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A R T – Artificial Reproductive Techniques Moderne Stimulationstherapien u.a. rFSH/rLH -GnRH- Agonisten/LH-Antagonisten etc. AIH (artificial insem. homologous) IUI - Intrauterine insemination AID (artificial insemination donor) IVF - In vitro Fertilisation ICSI - Intacytoplasmatic Sperm Injection MESA - Mikrochirurgische epidymale Spermatozonaspiration TESE - Testikuläre Spermien Extraction aus Hoden IMSI - Intrazytoplasmatische Morphologisch Selektierte Spermien Injektion FIS - ART - Belek 2009 2 A R T – Artificial Reproductive Techniques PICSI - Methode zur Selektion reifer Spermien in Picsi-Schale Assisted Hatching - Schlüpfhilfe SPS – Seminalplasmaspülung SEET - Stimulation of endometrium embryo transfer ET - Embryotransfer - Tag 2 - 3 BcT - Blastocystentransfer - Tag 4 - 5 Kryoverfahren – „slow cooling“ -Vitrifikation Präimplantationsdiagnostik – PKD - Polkörperdiagnostik PID - Präimplantationsdiagnostik FIS - ART - Belek 2009 3 Evidence-based medicine (EBM) expert opinions FIS - ART - Belek 2009 4 Stimulationsbehandlung Kontrollierte ovarielle (Hyper)Stimulation (KOH) mit Clomifen, urinären Präparaten (HMG), rFSH/rLH -GnRH- Agonisten/ LH-Antagonisten etc. z.T. mit verschiedenen Vorbehandlungen wie z.B. mit oder unter Metformin, OH, DHEA, GH usw. Zielsetzung: Heranreifen eines od. mehrerer Follikel aus Follikelkohorte mit Oocyten in guter Qualität Bei IVF / ICSI: – Vermeidung der spontanen Ovulation – Gewinnung mehrerer reifer Eizellen (Metaphase II) Bei IUI + VZO*: – Heranreifen von 1 – max. 3 Eizellen * Verkehr zum ovul. Optimum FIS - ART - Belek 2009 5 Ovarielle Stimulationstherapie in der Praxis Clomifen noch zeitgemäß ? Cochrane Metaanalyse aus 12 adäquaten prospektiv randomisierten Studien (Beck et al. 2005, Cochrane Database) Clomifen erhöht die Schwangerschaftsraten signifikant gegenüber Placebo (OR 5.8, 95% CI 1.6 – 21.5) Die Kombination mit Dexamethason (OR 11.3, 95% CI 5.3 - 24) oder die Vorbehandlung mit einer Pille (OR 27.2, 95% CI 3.1 – 235.0) verbessern beim PCOS die Ergebnisse signifikant Clomifen ist nach wie vor die Therapie der 1. Wahl bei anovulatorischer und idiopathischer Sterilität FIS - ART - Belek 2009 6 PCOS mit Insulinresistenz - Stimulationen immer unter Metformin? The role of metformin in polycystic ovary syndrome Moll E, van der Veen F, van Wely M (2007) Hum Reprod Update (ahead of print) 27 RCTs Kein Unterschied in der Lebendgeburtenrate im Vergleich Metformin vs. Placebo (OR 0,73, 95% CI 0,51 – 1,1) Bei CC-resistenten Frauen führte die Vorbehandlung mit Meformin zu signifikant höheren Lebendgeburtraten (OR 6,4, 95% CI 1,2 – 35) FIS - ART - Belek 2009 7 Welches Gonadotropin sollte eingesetzt werden ? Human menopausal gonadotropin versus recombinant follicle stimulation hormone for ovarian stimulation in assisted reproductive cycles Van Wely M, Westergaard LG, Bossuyt PMM, Van der Veen F (2003) 8 RCT Kein signifkanter Unterschied in der Lebendgeburtenrate zwischen HMG und r-FSH r-FSH HMG (OR 1,27, 95% CI 0,98 – 1,64) HMG (Menogon®) und r-FSH (Puregon®, Gonal F®) sind im wesentlichen gleich wirksam FIS - ART - Belek 2009 8 Long-Agonisten Schema mit rFSH Progesteron Vag. Transvaginale Punktion Nach 2-3 Wochen Kontrolle der „down regulation“ GnRH – Agonist Depot Tag 19-21 des Vorzyklus 150 – 300 IE rFSH ab Tag 2/3 vag.Sono FIS - ART - Belek ev.E2009 2 Menstruation 10000 IE HCG Follikel Embryotranfer > 18mm 2 bis 16zeller E2> 350 9 pro Follikel Short Antagonistenschema mit Mehrfachgabe Progesteron Vag. GnRH-Antagonist 0,25 mg Tranvag. Punktion (33-36h nach hCG 5-1000 IE hCG rFSH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Stimulationstage Vag. Sono FIS - ART - Belek 2009 ev. E2 Embryotransfer 2-16 Zellstadum Tag 2/3 od. BcT Tag 5 10 Ovulationsmonioring Follikel- und Endometriumsbeurteilung Große Follikel bis zu 19mm E2 > 350 pg/dl pro Follikel Bereits hochaufgebautes Endometrium FIS - ART - Belek 2009 11 Ovarielle Stimulationstherapien nur unter Ultraschallkontrollen! Optimales timing der Ovulation und des Konzeptionszeitpunktes Reduzierung des Mehrlingsrisiko, gerade auch bei Clomifen, besonders bei PCOS ( ≥ 3 Follikel keine IUI, Kohabitationsverbot) Beurteilung des Endometriums IR 35% 23% 17% 6% 7% 3% Abnehmende Implantationsraten (IR) Fanchin et al. (2000) Fertil Steril 74: 274-81 FIS - ART - Belek 2009 12 IUI im ART-Zeitalter noch sinnvoll ? 17 RCT mit 3662 Zyklen Die IUI im natürlichen Zyklus erhöht die SS-Raten gegenüber VZO (OR 2.43, 95% CI 1.54-3.83) Eine zusätzliche ovarielle Stimulationstherapie führt zu einer Versechsfachung der SS-Raten (OR 6.23, 95% CI 2.35-16.52) Bei mehr als 1 Mio. bewegliche Spermatozoen, ohne andere Sterilitätsfaktoren, sollte die IUI mit aufbereiteten Spermatozoen bevorzugt im stimulierten Zyklus empfohlen werden. FIS - ART - Belek 2009 13 Unexplained Infertility In vitro fertilisation for unexplained infertility Intrauterine Insemination for unexplained infertility Verhulst SM et al. (2006) Cochrane Database Pandian Z et al. (2005) Cochrane Database 6 RCTs 10 RCTs Signifikante Erhöhung der SS-Rate nur in stimulierten Zyklen Signifikante Erhöhung der SS-Rate Gegenüber abwartendem Verhalten (OR 1,68, 95% CI 1,13 – 2,50) (OR 3,24, 95% CI 1,07 – 9,80) Signifikant höhere Lebendgeburtenrate in stimulierten IUI-Zyklen Kein Unterschied zwischen IVF und Insemination (OR 2,07, 95% CI 1,22 – 3,50) (OR 1,15, 95% CI 0,55 – 2,40) Bei idiopathischer Sterilität (unexplained infertility) ist es daher legitim mit IUI`s in stimulierten Zyklen zu beginnen. Cave: Alter der Frau FIS - ART - Belek 2009 14 Polkörperdiagnostik (PKD) Gilt noch immer als ein in Erprobung befindliches Verfahren Indikationen: Erkennung eines spezifischen genetischen, einschließlich chromosomalen kindlichen Risikos mittels indirekter Diagnostik der Eizelle Erkennung unspezifischer chromosomaler Risiken im Rahmen von IVF zur möglichen Erhöhung der Geburtenrate – bisher in der Literatur sehr kontroversiell beurteilt, Vorteil eher nicht gegeben FIS - ART - Belek 2009 15 Polkörperdiagnostik (PKD) Entfernung eines/mehrerer Nuclei von Oozyten (Polkörperchen) oder Embryos (Blastomere/Trophektoderm) Untersuchung einer mütterlichen genetischen oder chromosomalen Veränderung des haploiden weibl. Chromosomensatzes durch die Untersuchung des ersten und zweiten Polkörperchen im Ablauf einer IVF/ICSI – indirekte Diagnostik einer Eizelle Testung auf Mutationen von Gensequenzen Aneuploidie FIS - ART - Belek 2009 16 Polkörperdiagnostik (PKD) Die PKD ist an die Anwendung an eine IVF/ICSI Behandlung geknüpft, auch wenn keine Fertilitätsstörung vorliegt Nachdem diese Untersuchung vor Bildung eines Embryos durchgeführt wird, ist das Embryonenschutzgesetz davon nicht berührt Nur ♀ Veränderungen können damit festgestellt werden Die Untersuchung am 2. Polkörperchen gelingt nicht immer FISH X/Y, 13, 16, 18, 21, 22 FIS - ART - Belek 2009 17 Was bringt die PGD wirklich? PGD bei fortgeschrittenem mütterlichen Alter Die Wirksamkeit der Präimplantationsdiagnostik (PGD) bei Frauen im "fortgeschrittenem Alter" wurde vorausgesetzt, ohne in RCTs überprüft zu sein. Die neue große Multizenterstudie findet keinen Vorteil der PGD, sondern ganz im Gegenteil, signifikant weniger Schwangerschaften (ongoing) und Lebendgeburten als bei Verzicht auf die Diagnostik. Mastenbroek S, Twisk M, van Echten-Arends J, et al. In vitro fertilization with preimplantation genetic screening. N Engl J Med 2007;357:9-17 FIS - ART - Belek 2009 18 In ART grundsätzlich nur ICSI durchführen? Indikationen: < 1 Mio. progressiv motile Spermatozoen bei Azoospermie mit MESA oder TESE Befruchtungsversagen bei IVF ICSI versus conventional techniques for oocyte insemination during in vitro fertilisation in patients with non-male subfertility Van Rumste MME, Evers JLH, Farquhar CM (2003), Cochrane Database 1 RCT Bei annähernd normalem Spermiogramm ist die ICSI der konventionellen IVF nicht überlegen (OR 1,40, 95% CI 0,95 – 2,2) FIS - ART - Belek 2009 19 IMSI - Intrazytoplasmische Morphologisch Selektierte Spermien Injektion Spermienfaktoren, die negativen Einfluss auf die embryonale Entwicklung haben, sind v.a. durch eine verminderte Spermienreife bedingt. Hierzu zählen u. a. DNAFragmentationen. Alle bisher zur Verfügung stehenden Diagnosemittel waren invasiv, wodurch eine Weiterverwendung der Spermien nicht möglich war. Die IMSI erlaubt ein Screening der Spermien bei sehr hoher Vergrößerung mit einem speziellen Invertmikroskop (6000x – 10 000x) mit Videokamera und Computer ohne Färbung in Echtzeit. Dadurch kann ein Spermium bezüglich seiner morphologischen Integrität seines Nukleus analysiert werden. Zahlreiche Publikationen haben gezeigt, dass eine Prä-Selektion des Spermaozoons für eine erfolgreiche ICSI essentiell ist. ICSI mit Spermien, die mittels hoher Vergrößerung ausgewählt wurden, ergaben eine höhere Schwangerschaftsrate, speziell in Fällen wo das Ausmaß an DNA-Fragmentationen im Spermium besonders hoch war. 400x ICSI IMSI FIS - ART - Belek 2009 20 IMSI Bartoov etablierte ein System für eine Selektion bei hoher Vergrößerung, ungefärbte, Echtzeit hochauflösende Untersuchung der Organellen von motilen Spermien Bartoov et al., NEJM 2001 Bartoov et al., J. Androl. 2002 Bartoov et al., Fertil. Steril. 2003 Ergebnisse ICSI mit abnormalen Spermatozoen: Reduktion der SS-Rate: 20,2% versus 36,7% Reduktion der Implantationsrate: 9,6% versus 18,7% Prä-Selektion der Spermien ist essentiell für eine erfolgreiche ICSI (De Vos et al., Hum. Reprod. 2003) FIS - ART - Belek 2009 21 Spindelanalyse Nicht invasive Darstellung der Spindel mittels computerassistierter Polarisationsmikroskopie - Darstellung der 3 Schichten der Zona pellucida Metaphase II – Eizellen Winkel zwischen erstem Polkörperchen (bei 12:00 Uhr) und meiotischer Spindel (ca. 30° abweichend) bei einer menschlichen Eizelle Kombination von Spindelanalyse & IMSI Die Kombination könnte zur weiteren Steigerung der Schwangerschaftsraten bei ICSI führen mit Senkung der Abortus-Raten – Entsprechende randomisierte Großstudien fehlen noch FIS - ART - Belek 2009 22 PICSI Eine Methode zur Selektion reifer Spermien im Rahmen der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI). Die Picsi-Schale ermöglicht in nicht invasiver Form die Auswahl von genetisch integeren, d.h. reifen Spermien durch Hyaluronsäure Spots. Die Köpfe reifer Spermien tragen eine spezifischen Rezeptor für Hyaluronsäure (Hyaluronan). Hyaluronan ist eine wesentliche Komponente der Hülle, welche die Eizelle umgibt. Unreife Spermien verfügen nicht über diesen Rezeptor Durch den sogenannten Hyaluronan-Bindungstest werden Spermien aufgrund von bestimmten Membran-Bindungseigenschaften selektiert. Alle bindenden Spermien sind reif und zeigen keine DNA-Degradierung auf. Diese gebundenen Spermien können für die ICSI verwendet werden. FIS - ART - Belek 2009 23 IMSI und PICSI erlauben in bestimmten Fällen eine Verbesserung der Ergebnisse: Bei fehlender Befruchtung nach ICSI bei fehlgeschlagener Implantation bei schwerer Teratozoospermie bei erhöhter DNA-Fragmentation und vielleicht auch bei idiopathischer Sterilität? Es fehlen derzeit Daten aus Studien mit Evidenzklasse I und II FIS - ART - Belek 2009 24 TESE / MESA FIS - ART - Belek 2009 25 Assisted Hatching – wie sinnvoll? „Hatchende“ Blastocyste Klare Aussage! Definitiv wird die Schwangerschaftsrate erhöht bei Frauen mit mehreren Misserfolgen bei IVF/ICSI, mit reduzierter Prognose (OR 1,33 (95% CI 1,12 bis 1,57) Beispiel: von 25% auf 28% bis 39% - auch die Mehrlingsrate steigt. Seif MMW, Edi-Osagie ECO, Farquhar C, Hooper L, Blake D, McGinlay P. Assisted hatching on assisted conception (IVF & ICSI). Cochrane Database of Systematic Reviews 2006, Issue 1. Art. No.: CD001894. 23 Studien mit guter Qualität und 2889 Frauen mit 954 Schwangerschaften FIS - ART - Belek 2009 26 Wann ist assisted Hatching sinnvoll? Die weltweit vorliegenden Studien sind derzeit nicht in der Lage zu sagen, die Methode nutzt sicher jeder Frau und die Nebenwirkungen sind kalkulierbar gering. Bei Frauen im ersten IVF Versuch ist kein Effekt zu finden auch nicht bei Transfer von kryokonservierten Zellen oder bei hohem FSH FIS - ART - Belek 2009 27 27 Embryotransfer (ET) Tag 2-3 Embryonen im 8-Zellstadium (d 3) Compacting Embryo (ebenfalls d 3) FIS - ART - Belek 2009 28 Blastozystentransfers (BcT) – Tag 4-5 Durchführung eines abhängig von Alter der Frau Anzahl der Oocyten Qualität der Oocyten Qualität der kommerziell erhältlichen Medien nicht bei poor Respondern (keineVerbesserung der Ergebnisse) Frühe Blastozysten (d 5) Morula deutlich kleiner (d4) Expandierte Blastocyste (d 5) „ fully expanded“ Blastozyste (d 5) FIS - ART - Belek 2009 29 Vorteile der Blastozystenkultur Gewinnung der besten lebensfähigen Embryonen nach Überwindung der Entwicklungsblockade in den in vitro Kulturen zwischen Tag 2-3 (4-8 Zellstadium) Bessere physiologische Bedingungen und Synchronisation zwischen Endometrium und Embryo-Entwicklungsstadium Im 2-4 Zellstadium ist die Zona pellucida durch die Kulturbedingungen in vitro so verhärtet, dass es nur schwer zum Hatchen kommt Völlige Entfernung der Zona pellucida mit enzymatischen Methoden und Transfer von zona pellucida freien Blastozysten für eine bessere Implantation (Eine Möglichkeit in der Zukunft?) FIS - ART - Belek 2009 30 Embryonen- Transfer versus Blastozysten-Transfer Cochrane Review 2007 - 18 RCTs Mehr Lebendgeburten: 9 RCTs OR 1,35, 95% CI 1,05 - 1,74 Tag 2/3: 29,4% versus Tag 5/6: 36,0% Vor allem bei den Patientinnen mit guter Prognose „Kein Transfer“ ist signifikant häufiger bei Blastozysten, 16 RCTs OR 2,85, (95% CI 1.97 -4,11) 2,8% versus 8,9% Der Unterschied gilt aber nicht bei Patientinnen mit guter Prognose. FIS - ART - Belek 2009 31 Erfolgsfaktoren- Embryoqualität Wer profitiert? Die junge Patientin mit guter Prognose reduziert nach Blastozystentransfer das Mehrlingsrisiko, weniger Fehlbildungen (Blake + Devroy, Evidenzklasse I/Ib,) mehr Single Transfers Gute Prognosefaktoren: Hohe Anzahl fertilisierter Oocyten Gute Embryoqualität Schlechte Prognosefaktoren: Geringe Anzahl fertilisierter Oocyten Schlechte Embryoqualität Alter? FIS - ART - Belek 2009 32 Seminalplasmaspülung (SPS) bei ART Ein Teil der Samenflüssigkeit – das Seminalplasma – von den Zellbestandteilen getrennt und nach der Follikelpunktion mit einem dünnen Katheter in den Gebärmutterhals gespült. Das Seminalplasma (Ejakulat ohne Spermien) besteht zu einem Großteil aus dem Sekret der Samenblase und zu 25% aus Prostatadrüsensekret. Es enthält eine Vielfalt an Botenstoffen z.B.: TGF und Interleukin, die das Wachstum von Blutgefäßen fördern und Entzündungsreaktionen oder andere immunologische Reaktionen beeinflussen. Heidelberger Arbeitsgruppe erzielte bei Durchführung einer Seminalplasmaspülung bei 129 Patientinnen eine Steigerung der Schwangerschaftsrate um 11,6 % Intravaginal and intracervical application of seminal plasma in in vitro fertilisation or intracytoplasmatic sperm injection treatment cycles - a double blind, placebocontrolled, randomized pilot study. Michael von Wolff, Sterility and Fertility, Feb. 2008 online) Hier fehlen für eine endgültige Aussage noch entsprechende Studien Evidenzklasse Ia und b FIS - ART - Belek 2009 33 SEET - Stimulation of endometrium embryo transfer Im Zuge eine Blastocystenzüchtung wird am 3. Tag nach Follikelpunktion eine Spülung der Gebärmutterhöhle mit dem verwendeten Kulturmedium vorgenommen. Dadurch soll die Einnistungsbereitschaft des Endometriums verbessert werden. Am Tag 5 oder 6 nach Punktion erfolgt dann der Blastocystentransfer. Die japanische Arbeitsgruppe berichtete von einer Verdopplung der Schwangerschaftsrate, allerdings bei sehr kleiner Fallzahl. Stimulation of endometrium embryo transfer (SEET): injection of embryo culture supernatant into the uterine cavity before blastocyst transfer can improve implantation and pregnancy ratesSakae Goto, M.D., Ph.D.a, Takashi Kadowaki, M.D., M.P.H., Ph.D.b, Hiromi Hashimotoa, Shoji Kokeguchi, M.D., Ph.D.a, Masahide Shiotani, M.D., Ph.D.a – FertilitySterility, Nov. 2007 Hier fehlen für eine endgültige Aussage noch entsprechende Studien der Evidenzklasse Ia und b FIS - ART - Belek 2009 34 Methoden der Kryokonservierung „slow cooling“ – langsames Einfrieren mittels computergesteuerten Freezingapparaten (z.B. – 0,30C/min., bei niedrigen Kryoprotektiva ~10%) Vitrifikation – ultraschnelles Abkühlen > -10.000oC/min wobei die Zellen direkt in einen amorphen Zustand (Verglasung) übergehen (Martino et al., 1996) Anwendung im medizinischen Bereich Reproduktionsmedizin Fertilitätsprophylaxe Stammzellforschung FIS - ART - Belek 2009 35 Nach heutigem Wissen ist die Vitrifikation die Methode für: Germinal Vesikel Eizellen Metaphase-II-Eizellen (Eizellspende) Blastozysten Ovargewebe ? Kommerzielle Medien sind verfügbar Aseptische Vitrifikation ist möglich Entsprechende Studien der Evidenzklasse Ia/Ib fehlen noch FIS - ART - Belek 2009 36 Ovarian Tissue Banking (OTB) Grosse Anzahl an Primordialfollikeln im Gewebe vorhanden höhere Erfolgschancen? Keine Stimulation, dafür aber LSK notwendig Kurzfristig durchführbar (Op. Freigabe) Natürliche Empfängnis denkbar Als autologe Hormonersatztherapie denkbar ______________________________________________________ Ovarielle Gewebeentnahme Bestrahlung/Chemotherapie/OP Retransplantation des ovariellen Gewebes FIS - ART - Belek 2009 37 Ovarian Tissue Banking (OTB) LSK - Entnahmetechnik 1 Präparat zur histologischen Kontrolle 1 Präparat zur Bakteriologie 2ml Kryotubs + Kryomedium (z.B. DMSO) Friervorgang Lagerung im überwachten Stickstoff-Tank FIS - ART - Belek 2009 38 Ovarian Tissue Banking - Reimplantation orthotop autologe: Reimplantation an die ursprüngliche Lokalisation im kleinen Becken Vorteil: spontane Ovulation und Schwangerschaft möglich Nachteil: potenzielles Rezidivrisiko heterotop autologe: Autotransplantation von Gewebe an hetorotope Körperstellen (Unterarm, Oberarm) – biolog. HRT, bei KW Punktion, IVM und IVF Xenotransplantation: Transplantation von Gewebe auf immundefiziente Mäuse Technik noch nicht über klinische Forschung hinaus ! FIS - ART - Belek 2009 39 In-vitro-Maturation (IVM) Gewinnung von Ovargewebe - Isolierung von unreifen Oozyten (Primordialfollikel, Primärfollikel) künstliche Reifung (FSH / HCG) IVF/ICSI-Therapie In-Vitro-Maturation bisher nur im Mausmodell gelungen (Smitz et al., Hum Reprod, 1999) FIS - ART - Belek 2009 40 IVM schon heute sinnvoll anwendbar? IVM ist die in vitro Reifung der Oocyten vom GV-Stadium zum Metaphase II Stadium IVM-Methodik: Aspiration unreifer Oocyten in nicht oder niedrig dosiert stimulierten Zyklen In vitro Maturation (IVM) ist bisher wenig untersucht in RCTs. Keine valide Aussage aus prospektiv kontrollierten Vergleichstudien zum Erfolg gegen „normale IVF“ möglich. Priming mit FSH/hMG oder unstimuliert punktieren? Mit oder ohne hCG Gabe? Diese Fragen sind nicht bisher zuverlässig beantwortet! FIS - ART - Belek 2009 41 IVM - mögliche Indikationen Zustand nach OHSS? Schlechte Embryonenqualität in wiederholten Zyklen? Poor Responder? Tumor-Patientinnen + Vitrification der Oocyten/OTB Fertilitätserhalt? Nachteile: Kosten (keine Medikamente, aber ICSI, bei 10-20% Erfolg gegen 30-40% konventionell?, lange Punktionszeiten) Blutungsrisiko? Geringe Zellausbeute? Wieviele Eizellen erreichen die Metaphase II? FIS - ART - Belek 2009 42 „Future Perspectives“ Prophylaktische bilaterale Ovarektomie bei Risikopatientinnen (z.B. BRCA 1 & 2) aber auch OTB bei erst späteren Kinderwunsch ohne Erkrankung dadurch Erhaltung der Fertilität bei möglichen spätem Kinderwunsch Vorsorgliche Einlagerung zur späteren biologischen HRT ev. anti aging bzw. „better aging“ Therapie FIS - ART - Belek 2009 43
