Enzymatische Aktivierung von Auxinen und ihre

in einer Weise, die mit den Befunden an Ribonucleasen etwa vergleichbar sind. Deshalb verdient um so
mehr Beachtung, daß der von uns erstmalig durchgeführte Vergleich der LDH's aus verschiedenen Ge-
titative Unterschiede könnten bei b und c in der aus
der in Abb. 4 ersichtlichen Weise bestehen. Von den
Komponenten IV und V stand zu einem Vergleich zu
wenig Material zur Verfügung.
weben ein und desselben Tieres (Herz und Skelett-
muskel der Ratte, Abb. 3) die stärksten Differenzen
Schlußbetrachtung
erkennen läßt. Dies läßt auf eine organspezifische
Bildung dieser Enzyme schließen. Die Peptidmuster
der heterogenen Herzmuskelenzyme, die sich im
elektrischen Feld sehr deutlich unterscheiden, weisen
hingegen äußerst große Übereinstimmung auf. Hieraus darf vielleicht gefolgert werden, daß die Ladungsunterschiede der Komponenten weniger auf
Unterschiede in der Primärstruktur als vielleicht
durch das Vorliegen von mehr oder weniger Säureamid-Seitenketten bedingt sein dürften.
Unsere vergleichenden Analysen lassen auf den
ersten Blick keine bedeutenden Unterschiede zwischen den verschiedenen Lactat-Dehydrogenasen erkennen. Hält man sich jedoch vor Augen, daß auch
im elektrischen Feld deutlich verschieden wandernde
Hämoglobine nur äußerst geringfügige Unterschiede
in ihrer Primärstruktur aufweisen 12, so wird man
auch den von uns aufgefundenen Differenzen eine
gewisse Bedeutung zumessen müssen. Neuerdings
sind von A N F I N S E N und Mitarbb. 13 ' 14 vergleichende
Untersuchungen an Ribonucleasen verschiedenen
Ursprungs bekanntgegeben worden. Dort bestehen
zwischen den Pankreasenzymen von Schwein und
Rind nur kleine, zwischen denen von Rind und Schaf
deutliche Unterschiede. Die von uns untersuchten
Enzyme aus gleichartigen Geweben verschiedener
Tiere unterscheiden sich in ihrer Zusammensetzung
Herrn Dipl.-Chemiker H. L . R E T T I G danken wir für
seine geschickte Mitarbeit bei der Reindarstellung des
Rattenherzenzyms.
12
V. M. INGRAM, Biochim. biophysica. Acta [Amsterdam] 28,
13
C . B . ANFINSEN,
539
J.
14
[1958].
S . E . G . ÄQUVIST,
biol. Chemistry
A . M . KATZ,
234,
1118
W . J . DREYER
U.
J . P . COOKE
U.
B . JÖNSSON,
J.
biol. Che-
[1959].
C.
B . ANFINSEN,
mistry 234, 2897 [1959].
Enzymatische Aktivierung von Auxinen
und ihre Konjugierung mit Glycin
V o n
M .
H .
ZENK
*
Aus dem Dept. of Horticulture, Purdue University, Lafayette, Ind. U.S.A. **
( Z . Naturforschg. 15 b , 4 3 6 — 4 4 1 [1960] ; e i n g e g a n g e n am 2. M a i 1960)
Octanoate-thiokinase, an enzyme from liver mitochondria, was found to catalyze the formation of
auxin-CoA esters with several different auxins in the presence of adenosinetriphosphate and
coenzyme-A. Evidence was provided to show that indoleacetyl-adenosinemonophosphate was an intermediate in the formation of indoleacetyl-CoA. This intermediate was supplied to the enzyme as the
synthetic anhydride, and could lead either to the formation of indoleacetyl-CoA when supplied with
CoA or to the formation of indoleacetic acid plus adenosinetriphosphate when supplied with pyrophosphate. Indoleacetyl-CoA was shown to be the intermediary product in the enzymatic formation of
indoleacetyl-glycine. 2.4-Dichlorphenoxyacetic acid and a-naphthylacetic acid were not measurably
conjugated with glycine under the same conditions. The results are discussed as to their implications
in auxin metabolism in plants.
Seit der Entdeckung, daß es sich bei dem pflanzlichen Zellstreckungshormon um /?-Indol-3-essigsäure (IES) handelt, fanden die morphologischen
und physiologischen Aspekte des Einflusses dieses
Auxins auf Pflanzen großes Interesse, sein Schicksal in pflanzlichen oder tierischen Organismen fand
dagegen wenig Beachtung. Daß IES mit Glycin im
Tier unter Bildung von Indolacetylglycin (Indolacetursäure) konjugiert wird, war frühzeitig bekannt 1. Der Stoffwechsel von Auxinen in Pflanzen
wurde überraschenderweise erst vor kurzem in einer
Reihe von Arbeiten des kanadischen Arbeitskreises
* Botanisches Institut der Universität, München 19, Menzinger Straße 67.
** Die Untersuchungen wurden von 1956 —1958 durchgeführt.
Herrn Prof. Dr. A. C. LEOOLD danke ich besonders herzlich
für die Überlassung des Themas und die immerwährende
Förderung und Hilfe.
L . E W I N S U . H. L A I D L A W , Biochem. J . 7 , 18 [1913].
1
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um A N D R E A E und G O O D
näher untersucht. Sie
konnten zeigen, daß Pflanzen von außen zugefügtes
IES teilweise mit Asparaginsäure konjugieren, teilweise in Indolacetamid überführen. Diese Konjugierung von IES mit Aminosäuren verdient Interesse,
da der Energieinhalt der Peptidbindung über dem
der freien Säure liegt und somit eine Aktivierung
der Säure vielleicht in Analogie zur Hippursäurebildung voraussetzt.
2 - 4
Das Ziel dieser Arbeit war es, die Aktivierung
von verschiedenen Auxinen, besonders die des
Heterocyclus IES mit Oktanoylthiokinase (OTK)
und ebenso die Konjugierung der Auxin-CoA-Verbindung mit Aminosäuren, zu studieren. Da aus
Pflanzen OTK bisher noch nicht isoliert wurde und
schon deren Demonstration im Homogenat auf erhebliche Schwierigkeiten stößt, obwohl das Enzym,
das die ^-Oxydation der Fettsäuren einleitet mehrmals
in intakten Pflanzen und in Mitochondrien indirekt
nachgewiesen wurde 5 ' 6 , sahen wir uns veranlaßt
OTK aus Kalbsleber-Mitochondrien zu verwenden.
Unser hauptsächliches Interesse richtete sich also
darauf, die Reaktion von IES mit Adenosintriphosphat (ATP) und Coenzym A (CoA) nach folgendem Reaktionsmechanismus zu demonstrieren:
IES + ATP^IES-AMP + PP
(1)
IES-AMP + CoA ^ IES-CoA + AMP
(2)
PP
= Pyrophosphat
IES-CoA = Indolacetyl-Coenzym A
IES-AMP = Indolacetyl-Adenosinmonophosphat.
Material und Methoden
OTK wurde aus Kalbsleber-Mitochondrien bereitet7.
Eine Präparation, die das aktivierende Enzym sowie
Glycin-Ar-Acylase enthielt, wurde durch Fraktionierung
des Mitochondrien-Extraktes mit Ammoniumsulfat in
der Kälte zwischen 42 und 46% Ammonsulfatsättigung
hergestellt; sie wird künftig Am46 bezeichnet.
Die chlorierten Phenoxyessigsäuren waren ein Geschenk der American Paint Company, für das herzlich
gedankt wird.
Zur quantitativen Bestimmung von Indolacetursäure
wurde die von C H A N T R E N N E 8 ausgearbeitete Methode für
2
3
4
5
6
ANDREAE
u. N. E. G O O D , Plant Physiol. 30, 3 8 0
[1955].
N. E . G O O D , W. A . A N D R E A E u. M . W . VAN YSSELSTEIN, Plant
Physiol. 31, 231 [1956].
W . A . ANDREAE
U. N. E. G O O D , Plant Physiol. 32, 566
[1957].
P. K. STUMPF U. G. B A R B E R , Plant Physiol. 3 1 , 3 0 4 [ 1 9 5 6 ] .
W . A .
Vgl.
C . H . FAWCETT,
H . F . TAYLOR,
R. L. WAIN
U.
F . WIGHT-
MAN, in: The Chemistry and mode of action of plant growth
substances. Butterworth Sei. Publ., London 1956, S. 182.
Hippursäure übernommen. Pyrophosphat wurde durch
Zugabe von Pyrophosphatase und Messung des Orthophosphates9 oder mittels der direkten Methode von
FLYNN
und Mitarbb.10 bestimmt, Sulfhydrylgruppen
nach M A H L E R und Mitarbb.7 an 0,2-ml-Proben. IES
wurde quantitativ mit dem SALKowsKi-Reagenz11 gemessen. Zur IES-CoA-Bestimmung wurde zuerst IES
quantitativ mit Essigester entfernt und die zurückgebliebene wäßrige Phase, die den Thioester enthielt, mit
S a l k o w s k i - Reagenz versetzt und die sich entwikkelnde violettblaue Farbe des IES-CoA-Komplexes nach
9 min bei 560 mju mit einem DU-Spektralphotometer
der Fa. Beckmann gemessen. Eine Eichkurve wurde mit
Indolacetylpantethein aufgestellt, da ja sämtliche dargestellten Thioester von IES nach Versetzen mit S a l k o w s k i - Reagenz die Eigenschaft zeigen, an Stelle
der üblichen roten Farbe (max. 520 m//) eine blauviolette (max. 560 m//) zu entwickeln 12. 0,1 //Mol IESCoA ergab unter diesen Bedingungen eine Extinktion
von 0,180 DU-Einheiten.
IES-AMP wurde in ähnlicher Weise bestimmt. Nur
erfolgte die Extraktion des IES wegen der Zersetzlichkeit des Adenylates bei 0 °C. Die Extinktionen von
äquimolaren Mengen IES und IES-AMP waren nach
Versetzen mit S a l k o w s k i - Reagenz bei 520 m/u dieselben.
Ergebnisse
1. E n z y m a t i s c h e A k t i v i e r u n g v o n
Auxinen unter P y r o p h o s p h a t a b s p a l t u n g aus ATP.
m
Um die Aktivierung von Auxinen nachweisen zu
können, wurden verschiedene Wuchsstoffe mit OTK,
ATP und CoA inkubiert und das bei dieser Reaktion in stöchiometrischen Mengen zum gebildeten
Thioester zu erwartende Pyrophosphat bestimmt.
Als Produkt dieser Umsetzung sollte das jeweils gebildete Auxinyl-CoA-Derivat im Testansatz akkumulieren. Weiterhin sollten die Säuren aus der Phenoxysäure (PES)-Reihe mit verschiedener Chlorierung daraufhin untersucht werden, ob sich etwaige
Unterschiede zwischen Chlorierung und AuxinAktivität13 auf Grund des verschiedenen Aktivierungsgrades ergeben würden.
7
8
9
10
H . R . M A H L E R , S. J . W A K I L U . R . M . B O C K , J . biol. Chemistry 2 0 4 , 4 5 3 [ 1 9 5 3 ] .
Vgl. H . CHANTRENNE, in: COLOWICK U . K A P L A N , Methods in
Enzymology II, 3 4 6 ( 1 9 5 5 ) .
G. M. KELLERMANN, J . biol. Chemistry 2 3 1 , 4 2 7 [ 1 9 5 8 ] .
R . M. F L Y N N , M. E . JONES U . F . L I P M A N N , J . biol. Chemistry
211, 791
11
11
12
13
[1954].
Y . M . TANG
U.
J . BONNER,
Arch. Biochem. Biophysics
13,
[1947].
M. H. ZENK, Masters thesis, Purdue University 1958.
Vgl. A. C. LEOPOLD, Auxins and plant growth, University
of Cal. Press 1955.
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Tab. 1 zeigt, daß sowohl die heterocyclische IES
als audi NES und die Säuren aus der Phenoxyessigsäure-Reihe aktiviert werden. Die Menge an freigesetztem Pyrophosphat war der Menge an eingesetztem Enzym für IES als Substrat in einem Bereich von 35 jug bis 350 jug OTK proportional. Für
die Phenoxysäuren zeigte sich, daß die Monochlorierung der PES, gleichgültig in welcher Position, die
Aktivierung auf etwa 57%, bezogen auf PES, herabdrückt, während Disubstituierung die Aktivierung
noch stärker beeinflußt.
Säure
2
3
4
2.3
2.4
2.5
2.6
3.4
3.5
-CI
-CI
-CI
D-Cl
D-Cl
D-Cl
D-Cl
D-Cl
D-Cl
jxMol P P
freigesetzt
IES
NES
PES
PES
PES
PES
PES
PES
PES
PES
PES
PES
% von PES
0,27
0,17
0,43
0,23
0,25
0,26
0,17
0,10
0,10
0,03
0,06
0,04
System
100
54
58
60
40
23
23
7
14
9
Der Einfluß eines „orthoposition effects" auf die
Aktivierung läßt sich nicht feststellen. Die Minderung in der Aktivierungsgeschwindigkeit mit steigender Anzahl der Substituenten kann sicherlich
auf sterische oder elektronische Faktoren zurückgeführt werden14. Ein Zusammenhang zwischen
Aktivierbarkeit und Wuchsstoffeigenschaft besteht
also in der Phenoxyessigsäure-Reihe nicht.
2. K o n j u g i e r u n g v o n A u x i n mit
Glycin
Eine biologisch sehr bedeutsame Acylierung der
Aminosäuren liegt in den Entgiftungsmedianismen
tierischer und pflanzlicher Organismen vor. Als Konjugationsprodukte von IES mit Aminosäuren wurden bisher Indolacetursäure1, Indolacetylglutamin15
und Indolacetylasparaginsäure2 gefunden. Indol14
K. V. T H I M A N N , Plant Physiol. 2 7 , 3 9 2 [ 1 9 5 2 ] .
J. V. JEPSON, Biochem. J. 64, 14 [1956],
R-Acetursäure [u.Mol]
—
Tab. 1. Freisetzung von anorganischem Pyrophosphat aus
A T P durch die Aktivierung verschiedener Auxine. System:
5 ^Mole des angegebenen Kaliumsalzes, 100 /<Mole Tris-HClPuffer PH 7,6, 3 /*Mole M g C l 2 , 1 //Mol KBH 4 , 3 /tMole ATP,
0,25 jWMol COA, 350 /ug ÖTK ( = „Normalansatz"), 120
H e p p e 1 - Einheiten Pyrophosphatase. Gesamtvolumen 1 ml,
Temperatur 37 °C. Versuchsdauer 60 Minuten.
15
acetylglycin wurde im Harn von Tieren nach Verfütterung von IES festgestellt, wird aber audi nach
eigenen Versuchen im isolierten Tierorgan (Rattenniere) gebildet.
Es sollte untersucht werden, ob IES sowie andere
Auxine, deren Aktivierbarkeit nachgewiesen worden war, ebenfalls in der Lage sind, mit Glycin konjugiert zu werden. Dem Normalansatz wurden daher
bei pn 8,0 1 mg Protein der Am46-Fraktion, die ja
sowohl OTK als auch Glycin-V-Acylase im Überschuß enthält, sowie 50 //Mole Glycin zugesetzt, und
die Menge der entstandenen Acetursäuren quantitativ bestimmt.
IES
-ATP
-CoA
2.4-D
NES
0,452
0,052
0,00
0,00
0,00
Tab. 2. Konjugierung verschiedener Auxine mit Glycin.
System: 5 //Mole Kaliumsalz des Auxins, 90 //Mole Trispuffer ph 8,0, 3 /tMole MgCl 2 , 50 //Mole Glycin, 1 //Mol
K B H 4 , 6 //Mole ATP, 0,25 /tMol CoA, 1 mg der Am 46 -Fraktion. Volumen 1,0 ml, Temperatur 37 °C, Versuchsdauer
60 Minuten.
Tab. 2 zeigt, daß IES also nicht nur aktiviert
wird, sondern auch mit Glycin eine Peptidbindung
eingeht. Die Reaktion war weitgehend ATP-abhängig und völlig CoA-abhängig. 2.4-D und NES wurden nicht meßbar mit Glycin gekoppelt. Dies steht
in Übereinstimmung mit Versuchen von T A N A K A ,
der bei Verfütterung von IES und NES an Ratten
fand, daß IES wohl eine Acetursäure bildet, aber
NES unverändert im Harn ausgeschieden wurde.
1 6
Die Abhängigkeit der Peptidbildung vom CoA
konnte durch die Verfolgung der Kinetik der Indolacetursäure-Bildung in Ansätzen mit und ohne CoA
gezeigt werden. Das Experiment (Abb. 1) zeigt
eindeutig das Bedürfnis der Reaktion für die Anwesenheit von CoA, wodurch die Natur des energiereichen Zwischengliedes in der IndolacetursäureSynthese als IES-CoA wahrscheinlich gemacht ist.
Es sollte audi geprüft werden, ob Hydroxylamin
die aktivierte IES im Gegensatz zur aktivierten
Benzoesäure 9 abfangen kann.
Uberraschenderweise werden bei einer so hohen
Konzentration wie 1000 //Mole NH2OH pro ml noch
16
Z. TANAKA, J. pharmac. Soc. Japan [Jakuyakuzasshi] 60,
362 [1940],
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immer 23% Acylgruppen des gebildeten IES-CoA
enzymatisch auf Glycin übertragen (Abb. 2 ) ; wahrscheinlich verläuft die Reaktion des Thioesters mit
NH2OH relativ langsam, wodurch eine Konkurrenz
der nucleophilen Aminogruppen um das gebildete
IES-CoA möglich ist. Indolacetylhydroxamat konnte
chromatographisch aus dem Ansatz isoliert werden
und zeigte sich mit einer synthetischen Probe durch
Kochromatographie genau identisch.
linear verläuft; im späteren Verlauf stellt sich ein
Gleichgewicht ein und die Reaktion kommt zum Stillstand. Der Betrag an Thioester entspricht einer 47proz. Umwandlung des verfügbaren CoA in IESCoA. Bei Zusatz der halben Menge an Enzym wurde
ungefähr der halbe Betrag an Thioester gebildet.
Ein Zusatz von 120 H e p p e 1 - Einheiten Pyrophosphatase oder 35 H e p p e 1 - Einheiten AMPase
oder beide Phosphatasen zusammen, vermochten die
Reaktion nicht wieder in Gang zu setzen; eine Produktenhemmung ist dadurch ausgeschlossen. Keiner
der Zusatzfaktoren, wie ATP, CoA, IES, kann unter
10
0
10-20
30
10
50 60 10 80
Zeit
[Min]—
Abb. 1. Abhängigkeit der Indolacetursäure-Synthese von der
Anwesenheit von CoA. System: 5 //Mole Kaliumsalz der IES,
100 //Mole Trispuffer PH 7,6, 3 / / M o l e MgCl 2 , 50 //Mole
Glycin, 1 / / M o l K B H 4 , 6 //Mole A T P , 1 mg Protein der
Am 46 -Fraktion, (o) 0,25 / / M o l CoA am Anfang zugesetzt,
( • ) 0,26 / / M o l CoA nach 40 Min. zugesetzt. Volumen 1,0 ml,
Inkubationstemperatur 37 ° C .
20
30
W
50 60 70 80
Zeit [Minj—
Abb. 3. Kinetik der IES-CoA-Bildung. 5 //Mole Kaliumsalz
der IES, 100 / / M o l e Trispuffer pH 7,6, 3 //Mole M g C U ,
1 / / M o l K B H 4 , 6 //Mole ATP, 0,4 / / M o l CoA, ( • ) mit 350 / / g
OTK, (o) mit 175 /ug OTK. Volumen 1,0 ml,
Temperatur 37 °C.
OES f/iM] •
800 1000
Abb. 4. Zusammenhang zwischen der IES-Konzentration und
der IES-Co-Bildung. System wie in Abb. 3, mit 350 /ug
OTK, jedoch mit steigenden Konzentrationen an IES.
NHZ0H[[IM]—
Abb. 2. System wie in Abb. 1 mit 0,25 / / M o l CoA und steigenden Mengen an NH 2 OH, Versuchsdauer 60 Minuten.
Temperatur 37 ° C .
3. E n z y m a t i s c h e B i l d u n g v o n I E S - C o A
Zur Verfolgung der Kinetik der IES-CoA-Bildung
in direkter Demonstration wurde IES zusammen mit
OTK im Normalansatz für verschiedene Zeiten inkubiert.
Abb. 3. zeigt, daß die Bildung des Thioesters
unter diesen Bedingungen bis etwa zur 30. Min.
diesen Bedingungen limitierend wirken, daher ist
anzunehmen, daß IES-CoA als Reaktionsprodukt die
weitere Synthese hindert. Bei der Verfolgung der
Kinetik der Acetyl-CoA-Synthese durch ein Enzym
aus Herzmuskel wurden ähnliche Verhältnisse gefunden 17. In diesem Falle wurden 48% des verfügbaren CoA in Acetyl-CoA umgewandelt. Einer
Probe des obigen Ansatzes wurde 5 //Mole Pyrophosphat (PE 7,6) zugesetzt, wobei eine 65-proz.
17
H . BEINERT, D . E . GREEN, P . HELE, H . HIFT, R . W .
u. C. V.
RAMAKRISHNAN,
J.
biol. Chemistry
203,
VON K O R F F
35
[1953].
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Hemmung der IES-CoA-Synthese nach 30 Min. beobachtet werden konnte.
Zur Berechnung der M i c h a e l i s - Konstante
(Km ) wurde die Konzentration an IES über einen
20-fachen Bereich variiert. Die Inkubationszeit betrug 30 Min., da sich im vorherigen Versuch gezeigt
hatte, daß die Geschwindigkeit der Reaktion bis
dahin konstant bleibt. Die Bestimmung der Km aus
den in Abb. 4 gewonnenen Werten erfolgte mittels
der doppelt reziproken Darstellung und ergab für
IES als Substrat den Wert Km = 3,7 • 10" 4 -molar.
Im Vergleich mit anderen Säuren kann also geschlossen werden, daß IES für OTK durchaus ein „natürliches" Substrat darstellt.
4. D i e
Rolle von I n d o l a c e t y l a d e n y l a t
in d e r A k t i v i e r u n g v o n I E S
Das Auftreten von IES-CoA macht den Reaktionsmechanismus, wie er in Gl. (1) und (2) gezeigt
wurde, wahrscheinlich. Um Gl. (1) zu studieren,
wählten wir die Rückwärtsreaktion. Es sollte synthetisches IES-AMP 12 mit OTK und Pyrophosphat
inkubiert und das so entstehende ATP mit Glucose
und Hexokinase in Glucose-6-Phosphat übergeführt
werden; als Test diente der Rückgang an Pyrophosphat. Kaliumfluorid wurde in das System mit eingeschlossen, um Spuren von Pyrophosphatase in dem
Hexokinase-Präparat zu hemmen, 50 //Mole Trispuffer pn 7,6, 2,5 //Mole Pyrophosphat, 5 //Mole
MgCl 2 , 25//Mole KF, 50//Mole Glucose, 0,1mg
Hexokinase, 0,35 mg OTK und 1,8 //Mole IES-AMP
wurden in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml 20 Min.
bei 37 °C inkubiert. Als Kontrollen dienten Proben
ohne Enzym, sowie Proben ohne IES-AMP. Der
Rückgang an Pyrophosphat gegenüber den Kontrollen betrug A = 0,45 //Mol Pyrophosphat, was bei
einem Einsatz von 1,8 //Mole IES-AMP einer Umwandlung von 25% entspricht.
Um Gl. (2) zu beweisen, wurde ein Gemisch aus
60//Mole Trispuffer pH 8,0, 2//Mole
KBH 4 ,
5 //Mole MgCl2 , 0,3 //Mol CoA, 350 jug OTK mit
1,3 //Mole IES-AMP in einem Gesamtvolumen von
0,4 ml bei 37 °C für 20 Min. inkubiert. Daraufhin
wurde IES-CoA auf dreierlei Weise analysiert.
Erstens wurde der Rückgang an freien SH-Gruppen,
der ja als Maß der Veresterung des CoA dient, gemessen (1), zweitens das IES-CoA mit S a l k o w s k i - Reagenz direkt nachgewiesen (2) und
drittens wurde nach 20 Min. der Ansatz mit
50 //Mole Glycin pn 8,0 und 1 mg Protein der Am 46 -
Fraktion versetzt und die entstandene Indolacetursäure nach weiteren 40 Min. auf die bekannte Weise
bestimmt (3). Dabei ergaben sich folgende Werte:
1.
-SH
//Mol
IES-CoA
//Mol
Indolacetylglycin
//Mol
0,176
0,165
0,155
2.
Der Rüdegang an freien SH-Gruppen entspricht
etwa dem gebildeten, direkt gemessenen Betrag an
IES-CoA; ebenso auch der Betrag an Acetursäure.
Dies entspricht etwa einer Umwandlung des IESAMP in den IES-Thioester von ca. 13 Prozent. Kontrollen mit CoA und IES-AMP aber ohne Enzym
zeigten keinen Rückgang im freien SH-Gehalt; Kontrollen, die mit Enzym aber ohne CoA inkubiert
wurden, ließen keinerlei IES-CoA-Bildung erkennen, jedoch war das gesamte IES-AMP nach 20 Min.
enzymatisch hydrolysiert. Die niederen Ausbeuten
an ATP und IES-CoA in den Reaktionen I und II
lassen sich auf diese Hydrolase zurückführen. Die
hydrolytische Aktivität des Präparates betrug:
1,94 //Mole IES-AMP/mg Protein/Minute.
Mit diesen Versuchen können Gl. (1) und (2)
als bewiesen angesehen werden. Die Aktivierung des
heterocyclischen Auxins IES folgt daher dem selben
Typus, wie er von anderen Autoren schon für verschiedene aliphatische Säuren und Benzoesäure gefunden wurde.
Diskussion
Die Esterifizierung von Auxinen mit CoA in Pflanzen wurde bereits von L E O P O L D und G U E R N S E Y 18 als
Wirkungsmechanismus der Phytohormone vorgeschlagen. S I E G E L und G A L S T O N 19 bezeichneten IESCoA als die Form, in der dies Auxin seine Wuchsstoffeigenschaft ausübt. A N D R A E und G O O D 4 und
FAWCETT
und Mitarbb.20 konnten erstmals die
/5-Oxydation von langkettigen Indolsäuren in vitro
beobachten, die ja über die Auxin-CoA-Derivate laufen muß. Der in vitro-Befund, daß IES in Pflanzen
mit Asparaginsäure konjugiert wird, macht als Parallele zur tierischen Indolacetylglycin-Synthese das
intermediäre Auftreten von IES-CoA audi wahr18
19
20
A. C. LEOPOLD u. F. S. GUERNSEY, Proc. nat. Acad. Sei.
USA 3 9 , 1 1 0 5 [1953].
S . M . SIEGEL u. A. W . GALSTON, Proc. nat. Acad. Sei. USA
39, 1111 [1953].
C . H . FAWCETT, R . L. W A I N u. F . WIGHTMAN, Nature [London] 181, 1387 [1958].
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sdieinlidi. Der erste direkte Beweis der Aktivierung
von IES und anderen Auxinen konnte in dieser
Arbeit erbracht werden. Durch das Auftreten von
IES-CoA im tierischen Modellsystem scheint daher
die ursprüngliche Hypothese von L E O P O L D und
G U E R N S E Y 18 gefestigt zu werden. Den Befunden von
ANDREAE
und G O O D 4, wonach radioaktives 2.4-D
fast unverändert in der Pflanzenzelle akkumuliert
und kaum mit Asparaginsäure konjugiert wird, entsprechen unsere Ergebnisse, die zeigen, daß 2.4-D
wohl aktiviert, aber nicht meßbar konjugiert werden
kann. Es ist daher verlockend, die stark phytotoxische Wirkung von 2.4-D so zu interpretieren, daß
die Säure jeglicher Degradierung und Entgiftung
widersteht und dadurch, in genügend hoher Konzentration gegeben, toxische Symptome hervorruft. Dies
scheint nicht nur in Pflanzen, sondern auch in Tieren der Fall zu sein, denn S C E N T - G Y Ö R G Y I 21 gibt an,
daß bei Mäusen schon 300 mg 2.4-D/kg Maus (ca.
1,5' 10~3-m.) letal wirken. Neben diesen Entgiftungsreaktionen können die Auxin-CoA-Thioester
vielleicht auch eine Rolle in der Wuchsstoffwirkung
selbst spielen. In neuerer Zeit wird die Vorstellung
vertreten, daß IES primär einen Umbau der Wandsubstanz, sowohl der wachstumsfähigen als auch
wachstumsunfähigen Zellwand22, bewirkt, der zu
21
einer Plastizitätserhöhung führt und damit eine
Streckung der Zellen mit Hilfe osmotischer Kräfte
gestattet. Durch nachfolgende Neusynthese von
Wandmaterial wird der neue Zustand fixiert, wobei
der vermehrte Energiebedarf, der zu dieser Synthese
benötigt wird, zu einer Atmungssteigerung führt23.
Man muß nun einen Zusammenhang zwischen Zellwandkatalyse und der Auslösesubstanz, dem Auxin,
herzustellen suchen. Dazu wird folgende Arbeitshypothese der Reaktionsabläufe vorgeschlagen.
Auxin wird aktiviert und kann nun mit einem spezifischen Zellreceptor reagieren und so die lang postulierte „catalytic entity" herstellen, welche die Zellwandkatalyse einleitet und letztlich zum Wachstum
der Zelle führt. Das überschüssige reaktionsfähige
aktivierte Auxin wird durch Konjugierung mit Asparaginsäure entgiftet.
aktivierte IES
IES
->
Receptor
Zellwandkatalyse
/
j
Wachstum
IES-AMP ->• IES-CoA
Atmungssteigerung
\
IES-Asparaginsäure
Diese Arbeit wurde durch eine Beihilfe, C-2204, des
N a t i o n a l I n s t i t u t e s of He a 11 h , U.S. Public
Health Service, an Prof. Dr. A. C. L E O P O L D unterstützt.
Journal paper No. 1531, Agricultural Experiment
Station, Lafayette, Ind. U.S.A.
A. SZENT-GYÖRGYI, Bioenergetics. Academic Press Inc., N.Y.
22
L . BRAUNER U. M . HASMAN,
1957,
23
M . BUSSE U. O . KANDLER,
S.122.
Protoplasma 4 1 , 3 0 2 [ 1 9 5 2 ] .
Planta 4 6 , 6 1 9 [ 1 9 5 6 ] .
über ein infektiöses Desoxyribonucleinsäure-Agens
aus dem Phagen
174
V o n
P.
H .
HOFSCHNEIDER
AUS dem Max-Planck-Institut für Biochemie, München
( Z . N a t u r f o r s c h g . 15 b , 4 4 1 — 4 4 4 [ 1 9 6 0 ] ; e i n g e g a n g e n a m 26. A p r i l 1 9 6 0 )
A DNA-agent has been obtained by phenol extraction of <?X174 bacteriophage. This DNA-agent is
infectious for both E. coli C and E. coli B prepared in sucrose-tris buffer and for EDTA-lysozyme
spheroplasts of the same cells. It differs from the intact phage in DNase susceptibility, an altered
host range and greater temperature stability. Up to the present time the participation of a protein
component in the infective principle could be demonstrated neither by inactivation with <?X174 antiserum nor by digestion with proteases.
Im Unterschied zu Versuchen an RNS *-haltigen
Viren, welche zur Isolierung infektiöser Ribonucleinsäure-Fraktionen führten, liegen bis jetzt entspre-
chende Ergebnisse bei DNS-haltigen Bakterienviren
nicht vor. Abbauversuche an E. coli T2-Bakteriophagen durch osmotischen Schock und Wärmeeinwir-
* Abkürzungen: BST/CST E.coli B- bzw. C-Bakterien in
Saccharose-Tris-Puffer suspendiert, BLS/CLS LysozymEDTA-Sphaeroplasten aus E. coli B- bzw. C-Bakterien,
Cind E. coli C-Indikator-Bakterien, DNS/DNase Desoxy-
ribonucleinsäure/-ase.
EDTA Äthylendiamintetraessigsäure, RNS Ribonucleinsäure, Tris Tris-hydroxymethylaminomethan, 0ph phenolbehandelte $X174-PhagenSuspension.
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