroup/ Nonnaturalreceptors.html
10-12
Alle Bilder
[1]
16
Dictyostelium-Pilz
www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/d27_10/27_10.htm
16
cAMP-Strukturformel
www.uni-frankfurt.de/fb14/fsbc/lexikon/c/camp.html
18-23
Alles außer den folgenden
[2]
19
REM-Aufnahme des Zellskeletts
35.9.122.184/images/07-TourOfTheCell/
20
Chemotaxie-Video
http://www.physik.uni-stuttgart.de/SMG/altleiningen/talks/
25
Adeno-assoziierter Virus
www.cup.uni-muenchen.de/schnupper/Inhalte.html
26-30
Alles außer den folgenden
[3]
26,27,29
SVT-Videos
www.single-virus-tracing.com
28
Nocodazol-Strkturformel
w-chemdb.nies.go.jp/noyaku/1615.htm
28
Kinesin
ung.nbi.dk/biofysik/biofysik.htm