Biotechnologie Praktikum MBT2

Biotechnologie Praktikum MBT2
Zeitplan
Tag
Programm
1
Montag
16.Mai
Antibiotika, Medien, Puffer für Komp. Zellen / Animpfen ÜNK
Komp Zellen BL21 / Platten gießen (NAAmp)
2
Dienstag
17.Mai
Präparation komp.Zellen / Trafo Kontrolle u. pTaq /
Ausplattieren/Animpfen ÜNK EX/ Medien VK /HK, IPTG
3
Mittwoch
18.Mai
HK EX, Wachstumskurve, Induktion / Proben für SDS nehmen
/Lösungen SDS-Gel / Kolonien zählen u. auswerten
4
Donnerstag
19.Mai
Proben für SDS nehmen /Ernte HK EX / SDS-Gele
gießen/Puffer für Zellaufschluss, IEC
5
Freitag
20.Mai
SDS-Gel#1 (Expression) laden/Elpho/Färben, Entfärben
Einscannen / weiter Puffer für Zellaufschluss, IEC
6
Montag
23.Mai
Zellaufschluss Freeze/Thaw /Zentrifugation Zelltrümmer/
Überstand auf DEAE laden u. eluieren /Taq Pool SDS-Proben
nehmen / Konzentrieren
7
Dienstag
24.Mai
Mittwoch
25.Mai
Proteinbestimmung/ Dialysepuffer
9
Donnerstag
26.Mai
PCR Test gereinigte vs. gekaufte Taq /Puffer Agarose
Gel/Agarose Gel gießen
10
Freitag
27.Mai
Agarose Gel Elpho Gel Einscannen, Abschlussbesprechung
8
Taq Pool konzentrieren in Dialyse starten / SDS-Gel#2
(Proteinreinigung) laden, Elpho, Färben, Entfärben,
Einscannen
1
Biotechnologie Praktikum MBT2
Tabelle 1 Antibiotika Lösungen
Stammlösungen
Ampicillin (Ap)
Konzentrationen
Lagerung
Arbeitskonzentration
100 mg/ml in 50% Ethanol
-20°C
100 µg/ml
Tabelle 2 Antibiotika Wirkung
Antibiotikum
Wirkung
Ampicillin (Ap)
Inhibiert die Bakterienzellwandsynthese, Hemmung der Quervernetzung der
Peptidoglykane durch Inhibition der D-Alanin-Transpeptidase,
=> Betalaktamantibiotika
Chloramphenicol (Cm)
Inhibiert die Bakterienproteinbiosynthese, durch Blockieren der Peptidyltransferase
auf der ribosomalen 50S Untereinheit; bei höheren Konzentrationen kann die
eukaryontische DNA Synthese inhibiert werden
Schematische Darstellung der PCR (Polymerase Ketten Reaktion)
Das Prinzip der Methode soll hier kurz zusammengefasst werden: Die PCR-Technik beruht auf der Fähigkeit fast
aller DNA-Polymerasen, Oligonukleotide an ihrem freien 3´-OH Ende an einem komplementären Template zu
elongieren. Durch die Verwendung einer DNA-Polymerase aus einem thermophilen Bakterium, Thermophilus
(Thermus) aquaticus, und einer Maschine, die automatisch verschiedene Inkubationsbedingungen einstellen
kann, ist es möglich, die gewünschte DNA-Synthese mehrfach nacheinander ablaufen zu lassen. Da zwei
gegenläufige Oligonukleotide mit Komplementarität zum rechten und linken Ende der gewünschten Zielsequenz
verwendet werden, erhält man schon nach wenigen Synthesezyklen ein definiertes Genfragment.
Programm des Thermocyclers:
1. Schritt
4 min
95°C
Denaturieren
2. Schritt
30 s
30 s
60 s
95°C
63°C
72°C
Denaturieren
Primerhybridisierung = "Annealing"
Elongation
3. Schritt
Den 2. Schritt 29x wiederholen (insgesamt 30 Zyklen)
4. Schritt
5 min
72°C
5. Schritt
4°C
zeitlich unbegrenzte Kühlung
abschließende Elongationsreaktion ="Final-Elongation"
2
Tabelle 3 Lösungen, kompetente Zellen, CaCl2 Methode
CaCl2 Lösung 200 ml
Substanz
Konzentrationen
Einwaage
Kommentar
CaCl2.2H2O (M=147,02)
60 mM
1,8 g
Glyzerin
15 %
30 ml
In 180 ml H2O lösen, pH auf
7.0 einstellen, auf 200 ml
auffüllen und sterilisieren
durch autoklavieren.
HEPES (M=238,31)
10 mM
0,5 g
Herstellen kompetenter Zellen nach der CaCl2 Methode
Beimpfe 500 ml NB Medium, in einem 2-l-Erlenmeyerkolben mit Schikanen, mit 5 ml einer Übernachtkultur E. coli
BL21 und lasse den Kolben bei 200 UpM im Inkubator bei 37°C schütteln. Überprüfe die optische Dichte der
Kultur bei 600 nm in 30minütigen Abständen, bis ein Wert von 0,6 erreicht wird (jew. 1000 µl Probe entnehmen
und gegen unbeimpftes Medium messen). Überführe die Kultur in einen Zentrifugenbecher und tariere gegen
einen zweiten Becher mit Wasser aus.
Alle folgenden Schritte auf Eis bzw. bei 4°C ausführen!
Stelle die Becher in gegenüberliegende Positionen in den Rotor JA10 in der Beckman-Zentrifuge Avanti J-20,
schraube den Deckel zu und schalte das Gerät an. Stelle an den Drehknöpfen folgende Werte ein: ROTOR JA10, SPEED 5000 g, TIME 10 min, TEMP 4°C. Starte den Lauf durch Drücken auf die grüne Starttaste.
Gieße den Überstand in den Erlenmeyerkolben zurück (wird später zum Autoklavieren gegegeben) und
resuspendiere das Bakteriensediment in 100 ml kalter CaCl2-Lösung. Zentrifugiere nochmals wie oben und
resuspendiere nun in 5 ml der CaCl2-Lösung. Die Zellen sind jetzt kompetent für Aufnahme von Plasmiden und
können für die Transformation verwendet werden.
Transformation durch Hitzeschock
Mische 100 µl der kompetenten Zellen mit 1 µl Plasmid pTrc99_TaqPol in einem 1.5-ml-Eppendorfgefäß auf Eis.
Lasse das Gefäß in einem Schwimmer für 2 min bei 42°C in einem Wasserbad schwimmen und stelle es sofort
zurück auf Eis. Gib anschließend 500 µl NB-Medium zu dem Ansatz und inkubiere die Zellen zur Regeneration 45
min bei 37°C. 200 µl der Zellen können nun in die Vorkultur (50 ml NB mit 100 µg/ml Ap in 500-mlErlenmeyerkolben) pipettiert werden. Stelle die Kultur in den 37°C Schüttelinkubator und lasse sie bei 200 UpM
bis zum nächsten Morgen schütteln. Zur Sicherheit sollte ein Teil des restlichen Transformationsansatzes auf
Selektionsagar (NA mit 100 µg/ml Ap) ausplattiert werden. Pipettiere dazu jeweils 20/100/200 µl des Ansatzes auf
eine Platte und verteile die Lösung mit einem vorher abgeflammten Drygallski-Spatel. Stelle die Platten in den
37°C Inkubator.
Zur Kontrolle der Kompetenz der Zellen transformiere 100 µl der kompetenten Zellen mit 1 µl einer 0,25 ng/µl
konzentrierten Lösung des Plasmids pUC18. Plattiere nach der Regeneration 50 µl auf NA mit 100 µg/ml Ap aus
und inkubiere die Platten wie oben. Vergiss nicht, die Platten am nächsten Morgen aus dem Inkubator zu
nehmen, zähle die gewachsenen Kolonien, berechne die Kompetenz der Zellen (Kolonien pro µg Plasmid) und
stelle alle Platten anschließend in den Kühlschrank.
3
Hauptkultur: Induktion/Expression/Ernte/Lagerung
Beimpfe 500 ml NB-Medium (100 µg/ml Amp) in einem Erlenmeyerkolben mit 10 ml der am Vortag gestarteten
Vorkultur und lasse die Zellen bei 37°C im Schüttelinkubator bei 150 UpM wachsen. Die OD 600 der angeimpften
HK wird fotometrisch verfolgt (d.h. alle 30 Minuten werden 1000 µl Probe gezogen und gegen unbeimpftes
Medium bei 600 nm im Fotometer gemessen). Erstelle mit den erhaltenen Werten eine Wachstumskurve. Sobald
eine OD600 von 1,0 erreicht ist, wird die HK mit ß-Isopropylthiogalactosid (IPTG) induziert (Endkonzentration
IPTG: 1 mM). Nach Induktion der HK weiterhin Proben für die Wachstumskurve vermessen!
Die Zellen der induzierten HK werden über Nacht bei 37°C im Schüttler inkubiert. Überführe am Morgen in 1000ml-Zentrifugenbecher, zentrifugiere in der Beckman-Zentrifuge Avanti J-20. Stelle an den Drehknöpfen folgende
Werte ein: ROTOR 8.1000, SPEED 5000 g, TIME 10 min, TEMP 4°C. Starte den Lauf durch Drücken auf die
grüne Starttaste.
Gieße den Überstand nach der Zentrifugation in den Erlenmeyerkolben zurück (wird später zum Autoklavieren
gegegeben) und überführe das Bakteriensediment mit einem Plastikschaber in 50-ml-Falconröhrchen.
Resuspendiere die Bakterien in 20 ml Puffer 1 (50 mM Tris .Cl, pH 8.0) und friere die Zellen in flüssigen Stickstoff
ein. Die gefrorene Suspension wird bis zum Zellaufschluss bei –80°C im Tiefkühlschrank gelagert.
Zellaufschluss
Stelle die bis dahin bei –80°C gelagerte Falconröhrchen mit der Bakteriensuspension in ein bei 75°C temperiertes
Wasserbad und inkubiere für 30 min. Friere die Zellen erneut in flüssigem Stickstoff ein und wiederhole danach
den Inkubationsschritt im Wasserbad. Durch den Wechsel zwischen Schockfrieren und Hochtemperaturauftauen
lysieren die Zellen. Die E.-coli-Proteine denaturieren bei 75°C und fallen aus, während die thermostabile
Polymerase nativ gefaltet in Lösung bleibt.
Überführe die Suspension in ein Zentrifugationsgefäß für die Ultrazentrifuge und sedimentiere die Zelltrümmer im
Rotor P30 bei 30.000 UpM in der Zentrifuge himac CP75ß (Hitachi) für 30 min. Gieße den Überstand nach der
Zentrifugation vorsichtig (ohne das Sediment zu lösen!) in ein Falcongefäß, pipettiere für die spätere SDS-GelElektrophorese 100 µl in ein Eppendorfgefäß und friere die Elektrophoreseprobe bei –20°C ein. Der
Zentifugationsüberstand im Falcon wird für die folgende Ionenaustauschchromatographie bereitgehalten.
Ionenaustauschchromatographie
Bei der Ionenaustauschchromatographie erfolgt die Trennung von Proteinen nach ihrer Ladung und unabhängig
von der Molekülgröße. Proteine bestehen aus verschiedenen Aminosäuren, deren Seitenketten neben
ungeladenen auch saure und basische Reste tragen können und so zur Gesamtladung des Proteins beitragen.
Der pH Wert an dem sich positive und negative Ladungen ausgleichen und das Protein nach außen ungeladen
erscheint ist für jedes Protein charakteristisch und wird als isoelektrischer Punkt (pI) bezeichnet. Bei pH-Werten
unter dem pI ist die Gesamtladung wegen der Protonierung der geladenen Seitenketten positiv, bei pH-Werten
höher als der pI negativ. Da Proteine eine Vielzahl von geladenen Gruppen tragen, deren tatsächliche Ladung bei
einem bestimmten pH-Wert zudem noch von der Umgebung der einzelnen Aminosäure abhängt, ist die genaue
Ladungsverteilung eine sehr spezifische Größe und die Trennung nach Ladung damit eine leistungsfähige
Methode zur Proteinseparierung. Die in diesem Versuch genutzte Ionenaustauschermatrix DEAE besteht aus
einem Polymer, das negativ geladene Diethylaminoethyl-Gruppen trägt.
4
Die Proben werden in einem Puffer mit niedrigem Salzgehalt (Puffer 2) bei einem pH-Wert auf die Säule
aufgegeben, daß die Taq-Polymerase an die Matrix bindet. Dies ist im Fall von Anionenaustauschern eine pHStufe oberhalb, bei Kationenaustauschern unterhalb des isoelektrischen Punktes des Proteins. Die Bindung an
die Matrix erfolgt über elektrostatische Interaktionen. Diese Wechselwirkungen sind abhängig von der
Salzkonzentration im Puffer. Der Puffer mit dem niedrigen Salzgehalt wird dazu verwendet, die nicht gebundenen
Proteine von der Säule zu waschen. Danach wird die Taq-Polymerase mit Hilfe des Elutionspuffers (Puffer 3) von
der Matrix entfernt und in mehreren Durchlauffraktionen gesammelt. Die höhere Salzkonzentration in diesem
Puffer bewirkt eine Schwächung der Bindung des Proteins an die Matrix.
Puffer 1 (Resuspensionspuffer)
Tris/Cl
50 mM; pH 8,0
Puffer 2 (Waschpuffer)
Tris/Cl
50 mM; pH 8,0
NaCl
40 mM
Puffer 3 (Elutionspuffer)
Tris/Cl
50 mM; pH 8,0
NaCl
80 mM
Der Durchlauf durch die Säule wird in Fraktionen mit definiertem, gleich bleibendem Volumen aufgefangen. Vom
jeweiligen Durchlauf nach dem Auftragen des Zellextraktes, während des Waschens der Säule sowie von den
Fraktionen mit dem Eluat des gebundenen Proteins werden für die spätere SDS-Gelelektrophorese 100 µl Probe
entnommen, in ein Eppendorfgefäß pipettiert und bei –20°C eingefroren.
Proteinbestimmung/Einengen/Dialyse
Diejenigen Fraktionen, die das Eluat mit der Taq-Polymerase enthalten, werden vereinigt („gepoolt“). Danach wird
ein BC Assay durchgeführt, um den Proteingehalt zu bestimmen.
Um das Protein zu konzentrieren, muss das Volumen des Fraktionenpools reduziert werden. Das Einengen der
Lösung erfolgt unter Verwendung von Amicon-15-Filterröhrchen mit einer Ausschlussgröße von 30 000 Da. Diese
werden im Rotor 19776 bei 4500 UpM 30 min zentrifugiert. Falls danach das Volumen der Lösung noch mehr als
2 ml beträgt, muss der Zentrifugationsschritt wiederholt werden. Andernfalls kann die Proteinlösung mit Puffer 1
auf 2 ml aufgefüllt werden. Schließlich wird die Taq-Polymerase durch Dialyse in ihren Lagerpuffer (Puffer 4)
umgepuffert und bei -20°C aufbewahrt. Damit der Puffer mit dem BC Assay kompatibel ist, muss der Puffer 1:10
verdünnt werden.
5
Puffer 4 (Lager- bzw. Dialysepuffer)
Tris/Cl
20 mM; pH 8,0
KCl
100 mM
EDTA
0,1 mM
Dithioerythritol
1 mM
(Dithiothreitol,
DTE, DTT)
Tween 20
0,5%
Nonidet P40
0,5%
Glycerol
50%
PCR-Test gereinigte vs. gekaufte Taq
Um die Funktion der heterolog exprimierten und gereinigten Taq-Polymerase zu überprüfen und ihre Aktivität
abzuschätzen, werden mehrere verschiedene Verdünnungen des selbst hergestellten Enzyms angesetzt und
parallel zu kommerziell erhältlicher Taq-Polymerase zur Durchführung einer Test-PCR verwendet. Die PCRProdukte werden danach auf ein Agarosegel aufgetragen und mittels Elektrophorese getrennt.
Gereinigte Taq
1.
2.
3.
4.
5.
Gekaufte Taq
1:2000
1:1000
1:800
1:500
1:300
PCR-Ansatz (1x)
Wasser
Puffer (10x) mit MgCl2
dNTP (5 µM)
Template
Primer 1
Primer 2
Taq-Pol.
End
∑
Template:
pKKHC_meg (2µg/µl, 1:400 verd.)
Primer 1:
at meg 1 36
Primer 2:
at meg 2 37
PCR-Programm (<FH> Sv)
11,0 µl
2,0 µl
0,2 µl
2,0 µl
0,4 µl
0,4 µl
4,0 µl
95°C
95°C
63°C
72°C
Goto 2,
72°C
4°C
for 4:00
for 0:30
for 0:30
for 1:00
29 times
for 5:00
for ever
20,0 µl
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
Einführung
Unter Elektrophorese versteht man die Wanderung von positiv oder negativ geladenen Molekülen im elektrischen
Feld in einer Lösung oder einer Trägermatrix. Unterwirft man eine Mischung von Proteinen einer Elektrophorese,
kann man erwarten, daß die verschiedenen Proteine in schmalen einzelnen Banden mit unterschiedlicher
Geschwindigkeit wandern, da die Wanderungsgeschwindigkeit des Proteins von der Molekülgröße und der
Anzahl überschüssiger positiver bzw. negativer Ladungen auf der Moleküloberfläche abhängt. Besteht die
Trägermatrix aus Gel (z.B. Stärke, Agarose oder Polyacryl) so spricht man von Gelelektrophorese. Die
Wanderung von Makromolekülen in solchen Gelen wird zusätzlich von der Struktur des Gels beeinflußt.
6
Unabhängig davon, welches Polymer als Matrix verwendet wird, kann der Vernetzungsgrad variiert und damit die
Maschenweite der Gele der Größe der Moleküle angepaßt werden. Polyacrylamidgele entstehen durch die
Polymerisation von Acrylamid und der Vernetzung der linearen Polymere durch N,N‘-Methylenbisacrylamid. Die
Polymerisation von Acrylamid und Bisacrylamid wird durch Ammoniumperoxodisulfat (APS), das leicht Radikale
bildet,
initiiert.
Als
Acrylamidkonzentration
Katalysator
im
dient
dabei
Polymerisationsansatz
N,N,N‘,N‘-Tetramethylethylendiamin
bestimmt
die
Länge
der
(TEMED).
Polyacrylamidketten,
Die
die
Bisacrylamidkonzentration den Vernetzungsgrad. Beide zusammen bestimmen die Eigenschaften des Gels,
insbesondere die Porengröße, Elastizität und Dichte. Je nach Größe der zu trennenden Moleküle verwendet man
Gele unterschiedlicher Porosität: 2.5 %-Gele erlauben es, Moleküle mit einem Molekulargewicht im Bereich von
106 Dalton, 30 %-Gele solche mit einem Molekulargewicht im Bereich von 103 Dalton zu trennen.
Die Gelelektrophorese dient somit der Analyse von Makromolekülen (Proteinen oder Nukleinsäuren) und
ermöglicht eine schnelle Molekulargewichtsbestimmung.
Diskontinuierliche Proteinelektrophorese im SDS-Polyacrylamidgel
Die meisten Proteine verbinden sich mit SDS (Sodiumdodecylsulfat) zu negativ geladenen SDS-ProteinKomplexen mit konstantem Masse zu Ladungsverhältnis (1,4 g SDS/g Protein in 1 % SDS-Lösungen). SDS
denaturiert die Proteine, – besonders nach vorheriger Reduktion mit Mercaptoethanol oder DTT (Dithiothreitol), –
so daß sie ihre spezifische Quartär-, Tertiär- und zum Teil auch ihre Sekundärstruktur verlieren und eine mehr
oder weniger einheitliche Form annehmen. Während der Elektrophorese wandert der SDS-Protein-Komplex im
elektrischen Feld zum Pluspol (Anode). Dabei trennt der Molekularsiebeffekt der Polyacrylmatrix die SDS-ProteinKomplexe nach ihrem Stokes-Radius und somit nach ihrem Molekulargewicht auf. Es ergibt sich eine lineare
Beziehung zwischen dem Logarithmus des Molekulargewichtes und der elektrophoretischen Mobilität des
Polypeptids
im
Bereich
von
Molekulargewichtsbestimmungen
10
bis
1000
von
Proteinen
kDa,
bzw.
je
nach
Konzentration
Proteinuntereinheiten
sind
des
Trenngels.
Proteinstandards
Für
als
Eichsubstanzgemische kommerziell erhältlich.
Das am häufigsten verwendete SDS-Gelelektrophoresesystem ist das diskontinuierliche Lämmli-System mit TrisGlycin-Puffern: Ein Sammelgel (Tris-Glycin-Puffer pH 6.8, 3-4 % Acrylamid) überschichtet ein Trenngel (TrisGlycin-Puffer pH 8.8, 5-20 % Acrylamid). Der Vorteil dieser Methode liegt in der höheren Trennschärfe und
besseren Nachweisempfindlichkeit. Sie beruht auf der Diskontinuität der Gelstruktur und der unterschiedlichen
Pufferzusammensetzung im Sammel- und im Trenngel. Das Sammelgel, in dem die Probe konzentriert wird, ist
großporig, so daß ein Siebeffekt nicht zum Tragen kommt. Das Trenngel ist so engporig, daß ein Siebeffekt
eintritt und die Komponenten der Probe der Größe nach aufgetrennt werden. Die Probe, wie auch das Trenn–
und Sammelgel enthalten Chloridionen, während der Laufpuffer Glycinionen enthält.
Der Mechanismus der Konzentrierung beruht darauf, daß beim Anlegen der Spannung die Chloridionen im Gel
mit hoher Mobilität zur Anode wandern, während die in das Sammelgel eindringenden Glycinionen aufgrund des
neutralen pH-Wertes überwiegend als Zwitterionen vorliegen und deshalb nur sehr langsam wandern. Zwischen
Glycin und Chloridionen entsteht eine an Ionen verarmte Zone. Die Proteine in der Probe sind negativ geladen
und werden sich gemäß ihrer elektrophoretischen Mobilitäten zwischen den schnell wandernden Chloridionen
und den langsam wandernden Glycinionen anordnen. Dabei werden sie konzentriert, da sich zwischen den Leitund Folgeionen ein Spannungsgradient aufbaut, der zur Beschleunigung der negativ geladenen Proteine führt,
bis sie in Form von direkt aufeinanderfolgenden Stapel zum Leition aufgeschlossen haben. Wenn die Ionenfront
das Trenngel erreicht hat, wird Glycin aufgrund des veränderten pH-Wertes vollständig dissoziieren und die
Proteine überholen, welche nun im engporigen Trenngel dem Siebeffekt ausgesetzt sind und deshalb nach Größe
aufgetrennt werden (vergleiche Abbildung 1).
7
Nachweis von Proteinen durch Färbung mit Coomassie –Brilliantblau
Nach der Auftrennung der Proteine ist es notwendig, die Proteinbanden im Gel sichtbar zu machen, d.h.
anzufärben. Vor oder während dem Färben werden die Proteine im Gel fixiert, also denaturiert und ausgefällt.
Fixiert wird meistens mit Ethanol/Essigsäure/Wasser-Mischungen, die ein Färbemittel, z.B. Coomassie-Blau,
enthalten.
Die Coomassie-Färbung ist einfach und macht wenig Arbeit, doch auch bei dünnen Gelen dauert das Entfärben
2-3 Stunden. Die Empfindlichkeit ist mäßig (200-400 ng Protein pro Bande), reicht jedoch für Routineprozeduren
vollkommen aus. Zum Nachweis niedriger Proteinkonzentrationen empfiehlt sich die Silberfärbung. Diese
Färbung hat eine höhere Empfindlichkeit (5-30 ng pro Bande), ist jedoch erheblich arbeits- und zeitaufwendiger.
Abbildung 1: Vorgänge bei der diskontinuierlichen Gelelektrophorese
Versuchsdurchführung und Auswertung

Kammer und Platten für die Multigießkammer mit Spüli und Schwamm säubern und mit ausreichend H2Odest.
spülen und trocknen.

Glasplatten und Aluminiumoxidplatten mit Spacern trennen und in die Gießkammer legen (Glasplatten nach
vorne) Gießkammer mit Glasplatten auffüllen und mit Klemmen schließen.

Trenngel und Sammelgel in jeweils einem Falcongefäß vorbereiten und alles bis auf APS und TEMED
hinzugeben.
Tabelle 4: Trenngel (0.375M Tris/Cl, pH 8.8) 10%ig
3 Gele
6 Gele
4x Puffer Trenngel (LT)
5 ml
10 ml
30% Acrylamid/Bisacrylamidlösung (Protogel)
6,67 ml
13,4 ml
10% APS
100 µl
200 µl
TEMED
10 µl
20 µl
H2Odest.
ad 20 ml
ad 40 ml
8
Tabelle 5: Sammelgel (0,125M Tris/Cl, pH 6,8) 5%ig

3 Gele
6 Gele
4x Puffer Sammelgel (UT)
2,5 ml
5 ml
30% Acrylamid/Bisacrylamidlösung (Protogel)
1,6 ml
3,2 ml
10% APS
50 µl
100 µl
TEMED
5 µl
10 µl
H2Odest.
ad 10 ml
ad 20 ml
sind die Platten vorbereitet, gibt man APS und TEMED zur Trenngellösung und pipettiert das Trenngel in die
Kammer, bis etwa 4 cm unter der Oberkante der Glasplatte.

Überschichten mit 1 ml Isopropanol/Wasser (50/50)-Gemisch.

Etwa 30 Minuten warten, bis das Gel auspolymerisiert ist (sieht man auch am Rest des Gels im Falcon). Ist
das Gel polymerisiert, Isopropanol/Wasser-gemisch abschütten.

TEMED und APS zum Sammelgel pipettieren, in die Kammer auf das Trenngel pipettieren und direkt den
Kamm einfügen. Auspolymerisieren lassen.

Elektrophoresekammer zusammenbauen.

Die Multigießkammer auseinanderbauen, das Gelsandwich (mit Aluminiumoxidplatte , Spacern und
Glasplatte) in die Elektrophoresekammer einspannen und auf Dichtigkeit überprüfen.

Kammer mit Laufpuffer befüllen, Geltaschen mit Filzstift markieren (alternativ Schablone passend auflegen)
und den Kamm vorsichtig aus dem Gel herausziehen.

Die Proben mit SDS-Gel-Ladepuffer und gegebenenfalls mit H2Odest verdünnen (die Proben sollten zwischen
2-3 µg Protein pro Bande haben), danach 5 min im Wasserbad kochen. Kurz in der Tischzentrifuge
abzentrifugieren.

Mit einer Mikropipette Proben und Proteinstandard in die Taschen des Gels auftragen.

Deckel der Elektrophoresekammer schließen, Wasserkühlung anschließen, an Netzgerät anschließen und
Netzgerät auf 10 mA einstellen.

Ist die Front des Farbmarkers an dem unteren Ende des Gels angelangt, wird die Kammer abgebaut, das
Gelsandwich vorsichtig auseinandergebaut. Eventuell das Gel durch Abschneiden einer Ecke markieren.

Das Gel wird vorsichtig in ein Bad mit der Coomasie-Färbelösung gegeben und etwa 30 min auf dem
Taumelschüttler gefärbt.

Die Färbelösung wird wieder zurück in die Vorratsflasche gefüllt (Handschuhe!) und das Gel vorsichtig mit
Wasser abgespült. Das Gel wird dann im Entfärbebad entfärbt (Entfärbelösung mehrmals wechseln,
Entfärbelösung wird über Aktivkohlefilter regeneriert).

Gel kurzzeitig in Wasser aufbewahren, und dokumentieren, später im Geltrockner trocknen.

Auswertung:
Das Gel wird dokumentiert, die Molekulargewichte der Proteine anhand des Proteinstandards abgeschätzt
und mit den theoretischen Werten verglichen.
9
Geräte, Substanzen und Lösungen
Geräte und Materialien
Minigel Vertikal –Einheit mit Glassplatten, Kämmen, Spacern, Klammern und Pufferkammer, Netzgerät, MultiGelgießkammer, 5 ml-, 1 ml-, 200 µl-, 10 µl- Pipetten und passende Spitzen, 2 Falcon-Gefäße
Wasserbad und Schwimmer
Lösungen
4 X Trenngelpuffer (LT)
1.5 M Tris/HCl, pH 8.8
0.4 % SDS
4 x Sammelgelpuffer (UT)
0.5 M Tris/HCl, pH 6.8
0.4 % SDS
SDS Gelladepuffer (2 x)
1 M Tris/HCl, pH 6.8
1
ml
20 % SDS
2.0 ml
Glycerin
4.0 ml
0.1 % Bromphenolblau
0.2 ml
-Mercaptoethanol
0.8 ml
H2Odest
2.0 ml
Laufpuffer (5 x)
Tris
15.1 g
Glycin
94.0 g
20 % SDS
25 ml
H2Odest
ad 1000 ml
Coomassie Färbelösung
0.1 % Brilliant Blue
1.0 g
45 % Methanol
500 ml
10 % Essigsäure
100 ml
H2Odest
ad 1000 ml filtrieren
Coomassie Entfärbelösung
45 % Methanol
100 ml
10 % Essigsäure
100 ml
H2Odest
ad 1000 ml
10% Ammoniumperoxodisulfat (APS)
30% Acrylamid/Bisacrylamid
10
à 50 ml,
TEMED
Isopropanol /Wasser-Gemisch (50/50; v/v)
Proben, Proteinstandards
Entnahme und Aufbereitung von Proben für die SDS-Page
Probennahme während der Proteinexpression
Unmittelbar vor der Induktion der heterologen Proteinexpression und vor der Zellernte werden jeweils Proben für
die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) aus der Hauptkultur entnommen. Wenn die Expression
nicht über Nacht stattfindet, können auch während der Expression regelmäßig Proben entnommen werden. Die
Induktion erfolgt, wenn die OD600 der Kultur einen Wert von 1,0 erreicht hat. Das Probenvolumen, das zu diesem
Zeitpunkt entnommen werden soll, beträgt 1 ml.
Die SDS-PAGE dient dazu, die im Medium und in den Zellen vorhandenen Proteine aufzutrennen und so die
Menge des heterolog exprimierten Proteins abzuschätzen. Dabei soll die von einer definierten Anzahl von Zellen
produzierte Proteinmenge über die Zeit bestimmt und verglichen werden. Daher wirkt auch das nach der
Induktion fortgesetzte Wachstum, also die Zunahme der Zellzahl, als Störgröße, die das Ergebnis verfälscht, weil
mehr Zellen auch mehr Protein produzieren können. Um sicherzustellen, dass die Zellzahl in allen Proben etwa
gleich groß ist, muss das Probenvolumen mit der Zeit umgekehrt proportional zur optischen Dichte verringert
werden, ausgehend von 1000 µl Probe bei einer OD von 1,0. Nach jeder OD-Messung muss also das zu
entnehmende Probenvolumen nach folgender Formel berechnet werden:
VProbe = 1000 µl / OD600
Probennahme während der Proteinreinigung
Während der Ionenaustauschchromatographie (IEC) werden vom jeweiligen Durchlauf nach dem Auftragen des
Zellextraktes, während des Waschens der Säule sowie von den Fraktionen mit dem Eluat des gebundenen
Proteins für die spätere SDS-PAGE 100 µl Probe entnommen.
Probenaufbereitung
Die während der Proteinexpression entnommenen Proben werden jeweils in ein 1,5 ml-Eppendorfgefäß pipettiert
und darin in der Tischzentrifuge kurz zentrifugiert (auf symmetrische Anordnung der Gefäße im Rotor achten, evtl.
Gegengewicht mit gleichem Volumen bereitstellen!). Den Überstand vorsichtig in ein Gefäß mit Bakterienabfall
abgießen und das Bakteriensediment in 100 µl SDS-Gelladepuffer resuspendieren. Während der Proteinreinigung
genommene Proben werden direkt mit 100 µl SDS-GLP versetzt. Auf diese Weise behandelte Proben können im
Kühlschrank gelagert und bis zur Weiterverarbeitung gesammelt werden.
Um die Bakterienzellen aufzulösen und die Proteine zu denaturieren, werden die Proben schließlich bei 100°C für
5 Minuten im Wasserbad gekocht. Dazu müssen die Deckel der Eppis mit Deckelklemmen (cap locks) fixiert
werden, damit sie nicht aufspringen können. Die Eppis nach 5min vom Schwimmer nehmen und einige Minuten
auf Eis stellen. Danach werden die Proben in der Tischzentrifuge kurz zentrifugiert, um Kondenswasser
zurückzugewinnen. Bis zur Elektrophorese können die Proben im Kühlschrank oder bei -20°C gelagert werden.
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Der Proteinstandard (Marker) für die SDS-PAGE wird auf dieselbe Weise 5 min gekocht, bevor er aufgetragen
wird.
Konzentrationsbestimmung
Zur Bestimmung der Proteinkonzentration der im Praktikum hergestellten Taq-Polymerase wird das BC Assay Kit
(BC = bichinonic acid) von Uptima (Fa. Interchim) verwendet. Es handelt sich um einen colorimetrischen Assay,
der auf der spektrometrischen Messung eines löslichen lila Komplexes beruht, den eine organische Säure im
Reaktionsansatz mit Cu+-Ionen bildet. Diese wiederum entstehen, wenn Peptidbindungen vorhanden sind, die die
Cu2+-Ionen im Reaktionsansatz reduzieren. Der Cu+-Komplex besitzt eine hohe Absorption bei 562 nm, die der
Proteinkonzentration über einen weiten Bereich proportional ist.
Zur Konzentrationsbestimmung werden 50 µl der eingeengten und umgepufferten Proteinlöösung als Probe
genommen und 1:10 mit Puffer 4 verdünnt. Auf diese Weise steht genügend Volumen zur Durchführung der
Assay-Reaktion zur Verfügung, ohne das zu viel Taq-Polymerase verloren geht. Außerdem wird die Reaktion mit
Lagerpuffer (ohne Protein) als Kontrolle durchgeführt. Bei der Berechnung der Proteinkonzentration muss dann
der Verdünnungsfaktor berücksichtigt werden!
1. Erstellen einer Eichgeraden
Um den Zusammenhang zwischen der Proteinkonzentration einer Probe und der Absorption des durch die AssayReaktion entstehenden Cu+-Komplexes näher zu untersuchen, muss eine Eichgerade erstellt werden, bei der die
bei 562 nm im Photometer gemessene Absorption des Reaktionsansatzes gegen die definierte Konzentration
eines Proteinstandards aufgetragen wird.
Das Kit enthält eine Stammlösung des Rinderproteins BSA (Bovine Serum Albumin) mit einer Konzentration von
2 mg/ml. Durch schrittweise Verdünnung dieser Proteinlösung mit Wasser oder Puffer (in unserem Fall
Lagerpuffer (Puffer 4), 1:10 verdünnt!) erhält man 8 Konzentrationsstufen des Proteinstandards, die hier
fprtlaufend mit A bis H bezeichnet sind. Folgende Verdünnungen werden in beschriftete 1,5 ml-Eppis angesetzt
(siehe Tabelle 4):
Tabelle 4: Pipettierschema zur Herstellung der verschiedenen BSA-Standards
mit den angegebenen Konzentrationen.
Standard Proteinlösung
Puffer 4 Konzentration
A
Stammlösung 400 µl 0 µl
2 mg/ml
B
Stammlösung 300 µl 300 µl
1 mg/ml
C
Stammlösung 420 µl 700 µl
750 µg/ml
D
Stammlösung 100 µl 300 µl
500 µg/ml
E
Stammlösung 100 µl 700 µl
250 µg/ml
F
Standard E
200 µl 300 µl
100 µg/ml
G
Standard E
100 µl 400 µl
20 µg/ml
H
/
0 µl
0 µg/ml
2. Vorbereitung der Proben und ihrer Verdünnungen
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700 µl
Von der bereits vorverdünnten Probe der Proteinlösung werden die angegebenen Verdünnungnen jeweils
zweimal in beschriftete 1,5 ml-Eppis angesetzt (siehe Tabelle 5). Zur Verdünnung wird Lagerpuffer verwendet
(Puffer 4,1:10 verdünnt) benutzt. Zusätzlich wird der Puffer alleine als Negativkontrolle getestet. Puffer 4 enthält
Glycerol und DTE in Konzentrationen, die den Ablauf der Assay-Reaktion beeinflussen und daher das Ergebnis
verfälschen könnten.
Tabelle 5: Pipettierschema zum Ansetzen der verschiedenen Verdünnungen der Probe sowie der Negativkontrolle und des
Referenzwertes der photometrischen Messung für die Assay-Reaktion.
Art der Probe
Verdünnung Bezeichnung Probe (verd.) [µl] Puffer 4 [µl]
Referenzwert
/
0-Ref
0
200
Negativkontrolle
/
0-NK
0
200
Taq-Lösung
1:1
3-1/3-2
200
0
2-1/2-2
20
180
1-1/1-2
2
198
(Verd. jeweils 2x ansetzen) 1:10
1:100
3. Ansetzen des BC-Assay-Reagens
Zur Vorbereitung der Reaktion des BC-Assays müssen die beiden Reagenzien des Kits, A und B, im
Verhältnis 50:1 gemischt werden. D.h., 50 Teilen Reagens A wird 1 Teil Reagens B hinzugefügt (insgesamt 51
Teile). Beachte den Unterschied zu Verdünnung 1:50 (1 Teil Lösung + 49 Teile Lösungsmittel = 50 Teile
insgesamt)! Der fertige Reagenzienmix sollte möglichst rasch (innerhalb weniger Stunden) benutzt werden. Für
eine Anzahl von 8 Standards, 2x3 Proben und die 2 Leerwerte werden mindestens 50 ml Reagens A und 1 ml
Reagens B benötigt.
4. Durchführung des BC-Assays
Zu Beginn des BC-Assays müssen die Standards, die Proben und das Reagens Raumtemperatur besitzen. Die
Reaktionen der Standards für die Eichkurve, der Proben und der Negativkontrolle werden gemeinsam
durchgeführt. Der Referenzwert wird für die Referenzküvette des Zweistrahlphotometers benötigt, mit der der
Nullabgleich erfolgt und gegen die die Messung der Absorption durchgeführt wird.

Pipettiere jeweils 100 µl der Standards und Proben, der Kontrolle und des Leerwertes in vorher
beschriftete 2 ml-Eppendorfgefäße.

Füge jeweils 2 ml des BC-Assay-Reagens (A:B = 50:1) hinzu und mische durch invertieren.

Inkubiere die Reaktionsansätze bei 37°C für 30 min (alternativ: 2 h bei Raumtemperatur).

Lasse die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen (evtl. kurz auf Eis stellen), fülle sie in Küvetten um und
miss jeweils die Absorption bei 562 nm (Spektrum 450-650 nm) im Photometer gegen den Leerwert. Von
jeder Verdünnungsstufe erhält man zwei Messwerte.
5. Auswertung des BC-Assays
Die gemessenen Absorptionswerte der 8 BSA-Standards werden in einem Diagramm gegen die jeweiligen
Proteinkonzentrationen aufgetragen. Durch die erhaltenen Punkte wird eine Ausgleichsgerade gelegt. Mit Hilfe
dieser Eichgeraden können die Proteinkonzentrationen der Proben anhand der gemessenen Absorptionen
berechnet werden. Es wurden drei verschiedene Verdünnungsstufen gemessen, damit möglichst wenigstens eine
davon im Bereich der Eichgeraden liegt, die über den Messbereich hinaus nicht beliebig verlängert werden darf.
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Von jeder Probe, deren Messwert im Bereich der Eichgeraden liegt, werden Verdünnung, die gemessene
Absorption, die ermittelte Proteinkonzentration und die ursprüngliche Proteinkonzentration in der Probe (ermittelte
Konzentration x Verdünnungsfaktor) notiert. Das Ergebnis für jede Verdünnungsstufe ergibt sich als
arithmetischer Mittelwert der beiden Parallelansätze.
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