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Cytochrom P450, Polymorphismus, Transporter 10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 1 Cytochrom P450, Polymorphismus, Transporter Vom Dünndarm (small intesitine) aus gelangen aufgenommene Xenobiotica über die Pfort Ader (portal vein) in die Leber. Hier finden eine ganze Reihe von biochemischen Modifikationen statt. 10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 2 Cytochrom P450 Metabolismus (I) Zuerst: First pass effect Vorwiedend lipophile oder schwere (MW >500) Verbindungen werden ekzessiv metabolisiert Diese werden dadurch hydrophiler und damit leichter ausscheidbar gemacht. H O CH3 COOH phase I N COOH phase II Verantwortlich für die als Phase I bezeichneten Reaktionen sind hauptsächlich eine Gruppe von Cytochrom P450 Enzymen (CYP). 10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 3 Cytochrom P450 Metabolismus (II) Die Monooxygenierung der Substrate erfolgt in einem katalytischen Zyklus an einem Hämoglobin-Eisen (Fe) Drug-R + O2 CYP NADPH 10. Vorlesung Drug-OR + H2O NADP Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 4 Cytochrom P450 Metabolismus (III) Die am Metabolismus beteiligten Cytochrome sind überwiegend Monooxygenasen, die evolutionär von der Steroid- und Fettsäuren-biosynthese stammen Im Menschen wurden bisher 17 CYP-Familien mit ungefähr 50 Isoformen charakterisiert Nomenklatur: CYP 3 A 4 *15 A-B Familie Isoenzym >40% SequenzUnterfamilie homolgie >55% Sequenzhomolgie 10. Vorlesung Allel Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 5 Cytochrom P450 Gene families Human 14+ Molluscs 1 CYP450 Plants 22 Insects 3 Fungi 11 10. Vorlesung Bacteria 18 Yeasts 2 Nematodes 3 Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 6 Human cytochrome P450 family Aus der Superfamilie der Cytochrome kommen folgende Familien im Menschen vor: CYP 1-5, 7, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26, 27, 39, 46, 51 CYP 1, 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 3 Metabolismus von Xenobiotica CYP 2G1, 7, 8B1, 11, 17, 19, 21, 27A1, 46, 51 Steroid Metabolismus CYP 2J2, 4, 5, 8A1 Fettsäuren Metabolismus CYP 24 (Vitamin D), 26 (retinoic acid), 27B1 (Vitamin D), ... 10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 7 Cytochrom P450 Enzyme (I) Flavin Monooxygenase Isoenzyme Alkohol Dehydrogenase Aldehyd Oxidase Monoamin Dehydrogenase (MAO) Drug-R + O2 CYP NADPH 10. Vorlesung Die Redoxaktivität wird durch ein Eisenporphyrin im aktiven Zentrum ermöglicht Drug-OR + H2O NADP Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 8 Cytochrom P450 Enzyme (II) Trotz der niedrigen Sequenzidentität von CYP aus unterschiedlichen Organismen, ist die Tertiärstruktur hoch konserviert. Überlagerung von hCYP 2C9 (1OG5.pdb) und CYP 450 BM3 (2BMH.pdb) Bacillus megaterium Gegenüber den bakteriellen CYP besitzen die microsomalen mammalian CYP eine zusätzliche Transmembranhelix als Membrananker 10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 9 Cytochrom P450 Enzyme (III) Die überwiegende Menge an CYP befindet sich in der Leber, aber auch in der Dünndarmwand kommen bestimmte vor. Die mammalian CYP sind an das endoplasmatische Reticulum gebunden, also membranständig. CYP 2D6 2% CYP 2A6 4% CYP distribution other 7% CYP 3 31% CYP 1A2 13% CYP 1A6 8% CYP 2C6 6% 10. Vorlesung CYP 2E1 13% CYP 2C11 16% Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 CYP 3 CYP 2C11 CYP 2E1 CYP 2C6 CYP 1A6 CYP 1A2 CYP 2A6 CYP 2D6 other 10 Cytochrom P450 Enzyme (IV) Am Metabolismus von endogenden Stoffen sind vor allem CYP 3A4, CYP 2D6, und CYP 2C9 beteiligt. Metabolic Contribution hepatic only CYP 2C9 10% CYP 1A2 other 2% 3% CYP 3A4 CYP 2D6 CYP 2C9 CYP 1A2 other CYP 3A4 55% CYP 2D6 30% also small intestine 10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 11 Substratspezifität der CYP (I) Spezifische Substrate der einzelnen human CYP CYP 1A2 verapamil, imipramine, amitryptiline, caffeine (arylamine N-oxidation) CYP 2A6 nicotine CYP 2B6 cyclophosphamid CYP 2C9 diclofenac, naproxen, piroxicam, warfarin CYP 2C19 diazepam, omeprazole, propanolol CYP 2D6 amitryptiline, captopril, codeine, mianserin, chlorpromazine CYP 2E1 dapsone, ethanol, halothane, paracetamol CYP 3A4 alprazolam, cisapride, terfenadine, ... siehe http://medicine.iupui.edu/flockhart/ 10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 12 Substratspezifität der CYP (II) Decision tree for human P450 substrates CYP 1A2, CYP 2A-E, CYP 3A4 CYP 2E1 CYP 2C9 low Volume high medium acidic basic pK a CYP 3A4 CYP 2D6 neutral CYP 1A2, CYP 2A, 2B CYP 2B6 low planarity high CYP 1A2 medium CYP 2A6 Lit: D.F.V. Lewis Biochem. Pharmacol. 60 (2000) 293 10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 13 Cytochrom P450 Metabolismus (IV) Im Rahmen der präklinischen Entwicklung ist auch die Erfassung der Metabolite von Wirkstoffen notwendig, da diese u.U. toxisch sein können. Dazu exprimiert man die entsprechenden CYP Enzyme durch Klonierung in E. coli, und verfolgt die Umsetzung der Wirkstoffe mittels Gaschromatographie und Massenspektroskopie. Dies ermöglicht die selektive Bestimmung von Metaboliten durch einzelne Cytochrom P450 Enzyme, bzw. deren genetische Varianten. Diese Ergebnisse werden dann mit den analogen in vivo Ergebnissen aus Tiermodellen verglichen. Lit. zum Klonieren: R.Knippers, Molekulare Genetik 8.Auflage, Kapitel 10 10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 14 Cytochrom P450 Polymorphismus „Jeder Mensch ist (mehr oder minder) anderst“ Der Phänotyp läßt sich anhand der tatsächlichen Aktivität oder der Menge des exprimierten Enzyms unterscheiden. Der Genotyp widerum ist durch die individuelle DNA Sequenz bestimmt. D.h. der gleiche Genotyp läßt verschiedene Phänotypen zu (Diploider Satz an Chromosomen, differentielle Expression) Entsprechend der metabolischen Aktivität unterscheidet man bei CYP normale (extensive metabolizer), schwache (poor metabolizer), und verstärkte (ultra-rapid metabolizer) Umsetzer. Lit: K. Nagata et al. Drug Metabol. Pharmacokin 3 (2002) 167 10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 15 Single Nucleotide Polymorphism (SNP) SNPs sind Unterschiede einer einzelnen Base in der DNA die innerhalb einer Population auftauchen. Als Polymorphismus bezeichnet man Allele die bei mindestens 1% der Population auftreten. D.h. diese Genotypen sind regulär. Im Gegensatz dazu bezeichnet man Veränderungen des Genoms die seltener als 1% auftauchen nur als Mutationen. Typischerweise werden bei seltenen, ererbten Krankheiten Mutationen im kodierenden Bereich von DNA-Abschnitten festgestellt. Lit: A.D. Rose Nature 405 (2000) 857. 10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 16 CYP 2D6 Polymorphismus (I) Am besten untersucht ist der Polymorphismus von CYP 2D6 (Debrisoquine 4-hydroxylase) Zuerst für die Umsetzung von debrisoquine und sparteine (Antipsychotica) beschrieben Siehe: D.B.Goldstein et al. Nature Rev. Genetics 4 (2003) 937. Lokalisiert auf Chromosom 22 Von den 75 Allelen exprimieren 26 Proteine siehe http://www.imm.ki.se/CYPalleles/cyp2d6.htm 10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 17 CYP 2D6 Polymorphismus (II) Lit: J. van der Weide et al. Ann. Clin. Biochem 36 (1999) 722 10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 18 CYP 2D6 Polymorphismus (III) MGLEALVPLAVIVAIFLLLVDLMHRRQRWAARYPPGPLPLPGLGNLLHVDFQNTPYCFDQ poor debrisoquine metabolism S R impaired mechanism of sparteine LRRRFGDVFSLQLAWTPVVVLNGLAAVREALVTHGEDTADRPPVPITQILGFGPRSQGVF poor debrisoquine metabolism I LARYGPAWREQRRFSVSTLRNLGLGKKSLEQWVTEEAACLCAAFANHSGRPFRPNGLLDK poor debrisoquine metabolism R AVSNVIASLTCGRRFEYDDPRFLRLLDLAQEGLKEESGFLREVLNAVPVLLHIPALAGKV LRFQKAFLTQLDELLTEHRMTWDPAQPPRDLTEAFLAEMEKAKGNPESSFNDENLRIVVA missing in CYP2D6*9 allele DLFSAGMVTTSTTLAWGLLLMILHPDVQRRVQQEIDDVIGQVRRPEMGDQAHMPYTTAVI P loss of activity in CYP2D6*7 HEVQRFGDIVPLGMTHMTSRDIEVQGFRIPKGTTLITNLSSVLKDEAVWEKPFRFHPEHF LDAQGHFVKPEAFLPFSAGRRACLGEPLARMELFLFFTSLLQHFSFSVPTGQPRPSHHGV FAFLVSPSPYELCAVPR T impaired metabolism of sparteine in alleles 2, 10, 12, 14 and 17 of CYP2D6 siehe http://www.expasy.org/cgi-bin/niceprot.pl?P10635 10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 19 CYP 2D6 Polymorphismus (III) Variabilität der Debrisoquine-4-Hydroxylierung HO H CYP2D6 N NH2 NH NH2 N NH = number of individuals (european population) homocygote extensive metabolizers homocygote poor metabolizers = metabolic rate heterocygote extensive metabolizers Lit: T. Winkler Deutsche Apothekerzeitung 140 (2000) 38 10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 20 CYP 2D6 Polymorphismus (IV) Der poor metabolizer Phänotyp hat Auswirkungen auf den Metabolismus von mehr als 25% aller gängigen Medikamente, da er zu einer erhöhten Konzentration nicht umgesetzer Xenobiotika führt. Lit: H.K.Kroemer & M.Eichelbaum. Life Sci. 56 (1995) 2285. Deshalb wurde CYP2D6 Genotypisierung bereits zur Auswahl geeigneter Testpersonen für die Phase III in klinischen Studien eingesetzt: Lamotrigine, Desipramine (Antidepressiva) Lit: M.P.Murphy et al. Pharmacogenetics 10 (2000) 583. 10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 21 Polymorphismus weiterer CYPs CYP 1A2 individuell; hohe, mittlere und langsame Umsetzung von caffeine CYP 2B6 fehlt in 3-4 % der kaukasischen Bevölkerung CYP 2C9 Defizit bei 1-3 % der kaukasischen Bev. CYP 2C19 Individuen mit inaktivem Enzym (3-6 % der kaukasischen und 15-20 % der asiatischen Bevölkerung) CYP 2D6 schwache Metabolisierer bei 5-8 % der europäischen, 10 % der kaukasischen und <1% der japanischen Bevölkerung. Überexpression (doppeltes Gen) bei Teilen der afrikanischen und orientalischen Bev. CYP 3A4 nur geringe Mutationen im Zusammenhang mit dem Polymorphismus des MDR1 Transporter Gen 10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 22 Genotypisierung von CYP P450 Allelen Die Firma Affymetrix (USA) hat unter Verwendung von immobilisierten synthetischen Kopien von P450 Nukleotiden Microarrays (Gen Chips) entwickelt, die die Indentifizierung aller klinisch relevanten Allele erlauben. 10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 23 Induktion und Regelung von CYP3A (I) Man hat eine ganze Reihe von Xenobiotica gefunden die zur verstärkter Exprimierung von Enzymen der CYP3A Familie führen. indinavir efavirenz cyclosporin carbamazepine atorvastatin tamoxifen Antiviral Antiviral Immunosuppressant Anticonvulsant HMG CoA Reductase Inhibitor Antineoplastic, Anti-hormone Diese binden an den pregnane X receptor (PXR) der als Transkriptionsfaktor die expression von des CYP3A Genes reguliert. Lit: T.M. Wilson et al. Nature Rev. Drug Disc. 1 (2002) 259 10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 24 Induktion und Regelung von CYP3A (II) Der PXR Rezeptor wirkt als Heterodimer zusammen mit dem retinoid X receptor (RXR) Als Folge der Induktion von CYP3A kommt es zu verstärktem Metabolismus der aufgenommenen Substanz. Im ungünstigsten Fall kommt es dadurch zu Nebenwirkungen, wie etwa Leberentzündung. 10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 25 RXR und weitere nukleare Rezeptoren (I) Als spezifischen, endogenen Aktivator von RXR hat man 5b-pregnane-3,20-dione gefunden. Im Gegensatz dazu ist PXR sehr viel weniger spezifisch und wird sowohl von Glucocorticoiden als auch von AntiGlucocorticoiden aktiviert. Der unspezifische constitutive androgen receptor (CAR) findet sich dagegen im Cytoplasma und dimerisiert erst im Nucleus mit RXR. Analog zu PXR wird hier das CYP2B Gen reguliert. Ebenfalls hohe Sequenzhomologie wurde für den vitamin D receptor (VDR) der CYP27 reguliert, und für den arylhydrocarbon receptor (AHR) (Dioxin Rezeptor) gefunden. 10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 26 RXR und weitere nukleare Rezeptoren (II) Diese nuklearen Rezeptoren gehören zu einer Familie von Transkriptionsfaktoren. Jeder besitzt eine doppelte Zink-Finger DNA-Bindungsdomäne (DBD), sowie eine größere Carboxy-terminale Ligandenbindungsdomäne (LBD). Da ihre Liganden erst später gefunden wurden, werden sie als orphan nuclear receptors bezeichnet. 10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 27 Human Orphan Nuclear Receptors Receptor (Gene ID) Natural ligand (synthetic ligand) CAR (NR1I3) COUP (NR2F1) ERR (NR3B1) FXR (NR1H4) HNF4 (NR2A1) LRH (NR5A2) PPAR (NR1C1) PXR (NR1I2) ROR (NR1F1) RXR (NR2B1) 3a,5a-Androstanol – (4-Hydroxytamoxifen) Chenodeoxycholic acid Palmitic acid – Eicosapentaenoic acid 5b-Pregnane-3,20-dione, (Rifampicin) Stearic acid 9-cis-RNA Auswahl, mehr in der angebenen Literatur Lit: T.M.Wilson & J.T. Moore Mol. Endocrin. 16 (2002) 1135. 10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 28 Induktion und Regelung von CYP3A (III) O HO O O Hyperforin, der natürliche Bestandteil des St. John‘s wort (Johanniskraut, Hypericum performatum) zeigt die bisher höchste gemessene Affinität zu PXR (Kd = 27 nM) Anwendung: Heilmittel gegen Gallestauung (cholestasis) sowie als mildes Antidepressivuum 10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 29 Induktion und Regelung von CYP3A (IV) Struktur von PXR mit Hyperforin (1M13.pdb) Lit: R.E. Watkins et al. Biochemistry 42 (2003) 1430 10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 30 Induktion weiterer CYP CYP 1A2 omeprazole, insulin, aromatic hydrocarbons (cigarette smoking, charbroiled meat) Führt zu erhöhter Coffein-Konzentration im Plasma wenn man aufhört zu Rauchen CYP 2C9 rifampicin, secobarbital CYP 2C19 carbamazepine, prednisone CYP 2D6 dexamethason CYP 2E1 ethanol, isoniazid CYP 3A4 glucocorticoide, phenobarbitone, rifampicin, nevirapine, sulfadimindine, nevirapine, sulfinpyrazone, troglitazone 10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 31 Typische Inhibitoren von CYP (I) CYP 1A2 cimetidine, ciprofloxacine, enoxacine... grapefruit juice (naringin, 6‘,7‘-dihydroxybergamottin) CYP 2C9 chloramphenicol, amiodarone, omeprazole,... CYP 2C19 fluoxetine, fluvastatin, sertraline,... CYP 2D6 fluoxetine, paroxetine, quinidine, haloperidol, ritonavir,... CYP 2E1 disulfiram, cimetidine,... CYP 3A4 cannabinoids, erythromycin, ritonavir, ketokonazole, grapefruit juice siehe http://medicine.iupui.edu/flockhart/ 10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 32 Transporter (I) Im Gegensatz zur passiven Diffusion durch Membranen, bewirken Transporter verstärkten influx in, oder efflux aus Kompartimenten, wobei ATP verbraucht wird. Lit: A.Ayrton et al. Xenobiotica 31 (2001) 469 10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 33 Transporter (II) Membranständige Transporter die an der Pharmakokinetik von endogenden Stoffen beteiligt sind Superfamilien: solute carriers (SLC) ATP-binding cassette (ABC) P-type ATPase Lit: M.K.Leabman et al. Proc.Nat.Acad.Sci.USA 100 (2003) 5896 10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 34 Struktur von Membrantransportern Membrantransporter sind Proteine mit teilweise über 12 Transmembranhelices die über Loops verbunden sind. Bisher gelang die Strukturaufklärung mittels X-ray noch bei keinem Transporter. Lit: M.K.Leabman et al. Proc.Nat.Acad.Sci.USA 100 (2003) 5896 10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 35 P-glycoprotein P-gp gehört zur Familie der multidrug resistant proteins (MDR) und wird von dem MDR1 Gen kodiert. Insbesondere die Bioverfügbarkeit von Psychopharmaka wird limitiert durch den Rücktransport aus dem Gehirn in den Blutkreislauf. Transport von Stoffen aus der Leber in den gastrointestinalen Trakt (bilary excretion) z.B. von Indinavir Die Überexpression von P-gp führt bei Krebszellen zu Resistenz gegen Antineoplastica. Lit: A.Ayrton et al. Xenobiotica 31 (2001) 469. A.Seelig Eur.J.Biochem. 251 (1998) 252. 10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 36 Transportproteine für Organische Ionen Dazu gehören die Familien der Organic Anion Transporter (OAT) und der Organic Cation Transporter (OCT) Diese sind vor allem an der Ausscheidung hydrophiler Katabolite beteiligt Lit: A.Ayrton et al. Xenobiotica 31 (2001) 469 10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 37 Transportproteine für influx Es gibt aber auch Transporter für die aktive Aufnahme von Stoffen aus dem Dünndarm Pept1 (intestinal peptide transporter) Transmembranprotein mit 12 TM-Helices Verantwortlich für Stickstoffaufnahme ! Substrate: kleine Peptide (Di- und Tripeptide, sowie Verbindungen mit Peptidcharakter, z.B. Captopril) O OH N O HS CH3 10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 38 Polymorphismus bei Transportern Auch Transporter weisen erhebliche genetische Variationen auf: Gen Protein / Funktion ABCB1 (ATP-binding cassette subfamily B member 1) P-gp efflux SLC6A3 (Dopamine Transporter) Neurotransmitter SLC6A4 (Serotonin Transporter) Neurotransmitter ADRB2 (b-adrenergic receptor) Rezeptor für Betablocker ALOX5 (Arachidonate 5-lipoxygenase) Biosynthese von Leukotrienen Siehe: D.B.Goldstein et al. Nature Rev. Genetics 4 (2003) 937. 10. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 39
