Luciferase-Reporterassay
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Luciferase-Reporterassay Donnerstag 4.11. und Freitag 5.11. Messung der Genexpression des EP-Gens von Trypanosoma brucei nach Induktion durch Kälteschock (Martin Brenndörfer) Einleitung Biolumineszenz, die Erzeugung von Licht durch enzymatische Reaktionen, ist ein Phänomen, das bislang in Organismen aus 17 Phyla und über 700 Genera beobachtet werden konnte. Die biologische Leuchtreaktion kann durch verschiedene Enzyme katalysiert werden, die man allgemein als Luciferasen bezeichnet. Die korrespondierenden Substrate werden Luciferine genannt. Die Luciferase PhotinusLuciferin 4-mono-oxygenase (EC 1.13.12.7) aus dem nordamerikanischen Glühwürmchen Photinus pyralis, ist das am besten untersuchte Enzym (de Wet et al. 1987). Bei in vitro Versuchen hat diese Biolumineszenzreaktion eine Quantenausbeute1 von >0,88, was zu erhöhter Sensitivität gegenüber anderen Reportersystemen beiträgt (Bronstein et al. 1994). In diesem Praktikumsversuch soll die Expression des Luciferase Reportergens (Gould and Subramani 1988) bestimmt und verglichen werden. Ein Luminometer misst mit einem Photomultiplier die Lichtmenge im Spektralbereich zwischen 390 und 620nm, die bei der enzymatisch katalysierten Oxidation von D-Luciferin zu Oxyluciferin emittiert wird und gibt diese als relative Lichteinheiten (RLU, „relative light units“) aus. Da die Reaktion der Michaelis-Menten Kinetik folgt, ist bei Eduktüberschuß die Lichtemission proportional zur Luciferasemenge in der Probe. In der dargestellten Reaktion wird Luciferin durch die P.pyralis Luciferase zu Oxyluciferin umgewandelt. Die Reaktion ist ATP-abhängig. Es entsteht Licht einer Wellenlänge von 562nm. Das monomere, 62kDa große Enzym Luciferase benötigt keine posttranslationale Modifikation, die Enzymaktivität beginnt unmittelbar nach der Translation. Im Gegensatz zur „flash“ Lumineszenz, die nur für einige Sekunden Emission zeigt, wird bei der, in diesem Versuch durchgeführten, „glow“ Lumineszenz durch Zugabe von Coenzym A und DTT die Umwandlung des Oxyluciferin-Enzym Komplexes zu freiem Enzym, AMP und Oxyluciferin-CoA ermöglicht. Dies gewährleistet anhaltende Reaktionszyklen, mit über einen Zeitraum von mehreren Minuten fast konstanter Lichtemission. Die maximale Signalstärke ist dennoch vergleichbar (Airth et al. 1958). Dadurch wird eine genaue Messung auch ohne automatisierte Probeninjektion und -durchmischung ermöglicht. Die Zugabe von DTT hält das Coenzym A im 1 Quantenausbeute: Zahl, der von jedem umgesetzten Substratmolekül emittierten Photonen 1 reduzierten, aktiven Zustand und schützt zusätzlich die Sulfhydrylgruppen im aktiven Zentrum der Luciferase. Luciferase als Reportergen In diesem Versuch soll das Prinzip von Reportergen-Assays zur Analyse von Genexpression veranschaulicht werden. Ein Reportergen codiert für ein heterologes Protein (aus einer anderen Spezies) welches durch einen geeigneten Testaufbau (Assay) leicht und sensitiv nachweisbar ist. Der Assay darf in den zu untersuchenden Zellen keinen nennenswerten Hintergrund erzeugen. Fusioniert man ein solches Gen z.B. mit der Promotorregion eines zweiten Gens und bringt die rekombinante DNA zurück in den zu untersuchenden Organismus oder dessen kultivierte Zellen, wird das Reportergen unter die Kontrolle dieses Promotors exprimiert. Anhand der Aktivität des Reportergens lässt sich dann auf die Aktivität des untersuchten Promotors bzw. dessen Regulation schließen. In gleicher Weise können auch Elemente der posttranskriptionellen Regulation untersucht werden, wie in diesem Versuch durchgeführt. Kälteschock in Trypanosomen Trypanosoma brucei wechselt im Laufe seines Lebenszyklus zwischen zwei Wirten, einem Säugetier und der blutsaugenden Tsetsefliege als Überträger (Vektor). An beide Wirte muss der Parasit perfekt angepasst sein, was z.B. durch unterschiedliche Oberflächenproteine erreicht wird. Im Säuger sind die Trypanosomen von einem VSG- (variant surface glycoprotein) Mantel umgeben, während im Verdauungstrakt der Fliege das Glykoprotein EP (Name aufgrund charakteristischer E-P Wiederholungen in der AS-Sequenz) Schutz vor Proteasen gewährt. Die Expression der EP-Gene ist im Säugerwirt bei 37°C vollständig reprimiert. Setzt man die Trypanosomen einem Kälteschock (20°C) aus, womit der Übergang zu dem wechselwarmen Insekt simuliert wird, exprimieren sie jedoch EP innerhalb kürzester Zeit. Untersuchung des Kälteschocks durch Luciferase als Reportergen Im Praktikumsversuch werden die zwei Luciferasegene luc und luc+ aus den Promega Vektoren pGL2 bzw. pGL3 eingesetzt. Das pGL3 Reportersystem ist eine Weiterentwicklung von pGL2 mit etwa 10fach stärkerem Signal. Im Bioinformatik Teil dieses Praktikums sollen durch Sequenzanalyse die Unterschiede der beiden Reportergene identifiziert werden. Zur Untersuchung der Kälteschockinduktion des EP1 Gens in T.brucei wurde der kodierende Bereich des Gens EP1 im natürlichen Locus in Trypanosomen durch das Luciferase-Gen luc bzw. luc+ ausgetauscht. Das in Tandem angeordnete EP2-Gen wurde durch ein Neomyzin-Resistenzgen ersetzt, welches die Selektion solcher Trypanosomen erlaubt, bei denen der gewünschte Genaustausch stattgefunden hat. Das Substrat für homologe Rekombination ist das rekombinante Plasmid pG.Luc 2 (bzw. pG.Luc+) welches die einzusetzenden Fusionsgene für Luciferase und Neomyzinresistenz sowie flankierende- zum T.brucei Genom homologe Sequenzen enthält. Darstellung der homologen Rekombination zur Integration des Luciferase- und NeomyzinResistenzgens vom Plasmid pG.Luc (bzw. pG.Luc+) in den EP/PAG1 Locus auf Chromosom X. Die 5’ und 3’ UTRs sind dunkel- bzw. hellgrau dargestellt. Gene enthalten außer den codierenden Sequenzen so genannte UTRs (untranslated regions) an den 5’- und 3’ Enden, welche eine Rolle bei der posttranskriptionellen Regulation der Expression spielen können. Es ist bekannt, dass die 3’-UTR des EP1Gens für die hier untersuchte Kälteschockantwort verantwortlich ist. In diesem Versuch werden transgene Trypanosomen, die anstatt des EP1-Gens die Luciferase unter Kontrolle der EP1-3’-UTR tragen, bei 37°C oder bei 20°C inkubiert. Anschließend werden die Zellen geerntet und lysiert. Die Luciferase-Aktivität der Zellextrakte soll bestimmt und miteinander verglichen werden. Benötigte Puffer Erntepuffer (TDB = Trypanosoma dilution buffer pH7,7): 5 mM KCl 80 mM NaCl 1 mM MgSO2 20 mM Na2HPO4 2 mM NaH2PO4 20 mM Glucose Lysepuffer: 250 mM Tris-HCl pH 7,8 1 mM EDTA 1 mM DTT 0,2 % Saponin Luciferase-Assay-Reagenz: 20 mM Tris-HCl pH 7,8 5 mM MgCl2 0,1 mM EDTA 33,3 mM DTT 270 µM Coenzym A 470 µM Luciferin2 530 µM (ribo)ATP (nicht dATP, wie etwa für PCR) 2 Luciferin ist Licht empfindlich. Deshalb ist das Gefäß in Alufolie eingewickelt. 3 Durchführung Achtung: Trypanosomen sind pathogen! Deshalb bitte Handschuhe tragen und alle Abfälle zum Autoklavieren geben. 1. Herstellung der Zellextrakte Für den Versuch werden von den Betreuern die Zellen (T.brucei MITat1.2 Δep::LUC NEO und T.brucei MITat1.2 Δep::LUC+ NEO) für über Nacht bei 20°C bzw. 37°C inkubiert. Anschließend werden die Zellen gezählt und jede Gruppe erhält 7,5 x 106 Zellen in HMI9 Medium (Standardmedium für die Kultivierung von T.brucei) in einem 50ml Reaktionsgefäß. Folgende Schritte führen Sie selbst AUF EIS durch: • Zellen abzentrifugieren (10min, 1400g, 4°C) • Überstand abgießen (Flüssigabfall muss autoklaviert werden) • Zellen in Erntepuffer waschen: Pellet vorsichtig in 5ml kaltem Erntepuffer resuspendieren Zellen erneut zentrifugieren (10min, 1400g, 4°C) Überstand bis auf ca. 0,5ml abgießen (Flüssigabfall autoklavieren) Zellen in den verbleibenden 0,5ml resuspendieren • Zellen mit Pipette in 2ml Eppendorf-Reaktionsgefäße überführen • Zellen abzentrifugieren (10min, 1400g, 4°C) • Überstand mit Pipette vollständig3 entfernen (Flüssigabfall autoklavieren) • Zellpellet in 150µl Lysepuffer aufnehmen • Zellen mit Frier-Tau-Methode aufschließen: Zellen in einem Trockeneis-Ethanolbad vollständig gefrieren Im 37°C Wasserbad auftauen bis nur noch ein kleiner Eisklumpen sichtbar Frier-Tau-Zyklus 3x nacheinander wiederholen Zellen bis zur Zentrifugation auf Eis • Zentrifugation (10min, 10000g, 4°C), um lösliche von partikulärer Fraktion (Zellkerne, Organellen, Membranen, Zytoskelett) zu trennen • Überstand (=Zellextrakt mit löslichen Proteinen) in neues EppendorfReaktionsgefäß überführen Extrakte unbedingt immer auf Eis halten, um Proteolyse der Luciferase zu verhindern. 2. Messung der Luciferase-Aktivität Die Messung erfolgt gruppenweise am Luminometer Lumat LB 9501 der Firma Berthold. Jeweils zwei Gruppen führen zusammen mit dem Betreuer die Messung gleichzeitig durch. Bis zur Messung halten bitte alle Gruppen ihre Proben auf Eis. Zellextrakt und Luciferase-Assay-Reagenz werden erst direkt vor der Messung am Luminometer gemischt! 3 Das im HMI9 Medium enthaltene Phenolrot verringert die Sensitivität der Messung 4 Messung der Luciferase-Aktivität in den Zellextrakten: • 90µl Luciferase-Assay-Reagenz in Röhrchen vorlegen (bei Raumtemperatur) • 10µl eiskalten Zellextrakt zugeben und mischen • 100sec inkubieren und dann im Luminometer messen Negativkontrolle: • 90µl Luciferase-Assay-Reagenz in Röhrchen vorlegen (bei Raumtemperatur) • 10µl eiskalten Lysepuffer zugeben und mischen • 100sec inkubieren und dann im Luminometer messen Auswertung Berechnen Sie die Luciferase-Aktivität in allen gemessenen Proben bezogen auf 5x105 Zellen. Beachten Sie, dass hierzu der „Hintergrund“ (Negativkontrolle) von allen Rohmesswerten abgezogen werden muss. Vergleichen sie die Messwerte bei 20°C und 37°C und berechnen Sie den Faktor der Induktion nach Kälteschock. Luciferase-Aktivität pro 5x105 Zellen [RLU] Negativkontrolle Luc 37°C Luc 20°C Luc+ 37°C Luc+ 20°C Messwert nach Abzug des Hintergrundes [RLU] -------- Luc Induktionsfaktor (20°C/ 37°C) Luc+ Induktionsfaktor (20°C/ 37°C) Die von allen Gruppen gemessenen Werte, sollen in einer Exceltabelle gesammelt und die Mittelwerte sowie die jeweiligen Standardabweichungen verglichen werden. Wie stark schwanken die Messwerte und Induktionsfaktoren zwischen den verschiedenen Luciferase Reportern? Wie groß sind die Unterschiede zwischen den Gruppen? Literatur Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 9, Section II, Units 9.6-9.8 Lottspeich, Zorbas, (1998). Bioanalytik. S. 665 f, S. 898 ff Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg/Berlin Sambrook, Fritsch, Maniatis (2001). Molecular Cloning. A9.21 ff Cold Spring Harbor Laboratoty Press, New York 5 Bestimmung der Gesamtprotein-Konzentration im Zellextrakt nach Bradford Einleitung Zusätzlich zur Eichung der Ergebnisse des Luciferase Assays über die in den Versuch eingesetzte Zellzahl, sollen die Messwerte auch durch photometrische Bestimmung der Gesamtproteinmenge im Zellextrakt mit dem BIO RAD Protein Assay normiert werden. Die Proteinbestimmung basiert auf der Beobachtung, dass sich das Absorptionsmaximum einer sauren Coomassie Brilliant Blue G-250 Lösung nach Bindung an Proteine von 465nm auf 595nm verschiebt (Bradford 1976). Nach Erstellung je einer Eichgeraden für jedes Photometer kann, anhand gemessener Absorption des Zellextraktes, die Gesamtprotein Konzentration ermittelt werden. Durchführung • • • Nur eine Gruppe bereitet das Reagenz und die Eichgerade für alle Kursteilnehmer vor. Die BIO RAD Protein Assay Reagenz Stocklösung 1:5 verdünnen mit ddH2O Anschließend durch Faltenfilter filtrieren 1. Eichgerade • • Eichreihe von 1-10µg BSA (Bovine Serum Albumin = Standard Proteinlösung) in 100µl H2O im Triplikat herstellen aus 1mg/ml BSA Stocklösung. Dazu die Ansätze direkt in beschriftete Halbmikroküvetten pipettieren Pipettierschema für Eichreihe 0µg/100µl 1µg/100µl 2µg/100µl 4µg/100µl 6µg/100µl 8µg/100µl 10µg/100µl • • • • • • 0 µl BSA + 100 µl H2O (ad 100µl) als Blank-Wert ___µl BSA + ____µl H2O (ad 100µl) ___µl BSA + ____µl H2O (ad 100µl) ___µl BSA + ____µl H2O (ad 100µl) ___µl BSA + ____µl H2O (ad 100µl) ___µl BSA + ____µl H2O (ad 100µl) ___µl BSA + ____µl H2O (ad 100µl) Zu jedem dieser Ansätze 1ml des 1:5 verdünnten BIO RAD Reagenzes geben Küvetten mit Parafilm abdecken und kurz durch invertieren mischen Alle Ansätze für 5-15min bei RT inkubieren. Eichgerade erstellen an beiden Photometern bei 595nm Dazu entsprechende Triplikate hintereinander messen und Werte in eine Exceltabelle eintragen Wenn Eichgerade akzeptabel die Zellextrakte messen 6 2. Messung der Zellextrakte • • • • • • Nach Erstellung einer akzeptablen Eichkurve je 10µl des Zellextraktes und 90µl ddH2O in Halbmikroküvette vorlegen. Um Pipettierfehler auszuschließen alle Messungen der Zellextrakte im Duplikat durchführen. D.h. insgesamt 8 Ansätze pro Gruppe Zu jeder Küvette 1ml des 1:5 verdünnten BIO RAD Reagenzes geben Die Küvetten mit Parafilm abdecken und durch Invertieren mischen Anschließend für 5-15min bei RT inkubieren Absorption bei 595nm messen Zelllinie Inkubationstemp Abs595 Messung1 Abs595 Messung2 Abs595 Mittelwert Gesamtprotein/ 10µl Zellextrakt Luc 37°C Luc 20°C Luc+ 37°C Luc+ 20°C • • • Berechnen Sie aus den Mittelwerten des Bradford Assays und der Geradengleichung der Eichkurve des entsprechenden Photometers die Gesamtproteinmenge/ 10µl Zellextrakt Berechnen Sie aus den Messwerten von Luciferase und Bradford Assay die Luciferaseaktvität pro µg Gesamtprotein. Welcher Induktionsfaktor ergibt sich aus den Werten nach Normierung auf die Gesamtproteinkonzentration? Luc Induktionsfaktor (20°C/ 37°C) Luc+ Induktionsfaktor (20°C/ 37°C) • • • Tragen sie die Ergebnisse ebenfalls in die Exceltabelle ein. Wie unterscheiden sich die Messwerte zwischen den Gruppen? Woraus resultieren mögliche Differenzen? 7 Vergleich der Luciferase Reportergene aus pGL2 und pGL3 Einleitung Im Luciferase-Reporterassay Versuch werden zwei verschiedene Luciferase Gene als Reporter eingesetzt (Luc aus dem Promega Vektor pGL2 und Luc+ aus pGL3). Das Luc+ Luciferase Gen ist eine gentechnische Weiterentwicklung der Luciferase, von P.pyralis. Die Signalstärke von Luc+ ist durch geringfügig veränderte Aminosäuresequenz deutlich erhöht. Dies führt zu einem besseren Signal/Hintergrund Verhältnis, was die Analyse vor allem schwächerer Signale verbessert. Durch bioinformatische Methoden sollen die Unterschiede identifiziert werden. Welche Veränderungen wurden in den pGL3 Vektor eingeführt und warum? Diese Aufgaben können in freier Zeiteinteilung immer dann bearbeitet werden, wenn zwischen den Versuchen unvermeidliche Pausen entstehen. Die benötigten Programme wurden bereits auf allen CIP-Pool Rechnern vorinstalliert. Durchführung • Laden Sie sich die (Basic) Vektorsequenzen herunter. http://www.ncbi.nlm.nih.gov pGL2-Basic Vector GenBank Accession Number X65323 pGL3-Basic Vector GenBank Accession Number U47295 oder www.promega.com • Importieren Sie die Nukleotidsequenz in das Programm Gene Construktion Kit (GCK Demoversion unter http://www.textco.com/downloads/index.html) Machen Sie aus der zunächst linearen Sequenz ein zirkuläres Plasmid Suchen Sie nach Leserahmen Identifizieren Sie die einzelnen Leserahmen. Was ist die jeweilige Funktion? Speichern Sie die Sequenz der Luciferase im Fasta Format in ein Simple Text Fenster. (>„NAME ohne jedes Sonderzeichen“ <enter> „Sequenz“) z.B. • • • • 8 • Machen Sie je ein Alignment der Nukleotid- und Aminosäuresequenz mit dem Programm ClustalX (Befehle Append Sequences/ Do Complete Alignment) Auswertung • • • Wo sind Unterschiede auf Nukleotid und Aminosäure Ebene? Recherchieren Sie den Grund für die offensichtlichsten Veränderungen. Folgende Links können bei der Auswertung weiterhelfen: http://www.promega.de/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 9
