Molekulare Diagnostik

Molekulare Diagnostik
Ralf Lichtinghagen, Klinische Chemie
Gliederung
•Methodische Grundlagen der DNA-Analytik
•Anwendungen der molekularen Diagnostik:
Assoziation von DNA-Polymorphismen mit
Krankheiten oder Krankheitsrisiken
Pharmakogenetik
Tumordiagnostik auf Grundlage von
molekularbiologischen Methoden
Untersuchung von DNA
•Southern-Blot (Gensondentechik)
•Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus-PCR
Allel-spezifische Oligonukleotid-Hybridisierung
•DNA-Sequenzierung
•DNA-Chips
Southern Blot
Southern Blot: Anwendungen
Bsp: Sichelzellanämie
Restriktionsenzym
Mst II
..CCTNAGG..
β-Globingen
..CCTGAGG..
Mutation
..CCTGTGG..
Polymerase Chain Reaction (PCR)
cycle 1
94°C
∼1min
cycle 2
94°C
∼1min
72°C
∼1min
72°C
∼1min
55°C
∼1min
55°C
∼1min
1
1
1
1
1
2
2
1
2
denaturation
annealing
2
2
1
2
2
1
2
elongation
DNA-Template, Primer (sense, antisense)
Nukleotide, Puffer, Mg2+,
thermostabile DNA-Polymerase
Temperaturen und Zeiten beispielhaft
Bedeutung der PCR-Effizienz
N = N0 x En,
E
[%]
Ausbeute
[%] *)
100
100
95
21
90
4
85
0,8
80
0,1
75
0,02
70
0,002
(E von 0-2)
*)nach
Effizienz (E) der Reaktion wichtig (oft 70-80%)
30 Zyklen
Protein-Polymorphismus in einer Population
Ursache:
Akkumulation verschiedener Mutationen (Genpolymorphismen)
im Genpool einer Population
Die Phänotyp-Verteilung in einer Population hängt von
der Art der zugrunde liegenden Mutation ab
SNP: „single nucleotide polymorphisms“
Mehrere Millionen SNPs / Genom
Coding SNPs: 3-5%
Mutationstypen
Drei Zygotiezustände: Wildtyp, heterozygot, homozygot
Ermittlung eines Genotyps
durch die Analyse einer
bekannten Mutation
•RFLP (Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus)-PCR
(Häufigkeit des Einsatzes etwa 25%)
•Allel-spezifische Oligonukleotid-Hybridisierung
(Häufigkeit des Einsatzes etwa 50%)
Genchip-Analyse zur gleichzeitigen Erfassung
vieler unterschiedlicher Mutationen
kommerziell bedingt erhältlich (z.B. CYP450-Array
mit 33 versch. Mutationen)
Ausstattung für RFLP-PCR
RFLP-PCR
Ermittlung der Punktmutation (C/T) bei Nukleotid 677 im MTHFR-Gen
(Methylentetrahydrofolsäure-Reduktase)
Bedeutung für den VitB12/Folsäure-Stoffwechsel
(Artheroskleroserisiko über Einfluss auf Homocystein-Konzentration im Serum)
HE N N N N
N HO HE N
M
bp
300
200
100
•Amplifikation des DNA Bereiches
•DNA-Fragment von 198 bp
•Verdauung der DNA mit Hinf I
Wildtyp (N):
198 bp
Homozyg. Mutation (HO):
175 bp
Heterozyg. Mutation (HE):175+198 bp
Real-Time-PCR
Bsp.: Glaskapillar-Thermocycler
Real-Time-PCR
Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET)
zwischen Hybridisierungssonden
ion
tat
Mu
•Methode geeignet zur Quantifizierung von PCR-Produkten
Messung eines zunehmenden Fluoreszenzsignals während der laufenden
PCR. Beginn des Signalanstiegs ist das Maß für die Ausgangskonzentration
des betreffenden DNA-Bereiches.
•Methode geeignet zur Mutationsanalyse
Nach der abgeschlossenen PCR wird das Schmelzverhalten der FRETSonden geprüft. Mutation und Wildtyp haben aufgrund von BasenFehlpaarungen verschiedene Schmelzpunkte.
Genotypisierung mittels
Schmelzkurvenanalyse
Schmelzkurve
45 –75 °C
WT
HE
HO
Schmelzpunkt
ca. 58°C
Schmelzpunkt
ca. 66°C
HO
HE
WT
In diesem Beispiel:
FRET-Sonden
haben eine exakte
Übereinstimmung mit
der Wildtyp-Sequenz
1. Ableitung
-d[Fluoreszenz]/dT
Genotypisierung mittels Sequenzierung
der betroffenen Genregion
Erforderlich bei:
•Aufspüren unbekannter Mutationen
•zahlreiche Polymorphismen/Gen
Nukleotid 677 im
MTHFR-Gen
GAT GAT GAA ATC GG…
GAT GAT GAA ATC GA…
G
G
A T C
A
G A T
G A
T
G A
klassische Autoradiographie
Enzymatische Reaktion (DNA-Polymerase):
Einbau von Didesoxynukleotiden (ddNTP) in 4 getrennten Reaktionen (G, A, T, C),
Statistisch verteilte Strangabbrüche, Fragmente elektrophoretisch getrennt,
Einbau markierter dNTP (dATP)
Autoradiographie (32P), Fluoreszenzlabel
Increasing role of environment
and stochastic factors
Assoziation von DNA-Polymorphismen
mit Krankheiten oder Krankheitsrisiken
•G6PD deficiency
•Hemochromatosis
•Acute intermittent porphyria
• α1-Antitrypsin ZZ
•Type I diabetes mellitus
•Apo E-2/E-2 hyperlipoproteinämie
•Phenylketonuria
•Sickle-cell anemia
•Cystic fibrosis
•Huntington disease
•Duchenne dystrophy
•Tay Sachs
Increasing role of genotype at other loci
Häufig untersuchte Gene (Beispiele)
•
Alpha-1-Antitrypsin
•
Angiotensin converting enzyme (ACE)
•
Apolipoprotein B100
•
Apolipoprotein E
•
Faktor II-Leiden (Prothrombin)
•
Faktor V-Leiden
•
HFE (HLA-H)
•
HLA (Klasse I und Klasse II, zur Typisierung)
•
Laktase (Laktosetoleranzstörung)
•
MTHFR
•
Mukoviszidose
•
UDP-Glucuronosyltransferase (Gilbert-Meulengracht)
Angiotensin-converting enzyme (ACE)
Insertions (I) / Deletions (D) –Polymorphismus im ACE-Gen
12
Häufigkeit
10
ID
8
6
4
II
2
0
0
20
DD
40
Referenzintervalle (Genotyp-abhängig)
ACE Genotyp DD (ca. 25%)
ACE Genotyp DI (ca. 50%)
ACE Genotyp II (ca. 25%)
24-89 U/l
13-66 U/l
7-33 U/l
60
80
100 U/l
Klinische Bedeutung:
Labordiagnostik der Sarkoidose:
S-ACE als Surrogatmarker erhöht
(Polymorphismus beeinflusst Serumkonz.)
Gendefekt: Risikofaktor
kardiovaskulärer Erkrankungen??
α1-Antitrypsinmangel
α1-Antitrypsin:
Akute-Phase-Protein aus Hepatozyten,
Aktivitätshemmung von Serinproteasen
(PMN-Elastase)
>40 Allele
Wildtyp (PiM), Mangelallele: 7% Prävalenz
Wichtige klinisch relevante Mangelallele:
PiZ, PiS, PiNull
Risiko korreliert mit vermind. Antitryp.-Konz.
high risk: PiZZ, PiZNull, PiNullNull
increased risk : PiSZ
Erkrankungen der Leber (Kindesalter):
Sekretionsstörung in Hepatozyten bei PiZZ
Lungenemphysem (Erwachsenenalter):
Folge einer nicht inhibierten PMN-ElastaseAktivität
Hereditäre Hämochromatose (HH)
Prävalenz in Mitteleuropa: 1:400, häufigste autos. rez.
Erbkrankheit
Manifestationsalter: 40-60 Jahre,
Hepatomegalie, Leberzirrhose,
D. mellitus, dunkle Hautpigmentierung
Mutationen im HFE-Gen (Typ 1-Hämochromatose)
Cys 282Tyr (C282Y) homozygot bei ca. 85-95% der HHPatienten, Compound-Heterozygotie mit His63Asp (H63D) bei
3-8% der HH-Patienten (Prävalenz dieses H63D-Polymorphismus: 13%)
Typ 2-Hämochromatose (Hepcidin, Hämojuvelin):
seltene juvenile Form, vor 30. Lebensjahr manifest, geht mit
schwerer Kardiomyopathie und Hypogonadismus einher.
Typ 3: (Transferrinrezeptor 2)
Typ 4: (basolateraler Eisencarrier Ferroportin 1)
Diagnoseweg bei V.a. hereditäre Hämochromatose
Klinische Hinweise und Transferrinsättigung >60% und S-Ferritin >250-300 ng/l
Gen-Test: Cys282Tyr-Mutation, gegebenenfalls His63Glu
_
+
Gentest negativ, aber klin. Verdacht,
bzw. zur Bestimmung des Ausmaßes
des Leberschadens
Hämochromatose gesichert
Leberbiopsie mit quantitativer Messung
des Lebereisengehaltes
Aderlasstherapie
+
Fettstoffwechsel
Lipoproteinstoffwechsel maßgeblich durch
Zelloberflächenrezeptoren mitbestimmt
LDL-Rezeptor bindet neben ApoB100 auch Apo E
Funktion:
Regulation der Cholesterinkonzentration
Cholesterinlieferung für zell. Bedarf, Hormonsynthese
Familiäre Hypercholesterinämie:
LDL-Rez.defekte: >100 bislang bekannte Mutationen
(DNA-Sequenzierung)
ApoB100:
häufigste Mutation: G10699A (Arg3500Gln)
Frequenz: 1 auf 700 Kaukasier
bei Heterozygotie erhöhtes S-LDL-Cholesterin,
gestörte Bindung an LDL-Rezeptor,
Risiko kardiovaskulärer Erkrankungen
Fettstoffwechsel
Hyperlipoproteinämie Typ III:
ApoE:
ApoE2-Homozygotie ist Voraussetzung zur
Ausprägung dieser Fettstoffwechselstörung
Aber:
Nur ein kleiner Teil der Homozygoten erkrankt!!!
Ansonsten korreliert das Allel E2 mit niedrigeren
Cholesterinspiegeln.
ApoE-Allele:
Isoformen:
E2, E3 und E4 durch Mutat. C112R und R158C
E2/2 (1%), E3/3(55%), E4/4, E2/3, E2/4, E3/4 (26%)
Rezeptorbindung
E2 bindet nicht ,
Aktivierung des hepat. LDL-Rezeptors
E4-Partikel bewirken das Gegenteil,
E4 ist somit potentiell artherogen, E2 protektiv
Assoziation mit (late onset) M. Alzheimer für E4
Thrombophiliediagnostik
Faktor V:
G1691A (Arg506Gln), autosom. dominant
(nach Entdeckungsort Faktor V/Leiden genannt)
Effekt : verlangsamte Spaltung durch aktiviertes
Protein C (APC-Resistenz)
Prävalenz: 1:20 für heterozygoten Defekt
Weitverbreitester Risikofaktor für venöse Thrombosen
Heterozygotie: ca. fünf- bis zehnfache Erhöhung des
Thromboserisikos gegenüber der Normalbevölkerung
Homozygotie: Risiko ca. 100fach erhöht
Weitere
Risikofaktoren
(z.B.
Kombinationsdefekte,
Nikotinkonsum, Einnahme oraler Kontrazeptiva) können das
Thromboserisiko zusätzlich erheblich erhöhen.
(zusätzlich
Ausschluss
von
Prothrombin-Genmutation,
Antithrombin III-, Protein C-, Protein S-Mangel).
Pharmakogenetik
PM: poor metabolizer
IM: intermediate metabolizer
EM: extensive metabolizer
UM: ultrafast metabolizer
Beschäftigt sich mit den hereditären
Grundlagen der Unterschiede in einer
Population bezüglich dem Response auf
ein Arzneimittel.
DNA-Sequenzen variieren leicht von
Individuum zu Individuum
zahlreiche Polymorphismen
Genetische und damit häufig auch
Unterschiede in Proteinzusammensetzungen verursachen daher bei
gleicher Medikation verschiedene
systemische Konzentrationsniveaus.
Insgesamt abhängig von
Aufnahme, Absorption, Metabolismus
(Phase I und Phase II Biotransformationsreaktionen), Clearance und Exkretion
Pharmakogenetik
Enzym
Häufigkeit
Medikamente
Probleme
Cytochrom P450
CYP2D6
CYP2C19
CYP1A2
3-10%
2-5%
12%
viele (Antidepressiva
Neuroleptika, Beta-Blocker.....)
Meist verstärkte
Wirkung
N-Acetyltransferase
NAT2
50%
Isoniazid, Sulfapyridin
Dapson, Koffein, Hydralazin
Überempfindlichkeitsreaktionen
Thiopurinmethyltransf.
TPMT
0,3%
Azathioprin, Mercaptopurin
Leukopenie
Dihydropyrimidin-Dehydr. 5% (Het.)
(DPD, DPYD)
5-Fluoruracil
verstärkte Wirkung
Glukose-6-Phos.-Dehydr. 1%
Sulfonamide, Primaquin
Hämolyse
Serum-Cholinesterase
0,04%
Succinylcholin
Apnoe
Ca-Transport im ER
0,005%
Inhalationsanästhetika
Maligne
Hyperthermie
Pharmakogenetik: Cytochrom P450-Isoenzyme
Die Cytochrom P450-Isoenzyme sind Hämoproteine, die im katalytischen
Zentrum Eisen als Zentralatom enthalten.
Als Monooxygenasen katalysieren sie den Metabolismus von zahlreichen
exogenen und endogenen Substraten und werden durch CO stark gehemmt.
Das UV-Absorptionsmaximum des Kohlenmonoxid-Hämkomplexes
liegt bei 450 nm.
CYP :
erste Zahl (z.B. 3):
folgender Buchstabe (A, B, C, D, E) :
letzte Zahl (z.B. 4) :
steht für ein CYP-Gen
Bezeichnung der Genfamilie
Bezeichnung der Unterfamilie
steht für das individuelle Gen
Wichtig für Arzneistoffmetabolismus:
CYP3A4, CYP2D6, CYP2C9, CYP2C8, CYP2C19, CYP1A2, CYP2E1
CYP3A4 stellt mit ca. 30% die Hauptmenge der CYP-Isoenzyme in der
Leber dar und wird auch in den Epithelzellen des Dünndarms exprimiert.
Pharmakogenetik: z.B. CYP 2D6
CYP2D6*3 („extensive (rapid)
Metabolizer“).
CYP2D6*3, *4, *5, *6 („poor
(slow) Metabolizer (PM)“) sind in
98% aller Fälle an einem Verlust der
CYP2D6-Aktivität beteiligt. Zwei
Mangelallele müssen allerdings
nachgewiesen werden.
CYP2D6*4, *10, *41
(„intermediate Metabolizer“) in
Verbindung mit einem PoorMetabolizer-Allel.
Genduplikationen führen zu
„Ultrafast Metabolizer“.
Betroffene Pharmaka:
Antidepressiva (s.o.) (z.B. Amitriptylin),
Neuroleptika (z.B. Haloperidol),
Antiarrhythmika (z.B. Propafeno
Siehe (alte)MHH-Homepage/MHH-Internes/
CYP-Interaktionen
sowie
www.mh-hannover.de/analysenspektrum.html
(auf Link „Pharmakogenetik“ (pdf) klicken)
Pharmakogenetik: z.B. CYP 2D6
200
40
inpatient treatment days
45
150
5
100
50
0
N=
25
30
non-polymorphism
polymorphism
EM
PM/IM
CYP-abhängige
Schwierigkeiten bei der
medikamentösen
Therapie psychiatrischer
Patienten spiegeln sich
sogar in der stationären
Behandlungsdauer wider.
Höhere
Behandlungskosten
Mutationsnachweise in der
molekulargenetischen Tumordiagnostik
•Keimbahnmutationen
•somatische Mutationen
Tumordiagnostik
Nachweis von Keimbahn-Mutationen
Familiäre Disposition bei Krebserkrankungen:
Hereditäre Tumoren: ca. 2% aller Krebserkrankungen
Hinweise auf erbliche Disposition für Tumoren:
Familie
Zwei oder mehr Verwandte ersten Grades mit demselben Tumor
Zwei oder mehr Verwandte mit seltenen Tumoren
Evtl. drei oder mehr Tumoren in typischer Assoziation (z.B. Mamma und Ovar)
Patient
Multiple Tumoren in einem Organ oder in typischer Assoziation
Assoziation von Tumoren mit anderen genetischen Auffälligkeiten oder
kongenitalen Defekten
Tumoren an ungewöhnlichem Ort oder in frühen Lebensjahren
Tumordiagnostik
Nachweis von Keimbahn-Mutationen
Erkrankung
Gen
Fam. Retinoblastom
Fam adenomatöse Polyposis (FAP)
Heredit. kolorektale Karzinome o. Polyposis
Fam. Brust-/Ovarialkrebs
Fam. Brustkrebs
Li Fraumeni Syndrom
Multiple endokrine Neoplasie (MEN) Typ1
Fam. Medulläres Schilddrüsenkarzinom
MEN Typ 2A und 2B
Fam. Melanom
Neurofibromatose Typ 1
Neurofibromatose Typ 2
Gorlin Sydrom, Basalzellkarzinom
Von Hippel-Lindau Syndrom
Fam. Wilms-Tumor
rb
apc
mlh 1
brca 1
brca 2
p53
men 1 (menin)
ret
p16
nfl 1
nfl 2
ptch
vhl
wt 1
Tumordiagnostik
Nachweis von Keimbahn-Mutationen
Diagnostische und präventive Maßnahmen, die den Nachweis
einer genetischen Tumordisposition rechtfertigen:
Maßnahme
Beispiele
Präventive Diagnostik
Koloskopie bei HNPCC und FAP
Vermeidung invasiver diagnost.
Maßnahmen bei Ausschluss einer
disponierenden Mutation
Ausschluss eines Risikos bei
Mitgliedern von HNPCC- und FAPFamilien
Präventive therapeutische Maßnahmen Thyreodetektomie bei Patienten aus
MEN Typ II-Familien
HNPCC: Hereditäres nicht-polypöses kolorektales Karzinom
FAP:
Familiäre adenomatöse Polyposis Coli
MEN: Multiple endokrine Neoplasie
Tumordiagnostik II
Nachweis von somatischen Mutationen
Genetische Instabilität in malignen Tumoren:
Entweder kausal für Tumorgenese verantwortlich,
und/oder für Tumorprogression verantwortlich!
Wichtige Gene: p53, k-ras
Mutationsanalyse zur Früherkennung von Tumoren.
Tumorzellnachweise in Körperflüssigkeiten und Stuhl.
Problem: Vielzahl möglicher Mutationen, Nachweis
eines mutierten Allels unter einem Überschuss von
Wildtyp-Allelen.
Tumoren: z.B. Kolon-Karzinom, Pankreas-Karzinom
Tumordiagnostik II
Nachweis von somatischen Mutationen
p53
Am häufigsten mutiertes Tumorgen (Tumorsuppressorgen
kodiert für Transkriptionsfaktor). Mutationen (meist Punktmutationen/missense) fast ausschließlich im Bereich der
DNA-bindenden Domäne (Exone 4-8).
Mutiertes P53-Protein häufig mit verlängerter Halbwertszeit,
immunhistochemisch im Tumorgewebe nachweisbar.
Mutationen bzw. zelluläre Akkumulationen korrelieren mit
geringerer Überlebenszeit des Patienten. (z.B. Mamma-Ca:
unabhängiger prognostischer Parameter)
Tumordiagnostik III
Nachweis von somatischen Translokationen
(Tumorgene an Bruchstellen von Chromosomen)
Aus technischen Gründen Nachweis von Chromosomenanomalien in
Tumoren hämatopoetischer Zellen leichter. Große Mehrzahl bisher
gesicherter Chromosomenanomalien bei Leukämien und Lymphomen.
Gen
Rearrangement
Erkrankung
Rearrangements, kodierende Sequenz exprimiert und nicht verändert
BCL2
t(14;18)(q32;q21)
follikuläres Lymphom
Rearrangements, Hybridgene
BCR-ABL
t(9;22) (q34;q11)
CML, B-ALL
Philadelphia-Chromosom zytogenetisch bei bis zu 90% der CML nachweisbar!!!
Nachweis mittels PCR /RT-PCR mit Primern von beiden Seiten
der chromosomalen Bruchstelle.
Tumordiagnostik IV
Nachweis/Quantifizierung zirkulierender Tumorzellen
Nachweis residualer Tumorzellen im peripheren Blut,
Knochenmark oder Blutprodukten über Marker (Transkripte,
Methylierungsgrad der DNA), welche nicht in hämatopoetischen
Zellen vorhanden sind.
Target:
meist Gene klassischer Tumormarker: z.B.
AFP
PSA
CK19
alpha-Fetoprotein
Prostataspezifisches Antigen
Zytokeratin 19
Nachweis mittels RT-PCR o. quantitativer RT-PCR
Nachweisgrenzen: ca. 1 Tumorzelle unter 106 Zellen
Methylierungsgrad der DNA: (neuerer Trend). DNA von Tumoren ist häufig
5mC).
(spez. in Promorbereichen) hypermethyliert (C
Nachweis des Methylierungsgrades von ausgewählten Indikatorgenen
zum sensitiven Nachweis einer Metastasenbildung.
Experimentelle Doktorarbeit
Gemeinschaftsprojekt der Abt. Gastroenterologie und der Klinischen Chemie
Matrixdegradation bei chronischen Lebererkrankungen
Funktionelle Rolle des MMP/TIMPSystems für die hepatische
Regeneration und die Entwicklung
chronischer Organschäden an der
Leber. Adenovirale hepatische
Überexpression von MMPs im
Mausmodel.
Techniken:
Immunoassays, Western-Blot
in situ-Techniken, (quantitative) RT-PCR,
PCR, Genexpression, Genotypanalyse,
rekombinante Proteinherstellung in
prokaryonten und viralen Expressionssystemen, molecular cloning
Kontakt: Prof. Dr. Ralf Lichtinghagen Tel: 3940; Pieper: 74-2272
Bei Interesse an wissenschaftlichem Arbeiten ist ein Info-Gespräch jederzeit möglich
November 2006