Restrictiondigest

Restriktionsverdau
Theorie
Restriktionsenzyme schneiden DNA
Molekülansicht des Restriktionsenzyms
Restriktionsenzyme sind die molekularen Scheren in der Biotechnologie. Ursprünglich
wurden sie erstmals in Bakterien entdeckt und isoliert. Da Bakterien sehr leicht DNA
aufnehmen können, besteht ihre Aufgabe darin artfremde DNA zu schneiden und somit zu
verhindern, dass diese in das eigene Genom aufgenommen wird.
Einfacher Restriktionsverdau eines ringförmigen Plasmids. Eine Schnittstelle ergibt ein lineares DNA Fragment
Hind III
37°C
Plasmid mit HindIII
Schnittstelle
Plasmid-DNA
DNA linearisiert
Diese Eigenschaft ist in der Gentechnik von sehr großer Bedeutung, da bestimmte Enzyme
sehr spezifisch schneiden. Es entstehen so DNA Fragmente mit genau definierten
Schnittstellen, die dann weiter untersucht werden können.
In diesem Versuch wird das Plasmid PSK untersucht. Es handelt sich dabei um eine
ringförmige DNA, die unter anderem die genetische Information für eine Antibiotikaresistenz
(Ampicillin) beherbergt. Das Plasmid wird mit den Restriktionsenzymen Hind III und Dra I
sowie einer Kombination aus beiden geschnitten. Anhand dieser Fragmente soll dann eine
Karte des Plasmids erstellt werden, die Auskunft über die Schnittstellen ergibt, d.h. eine
Restriktionskarte.
Vektorkarte von PSK
Resistenz
Schnittstellen der verwendeten Enzyme
Hind III
Dra 1
AA G C T T
T T C G AA
T TT AAA
AAA TT T
Optimale Enzymaktivität bei 37°C
Restriktionsverdau
Start
Es sollen 4 Reaktionsansätze pipettiert werden. Eine Kontrolle ohne Restriktionsenzym, zwei Einfachverdaus und
ein Doppelverdau. Die leeren Eppendorfgefäße 1,2,3,4 wie im rechten Bild beschriften und die Schritte abarbeiten.
Inhalt der Eppendorfgefäße
gelb
= Gemisch aus DNA, Puffer,H2O
grün
= Restriktionsenzym
Dra I
blau
= Restriktionsenzym Hind III
grün/blau= Gemisch Dra I & Hind III
1,2,3,4 = leere Eppendorfgefäße
1
Das Plasmid-DNA Gemisch (gelb) wird
nach folgendem Schema pipettiert
20µl 17µl 17µl 17µl
2
DNA 1
2
3
D
N
A
1
2
3
4
4
Jetzt werden 3 µl vom Restriktionsenzym
Dra I (grün) in das Eppi Nr 2 pipettiert
3
4
Dann werden 3 µl von Hind III (blau)
in das Eppi Nr. 3 pipettiert
Restriktionsverdau
Zum Schluss werden noch 3 µl von
dem Gemisch Hind III/ DraI in das
Eppi Nr. 4 pipettiert.
In jedem Eppendorfgefäß befinden
sich jetzt 20 µl.
5
6
Da sich beim Mischen einige Tropfen am
Gefäßrand
absetzten, müssen die
Eppendorfgefäße 20 sek. zentrifugiert
werden.
(Achtung! Zentrifuge immer austarieren)
Anschließend
werden
Eppendorfgefäße 1,2,3,4
Vortexen gemischt.
die
durch
7
Jetzt kommen die Eppis für 1 Stunde
bei 37 ° C in den Thermoblock
8
Weiter zur Gelelektrophorese
Gelelektrophorese
Theorie 1
Nach einem Restriktionsverdau besitzt man ein
Gemisch aus unterschiedlich langen linearisierten DNA Fragmenten
Um dieses Gemisch aufzutrennen, wird ein Gel verwendet. Das Gel
besteht aus Puffer, in dem Agarose durch Erhitzen gelöst wird. Kühlt
das Gemisch ab, so entsteht ein Netz auf molekularer Basis.
Schematische Darstellung: Netz im Agarosegel
Wird an dem Gel Spannung angelegt, so wandert die negativ
geladene DNA (Phosphatrest mit negativ geladenem Sauerstoff) zum
positiven Pol. Dabei laufen DNA Fragmente mit wenig Basenpaaren
schneller durch das Netz. Größere Fragmente sind langsamer.
Auf dem rechten Schaubild wird dieser
Sachverhalt noch einmal verdeutlicht.
Die DNA Fragmente mit dem Index A
sind länger, d.h. sie wandern langsamer
durch das Gelnetz. Die kleineren Fragmente B
laufen schneller durch das Gel.
Einzelsträngige DNA mit
negativ geladenen Phosphatresten
Gelelektrophorese
Theorie 2
Um Später eine Aussage über die Anzahl der Basenpaare also die
Länge eines DNA Fragments machen zu können wird ein StandardMarker mit auf das Gel aufgetragen. Er besteht aus einem Gemisch
von DNA Fragmenten mit bekannter Größe.
(Siehe dazu Gelelektrophorese Schritt 10)
Zu dem zu analysierenden DNA Gemisch wird noch ein Ladepuffer zugegeben. Dieser
enthält einen Farbstoff mit dem man abschätzen kann, wie weit die DNA im Gel schon
gewandert ist. Sind Marker und das DNA – Puffergemisch auf das Gel aufgetragen, kann
die Spannung angelegt werden. (Siehe dazu Gelelektrophorese Schritt 9)
Farbstoffbande
nach 1h bei 130 V
Nachdem die DNA in das Gel gewandert ist, muss sie sichtbar gemacht werden. Dazu
verwendet man Ethidiumbromid – ein Farbstoff der mit der DNA interkaliert und unter
UV- Licht fluoresziert.
Farbstoffmoleküle
Formel von Ethidiumbromid.
Das flache mehrgliedrige Ringsystem
lagert sich zwischen zwei benachbarte
Basenpaare
Schematische Darstellung der
DNA- Doppelhelix mit den
gestapelten Basen in der Mitte
Gestreckte DNA Helix
durch eingelagerte
Farbstoffmoleküle (blau)
Gelelektrophorese
Start
Auf dem rechten Bild ist die
Gelelektrophoresekammer abgelichtet
und ein dazu passener Gelschlitten.
1
2
Das flüssige Agarose - Gel (Vorsicht
heiß!) wird dann in die rechteckige
Form gegossen. Anschließend wird der
Kamm eingesetzt. Dadurch werden im
Gel Taschen gebildet, in die später das
DNA Gemisch eingefüllt werden kann.
Zuerst wird der Gelschlitten
senkrecht
in
die
Kammer
eingesetzt. Dadurch erhält man eine
rechteckige Form, in welche das
Gel gegossen werden kann.
3
4
Das Gel benötigt ca. 30 min zum
trocknen.
Zum Schutz vor Verunreinigung wird
auf dem Apparat der Deckel aufgesetzt.
Gelelektrophorese
Nach dem das Gel sich verfestigt hat
kann der Deckel wieder abgenommen
werden.
5
6
Die Gelelektrophoreskammer wird mit
1 x TBE – Puffer bis zur Haltelinie
gefüllt (Beim Füllen abwechselnd in
die rechte und die linke Kammer den
Puffer zugeben bis das Gel vom Puffer
bedeckt ist.
Der Schlitten mit dem festen Gel
wird jetzt herausgenommen und
um 90° gedreht. Dann wird er so
eingesetzt, dass der Kamm oben ist.
(Die Anschlüsse für die Elektroden
müssen sich auf der rechten Seite
befinden.)
7
Jetzt wird der Kamm vorsichtig
dem Gel gezogen.
8
aus
Gelelektrophorese
Der Restriktionsverdau ist nach 1 h fertig.
Die Eppis können aus dem Thermoblock
entnommen werden.
Dann wird in jedes Eppendorfgefäß 5 µl
Ladepuffer hinzugegeben
(Kurz vortexen und 5 sek. Zentrifugieren)
9
Die DNA Gemische werden dann
nach folgenden Schema aufgetragen
10
1
2
3
5
6
7
8
9
Marker
1: DNA
2: Dra 1
Zum Schluss wird der Deckel
geschlossen.
Dann
wird
die
Elektrophoresekammer mit dem
Netzgerät verbunden. Dabei auf
richtige Polung achten
(rot = - ; schwarz = + )
4
3: Hind III
4: Dra 1& HindIII
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12
Bei 130 V und 55 mAh wird das
Gel unter Spannung gesetzt.
Nach einer Stunde wird die Stoptaste betätigt.
Das Gel ist dann Fertig zum Färben.
Fertig zum Färben
Färben und Auswerten
Start
Da der verwendete Farbstoff Ethidiumbromid
krebserregend ist, wird das Färben von den
Betreuern durchgeführt. Die Gele werden nach
dem Färben unter UV - Licht betrachtet und
fotographiert.
1
2
Auf dem linken Feld wird das Foto
eingeklebt. Dann werden die Marker Banden beschriftet. Jetzt kann die
ungefähre Größe der zu untersuchenden
Banden abgeschätzt und notiert werden.
Banden (Anzahl der Basenpaare)
Hind III :__________________
Dra I :__________________
HindIII & Dra I:____________
5
4,5
4
3,5
3
3
kb
Jetzt werden die DNA – Fragmente in die
rechte Tabelle eingezeichnet. Ein Fragment
ist gleichbedeutend mit einer Schnittstelle !
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Hind III
4
Dra I
Hind III & Dra I
- Geben Sie die Größe des Plasmids (kb)an
- Zeichnen Sie die relativen Positionen der
Hind III und Dra 1 Schnittstellen ein
- Ist die Anordnung der Schnittstellen die
einzig mögliche oder gibt es noch eine
Alternative ?
Erstellt für das „Regensburger Experimentierlabor“ (Autor: Johannes Wällisch)