Pharmakogenomik Dr. Peter Ahnert [email protected] http://www.uni-leipzig.de/~ahnert 07.11.2007 1/37 Übersicht • Definition “Pharmakogenomik” • Pharmakogenomik und Wirkstoffentwicklung • Identifizierung der genetischen Komponente einer Erkrankung • Assoziationsstudien • Genetische Variabilität • Struktur von Assoziationsstudien • Kandidatengen-Selektion • SNP-Auswahl • Genotypisierung • Datenanalyse • Genomweite Studien • Beispiele 2/37 Pharmakogenomik – Eine Definition • Pharmakogenomik verbindet Pharmakologie (genomweiter) Genetik (Genomik). mit • Verbindet die Erbanlagen von Individuen mit deren Suszeptibilität für Erkrankungen und ihrer Reaktion auf Wirkstoffe und Behandlungsmethoden um die Entwicklung und Anwendung neuer Wirkstoffe und Therapien zu unterstützen. Basiert auf humaner genetischer Variabilität in: • • • • Krankheitsätiologie and Pathogenese Wirkstoff - Target Interaktionen Bioverfügbarkeit von Wirkstoffen Wirkstoffmetabolismus 3/37 http://www.ornl.gov/hgmis/medicine/pharma.html Pharmakologie zu Pharmakogenomik Pharmakologie: Entwicklung und Bereitstellung von Wirkstoffen, die es ermöglichen gesund zu werden oder zu bleiben. Probleme: • Wirkstoffentwicklung ist teuer • Rationale Wirkstoffentwicklung ist schwierig • Wirkstoffe werden für “Durchschnittsbürger”entwickelt – 10 - 70% non-responders – ~ 100.000 Todesfälle in den USA pro Jahr – Frauen – Kinder Lösung: Wirkstoffe für bestimmte Gruppen von Individuen entwickeln und anwenden; Verlangt die Zuordnung von Individuen zu diesen Gruppen. Pharmakogenomik!? 4/37 Pharmakogenomik & Wirkstoff Entwicklung Ziele: • Verständnis von Krankheitsmechanismen Drug Targets • Biomarker • Marker für Toxizität und Wirksamkeit • Marker für Differentielle Diagnostik Unterstützung von Therapie-Entscheidungen 5/37 Pharmakogenomik & Wirkstoff Entwicklung Grundlagen- & Pharmazeutische Forschung: Biologie & Klinische & Biologische Medizinische Krankheitsmodelle Forschung Identifizierung von Drug Targets Identifizierung von „Krankheitsgenen“ & -mechanismen Präklinische Forschung: Wirkstoff-Screening & KandidatenIdentifikation in vitro Validierung in vivo Validierung Toxikologische Analyse Klinische Studien: Phase I Phase II Phase III Phase IV Sicherheit, Wirksamkeit, Dosisfindung 6/37 Individualisierte Medizin Rationale für Pharmakogenomik Alle Erkrankungen beruhen zumindest teilweise auf Veranlagung … Umwelteinflüsse Erbanlagen Hämophilie Down-Syndrom HFI Diabetes Asthma Rheumatoide Arthritis Infektionskrankheiten ... Lungenkrebs Motorradunfall Knochenbrüche 7/37 Spielen Genetische Ursachen eine Rolle? • Zwillings und Geschwisterstudien • Genomweite Kartierungsstudien • Mechanistische Studien • Kandidaten-Gen Assoziationsstudien • Tiermodelle Zur Identifizierung von: - Im Krankheitsgeschehen implizierten biologischen Prozessen - Wirkstoff Targets - Diagnostischen Markern - Toxikologischen Markern 8/37 Zwillingsstudien 1 3 2 4 1 … Einfluss der Umweltbedingungen 2 … Einfluss zufälliger Größen 3 … Einfluss von Umwelt und Genen 4 … Einfluss der Veranlagung Durch den Vergleich der Häufigkeit des Auftretens der Krankheit bei Geschwistern 9/37 unter verschiedenen Bedingungen lässt sich die Rolle der Veranlagung abschätzen. Genomweite Kopplungskartierung 10/37 Mechanistische Untersuchungen 11/37 Kandidatengen-Assoziationsstudien Komplexe Phänotypen Morphologie Umwelt Proteom Expression: Gene, ncRNA Epigenetik Genetische Variation 12/37 Spielen Varianten eines Gens eine Rolle in einer Erkrankung? Variable Elemente des Genoms • Chromosomenaberrationen • Mutationen • Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) • Insertionen und Deletionen • Copy Number Variation • Repeats (meist nicht kodierend) - Megasatelliten (mehrere kbp, Blocks bis 100e kbp) - Satelliten (5-171 bp, - Minisatelliten (6-64 bp, - Microsatelliten (1-4 bp, Blocks 100 kbp bis Mbp) Blocks 0,1 – 20 kbp) Blocks bis 150bp) • Repetitive kodierende DNA • “Variable Number Tandem Repeats” (VNTRs) • “Transposable Elements” 13/37 SNPs und Humane Genetische Variabilität ~ 3 Mrd. Basenpaare ~ 99.9 % Identität zwischen Individuen ~ 3 Millionen Basenunterschiede zwischen Individuen SNP... Single Nucleotide Polymorphism ACGTCTATGCATAGCTAG TGCAGATACGTATCGATC ACGTCTATTCATAGCTAG TGCAGATAAGTATCGATC 14/37 Aufbau Genetischer Assoziationsstudien Analysis & Gene Selection Clinical-Biological System Candidate Genes SNP Retrieval Clinical Problem Clinical Study Candidate SNPs SNP Evaluation and Selection SNP Short List Assay Design & Genotyping Clinical Data Genotype Data Statistics / Data Mining Pattern Recognition Diagnostics Associations Verification Studies Verification Studies Research into Causations Drug Targets Personalized Medicine 15/37 Identifizierung von Kandidatengenen Genetische Kartierung “Krankheits Loci” Funktionelle Biologie/Biochemie Proteomik Genfunktion Kandidatengene Genexpression Studien in Tiermodellen 16/37 Datenbanken mit Information zu Gen-Eigenschaften SERPINA1 SERPINA3 C9 CTSD MCP IGF2 CST3 PTGS1 PTGS2 PLA2G1B IGFBP3 GAD1 PROC SERPINC1 Umfassende (automatisierte) Literatur Analyse HTATIP IDDM2 CD59 C5 CTSL CD38 CTSB C2 IGF1 ICA1 CD22 DAF HFE IGFBP2INS LEP BCGF1 C3 A2M CR1 NOVA2 IL10RA PEPD DPP4 ITGA6 SPN POLA2 UBTF ITGA4 POLG PTGDR CP C6 SLC3A2 SLC25A4 TIMP1 MMP2 RCD-8 B2M SSB ITGB1 CD68 ITGB2 CALR MMP13 ITGAX MMP9 HNRPC ATM IL2RB PECAM1 PTPRC GYPB FLG ICAM2 MMP16 ITGAM MMP14 CD44 HSMCR30 IL1B MMP1 TIMP2 CD8A SELP CAST MTX1 TNFRSF5CD4 SELL LIF TNFSF5 SSA1 CD80 GUSB ICAM1 KITLG IL2RA ITGAL TIMP3 PLG CSF3 VEGF IL1RN IL10 IL2 CRP MMP3 SERPINE1 ALPP SELE ICAM3 SIASDIL6 IL1A IL4 VCAM1 SERPINB2 OSM TFRC CD2 LTA EGF CD14 CD86 CRAT CDR3 CDR1 MPO SF CD28ITGA1 IL8 TNF CD69 KPNB2 EPO ESR1 CSF2IFNG CD57 TRH LYZ IL11 TNFRSF1A IL7 CTLA4 IL13 CD58 PRL IL15 CAT IL5 TNFSF6 TNFRSF1B CSF1 IL3 FCER2 ITGA5 IL17 POMC CTSG CRH CD19 CR2 SCYA5 PRTN3 IL6R IL18 TRB@ NCAM1 IL5RA FPR1 SULT2A1 IL1R1 MME MIF TNFRSF6 CD33 MAPK14 SCYA2 IL18BP FN1 MAPK8 SCYB10 MAPK1 ANPEP VTN CXCL10 IL4R SCYB5 SR-BP1 SAA4 SAA1 LOC64167 CCR4 ACP5 TNFRSF11B HLA-B CCR3 CXCL9 SAA2 CALCR HLA-A TNFSF11 LAP3 CCR6 CXCL12 CXCR3 TNFRSF11A HLA-DPB1 HLA-DPA1 CXCR4 HLA-DQA1 CCR5 CCL5 HLA-DRB1 ALB MMP8 FUT2 NXF1 TAP1 CCR2 SDF1 TAP2 HLA-DQB1 CCR7 CCL2 CCR1 TNFRSF12 18/37 Aufbau Genetischer Assoziationsstudien Analysis & Gene Selection Clinical-Biological System Candidate Genes SNP Retrieval Clinical Problem Clinical Study Candidate SNPs SNP Evaluation and Selection SNP Short List Assay Design & Genotyping Clinical Data Genotype Data Statistics / Data Mining Pattern Recognition Associations 19/37 Identifizierung, Bewertung und Auswahl von SNPs Ausgewählte SNPs sollten: - Die häufigsten Varianten eines Gens detektieren - Mit hoher Wahrscheinlichkeit Einfluss auf die Funktion des Genproduktes haben 20/37 SNPs zur Detektion Wichtiger Genvarianten Die Haplotyp-Struktur des Genoms: 21/37 Barrett JC, Fry B, Maller J, Daly MJ. Haploview: analysis and visualization of LD and haplotype maps. Bioinformatics. 2004 Aug 5 Aufbau Genetischer Assoziationsstudien Analysis & Gene Selection Clinical-Biological System Candidate Genes SNP Retrieval Clinical Problem Clinical Study Candidate SNPs SNP Evaluation and Selection SNP Short List Assay Design & Genotyping Clinical Data Genotype Data Statistics / Data Mining Pattern Recognition Associations 23/37 Genotypisierungsmethoden • Sequenzierung • Minisequenzierung • Pyrosequenzierung Allelspezifische Primerextension • Single Base Extension (SBE) • TaqMan • Invader Allelspezifische Enzymreaktion • MLPA • Hoch- und niedrigdichte Oligo-DNA Hybridiserungsarrays Allelspezifische Hybridisierung Die verschiedenen Detektionsmethoden basieren vor allem auf: - Fluoreszenz - Massenspektrometrie - Chemolumineszenz 24/37 - Fluoreszenzpolarisation Genotypisierung - Single Base Extension C G Biotin Single base Extension A ddNTPs SBE primer PCR product Product Purification SBE primer Streptavidin Photocleavage T G UV SBE primer +G MALDI-TOF MS 25/37 Aufbau Genetischer Assoziationsstudien Analysis & Gene Selection Clinical-Biological System Candidate Genes SNP Retrieval Clinical Problem Clinical Study Candidate SNPs SNP Evaluation and Selection SNP Short List Assay Design & Genotyping Clinical Data Genotype Data Statistics / Data Mining Pattern Recognition Associations 26/37 Daten Analyse – Wie sehen die Daten aus? Side-effect 1 Side-effect 2 Side-Effect 3 Clinical Background 1 Clinical Background 2 Patient SNP 1 SNP 3 SNP 4 SNP 5 SNP 6 1 2 3 4 5 6 7 4 10 3 2 4 10 1 6 5 3 8 2 7 3 5 3 7 5 8 2 9 1 3 2 8 8 8 3 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 1 2 3 4 5 6 7 A A A A A B A A AB B AB A A A B B AB B A A B AB B B B AB B B A A A A A A A A A B B B A B SNP 2 Drug Efficacy Genetische Daten Patient Klinische Daten 27/37 Analyse Einzelner Polymorphismen • Vergleich von Allelfrequenzen mit Chi-Quadrat Analyse • Vergleich von Genotypfrequenzen mit Chi-Quadrat • Test auf Hardy-Weinberg-Gleichgewicht (HWE) • Vererbung berücksichtigende Tests • Transmission Disequilibrium Tests (TDT) • Affected Family Based Controls (AFBAC) • Genetisches Relatives Risiko (GRR) • ... 28/37 Musteranalysen “Clinical Bar Codes” “Genetic Bar Codes” Patient 1 Patient 2 Patient 3 • Schrittweise Progressive Regression • Klassifikation (Support Vector Machines, Neuronale Netze) • Mustererkennung 29/37 Herausforderungen bei der Analyse der Genetik Polygener Phänotypen • Phänotyp-Bestimmung • Sehr geringe Penetranz einzelner Genvarianten (Common Disease – Common Variant vs. Common Disease – Rare Variant ) • Geringe Penetranz von Haplotypen • Genomweite Variantenmuster (GVPs) • GVP-Subgruppen für einen Phänotyp • Erreichen genomweiter statistischer Signifikanz 30/37 Genomweite Studien 31/37 Bekannte Assoziationen Gene Disease/Field Effect/Comment Deep-vein Coagulation factor 5 thrombosis, etiology Activated protein C (APC) limits clot formation by inactivating factor V. The phenotype heterozygosity or homozygosity for a single point mutation in the factor V gene (at nucleotide position 1,691, G-->A substitution), synthesis of a factor V molecule (FV Q506, or FV Leiden) that is not properly inactivated by APC Thiopurine Smethyltransferase Leukemia, drug response Adverse drug reactions, metabolism, Three mutant alleles, TPMT(*)2, TPMT(*)3A and TPMT(*)3C, more adverse effects in TPMT-deficient heterozygous patients on thiopurine medications (e.g. 6-mercaptopurine against childhood acute lymphoblastic leukemia, lowering dose 15-fold works!) Apolipoprotein E Alzheimer's, susceptibility, drug response Her2 Breast cancer, susceptibility, drug response Literature Nature 1994 May;369(6475):647 Pharm Res 1999 Mar;16(3):342-9, Pharmacology 2000 Sep;61(3):136-46 Susceptebility to disease, response to cholinesterase inhibitor, Proc Natl Acad Sci The results strongly support that apoE4 plays a role in U S A 1995 cholinergic dysfunction associated with AD, may be a Dec;92(26):12260prognostic indicator of poor response to therapy with 4 acetylcholinesterase inhibitors (tacrine) Growth factor receptor, multiple copies lead to overexpression (~30% of breast cancer patients), higher risk for breast cancer and harder to treat traditionally, Trastuzumab (Herceptin, Genentech) is a specific Ab against her2 product Semin Oncol. 2000 Dec;27(6 Suppl 11):46-52 (Review) 32/37 Pharmakogenetischer Test Warfarin - “Blutverdünner” z.Bsp. bei Schlaganfallrisiko - Stärkere Reaktion bei ca. 1/3 der Patienten - 25 % Varianten im Vitamin K Epoxidreduktase Komplex 1 Gen (VKORC1) - 10 % Varianten im Cytochrom P450 (CYP2P9) - Ca. 2 Mill neue Patienten pro Jahr - Individuelle Anpassung der Dosierung durch “Trial & Error” - Alter - Gewicht - Ernährung - Medikamente - Genetik - FDA: genetische Tests könnten - Pro Jahr 85.000 Blutungsereignisse verhindern - Pro Jahr 17.000 Schlaganfälle verhindern - Am 17.09.2007 durch die FDA in den USA zugelassen 34/37 35/37 Phänotyp - Genotyp Analyse der Rheumatoiden Arthritis • Autoimmunerkrankung: Progressive Gelenkzerstörung • Etwa 1% der Bevölkerung betroffen • Lebenserwartung um 5 - 10 Jahre reduziert • Ätiologie nicht genau bekannt • Genetische Suszeptibilität 30-60% 36/37 Warum sollte die RA-Genetik untersucht werden? Verständnis der biologischen Prozesse in Ätiologie und Pathogenese Neue Behandlungsstrategien Frühdiagnose Therapieentscheidungen Differentialdiagnose Voraussage der Progression 37/37 Rheumatoid Arthritis - Etiology and Pathogenesis genetic predisposition other risk factors unknown antigens T-cells & Bcell activation Synovial membrane Activation Adhesion Permeabilization Migration of inflammatory cells Cytokines Mediators Pannus formation Production of Collagenases (MMPs) by TNF IL-1 fibroblasts, chondrocytes and osteoclasts Lining cells T-cells, M Joint destruction 38/37 Dinarello C.A., Moldawer L.L. Amgen 1999, Proinflammatory and Anti-inflammatory Cytokines in Rheumatoid Arthritis; with Modifications by Ulrich Sack Kopplungs-Loci und Kandidatengene in RA IL5R CCR5 Linkage CD8A Likely IL18R1 IL6R Il2 PRG4 Linkage CTLA4 Possible PRL HLA HSPA1L; LTA; LTB, MICA No IL6 linkage CRH CSF2;Il4; Il5; Il13; IRF1 39/37 Unsere Bisherigen Resultate Suszeptibilitätsanalyse rheumatoide Arthritis: • ~180 SNPs in ~50 Kandidatengenen • Genotypisierung in 500 Proben >90.000 Genotypen • Kapazität: ~3000 Genotypen pro Tag • >98% erfolgreiche Genotypisierung • <0.1% falsche Bestimmungen (PedCheck) • mehrere mögliche Assoziationen einzelner SNPs • einige Assoziationen konnten bestätigt werden • Geninteraktionsanalyse läuft 40/37 Genotypisierung - TaqMan 41/37 Genotypisierung - Weitere Techniken … Invader Assay www.twt.com Pyrosequencing www.pyrosequencing.com 42/37