Abstract - ETH E

Dfs&gflj aa-lfe
DISS. ETHNr. 11038
Techniques for genetically
engineered cell fate mapping in
crucifer embryos
A dissertation submitted to the
Swiss Federal Institute of Technology Zurich
for the
degree
of
Doctor of Natural Sciences
presented by
Benedikt Kost
dipl.sc.nat.
ETH
born 19. November 1964
citizen of Luzern
accepted on
the recommendation of
Ingo Potrykus, examiner
Prof. Dr. Klaus Apel, coexaminer
PD Dr. Gunther Neuhaus, coexaminer
Prof. Dr.
1995
Ca'.E
1.
Summary
1.
1
Summary
have been established for
Techniques
zygotic
the
crucifer
embryos. 1)
The assay used to
has been set up that is sensitive
in
(LUC) activity
Arabidopsis
of
earlier
with
(Kost
et
single plant
embryos. 3)
al. 1992,
and
accelerators has been
microinjection
system and
obtained
into
given
at
A flexible,
scan
CCD
In the
transgenic
the
and the
as
well
as
firefly
of
system
luciferase
had been established
similar culture system
a
juncea (Indian mustard)
two
different particle
of genes
encoding visible
analysed.
was
improved using
and the
protoplasts
of DNA
as a
model
juncea embryos. All results
of the
techniques
listed above
the work that is summarised in
submitted for
were
technique
The
tobacco
application
into
publication.
The references
paragraph.
(Charge Coupled Device)
camera
based
on
has been
a
set
liquid nitrogen cooled,
up, that
chemiluminescence
system and the firefly luciferase (LUC)
tobacco cells
transiently expressing
no
effect
on
employed
for
fluorescence) imaging.
or
as
a
screenable marker,
the
firefly
luciferase gene
stably transformed calli, regenerated shoots, plantlets
could be monitored in vivo with
be
can
slow
direct gene transfer. Bioluminescence
produced by
tobacco lines have been
from
of
camera
by microprojectile bombardment
resulting expression
comparatively inexpensive system
single
in excised
for gene transfer into cells of young excised
A. thaliana and B.
globular
development
the end of each
emitted from
presented thesis,
Gene transfer
following paragraphs
camera
video
a
globular stage
is described for Brassica
quantitative low-light (bioluminescence,
Using this
and
microscopical detection
Additionally, manuscripts describing
here.
each of the three
optimised
excised at the
cells has been
to
mapping
2) A culture system that allows in vitro development
techniques
optimised
plant
concerning
presented
was
early heart-shaped B. juncea embryos using
applied
was
cell fate
non-destructively analyse expression
cells and multicellular sectors
single
markers in
for
appendix).
tested.
were
globular, transition
are
see
Two alternative
embryos
crucifer
are
cells.
embryos
thaliana
cells
enough
improved performance
an
plant
luciferase gene (Luc) in
firefly
genetically engineered
the
and Tl
(Luc)
seedlings
viability of the analysed material.
The
pattern of light emission from sections through Lwc-expressing leaves and bioluminescent
single protoplasts
isolated from such leaves
used to detect in vivo LUC
emitted from
Luc-expressing
substrate solutions and
activity
was
tobacco
determining
were
imaged microscopically.
also
The assay
optimised by quantifying bioluminescence
protoplasts
the kinetics of
and leaves incubated in different
light
emission
during
incubation in the
substrate solution.
("Non-destructive
using
I.
a
detection
cooled, slow
scan
of firefly luciferase (LUC) activity
CCD
camera
and
an
optimised assay."
Potrykus and G. Neuhaus; "The Plant Journal",
in press)
in
single plant
B. Kost, M.
cells
Schnorf,
1.
2
Summary
single cells of
A method has been established that allows the transfer of genes into
globular stage zygotic
excised
cells
was
(EMB)
or
at
followed
later stages,
which
suspensor)
solid
and
both
a
particle
transient
(PIG)
and
30 \xm
are
deleterious effects
in vitro
on
development
of
in
receiving
survive
can
particular genetically marked
cells.
embryonic
(Luc)
luciferase gene
a
new
sectors,
we
acceleration
(|$-
had
no
sectors were
normal
resume
information about the
To be able to follow
tried to
identify reporter
be
non-destructively
(which encodes GUS),
Preliminary
resulted in
transient GUS
particle and
provided
data has shown that
be detected in bombarded
can
particle
on
characterising early B. juncea embryogenesis.
genes that, in contrast to the uidA gene
assayed
microprojectile
to
optimal conditions
under
The examination of these sectors has
cell division patterns
the surface of
embryogenesis. Multicellular GUS expressing
obtained, showing that cells
development.
on
early heart-shaped embryos using
visible markers. For both
glucuronidase) expression. Bombarding embryos
the
accessible
shooting conditions have been optimised based
devices the
proper without
long (embryo
grow
globular
the
The smallest
embryos.
grown
embryos
freely
at
micro-targeting particle accelerator
a
encoding
of genes
are
transition and
globular,
at
inflow gun
expression
and
embedding
Shooting
bombardment.
fully
than 20 cells. The
comprised of less
and defined culture medium
simple
juncea embryos, excised
B.
into mature,
cultured
efficiently
be
without
medium
zygotic
which
on
A
embryogenesis.
develop normally
can
are
juncea embryos. The fate of single, genetically marked
in vitro
designed
has been
embryos
during
B.
can
expression
of the
without
affecting
embryos
firefly
their
viability.
("Transient marker
gene
expression during zygotic in vitro embryogenesis ofBrassica
juncea (Indian mustard) following particle bombardment." B. Kost, N. Leduc, C.
Sautter, I. Potrykus and G. Neuhaus; submitted to "Planta")
An efficient system has been established that allows well controlled DNA
into tobacco
analysis of
targeted
mesophyll protoplasts
transient
cells
or
as
well
as
with
stable
partially regenerated
expression
of
cell walls and
injected reporter genes
derived clones. The system represents
an
techniques. Protoplasts
solidified with agarose
were
alginate.
or
DNA
coinjecting
FITC-dextrane and aimed
procedure
was
optimised
compartment. Cells
were
for
found
immobilised in
at
efficient
to
microinjection
the
cytoplasm
delivery
be at the
of
very thin
a
was
of
days by incubating
injection solution
was
in
particular
to
microinjection
monitored
optimal stage
for
into
solution
microinjection
kept
at
coinjection of FITC-dextraiie and pSH1913,
into 20-40 cells.
a
this
about 24
this stage
them at 4*C in the dark. Within 1 hour successful
routinely possible
by
injection
of target cells. The
injection
study
layer of medium
routinely
hours after immobilisation in solid medium. Embedded cells could be
for up to 4
subsequent
effective tool
parameters important for the successful transformation of plant cells by
and other
microinjection
delivery
Following cytoplasmic
plasmid containing
the
neo
(neomycin
1.
Summary
3
phosphotransferase II)
recovered
gene,
stably transformed, paromomycin
through selection. Transgenic tobacco lines has
clones.
Injection
mg/ml
have been tested. With 1
per
solutions
successfully injected
embedded
protoplasts
containing pSHI913
cell
at
determined
was
4°C before
of resistant clones obtained per
pattern and the location of injected cells
of
injected
dextrane and 1
developed
Transient
integration
that
of the
injection
of the
of
DNA
found
Protoplasts
recorded
were
to
1
of
reduce the percentage
immobilised above
by Polaroid photography.
firefly
injected
average about 20% of the
on
roughly
50% of these calli
luciferase gene
(Luc)
pAMLwc. Approximately
expressed the
this time
at
was
higher. Incubation
possible. Following cytoplasmic coinjection
was
into microcalli and
24 hours after
alive
cells
mg/ml plasmid
expression
was
or
a
grid
The fate
cells could be observed. Isolation and individual culture of clones
particular targeted
derived from
be about 3.5 times
to
cell.
|ig/ml
DNA the percentage of resistant clones
microinjection
injected
been established from such
concentration of either 50
at a
mg/ml plasmid
resistant clones could be
Luc gene
was
were
essentially
cells
non-destructively analysed
50% of the
all
targeted
stably transformed.
injected
transiently. Apparently,
genes occurred in
of FITC-
cells that
stable
were
genomic
transiently expressing
cells
developed into clones.
("High-efficiency transient and stable transformation by optimised DNA microinjection
protoplasts."
into tobacco
Potrykus
B. Kost, A. Galli, I.
and G. Neuhaus; submitted
to
"Journal of Experimental Botany ")
Genes
encoding
particular target
alginate on
cells within excised
medium with
plasmid DNA
of
appeared
microinjected
zygotic
a
tiny
under
optimal
A. thaliana and B.
amount
visual control into
juncea embryos. The
of culture medium solidified with
the top of solid basis medium. The type and concentration of the
optimised
delivery
were
have been immobilised in
embryos
been
visible markers
for firm
injection capillaries.
solution into
be difficult
development
of
however, could
targeted
Microinjection
cells
had
no
targeted embryos. Transient
never
be observed.
and easy
FTTC-dextrane
in order to be able to monitor the
injection
to
embryo immobilisation
was
delivery
was
penetration
with the
of injection solution. Successful
possible
stable
embedding
coinjected together
in many cases,
deleterious effects
or
of the
alginate has
on
although
it
the further in vitro
expression of injected genes,
2.
Zusammenfassung
2.
4
Zusammenfassung
Um das Schicksal
einzelner, genetisch markierter Zellen in zygotischen Embryonen
KreuzblMern wahrend der in vitro
engineered
cell fate
fur den Nachweis
wurde
optimiert
mapping"),
LUC
von
und ein
Entwicklung verfolgen
folgende Techniken
wurden
Videokamera-System
wurde
in lebenden Pflanzenzellen
aufgebaut,
mit dessen Hilfe LUC
Aktivitat in einzelnen Pflanzenzellen detektiert werden kann. 2) Ein
Entwicklung
die in vitro
bereits friiher
worden
(Kost
Arbeit wird ein ahnliches, verbessertes
Embryonen
junger
Zellen
Embryonen
Entwicklungsstadium
die
daraus
von
Appendix).
In der
vorliegenden
Kreuzbliidern wurden ausgetestet. Der Gentransfer in
resultierende
Expression
Pflanzenzellen wurde
am
optimiert
Markergenen (Gene,
gemacht werden kann)
analysiert
sowie erste
Die
und
deren
in einzelnen Zellen
Die Technik der DNA
Anwendungen
Manuskripte
Ergebnisse prasentiert werden,
sind.
sichtbaren
von
wurde
Mikroinjektion
in
auf
juncea Embryonen angewandt. Die Entwicklung der
beschrieben. Zusatzlich wurden
zusammengefasst
Mikroprojektilen
Modellsystem "Tabak Protoplasten" verbessert und
A. thaliana und B.
aufgezaWten Techniken
mit
sichtbar ist oder
und multizellularen Sektoren wurde
Abschnittes
al. 1992,
Kultursystem fur Brassica juncea (Indischer Senf)
Bombardierung
durch
Expression in lebenden Zellen
globulare
et
ist
juncea Embryonen im globularen, intermediaren und herzfQrmigen
B.
von
das
3) Zwei alternative Methoden fur den Gentransfer in Zellen
beschrieben.
isolierter
Kultursystem,
globularen Arabidopsis thaliana Embryonen erlaubt,
von
ausgearbeitet
1) Die Methode
entwickelt:
("Firefly" Luciferase) Aktivitat
("genetically
konnen
zu
von
die
in
zur
jedem
sind in der
Publication
der
drei
vorliegenden
eingereicht,
Arbeit
in denen die
nachfolgenden Abschnitte
entsprechenden Literaturhinweise sind
am
Ende
jedes
aufgefuhrt.
Basierend auf einer Stickstoff
gekiihlten, langsam auslesenden CCD (Charge Coupled
Device) Kamera wurde ein flexibles und vergleichsweise kostengiinstiges System
aufgebaut, mit dem schwache Lichtemissionen (Biolumineszenz, Chemilumineszenz oder
Fluoreszenz) quantitativ detektiert werden konnen. Dieses Kamerasystem und das
"Firefly"
Luciferase Gen
transgene
Aufnahmen
Tabaklinien
von
durch
Gentransfer
regenerierten Sprossen,
negative Auswirkungen
werden. Schnitte durch
Protoplasten
direkten
herzustellen.
wurden
von
von
Keimlingen
auf die Vitalitat des untersuchten Materials
Lwc-exprimierende
ebenfalls
in
Biolumineszenz konnte sogar durch das
fur den Nachweis
Pflanzchen und Tl
Blatter sowie
Substratlosung
Mikroskop
aus
um
Biolumineszenz
einzelnen, transient Luc-exprimierenden Tabakzellen sowie
transformierten Kalli,
ohne
(Luc) als "selektierbarer" Marker wurden verwendet,
stabil
konnten
gemacht
solchen Blattern isolierte
inkubiert
Die
ausgesandte
detektiert werden. Um die Methode
LUC Aktivitat in Pflanzenzellen
zu
optimieren,
wurde die
von
Luc-exprimierenden Tabakbl&ttern und -protoplasten in verschiedenen Substratl&sungen
2.
Zusammenfassung
5
prcxiuzierte Biolumineszenz
Inkubation in
gemessen und die Kinetik der
Substratldsung
Lichtproduktion wahrend
bestimmt
("Non-destructive detection of firefly luciferase (LUC) activity
using
I.
a
cooled, slow
CCD
scan
der
and
camera
an
single plant
in
cells
optimised assay." B. Kost, M. Schnorf,
Potrykus and G. Neuhaus; "The Plant Journal", in press)
Eine Methode wurde
ausgearbeitet,
Mikroprojektilen in einzelne
Zellen
wurde
zu
ausgewachsenen,
auf dem sich
von
weniger
als 20 Zellen. Die
festem
Medium
Mikroprojektilen.
Embryonen
targeting"
und
frei
waren
Verwendung
Partikel
lang (Embryo
ii.m
Embryonen wuchsen
Der Beschuss
unter
30
waren
von
zuganglich
"particle
fuhrte
zu
Markergenen. Basierend
auf transienter GUS
Schiessparameter
beide
Partikelbeschuss
Auswirkung
fur
von
Partikel
Embryonen
auf die in vitro
unter
zum
und bestanden
Bombardierung
die
und friihen
inflow gun
(PIG)"
transienter
Expression
herzformigen
oder eines "micro-
Beschleunigungsapparate
sichtbaren
von
(P-Glukuronidase) Expression
optimierten Bedingungen
wurden die
optimiert.
hatte keine
subepidermale
Zellteilungsmuster
zeigen,
dass Zellen den
Empfang eines
Nachweis
sichtbare
von
GUS-Aktivitat
als
Markergene
Pflanzengewebe analysiert
Zellschicht ausdehnten, liessen
typisch
zu, die
Partikels
sind fur die Kreuzblutler
war
UidA
fur die untersuchten
wurden
werden kann.
getestet,
Embryoentwicklung.
Embryonen lethal.
deren
zu
der
von
Schliisse auf die
neue
Expression
Vorlaufige Ergebnisse zeigen,
ist, "Firefly" Luciferase (LUC) Aktivitat in bombardierten Embryonen
ohne deren Vitalitat
Der
negativen
iiberleben und sich nachher normal entwickeln konnen. Sektoren, die sich
in die
mit
Embryoentwicklung. Multizellulare, GUS-exprimierende
Sektoren wurden beobachtet, die
Epidermis
voll
auf der Oberflache
Einbettung
fur
(EMB)
die effizient
Embryonen,
globularen, intermediaren
einer
Beschleunigers
ohne
normal
Suspensor)
ohne
zu
wahrend der normalen
globulare B. juncea Embryonen
reifen Stadium entwickeln. Die kleinsten
kultiviert werden konnten,
aus
genetisch markierten Zellen
Ein einfaches und definiertes Kulturmedium
verfolgen.
zusammengestellt,
erlaubt, Gene durch Bombardierung mit
es
globularen, zygotischen B. juncea Embryonen
von
transferieren und das Schicksal der
Embryoentwicklung
die
in
dass
zu
Der
Andere
lebendem
es
moglich
detektieren,
vermindern.
("Transient marker gene expression during zygotic
embryogenesis of Brassica
in vitro
juncea (Indian mustard) following particle bombardment."
B. Kost, N. Leduc, C.
Sautter, I. Potrykus and G. Neuhaus; submitted to "Planta")
Ein effizientes
System wurde entwickelt,
Tabakprotoplasten
mit
nachfolgende Analyse
bestimmten Zielzellen
Systems
von
teilweise
das gut kontrollierbare DNA
regenerierten
transienter und stabiler
beziehungsweise
Zellwanden
zulasst,
sowie
Expression injizierter Markergene
in
die
in
daraus entstandenen Klonen. Mit Hilfe dieses
konnen Parameter ausgetestet werden, die fur die
Pflanzenzellen durch DNA
Mikroinjektion
erfolgreiche
Transformation
Mikroinjektion und andere Techniken wichtig sind. Die
2.
Zusammenfassung
Protoplasten
6
wurden
routinemassig
durch
ausgewShlten
immobilisiert.
Koinjektion
Zellen
Einspritzen
effizientes
diinnen, durch Zugabe
einer
Mediumschicht
verfestigten,
von
in
24 Stunden nach der
gezielt.
DNA
Alginat oder Agarose
Mikroinjektion
FITC-Dextran uberwacht und in das
von
Der gesamte
Immobilisierung
Injektionsvorgang wurde
in dieses
InjektionslQsung
von
Die
von
Zytoplasma
im Hinblick auf
Kompartiment optimiert. Ungefahr
verfestigtem
in
wurde
Medium
waren
die Zellen in einem
optimalen Stadium fur die Mikroinjektion. Eingebettete Zellen konnten durch Inkubation
in
volliger Dunkelheit
einer Stunde
war es
bei 4°C bis
zu
4
in diesem Stadium konserviert werden. In
mdglich, erfolgreich Injektionslosung
zytoplasmatischer Koinjektion
Nach
Tage
(Neomyzin Phosphotransferase TI)
in 20-40 Zellen
pSHT913
FTTC-Dextran und
von
zu
spritzen.
mit dem
Gen konnten stabil transformierte,
neo
Paromomyzin
resistente Klone durch Selektion isoliert werden. Eine Anzahl transgener Tabaklinien
wurde
von
solchen Klonen
regeneriert. Injektionslosungen, die entweder 50 |xg/ml oder
mg/ml pSHI913 enthielten, wurden getestet. Die
erfolgreiche Injektionen
Inkubation
von
ungefahr
war
Anzahl resistenter Klone auf 100
3.5x hoher mit 1
eingebetteten Zellen bei
4°C
vor
Reduktion der Anzahl resistenter Klone auf 100
der
mg/ml
Fotografien festgehalten.
verfolgt
konnte
werden. Es
isolierten und einzeln
mg/ml
Dextran und 1
aller
zu
injizierter
Zellen
diesem
kultivieren. Nach
zu
Mikrokalli und
Expression
des
injizierter
injizierten Zellen
Zellen wurde
injizierter
entstandene Klone
zytoplasmatischer Koinjektion
etwa
50%
Zellen
zu
FTTC-
von
ungefahr 20%
der Mikrokalli
waren
'Firefly" Luciferase Gens (Luc)
stabil
wurde 24
erfolgreich injizierten Zellen, die
Zeitpunkt uberlebt hatten, exprimierten
das Luc Gen transient. Stabile,
genomische Integration der injizierten
Gene
transient exprimierenden Zellen, die sich
("High-efficiency
into tobacco
einer
Etwas 50% der
Injektion analysiert.
Stunden nach der
zu
aus
zu
erfolgreiche Injektionen. Protoplasten
Das Schicksal ganz bestimmter
moglich,
ftihrte
Plasmid DNA entwickelten sich im Durchschnitt
transformiert. Transiente
bis
war
Plasmid DNA. Die
Mikroinjektion
wurden fiber einem Gittermuster immobilisiert und die Position
auf Polaroid
1
transient and stable
protoplasts."
B. Kost, A.
zu
erfolgte offensichtlich grundsatzlich
in alien
Mikrokalli weiter entwickelten.
transformation by optimised DNA microinjection
Galli, I. Potrykus and G. Neuhaus; submitted
to
"Journal of Experimental Botany ")
Sichtbare
Markergene
wurden unter
isolierten
zygotischen
A. thaliana und B.
wurden
in
immobilisiert.
einer
Typ
sehr
kleinen
optimaler optischer Kontrolle
Menge
juncea Embryonen injizierL
mit
Alginat verfestigtem
und Konzentration des verwendeten
Embryo Immobilisierung
und
Injektionskapillaren optimiert.
problemlose Penetration
Um das
konnen, wurde FITC-Dextran
Einspritzen
zusammen
regelm&ssig Schwierigkeiten auftraten,
in bestimmte Zellen in
von
Alginats
des
Die
Embryonen
Kulturmedium
wurde auf stabile
Einbettungsmediums
Injektionslosung uberwachen
mit der Plasmid DNA
konnte in vielen Fallen
koinjiziert.
mit
zu
Obwohl
Injektionslosung
in
2.
Zusammenfassung
Embryozellen
Auswirkungen
der
7
eingespritzt
werden.
auf die in vitro
injizierten Markergene
Die
Mikroinjektion
Embryoentwicklung.
wurde
allerdings
keine
negativen
Transiente oder stabile
Expression
nie beobachtet.
hatte