Analyse eines Microarray-Experiments

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Analyse eines Microarray-Experiments
1. Biologische Frage
2. Experimentelles Design
3. Microarray-Experiment
4. Bildanalyse
5. Normalisierung
6. Statistische Analyse
7. Biologische Verifikation
and Interpretation
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16.04.2009
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Analyse eines Microarray-Experiments
• Microarray-Experimente
• werden seit Ende der 90er in großem Umfang durchgeführt
• haben viele Kooperationen zwischen Statistikern und
Biologen/Medizinern generiert und ermöglicht
• Vielzahl und Brandbreite der eingesetzten statistischen Methoden ist
beeindruckend
• Übersicht der Microarray-Analyse (ausschnitthaft und grob) auf den
nächsten 17 Folien, später ausführlicher
• Statistische Methoden (Beispiele)
• Versuchsplanung (Experimentelles Design)
• Clusteranalyse (Bildverarbeitung)
• Lokal lineare Regression, varianzstabilisierende Transformation
(Normalisierung)
• Varianzanalyse, Diskriminanzanalyse, Testtheorie (Analyse
verschiedener Proben)
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Zwei-Farben Microarray-Experiment
Kontrolle
Tumor
cDNA von Kontroll- und
Tumorgewebe
Markieren (labeling) von Proben
mit grüner (532 nm) und roter
(635 nm) Farbe
Kompetitive Hybridisierung
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Zwei-Farben Microarray-Experiment
Microarray Slide
Scannen des Bildes mit
konfokalem Scanner
Identifikation der Spots
Quantifizierung der roten
und grünen Intensität
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Gründe für niedrige Datenqualität
1. Abnehmende Pin-Qualität
Nach 500.000 Spots
2. Räumliche Effekte
auf dem Microarray
Farb-Repräsentation
Expressionswerte sind
sortiert (Ränge) von
blau nach gelb
G
Nach 300.000 Spots
H. Sueltmann DKFZ/MGA
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R
Rb
R-Rb
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Affymetrix Gene Chips
Zelle (cell) einer hybridisierten
* Probe
GeneChip Probe Array
*
*
*
*
Oligonukleotid-Probe
20 µm
1.28 cm
Jede Zelle enthält
Millionen von Kopien einer
spezifischen
Oligonukleotid-Probe
Über 400,000
verschiedene Proben,
jeweils komplementär zu
(Teilen von) Genen
Bild eines hybridisierten Arrays
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Analyse eines Microarray-Experiments
1. Biologische Frage
• Wahl des Designs
•
•
•
•
2. Experimentelles Design
3. Microarray-Experiment
4. Bildanalyse
• Nebenbedingungen
• Anzahl der Experimente:
Kosten pro Exp. ~ 500-800 €
• Material (mRNA):
Oft schwer zu erhalten
5. Normalisierung
6. Statistische Analyse
7. Biologische Verifikation
and Interpretation
Behandlung vs. Kontrolle
Mehrere Behandlungen
Faktorielles Design
Zeitreihen
• Anzahl der Replikate
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• Fallzahlplanung?
• Keine allgemein akzeptierten
Modelle
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Experimentelles Design: 2 x 2 faktorielles Design
Indirekt
I)
A
Balance von direkt und indirekt
II)
B
A.B C
C
B
III)
A
IV)
C
A.B B
# Experimente
A
C
A
A.B
B
A.B
N=6
Haupteffekt A
0.5
0.67
0.5
NA
Haupteffekt B
0.5
0.43
0.5
0.3
1.5
0.67
1
0.67
Wechselwirkung
A.B
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Experimentelles Design: Zeitreihen
Lag 1
Lag 2
Lag 3
Varianzvergleich
Ave
T1T2
T2T3
T3T4
T1T3
T2T4
T1T4
T1
T2
T3
T4
1
2
2
1
2
1
1.5
T1
T2
T3
T4
1
1
1
2
2
3
1.67
T1
T2
T3
T4
2
2
2
2
2
2
2
0.67
0.67
1.67
0.67
1.67
1
1.06
0.75
0.75
0.75
1
1
.75
.83
1
.75
1
.75
.75
.75
.83
N=3
C
T1
T2
T3
T4
N=4
T1
T2
T1
T2
T3
T4
T3
T4
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1. Biologische Frage
2. Experimentelles Design
3. Microarray-Experiment
4. Bildanalyse
5. Normalisierung
6. Statistische Analyse
7. Biologische Verifikation
and Interpretation
• Addressierung:
• Finden der Bereiche im Bild die zu
einzelnen Spots gehören.
• Bereich von Spot und zugehörigem
Hintergrund heißt „target area“.
• Segmentierung:
• Aufteilen der „target area“ in
Vordergrund (fg) und Hintergrund
(bg).
• Reduktion:
• Extrahieren zweier skalarer Werte
R and G für rote und grüne
Intensität.
• Berechnung eines Wertes R/G für
relative Abundanz.
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Bildanalyse – Clusteranalyse
Spot mit Loch im Zentrum
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1. Biologische Frage
2. Experimentelles Design
3. Microarray-Experiment
4. Bildanalyse
5. Normalisierung
6. Statistische Analyse
7. Biologische Verifikation
and Interpretation
• Globale Normalisierung
• Experimentelle Varianz: Verschiedene
Größenordnungen für grün bzw. rot
markierte Proben
• Annahme: Die meisten Gene sind nicht
differentiell exprimiert
• Intensitäts-abhängige Normalisierung
• Varianz von Genexpressions-Quotienten
größer für niedrige Intensitäten
• Varianz-stabilisierende
Transformation
• Modell-basierte Normalisierung
• Macht Varianz konstant über ganzen
Intensitätsbereich
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Normalisierung
MA-plot
M = log2 ( R G )
A = log2 ( RG ) 2
M … log ratio
A … average log intensity
Annahme: Differentiell
exprimierte Gene
gleichmäßig verteilt über
Intensitätsbereich
Lösung: Ziehe lokal lineare
Regressionsschätzung
von den Daten ab
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Normalisierung
MA-plot
M = log2 ( R G )
A = log2 ( RG ) 2
M … log ratio
A … average log intensity
Annahme: Differentiell
exprimierte Gene
gleichmäßig verteilt über
Intensitätsbereich
Lösung: Ziehe lokal lineare
Regressionsschätzung
von den Daten ab
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Normalisierung – VSN: Fehlermodell
Gemessene Intensität = offset
+
Faktor × wahre Abundanz
y ik = aik + bik xik
bik = bi bk exp(ηik )
aik = ai + ε ik
ai per-sample offset
bi per-sample Normalisierungsfaktor
εik ~ N(0, bi2s12)
bk Sequenzabhängige Effizienz
“additives Rauschen”
ηik ~ N(0,s22)
i… Sample, Experiment, Array
k… Gen
“multiplikatives Rauschen”
ppt-Folien adaptiert von W. Huber
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Normalisierung: Fehlermodell (ppt-Folien: W. Huber)
• Für das vereinfachte Modell mit bk=1 für alle Gene k gilt:
y ik = ai + ε ik + bi exp(ηik )xik
⇒
Var ( y ik ) = c 2 (E ( y ik ) − ai )2 + bi2s12
mit c 2 = Var (eη ) / E 2 (eη )
• Varianz ist quadratische Funktion des Erwartungswerts
• Dieser Effekt kann durch eine varianzstabilisierende
Transformation kompensiert werden
x
f (x) =
∫
1
v (u )
2
du
• In diesem Fall: v (u ) ∝ (u + u0 ) + s
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2
u + u0
⇒ f ∝ arsinh
s
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Differenz rot-grün
Normalisierung: Validität von VSN
Gene sortiert
nach Expression
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Differentiell exprimierte Gene
Teststatistik für die Identifizierung von differentiell
exprimierten Genen (im Fall von n Replikaten):
Mittelwert
m
t
= m / sd
S = m / (sd+a)
t-Test (Mittelwert/Standardabweichung)
adaptiver t-Test, a = 90th perc. von allen sd’s (Stanford)
2
2
2
log ( p (1 − p ) ) 
a +s +m

B =
 a 2 + s 2 + m 2 (1 + nc )
1 + nc

(
ν+
)




n
2
‘empirical Bayes log odds’ Teststatistik (Berkeley)
p…
apriori Wahrscheinlichkeit für differentielle Expression
ν, a, c… Hyperparameter, geschätzt aus Daten
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Differentiell exprimierte Gene
log ( p (1 − p )) 
a2 + s 2 + m2

B =
 a 2 + s 2 + m 2 (1 + nc )
1 + nc

(
ν+
)




n
2
ist „empirical Bayes posterior log odds statistic“, wenn für jedes Gen gilt
log(R/G) ~ N(µ,σ2),
τ
= na/2σ2 ~ Γ(ν,1),
µ|τ = 0
für nicht-differentiell exprimierte Gene,
µ|τ = N(0,cna/2σ2) für differentiell exprimierte Gene
• Parameter a, ν, c werden aus Daten geschätzt, p apriori festgelegt
• Simulierte MA-plots sind ähnlich zu MA-plots von realen Daten
• Kompromiss zwischen M and t wie auch bei Efrons Statistik S
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2. Markovketten – Sequenzmodellierung –
Hidden Markov Modelle (HMMs)
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Markovketten
• Bedeutung von Markovketten in der Bioinformatik
• Modellierung von Sequenzevolution (stochastische Prozesse)
• Modellierung von Zufallsequenzen als sogenannte Nullmodelle
(Generierung der Nullhypothese)
• Grundlage für HMMs (Hidden-Markov-Modelle)
• HMMs sind wesentlicher Bestandteil in der Sequenzanalyse
• Markovketten
• Stochastische Prozesse
• Übergänge zwischen Zuständen werden stochastisch modelliert
• Gedächtnislosigkeit (oder Markov-Eigenschaft) der Zustände:
Übergangswahrscheinlichkeiten von einem Zustand in den
nächsten hängen nur vom derzeitigen Zustand ab, nicht von
vorherigen Zuständen
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Markovketten
• Beispiel für Markovkette
• Nukleotid an fester Position in Sequenz im Laufe der Evolution
• Mögliche Zustände: A,G,C,T
• Zeiteinheit (z.B.): 1 Million Jahre
• Hypothetische Übergangsmatrix P
• P stochastische Matrix mit Zeilensumme 1
• Die Wahrscheinlichkeit, dass sich ein bestimmtes Nukleotid innerhalb
von 1 Million Jahre von A nach G geändert hat, sei 0.01 (analog für alle
anderen Kombinationen)
→ A →G →C →T 

 A → 0.97 0.01 0.01 0.01 
• Die i-te Zeile von P gibt


die Verteilung des
P =  G → 0.01 0.97 0.01 0.01 
nächsten Zustandes an,


C
→
0.01
0.01
0.97
0.01


wenn die Kette gegenwärtig
 T → 0.01 0.01 0.01 0.97 
im Zustand i ist


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Markovketten
• Definition: Stochastischer Prozess
• Ein stochastischer Prozess ist eine Zufallsvariable X(t) im Verlauf
der Zeit t. Die Zufallsvariable nimmt Werte aus einem
vorgegebenen Zustandsraum X an.
• Die Zeit kann diskret oder stetig sein
• Wahrscheinlichkeits-Aussagen über X(t) werden mit P
beschrieben, d.h. P(X(0)=A) ist die Wahrscheinlichkeit, dass A
das Startsymbol ist
• Nukleotid-Beispiel
• X = {1,2,3,4} endlich (Kodierung zum Beispiel A=1, G=2, C=3, T=4).
• Aminosäure-Beispiel
• X = {1,...,20} endlich (zum Beispiel mit Alanin=1, Aspartat=2, ...).
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Markovketten
• Definition Markovkette
• Eine (zeitdiskrete und homogene) Markovkette ist ein
stochastischer Prozess, der vollständig durch eine Startverteilung
π(0) auf X und eine Übergangsmatrix P zwischen den Zuständen
gegeben ist.
• Der Wert Pij gibt die bedingte Wahrscheinlichkeit an, zum
nächsten Zeitpunkt in Zustand j zu landen, wenn i der jetzige
Zustand ist.
• Bei nichthomogenen Markovketten kann sich P mit der Zeit
ändern
• In Gleichungen:
π i( 0 ) = P ( X ( 0 ) = i )
Pij = P ( X ( t + 1) = j X ( t ) = i )
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Markovketten
Typische Fragestellungen
• Heute steht hier ein A, was steht dort vermutlich in 10 Millionen
Jahren?
• Gegeben X(t) = i, wie ist die Verteilung von X(t+k) für ein k>0?
• Gegeben die 1-Schritt Übergangswahrscheinlichkeiten Pij , was sind die kSchritt Übergangswahrscheinlichkeiten Pij(k)?
• Wie häufig sieht man im Mittel jedes Nukleotid A,C,G,T?
• Was ist die Zustandsverteilung im Zeitmittel?
• Oft äquivalent zur Frage nach einer stationären Verteilung, d.h. einer
Verteilung, die sich durch Anwenden der Übergangsmatrix P nicht ändert
• Das Modell sieht sehr symmetrisch aus. Sind Mutationswahrscheinlichkeiten nicht eher unterschiedlich für Transitionen/Transversionen?
• Woher kommen die Übergangswahrscheinlichkeiten, d.h. wie findet man die
Parameter des Markovmodells, wenn Beobachtungsreihen von Zuständen
gegeben ist sind?
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Markovketten
• Heute steht hier ein A, was steht dort vermutlich in 10 Millionen
Jahren?
• Gegeben X(t) = i, wie ist die Verteilung von X(t+k) für ein k>0?
• Gegeben die 1-Schritt Übergangswahrscheinlichkeiten Pij , was sind die
k-Schritt Übergangswahrscheinlichkeiten Pij(k)?
• Für den Übergang von Zustand i nach Zustand j nach zwei Schritten gilt
P  X ( 2 ) = j X ( 0 ) = i 
= ∑ P  X ( 2 ) = j , X (1) = y X ( 0 ) = i 
y
= ∑ P  X (1) = y X ( 0 ) = i  ⋅ P  X ( 2 ) = j X (1) = y , X ( 0 ) = i 
y
und damit
Pij( 2) = ∑ Piy ⋅ Pyj
y
• In Matrixschreibweise ergibt sich:
P ( 2) = P ⋅ P = P 2
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Markovketten
• Heute steht hier ein A, was steht dort vermutlich in 10 Millionen
Jahren?
• Gegeben X(t) = i, wie ist die Verteilung von X(t+k) für ein k>0?
• Gegeben die 1-Schritt Übergangswahrscheinlichkeiten Pij , was sind die
k-Schritt Übergangswahrscheinlichkeiten Pij(k)?
• Analog erhält man für die k-Schritt Übergangswahrscheinlichkeiten
Pij( k ) = ∑ Piy( k −1) ⋅ Pyj
y
und damit in Matrixschreibweise
P ( k ) = P ( k −1) ⋅ P = P k
• Übungen: Berechnung von k-Schritt Übergangswahrscheinlichkeiten
• Bemerkung: Auch wenn an einer bestimmten Stelle ein Nukleotid
nach einer bestimmten Zeit noch steht, kann es sich mehrfach
zwischendurch geändert haben!
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