SDS-PAGE Experimentelle Vorgehensweise

SDS-PAGE
Experimentelle
Vorgehensweise
16.05.2016
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Ziel des Experiments
Untersucht werden Muskelproben z.B. von
Fischen auf:
•
deren Proteinzusammensetzung
•
das Molekulargewicht der Muskelproteine
• die Verwandtschaftsbeziehungen zwischen
den untersuchten Species
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Dauer des Experiments
90 Minuten: Experimentvorbereitung
(in Theorie und Praxis)
90 Minuten: Proteinextraktion und PAGE
60 Minuten: Färben des Gels (außerhalb des Unterrichts)
Über Nacht: Entfärben des Gels
45 Minuten: Gelauswertung
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Experimentvorbereitung
• Besorgen der Fischmuskelproben (durch die
Schüler)
(jeweils kleine Stücke sind in der Regel kostenlos
erhältlich)
• Auch Krabben, Muscheln usw. sind zur Untersuchung geeignet
• Verteilen der Proben, dabei auf die Beschriftung
achten! (2 Arbeitsgruppen verteilen Stücke von jeweils 3 Species)
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Experimentvorbereitung
• Der konzentrierte Tris/Glycerin/SDS-Puffer
(TGS) im Kit (1 L) wird mit
H2Odest. 1 : 10 verdünnt.
Pro Kammer werden 350 ml des
verdünnten Puffers benötigt.
Ansatz:
35 ml konzentrierter TGS-Puffer + 315 ml H2Odest.
(2 Arbeitsgruppen)
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Experimentvorbereitung
• Aliquotieren der Coomassie-Färbelösung:
Pro Arbeitsgruppe werden
70 ml Coomassie-Färbelösung
aliquotiert und verteilt
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Experimentvorbereitung
• Aliquotieren des Lämmli-Puffers:
Pro Arbeitsgruppe werden 1,6 ml Lämmli-Puffer
in ein 2 ml Eppendorftube
pipettiert. (reicht für 6 Proben)
Komponeneten des Lämmli-Puffers:
Tris, SDS, Glycerin, Bromphenolblau
(ß-Mercaptoethanol)
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Experimentvorbereitung
• Aliquotieren des vorgefärbten KaleidoskopStandards: 11 µl pro Arbeitsgruppe
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Experimentvorbereitung
• Rehydratisieren und aliquotieren des ActinMyosin-Standards:
- Ins Gefäß des lyophilisierten
Standards 500 µl Lämmli-Puffer
pipettieren
- 5 Min. bei 20oC inkubieren
- für jede Arbeitsgruppe werden 12 µl
in ein beschriftetes Reaktionsgefäß
mit Schraubverschluss pipettiert und
verteilt
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Experimentvorbereitung
• Wasserbad auf 95oC erhitzen
95°C
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1. Probenvorbereitung
1.1 Je ein Eppendorftube wird mit dem
Namen der vorhandenen Fischproben
beschriftet
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1. Probenvorbereitung
1.2 In jedes Tube werden 250 µl LämmliPuffer pipettiert
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2. Proteinextraktion
2.1 Von jeder Fischmuskelprobe wird ein
ca. 1 g schweres Stück (Würfel mit
Kantenlänge
ca. 3 mm) abgeschnitten und in
das entsprechend
beschriftete Tube
überführt.
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2. Proteinextraktion
2.2 Nach kurzem Vortexen werden die
Proben 5 Minuten bei Raumtemperatur
inkubiert
Während der Inkubation werden
Schraubtubes mit den Namen der
Fischspezies beschriftet
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2. Proteinextraktion
2.3 Nach der Inkubation werden 18 µl des
Protein-Puffergemisches aus den
Tubes in die entsprechend beschrifteten Gefäße mit Schraubverschluss
pipettiert
18 µl ohne Fischmuskelstücke!
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2. Proteinextraktion
2.4 Die Proben, sowie der Actin-MyosinStandard, werden 5 Minuten bei
95°C im Wasserbad
erhitzt.
95°C
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Aufbewahrung der Proben
 Die Proben können nach Erhitzen im
Wasserbad für 3-4 Stunden bei
Raumtemperatur gelagert oder bei
–20°C über mehrere Wochen
aufbewahrt werden
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3. Vorbereiten der Elektrophoresekammer
3.3 Mit Rasierklinge/Skalpell die Klebefolie
der Gelkassette entlang der markierten
unteren Linie einschneiden und
den unteren Streifen abziehen
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3. Vorbereiten der Elektrophoresekammer
3.1 Die Verpackung des Fertiggels entlang
der vorgegebenen Linie aufschneiden
und die Gelkassette entnehmen
3.2 Kamm ziehen
Einkerbungen nutzen!
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4. Vorbereiten der Elektrophoresekammer
4.1
Die Gelkassette mit der kürzeren Platte nach
innen gerichtet in den Elektrodenstand
einsetzen
Auf der gegenüberliegenden Seite eine weitere
Gelkassette oder eine Blindplatte einsetzen
4.2
4.3
Den Elektrodenstand im Klammerrahmen
nach unten drücken und die 2 Klemmklappen schließen
Klammerrahmen mit Elektrodenstand in den Pufferbehälter setzen
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5. Befüllen der Kammer mit Puffer
5.1
5.2
Den Elektrodenstand mit 140 ml verdünntem
TGS-Puffer füllen
Den Pufferbehälter ebenfalls mit 200 ml
TGS-Puffer füllen
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Vorbereiten der Elektrophoresekammer
Tipp:
Läuft der Puffer aus dem Klammerrahmen aus,
diesen entnehmen, Puffer entfernen und
Elektrodenstand erneut festklemmen.
Läuft dennoch Puffer aus, kann der Pufferbehälter auf die gleiche Höhe mit Puffer wie im
Elektrodenstand gefüllt werden.
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6. Befüllen der Geltaschen
Die Geltaschen werden befüllt mit:
- 10 µl Probelösung (P1 – P5)
- 10 µl Actin-Myosin-Standard (AM)
- 10 µl Kaleidoskop-Längenstandard (KL)
Reihenfolge von links nach rechts:
-- P1 P2
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P3
P4
P5 AM KS --
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7. Durchführung der Elektrophorese
Die Gelkammer schließen und die Elektrophorese bei 200 V starten
Die Elektrophorese wird beendet, wenn Bromphenolblau die untere Kante des Gels erreicht
hat (Dauer: ca. 25 Minuten).
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8. Entnahme des Gels
8.1 Den Klammerrahmen aus dem
Pufferbehälter entnehmen und den
Puffer dekantieren (Puffer ist wieder
verwendbar)
8.2 Die Gelkassette aus dem Elektrodenstand entnehmen und mit der
kurzen Platte nach oben abgelegen
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8. Entnahme des Gels
8.3 Die Klebefolie an
den Seiten der
Gelkassette entlang der weißen
Linien einschneiden.
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9. Anfärben des Gels
9.1
9.2
9.3
Die obere Gelplatte abheben
Zum Entfernen des SDS, die untere Gelplatte
mit dem Gel 5 Minuten in eine Wasser gefüllte
Färbeschale legen. Gel unter Wasser von der
Platte ablösen.
Wasser durch 70 ml
Coomassie-Lösung
ersetzen und eine
Stunde darin färben.
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10. Entfärben des Gels
10.1 Färbelösung nach einer Stunde dekantieren.
10.2 Gel mehrere Stunden unter fließendem
Wasser (evtl. über Nacht) entfärben bis der
Gelhintergrund farblos ist.
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11. Gelauswertung
11.1 Stellen Sie die Unterschiede zwischen
den untersuchten Species hinsichtlich
der Zusammensetzung ihrer Muskelproteine fest.
11.2 Bestimmen Sie das Molekulargewicht
von zwei Proteinen anhand einer Eichkurve.
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-- P1 P2 P3 P4 P5 AM KS --
Myosin
Actin
-
Ergebnis der
SDSGelelektrophorese
kD
250
75
50
25
Tropomyosin
15
10
+
AM: Actin- u. Myosinstandard; KS: Kaleidoskop-Standard;
P1 – P5: Fischmuskelproben
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Mathematische Auswertung der
Gelelektrophorese
10000
Erstellen einer Eichkurve
mit Hilfe des ProteinStandards:
Abmessen der Wegstrecken
zwischen Tasche und ProteinBanden.
(Gemessen wird jeweils zwischen
1000
Unterkante Geltasche und Bandenmitte)
100
0
1
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2
3
4
5
6
7
8
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