using particle bombardment - ETH E

DISS.ETH
C*s-3>
Diss. ETHNo
10628
Genetic transformation studies in wheat
using particle bombardment
A dissertation submitted to the
SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZURICH
for the
degree of
Doctor in Natural Sciences
Presented
by
Alejandro Iglesias
Agric. Eng.
Universidad Nacional de Cuyo
Victor
born
May 3,
citizen of
accepted
Prof. Dr.
Prof. Dr.
on
1960
Argentina
the recommendation of
Ingo Potrykus
Peter Stamp
P.D. Dr. Christof Sautter
1994
examiner
co-examiner
co-examiner
m
Summary
Summary
Wheat
genetic transformation
Immature
delivery.
embryos
were
Two different
model
as a
used
as
strategies
system
for cereals
was
established.
explants and particle bombardment for
were
followed:
(1) transformation of
DNA
meristem
cells, followed by growth of the plants to maturity and analysis of the progeny
for solid
transformants,
regeneration
of
plants
Two different
was
Gun
or
(2) transformation of scutellum cells, followed by
via somatic
embryogenesis under selective
particle accelerators
used. A
were
Microtargeting
utilised for bombardment of meristems and scutella, and
was
conditions.
a
device
Particle Inflow
used for bombardment of scutella and scutellum-derived somatic
embryos.
Transformation of meristem cells involved the formation of chimeral
plants which would
not survive selection but which could transmit the
to progeny. The results obtained
wheat
embryos
suitable for
with
7
days
following
after anthesis had
particle bombardment; b)
frequencies
of up to 90%
these
using
this
an
approach
indicated that:
embryos germinated
culture media
transient
coleoptile
cells showed transient
expression of transgenes
was
a)
exposed shoot apical meristem
to fertile
containing
gradient; c) particles accelerated by Microtargeting penetrated
layers; d) meristem
transgene
an
plants
osmotic
up to four cell
expression of marker genes; e)
ten-fold lower in meristem cells than
and scutellum cells under similar conditions;
f) resistant kernels
were
not found among the progeny derived from bombarded meristems.
Scutellum cells of immature
plants
via somatic
bombardment
regeneration
was
for
particle
applied
during
in order to inhibit the
somatic
growth
capacity
of these
bombardment and
cells
regenerate
after
particle
and
plant
of non-transformed cells. Results
Microtargeting
and
a
Particle Inflow Gun
were
suitable
explants
plant regeneration; b) high levels of transient
were
achieved for both
integration of visual marker genes
explant types; c) indications
were
observed six weeks after
bombardment; d) pre-cultured embryos bombarded using
allowed recovery of
to
embryogenesis
a) freshly excised and pre-cultured scutella
expression of marker genes
of stable
had the
embryogenesis. Selection
obtained from bombardment with a
showed that:
embryos
a
Particle Inflow Gun
plants which showed stable nuclear integration of the
selectable marker gene.
IV
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Gentransfer
in
Weizen
wurde
als
Model
eingerichtet
fur
Getreide
im
allgemeinen. Als methodischen Ansatz wahlten wir den DNA Transport mithilfe
von
Mikroprojektilen auf unreife Embryonen. Dabei verfolgten wir zwei
Strategien: (1) Gentransfer in Meristemzellen, gefolgt von Aufzucht der
auf klonale
und Analyse der Nachkommen
Pflanzen
bis zur Reife
in
Gentransfer
anschliessend
Skutellumzellen,
Transformanten, oder (2)
somatische Embryogenese unter Selektionsbedingungen mit Regeneration.
Wir benutzen zwei verschiedene
Microtargetingapparatur
letzere sowie somatische
wurden
Mikroprojektilbeschleuniger.
Meristemzellen
Embryonen
von
und
Skutella
Mit der
beschossen,
Skutella wurden auch mit der Particle
Inflow Gun beschossen.
Der Gentransfer in Meristemzellen sollte
zu
sektorialen Chimaren fiihren,
Blutenbildung beitragen, ihr Transgen auf die Nachkommen
vererben konnten. Die Ergebnisse aus diesen Experimenten lassen folgende
Schlusse zu: a) Weizenembryonen haben ca 7 Tage nach der Pollenreife ein
exponiertes Sprossmeristem, das zur Behandlung mit Mikroprojektilen geeignet
ist; b) Auf Medien mit Kombinationen verschiedener Osmolatitaten keimen 90%
dieser Embryonen und wachsen zu fertilen
Pflanzen heran; c) Die
Mikroprojektile drangen teilweise bis zu 4 Zellschichten tief in das Gewebe ein;
d) Expression von Markergenen konnte in den Meristemzellen nachgewiesen
werden; aber e) die Expression rate im Meristem erreichte nur etwa ein Zehntel
der Expression als unter den gleichen Bedingungen in der Koleoptile oder im
Skutellum; f) Resistente Nachkommen aus diesem Ansatz konnten jedoch
bisher keine nachgewiesen werden.
die falls sie
zur
Skutellumzellen unreifer
Embryonen
konnen durch somatische
Embryo¬
genese ganze Pflanzen regenerieren. Nach Mikroprojektilbombardement mit
Selektionsmarkern wurde wahrend der somatischen Embryogenese ein-
schliesslich der
Regeneration
nicht-transgener
Microtargeting und
Zellen
ganzer Pflanzen selektiert,
hemmen. Ergebnisse aus
urn
das Wachstum
Experimenten mit
Particle Inflow Gun zeigten: a) sowohl frisch praparierte als
auch vorkultivierte Skutella sind brauchbare Ziele fur das Mikroprojektil¬
bombardement
und
die
nachfolgende Pflanzenregeneration; b) Beide
die
Gewebstypen exprimierten
Markergene sehr gut; c) erste Anzeichen von
stabiler Integration wurde mit sichtbaren Markergenen sechs Wochen nach
Projektilbeschuss beobachtet; d) aus vorkultivierten Skutella konnten nach
Beschuss mit der Particle Inflow Gun Pflanzen regeneriert werden, bei welchen
die stabile Integration eines Selektionsmarkergens in das Kemgenom
nachgewiesen werden konnte.
zu