Molekulare Diagnostik

Molekulare Diagnostik
www.mh-hannover.de/lichtinghagen.html
Increasing role of environment
and stochastic factors
Assoziation von DNA-Polymorphismen
mit Krankheiten oder Krankheitsrisiken
•G6PD deficiency
•Hemochromatosis
•Acute intermittent porphyria
• α1-Antitrypsin ZZ
•Type I diabetes mellitus
•Apo E-2/E-2 hyperlipoproteinämie
•Phenylketonuria
•Sickle-cell anemia
•Cystic fibrosis
•Huntington disease
•Duchenne dystrophy
•Tay Sachs
Increasing role of genotype at other loci
Monogene Erkrankungen
Polygene Ursachen
i.d.R. bei typ. Volkskrankheiten
einzelne Kandidatengene
viele Gene
Hoher Beitrag zur Krankheitsentstehung
unklare Assoziationen
Kopplungsuntersuchung (Vererbung
der Krankheit in betroffenen Familien)
chromosomale Lage schrittweise
eingrenzen, Gen identifizieren
geringer Beitrag des
einzelnen Gens zur
Krankheitsentstehung
genomweite
Assoziationsstudien
Erforderlich: komplette Sequenzierung des humanen Genoms
(Grundlage: Human Genom Project, 3.2 x 109 Basenpaare)
Protein-Polymorphismus in einer Population
Homozygot
Ursache:
heterozygot
Wildtyp
Akkumulation verschiedener Mutationen (Genpolymorphismen)
im Genpool einer Population
Die Phänotyp-Verteilung in einer Population hängt von
der Art der zugrunde liegenden Mutation ab
SNP: „single nucleotide polymorphisms“
Mehrere Millionen SNPs / Genom
Coding SNPs: 3-5%
Mutationstypen
Drei Zygotiezustände: Wildtyp, heterozygot, homozygot
Begriffe / Definitionen
Polymorphismus:
DNA-Sequenz-Variante an einem Lokus
Mitglieder derselben Art unterscheiden sich hier, es
existieren zwei oder mehr Allele in der Bevölkerung
synonym auch „Sequenzvariation“
(häufig aber auch benutzt für Veränderung ohne
phänotypische Auswirkung)
SNP:
„single nucleotide polymorphism“
Polymorphismus betrifft einzelne Base
z.B.:
TTG CAT GGG ACC TTG
TTT CAT GGG ACC TTG
Haplotyp:
allelische Zusammensetzung der Polymorphismen
einzelner Chromosomen, ergibt sich nicht aus
Genotyp.
z.B.
Genotyp
mögliche Haplotypen
AaBb
AB, ab, Ab, aB
Kopplungsungleichgewicht
„linkage disequilibrium“
bestimmte Haplotypen treten
häufiger auf als sich aus
relativer Häufigkeit einzelner
Allele innerhalb der
Population ergibt
Freudenberg et al., Deutsches Ärzteblatt 2002
HapMap
Veröffentlichung einer Haplotypen-Karte
Zusammenfassung gemeinsam vererbter SNPs
zu Haplotypen
Festlegung charakteristischer tag-SNPs
tag-SNP
SNP-Variante innerhalb eines Haplotyp-Blocks,
welche einen Block charakterisiert
„Genome Wide Association Studies“
Durch tag-SNPs Begrenzung auf 300.000 SNPs
für das Genotypisieren
Genchipdianostik, Mikroarray-Technologie
Vergleich von Haplotypen:
Kontrollgruppe
Kollektive Erkrankter
HuRef
Craig Venter publizierte Sequenz seines Genoms
99,5% identisch mit bereits publizierten Versionen
4 Millionen Polymorphismen,
30% bisher nicht beschrieben, meist SNPs auch
Insertionen, Deletionen, segmentale Duplikationen
Vision:
JEDEM SEIN GENOM FÜR 1000 DOLLAR
Derzeitiger Stand der Technik
Genome Sequencer System (Amplicon Sequencing)
basierend auf Mikroarray-Technologie/ Picoliter-Technik
basierend auf dem Wissen des „Human Genom Projects“
100 Megabasenpaare (1 x 108) an einem Arbeitstag
Ermittlung eines Genotyps
durch die Analyse einer
bekannten Mutation
•RFLP (Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus)-PCR
(Häufigkeit des Einsatzes etwa 25%)
•Allel-spezifische Oligonukleotid-Hybridisierung
(Häufigkeit des Einsatzes etwa 50%)
Genchip-Analyse zur gleichzeitigen Erfassung
vieler unterschiedlicher Mutationen
kommerziell bedingt erhältlich (z.B. CYP450-Array)
Southern Blot
Grundprinzip als Vorbild für moderne Genchip-Methoden
Trennung
nach
Größe
Detektion:
Nachweis
spezifischer
Signale
hier:
Banden(muster)
Immobilisation
Hybridisierung:
Sequenzspezifische
Bindung
Southern Blot: Anwendungen
Bsp: Sichelzellanämie
Restriktionsenzym
Mst II
..CCTNAGG..
β-Globingen
..CCTGAGG..
Mutation
..CCTGTGG..
Ausstattung für RFLP-PCR
RFLP-PCR
Ermittlung der Punktmutation (C/T) bei Nukleotid 677 im MTHFR-Gen
(Methylentetrahydrofolsäure-Reduktase)
Bedeutung für den VitB12/Folsäure-Stoffwechsel
(Artheroskleroserisiko über Einfluss auf Homocystein-Konzentration im Serum)
HE N N N N
N HO HE N
M
bp
300
200
100
•Amplifikation des DNA Bereiches
•DNA-Fragment von 198 bp
•Verdauung der DNA mit Hinf I
Wildtyp (N):
Homozyg. Mutation (HO):
198 bp
175 bp
Heterozyg. Mutation (HE):175+198 bp
Real-Time-PCR
Bsp.: Glaskapillar-Thermocycler
Real-Time-PCR
Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET)
zwischen Hybridisierungssonden
ion
tat
Mu
•Methode geeignet zur Quantifizierung von PCR-Produkten
Messung eines zunehmenden Fluoreszenzsignals während der laufenden
PCR. Beginn des Signalanstiegs ist das Maß für die Ausgangskonzentration
des betreffenden DNA-Bereiches.
•Methode geeignet zur Mutationsanalyse
Nach der abgeschlossenen PCR wird das Schmelzverhalten der FRETSonden geprüft. Mutation und Wildtyp haben aufgrund von BasenFehlpaarungen verschiedene Schmelzpunkte.
Genotypisierung mittels
Schmelzkurvenanalyse
Schmelzkurve
45 –75 °C
WT
HE
HO
Schmelzpunkt
ca. 58°C
Schmelzpunkt
ca. 66°C
HO
HE
WT
In diesem Beispiel:
FRET-Sonden
haben eine exakte
Übereinstimmung mit
der Wildtyp-Sequenz
1. Ableitung
-d[Fluoreszenz]/dT
Häufig untersuchte Gene (Beispiele)
•
Alpha-1-Antitrypsin
•
Angiotensin converting enzyme (ACE)
•
Apolipoprotein B100
•
Apolipoprotein E
•
Faktor II-Leiden (Prothrombin)
•
Faktor V-Leiden
•
HFE (HLA-H)
•
HLA (Klasse I und Klasse II, zur Typisierung)
•
Laktase (Laktosetoleranzstörung)
•
MTHFR
•
Mukoviszidose
•
UDP-Glucuronosyltransferase UGT1A1(GilbertMeulengracht)
α1-Antitrypsinmangel
α1-Antitrypsin:
Benennung der Allele
historisch aus der
Phänotypisierung
mittels isolelektrischer Fokussierung
Akute-Phase-Protein aus Hepatozyten,
Aktivitätshemmung von Serinproteasen
(PMN-Elastase)
>40 Allele
Wildtyp (PiM), Mangelallele: 7% Prävalenz
Wichtige klinisch relevante Mangelallele:
PiZ und PiS relevant für Genotyp., PiNull
Risiko korreliert mit vermind. Antitryp.-Konz.
high risk: PiZZ, PiZNull, PiNullNull
increased risk : PiSZ
Erkrankungen der Leber (Kindesalter):
Sekretionsstörung in Hepatozyten bei PiZZ
Lungenemphysem (Erwachsenenalter):
Folge einer nicht inhibierten PMN-ElastaseAktivität
Hereditäre Hämochromatose (HH)
Prävalenz in Mitteleuropa: 1:400, häufigste autos. rez.
Erbkrankheit
Manifestationsalter: 40-60 Jahre,
Hepatomegalie, Leberzirrhose,
D. mellitus, dunkle Hautpigmentierung
Mutationen im HFE-Gen (Typ 1-Hämochromatose)
Cys 282Tyr (C282Y) homozygot bei ca. 85-95% der HHPatienten, Compound-Heterozygotie mit His63Asp (H63D) bei
3-8% der HH-Patienten (Prävalenz dieses H63D-Polymorphismus: 13%)
Typ 2-Hämochromatose (Hepcidin, Hämojuvelin):
seltene juvenile Form, vor 30. Lebensjahr manifest, geht mit
schwerer Kardiomyopathie und Hypogonadismus einher.
Typ 3: (Transferrinrezeptor 2)
Typ 4: (basolateraler Eisencarrier Ferroportin 1)
Diagnoseweg bei V.a. hereditäre Hämochromatose
Klinische Hinweise und Transferrinsättigung >60% und S-Ferritin >250-300 ng/l
Gen-Test: Cys282Tyr-Mutation, gegebenenfalls His63Glu
_
+
Gentest negativ, aber klin. Verdacht,
bzw. zur Bestimmung des Ausmaßes
des Leberschadens
Hämochromatose gesichert
Leberbiopsie mit quantitativer Messung
des Lebereisengehaltes
Aderlasstherapie
+
Fettstoffwechsel
Lipoproteinstoffwechsel maßgeblich durch
Zelloberflächenrezeptoren mitbestimmt
LDL-Rezeptor bindet neben ApoB100 auch Apo E
Funktion:
Regulation der Cholesterinkonzentration
Cholesterinlieferung für zell. Bedarf, Hormonsynthese
Familiäre Hypercholesterinämie:
LDL-Rez.defekte: >100 bislang bekannte Mutationen
(DNA-Sequenzierung)
ApoB100:
häufigste Mutation: G10699A (Arg3500Gln)
Frequenz: 1 auf 700 Kaukasier
bei Heterozygotie erhöhtes S-LDL-Cholesterin,
gestörte Bindung an LDL-Rezeptor,
Risiko kardiovaskulärer Erkrankungen
Fettstoffwechsel Hyperlipoproteinämie Typ III
ApoE:
ApoE2-Homozygotie ist Voraussetzung zur
Ausprägung dieser Fettstoffwechselstörung
Aber:
Nur ein kleiner Teil der Homozygoten erkrankt!!!
Ansonsten korreliert das Allel E2 mit niedrigeren
Cholesterinspiegeln.
ApoE-Allele:
Isoformen:
E2, E3 und E4 durch Mutat. C112R und R158C
E2/2 (1%), E3/3(55%), E4/4, E2/3, E2/4, E3/4 (26%)
Benennung der Allele historisch aus der Phänotypisierung mittels
isolelektrischer Fokussierung.
Rezeptorbindung
E2 bindet nicht ,
Aktivierung des hepat. LDL-Rezeptors
E4-Partikel bewirken das Gegenteil,
E4 ist somit potentiell artherogen, E2 protektiv
Assoziation mit (late onset) M. Alzheimer für E4
Thrombophiliediagnostik
Faktor V:
G1691A (Arg506Gln), autosom. dominant
(nach Entdeckungsort Faktor V/Leiden genannt)
Effekt : verlangsamte Spaltung durch aktiviertes
Protein C (APC-Resistenz)
Prävalenz: 1:20 für heterozygoten Defekt
Weitverbreitester Risikofaktor für venöse Thrombosen
Heterozygotie: ca. fünf- bis zehnfache Erhöhung des
Thromboserisikos gegenüber der Normalbevölkerung
Homozygotie: Risiko ca. 100fach erhöht
Weitere
Risikofaktoren
(z.B.
Kombinationsdefekte,
Nikotinkonsum, Einnahme oraler Kontrazeptiva) können das
Thromboserisiko zusätzlich erheblich erhöhen.
(zusätzlich
Ausschluss
von
Prothrombin-Genmutation,
Antithrombin III-, Protein C-, Protein S-Mangel).
Genotyp-abhängige Referenzbereiche
Auswirkungen von Genpolymorphismen auf
die Konzentration klinisch-chemischer Messgrößen
Beispiele:
Angiotensin converting enzyme (ACE-ID-Polymorphismus)
Bilirubin
(UGT1A1)
Tumormarker CA19-9
(höhere Werte bei Le und Se Allelen
im Vergleich zu le und se)
Angiotensin-converting enzyme (ACE)
Insertions (I) / Deletions (D) –Polymorphismus im ACE-Gen
12
Häufigkeit
10
ID
8
6
4
II
2
0
0
20
DD
40
Referenzintervalle (Genotyp-abhängig)
ACE Genotyp DD (ca. 25%)
ACE Genotyp DI (ca. 50%)
ACE Genotyp II (ca. 25%)
24-89 U/l
13-66 U/l
7-33 U/l
60
80
100 U/l
Klinische Bedeutung:
Labordiagnostik der Sarkoidose:
S-ACE als Surrogatmarker erhöht
(Polymorphismus beeinflusst Serumkonz.)
Gendefekt: Risikofaktor
kardiovaskulärer Erkrankungen??
Pharmakogenetik: Individualisierte Arzneimitteltherapie
PM: poor metabolizer
IM: intermediate metabolizer
EM: extensive metabolizer
UM: ultrafast metabolizer
Beschäftigt sich mit den hereditären
Grundlagen der Unterschiede in einer
Population bezüglich dem Response auf
ein Arzneimittel.
DNA-Sequenzen variieren leicht von
Individuum zu Individuum
zahlreiche Polymorphismen
Genetische und damit häufig auch
Unterschiede in Proteinzusammensetzungen verursachen daher bei
gleicher Medikation verschiedene
systemische Konzentrationsniveaus.
Insgesamt abhängig von
Aufnahme, Absorption, Metabolismus
(Phase I und Phase II Biotransformationsreaktionen), Clearance und Exkretion
Pharmakogenetik Häufigkeit von Polymorphismen
Enzym
Häufigkeit
Medikamente
Probleme
Cytochrom P450
CYP 2D6
CYP 2C19
CYP 1A2
CYP 2C9
3-10%
2-5%
12%
viele (Antidepressiva
Meist verstärkte
Wirkung
Neuroleptika, Beta-Blocker.....)
Warfarin-Therapie
N-Acetyltransferase
NAT2
50%
Isoniazid, Sulfapyridin
Dapson, Koffein, Hydralazin
Überempfindlichkeitsreaktionen
Thiopurinmethyltransf.
TPMT
0,3%
Azathioprin, Mercaptopurin
Leukopenie
Dihydropyrimidin-Dehydr. 5% (Het.)
(DPD, DPYD)
5-Fluoruracil
verstärkte Wirkung
Glukose-6-Phos.-Dehydr. 1%
Sulfonamide, Primaquin
Hämolyse
Serum-Cholinesterase
0,04%
Succinylcholin
Apnoe
Ca-Transport im ER
0,005%
Inhalationsanästhetika
Maligne
Hyperthermie
Pharmakogenetik: Cytochrom P450-Isoenzyme
Die Cytochrom P450-Isoenzyme sind Hämoproteine, die im katalytischen
Zentrum Eisen als Zentralatom enthalten.
Als Monooxygenasen katalysieren sie den Metabolismus von zahlreichen
exogenen und endogenen Substraten und werden durch CO stark gehemmt.
Das UV-Absorptionsmaximum des Kohlenmonoxid-Hämkomplexes
liegt bei 450 nm.
CYP :
erste Zahl (z.B. 3):
folgender Buchstabe (A, B, C, D, E) :
letzte Zahl (z.B. 4) :
steht für ein CYP-Gen
Bezeichnung der Genfamilie
Bezeichnung der Unterfamilie
steht für das individuelle Gen
Wichtig für Arzneistoffmetabolismus:
CYP3A4, CYP2D6, CYP2C9, CYP2C8, CYP2C19, CYP1A2, CYP2E1
CYP3A4 stellt mit ca. 30% die Hauptmenge der CYP-Isoenzyme in der
Leber dar und wird auch in den Epithelzellen des Dünndarms exprimiert.
Pharmakogenetik: z.B. CYP 2D6
CYP2D6*1, *2 („extensive (rapid)
Metabolizer“).
CYP2D6*3, *4, *5, *6 („poor
(slow) Metabolizer (PM)“) sind in
98% aller Fälle an einem Verlust der
CYP2D6-Aktivität beteiligt. Zwei
Mangelallele müssen allerdings
nachgewiesen werden, sonst IMPhänotyp.
CYP2D6*9, *10, *41
(„intermediate Metabolizer“, IM)
relevant in Verbindung mit einem
weiteren IM bzw. PM-Allel.
Genduplikationen führen zu
„Ultrafast Metabolizer“ (UM).
Betroffene Pharmaka:
Antidepressiva (s.o.) (z.B. Amitriptylin),
Neuroleptika (z.B. Haloperidol),
Antiarrhythmika (z.B. Propafenon)
Siehe (alte)MHH-Homepage/MHH-Internes/
CYP-Interaktionen
sowie
www.mh-hannover.de/analysenspektrum.html
(auf Link „Pharmakogenetik“ (pdf) klicken)
Pharmakogenetik: z.B. CYP 2D6
200
40
inpatient treatment days
45
150
5
100
50
0
N=
25
30
non-polymorphism
polymorphism
EM
PM/IM
CYP-abhängige
Schwierigkeiten bei der
medikamentösen
Therapie psychiatrischer
Patienten spiegeln sich
sogar in der stationären
Behandlungsdauer wider.
Höhere
Behandlungskosten
Mutationsnachweise in der
molekulargenetischen Tumordiagnostik
•Keimbahnmutationen
•somatische Mutationen
Tumordiagnostik
Nachweis von Keimbahn-Mutationen
Familiäre Disposition bei Krebserkrankungen:
Hereditäre Tumoren: ca. 2% aller Krebserkrankungen
Hinweise auf erbliche Disposition für Tumoren:
Familie
Zwei oder mehr Verwandte ersten Grades mit demselben Tumor
Zwei oder mehr Verwandte mit seltenen Tumoren
Evtl. drei oder mehr Tumoren in typischer Assoziation (z.B. Mamma und Ovar)
Patient
Multiple Tumoren in einem Organ oder in typischer Assoziation
Assoziation von Tumoren mit anderen genetischen Auffälligkeiten oder
kongenitalen Defekten
Tumoren an ungewöhnlichem Ort oder in frühen Lebensjahren
Tumordiagnostik
Nachweis von Keimbahn-Mutationen
Erkrankung
Gen
Fam. Retinoblastom
Fam adenomatöse Polyposis (FAP)
Heredit. kolorektale Karzinome o. Polyposis
Fam. Brust-/Ovarialkrebs
Fam. Brustkrebs
Li Fraumeni Syndrom
Multiple endokrine Neoplasie (MEN) Typ1
Fam. Medulläres Schilddrüsenkarzinom
MEN Typ 2A und 2B
Fam. Melanom
Neurofibromatose Typ 1
Neurofibromatose Typ 2
Gorlin Sydrom, Basalzellkarzinom
Von Hippel-Lindau Syndrom
Fam. Wilms-Tumor
rb
apc
mlh 1
brca 1
brca 2
p53
men 1 (menin)
ret
p16
nfl 1
nfl 2
ptch
vhl
wt 1
Tumordiagnostik
Nachweis von Keimbahn-Mutationen
Diagnostische und präventive Maßnahmen, die den Nachweis
einer genetischen Tumordisposition rechtfertigen:
Maßnahme
Beispiele
Präventive Diagnostik
Koloskopie bei HNPCC und FAP
Vermeidung invasiver diagnost.
Maßnahmen bei Ausschluss einer
disponierenden Mutation
Ausschluss eines Risikos bei
Mitgliedern von HNPCC- und FAPFamilien
Präventive therapeutische Maßnahmen Thyreodetektomie bei Patienten aus
MEN Typ II-Familien
HNPCC: Hereditäres nicht-polypöses kolorektales Karzinom
FAP:
Familiäre adenomatöse Polyposis Coli
MEN: Multiple endokrine Neoplasie
Tumordiagnostik II
Nachweis von somatischen Mutationen
Genetische Instabilität in malignen Tumoren:
Entweder kausal für Tumorgenese verantwortlich,
und/oder für Tumorprogression verantwortlich!
Wichtige Gene: p53, k-ras
Mutationsanalyse zur Früherkennung von Tumoren.
Tumorzellnachweise in Körperflüssigkeiten und Stuhl.
Problem: Vielzahl möglicher Mutationen, Nachweis
eines mutierten Allels unter einem Überschuss von
Wildtyp-Allelen.
Tumoren: z.B. Kolon-Karzinom, Pankreas-Karzinom
Tumordiagnostik II
Nachweis von somatischen Mutationen
p53
Am häufigsten mutiertes Tumorgen (Tumorsuppressorgen
kodiert für Transkriptionsfaktor). Mutationen (meist Punktmutationen/missense) fast ausschließlich im Bereich der
DNA-bindenden Domäne (Exone 4-8).
Mutiertes P53-Protein häufig mit verlängerter Halbwertszeit,
immunhistochemisch im Tumorgewebe nachweisbar.
Mutationen bzw. zelluläre Akkumulationen korrelieren mit
geringerer Überlebenszeit des Patienten. (z.B. Mamma-Ca:
unabhängiger prognostischer Parameter)
Tumordiagnostik III
Nachweis von somatischen Translokationen
(Tumorgene an Bruchstellen von Chromosomen)
Aus technischen Gründen Nachweis von Chromosomenanomalien in
Tumoren hämatopoetischer Zellen leichter. Große Mehrzahl bisher
gesicherter Chromosomenanomalien bei Leukämien und Lymphomen.
Gen
Rearrangement
Erkrankung
Rearrangements, kodierende Sequenz exprimiert und nicht verändert
BCL2
t(14;18)(q32;q21)
follikuläres Lymphom
Rearrangements, Hybridgene
BCR-ABL
t(9;22) (q34;q11)
CML, B-ALL
Philadelphia-Chromosom zytogenetisch bei bis zu 90% der CML nachweisbar!!!
Nachweis mittels PCR /RT-PCR mit Primern von beiden Seiten
der chromosomalen Bruchstelle.
Tumordiagnostik IV
Nachweis/Quantifizierung zirkulierender Tumorzellen
Nachweis residualer Tumorzellen im peripheren Blut,
Knochenmark oder Blutprodukten über Marker (Transkripte,
Methylierungsgrad der DNA), welche nicht in hämatopoetischen
Zellen vorhanden sind.
Target:
meist Gene klassischer Tumormarker: z.B.
AFP
PSA
CK19
alpha-Fetoprotein
Prostataspezifisches Antigen
Zytokeratin 19
Nachweis mittels RT-PCR o. quantitativer RT-PCR
Nachweisgrenzen: ca. 1 Tumorzelle unter 106 Zellen
Methylierungsgrad der DNA: (neuerer Trend). DNA von Tumoren ist häufig
5mC).
(spez. in Promorbereichen) hypermethyliert (C
Nachweis des Methylierungsgrades von ausgewählten Indikatorgenen
zum sensitiven Nachweis einer Metastasenbildung.
Anhang
PCR-Grundprinzip
Bedeutung der Effizienz bezogen auf die praktische Ausbeute
nach einem PCR-Assay
Grundprinzip der DNA-Sequenzierung
Polymerase Chain Reaction (PCR)
cycle 1
94°C
∼1min
cycle 2
94°C
∼1min
72°C
∼1min
72°C
∼1min
∼ 60°C
∼1min
∼ 60°C
∼1min
1
1
1
1
1
2
2
Teilschritte
denaturation
annealing
1
2
elongation
2
2
1
2
2
1
2
Insgesamt 30 – 40 Zyklen/PCR
DNA-Template, Primer (sense, antisense)
Nukleotide, Puffer, Mg2+,
thermostabile DNA-Polymerase (z.B. Taq-Polymerase)
Temperaturen und Zeiten beispielhaft
Bedeutung der PCR-Effizienz
N = N0 x En,
E
[%]
Ausbeute
[%] *)
100
100
95
21
90
4
85
0,8
80
0,1
75
0,02
70
0,002
(E von 0-2)
Effizienz (E) der Reaktion wichtig (oft 70-80%)
*)nach
30 Zyklen
N: Kopienzahl nach PCR, N0: initiale Kopienzahl
Genotypisierung mittels Sequenzierung
der betroffenen Genregion
Erforderlich bei:
•Analyse kompletter
Sequenzinformationen
•Nachweis unbekannter
Mutationen
•Untersuchung zahlreicher
Polymorphismen/Gen
1.
2.
Nukleotid 677
MTHFR-Gen
G
G
Sequenz , gelesen von unten nach oben
1. GAT GAT GAA ATC GG…
2. GAT GAT GAA ATC GA…
C
A T
A
G A T
G A
T
G A
Lese
richtung
klassische Autoradiographie
Enzymatische Reaktion (nach Sanger, mittels DNA-Polymerase):
Einbau von Didesoxynukleotiden (ddNTP) in 4 getrennten Reaktionen (G, A, T, C),
ergibt statistisch verteilte Strangabbrüche, Fragmente werden elektrophoretisch getrennt,
Einbau markierter dNTP (z.B.dATP)
Autoradiographie (32P), Fluoreszenzlabel*)
*) inkl. computergesteuerter autom. Sequenziersysteme, schneller Datenbankabgleich
Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!