(full text in PDF). - Lehrstuhl für Biochemie - Friedrich

Die Bedeutung des zentralen
Blatt-Kohlenhydratstoffwechsels von
Arabidopsis thaliana für die Interaktion mit
Colletotrichum higginsianum
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
vorgelegt von
Timo Engelsdorf
aus Braunschweig
Als Dissertation genehmigt von der
Naturwissenschaftlichen Fakultät der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 13. März 2013
Vorsitzender der
Promotionskommission:
Prof. Dr. Johannes Barth
Erstberichterstatter:
Prof. Dr. Uwe Sonnewald
Zweitberichterstatter:
PD Dr. Ruth Stadler
Teile dieser Arbeit sind in folgender Publikation enthalten:
Engelsdorf T, Horst RJ, Pröls R, Pröschel M, Dietz F, Hückelhoven R, Voll LM
(2013) Reduced carbohydrate availability enhances susceptibility of Arabidopsis towards
Colletotrichum higginsianum. Plant Physiology: doi: 10.1104/pp.112.209676
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung
1
Summary
2
1
Einleitung
5
1.1
Biotischer Stress bei Pflanzen - Phytopathologie . . . . . . . . . . . . . .
5
1.2
Determinanten von Suszeptibilität und Resistenz . . . . . . . . . . . . .
6
1.2.1
Zellwand-basierte Abwehr von Pflanzen . . . . . . . . . . . . . .
7
1.2.2
Die basale Abwehr von Pflanzen . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7
1.2.3
Spezifische Abwehr in Pflanze-Pathogen Interaktionen . . . . . .
9
1.2.4
Hormonsignalwege in der Abwehrantwort . . . . . . . . . . . . .
9
Lebensweisen phytopathogener Pilze . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11
1.3.1
Das Arabidopsis - Colletotrichum Pathosystem . . . . . . . . . .
13
1.4
Kohlenhydratstoffwechsel in Arabidopsis-Blättern . . . . . . . . . . . . .
16
1.5
Biosynthese und Zusammensetzung der primären Zellwand in
1.3
2
Arabidopsis-Blättern . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
19
1.6
Die Bedeutung des pflanzlichen Primärmetabolismus für Suszeptibilität .
20
1.7
Zielsetzung dieser Arbeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
23
Material und Methoden
24
2.1
Chemikalien, Enzyme und Verbrauchsmaterialien . . . . . . . . . . . . .
24
2.2
Oligonukleotide und Sequenzierungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
24
2.3
Biologisches Material . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
24
2.3.1
Arabidopsis thaliana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
24
2.3.2
Phytopathogene Pilze . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
24
2.3.2.1
Colletotrichum higginsianum . . . . . . . . . . . . . .
24
2.3.2.2
Erysiphe cruciferarum . . . . . . . . . . . . . . . . . .
24
Anzucht- und Infektionsmethoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
25
2.4.1
Anzucht von Arabidopsis thaliana . . . . . . . . . . . . . . . . .
25
2.4.2
Kultivierung von Colletotrichum higginsianum . . . . . . . . . .
26
2.4.2.1
26
2.4
Infektion von A. thaliana mit C. higginsianum . . . . .
i
I NHALTSVERZEICHNIS
2.4.3
Kultivierung von Erysiphe cruciferarum . . . . . . . . . . . . . .
27
2.4.3.1
Infektion von A. thaliana mit E. cruciferarum . . . . .
27
Mikroskopische Methoden und histologische Färbungen . . . . . . . . .
27
2.5.1
Mikroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
27
2.5.2
Trypanblau Färbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
27
2.5.3
Klassifizierung der Infektionsstadien von C. higginsianum . . . .
27
2.5.4
Anilinblau Färbung von Callose . . . . . . . . . . . . . . . . . .
28
2.5.5
Stärkefärbung mit Jod-Kaliumjodid . . . . . . . . . . . . . . . .
28
Molekularbiologische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
28
2.6.1
Molekularbiologische Standardmethoden . . . . . . . . . . . . .
28
2.6.2
Schnellpräparation genomischer DNA . . . . . . . . . . . . . . .
28
2.6.3
Quantitative PCR genomischer DNA von C. higginsianum . . . .
29
2.6.4
Quantitative PCR genomischer DNA von E. cruciferarum . . . .
29
2.6.5
Isolation von RNA aus Pflanzengewebe . . . . . . . . . . . . . .
30
2.6.6
Northernblot-Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
31
2.6.6.1
Sondenherstellung für Northernblot-Analysen . . . . .
31
Metabolitanalysen und physiologische Methoden . . . . . . . . . . . . .
31
2.7.1
Bestimmung der Gehalte an löslichen Zuckern und Stärke . . . .
31
2.7.2
Analyse der Zellwand-Monosaccharid Zusammensetzung . . . .
32
2.7.3
Protoplast Release Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
34
2.7.4
Bestimmung der Gehalte an Salicylsäure und Camalexin . . . . .
34
2.7.5
Bestimmung der Gehalte löslicher Phenylpropane . . . . . . . . .
35
2.7.6
Bestimmung der Gehalte zellwandgebundener Phenylpropane . .
36
2.7.7
Bestimmung der Gehalte an Glucosinolaten . . . . . . . . . . . .
37
2.7.8
Bestimmung der Gehalte an Raphanusamsäure . . . . . . . . . .
38
2.7.9
Bestimmung von Chlorophyllgehalten . . . . . . . . . . . . . . .
38
2.8
Chemische Mutagenese von Arabidopsis Saatgut . . . . . . . . . . . . .
39
2.9
Durchmusterung chemisch mutagenisierter Arabidopsis pgm Mutanten . .
40
2.10 Analyse selektierter Mutanten im Wildtyp-Hintergrund . . . . . . . . . .
41
2.11 Kartierung von Mutationen selektierter Kandidaten . . . . . . . . . . . .
42
2.12 Statistische Hypothesentests . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
42
Ergebnisse
43
2.5
2.6
2.7
3
3.1
3.2
Die Beeinträchtigung des Arabidopsis Stärke-Stoffwechsels erhöht die
Suszeptibilität für C. higginsianum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
43
Kohlenstoffmangel erhöht die Suszeptibilität für C. higginsianum . . . . .
49
ii
I NHALTSVERZEICHNIS
3.3
Die induzierte Abwehrantwort ist in stärkefreien Arabidopsis-Mutanten
beeinträchtigt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.4
Die Penetrationsresistenz von Arabidopsis-Mutanten mit beeinträchtigtem Stärkestoffwechsel gegen C. higginsianum ist reduziert . . . . . . . .
3.5
71
Stärkefreie Arabidopsis haben eine erhöhte Resistenz gegen Erysiphe cruciferarum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.9
68
Kohlenstoffmangel bewirkt eine Reduktion spezifischer Monosaccharide
in der Zellwand von Arabidopsis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.8
65
Veränderungen der Zellwand-Zusammensetzung können die Suszeptibilität für C. higginsianum beeinflussen . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.7
59
Die Zellwand-Monosaccharid Zusammensetzung stärkefreier ArabidopsisMutanten ist verändert . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.6
53
74
Identifizierung von Suszeptibilitäts-Suppressor-Mutationen mittels Vorwärtsgenetik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
76
3.10 Chemische Mutagenese und Durchmusterung von Arabidopsis pgm Mu-
4
tanten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
76
3.11 Genetische Charakterisierung potentieller Suppressormutanten . . . . . .
82
Diskussion
92
4.1
Die Kohlenhydratverfügbarkeit in Arabidopsis beeinträchtigt die Suszeptibilität für C. higginsianum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.1.1
Die Kohlenhydratverfügbarkeit begrenzt das Ausmaß induzierter
Abwehrreaktionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.1.2
92
94
Die Penetrationsresistenz gegenüber C. higginsianum ist in Mutanten des Stärkestoffwechsels beeinträchtigt - Welche Rolle spielen dabei Glucosinolate? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.1.3
98
Veränderungen in der Zellwandzusammensetzung beeinflussen
die Interaktion von Pflanzen mit phytopathogenen Pilzen . . . . . 100
4.2
Die Kohlenhydratverfügbarkeit des Wirtes begrenzt das Wachstum biotropher Hyphen von C. higginsianum nicht . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
4.3
Eine chemisch mutagenisierte Population stärkefreier Mutanten beinhaltet Colletotrichum higginsianum-resistente Linien . . . . . . . . . . . . . 105
4.3.1
Die angewandte Durchmusterung ermöglicht die Kartierung einer
Teilmenge der selektierten Mutanten . . . . . . . . . . . . . . . . 106
4.3.2
Welche Mutationen könnten zu einer generellen Resistenz gegenüber C. higginsianum beitragen? . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
iii
I NHALTSVERZEICHNIS
4.3.3
Die Suszeptibilität stärkefreier Mutanten kann durch induzierte
Mutationen spezifisch supprimiert werden . . . . . . . . . . . . . 108
Literaturverzeichnis
111
Abbildungsverzeichnis
133
Tabellenverzeichnis
135
Abkürzungsverzeichnis
136
Anhang
137
A.1 Verwendete Oligonukleotide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137
A.2 Kohlenhydratgehalte in Arabidopsis nach Infektion mit C. higginsianum
und Kontrollbehandlung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140
A.3 Elutionszeiten und Absorptionsmaxima analysierter Phenlypropane . . . 142
A.4 Analyse von Transkript-Daten von Genen des Zellwand-Metabolismus in
pgm im Vergleich zu Col-0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143
A.5 Kartierungsergebnisse der pgm EMS Linien 3-6-8, 7-16-2, 8-18-1 und 97-10 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144
A.6 Liste der Gene zwischen 21,1 Mb und 21,9 Mb auf Chromosom 3 von
Arabidopsis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147
iv
Zusammenfassung
Hemibiotrophe Pathogene interagieren mit ihren Wirtspflanzen in zwei zeitlich aufeinanderfolgenden Phasen. In einer initialen biotrophen Phase wachsen die Pathogene innerhalb lebendender Wirtszellen, während das Wirtsgewebe in der nachfolgenden nekrotrophen Phase sequentiell abgetötet wird. Colletotrichum higginsianum ist ein hemibiotropher Pilz, der eine kompatible Interaktion mit Arabidopsis thaliana eingeht und dabei verschiedene klar definierte Infektionsschritte durchläuft. Nachdem die Zellwand des
Wirtes mit einem Appressorium durchstoßen wurde, bildet der Pilz intrazelluläre biotrophe Hyphen die von der Plasmamembran der Wirtszelle umgeben sind. Nach einer kurzen
biotrophen Phase wird das Blattgewebe von sekundären nekrotrophen Hyphen besiedelt,
woraufhin großflächige nekrotische Läsionen auf Blättern der Wirtspflanze entstehen.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Kohlenhydratverfügbarkeit von
Arabidopsis die Suszeptibilität gegenüber C. higginsianum beeinflusst. Mutanten mit einem beeinträchtigten Stärkestoffwechsel wurden schneller durch den Pilz besiedelt und
wiesen nach Etablierung der Interaktion stärkere Krankheitssymptome auf. Quantitative
Analysen des intrazellulären Pilzwachstums zeigten, dass diese Mutanten unabhängig von
der Dauer der Lichtphase eine erhöhte Suszeptibilität gegenüber C. higginsianum aufwiesen. Daraus konnte geschlossen werden, dass nicht die Dauer des Zuckermangels, sondern
die Reduktion des Kohlenhydratbudgets die erhöhte Suszeptibilität vermittelt. Dieser Zusammenhang wurde auch durch eine negative Korrelation zwischen der Kohlenhydratakkumulation während der Lichtphase und der Suszeptibilität gegenüber C. higginsianum
unterstützt.
Durch die Untersuchung weiterer Genotypen mit einem nächtlichen Kohlenstoffmangel konnte eine klare Koinzidenz zwischen dem diurnalen Kohlenhydratumsatz und der
Suszeptibilität weiter bekräftigt werden. Analysen verschiedener induzierter Abwehrreaktionen zeigten, dass die Kapazität zur Bildung von Sekundärmetaboliten wie Salicylsäure, Camalexin und Glucosinolaten in stärkefreien Mutanten aufgrund einer reduzierten
Kohlenhydratverfügbarkeit vermindert war.
Durch Dunkel-induzierten Kohlenhydratmangel während verschiedener Phasen der Interaktion zwischen Arabidopsis und C. higginsianum konnte gezeigt werden, dass der Pilz
während des biotrophen Wachstums nicht auf die Versorgung mit Kohlenhydraten durch
1
Z USAMMENFASSUNG
den Wirt angewiesen ist. Außerdem wirkte sich ein induzierter Kohlenhydratmangel während der nekrotrophen Interaktionsphase besonders stark auf die Suszeptibilität für den
Pilz aus. Beeinträchtigungen induzierter Abwehrreaktionen könnten sich folglich besonders während des nekrotrophen Wachstums des Pilzes auf die Suszeptibilität auswirken.
Analysen der Zellwandzusammensetzung verschiedener Mutanten mit einem nächtlichen Kohlenhydratmangel zeigten, dass der regelmäßig wiederkehrende Kohlenhydratmangel zu verringerten Gehalten der Monosaccharide Arabinose, Galactose und Galacturonsäure im Pektinanteil der Zellwandmatrix führte. Vergleichende Analysen mit beschriebenen Zellwandmutanten lieferten klare Hinweise, dass dieser Zellwanddefekt die
Penetrationsresistenz von Arabidopsis gegen C. higginsianum reduziert.
Im Gegensatz zu der erhöhten Suszeptibilität für C. higginsianum hatten stärkefreie
Mutanten eine erhöhte Resistenz gegen den obligat biotrophen Mehltaupilz Erysiphe cruciferarum, die nicht durch die beobachteten Zellwandveränderungen begründet war.
Durch eine Mutagenese stärkefreier pgm Pflanzen konnte eine Population von
Mutanten für vorwärtsgenetische Durchmusterungen erzeugt werden. Durch die Selektion auf Suppressor-Phänotypen der Hypersuszeptibilität von pgm konnten 63 Mutanten
mit einer reduzierten Suszeptibilität gegenüber C. higginsianum identifiziert werden,
von denen 8 Mutanten eine pgm-spezifische Resistenz zeigten. Durch die Identifizierung
einer Mutante, die bereits als resistent beschrieben war, konnte die Selektivität der Durchmusterung belegt werden. Zudem konnte eine Mutante mit pgm-spezifischer Resistenz
auf einen 800 kb umfassenden Genombereich von Chromosom 3 kartiert werden, der
interessante Kandidatengene für weiterführende Analysen beinhaltet.
2
Summary
Hemibiotrophic pathogens interact with host plants in two consecutive phases. An initial
biotrophic growth phase inside living host cells is followed by a necrotrophic phase, in
which host tissue is sequentially killed. The hemibiotrophic fungus Colletotrichum higginsianum establishes itself through clearly defined infection steps on Arabidopsis thaliana
in a compatible interaction. After breaching the host cell wall with an appressorium, the
fungus forms intracellular biotrophic hyphae surrounded by the host plasma membrane.
Following a short biotrophic phase, leaf tissue is colonized by secondary necrotrophic
hyphae accompanied by extensive necrotic lesions on host leaves.
In this study, it was shown that carbohydrate availability of Arabidopsis influences susceptibility towards C. higginsianum. Mutants with an impaired starch metabolism experienced faster fungal proliferation and showed increased disease symptoms. Accordingly,
the reduced carbohydrate budget and not the duration of carbohydrate shortage increased susceptibility in this interaction. This observation was further supportet by a negative
correlation between carbohydrate accumulation in the light and susceptibility towards
C. higginsianum.
By employing additional genotypes with nocturnal carbohydrate shortage, a clear coincidence between diurnal carbohydrate turnover and susceptibility was corroborated. Analyses of different defense responses revealed that the accumulation of secondary metabolites such as salicylic acid, camalexin and glucosinolates was limited due to reduced
carbohydrate availability.
Dark-induced carbohydrate shortage in different interaction phases indicated that carbohydrate supply by the host is dispensable during biotrophic growth of C. higginsianum.
Furthermore, induced carbohydrate shortage affected susceptibility most during the necrotrophic interaction, indicating that affected defense increases susceptibility especially
during necrotrophic colonization.
An analysis of cell wall composition demonstrated that periodic carbohydrate shortage
in different mutants suffering from nocturnal carbon starvation, caused reduced contents
of the monosaccharides arabinose, galactose and galacturonic acid in pectic cell wall matrix polymers. Comparison to described cell wall mutants suggested that the observed cell
wall defects reduce penetration resistance to C. higginsianum.
3
S UMMARY
In contrast to the increased susceptibility towards C. higginsianum, starchless mutants
were more resistant towards the biotrophic powdery mildew fungus E. cruciferarum,
which was not due to the observed changes in cell wall composition.
Mutagenesis of starchless pgm mutants yielded a mutant population for forward genetic screens. By selecting suppressors of pgm hypersusceptibility, 63 mutants with reduced
susceptibility towards C. higginsianum including 8 mutants with pgm-specific resistance
could be identified. Selectivity of the screening was proven by the identification of a previously described resistant mutant. Moreover, a mutant showing pgm-specific resistance
could be mapped to a 800 kb genomic region on chromosome 3 containing interesting
candidate genes for further analyses.
4
1 Einleitung
Die Energiegewinnung von Pflanzen basiert auf der Assimilation von Kohlenstoff durch
Photosynthese. Neben der Sicherstellung der Versorgung mit Sonnenenergie, ist dafür
auch die Aufnahme von Wasser und Mineralstoffen über Wurzeln notwendig. Pflanzen
sind daher auf eine sessile Lebensweise angewiesen, die häufig Konfrontationen mit abiotischen und biotischen Stresssituationen impliziert. Stressreaktionen von Pflanzen verursachen einen zusätzlichen Energiebedarf, der in Konkurrenz zum Wachstum des Organismus steht und daher sehr genau reguliert sein muss (Herms und Mattson, 1992; Züst et al.,
2011).
1.1 Biotischer Stress bei Pflanzen - Phytopathologie
Phytopathogene Mikroorganismen verfolgen unterschiedliche Besiedelungsstrategien,
die eine flexible pflanzliche Abwehrantwort erfordern. Bakterien, Pilze und Oomyceten
können durch die Spaltöffnungen der Blätter oder Wunden im Pflanzengewebe in den Wirt
eindringen, viele Pilze und Oomyceten nutzen zudem hochspezifische Infektionsstrukturen um die Epidermis von Blättern oder Wurzeln zu penetrieren (Faulkner und Robatzek,
2012). Pflanzen haben eine Vielzahl einfacher und komplexer Abwehrmechanismen entwickelt, welche auf zellulärer und systemischer Ebene ein Immunsystem bilden (Jones
und Dangl, 2006). Wenn Pathogene nicht an einen Wirt angepasst sind, führt Nicht-Wirt
Resistenz zu einer inkompatiblen Interaktion (Heath, 2000b). Resultiert aus dem Befall
einer Pflanze hingegen eine Erkrankung, so handelt es sich um eine kompatible Interaktion (O’Connell und Panstruga, 2006).
Adaptierte Mikroorganismen verursachen große Ertragseinbußen im Nutzpflanzenanbau, insbesondere bei Anbau von Monokulturen, welche durch eine hohe Dichte und genetische Homogenität die Adaption von Pathogenen begünstigen (Stukenbrock und McDonald, 2008). Der weltweite Ertragsverlust der wichtigsten Nutzpflanzen durch Pathogenbefall wird auf 10-15 % geschätzt (Strange und Scott, 2005; Oerke, 2006).
5
1 E INLEITUNG
1.2 Determinanten von Suszeptibilität und Resistenz
Pflanzen haben im Unterschied zu Säugetieren kein Immunsystem mit mobilen Abwehrzellen, sondern ein zellbasiertes Immunsystem das Pathogene sowohl an der Zellperipherie als auch im Zytoplasma erkennen kann. Die Erkennung mikrobieller Proteine und die
intrazelluläre Signalweiterleitung ist bei Säugetieren und Pflanzen allerdings bemerkenswert ähnlich (Nürnberger et al., 2004). Wie Säugetiere können auch Pflanzen zwischen
selbst und fremd unterscheiden und sowohl beschädigungsassoziierte molekulare Muster (damage-associated molecular patterns, DAMPs) als auch mikrobenassoziierte molekulare Muster (pathogen-associated molecular patterns, MAMPs) erkennen. Während
DAMPs Bestandteile pflanzlicher Zellen sind die durch Pathogene abgelöst werden können, handelt es sich bei MAMPs um konservierte Moleküle mikrobiellen Ursprungs die
im Wirtsorganismus nicht vorkommen (Monaghan und Zipfel, 2012).
Jones und Dangl (2006) haben ein sehr verständliches Modell entworfen, das eine Unterscheidung von basalen, universell wirkenden Abwehrreaktionen und pathogenspezifisch aktivierten Abwehrreaktionen beinhaltet. Demnach führt die Erkennung von
MAMPs zu der sogenannten basalen Abwehrantwort, welche gegen potentielle Pathogene
gerichtet ist und als MTI (MAMP-triggered immunity) bezeichnet wird. Ist ein Pathogen
in der Lage Effektor-Proteine in die Wirtszelle einzubringen, so können diese die Abwehr
der Wirtes unterdrücken und zu Suszeptibilität für das Pathogen, der sogenannten ETS
(effector triggered susceptibility), führen. Im Zuge einer evolutionären Anpassung einer
Wirtspflanze an ein spezifisches Pathogen können Effektorproteine durch die Bindung an
spezifische Resistenzproteine als Avirulenz (Avr) Proteine erkannt werden und eine verstärkte Abwehrreaktion auslösen, die zu einer Resistenz gegen das Pathogen führt, welche
als ETI (effector-triggered immunity) bezeichnet wird.
Diese induzierten Abwehrreaktionen sind stark reguliert, da der benötigte Energieaufwand auf Kosten von Wachstum und Entwicklung der Pflanze geht. Die wichtigen
Abwehrsignalmoleküle Jasmonsäure (JA) und Salicylsäure (SA) wirken negativ auf das
Wachstum der Pflanze, während gleichzeitig vermehrt Energie für Abwehrreaktionen aufgewendet wird (Rivas-San Vicente und Plasencia, 2011; Yang et al., 2012). Kürzlich haben Pajerowska-Mukhtar et al. (2012) einen Transkriptionsfaktor beschrieben, der für das
Umschalten von Wachstum auf Abwehr in Folge der Erkennung des bakteriellen MAMPs
elf18 und des Hormons SA notwendig ist. TRANSLOCON1-BINDING TRANSCRIPTION FACTOR 1 (TBF1) bindet an das cis Element TRANSLOCON1 (TL1), das in den
Promotoren vieler abwehrbezogener Gene zu finden ist.
6
1 E INLEITUNG
1.2.1 Zellwand-basierte Abwehr von Pflanzen
Die erste Barriere gegen potentielle Pathogene bilden präformierte Strukturen wie die
Kutikula und die Zellwand, die allerdings neben ihrer Funktion als physikalische Barriere auch flexibel umgestaltet werden um den Befall durch Pathogene einzuschränken
(Reina-Pinto und Yephremov, 2009; Underwood, 2012). Es konnten bereits mehrere zellwandmodifizierende Proteine identifiziert werden, welche die Suszeptibilität für pilzliche Pathogene beeinflussen. In Arabidopsis wird die Suszeptibilität für das nekrotrophe
Pathogen Botrytis cinerea durch O-Acetylierung der Wirtszellwand und die Expression
einer Pektinmethylesterase erhöht (Manabe et al., 2011; Raiola et al., 2011). Resistenz
gegen den biotrophen Mehltau-Erreger Erysiphe cichoracearum ist in zwei unabhängigen Mutanten mit einem erhöhten Pektinanteil der Zellwand und einer reduzierten Zellexpansion verbunden (Vogel et al., 2002, 2004). An zellwandbasierten Abwehrreaktionen, wie der Bildung von Zellwandauflagerungen (Papillen) oder dem gezielten Transport
von Proteinen zu Infektionsstellen, ist zudem das Zytoskelett beteiligt (zusammengefasst
von Day et al., 2011). In Papillen werden darüberhinaus antimikrobielle Sekundärmetabolite und das β -1,3-Glukan Callose eingelagert (Bednarek et al., 2009; Clay et al.,
2009). Inwieweit Callose eine strukturelle Barriere für zellwandpenetrierende Pilze und
Oomyceten darstellt ist jedoch unklar. Das Fehlen der pathogeninduzierbaren Isoform der
Callose Synthase, POWDERY MILDEW RESISTANT 4 / GLUCAN SYNTHASE-LIKE
5 (PMR4/GSL5), beeinträchtigt die Penetrationsresistenz kaum, sondern führt zu einer
verstärkten SA-abhängigen Abwehr (Jacobs et al., 2003; Nishimura et al., 2003). Die
Ablagerung von Callose in Papillen ist wiederum durch verschiedene Abwehrsignalwege
reguliert und stark von den Wachstumsbedingungen der untersuchten Pflanzen abhängig
(Luna et al., 2011).
1.2.2 Die basale Abwehr von Pflanzen
MAMPs und DAMPs können an plasmamembranlokalisierten Rezeptoren (pattern recognition receptors, PRRs) spezifisch erkannt werden. Eine aktuelle Zusammenfassung von
PRRs mit bekannten Liganden wurde von Monaghan und Zipfel (2012) veröffentlicht.
Viele PRRs, wie die gut untersuchten Rezeptoren bakterieller MAMPs in Arabidopsis,
FLAGELLIN-SENSING 2 (FLS2; Gómez-Gómez und Boller, 2000; Chinchilla et al.,
2006) und der EF-Tu Rezeptor (EFR; Zipfel et al., 2006), haben eine extrazelluläre Rezeptordomäne sowie eine intrazelluläre Kinasedomäne und werden als Rezeptor-ähnliche Kinasen (receptor like kinase, RLK) bezeichnet. Andere PRRs wie die Rezeptoren pilzlicher
Xylanase in Tomate weisen keine Kinasedomäne auf und werden als Rezeptor-ähnliche
7
1 E INLEITUNG
Proteine (receptor like protein, RLP) bezeichnet (Ron und Avni, 2004). Viele PRRs, darunter auch die drei oben genannten Beispiele, interagieren mit der RLK BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-ASSOCIATED KINASE 1 (BAK1), die an der intrazellulären Signalweiterleitung beteiligt ist (Chinchilla et al., 2007; Bar et al., 2010; Roux et al., 2011).
Kürzlich wurde gezeigt, dass Brassinosteroide die FLS2- und EFR-abhängigen Abwehrsignale inhibieren und die Suszeptibilität von Arabidopsis für verschiedene Pathogene
beeinflussen können (Albrecht et al., 2012; Belkhadir et al., 2012). BAK1 ist daher an
der Regulation der Balance zwischen Brassinosteroid-abhängigem Wachstum und MTIabhängigen Abwehrreaktionen beteiligt. Bislang wurden drei PRRs identifiziert, die an
der Erkennung endogener molekularer Muster beteiligt sind. PEP RECEPTOR 1 (PEPR1)
und PEPR2 binden pathogeninduzierte Arabidopsis Pep Proteine und tragen gemeinsam
zu der Abwehr gegen Pathogene bei (Krol et al., 2010; Yamaguchi et al., 2010). Brutus
et al. (2010) identifizierten die Zellwand-assoziierte Kinase WALL-ASSOCIATED KINASE 1 (WAK1) als Rezeptor für Oligogalacturonide (OGs) und zeigten die Bedeutung
der Erkennung dieser DAMPs für die Abwehr gegen den phytopathogenen Pilz Botrytis
cinerea. OGs sind Fragmente des Pektin-Polymers Homogalacturonan, die bei der Penetration der Wirts-Zellwand durch pektinolytische Enzyme von Pathogenen freigesetzt
werden können.
Die intrazellulären Ereignisse nach der Erkennung von MAMPs und DAMPs ähneln
sich, unabhängig davon welcher PRR ein Ziel-Molekül gebunden hat. Besonders gut ist
die Abwehrantwort infolge der Erkennung des bakteriellen flg22 Peptides untersucht. Unmittelbar nach der Behandlung von Arabidopsis mit flg22 kommt es zu einem erhöhten
Ionenfluss über die Plasmamembran, der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (reactive
oxygen species, ROS), der Aktivierung einer MAPK (mitogen activated protein kinase)
Kaskade und einer erhöhten Proteinphosphorylierung (Boller und Felix, 2009). An der
Bildung von ROS sind neben plasmamembranlokalisierten NADPH Oxidasen auch apoplastische Peroxidasen beteiligt, welche eine oxidative Quervernetzung der Zellwand bewirken können (Bradley et al., 1992). Kürzlich wurde die Beteiligung zweier apoplastischer Peroxidasen an der MAMP-induzierten Bildung von ROS entdeckt, die eine Rolle in
der Regulation von Polygalacturonase-inhibierenden Proteinen (PGIPs), einer Pektinacetylesterase (PAE) sowie einer Pektinmethylesterase (PME) spielen, und daher vermutlich
an der Regulation der Zellwandmodifikation beteiligt sind (Daudi et al., 2012; O’Brien
et al., 2012). Als weitere Folge der flg22 Erkennung wird der FLS2 Rezeptor internalisiert und eine Vielzahl an Genen differentiell reguliert (Zipfel et al., 2004; Robatzek
et al., 2006). Unter den transkriptionell hochregulierten Genen finden sich neben Tran-
8
1 E INLEITUNG
skriptionsfaktoren auch weitere PRRs und pathogenesebezogene (pathogenesis related,
PR) Gene (Gómez-Gómez et al., 1999; Zipfel et al., 2004, 2006).
1.2.3 Spezifische Abwehr in Pflanze-Pathogen Interaktionen
Die intrazelluläre Erkennung von Pathogen-Effektormolekülen ist die Grundlage zur Etablierung von ETI. Die Erkennung dieser Moleküle wird meist von einer Klasse von Rezeptoren mit Nukleotid-Bindedomöne (NB) und leucin-rich repeat-Domäne (LRR) vermittelt (Caplan et al., 2008). Gene, welche für NB-LRRs kodieren, werden als Resistenzgene (R-Gene) bezeichnet, da eine spezifische Erkennung individueller Effektoren
zu Resistenz führt. Die Interaktion zwischen NB-LRRs und Effektoren kann entweder
direkt oder indirekt stattfinden. Indirekte Interaktionen erfordern die Bindung eines weiteren Proteins, das entweder ein Zielprotein des Effektors oder ein strukturell ähnliches
Köderprotein darstellen kann (Caplan et al., 2008). Darüberhinaus wurden in der Interaktion zwischen dem biotrophen Pilz Cladosporium fulvum und Tomate auch RLPs mit
extrazellulärer LRR-Domäne als Produkte von R-Genen identifiziert (Dixon et al., 2000).
Die intrazellulären Prozesse nach der Erkennung von Effektoren ähneln stark den Prozessen nach der Erkennung von MAMPs. ETI wird daher als eine schnellere und stärkere
Form von MTI betrachetet (Jones und Dangl, 2006). Häufig führt ETI zu einer hypersensitiven Abwehrantwort (hypersensitive response, HR) der infizierten Zelle, was besonders in der Abwehr gegen biotrophe Pathogene, welche dauerhaft oder vorübergehend lediglich eine Zelle besiedeln, wirkungsvoll sein kann. Hypersensitive Abwehrantworten spielen zudem eine Rolle in der systemischen Weiterleitung von Abwehrsignalen
(Heath, 2000a). Bislang konnten nur wenige zentrale Komponenten des ETI-induzierten
Signalweges identifiziert werden. TIR (Toll-interleukin-like receptor)-NB-LRR abhängige Signale benötigen ENHANCED DISEASE SUSCEPTIBILITY 1 (EDS1), während
NON-RACE-SPECIFIC DISEASE RESISTANCE 1 (NDR1) für viele CC (coiled-coil)NB-LRR abhängige Signale nötig ist (Parker et al., 1996; Aarts et al., 1998).
1.2.4 Hormonsignalwege in der Abwehrantwort
Abwehrsignale der MTI und der ETI werden in ein stark reguliertes Netzwerk aus kooperativen und antagonistischen Hormonsignalwegen integriert. Eine zentrale Rolle in der
Regulation und Weiterleitung von Abwehrsignalen haben die Hormone SA und JA, deren
Signale stark antagonistisch reguliert sind. Während SA-abhängige Signale eine effektive
Abwehr gegen biotrophe Pathogene begünstigen, sind JA-abhängige Signale häufig in der
Abwehr gegen nekrotrophe Pathogene effektiv (Glazebrook, 2005).
9
1 E INLEITUNG
SA kann durch zwei Synthesewege aus Chorismat synthetisiert werden, für die pathogeninduzierte Akkumulation von SA scheint allerdings nur der Syntheseweg über ISOCHORISMATE SYNTHASE (ICS) wichtig zu sein (Vlot et al., 2009). Die Akkumulation
von SA wird durch die ETI-induzierten EDS1- und NDR1-abhängigen Signalwege ausgelöst (Feys et al., 2001; Shapiro und Zhang, 2001). Fu et al. (2012) diskutieren, dass ein
hoher SA-Gehalt in pathogeninfizierten Zellen zu lokalem Zelltod führt, während systemisch induzierte niedrigere SA-Gehalte die Expression SA-induzierter Gene begünstigen.
Spezifisch durch den SA-abhängigen Signalweg induzierte PR-Gene, wie PR-1, PR-2 (β 1,3-Glucanase) und PR-5 (thaumatin-like), sind gute Marker für diesen Signalweg (Uknes
et al., 1992). Die Aktivierung des SA Signalweges an Infektionsstellen spielt darüberhinaus eine wichtige Rolle in der Etablierung von systemischen Abwehrreaktionen in nicht
befallenen Bereichen der Pflanze, welche als systemisch erworbene Resistenz (systemic
acquired resistance, SAR) bezeichnet werden (Vlot et al., 2008).
JA wird ausgehend von α-Linolensäure aus Membranlipiden in Chloroplasten und
Peroxisomen synthetisiert (Browse, 2009). JA kann daraufhin in eine Vielzahl von Derivaten umgewandelt werden, von denen besonders Jasmonyl-Isoleucin (JA-Ile) von Bedeutung für den JA-abhängigen Abwehrsignalweg ist (Staswick et al., 2002; Staswick
und Tiryaki, 2004). Das F-Box Protein CORONATINE INSENSITIVE 1 (COI1) ist ein
zentraler Regulator des JA Signalweges. COI1 fungiert als JA-Ile Rezeptor in dem E3
Ubiquitinligase SKP1/Cullin/F-Box Komplex SCF COI1 , der die Degradation von transkriptionellen Repressoren der JASMONATE-ZIM DOMAIN (JAZ) Familie durch das
Proteasom vermittelt (Thines et al., 2007; Sheard et al., 2010). In Arabidopsis sind zwei
verschiedene Zweige des JA-abhängigen Signalweges bekannt. Während in dem einen
Zweig Transkriptionsfaktoren der MYC Familie reguliert werden (Pauwels et al., 2010),
ist der andere Zweig zusätzlich von Ethylen (ET)-Signalen abhängig und an der Regulation der Transkriptionsfaktoren ETHYLENE RESPONSE FACTOR 1 (ERF1) und
OCTADECANOID-RESPONSIVE ARABIDOPSIS 59 (ORA59) beteiligt (Zhu et al.,
2011). Während der MYC-abhängige JA-Signalweg die Transkription verwundungsresponsiver Gene induziert, werden im JA/ET-abhängigen Signalweg pathogenresponsive
Gene wie PLANT DEFENSIN 1.2 (PDF1.2), PR-3 (basic chitinase) und PR-4 (heveinlike) induziert (Lorenzo et al., 2003, 2004; Pré et al., 2008).
Eine Analyse zu der Regulation der SA- und JA-abhängigen Abwehrantwort in 18
Arabidopsis Ökotypen in Gegenwart beider Hormone zeigte, dass JA-abhängige Abwehrsignale stark von SA supprimiert werden (Koornneef et al., 2008). Brodersen et al. (2006)
berichteten, dass EDS1 zusammen mit PHYTOALEXIN DEFICIENT 4 (PAD4) stromabwärts von ERF1 als Repressor JA/ET-induzierter Abwehrsignale wirkt. MAP KINASE 4
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1 E INLEITUNG
(MPK4) reprimiert EDS1/PAD4 und ist daher für die Expression JA/ET-abhängiger Transkripte notwendig. Weitere Komponenten der Suppression von JA/ET-abhängigen Abwehrsignalen durch SA wie Redox Regulatoren, NPR1 und Transkriptionsfaktoren werden in Pieterse et al. (2012) diskutiert. Ein klarer antagonistischer Einfluss von JA auf
SA-abhängige Abwehrreaktionen konnte bislang hingegen nicht gezeigt werden. Neben
SA, JA und ET beeinflussen auch die Hormone Abscisinsäure (ABA), Gibberellinsäure
(GA), Auxin und Cytokinine die Abwehrantwort gegen Pathogene (zusammengefasst von
Pieterse et al., 2012).
1.3 Lebensweisen phytopathogener Pilze
Phytopathogene Pilze besiedeln ihre Wirtspflanzen mit spezialisierten Hyphen, die jeweils
an die Lebensweise des Pathogens angepasst sind. Anhand ihrer Ernährungsstrategie lassen sich pilzliche Pathogene in drei Klassen einordnen.
Nekrotrophe Pilze haben meist ein breites Wirtsspektrum und sind nicht auf lebende
Wirtszellen angewiesen um ihren Lebenszyklus abzuschließen. Sie sekretieren zellwanddegradierende Enzyme, Toxine und Nekrose-bezogene Proteine um die Zellen ihres Wirtes abzutöten und sich saprophytisch von den Abbauprodukten des Gewebes zu ernähren
(Oliver und Ipcho, 2004; Divon und Fluhr, 2007).
Biotrophe Pilze sind hingegen auf lebende Wirtszellen angewiesen um ihren Lebenszyklus zu vollenden. Sie haben ein enges Wirtsspektrum und sekretieren während der
Penetrationsphase nur geringe Mengen lytischer Enzyme, um möglichst geringen Schaden an der Wirtszelle zu erzeugen (Oliver und Ipcho, 2004). Die Besiedelungsmechanismen biotropher Pilze sind sehr vielfältig und beinhalten inter-, intra- und extrazelluläres
Wachstum (Mendgen und Hahn, 2002). Obligat biotrophe Mehltaupilze bilden in den
penetrierten Epidermiszellen Haustorien, hochspezialisierte Hyphen, die der intrazellulären Nahrungsaufnahme dienen und auf eine Zelle des Wirtes begrenzt sind. Haustorien
bleiben durch eine Membran vom Zytoplasma der Wirtszelle getrennt. Diese extrahaustorielle Membran (EHM) unterscheidet sich allerdings strukturell von der Plasmamembran
der Wirtszelle (Koh et al., 2005). Es ist bisher unklar, ob die EHM durch Einstülpung der
Plasmamembran mit einer nachfolgenden Differenzierung oder durch de novo Synthese
gebildet wird. Die Grenzfläche zwischen der Zellwand des Pilzes und der EHM der Wirtszelle wird als extrahaustorielle Matrix (EHMx) bezeichnet. Diese Matrix wird als Interaktionsraum zwischen den Organismen interpretiert, in dem ein Austausch an molekularen Signalen und Nährstoffen stattfindet. Es wurden sowohl in der Wirtszelle als auch
in Haustorien mulitvesikuläre Körper (multivesicular bodies, MVBs) beobachtet, die ver-
11
1 E INLEITUNG
mutlich an Exo- und Endozytoseprozessen beteiligt sind (Meyer et al., 2009; Micali et al.,
2011). Der haustorielle Komplex aus Haustorium, EHM und EHMx wird zudem im Laufe der Interaktion von Zellwandmaterial der Pflanze umhüllt, das Ähnlichkeit mit lokalen
Zellwandauflagerungen hat (Meyer et al., 2009; Micali et al., 2011).
Während viel zu Abwehrreaktionen gegen obligat biotrophe Pilze veröffentlicht wurde,
ist nicht viel über die Mechanismen der Nahrungsbeschaffung und -aufnahme bekannt. In
Haustorien von Rostpilzen ist ein Hexosetransporter lokalisiert, der gleichermaßen Glukose und Fruktose transportiert (Vögele et al., 2001). Die Verwertung dieser Hexosen
könnte durch haustoriell lokalisierte Enzyme erklärt werden (Vögele et al., 2005; Vögele
und Mendgen, 2011). Auch für Haustorien von Mehltaupilzen wurden Indizien für eine
preferentielle Aufnahme von Glukose veröffentlicht (Sutton et al., 1999, 2007). Hexosen
des Wirtes könnten Rostpilzen und Mehltaupilzen durch eine erhöhte Aktivität apoplastisch lokaliserter Invertasen nach der Infektion bereitgestellt werden, wobei diese Invertasen sowohl im Pathogen als auch im Wirt kodiert sein können (Vögele et al., 2006;
Sutton et al., 2007). Obwohl haustoriell exprimierte Aminosäuretransporter eines Rostpilzes charakterisiert wurden, konnte bisher keine Lokalisierung in Haustorien gezeigt
werden (Struck et al., 2002, 2004).
Hemibiotrophe Pilze durchlaufen nach der Penetration einer Wirtszelle zumeist eine
initiale biotrophe Wachstumsphase, die anschließend in ein nekrotrophes Wachstum übergeht (Mendgen und Hahn, 2002). Die Dauer der biotrophen Interaktionsphase und die Art
der Besiedelung unterscheiden sich zwischen hemibiotrophen Pilzarten. Der Reisbrandpilz Magnaporthe oryzae kolonisiert Wirtszellen zunächst biotroph und geht sequentiell
in zuvor besiedelten Zellen zu einem nekrotrophen Wachstum über (Kankanala et al.,
2007). Auch innerhalb der Gattung Colletotrichum gibt es hemibiotrophe Arten, die Biotrophie in mehreren Zellen etablieren können, während die biotrophe Phase in anderen
Colletotrichum spp. auf die erste infizierte Zelle beschränkt ist (Perfect und Green, 2001).
Aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit von Infektionshyphen, welche auf eine Wirtszelle
beschränkt sind, und Haustorien obligat biotropher Pilze, wird eine vergleichbare Funktion in der Aufnahme von Nährstoffen und dem Austausch an Signalstoffen angenommen
(O’Connell und Panstruga, 2006; Münch et al., 2008). Biotrophe Hyphen hemibiotropher
Pilze sind häufig von einer Grenzflächenmatrix umgeben, die Ähnlichkeit mit der EHMx
obligat biotropher Pilze hat (O’Connell und Panstruga, 2006). Während in verschiedenen
Colletotrichum spp. Mutanten identifiziert wurden, die im Übergang aus der biotrophen
in die nekrotrophe Wachstumsphase beeinträchtigt waren, konnten keine Mutanten mit
einer fehlenden biotrophen Interaktionsphase gefunden werden (Münch et al., 2008; Huser et al., 2009). Nicht-adaptierte Colletotrichum spp. besiedeln verwundete Arabidopsis-
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1 E INLEITUNG
Blätter jedoch mit Hyphen, die morphologisch an nekrotrophe Hyphen erinnern (Hiruma
et al., 2010, eigene Beobachtung). Die biotrophe Wachstumsphase von Colletotrichum
spp. scheint daher für die intrazelluläre Etablierung in intaktem Wirtsgewebe notwendig
zu sein. Über Genfunktionen, die an dem Übergang von der biotrophen in die nekrotrophe
Phase regulatorisch beteiligt sind, ist bislang nichts bekannt.
1.3.1 Das Arabidopsis - Colletotrichum Pathosystem
Colletotrichum higginsianum ist ein phytopathogener Pilz aus der Abteilung der Ascomycota, der von Brassica rapa isoliert wurde und virulent für die Modellpflanze Arabidopsis
thaliana ist (O’Connell et al., 2004; Narusaka et al., 2004). Der Lebenszyklus von
C. higginsianum basiert auf einer hemibiotrophen Interaktion mit der Wirtspflanze und
ist stark von einer hohen Luftfeuchtigkeit abhängig. Wenn Conidien des Pilzes in Wassertropfen auf der Blattoberfläche von Arabidopsis landen, bilden sie schmale Keimschläuche, aus denen kuppelförmige Appressorien hervorgehen (Abbildung 1.1). Appressorien sind hochspezialisierte Infektionsstrukturen, die nach der Melanisierung der
Zellwand und der Akkumulation osmotisch aktiver Substanzen einen hohen Turgordruck
aufbauen. Dieser Turgor ist für die mechanische Penetration der Wirtszellen nötig, wobei auch lytische Enzyme eine Rolle spielen können (Bechinger et al., 1999; Deising
et al., 2000). Nach der Penetration der Kutikula und der Zellwand des Wirtes bildet
C. higginsianum knollige Infektionsvesikel und Primärhyphen aus, welche auf die erste
penetrierte Zelle beschränkt sind und großflächig in Kontakt mit der intakten umgebenden
Membran der penetrierten Epidermiszelle stehen (Kleemann et al., 2012). Im Gegensatz
zu vielen anderen hemibiotrophen Pilzen scheint in der Interaktion zwischen Arabidopsis
und C. higginsianum keine kontinuierliche Grenzflächenmatrix zwischen biotrophen Hyphen und der Plasmamembran des Wirtes ausgebildet zu werden (O’Connell et al., 2004).
Dagegen wurden separate Grenzflächenkörper beobachtet, die eine Matrix für den Austausch von Molekülen darzustellen scheinen (Kleemann et al., 2012). Der Übergang von
der biotrophen Interaktion in die nekrotrophe Interaktion der beiden Organismen wird
durch die Ausbildung schmaler sekundärer Infektionshyphen markiert, welche die Plasmamembran des Wirtes penetrieren und benachbarte Zellen besiedeln. Sekundärhyphen
breiten sich schnell im Blattgewebe aus und führen zu lokalen Blattnekrosen und Anthraknose. Schließlich werden asexuelle Fruchtkörper, die Acervuli, gebildet, an denen
durch Mitose wiederum Conidien entstehen.
Von 116 untersuchten Arabidopsis Ökotypen sind 47% suszeptibel für C. higginsianum,
darunter auch die in dieser Arbeit verwendeten Ökotypen Columbia (Col-0) und Lands-
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1 E INLEITUNG
Abbildung 1.1 Lebenszyklus von Colletotrichum higginsianum auf Arabidopsis. Conidien (C)
keimen auf der Blattoberfläche aus und bilden einen schmalen Keimschlauch (K), aus dem ein
Appressorium (A) hervorgeht. Nach der Melanisierung der Appressorien-Zellwand, der Akkumulation osmotisch aktiver Substanzen und der Bildung eines hohen Turgor, wird die Wirtszelle
unterhalb des Appressoriums mit einem Infektionsstachel penetriert. Innerhalb der ersten infizierten Zelle wird ein Infektionsvesikel (IV) gebildet, das zu einer gelappten Primärhyphe (PH)
differenziert. IV und PH gehen eine biotrophe Interaktion mit der lebenden Wirtszelle ein. Sobald
schmale Sekundärhyphen (SH) aus der PH hervorgehen, werden auch benachbarte Zellen besiedelt und in einer nekrotrophen Interaktion abgetötet. Der asexuelle Zyklus des Pilzes wird durch
die Bildung von Conidien an Acervuli abgeschlossen (nicht gezeigt).
berg erecta (Ler) (Birker et al., 2009). In resistenten Ökotypen konnten zwei genomische
Resistenz-Orte identifiziert werden. RCH1 (RECOGNITION OF COLLETOTRICHUM
HIGGINSIANUM 1) vermittelt Resistenz in Eil-0, es ist jedoch nicht bekannt durch welchen Mechanismus diese Resistenz vermittelt wird (Narusaka et al., 2004). Ein zweiter
Resistenz-Lokus, RCH2, ist für die Resistenz der Ökotypen Kondara, Can-0, Gifu-2 und
Ws-0 nötig (Birker et al., 2009; Narusaka et al., 2009). RCH2 beinhaltet zwei Gene, die
in der Interaktion mit Pseudomonas syringae bzw. Ralstonia solanacearum als R-Gene
identifiziert wurden (Gassmann et al., 1999; Deslandes et al., 2002). RESISTANT TO
PSEUDOMONAS SYRINGAE 4 (RPS4) und RESISTANT TO RALSTONIA SOLANACEARUM 1 (RRS1) vermitteln eine kooperative Resistenz gegenüber C. higginsianum,
die nicht mit einer HR verbunden ist, sondern die Penetrationsresistenz von Arabidopsis
erhöht (Birker et al., 2009; Narusaka et al., 2009). Die RCH1-vermittelte Resistenz geht in
abgetrennten Blättern von Eil-0 verloren, obwohl die basale Abwehrantwort im Vergleich
zu Infektionen von Col-0 stark erhöht bleibt (Liu et al., 2007).
Dennoch scheint auch die basale Abwehr die Suszeptibilität von Arabidopsis für
14
1 E INLEITUNG
C. higginsianum zu begrenzen, da eine NADP-MALIC ENZYME 2 (NADP-ME2)abhängige Akkumulation reaktiver Sauerstoffspezies zu Resistenz gegen das Pathogen
beiträgt (Voll et al., 2012). Chanda et al. (2008) zeigten zudem, dass ein erhöhtes Verhältnis von Glycerin-3-Phosphat (G3P) zu Glycerin Resistenz gegen C. higginsianum
vermittelt. In einer weiteren Studie konnte der Mechanismus dieser Resistenzreaktion
aufgeklärt werden. G3P interagiert mit dem Lipid Transfer Protein DIR1 in der Etablierung von SAR und wirkt somit in einem basalen Abwehrmechanismus, der gegen
eine Vielzahl unterschiedlicher Pathogene immunisiert (Chanda et al., 2011). Nach einer
Infektion mit C. higginsianum werden sowohl SA-abhängige, als auch JA/ET-abhängige
PR-Gene in Arabidopsis akkumuliert (Narusaka et al., 2004; Liu et al., 2007). Untersuchungen zur Suszeptibilität von Mutanten zentraler Regulatoren der Abwehrsignalwege
zeigten, dass die Suszeptibilität besonders durch den SA-abhängigen Signalweg und
in geringerem Maße durch den ET-abhängigen Signalweg begrenzt wird, wobei keine
quantitativen Daten zu der Proliferation des Pilzes erhoben wurden (O’Connell et al.,
2004; Liu et al., 2007). Die Beeinträchtigung der Biosynthese des Phytoalexins Camalexin durch eine Mutation in PHYTOALEXIN DEFICIENT 3 (PAD3) führt zu einer stark
erhöhten Suszeptibilität für C. higginsianum, die durch G3P-vermittelte SAR unterdrückt
werden kann (Narusaka et al., 2004; Chanda et al., 2008). Inkompatibilität nicht adaptierter Colletotrichum spp. mit Col-0 wird ebenfalls während der Penetrationsphase etabliert.
Shimada et al. (2006) konnten zeigen, dass Actinfilamente fokal an Kontaktstellen pilzlicher Appressorien angeheftet waren und vermehrt Zellwandauflagerungen an diesen
Kontaktstellen gebildet wurden.
Pathosysteme mit der Modellpflanze Arabidopsis thaliana sind besonders gut geeignet
um die Auswirkungen spezifischer Genfunktionen auf die Interaktion zu untersuchen, da
das Genom von Arabidopsis sehr gut charakterisiert ist und eine Vielzahl an Mutanten
in Samenbanken hinterlegt ist (Arabidopsis, 2000; Scholl et al., 2000; Koornneef und
Meinke, 2010). Darüberhinaus kann auch das Pathogen C. higginsianum, im Gegensatz
zu obligat biotrophen phytopathogenen Pilzen, in Kultur gehalten und transformiert werden und wird daher als Modell für hemibiotrophe Interaktionen und zur Untersuchung
des Übergangs zwischen der biotrophen und nekrotrophen Ernährungsstrategie verwendet (Kleemann et al., 2008, 2012; Huser et al., 2009; Takahara et al., 2009). Kleemann
et al. (2012) konnten zeigen, dass Effektoren von C. higginsianum an der appressoriellen
Penetrationspore sowie an Grenzflächenkörpern zwischen biotrophen Hyphen und der
Wirtsmembran sekretiert werden. Bestimmte Gruppen von Effektoren sind zudem spezifisch in den verschiedenen Infektionsstrukturen von C. higginsianum exprimiert und sind
vermutlich sowohl für die Aufrechterhaltung der biotrophen Lebensphase als auch für den
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1 E INLEITUNG
Übergang in die nekrotrophe Lebensphase von Bedeutung. Vor kurzem wurde die erste
vorläufige Sequenz des Genoms von C. higginsianum veröffentlicht (O’Connell et al.,
2012), was in der Zukunft gezielte genetische Analysen erleichtern wird. Aufgrund der
Ähnlichkeit des Lebenszyklus von C. higginsianum mit anderen Colletotrichum spp. können Erkenntnisse aus diesem Pathosystem potentiell für eine Vielzahl von Anthraknose
Erkrankungen von Kulturpflanzen von Bedeutung sein (Perfect et al., 1999; Münch et al.,
2008).
1.4 Kohlenhydratstoffwechsel in Arabidopsis-Blättern
Die photosynthetische Assimilation von Kohlenstoff kann formal in zwei Teilreaktionen
unterschieden werden. In der Lichtreaktion der Photosynthese werden Reduktionsäquivalente und Adenosintriphosphat (ATP) erzeugt, welche für die Assimilation von Kohlenstoff im Calvin-Zyklus der Dunkelreaktion aufgewendet werden. Während der Lichtphase wird der assimilierte Kohlenstoff entweder für die Synthese von Saccharose aus
Triosephosphaten oder für die Synthese transitorischer Stärke aus Fruktose-6-Phosphat
des Calvin-Zyklus genutzt (Abbildung 1.2).
Triosephosphate werden durch den Triosephosphattransporter (TPT) aus dem Chloroplasten in das Zytosol der Zelle exportiert und dort zu Hexosephosphaten und schließlich
zu Saccharose umgesetzt. Die Entnahme von Triosephosphaten aus dem Calvin-Zyklus
wird jedoch nicht auf Ebene des Exportes aus dem Chloroplasten, sondern durch die
Regulation enzymatischer Reaktionen der Saccharosebiosynthese begrenzt. Von zentraler Bedeutung ist die allosterische Hemmung der Fruktose-1,6-Bisphosphatase, welche
die erste irreversible Reaktion der Saccharosebiosynthese katalysiert. Durch die Bindung
von Fruktose-2,6-Bisphosphat wird die Affinität des Enzyms für sein Substrat Fruktose1,6-Bisphosphat stark verringert. Da Triosephosphate die Synthese von Fruktose-2,6Bisphosphat allerdings konzentrationsabhängig hemmen, muss der Gehalt an Triosephosphaten einen Schwellenwert überschreiten, damit die Saccharosebiosynthese ablaufen
kann. Saccharose-6-Phosphat wird aus Fruktose-6-Phosphat und UDP-Glukose synthetisiert. UDP-Glukose ist darüberhinaus die Ausgangssubstanz für die Synthese von Zuckernukleotiden der Zellwandbiosynthese und das Substrat für die Synthese von Cellulose. In
Mutanten des TPT wird der fast vollständige Verlust des Triosephosphat-Exportes durch
einen stark erhöhten Umsatz von Stärke und den Export von Hexosen aus dem Chloroplasten nahezu kompensiert, was zu einem erhöhten Stärkegehalt und leicht reduzierten
Gehalten löslicher Zucker in tpt Mutanten führt (Schneider et al., 2002). Saccharose und
Hexosen können in Vakuolen transportiert werden (Wormit et al., 2006; Martinoia et al.,
16
1 E INLEITUNG
2007), wo Saccharose durch Invertasen in Hexosen gespalten werden kann (Roitsch und
González, 2004; Yamada et al., 2010). Vakuolen können daher bei Stärkemangel und
in Stressreaktionen als Kohlenhydratspeicher dienen. Während photoautotrophe Gewebe Assimilate überwiegend exportieren und daher als source-Organe bezeichnet werden,
stellen Pflanzenorgane die auf den Import von Assimilaten angewiesen sind sink-Organe
dar. Saccharose kann über das Phloem in sink-Organe der Pflanze exportiert werden.
Um den Kohlenstoffbedarf der Pflanze während der Dunkelphase zu decken, wird
in Chloroplasten transitorische Stärke als Kohlenhydratspeicher gebildet. Fruktose-6Phosphat aus dem Calvin-Zyklus ist das Ausgangsmolekül für die Stärkebiosynthese.
Nach der Isomerisierung zu Glukose-6-Phosphat (Glu6P) katalysiert Phosphoglucomutase (PGM) die Umwandlung von Glu6P in Glukose-1-Phosphat (Glu1P). Glu1P dient
als Substrat für ADP-Glukose Pyrophosphorylase (ADG), welche die ATP-abhängige
Synthese von ADP-Glukose katalysiert. Arabidopsis-Mutanten mit einer beeinträchtigten Aktivität der Enzyme PGM oder ADG sind stärkefrei (Caspar et al., 1985; Lin et al.,
1988). Während der Lichtphase ist der Gehalt an löslichen Zuckern in pgm und adg1
Mutanten dagegen stark erhöht (Caspar et al., 1985; Lin et al., 1988). ADP-Glukose dient
als Substrat für Stärkesynthasen (SS), die in fünf Isoformen unterteilt sind. Stärkekorngebundene SS (granule bound starch synthase, GBSS) ist für die Synthese von Amylose
verantwortlich, während die vier löslichen SS-Isoformen unterschiedliche Funktionen bei
der Synthese von Amylopektin erfüllen (zusammengefasst von Streb und Zeeman, 2012).
In der transitorischen Blattstärke von Arabidopsis beträgt der Amylose-Anteil am Ende
einer 12h-Lichtphase lediglich rund 5%, da Amylose erst in eine bestehende semikristalline Matrix aus Amylopektin eingelagert wird (Zeeman et al., 2002). Darüberhinaus
sind für die Synthese von Stärkekörnern Verzweigungs- und Entzweigungsenzyme nötig
(Streb und Zeeman, 2012).
In der Dunkelphase wird transitorische Stärke abgebaut um den Kohlenhydratbedarf
der Pflanze in Abwesenheit von Photosynthese zu decken (Abbildung 1.2). Die Phosphorylierung von Stärkekörnern durch Glukan-Wasser-Dikinase (GWD1/SEX1) und
Phosphoglukan-Wasser-Dikinase (PWD) löst die semikristalline Struktur von Glukanen
an der Oberfläche der Stärkekörner und ermöglicht den Zugang von hydrolytischen Enzymen (Edner et al., 2007; Hejazi et al., 2008). Glukane werden daraufhin von verschiedenen Enzymen abgebaut, wobei β -Amylasen und Entzweigungsenzymen die wichtigste
Funktion zugeschrieben wird (Streb und Zeeman, 2012). Es konnte zudem gezeigt werden, dass Phosphoglukan-Phosphatasen für eine effiziente Stärkemobilisierung nötig sind
(Kötting et al., 2009; Hejazi et al., 2010; Santelia et al., 2011). Durch Entzweigungsenzyme freigesetzte lineare Glukane können durch β -Amylasen in Maltose oder durch
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1 E INLEITUNG
Abbildung 1.2 Schematische Darstellung des zentralen Blatt-Kohlenhydratstoffwechsels in
Arabidopsis. In dieser Übersicht über den Saccharose- und Stärkestoffwechsel in ArabidopsisBlättern sind die zentralen Enzyme (blau) und Intermediate (schwarz) dargestellt, die im Text
erläutert werden. In der Lichtphase werden Intermediate des Calvin-Zyklus für die Synthese
von Stärke und den Export aus dem Chloroplasten verwendet. In der Dunkelphase wird Stärke mobilisiert, woraufhin Maltose und Glukose aus dem Chloroplasten exportiert werden. Die
Saccharosebiosynthese erfolgt im Zytosol ausgehend von den exportierten Kohlenhydraten.
P, Phosphat; BP, Bisphosphat; ATP, Adenosintriphosphat; AMP, Adenosinmonophosphat; Fru,
Fruktose; Glu, Glukose; PGI, Phosphoglukose isomerase; PGM, Phosphoglukomutase; ADG,
ADP-Glukose Pyrophosphorylase; SS, Stärke-Synthasen; BE, Verzweigungsenzym (branching
enzyme); DBE, Entzweigungsenzym (debranching enzyme); SEX1, Glukan-Wasser-Dikinase;
PWD, Phosphoglukan-Wasser-Dikinase; BAM, β -Amylase; DPE, Disproportionierungsenzym;
HK, Hexokinase; BPase, Bisphosphatase; SPS, Saccharose-Phosphat Synthase; SPP, SaccharosePhosphat Phosphatase; MEX, Maltose Exporter; TPT, Triosephosphattransporter.
ein Disproportionierungsenzym (DPE1) in Glukose gespalten werden (Critchley et al.,
2001). Glukose und Maltose werden aus Chloroplasten in das Zytosol exportiert und dienen dort als Substrate der Synthese von Hexosephosphaten und Saccharose (Niittylä et al.,
2004; Cho et al., 2011). Die Spaltung von Maltose in Glukose wird von DPE2 katalysiert
(Chia et al., 2004; Lu und Sharkey, 2004). Arabidopsis-Mutanten mit einer beeinträchtigten Aktivität der Enzyme SEX1, PWD, verschiedener Phosphoglukan-Phosphatasen und
der Disproportionierungsenzyme 1 und 2 haben einen Stärkeüberschuss (starch excess,
SEX)-Phänotyp (Caspar et al., 1991; Critchley et al., 2001; Yu et al., 2001; Chia et al.,
2004; Baunsgaard et al., 2005; Kötting et al., 2005, 2009; Comparot-Moss et al., 2010). In
sex1 Mutanten ist der Stärkegehalt sowohl während der Licht-, als auch während der Dunkelphase stark erhöht und unterliegt nur sehr geringen diurnalen Schwankungen (Caspar
18
1 E INLEITUNG
et al., 1991). Während der Lichtphase akkumulieren zudem verstärkt lösliche Zucker, um
die reduzierte Stärkemobilisierung auszugleichen (Caspar et al., 1991).
Graf et al. (2010) konnten zeigen, dass die Stärkeabbaurate durch die zirkadiane Uhr
der Pflanze reguliert wird, so dass ein nahezu linearer Abbau transitorischer Stärke zu
einem fast vollständigen Verbrauch am Ende der Dunkelphase führt. Bislang ist jedoch
unklar, wie der verfügbare Stärkegehalt von der Pflanze erfasst wird (diskutiert von Stitt
und Zeeman, 2012). Die Anpassung des Stärkestoffwechsels an die Dauer der Lichtphase
funktioniert in Wildtyppflanzen nur bei diurnalen Zyklen von 24 Stunden, weshalb Abweichungen in der diurnalen Rhythmik oder Störungen in der Expression Uhr-abhängiger
Gene zu unvollständigem oder frühzeitigem Stärkeabbau führen (Graf et al., 2010). Eine
vorzeitige Erschöpfung der transitorischen Stärkereserven vor dem Ende der Dunkelphase führt ebenso wie der Verbrauch löslicher Zucker in stärkefreien Mutanten und Stärkeüberschussmutanten zu akutem Kohlenstoffmangel gegen Ende der Dunkelphase. In der
Konsequenz ergibt sich eine vorübergehende Hemmung des Wachstums und eine erhöhte Kohlenhydratakkumulation zu Beginn der folgenden Lichtphase (Gibon et al., 2004b;
Osuna et al., 2007). Andererseits führt auch ein unvollständiger Stärkeabbau zu einem
reduzierten Wachstum, da Kohlenstoff in Stärke gelagert wird, welcher in der Folge für
andere Stoffwechselprozesse nicht zur Verfügung steht (Graf et al., 2010). In einer umfassenden Analyse zur Wechselbeziehung von Biomasse und Metabolitgehalten in 94 Ökotypen von Arabidopsis, korrelierte der Stärkegehalt am Ende der Lichtphase negativ mit
dem Pflanzenwachstum (Sulpice et al., 2009), während die Stärkeabbaurate in der Dunkelphase positiv mit der relativen Wachstumsrate (relative growth rate, RGR) korrelierte
(Gibon et al., 2009). In Übereinstimmung mit den Daten von Sulpice et al. (2009) berichteten Wiese et al. (2007), dass die RGR während der Lichtphase deutlich gegenüber der
RGR der Dunkelphase erhöht ist, weshalb eine erhöhte Stärkesynthese in der Lichtphase
mit Wachstum konkurrieren könnte. Die Stärkesyntheserate ist in kurzen Lichtphasen zunehmend erhöht, während die Stärkeabbaurate in der Dunkelphase entsprechend reduziert
ist (Gibon et al., 2009).
1.5 Biosynthese und Zusammensetzung der primären Zellwand in
Arabidopsis-Blättern
Die Hauptbestandteile der primären Zellwand in Arabidopsis-Blättern sind Cellulose (14% der Zellwand), Hemicellulose (24%) und Pektin (42%) (Zablackis et al.,
1995). Zytosolische UDP-Glukose ist ein zentraler Metabolit für die Synthese dieser
Zellwandmatrix-Komponenten. Cellulose ist ein lineares β -1,4-Glukan, das an Cellulo-
19
1 E INLEITUNG
sesynthase (CesA)-Komplexen an der Plasmamembran aus UDP-Glukose synthetisiert
wird. Bisher ist jedoch nur wenig über die Zusammensetzung der CesA-Komplexe und
den Mechanismus der Cellulosesynthese bekannt (Endler und Persson, 2011). Es konnte
jedoch gezeigt werden, dass CesA im Golgi-Apparat lokalisiert sind und über Microtubuli
und Actinfilamente transportiert werden (Paredez et al., 2006; Crowell et al., 2009; Gutierrez et al., 2009). Im Golgi-Apparat werden 7 weitere UDP-Monosaccharide aus UDPGlukose synthetisiert, während 4 Monosaccharide ausgehend von Mannose mit GDP aktiviert werden (Reiter, 2008). Diese Zuckernukleotide stellen die Basiskomponenten zur
Synthese der verschiedenen Hemicellulose- und Pektinpolymere durch Glycosyltransferasen im Golgi-Apparat dar (Mohnen, 2008; Scheller und Ulvskov, 2010). Die häufigsten
Hemicellulosepolymere in primären Arabidopsis-Zellwänden sind Xyloglucan (20% der
Zellwand) und Glucuronoarabinoxylan (4%), während Pektin vor allem aus den Polymeren Homogalacturonan (23%), Rhamnogalacturonan-I (11%) und RhamnogalacturonanII (8%) besteht (Zablackis et al., 1995). Obwohl die Struktur der verschiedenen Polymere
gut beschrieben ist, ist bisher wenig über deren funktionelle Verknüpfung und die Regulation der Zellwandzusammensetzung bekannt. Lösliche Zellwandbestandteile, denen
verschiedene regulatorische Funktionen zugeschrieben werden, sind ArabinogalactanProteine (AGPs). Bei AGPs handelt es sich um Glycoproteine mit komplexen Kohlenhydratketten, die einen hohen Anteil an Arabinose und Galactose aufweisen (zusammengefasst von Seifert und Roberts, 2007).
1.6 Die Bedeutung des pflanzlichen Primärmetabolismus für
Suszeptibilität
Durch Pathogenbefall induzierte Abwehrreaktionen und die Synthese von Sekundärmetaboliten benötigen Energie und Kohlenstoff, die entsprechend aus anderen Stoffwechselwegen umverteilt werden müssen (diskutiert von Bolton, 2009). Über die konkrete Rolle
von Enzymen und Intermediaten des Primärmetabolismus in der Interaktion mit Pathogenen ist hingegen wenig bekannt. Es wird davon ausgegangen, dass viele Pathogene durch
die Infektion lokale sinks für photosynthestische Assimilate bilden und der Stoffwechsel
in infizierten Zellen grundlegend umgesteuert wird (Biemelt und Sonnewald, 2006). Häufig wird in infiziertem Blattgewebe eine erhöhte Aktivität zellwandgebundener Invertase
beobachtet, welche entweder pathogeninduziert der Ernährung apoplastisch lokalisierter
(hemi-) biotropher Pathogene oder wirtsinduziert der Zurückhaltung exportierter Saccharose dienen könnte (Scharte et al., 2005; Vögele et al., 2006; Swarbrick et al., 2006; Sutton
et al., 2007). Es ist gezeigt worden, dass das Saccharose-zu-Hexose-Verhältnis als Signal
20
1 E INLEITUNG
für die Induktion der SA-abhängigen Abwehrantwort dient (Herbers et al., 1996; Chou
et al., 2000; Berger et al., 2004).
Chen et al. (2010) zeigten, dass in Arabidopsis bei Befall durch verschiedene Pathogene die Expression von Zucker-Efflux Transportern der SWEET-Familie induziert wird.
Die Induktion von SWEETs nach Infektion mit dem Bakterium Pseudomonas syringae
ist dabei von einem funktionalen Effektortranslokationssystem abhängig. In verschiedenen Pathosystemen waren unterschiedliche Gruppen von SWEETs induziert oder auch
reprimiert, was auf eine pathogenspezifische Deregulation dieser Transportproteine hindeutet. Der Saccharose Uniporter OsSWEET11 aus Reis ist für eine erfolgreiche Infektion
durch das Bakterium Xanthomonas oryzae notwendig und wird in der Interaktion von einem bakteriellen Effektorprotein induziert. Eine Mutation in der Effektorbindestelle des
OsSWEET11-Promotors führte ebenso zu Resistenz gegenüber dem Bakterium wie eine
Mutation des Effektorproteins (Yang et al., 2006; Chen et al., 2012). In Übereinstimmung
damit konnte gezeigt werden, dass die reduzierte Verfügbarkeit photosynthetischer Assimilate in einer Gerstenmutante die Resistenz gegen einen obligat biotrophen Mehltaupilz
erhöht (Jain et al., 2004). Im Gegensatz dazu zeigte die selbe Gerstenmutante eine erhöhte
Suszeptibilität für einen hemibiotrophen Pilz, was auf einen uneinheitlichen Einfluss der
Kohlenhydratverfügbarkeit in unterschiedlichen Pathogeninteraktionen hindeutet (Schäfer et al., 2004).
Hinweise auf die Bedeutung der Kohlenhydratverfügbarkeit für eine effektive Abwehrantwort liefern auch Studien von Moreno et al. (2005) und Chaouch et al. (2010). Eine
Mutation in SERIN HYDROXYMETHYLTRANSFERASE 1 (SHMT1) im photorespiratorischen Stoffwechselweg von Arabidopsis erzeugt oxidativen Stress und eine konstitutive
Expression von PR-Genen. Dennoch hatten shmt1 Mutanten eine erhöhte Suszeptibilität für biotrophe und nekrotrophe Pathogene, da die Abwehrantwort nach einer Infektion
nicht mehr gesteigert werden konnte (Moreno et al., 2005). Eine Beeinträchtigung des
Primärstoffwechsels durch eine photorespirationsabhängige Hemmung des Calvin Zyklus
könnte in shmt1 die Kohlenhydratverfügbarkeit für eine induzierte Abwehr begrenzen. In
der photorespiratorischen Katalase Mutante (cat2) waren SA-abhängige Abwehrsignale
lediglich unter Langtagbedingungen erhöht, wenn photosynthetische Assimilate reichlich
vorhanden sind, aber nicht unter Kurztagbedingungen, in denen das Kohlenhydratbudget
stärker begrenzt ist (Chaouch et al., 2010).
Eine Akkumulation von Threonin durch die Beeinträchtigung der pflanzlichen Aminosäurebiosynthese führte zu Resistenz gegen den biotrophen Oomyceten Hyaloperonospora arabidopsidis, nicht aber gegen den biotrophen Mehltaupilz Golovinomyces orontii
(Stuttmann et al., 2011). Allerdings ist diese Reaktion vermutlich auf eine Vergiftung des
21
1 E INLEITUNG
Oomyceten und nicht auf einen Nährstoffbedarf oder eine regulatorische Beeinträchtigung der Abwehrantwort zurückzuführen.
Eine Schnittstelle zwischen dem pflanzlichen Primärstoffwechsel und der induzierten
Abwehrantwort stellt die Redox-Balance der Wirtszellen dar. Es wurde gezeigt, dass die
Enzyme Glukose-6-Phosphat Dehydrogenase (Scharte et al., 2009), Prolin Dehydrogenase (Cecchini et al., 2011) und NADP-Malat Enzym (Parker et al., 2009; Voll et al., 2012)
an der lokalen pathogeninduzierten Bildung von ROS an Infektionsstellen beteiligt sind.
22
1 E INLEITUNG
1.7 Zielsetzung dieser Arbeit
In Vorarbeiten wurde festgestellt, dass der Stärkestoffwechsel in Arabidopsis-Blättern im
Verlauf einer Infektion mit Colletotrichum higginsianum beeinträchtigt war, während lösliche Zucker akkumulierten. Zudem wiesen stärkefreie Muntanten der plastidären Phosphoglucomutase Isoform eine stark erhöhte Suszeptibilität gegenüber C. higginsianum
auf (Engelsdorf, 2008). Es wurde daher angenommen, dass die veränderten Kohlenhydratgehalte in pgm die Suszeptibilität gegenüber C. higginsianum erhöhen.
Folgende Fragestellungen sollen in dieser Arbeit adressiert werden:
1. Welcher Aspekt des veränderten Kohlenhydratstoffwechsels ist kausal für die erhöhte Suszeptibilität von pgm gegenüber C. higginsianum verantwortlich? Beeinträchtigt die veränderte Kohlenhydratverteilung in stärkefreien Mutanten die Ernährung des Pilzes oder die Abwehrantwort des Wirtes?
2. Hat ein veränderter Kohlenhydratstoffwechsel in einer bestimmten Phase der hemibiotrophen Interaktion zwischen Arabidopsis und C. higginsianum einen besonders
ausgeprägten Einfluss? Ist C. higginsianum während der biotrophen Wachstumsphase auf Kohlenhydrate der Wirtspflanze angewiesen?
3. Kann die erhöhte Suszeptibilität in stärkefreien Mutanten spezifisch durch andere
Mutationen supprimiert werden?
23
2 Material und Methoden
2.1 Chemikalien, Enzyme und Verbrauchsmaterialien
Soweit nicht anderweitig spezifiziert, wurden Produkte aus dem Sortiment der Firmen
Acros Organics (Geel, Belgien), AppliChem (Darmstadt), Carl Roth (Karlsruhe), New
England Biolabs (Ipswich, USA), Sigma-Aldrich (St. Louis, USA), Thermo Fisher Scientific (Waltham, USA) und VWR (Radnor, USA) bezogen.
2.2 Oligonukleotide und Sequenzierungen
Alle Oligonukleotide wurden bei der Firma Metabion International AG (Martinsried) bestellt und sind im Anhang angeführt (Tabelle A.1). Sequenzierungen wurden von der Firma GATC (Konstanz) durchgeführt.
2.3 Biologisches Material
2.3.1 Arabidopsis thaliana
Mit Ausnahme von N9808, N9809 (Ws-2 Hintergrund) und N4351 (Ler Hintergrund)
wurden A. thaliana Genotypen mit einem genetischen Hintergrund des Ökotyp Columbia
(Col-0) verwendet (Tabelle 2.1).
2.3.2 Phytopathogene Pilze
2.3.2.1 Colletotrichum higginsianum
Für Infektionen mit C. higginsianum wurde ausschließlich das Isolat MAFF 305635 (Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries, Tokyo, Japan) verwendet.
2.3.2.2 Erysiphe cruciferarum
Das verwendete E. cruciferarum-Isolat wurde von Dr. Reinhard Pröls und Dr. Ralph Hückelhoven (TU München) zur Verfügung gestellt.
24
2 M ATERIAL UND M ETHODEN
Genotyp
adg1-1
cca1-11/lhy-21
CCR2:LUC W1
coi1-21
Col-0
cyp79B2/cyp79B3
hig1-1 (myb51)
HIG1-1D
MEm4
mur4-1 (hsr8)
mur8-1
mur11-1 (sac9)
myb51/34
pad3-1
pad4-1
sex1-1
tpt1-2
pgm
pgm (stf1)
ADP glucose pyrophosphorylase
circadian clock associated /
late elongated hypocotyl
Parentallinie von N9809
coronatine insensitive
Columbia Wildtyp
cytochrome P450
monooxygenase
high indolic glucosinolate
activation-tagged HIG1-1
transgene Expression des
NADP-Malat Enzym aus Mais
murus
murus
murus
MYB-type transcription factor
phytoalexin deficient
phytoalexin deficient
starch excess
triose-phosphate/phosphate
translocator
plastidic phosphoglucomutase
plastidic phosphoglucomutase
AGI
Linie / Referenz
At5g48300
At2g46830 /
At1g01060
N3094
N9809
At2g39940
At4g39950/
At2g22330
At1g18570
At1g18570
N9808
N535548
N1092
Zhao et al. (2002)
Gigolashvili et al. (2007)
Gigolashvili et al. (2007)
Fahnenstich et al. (2007)
At1g30620
unbekannt
At1g59770
At1g18570/
At5g60890
At3g26830
At3g52430
At1g10760
At5g46110
N8568
N8575
N8579
Dr. Tamara Gigolashvili,
Universität zu Köln
N3805
N3806
N3093
N686324
At5g51820
At5g51820
N210
N4351
Tabelle 2.1 Verwendete Arabidopsis thaliana Genotypen. Von allen verwendeten Genotypen ist
der AGI-code sowie die Lagernummer des Nottingham Arabidopsis Stock Centre bzw. eine Referenz aufgelistet.
2.4 Anzucht- und Infektionsmethoden
2.4.1 Anzucht von Arabidopsis thaliana
A. thaliana Saatgut wurde auf Arabidopsis Erdmischung (65% Fruhstorfer Erde Typ P
(Fa. Hawita, Vechta), 25% Sand, 10% Liadrain Blähton (Fa. Liapor, Pautzfeld)) ausgebracht und anschließend für 48h bei 8°C dunkel und feucht inkubiert. Diese Stratifizierung
diente dem Brechen der Dormanz, um die Synchronität der Keimung zu erhöhen. Anschließend wurden die Sämlinge 2 Wochen unter Kurztag-Bedingungen (8 h (22°C)/16
h (19°C) Licht-/Dunkelrhythmus) angezogen, pikiert und in einer Phytokammer (GroBank; CLF, Weilheim) unter definierten Bedingungen (100 µmol m−2 s−1 , 70% relative
Luftfeuchtigkeit) gehalten. Sofern nicht anders erwähnt, wurde ein 12h / 12h Licht- / Dunkelzyklus als Standard verwendet. Zwei Wochen nach dem Pikieren wurde jede Pflanze
mit 40 ml 0,1% WUXAL-Super Dünger (Aglukon, Düsseldorf) gedüngt.
25
2 M ATERIAL UND M ETHODEN
2.4.2 Kultivierung von Colletotrichum higginsianum
Die Sporulation von C. higginsianum erfolgte auf Haferflocken Agarplatten (oatmeal
agar, OMA). Für die Anfertigung einer Glycerin-Stammkultur wurden Conidien einer
7 Tage alten Platte in sterilem Wasser aufgenommen, mit dem gleichen Volumen NSYMedium gemischt und bei -80°C gelagert. Je 10 µl einer Stammkultur wurden zur Vorbereitung einer Infektion auf OMA ausplattiert und 7 Tage bei 22°C im Licht inkubiert.
OMA Sporulationsmedium
50 g/l
12 g/l
oatmeal (zerkleinerte Haferflocken)
Agar
45 min bei 121°C autoklavieren
NSY-Medium
0,8% (w/v)
0,1% (w/v)
0,5% (w/v)
70,0% (w/v)
Nutrient Broth
(Pepton und Fleischextrakt 5:3)
Hefeextrakt
Saccharose
Glycerin
2.4.2.1 Infektion von A. thaliana mit C. higginsianum
Zur Infektion von A. thaliana wurden C. higginsianum Conidien von 7 Tage alten OMAPlatten verwendet. Die Conidien wurden mit Wasser abgespült und der Sporentiter in
einer Neubauer-Zählkammer bestimmt. Als Inokulum diente eine Conidiensuspension,
die 2 Millionen Conidien pro Milliliter enthielt. Diese wurde zügig und gleichmäßig auf
zuvor gut gewässerte Pflanzen ausgebracht. Die Inokulation erfolgte, sofern nicht anderweitig spezifiziert, 3 Wochen nach dem Pikieren unmittelbar vor Ende der Lichtperiode.
Pflanzschalen wurde am Rand mit feuchtem Papier ausgelegt und mit einer befeuchteten Plastikhaube abgedeckt um eine hohe Luftfeuchtigkeit für einen gleichmäßigen und
reproduzierbaren Infektionsprozess zu gewährleisten. 60h nach der Infektion wurden die
Hauben abgenommen und die Feuchtigkeit in den Pflanzschalen reduziert. Als Kontrollen wurde Pflanzen aus der selben Anzucht mit Wasser besprüht und wie die infizierten
Pflanzen behandelt.
26
2 M ATERIAL UND M ETHODEN
2.4.3 Kultivierung von Erysiphe cruciferarum
Der Arabidopsis Mehltau-Pilz E. cruciferarum wurde unter kontrollierten Bedingungen
(10 h /14 h Licht-/Dunkelrhythmus, 22°C, 120 µmol m−2 s−1 , 65% relative Luftfeuchtigkeit) auf Arabidopsis pad4-1 Mutanten propagiert.
2.4.3.1 Infektion von A. thaliana mit E. cruciferarum
Fünf Wochen alte Arabidopsis-Pflanzen wurden durch Abstreifen von E. cruciferarumConidien mit einem Pinsel inokuliert. Die Conidien-Dichte wurde mit einer NeubauerZählkammer bestimmt und betrug 3 bis 5 E. cruciferarum Conidien pro mm2 .
2.5 Mikroskopische Methoden und histologische Färbungen
2.5.1 Mikroskopie
Zur Mikroskopie von Arabidopsis-Blattmaterial wurde ein Leica DMR-Mikroskop (Bensheim) verwendet.
2.5.2 Trypanblau Färbung
Trypanblau färbt Pilzmaterial und tote Zellen blau an. Die Färbung nach Koch und Slusarenko (1990) wurde für die mikroskopische Beobachtung und Klassifizierung von C. higginsianum Infektionsstrukturen in planta eingesetzt. Das infizierte Blattgewebe wurde in
einem Reaktionsgefäß mit der Trypanblau-Färbelösung (10 mg Trypanblau, 10 g Phenol,
10 ml H2 O, 10 ml Milchsäure, 10 ml Glycerin) bedeckt, für 1 min bei 99°C inkubiert
und anschließend über Nacht bei Raumtemperatur gefärbt. Am folgenden Tag wurde das
Blattmaterial in gesättigte Chloralhydratlösung (250% (w/v)) überführt, mindestens einen Tag entfärbt und in der selben Lösung gelagert. Mit Trypanblau gefärbte Präparate
wurden im Hellfeld und im differentiellem Interferenzkontrast mikroskopiert.
2.5.3 Klassifizierung der Infektionsstadien von C. higginsianum
Die Häufigkeit spezifischer Infektionsstrukturen wurde mikroskopisch untersucht und bewertet. Unter Berücksichtigung der Entwicklungsreihenfolge von Appressorien, Infektionsvesikeln, Primärhyphen und Sekundärhypen (s. Abb. 1.1), wurde jeweils nur die fortgeschrittenste Infektionsstruktur ausgezählt. Je Replikat wurden 400-800 Infektionsstrukturen auf 4 unabhängigen Blättern ausgewertet.
27
2 M ATERIAL UND M ETHODEN
2.5.4 Anilinblau Färbung von Callose
Arabidopsis Blätter wurden in 80% EtOH bei 80°C entfärbt, 30 min in 0,07 M NatriumPhosphat Puffer (pH 9) inkubiert und 60 min in 0,005% (w/v) Anilinblau-Lösung inkubiert. Anschließend wurden die Blätter gründlich mit H2 O gewaschen und die Ablagerung
von Callose unter C. higginsianum-Appressorien unter UV-Licht untersucht. Je Replikat
wurde die Callose-Ablagerung unter mindestens 100 Appressorien ausgewertet.
2.5.5 Stärkefärbung mit Jod-Kaliumjodid
Um die lokale Verteilung von Stärke in Blattgewebe zu untersuchen, wurde Blattmaterial
für 30 min in 80% Ethanol bei 80°C entfärbt, gründlich mit H2 0 gewaschen und 5 min
mit Lugol’scher Lösung (1% Jod, 2% Kaliumjodid) inkubiert, um Blattstärke anzufärben.
Anschließend wurde das Blattmaterial gründlich mit H2 O gewaschen (Yu et al., 2001).
2.6 Molekularbiologische Methoden
2.6.1 Molekularbiologische Standardmethoden
Molekularbiologische
Standardmethoden
wie
Restriktionsverdau,
Polymerase-
Kettenreaktion, Ligation und Agarose-Gelelektrophorese wurden wie beschrieben durchgeführt (Mülhardt, 2009). Für direkte Sequenzierungen oder Klonierungen von PCRProdukten wurden PCR-Reaktionen mit dem QIAquick® PCR Purification Kit (Qiagen,
Hilden) aufgereinigt. Gelextraktionen wurden mit dem QIAquick® Gel Extraction Kit
(Qiagen, Hilden) durchgeführt.
2.6.2 Schnellpräparation genomischer DNA
Mit der Schnellpräparation nach (Edwards et al., 1991) kann aus kleinen Mengen von
Pflanzengewebe genomische DNA extrahiert werden, die für eine analytische PCR geeignet ist. Blattproben wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und entweder direkt
in 400 µl Extraktionspuffer mit einem rotierenden Pistill (RZR 1, Heidolph, Schwabach)
homogenisiert, oder zunächst mit einem Qiagen Tissue Lyser II aufgeschlossen und anschließend in 400 µl Extraktionspuffer homogenisiert. Die Zelltrümmer wurden 2 min bei
16000 g in einer Tischzentrifuge sedimentiert und 300 µl des Überstandes in ein neues
Gefäß überführt. Zum Fällen der DNA wurden 300 µl Isopropanol zugegeben und 2 min
bei RT inkubiert. Nach 5 min Zentrifugation bei 16000 g wurde der Überstand sorgfältig
abgenommen, das DNA-Sediment optional mit 70% EtOH gewaschen und anschließend
28
2 M ATERIAL UND M ETHODEN
getrocknet. Die extrahierte DNA wurde in 50-100 µl 1 x Tris-EDTA (10 mM Tris pH 7,5;
1 mM EDTA) Puffer resuspendiert und bei -20°C gelagert.
DNA Extraktionspuffer
200 mM
250 mM
25 mM
0,5%
Tris HCl pH 7,5
NaCl
EDTA
SDS
2.6.3 Quantitative PCR genomischer DNA von C. higginsianum
Zur quantitativen Auswertung der Proliferation von C. higginsianum wurden DNA Extrakte von infiziertem Arabidopsis-Blattmaterial mit quantitativer PCR analysiert. Aus
mindestens vier unabhängigen Blättern wurde mit einem Korkbohrer 2 cm2 Blattmaterial ausgestochen, unter flüssigem Stickstoff mit Mörser und Pistill homogenisiert und
anschließend genomische DNA mit dem Qiagen DNeasy Kit (Qiagen, Hilden) extrahiert.
Als interne Extraktionskontrolle wurde optional das Plasmid pA7-P19 (Vogel, 2009) zu
dem Blattpulver gegeben. Die relative Menge pilzlicher DNA wurde mit einem Stratagene Mx3000P qPCR System (Agilent, Santa Clara, USA) analysiert. Dazu wurden von
200 µl Elutionsvolumen 10 µl einer 1:10 Verdünnung in einen 20 µl PCR Ansatz mit
Brilliant II SYBR® Green QPCR Master Mix (Agilent, Santa Clara, USA) eingesetzt.
Für die Quantifizierung von C. higginsianum wurden Primer für das TrpC Gen und die
interne Kontrolle pA7-P19 verwendet (TE 15/16, RH 166/167; Tabelle A.1) und die
Blattfläche zur Normalisierung der Messwerte verwendet. Folgendes PCR-Programm
wurde verwendet: 10 min 95°C, gefolgt von 40 Zyklen 30 sek 95°C, 30 sek 56°C und
30 sek 72°C. Die Berechnung der relativen Menge (RQ, relative quantity) an pilzlicher
DNA erfolgte wie beschrieben (Rieu und Powers, 2009) mit folgender Formel:
RQ =
1
E Ct
RQ
relative quantity
E
experimentell bestimmte Primereffizienz
Ct
Zeitpunkt, zu dem das exponentielle
Fluoreszenzsignal einen manuell festgelegten
Schwellenwert von 300 überschreitet
2.6.4 Quantitative PCR genomischer DNA von E. cruciferarum
Zur quantitativen Auswertung der Proliferation von E. cruciferarum wurde 60 mg Probenmaterial unter flüssigem Stickstoff mit Mörser und Pistill homogenisiert und wie für
C. higginsianum beschrieben extrahiert. Von 100 µl Elutionsvolumen wurden 10 µl unverdünnt in einen 20 µl PCR Ansatz mit Brilliant II SYBR® Green QPCR Master Mix
29
2 M ATERIAL UND M ETHODEN
(Agilent, Santa Clara, USA) eingesetzt. Die Quantifizierung von E. cruciferarum DNA erfolgte mit spezifischen Primern für ein β -Tubulin-Gen, während zur Normalisierung auf
die extrahierte Menge an Pflanzenmaterial Primer für das Arabidopsis RbcS Gen verwendet wurden (TE 173/177, TE 74/75; Tabelle A.1). Das verwendete PCR-Programm und
die Berechnung der relativen Menge an pilzlicher DNA erfolgte wie für C. higginsianum
beschrieben.
2.6.5 Isolation von RNA aus Pflanzengewebe
Für die Isolation von RNA aus Pflanzengewebe wurde die RNase-all Methode verwendet
(Chomczynski und Sacchi, 1987). Alle wässrigen Lösungen wurden vor Benutzung 16
h mit 0,1% (v/v) Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandelt und anschliesend autoklaviert,
um RNAsen zu inaktivieren. Schockgefrorenes Material wurde im vorgekühlten Mörser
zu einem feinen Pulver zerrieben und sofort mit 3 mL RNase-all Arbeitslösung (wassergesättigtes Phenol: RNAse-all, 1:1) bedeckt. Wahrend des Auftauens wurde die zähflüssige Masse regelmäßig vermengt, um zu garantieren, dass das Material ausschließlich im
Puffer auftaute. Der Extrakt wurde auf zwei Reaktionsgefäße aufgeteilt, mit jeweils 0,3
mL CI (Chloroform:Isoamylalkohol, 24:1) versetzt und 10 s ausgeschüttelt. Nach 30 min
Inkubation auf Eis wurde fur 15 min bei 16000 g und RT zentrifugiert. Der Überstand
wurde mit 0,7 mL wassergesättigtem Phenol und 0,3 mL CI ausgeschüttelt, nochmals
zentrifugiert und ein letztes Mal mit 0,3 mL CI gewaschen. Die RNA wurde durch die
Zugabe von 1/20 Volumen 1 N Essigsäure und 1 Volumen Ethanol gefällt und durch 8 min
Zentrifugation bei 16000 g und 4°C sedimentiert. Anschliesend wurde der RNA-Extrakt
nacheinander mit 1 mL 3 M Natriumacetat (pH 6,0) und 1 mL 80% Ethanol gewaschen.
Die RNA wurde unter der Sterilbank getrocknet und in 30-100 µl H2 Odd aufgenommen.
Die RNA-Konzentration und Reinheit wurde nach 5 min Denaturieren bei 60°C photometrisch (Nanodrop® ND-1000, Peqlab, Erlangen) bei A260 , A280 und A230 bestimmt. RNA
wurde bis zur weiteren Verwendung bei -80°C gelagert.
RNAse-all
4M
25 mM
0,5%
0,7% (v/v)
Guanidinisothiocyanat
Natriumacetat
N-Lauroylsarcosin
β -Mercaptoethanol
pH auf 7,0 eingestellt und sterilfiltriert
30
2 M ATERIAL UND M ETHODEN
2.6.6 Northernblot-Analyse
Nach einem Denaturierungsschritt von 10 min bei 65°C wurden 8 µg Gesamt-RNA in einem 1,5% (w/v) Formaldehyd-Agarosegel aufgetrennt und wie beschrieben durch Kapillartransfer über Nacht auf eine Nylonmembran (GeneScreen, NEN, Boston, USA) übertragen (Mülhardt, 2009). Nach Vernetzung der Nukleinsauren mit der Membran unter
UV-Licht wurde die Membran 2 h in Church-Puffer (Church und Gilbert, 1984) bei 65°C
prähybridisiert. Für die Detektion der nachzuweisenden mRNA wurden entsprechende
cDNA-Fragmente mit 40 µCi [32 P]dCTP mittels High Prime Mix (Roche) nach Herstellerangaben radioaktiv markiert. Die radioaktiv markierte Sonde wurde 2 min bei 95°C
denaturiert, zum Hybridisierungspuffer gegeben und über Nacht bei 65°C hybridisiert.
Nach Waschen mit 6 x SSC/SDS-Puffer (900 mM NaCl, 90 mM Natriumcitrat, 0,1%
SDS) wurde die Membran auf einem Röntgenfilm (Kodak) für minimal 3 Stunden bis
maximal 7 Tage bei -80°C exponiert, um spezifische Signale zu detektieren.
2.6.6.1 Sondenherstellung für Northernblot-Analysen
Sonden für Northernblot-Analysen wurden mittels PCR von cDNA amplifiziert. Zur Vermehrung wurden die Sonden in pGEM-T-easy (Promega) kloniert und vor der radioaktiven Markierung aus dem Plasmid ausgeschnitten. Die verwendeten PCR-Primer zur Amplifikation der Sequenzenzen von PR-1, PR-2, PR-4 und PDF1.2 sind in Tabelle A.1 aufgeführt (TE 112/113, 114/115, 118/119, 122/123). Sonden zur Detektion von 18 S rRNA
wurden von Dr. Sophia Sonnewald zur Verfügung gestellt.
2.7 Metabolitanalysen und physiologische Methoden
2.7.1 Bestimmung der Gehalte an löslichen Zuckern und Stärke
Lösliche Zucker wurden aus tiefgefrorenem Pflanzenmaterial mit zweimal 1 ml 80%
Ethanol bei 80°C für je 30 min extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden in einem
Vakuumkonzentrator eingeengt und unter Schütteln in 200 µl H2 Odd aufgenommen.
Zur Extraktion von Stärke wurde das entfärbte Pflanzenmaterial mit 500 µl 0,2 M Kaliumhydroxid versetzt und mit einem rotierenden Pistill homogenisiert. Durch 45 min
Inkubation bei 95°C wurde die Stärke in Lösung gebracht. Die Lösung wurde 1 min auf
Eis inkubiert, mit 1 M Essigsäure auf einen pH-Wert von 5,5-6 eingestellt und nach Zugabe von 100 µl Enzymlösung (7,3 U α-Amylase, 5 U Amyloglukosidase in 0,1 M Natriumacetat) über Nacht bei RT inkubiert. Durch 10 minütiges Erhitzen bei 95°C wurde
31
2 M ATERIAL UND M ETHODEN
die enzymatische Reaktion abgestoppt, unlösliches Material 5 min bei 16000 g abzentrifugiert, und der Stärkegehalt anhand der entstandenen Glukoseeinheiten im Überstand
quantifiziert.
Zur Bestimmung des Gehaltes der löslichen Zucker Glukose, Fruktose und Saccharose
wurde nach Bergmeyer (1970) eine Substratkette ausgenutzt, bei welcher der Umsatz dieser Zucker an die Reduktion von NAD+ zu NADH/H+ und somit an eine Zunahme der
Absorption bei 340 nm gekoppelt ist. Die Analyse wurde in einem Mikrotiterplattenlesegerät (EL808; Biotek, Bad Friedrichshall) durchgeführt.
Reaktionsansatz des enzymatisch gekoppelten optischen Tests
Prämix
5 - 10 % (v/v)
100 mM
0,6 mM
2 mM
10 mM
40 mU
ad 200µl
Enzymzugabe
Extrakt
Hepes/KOH-Puffer, pH 8
NAD+
ATP
MgCl2
G6P-DH
H2 Odd
60 mU
140 mU
30 U
Hexokinase
PGI
Invertase
Den Zusammenhang zwischen Extinktionsänderung und Konzentration beschreibt das
Lambert Beer’sche Gesetz. Da anstatt einer Küvette hier eine Mikrotiterplatte verwendet
wurde, wurde die Formel wie nachfolgend erweitert:
∆E · π · r2
∆c =
ε340 (NADH/H + ) ·V
Extinktionsänderung
∆E
Radius der Messkavität (0,35 cm)
r
ε340
V
(NADH/H + )
Extinktionskoeffizient (6,3 mM−1 ·cm−1 )
eingesetztes Extrakt-Volumen
2.7.2 Analyse der Zellwand-Monosaccharid Zusammensetzung
Die Präparation und Fraktionierung von Zellwandproben wurde wie beschrieben (Reiter et al., 1993, 1997) mit kleinen Veränderungen durchgeführt. Für die Analyse der
Monosaccharid-Zusammensetzung der gesamten Zellwand, wurde 30-40 mg Blattmaterial zunächst zweimal mit 1 ml 80% EtOH für 20 min bei 80°C und einmal mit 1 ml Aceton für 5 min bei RT extrahiert. Das Blattmaterial wurde daraufhin für 10 min bei 60°C
getrocknet, mit einem rotierenden Pistill in 1 ml 2 M Trifluoressigsäure (TFA) resuspendiert und 1 h bei 120°C hydrolysiert. Nach kurzer Zentrifugation bei 16000 g wurde der
Überstand in einem Vakuumkonzentrator eingeengt und die Monosaccharide in H2 Odd
resuspendiert.
32
2 M ATERIAL UND M ETHODEN
Um Zellwandpräparate in pufferlösliche und pufferunlösliche Polymere zu fraktionieren, wurde Blattmaterial wie beschrieben extrahiert und getrocknet und anschließend mit
einem rotierenden Pistill in eiskaltem Puffer A (100 mM MOPS pH 7,0; 1,5% SDS, 5 mM
Natriumbisulfit) resuspendiert. Nach einem Ultraschallaufschluss für 5 min in einem EisWasser Bad (Sonopuls HD 2070 und UW 2027, 50% Betriebszyklus, 50% Energie; Bandelin, Berlin), wurde unlösliches Material für 10 min bei 16000 g und 4°C abzentrifugiert.
Der Niederschlag wurde mit 1 ml eiskaltem Puffer B (100 mM MOPS pH 7,0; 0,5% SDS,
3 mM Natriumbisulfit) gewaschen und die Überstände als pufferlösliche Fraktion zusammengeführt. Nach Zugabe von 8 M Ammoniumacetat bis zu einer Endkonzentration von
1 M, wurden Zellwandpolymere für 16 h mit 5 Volumenanteilen EtOH/Aceton (1:1) bei
RT ausgefällt. Nach einer Zentrifugation für 15 min bei 3200 g (Eppendorf 5810R, Rotor
A-4-62), wurde der Niederschlag mit 5 ml 80% EtOH gewaschen. Die pufferunlösliche
Fraktion wurde erneut mit 1 ml Puffer B, sowie dreimal mit 1 ml H2 Odd und einmal
mit 1 ml 80% EtOH gewaschen. Beide Fraktionen wurden kopfüber getrocknet wie oben
beschrieben hydrolysiert.
Die extrahierten Monosaccharide wurde mittels Hochleistungsanionenaustauschchromatographie mit gepulster amperometrischer Detektion (HPAEC-PAD) über eine
CarboPac® PA20 Säule (Dionex) bei einer Säulentemperatur von 30°C und einer Flussrate von 0,4 ml/min in einem Dionex ICS-3000 System (Sunnyvale, USA) aufgetrennt.
Um eine vollständige Trennung von Xylose und Mannose zu erreichen, wurde zunächst
21 min isokratisch mit 100% Puffer C (2 mM NaOH, Fluka 72064) eluiert. Innerhalb von
2 min wurde der Eluent zu 5% Puffer A (20 mM NaOH, 1 M NaAc), 50% Puffer B (200
mM NaOH) und 45% buffer C, anschließend innerhalb von 19 min zu 30% Puffer A,
50% Puffer B und 20% Puffer C und danach innerhalb von 5 min zu 50% Puffer A und
50% Puffer B geändert. Nach einer isokratischen Elution von 2 min wurde der Eluent in
2 min zu 100% Puffer B geändert und 3 min isokratisch gehalten. In 3 min wurde der
Eluent zu 100% C geändert und die Säule für 13 min reäquilibriert. Um eine vollständige
Trennung von Rhamnose und Arabinose zu erreichen, wurde zunächst 14 min isokratisch
mit 4% Puffer B und 96% Puffer C eluiert. Innerhalb von 2 min wurde der Eluent zu 2%
Puffer A, 48% Puffer B und 50% buffer C, anschließend in 16 min zu 30% Puffer A,
50% Puffer B und 20% Puffer C und danach in 4 min zu 50% Puffer A und 50% Puffer B
geändert. Anschließend wurde die Säule wie beschrieben gewaschen und reäquilibriert.
33
2 M ATERIAL UND M ETHODEN
2.7.3 Protoplast Release Assay
Zur Analyse der enzymatischen Verdaubarkeit der Zellwand verschiedener Arabidopsis
Genotypen, wurden jeweils 4 Blattexplantate à 5 · 5 mm auf 500 µl sterilfiltrierte Enzymlösung (1% Cellulase Onozuka R-10, 1% Macerozyme R-10 (Duchefa) und 1% Driselase
(Sigma D8037) in Gamborg B5 medium, 0.45 M mannitol) gelegt und auf einem Orbitalschüttler bei RT inkubiert. Die Freisetzungsrate von Protoplasten wurde nach 30 min,
60 min und 110 min in 2 µl Aliquots analysiert und mit einer Neubauer Zählkammer
quantifiziert.
2.7.4 Bestimmung der Gehalte an Salicylsäure und Camalexin
Freie Salicylsäure (SA), SA-Glucoside und Camalexin wurden wie beschrieben (Nawrath
und Métraux, 1999) mit kleinen Veränderungen extrahiert. Blattmaterial mit einer Fläche
von 2 cm2 oder 30-50 mg FG wurde mit 250 ng Ortho-Anissäure (o-ANI) als internem
Standard versetzt und je einmal mit 600 µl 70% MeOH bzw. 600 µl 90% MeOH bei
65°C für 1 h extrahiert. Das Lösungsmittel der vereinigten Extrakte wurde in einem Vakuumkonzentrator (Bachofer, Reutlingen) eingeengt. Nach einer Proteinfällung mit 500
µl 5% (w/v) Trichloressigsäure wurden freie Phenole und Camalexin zweimal in 600
µl Cyclohexan/Ethylacetat (1:1) ausgeschüttelt. Die vereinigten organischen Phasen wurden wiederum im Vakuumkonzentrator eingeengt und in 400 µl 20% Acetonitril/80% 25
mM KH2 PO4 (pH 2.6), der mobilen Startphase der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), resuspendiert. Freie SA und Camalexin wurden per HPLC (s.u.) quantifiziert. Für die Quantifizierung von gebundener SA wurde die verbleibende wässrige Phase mit einem Volumenanteil 8 M HCL versetzt und für 1 h bei 80°C inkubiert. Nach dieser
sauren Hydrolyse wurde freigesetzte SA zweimal in 600 µl Cyclohexan/Ethylacetat (1:1)
ausgeschüttelt, mit 20 µl H2 Odd versetzt, um die Sublimation von SA zu vermeiden und
das Lösungsmittel im Vakuumkonzentrator eingeengt. Nach dem Resuspendieren in 400
µl 20% Acetonitril/80% 25 mM KH2 PO4 (pH 2,6), wurden SA, o-ANI und Camalexin
über eine Phenomenex Luna Security Guard C18 Vorsäule (4,0 x 3,0 mm) und eine 5 µm
Luna C18(2) reversed phase Hauptsäule (250 x 4,6 mm) (Torrance, USA) bei einer Säulentemperatur von 30°C und einer Flussrate von 1 ml/min in einer Dionex Summit HPLC
(P680, ASI-100, TCC-100, RF-2000; Sunnyvale, USA) aufgetrennt.
Nach einer isokratischen Elution mit der mobilen Startphase für 5 min wurde der
Acetonitril-Anteil innerhalb von 23 min auf 50% und in 2 min auf 70% erhöht. Nach
2 min isokratischer Elution wurde der Anteil wieder auf 20% reduziert und die Säulen für
4 min reäquilibriert. Die Einstellungen des Fluoreszenzdetektors wurden dabei jeweils an
34
2 M ATERIAL UND M ETHODEN
die Messung von o-ANI (0 - 14 min, Anregung 305 nm, Emission 365 nm), SA (14 22 min, Anregung 305 nm, Emission 407 nm) und Camalexin (22 - 28 min, Anregung
318 nm, Emission 370 nm) angepasst. Zur Quantifizierung von SA und Camalexin wurden Standardreihen der Reinsubstanzen verwendet. Camalexin wurde wie beschrieben
über Dünnschichtchromatographie (Zhao und Last, 1996) aus C. higginsianum-infizierten
Arabidopsis Blättern gewonnen und über eine Phenomenex Luna Security Guard C18
Vorsäule (4,0 x 3,0 mm) und eine 5 µm Luna C18(2) reversed phase Hauptsäule (250 x
4,6 mm) (Torrance, USA) chromatographisch analysiert (Glawischnig et al., 2004). Das
UV Absorptionsspektrum wurde mit einem Dionex PDA-3000 Photodiodenarray Detektor aufgezeichnet und die Menge an extrahiertem Camalexin über den molaren Extinktionskoeffizient von 14,8 mM−1 cm−1 aus Tsuji et al. (1992) quantifiziert.
2.7.5 Bestimmung der Gehalte löslicher Phenylpropane
Zur Extraktion löslicher Phenylpropane wurde 100 mg gefrorenes Blattmaterial in 500 µl
60% Methanol mit Mörser und Pistill zerrieben. Rückstände an Mörser und Pistill wurden
mit 200 µl 60% Methanol abgespült und mit dem ersten Extrakt vereinigt. Die vereinigten
Extrakte wurden zweimal für 30 sek bei 16000 g zentrifugiert und in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Der Extrakt wurde in einem Vakuumkonzentrator (Bachofer, Reutlingen)
zur Trockne eingeengt und in 50 µl 60% Methanol resuspendiert. Nach erneuter Zentrifugation für 30 sek bei 16000 g wurde der Überstand für eine HPLC-Analyse eingesetzt.
Die Auftrennung erfolgte über eine Phenomenex Luna Security Guard C18 Vorsäule (4,0 x 3,0 mm) und eine 5 µm Luna C18(2) reversed phase Hauptsäule (250 x 4,6
mm) (Torrance, USA) bei einer Säulentemperatur von 24°C und einer Flussrate von 750
µl/min in einer Dionex ULTIMATE 3000 HPLC (DGP-3600MB, WPS-3000TB, PDA3000; Sunnyvale, USA) aufgetrennt. Zur Elution löslicher Phenylpropane wurde ein binärer Gradient aus 1% Phosphorsäure (A) und Acetonitril (B) verwendet. Die Elution
begann mit 90% A und 10% B, wurde innerhalb von 30 min auf 80% A, 20% B und
innerhalb weiterer 10 min auf 60% A 40% B geändert. Der Acetonitril-Anteil wurde danach innerhalb von 2 min auf 95% gesteigert, woraufhin ein fünfminütiger Waschschritt
mit dieser Zusammensetzung erfolgte. Anschließend wurde der Gradient innerhalb von
2 min auf 90% A und 10% A zurückgesetzt und die Säule für 6 min reäquilibriert. Zur
Identifizierung der löslichen Phenylpropane wurden die Absorptionsmaxima der authentischen Aglyka Sinapinsäure, Kaempferol und Quercetin bei 325 nm verwendet. Phenylpropanderivate wurden durch die Integration der Peakflächen und anhand von externen
Standards der authentischen Aglyka quantifiziert.
35
2 M ATERIAL UND M ETHODEN
2.7.6 Bestimmung der Gehalte zellwandgebundener Phenylpropane
Zur Extraktion zellwandgebundener Phenylpropane wurde 50 mg gefrorenes Blattmaterial in 1 ml 100% Ethanol mit Mörser und Pistill zerrieben. Rückstände an Mörser und
Pistill wurden mit 200 µl 100% Ethanol abgespült und mit dem ersten Extrakt vereinigt.
Die vereinigten Extrakte wurden 15 min bei 90°C erhitzt und anschließend 5 min mit
Ultraschall zur Solubilisierung von Stärke sonifiziert (Sonopuls HD 2070 und UW 2027,
50% Betriebszyklus, 50% Energie; Bandelin, Berlin). Die Suspensionen wurden für 10
min bei 10000 g zentrifugiert und die Sedimente zum Waschen mit einem rotierenden
Pistill einmal in 1 ml Methanol und zweimal in 1 ml Aceton bei Raumtemperatur homogenisiert, 20 min bei 1200 U/min geschüttelt und 10 min bei 10000 g zentrifugiert.
Nach dem letzten Waschschritt wurden die Extrakte bei 60°C bis zur Gewichtskonstanz
getrocknet. Für eine alkalische Hydrolyse wurde das Zellwandmaterial in 1 ml 2 M NaOH
mit einem rotierenden Pistill homogenisiert und über Nacht unter Stickstoff im Dunkeln
bei 37°C und 800 U/min geschüttelt. Die Extrakte wurden mit 1/10 Volumen 37% HCl auf
pH 1-2 angesäuert und für 10 min bei 10000 g zentrifugiert. Phenylpropane wurden aus
den Überständen dreimal in je 0,5 ml Ethylacetat extrahiert, indem kräftig ausgeschüttelt
und für 10 min bei 3500 g zentrifugiert wurde. Die vereinigten Extrakte wurden in einem
Vakuumkonzentrator (Bachofer, Reutlingen) getrocknet und bis zur HPLC-Analyse bei
4°C gelagert.
Die Zellwandextrakte wurden vor der Analyse in 40 µl 100% Methanol resuspendiert,
bei 10000 g für 30 sek zentrifugiert und über eine Phenomenex Luna Security Guard C18
Vorsäule (4,0 x 3,0 mm) und eine 5 µm Luna C18(2) reversed phase Hauptsäule (250
x 4,6 mm) (Torrance, USA) bei einer Säulentemperatur von 24°C und einer Flussrate
von 750 µl/min in einer Dionex ULTIMATE 3000 HPLC (DGP-3600MB, WPS-3000TB,
PDA-3000; Sunnyvale, USA) aufgetrennt. Zur Elution der Phenylpropane wurde ein binärer Gradient aus 1% Phosphorsäure (A) und Acetonitril (B) verwendet. Nach einer
isokratischen Elution mit 70% A und 30% B für 10 min, wurde der Anteil an Acetonitril
innerhalb von 15 min auf 60% erhöht. Innerhalb von 2 min wurde die Zusammensetzung
des Laufmittels auf 5% A und 95% B geändert, woraufhin ein dreiminütiger Waschschritt
mit dieser Zusammensetzung erfolgte. Anschließend wurde der Gradient innerhalb von 2
min auf 70% A und 30% A geändert und die Säule für 8 min reäquilibriert. Zur Identifizierung der zellwandgebundenen Phenylpropane wurden die Absorptionsmaxima authentischer Aglyka bei 325 nm herangezogen. Durch Integration der Peakflächen wurden die
Phenylpropane quantifiziert, und gegebenenfalls anhand von Standardreihen der authentischen Aglyka quantifiziert.
36
2 M ATERIAL UND M ETHODEN
2.7.7 Bestimmung der Gehalte an Glucosinolaten
Glucosinolate wurden wie beschrieben (Gigolashvili et al., 2007) mit kleinen Veränderungen extrahiert. Zur Aufreinigung der Glucosinolate wurden DEAE-AnionenAustauschersäulen wie folgt vorbereitet: Je Säule wurde 1 ml DEAE-Sepharose Fast
Flow-Suspension (GE Healthcare, Little Chalfon, UK) 3 min bei 130 g zentrifugiert, das
Ethanol der Suspension abgenommen und mit dem selben Volumen H2 Odd ersetzt. Je 1
ml der Suspension wurde in Säulen (1,5 ml Bio-Rad Micro Spin Chromatography Columns; Hercules, CA, USA) gefüllt und und 1 min bei 400 g zentrifugiert. Die Säulen
wurden dreimal mit 0,5 ml H2 Odd und zweimal mit 0,5 ml 0,5 M Essigsäurepuffer pH 5,0
(NaOH) gewaschen und bis zur Verwendung in dem Puffer gelagert.
Zur Abspaltung der Sufatgruppen von Glucosinolaten während der Aufreinigung wurde
eine Sulfatase nach Graser et al. (2001) aufgereinigt. 260 mg Sulfatase (Helix pomatia, EC
3.1.6.1, Sigma S9626) wurden in 11 ml H2 Odd gelöst, mit 11 ml 100% Ethanol gemischt
und für 20 min bei 3200 g zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 33 ml 100% Ethanol
gemischt und für 15 min bei 3200 g zentrifugiert. Das Pellet wurde in 9,2 ml H2 Odd gelöst
und in Aliquots von jeweils 1 ml bei -20°C gelagert.
40 mg Blattmaterial wurde in flüssigem Stickstoff mit Mörser und Pistill zerrieben und
in 1 ml 80% Methanol homogenisiert. Als interner Standard wurden 10 µl 1 mM Benzylglucosinolat (Glucotropaeolin; Phytoplan, Heidelberg) zugegeben. Der Extrakt wurde
in ein Reaktionsgefäß überführt und bei 16000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde in
ein neues Reaktionsgefäß überführt und das Pellet zweimal mit 1 ml 80% Methanol gewaschen und bei 16000 g zentrifugiert. Die gesammelten Überstände wurden in sechs
Aliquots à 0,5 ml auf eine Säulen gegeben. Durch die positive Ladung des Säulenmaterials wurden Glucosinolate mit der negativ geladenen Sulfatgruppe an die Säulenmatrix
gebunden. Die Säule wurde fünfmal mit 0,5 ml H2 Odd und zweimal mit 0,5 ml 0,02
M Essigsäurepuffer pH 5,0 (NaOH) gewaschen. Um die Sulfatgruppe der Glucosinolate
abzuspalten, wurden 50 µl der aufgereinigten Sulfatase-Lösung in 450 µl 0,02 M Essigsäurepuffer pH 5,0 (NaOH) zugegeben, die Säulen verschlossen und über Nacht bei
Raumtemperatur inkubiert. Die Desulfoglucosinolate wurden mit dreimal 400 µl H2 Odd
eluiert, in einem Vakuumkonzentrator eingeengt und in 200 µl H2 Odd resuspendiert. Nach
einer Zentrifugation für 2 min bei 16000 g wurden 50 µl des Überstandes mittels HPLC
analysiert.
Die Desulfoglucosinolate wurden über eine Phenomenex Luna Security Guard C18
Vorsäule (4,0 x 3,0 mm) und eine 5 µm Luna C18(2) reversed phase Hauptsäule (250
x 4,6 mm) (Torrance, USA) bei einer Säulentemperatur von 25°C und einer Flussrate
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2 M ATERIAL UND M ETHODEN
von 1 ml/min in einer Dionex ULTIMATE 3000 HPLC (DGP-3600MB, WPS-3000TB,
PDA-3000; Sunnyvale, USA) aufgetrennt. Zur Auftrennung wurde folgender Gradient
aus H2 Odd und Acetonitril (ACN) verwendet: 0-5 min, 0% ACN; 5-30 min, 30% ACN;
30-32 min, 40% ACN; 32-36 min, 40% ACN; 36-40 min, 0% ACN; 40-50 min, 0% ACN.
Die Detektion der Desulfoglucosinolate erfolgte bei 229 nm. Die Identifikation der Glucosinolate erfolgte durch den Vergleich der Retentionszeiten, der Elutionsreihenfolge und
der Spektren der einzelnen Substanzen mit Literaturwerten (Agerbirk et al., 2001; Kiddle
et al., 2001; Gigolashvili et al., 2007). Die Stoffmenge einzelner Glucosinolate (nGS ) wurde anhand einer Standardgerade von Benzylglucosinolat (Benzyl-GS) und der jeweiligen
Response-Faktoren (RF) aus Brown et al. (2003) nach folgender Formel bestimmt:
nGS = Peak f lache ·
RFBenzyl−GS
· SteigungBenzyl−GS
RFGS
2.7.8 Bestimmung der Gehalte an Raphanusamsäure
Raphanusamsäure wurde wie beschrieben (Bednarek et al., 2005) mit kleinen Abwandlungen extrahiert. 100-250 mg gefrorenes Blattmaterial wurde in kleine Stücke zerbröselt
und mit zweimal 300 µl und einmal 500 µl 80% Methanol für je 30 min bei Raumtemperatur extrahiert. Die vereinigten Überstände wurden in einem Vakuumkonzentrator
(Bachofer, Reutlingen) eingeengt und der Extrakt wurde in 200 µl H2 Odd aufgenommen.
Raphanusamsäure wurde über eine Phenomenex Luna Security Guard C18 Vorsäule
(4,0 x 3,0 mm) und eine 5 µm Luna C18(2) reversed phase Hauptsäule (250 x 4,6 mm)
(Torrance, USA) bei einer Säulentemperatur von 25°C und einer Flussrate von 1 ml/min in
einer Dionex ULTIMATE 3000 HPLC (DGP-3600MB, WPS-3000TB, PDA-3000; Sunnyvale, USA) aufgetrennt. Zur Auftrennung wurde folgender Gradient aus H2 Odd /0,1%
Trifluoressigsäure (TFA) und Acetonitril (ACN)/TFA verwendet: 0-3 min, 3% ACN/TFA;
3-13 min, 16% ACN/TFA; 13-16 min, 60% ACN/TFA; 16-18 min, 60% ACN/TFA; 1820 min, 3% ACN/TFA; 20-26 min, 3% ACN/TFA. Raphanusamsäure wurde bei 273 nm
detektiert und anhand eines authentischen Standards (Sigma, S12770) quantifiziert.
2.7.9 Bestimmung von Chlorophyllgehalten
Zur Bestimmung des Chlorophyllgehaltes von Arabidopsis Blattproben, wurden ethanolische Extrakte aus 2.7.1 in 0,2 ml H2 Odd mit 0,8 ml 99% Ethanol gemischt. Von dieser
Lösung wurden 50 µl mit 750 µl 95% Ethanol verdünnt und photometrisch bei 664 und
648 nm vermessen. Der Gesamtchlorophyllgehalt wurde nach Lichtenthaler (1987) mit
38
2 M ATERIAL UND M ETHODEN
der nachfolgenden Formel berechnet:
Chla +Chlb (µg/ml) = 5, 24 · A(664) + 22, 24 · A(648)
2.8 Chemische Mutagenese von Arabidopsis Saatgut
Die chemische Mutagenese von Arabidopsis pgm Saatgut mit Ethylmethansulfonat
(EMS) wurde wie von Lightner und Caspar (1998) und Kim et al. (2006) beschrieben
durchgeführt. Es wurden 400 mg pgm N210 Samen mutagenisiert, was bei einer experimentell bestimmten Zahl von 88 Samen je mg bei der pgm Mutante einer Anzahl von
rund 35.000 Samen entspricht. Die Samen wurden in 40 ml 100 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7.5 unter Rühren bei 4°C über Nacht inkubiert. Der Puffer wurde erneuert und
mit 100 µl 0,25% (v/v) EMS (Sigma M0880) versetzt. Nach 16 h Inkubation unter langsamem Rühren bei RT unter einem Abzug wurde die Lösung abgegossen und das Saatgut
15 x mit H2 Odd gewaschen. Sämtliche Behälter wurden dreimal mit 3 M NaOH gespült,
der Flüssigmüll nach Zugabe von 600 ml 3 M NaOH zwei Tage abgedeckt unter Rühren
inkubiert und der Arbeitsplatz mit 1 M NaOH dekontaminiert.
Nach der Mutagenese wurden 15 Parentalgruppen gebildet, wobei jeweils rund 1.500
vitale Samen gemeinsam ausgebracht wurden. Das übrige M1 Saatgut wurde getrocknet
und aufbewahrt. Nach der Selbstung der M1 Pflanzen aller Parentalgruppen wurde das
M2 Saatgut innerhalb einer jeden Gruppe vereinigt und für die Durchmusterung der nachfolgend beschriebenen Phänotypen verwendet. Eine gute Einschätzung der Mutationsfrequenz erlaubt das Auszählen von Pigment- Phänotypen und Mutanten mit veränderter Kotyledonenzahl (Lightner und Caspar, 1998). Bei einer Auszählung von 2.203 M2 Pflanzen
der Parentalgruppe 6 ergab sich eine Frequenz von 2,2 % Mutanten mit Albino- Phänotyp
und 0,3 % Mutanten mit drei Keimblättern, was mit publizierten Daten für gut mutagenisierte M2 Populationen von Arabidopsis und Sojabohne übereinstimmt (Lightner und
Caspar, 1998; Kiang und Halloran, 1975).
Da in Arabidopsis die genetisch wirksame Zellzahl (genetically effective cell number,
GECN) durchschnittlich 2 beträgt und in der Nachkommenschaft nur ein Viertel eines
heterozygoten Bereichs homozygot für die beobachtete Mutation ist, kann nur in einem
Achtel der Nachkommen in der M2 Generation mit einer rezessiven Mutation gerechnet werden (Lightner und Caspar, 1998; Page und Grossniklaus, 2002). Um die Anzahl
mehrfach selektierter Mutanten während der Durchmusterung möglichst gering zu halten,
wurde die Analyse verschiedener Parentalgruppen der sättigenden Analyse einzelner Parentalgruppen vorgezogen. Aufgrund experimenteller Beschränkungen in Bezug auf die
39
2 M ATERIAL UND M ETHODEN
Anzuchtdichte und den Anzuchtraum bei gleichzeitiger Durchmusterung möglichst vieler Parentalgruppen, wurden schließlich aus 9 Parentalgruppen in vier Durchmusterungen
jeweils mindestens 100 mg (ca 8.800) Samen ausgebracht. Da jede Parentalgruppe in der
M1 Generation ungefähr 1.500 Planzen enthielt, würden bei 8.800 M2 Pflanzen je Parentalgruppe durchschnittlich 6 Pflanzen je M2 Individuum untersucht. Unter Annahme
einer sättigenden Mutagenese würde die Mutation eines betrachteten Lokus daher mit
einer rechnerischen Wahrscheinlichkeit von ungefähr 55 % identifiziert:
1 7 i−1
∑ · 8
i=1 8
6
2.9 Durchmusterung chemisch mutagenisierter Arabidopsis pgm
Mutanten
Die Durchmusterung der M2 Pflanzen (siehe Methode 2.8) auf eine Suppression der erhöhten Suszeptibilität von pgm sollte einem möglichst einfachen Verfahren folgen, um die
Zahl an fälschlicherweise selektierten Mutanten, sogenannten Falsch-Positiven, gering zu
halten. M2 Keimlinge wurden daher zusammen mit Kontrollen der hypersuszeptiblen pgm
und der intermediär suszeptiblen Col-0 angezogen (Abbildung 2.1 A) und im Alter von
11 Tagen unter experimentellen Bedingungen mit C. higginsianum infiziert, welche das
vollständige Absterben aller pgm Kontrollpflanzen bewirkten (16h L, 25°C / 8h D, 22°C;
70 % relative Luftfeuchtigkeit; 80 µmol m−2 s−1 ). Der gesuchte Phänotyp in der M2 Population war daraufhin das Überleben und weitere Wachstum, wobei die Col-0 Kontrollen
als Anhaltspunkt für den Grad der erworbenen Resistenz verwendet werden konnten. Selektierte M2 Individuen wurden wiederum selbst befruchtet und in der nachfolgenden M3
Generation erneut durchmustert, um die Rate an Falsch-Positiven weiter zu verringern
(Abbildung 2.1 B).
40
2 M ATERIAL UND M ETHODEN
Abbildung 2.1 Durchmusterung chemisch mutagenisierter Arabidopsis pgm Mutanten. (A) Pflanzen der M2 Generation wurden für Durchmusterungsexperimente gleichmäßig auf Pflanzschalen
angezogen und nach einer Infektion mit C. higginsianum selektiert. Im Randbereich der Schalen wurden pgm (blau) und Col-0 (weiß) als Kontrollen ausgebracht. (B) In der M2 Generation
selektierte Pflanzen wurden nach Selbstbefruchtung in der M3 Generation erneut durchmustert.
M3 Pflanzen (rote Schilder) wurden zusammen mit pgm (blaue Schilder) ausgebracht und mit
C. higginsianum infiziert.
2.10 Analyse selektierter Mutanten im Wildtyp-Hintergrund
Suszeptibilitäts-Suppressor Kandidaten der pgm-Hypersuszeptibilität (pSSK) wurden in
der M4 Generation mit Col-0 gekreuzt. Nach Selbstbefruchtung der F1 Generation wurden Col-0 / pSSK F2 Pflanzen 9 Tage nach der Aussaat mit C. higginsianum infiziert. Je
Pflanzschale wurden 3 Col-0 / pSSK F2 Linien à 4 Replikaten, je 1 Topf der zugehörigen pSSK Parentallinie, 1 Topf pgm und 2 Töpfe Col-0 ausgebracht und zufällig auf der
Schale verteilt. Durschnittlich wurden je Linie und Topf der Col-0 / pSSK F2 Pflanzen 133
keimende Samen ausgebracht (vergleiche Abbildung 3.18 A). Jede Schale wurde in 2 Replikaten zusammengestellt und die aus 48 zu untersuchenden Linien resultierende Anzahl
von 32 Schalen wurde zufällig auf einem Gewächshaustisch verteilt. Alle angewachsenen
Keimlinge wurden vor der Infektion mit C. higginsianum gezählt. Um die Überlebensrate
der Col-0 Keimlinge nach der Infektion zu verringern, wurden alle Schalen für 3 Tage
statt der üblichen 2,5 Tage nach der Infektion bei gesättigter Luftfeuchtigkeit inkubiert.
Die Auszählung der Anzahl überlebender Pflanzen erfolgte 10 dpi. Zu diesem Zeitpunkt
waren überlebende und weiter wachsende Pflanzen durch den Kontrast der grünen Blattfarbe gegen die grauen abgestorbenen Keimlinge optimal auswertbar.
Der durchschnittliche Anteil an überlebenden Col-0 betrug 57 % bei einer Standardabweichung von 13 %. Um die Infektionsbedingungen jeder einzelnen Schale zu berücksichtigen, wurden die Mittelwerte der jeweils 4 Col-0 / pSSK F2 Replikate mit dem Mittelwert der jeweils 2 Col-0 Replikate derselben Schale verglichen. Unter der Annahme,
dass die eingekreuzten Mutationen keine Resistenz in Col-0 vermitteln und alle Pflanzen
die homzygot das pgm Allel tragen absterben, würde statistisch für
3
4
der Col-0 / pSSK F2
41
2 M ATERIAL UND M ETHODEN
ein Phänotyp wie bei Col-0 erwartet. Der durchschnittliche Anteil an überlebenden pgm
auf allen 32 Schalen betrug tatsächlich lediglich 1,3 % bei einer Standardabweichung von
2,3 %. Die Berechnung des Resistenzquotienten erfolgte daher mit der folgenden Formel:
A NTEIL ÜBERLEBENDE C OL -0 / pSSK F2
3
4 A NTEIL ÜBERLEBENDE C OL -0
Bei einem Ergebnis größer 1 müsste die Annahme, dass die eingekreuzte Mutation
keine Resistenz in Col-0 vermittelt demnach abgelehnt werden. Für die Einordung des
Resistenzgrades wurde eine Bewertung der Resistenz auf Basis der Mittelwerte beider
Replikate einer Linie eingeführt: < 0,8 = schwach; 0,8 bis 1,0 = mittel; > 1,0 = stark.
Analog dazu wurde auch der Resistenzgrad der Suszeptibilitäts-Suppressor Kandidaten
in der M4 Generation bewertet. Als Kriterium diente der prozentuale Anteil überlebender
Pflanzen: 0 % bis 9 % = schwach; 10 % bis 49 % = mittel; 50 % bis 100 % = stark. Die
Einordnung der Resistenzphänotypen aller untersuchter Linien ist in Kapitel 3.10, Tabelle
3.10 aufgeführt.
2.11 Kartierung von Mutationen selektierter Kandidaten
Selektierte Mutanten (siehe Methode 2.9) wurden mit stärkefreien pgm Mutanten im LerHintergrund (N4351) gekreuzt um Kartierungspopulationen zu erstellen. Nachkommen
wurden in der F2 Generation wie beschrieben durchmustert (Methode 2.9) und mit einer markergestützten Kartierung untersucht (Kapitel 3.11, Lukowitz et al., 2000; Jander
et al., 2002). Alle verwendeten Primer zur PCR-basierten Amplifikation genetischer Marker sind in Tabelle A.1 aufgelistet.
2.12 Statistische Hypothesentests
Statistische Analysen der Daten aus molekularbiologischen und biochemischen Experimenten wurden in SigmaPlot12 (Systat Software Inc., Chicago, USA) durchgeführt. Nach
dem Testen auf Normalverteilung (Shapiro-Wilk Test) und Gleichmäßigkeit der Streuung
der Datenpunkte, wurde ein Students t-Test für homoskedastische oder heteroskedastische
Varianz angewandt.
42
3 Ergebnisse
In Vorarbeiten waren physiologische Veränderungen in Arabidopsis-Blättern nach einer
Infektion mit C. higginsianum analysiert worden. Neben Veränderungen der Photosyntheseleistung und der Aminosäuregehalte, war in Wirtspflanzen besonders der Kohlenhydratstoffwechsel infolge der Infektion beeinträchtigt (Engelsdorf, 2008). Während lösliche Zucker im Vergleich zu Kontrollblättern zunehmend akkumulierten, war der Gehalt
an transitorischer Stärke verringert, sobald Nekrosen auf den infizierten Blättern entstanden waren (Engelsdorf, 2008). Physiologische Analysen zu Veränderungen der Dynamik
der Kohlenstoffverteilung zwischen Stoffwechselprodukten hatten zudem gezeigt, dass
der Einbau von Kohlenstoff in transitorische Blattstärke in infizierten Blättern deutlich
vermindert ist (Engelsdorf, 2008). Diese verminderte Stärkesynthese korrelierte mit einer
reduzierten Transkript-Expression zentraler Gene des Stärkestoffwechsels (Engelsdorf,
2008).
3.1 Die Beeinträchtigung des Arabidopsis Stärke-Stoffwechsels
erhöht die Suszeptibilität für C. higginsianum
Um den Einfluss des Arabidopsis-Kohlenhydratstoffwechsels auf die Interaktion mit
C. higginsianum näher zu untersuchen, wurden Arabidopsis-Mutanten mit Beeinträchtigungen in zentralen Enzymfunktionen des Stärkestoffwechsels und des Triose-Phosphat
Exportes aus den Chloroplasten getestet. In den Mutanten der plastidären Phosphoglucomutase (pgm) und der ADP-Glukose Pyrophophorylase (adg1-1) ist die Synthese
von Stärke vollständig verhindert (Caspar et al., 1985; Lin et al., 1988), während in
der Mutante der stärkephosphorylierenden Glukan-Wasser-Dikinase STARCH-EXCESS11 (sex1-1) die Mobilisierung gespeicherter Stärke stark beeinträchtigt ist (Caspar et al.,
1991; Yu et al., 2001; Ritte et al., 2002). Eine Verringerung des spezifischen TriosePhosphat-Transportes in der Mutante des Triose-Phosphat-Translocators (tpt1-2) ist mit
einem erhöhten Umsatz von Stärke verknüpft (Schneider et al., 2002; Walters et al., 2003).
Um Unterschiede im Wachstum von Col-0, pgm, adg1-1, sex1-1 und tpt1-2 möglichst gering zu halten, wurden die Pflanzen in einem 12 h / 12 h Licht- / Dunkelzyklus angezogen. Inokulationen mit C. higginsianum erfolgten zum Ende der vegetativen Phase. Um
43
3 E RGEBNISSE
Abbildung 3.1 Suszeptibilität von Arabidopsis Mutanten des zentralen Kohlenhydratstoffwechsels für C. higginsianum. (A) 5 Wochen alte Pflanzen in einem 12h/12h L/D Zyklus und (B) 4
Wochen alte Pflanzen in einem 20h/4h L/D Zyklus wurden mit C. higginsianum am Ende der
jeweiligen vegetativen Wachstumsphase infiziert. Die relative Menge an C. higginsianum-DNA
wurde 2 dpi (hellgraue Balken), 3 dpi (dunkelgraue Balken) und 4 dpi (schwarze Balken) als
Maß für die pilzliche Proliferation bestimmt. Die untersuchten Genotypen sind unter den Balken angegeben. Die abgebildeten Werte sind Mittelwerte aus drei biologischen Replikaten ±
Standardfehler, wobei für jedes Replikat Blattproben von zwei unabhängigen Pflanzen vereinigt
wurden. Alle Daten wurden auf den Wert von Col-0 4 dpi im 12h/12h L/D Zyklus normalisiert
und Sternchen markieren einen signifikanten Unterschied zu Col-0 unter den jeweiligen Anzuchtbedingungen (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; Students t-Test). (C) Krankheitssymptome
infizierter Pflanzen in einem 12h/12h L/D Zyklus und (D) in einem 20h/4h L/D Zyklus 4 dpi
(untere Reihe) im Vergleich zu nicht infizierten Pflanzen des selben Alters (obere Reihe).
quantitative Daten zu der Proliferation des Pilzes zu erheben, wurde die relative Menge
genomischer DNA von C. higginsianum aus infizierten Blattproben gemessen.
Bis 3 Tage nach Infektion (dpi, days post infection) waren kaum Veränderungen der
pilzlichen DNA Menge im Vergleich zum Zeitpunkt der Inokulation messbar, was der
DNA Menge der aufgesprühten Conidien entspricht. Im Vergleich zu Wildtyp Pflanzen
(Col-0) war die relative DNA Menge des Pilzes in pgm, adg1-1 und sex1-1 ab 3 dpi signifikant erhöht, wobei das Wachstum in den stärkefreien Mutanten stärker erhöht war als in
sex1-1. In diesen drei Mutanten wurde 4 dpi eine drei- bis vierfach erhöhte Menge pilzlicher DNA gemessen, während in tpt1-2 Proben keine Unterschiede zu Wildtyp-Pflanzen
festgestellt wurden (Abbildung 3.1 A). Zu diesem Zeitpunkt sind bereits deutliche Blattnekrosen als Symptome der Anthraknose sichtbar und eine visuelle Zuordnung zu den
quantitativ erhobenen Daten plausibel (Abbildung 3.1 B). Ein Vergleich von Infektionen
von Col-0 und pgm Mutanten der selben Anzucht zum Ende der Lichtphase und zum Ende
der Dunkelphase zeigte, dass die Suszeptibilität in stärkefreien pgm Mutanten unabhängig
44
3 E RGEBNISSE
EL
3,5 dpi
ED
Col-0
pgm
Col-0
pgm
1,00 ± 0,20
3,22 ± 0,53
0,66 ± 0,08
5,34 ± 0,68
Tabelle 3.1 Suszeptibilität von Col-0 und pgm bei Infektionen zu verschiedenen Tageszeiten.
Fünf Wochen alte Pflanzen der Genotypen Col-0 und pgm wurden in einem 12h/12h Licht/Dunkelzyklus zum Ende der Lichtphase (EL) bzw. zum Ende der Dunkelphase (ED) mit
C. higginsianum infiziert. Die relative Menge genomischer Pilz-DNA wurde 3,5 dpi aus drei biologischen Replikaten bestimmt. Abgebildet sind Mittelwerte ± Standardfehler. Für jedes Replikat
wurde Blattmaterial aus zwei unabhängigen Pflanzen vereinigt.
vom Infektionszeitpunkt erhöht war, wobei ein tendenziell erhöhtes Wachstum des Pilzes
auf pgm bei Infektion zum Ende der Dunkelphase beobachtet wurde (Tabelle 3.1).
Um die Kohlenhydratgehalte der untersuchten Arabidopsis-Mutanten unter den verwendeten Wachstumsbedingungen genau zu untersuchen, wurde eine diurnale Analyse
der Kohlenhydratgehalte in unbehandelten Pflanzen durchgeführt. Die Akkumulation der
löslichen Zucker Glukose, Fruktose und Saccharose war in pgm und adg1-1 im Licht
gegenüber Wildtyp Pflanzen zehnfach erhöht (Abbildung 3.2 A). Dabei korrelierte die
Akkumulation löslicher Zucker mit der Suszeptibilität der untersuchten Genotypen (Abbildung 3.2 E). Dies könnte bedeuten, dass die Verfügbarkeit löslicher Zucker während
der Lichtphase für die Nahrungsaufnahme und das Wachstum des Pilzes entscheidend ist.
Andererseits führt das Fehlen eines transitorischen Stärkespeichers in pgm und adg1-1
zu einem periodisch wiederkehrenden Mangel an Kohlenhydraten während der Dunkelphase, da die im Licht akkumulierten Zucker bereits vor Ende der Dunkelphase aufgebraucht sind (Abbildung 3.2 A; Caspar et al., 1985; Lin et al., 1988; Thimm et al., 2004).
Die Gesamtmenge der täglich akkumulierten Kohlenhydrate ist gegenüber Col-0 um 60%
reduziert (Abbildung 3.2 C). Aufgrund des beeinträchtigten Umsatzes von Stärke ist die
täglich verfügbare Menge an Kohlenhydraten in sex1-1 unter den verwendeten Anzuchtbedingungen in gleichem Maße reduziert wie in stärkefreien Pflanzen. Interessanterweise
ergibt die Auftragung der relativen Akkumulation von löslichen Zuckern und Stärke im
Licht gegen die Suszeptibilität für C. higginsianum eine klare negative Korrelation (Abbildung 3.2 F). Trotz der erhöhten Akkumulation löslicher Zucker, könnte die insgesamt
gegenüber Col-0 reduzierte Kohlenhydratverfügbarkeit in pgm, adg1-1 und sex1-1 zu einer beeinträchtigten Abwehrreaktion führen.
Diese Zusammenhänge zwischen dem Kohlenhydratmetabolismus der Wirtspflanze
Arabidopsis und der Proliferation des phytopathogenen Pilzes C. higginsianum blieben
auch bestehen, wenn das Pathosystem unter Wachstumsbedingungen mit stark verlängerter Lichtphase untersucht wurde (Abbildung 3.2 E-F). Bei einem diurnalen Zyklus von 20
45
3 E RGEBNISSE
Abbildung 3.2 Diurnaler Umsatz von Kohlenhydraten in Arabidopsis und Korrelationsanalysen
mit der Suszeptibilität für C. higginsianum. Der Gehalt an löslichem Zucker und Stärke in Blättern von Arabidopsis wurde (A) in einem 12h/12h L/D Zyklus und (B) in einem 20h/4h L/D Zyklus über 24h bestimmt. Col-0, schwarze Kreise; pgm, weiße Kreise; adg1-1, schwarze Dreiecke;
sex1-1, weiße Dreiecke; tpt1-2, schwarze Quadrate. Der diurnale Umsatz an Kohlenhydraten in
(C) einem 12h/12h L/D Zyklus und (D) einem 20h/4h L/D Zyklus wurde aus den Daten aus
(A) und (B) berechnet. Kohlenhydratakkumulation, weiße Balken; Kohlenhydratmobilisierung,
schwarze Balken. Die dargestellten Werte sind Mittelwerte aus vier biologischen Replikaten ±
Standardfehler. Korrelationsanalyse der Akkumulation an (E) löslichem Zucker und (F) GesamtKohlenhydraten (lösliche Zucker plus Stärke) relativ zu Wildtyp-Daten in 12h/12h L/D (schwarze
Kreise) und 20h/4h L/D (weiße Kreise) Zyklen und der relativen Menge C. higginsianum DNA
unter den jeweiligen Wachstumsbedingungen (Daten aus Abb. 3.1).
46
3 E RGEBNISSE
h Licht und 4 h Dunkelheit war die potentielle Kohlenhydratmangelphase der Mutanten
deutlich verkürzt (Abbildung 3.2 B), woraus geschlossen werden kann, dass deren Dauer
keinen Einfluss auf die relativen Unterschiede zwischen den untersuchten Genotypen hat.
Das Wachstum von C. higginsianum war unter diesen verlängerten Langtagbedingungen
gegenüber einem 12 h / 12 h Licht- / Dunkelzyklus in allen Genotypen beschleunigt und
eine lange Belichtungsdauer somit eindeutig von Nachteil für die Wirtspflanzen. Die relative Menge pilzlicher DNA in einem 20 h / 4 h Licht- / Dunkelzyklus 3 dpi war jeweils mit der DNA-Menge zum Zeitpunkt 4 dpi in einem 12 h / 12 h Licht- / Dunkelzyklus vergleichbar (Abbildung 3.1 B). Bemerkenswerterweise wuchsen Col-0, pgm und
sex1-1 unter den verlängerten Langtagbedingungen mit 20 h Licht zu einer vergleichbaren Rosettengröße heran (Abbildung 3.1 D), obwohl die täglich verfügbare Menge an
Kohlenhydraten in den Mutanten gegenüber Col-0 auch unter diesen Bedingungen um
60 - 70% verringert war (Abbildung 3.2 D). Das veringerte Wachstum der untersuchten
Mutanten mit Beeinträchtigungen des Stärke-Stoffwechsels in kürzeren Lichtphasen ist
somit nicht ursächlich für die erhöhte Suszeptibilität gegenüber C. higginsianum. Während Wachstumsbeeinträchtigungen auf Veränderungen in der Regulation von Enzymaktivitäten und Stoffwechselintermediaten nach akutem Kohlenstoffmangel beruhen (Gibon
et al., 2004a,b, 2006; Osuna et al., 2007), ist die Suszeptibilität für C. higginsianum direkt
von der Menge diurnal akkumulierter Kohlenhydrate abhängig.
Um zu testen, ob die Infektion mit C. higginsianum einen Einfluss auf die Kohlenhydratakkumulation der verschiedenen Genotypen hat, wurde 3,5 dpi und 4 dpi der Gehalt
an löslichen Zuchern und Stärke bestimmt (Tabelle A.2). In wasserbehandelten Kontrollpflanzen wurden keine Veränderungen gegenüber unbehandelten Pflanzen festgestellt, so
dass die zuvor bestimmten Korrelationen (Abbildung 3.2 E-F) bestehen blieben (Abbildung 3.3 A-B). Darüberhinaus wurden keine klaren Zusammenhänge zwischen der Veränderung der Gehalte an Glukose, Fruktose oder Saccharose in C. higginsianum-infizierten
Blättern und der Suszeptibilität für C. higginsianum festgestellt (Abbildung 3.3 C-F).
Während Fruktose und Saccharose in allen untersuchten Genotypen unabhängig von der
Suszeptibilität für C. higginsianum 4 dpi gegenüber Kontrollpflanzen akkumulierten, war
der Gehalt an Glukose zu diesem Zeitpunkt uneinheitlich durch die Infektion beeinträchtigt (Tabelle A.2). Wildtyp-Pflanzen wiesen einen reduzierten Stärkegehalt aber einen
unveränderten Glukosegehalt auf, wohingegen in den stärkefreien Genotypen pgm und
adg1-1 4 dpi ein deutlich reduzierter Glukosegehalt gemessen wurde, der daraufhin etwa
dem Gehalt in Col-0 entsprach. Reduzierte Stärkegehalte durch die Infektion beruhen auf
einer verringerten Stärkebiosynthese (Engelsdorf, 2008) und wurden in allen stärkehaltigen Genotypen mit Ausnahme von sex1-1 beobachtet (Tabelle A.2). Zusammengenom-
47
3 E RGEBNISSE
men deuten diese Daten darauf hin, dass die physiologischen Grundvoraussetzungen der
einzelnen Genotypen eine deutlich größere Bedeutung für die Suszeptibilität gegenüber
C. higginsianum haben, als die induzierten Veränderungen der Kohlenhydratgehalte.
Abbildung 3.3 Korrelationsanalysen zwischen Veränderungen des Kohlenhydratgehaltes in infizierten Blättern und Kontrollen mit der Suszeptibilität für C. higginsianum. Die relative Akkumulation an (A) löslichen Zuckern und (B) Gesamt-Kohlenhydraten (lösliche Zucker plus Stärke) in
wasserbehandelten Kontrollpflanzen 4 dpi sowie absolute Unterschiede im Gehalt an (C) Glukose, (D) Fruktose, (E) Saccharose und (F) löslichen Zuckern (Summe aus C-E) zwischen infizierten
Pflanzen und Kontroll-Pflanzen 4 dpi wurden gegen die relative Menge an C. higginsianum DNA
aufgetragen. Werte auf der Ordinate wurden aus Daten aus Tabelle A.2 berechnet und sind relativ
zu Wildtyp-Daten (A-B) bzw. in [µmol · g−1 FW] (C-F) angegeben. Werte auf der Abszisse wurden aus Abb. 3.1 A übernommen. Dargestellt sind Mittelwerte aus drei biologischen Replikaten
± Standardfehler.
48
3 E RGEBNISSE
3.2 Kohlenstoffmangel erhöht die Suszeptibilität für C. higginsianum
Gibon et al. (2004a) und Usadel et al. (2008) berichteten, dass bereits 4h nach einer Verlängerung der Dunkelphase der Stoffwechsel von Arabidopsis durch einen Mangel an
Kohlenhydraten limitiert ist, während der Gehalt an löslichem Zucker und Stärke nach 8h
bis 12h auf sehr geringe Werte fällt. Am Ende der regulären Dunkelphase verbleiben in
Col-0 Blättern lediglich rund 10 % des in einer Lichtphase assimilierten Kohlenstoffes in
der Form von löslichem Zucker und Stärke.
Um herauszufinden, ob die erhöhte Verfügbarkeit löslicher Zucker oder der GesamtKohlenhydratmangel zu der erhöhten Suszeptibilität von pgm, adg1-1 und sex1-1 beitragen, wurde durch Verdunkelung spezifischer Lichtphasen vor und nach einer Infektion
mit C. higginsianum ein Mangel an Kohlenhydraten induziert. Vorexperimente zeigten,
dass die Suszeptibilität gegenüber C. higginsianum nur erhöht war, wenn auch eine zusätzliche Verdunkelung nach der Infektion durchgeführt wurde. Daher wurde eine systematische Analyse zu der Proliferation von C. higginsianum auf Pflanzen durchgeführt,
welche nach einer Infektion unterschiedlichen Kombinationen aus verlängerten Dunkelphasen ausgesetzt waren.
Durch Verdunkelung der ersten Lichtphase (DLP 1) nach der Infektion wurde eine Verlängerung der Dunkelphase um 24 h erreicht. Eine zusätzliche Verdunkelung der zweiten
Lichtphase (DLP 2) verlängerte die Dunkelphase entsprechend um 48 h (Abbildung 3.4
A). In pgm und adg1-1 Mutanten ist der Blatt-Kohlenhydratspeicher bereits vor dem Ende der regulären Dunkelphase erschöpft (Abbildung 3.2). Nach einer Verlängerung der
Dunkelphase um 12 h waren auch in Col-0 keine Kohlenhydratreserven mehr messbar
(Tabelle 3.2).
Die relative Menge an genomischer DNA des Pilzes wurde 3,5 dpi in Blattproben unterschiedlich behandelter Pflanzen analysiert, um die Auswirkung der verlängerten Dunkelphasen auf die Proliferation von C. higginsianum quantitativ zu bestimmen. Nach DLP 1
war die relative Menge pilzlicher DNA in pgm und adg1-1 ca. zweifach erhöht, wohingegen in Col-0 Blättern keine Unterschiede zu Kontrollen gemessen wurden. Nach DLP 1+2
war die Proliferation von C. higginsianum in den stärkefreien Genotypen vierfach und in
Col-0 achtfach gegenüber den jeweiligen Kontrollen erhöht (Abbildung 3.4 B). In sex11 Mutanten war die Zunahme der Pilzmenge durch DLP 1+2 vergleichsweise nur leicht
erhöht. Aufgrund der beeinträchtigten Stärkemobilisierung wurde unter den experimentellen Bedingungen keine Abwesenheit von Stärke in sex1-1 bewirkt, weshalb potentiell
ein moderater Fluss in lösliche Zucker stattfinden könnte (Tabelle 3.2). Diese löslichen
Zucker würden potentiell nicht akkumulieren, da sie direkt den Kohlenstoffbedarf der
49
3 E RGEBNISSE
Abbildung 3.4 Suszeptibilität von Arabidopsis für C. higginsianum nach induziertem Kohlenhydratmangel. Pflanzen der Genotypen Col-0, pgm, adg1-1 und sex1-1 wurden nach einer
Infektion mit C. higginsianum zu unterschiedlichen Infektionsphasen dunkel inkubiert. (A) Schematische Darstellung der verwendeten Kombinationen verdunkelter Lichtphasen (DLP) nach der
Infektion. Weiße Balken stellen Lichtphasen, schwarze Balken stellen Dunkelphasen dar. Der
Zeitpunkt der Inokulation mit C. higginsianum, der ungefähre Zeitraum der Penetration und der
Zeitpunkt der Probennahme sind gekennzeichnet. (B) Relative Menge an C. higginsianum-DNA
zum Zeitpunkt der Probennahme 3,5 dpi. Kontrolle (12h/12h L/D), weiße Balken; DLP 1, hellgraue Balken; DLP 1+2, dunkelgraue Balken. (C) Relative Menge an C. higginsianum DNA in
Col-0 Kontrollen und Col-0 mit DLP 1, DLP 2 und DLP 3. Es sind Mittelwerte aus drei biologischen Replikaten ± Standardfehler dargestellt, wobei für jedes Replikat Blattproben von zwei
unabhängigen Pflanzen vereinigt wurden. Sternchen markieren einen signifikanten Unterschied
zwischen DLP Proben und Kontroll Proben (*P < 0.05; **P < 0.01; Students t-Test).
Pflanze speisen könnten. Zusammengenommen deuten die Daten darauf hin, dass eine zusätzliche Kohlenhydrat-Mangelphase von 24 h nach einer Infektion mit C. higginsianum
ausreicht, um die Pilzproliferation in Arabidopsis-Pflanzen ohne Kohlenhydratreserven
zu erhöhen.
Um zu untersuchen, ob ein Kohlenhydratmangel der Wirtspflanze Col-0 zu einem spezifischen Zeitpunkt nach der Infektion mit C. higginsianum einen besonders ausgeprägten
Einfluss auf die Interaktion hat, wurden neben der ersten Lichtphase nach der Infektion
auch die zweite (DLP 2) und die dritte Lichtphase (DLP 3) separat verdunkelt. Tatsächlich war die Besiedelung durch den Pilz nur erhöht, wenn die dritte Lichtphase nach der
Infektion verdunkelt worden war. In diesem Zeitraum, zwischen 2,5 und 3,5 dpi, hat ein
Großteil der applizierten Conidien bereits sekundäre Hyphen ausgebildet. Folglich scheint
sich ein Kohlenhydratmangel in Arabidopsis besonders während der nekrotrophen Interaktionsphase mit C. higginsianum auf die Suszeptibilität auszuwirken, während der
50
3 E RGEBNISSE
Mangel an Kohlenhydraten während der biotrophen Interaktionsphase keinen messbaren
Einfluss auf die pilzliche Proliferation hatte.
Hexosen
(µmol · g−1 FW)
0 dpi
1 dpi
2 dpi
Col-0
Kontrolle
1,61
± 0,23
1,24
± 0,05
0,57
± 0,12
11,82
± 0,60
7,43
± 0,29
0,92
± 0,07
11,47
± 1,63
8,88
± 0,82
0,63
± 0,11
3,59
± 0,49
1,91
± 0,25
0,84
± 0,11
DLP 1
DLP 1+2
pgm
Kontrolle
DLP 1
DLP 1+2
adg1-1
Kontrolle
DLP 1
DLP 1+2
sex1-1
Kontrolle
DLP 1
DLP 1+2
2,08
± 0,56
4,58
± 0,61
0,69
± 0,18
6,16
± 0,68
19,74
± 0,68
0,71
± 0,09
8,92
± 0,46
27,67
± 2,57
0,79
± 0,20
2,21
± 0,54
7,13
± 0,53
0,97
± 0,32
Saccharose
(µmol · g−1 FW)
0 dpi
1 dpi
2 dpi
1,26
± 0,08
0,54
± 0,06
0,14
± 0,01
1,31
± 0,32
0,50
± 0,07
0,06
± 0,02
1,85
± 0,18
0,46
± 0,03
0,06
± 0,01
1,03
± 0,14
0,43
± 0,04
0,17
± 0,02
0,34
± 0,19
0,42
± 0,05
0,00
± 0,00
0,70
± 0,12
0,67
± 0,14
0,00
± 0,00
0,18
± 0,16
0,20
± 0,33
0,00
± 0,00
0,45
± 0,10
0,27
± 0,15
0,02
± 0,02
Stärke
(µmol · g−1 FW)
0 dpi
1 dpi
2 dpi
43,44
± 3,42
42,49
± 2,02
0,12
± 0,06
0,80
± 0,61
0,60
± 0,25
0,45
± 0,30
0,59
± 0,08
0,25
± 0,07
0,00
± 0,00
154,50
± 5,55
136,57
± 9,36
117,28
± 9,20
39,79
± 2,51
39,36
± 1,87
0,00
± 0,00
0,72
± 0,34
0,49
± 0,38
0,31
± 0,24
0,19
± 0,14
0,23
± 0,27
0,01
± 0,01
113,16
± 11,85
119,85
± 7,33
113,92
± 8,66
Tabelle 3.2 Gehalt an löslichen Zuckern und Stärke in Arabidopsis-Blättern nach verlängerten
Dunkelphasen. Kohlenhydratgehalte wurden in Arabidopsis-Blättern, die für eine Lichtphase
(DLP 1, 24h andauernde Dunkelheit) bzw. zwei aufeinanderfolgende Lichtphasen (DLP 1+2,
48h andauernde Dunkelheit) nach einer Infektion mit C. higginsianum dunkel inkubiert waren,
bestimmt. Unter DLP 1 Bedingungen entspricht 1 dpi einer verlängerten Dunkelphase von 12h,
während die Pflanzen 2 dpi bereits wieder für 12h belichtet worden waren. Unter DLP 1+2 Bedingungen waren Pflanzen bis zur Probennahme 2 dpi dauerhaft verdunkelt. Der Gehalt an Hexosen, Saccharose und Stärke wurde 0, 1 und 2 dpi unter Kontrollbedingungen (12h/12h Licht/Dunkelzyklus) und DLP Bedingungen zum Ende der regulären Lichtphase in Col-0, pgm, adg1-1
und sex1-1 bestimmt. Eine schematische Übersicht über die DLP Bedingungen ist in Abb. 3.4 A
dargestellt. Alle Werte sind Mittelwerte aus vier biologischen Replikaten ± Standardfehler.
Nachdem starke Hinweise dafür präsentiert wurden, dass der Mangel an diurnal verfügbaren Kohlenhydraten die Suszeptibilität für C. higginsianum in Mutanten mit Beeinträchtigungen des Stärke-Stoffwechsels erhöht, sollte überprüft werden, ob ArabidopsisGenotypen mit einem diurnalen Kohlenstoffmangel, aber enzymatisch intakten Stärkestoffwechsel, in der Interaktion mit dem Pathogen beeinträchtigt sind.
In cca1/lhy Doppelmutanten ist die Oszillation der circadianen Uhr beschleunigt, was
zu einem verfrühten Verbrauch der transitorischen Blattstärke und einem periodischen
Kohlenhydratmangel zum Ende der Dunkelphase führt (Graf et al., 2010). Auch unter den
verwendeten Bedingungen mit einem 12 h / 12 h Licht- / Dunkelrhythmus war die Blattstärke zum Ende der Dunkelphase in cca1/lhy Mutanten vollständig verbraucht (Tabelle
3.3). Die Quantifizierung der relativen DNA-Menge von C. higginsianum 3 dpi zeigte in
51
3 E RGEBNISSE
Abbildung 3.5 Suszeptibilität von Arabidospsis-Mutanten mit Kohlenstoffmangel für
C. higginsianum. (A) 4 Wochen alte cca1/lhy Mutanten und die entsprechende Kontrolllinie
(Tabelle 2.1) wurden in einem 12h/12h Licht-/Dunkelzyklus vor Beginn der generativen Phase
mit C. higginsianum infiziert. Die Bestimmung der relativen Menge an C. higginsianum-DNA
in Blattproben erfolgte 3 dpi. Transgene MEm4 Pflanzen wurden in einem (B) 8h/16h bzw. (C)
12h/12h Licht-/Dunkelzyklus angezogen und im Alter von (B) sieben bzw. (C) fünf Wochen, zum
Ende der jeweiligen vegetativen Phase, mit C. higginsianum infiziert. Die relative Menge pilzlicher DNA wurde 4 dpi bestimmt. Alle Werte sind Mittelwerte aus drei biologischen Replikaten
± Standardfehler. Für jedes Replikat wurde Blattmaterial aus zwei unabhängigen Pflanzen vereinigt. Sternchen zeigen einen signifikanten Unterschied zu den jeweiligen Kontrollpflanzen (*P
< 0.01; **P < 0.001; Students t-Test). (D) Krankheitssymptome der oben angegebenen Genotypen zum Zeitpunkt der jeweiligen Probennahme (untere Reihe) im Vergleich mit nicht infizierten
Pflanzen des selben Alters (obere Reihe).
den Mutanten gegenüber Kontrollpflanzen der Parentallinie eine stark erhöhte Suszeptibilität. Darüberhinaus wurde der Infektionsverlauf in Arabidopsis-Pflanzen mit einer
konstitutiven Überexpression des NADP-Malat-Enzyms (MEm4) aus Mais untersucht.
Diese Pflanzen haben einen verringerten transitorischen Malat- und Fumarat-Speicher
und weisen unter Kurztagbedingungen gegen Ende der Dunkelperiode eine verringerte
Respirationsrate auf (Fahnenstich et al., 2007; Zell et al., 2010). Die Suszeptibilität für
C. higginsianum war in Übereinstimmung mit diesen publizierten Daten nur unter Kurztagbedingungen erhöht, nicht aber in einem 12 h / 12 h Licht- / Dunkelrhythmus, wenn
die nächtliche Respirationsrate nicht beeinträchigt sein sollte (Abbildung 3.5 B-C). Die
Ergebnisse dieser Analysen zur Suszeptibilität von cca1/lhy und MEm4 liefern weitere
deutliche Hinweise darauf, dass ein nächtlicher Mangel an Kohlenstoff die Proliferation
von C. higginsianum in Arabidopsis begünstigt.
52
3 E RGEBNISSE
Kontrolle
cca1/lhy
ED
EL
ED
EL
lösliche Zucker
(µmol · g−1 FW)
Stärke
(µmol · g−1 FW)
1,60 ± 0,16
3,00 ± 0,17
0,11 ± 0,06
1,89 ± 0,22
4,05 ± 0,92
76,49 ± 4,01
0,00 ± 0,00
57,27 ± 3,01
Tabelle 3.3 Gehalt an löslichen Zuckern und Stärke in cca1/lhy. Der Gehalt an löslichen Zuckern
und Stärke wurde in cca1/lhy und dem parentalen Kontroll- Genotyp (Tabelle 2.1) zum Ende der
Dunkelphase (ED) und zum Ende der Lichtphase (EL) in einem 12h/12h Licht-/Dunkelzyklus
bestimmt. Angegeben sind Mittelwerte aus fünf biologischen Replikaten ± Standardfehler.
3.3 Die induzierte Abwehrantwort ist in stärkefreien
Arabidopsis-Mutanten beeinträchtigt
Kohlenstoff wird im Zuge einer induzierten Abwehrantwort bei der Besiedelung von
Wirtspflanzen durch Pathogene in höherem Maße für die Synthese von Sekundärmetaboliten benötigt und Zuckermoleküle können darüberhinaus als Signale für die Induktion
von Abwehrreaktionen fungieren (Bolton, 2009). Wie in Kapitel 3.2 gezeigt wurde, erhöht
ein reduziertes diurnales Budget an Kohlenstoff die Suszeptibilität von Arabidopsis für
C. higginsianum. Daher wurde untersucht, ob Komponenten der Wirts-Abwehrantwort
in Mutanten mit Beeinträchtigungen im Stärkestoffwechsel gegenüber Wildtyp-Pflanzen
verändert waren. Frühere Studien hatten gezeigt, dass SA-abhängige Abwehrreaktionen
und die Akkumulation des Phytoalexins Camalexin zu einer wirkungsvollen Abwehr gegen C. higginsianum beitragen (Narusaka et al., 2004; O’Connell et al., 2004; Liu et al.,
2007).
In den stärkefreien Mutanten pgm und adg1-1 akkumulierte SA bis 2 dpi schneller
als in Col-0 (Abbildung 3.6 A). Während 3 dpi keine Unterschiede im SA-Gesamtgehalt
zwischen den Genotypen gemessen wurden, war der SA-Gehalt 4 dpi in den stärkefreien Mutanten und sex1-1 gegenüber Col-0 um 30-40% reduziert. Bemerkenswerterweise
betrug der Anteil an freier SA in pgm und adg1-1 4 dpi rund 90% des SA-Gehaltes, während nur 10% der SA glycosyliert vorlag. In Wildtyppflanzen lag der Anteil an freier SA
4 dpi dagegen unter 20% des SA-Gehaltes, wohingegen über 80% SA-Glucoside (SAG)
gemessen wurden. In sex1-1 betrug der Anteil freier SA 4 dpi 50% des SA-Gehaltes und
war folglich intermediär zwischen den Werten in Col-0 und den stärkefreien Genotypen.
In wasserbehandelten Kontrollpflanzen betrug der Gesamt-SA Gehalt in allen Messungen
unter 14 ng · cm−2 .
Freie SA stellt nach dem aktuellen Wissensstand die aktive Form von SA für die Induktion von Abwehrantworten dar und kann durch Pathogen-induzierbare Glycosyltransfera-
53
3 E RGEBNISSE
Abbildung 3.6 Induzierte Abwehrantwort in Arabidopsis nach Infektion mit C. higginsianum.
(A) Freie Salicylsäure (SA, gefüllte Balken), Gesamt- SA (freie SA + SA- Glucoside, leere Balken) und (B) Camalexin wurden 1 dpi (blassgraue Balken), 2 dpi (hellgraue Balken), 3 dpi (dunkelgraue Balken) und 4 dpi (schwarze Balken) quantifiziert. Abgebildet sind Mittelwerte ± Standardfehler. Sternchen zeigen einen signifikanten Unterschied zu Col-0 (*P < 0.05; **P < 0.01;
***P < 0.001; Students t-Test). (C) Northern Blot Analyse der Transkriptmengen von PR-1, PR2, PDF1.2 und PR-4. Untersucht wurden RNA- Extrakte aus Blattproben 0, 1, 2, 3 und 4 dpi mit
C. higginsianum. Jede Spur wurde mit 8 µg Gesamt- RNA beladen.
54
3 E RGEBNISSE
sen in inaktive SAG umgewandelt werden (Vlot et al., 2009). Es wäre daher zu erwarten,
dass der erhöhte Gehalt an freier SA in pgm, adg1-1 und sex1-1 zu einer stärkeren Induktion SA-abhängiger PR-Gene führt. Tatsächlich wurden Transkripte des SA-responsiven
Gens PR-2 analog zu dem erhöhtem Gehalt freier SA bereits 2 dpi in pgm und adg1-1,
aber erst 3 dpi in Col-0 und sex1-1 detektiert (Abbildung 3.6 C). Allerdings war die Transkriptmenge von PR-2 in den stärkefreien Mutanten 4 dpi in Kontrast zu der fortschreitenden Akkumulation freier SA gegenüber Col-0 und sex1-1 verringert. Darüberhinaus
konnte das ebenfalls SA-abhängig regulierte Gen PR-1 in allen Genotypen erst 3 dpi detektiert werden. In pgm und adg1-1 wurde 4 dpi eine leicht verringerte Menge an PR-1
Transkripten als in Col-0 und sex1-1 detektiert.
Die Jasmonsäure (JA) und Ethylen (ET) abhängig regulierten PR-Gene PDF1.2 und
PR-4 waren, in Übereinstimmung mit den Ergebnissen von Narusaka et al. (2004), bereits früher nach der Infektion mit C. higginsianum induziert als SA-abhängige PR-Gene.
Die Akkumulation der JA/ET abhängigen Transkripte war in pgm, adg1-1 und sex1-1 bis
4 dpi reduziert. Um zu überprüfen, ob diese Reduktion der JA/ET-abhängigen Abwehrsignale zu der erhöhten Suszeptibilität in den stärkefreien Mutanten beitragen könnte,
wurde die Suszeptibilität von coi1/pgm Doppelmutanten untersucht. COI1 kodiert für ein
Jasmonyl-Isoleucin (JA-Ile) bindendes F-Box Protein mit zentraler Bedeutung für die pathogenresponsive JA/ET-abhängige Abwehrantwort in Arabidopsis (Lorenzo et al., 2003;
Pré et al., 2008; Yan et al., 2009; Adams und Turner, 2010).
Während 3,5 dpi kein Unterschied in der relativen Menge an C. higginsianum DNA
in coi1-21 und Col-0 gemessen wurde, war die pilzliche DNA Menge in coi1-21/pgm
Doppelmutanten gegenüber pgm um 50% reduziert (Abbildung 3.7). Dies deutet darauf
hin, dass eine reduzierte JA/ET-abhängige Abwehrantwort in pgm die Suszeptibilität für
C. higginsianum verringert, wobei eine verstärkte SA-abhängige Abwehrantwort in coi121/pgm Doppelmutanten eine Rolle spielen könnte.
Das Phytoalexin Camalexin wird in Arabidopsis im Zuge von Abwehrreaktionen gegen
zahlreiche Pathogene akkumuliert, wobei die Akkumulation nur teilweise SA-abhängig
ist (Glawischnig, 2007). Da bereits gezeigt wurde, dass die Camalexin-BiosyntheseMutante pad3-1 hypersuszeptibel für C. higginsianum ist (Narusaka et al., 2004), wurde die Akkumulation dieser Abwehrsubstanz nach einer Infektion in Col-0, pgm, adg1-1
und sex1-1 untersucht. In wasserbehandelten Kontrollpflanzen und infizierten Pflanzen
bis 1 dpi konnte kein Camalexin detektiert werden. In den stärkefreien Mutanten pgm und
adg1-1 akkumulierte Camalexin zunächst schneller, wohingegen 4 dpi ein deutlich gegenüber Col-0 reduzierter Camalexingehalt gemessen wurde (Abbildung 3.6 B). In sex1-1
ähnelte die Camalexin-Akkumulation dahingegen stark dem Wildtyp, lediglich 3 dpi wur-
55
3 E RGEBNISSE
Abbildung 3.7 Suszeptibilität von coi1/pgm
Doppelmutanten für C. higginsianum.
(A) 5 Wochen alte Pflanzen der Genotypen Col-0, pgm, coi1 und coi1/pgm wurden in einem 12h/12h Licht-/Dunkelzyklus mit
C. higginsianum infiziert. Die relative Menge
genomischer pilzlicher DNA wurde 3,5 dpi bestimmt. Abgebildet sind Mittelwerte aus drei
biologischen Replikaten ± Standardfehler. Für
jedes Replikat wurde Blattmaterial aus zwei unabhängigen Pflanzen vereinigt. (B) Krankheitssymptome der oben angegebenen Genotypen
3,5 dpi (untere Reihe) im Vergleich mit nicht infizierten Pflanzen des selben Alters (obere Reihe).
de ein leicht erhöhter Gehalt gemessen. Generell zeigt die Akkumulation von Camalexin
in den stärkefreien Mutanten ein sehr ähnliches Muster wie die Akkumulation von SA.
Da mit SA und Camalexin zwei Metabolite eine Akkumulation nach Infektion mit
C. higginsianum zeigten, die aus Produkten des Shikimatweges synthetisiert werden, wurde zusätzlich eine Analyse von Phenylpropanen nach Infektion durchgeführt. Es wurde untersucht, ob lösliche oder zellwandgebundene Phenylpropane nach Infektion mit
C. higginsianum akkumulieren und ob die Akkumulation dieser Stoffe in pgm oder sex1-1
beeinträchtigt ist. Pathogenresponsiv akkumulierende Phenylpropane könnten als Phytoalexine wirken. Beispielsweise zeigten Arabidopsis Mutanten mit einer beeinträchtigten
Phenylpropanbiosynthese eine erhöhte Suszeptibilität gegenüber dem nekrotrophen Pathogen Botrytis cinerea.
Phenylpropane werden aus der aromatischen Aminosäure Phenylalanin synthetisiert
und bilden eine große Gruppe aus Sekundärmetaboliten wie Flavonoiden (Kaempferol,
Quercetin) und Monolignolen wie Lignin. Die charakteristische Grundstruktur von Phenylpropanen besteht aus einem Benzolring und einer C3 -Seitenkette, wie das Produkt der
Desaminierung von Phenylalanin, Zimtsäure.
In einer Analyse löslicher Phenylpropane konnten 3 einfache Phenole, 4 HydroxyZimtsäure (HCA)-Derivate, 3 Kaempferol-Derivate und 3 Quercetin-Derivate detektiert
werden, die aufgrund des Vergleichs der Absorptionsspektren mit den Aglyka des externen Standards zugeordnet wurden. Aufgrund der quantitativen Verhältnisse der HCAGehalte sowie der Absorptionsspektren in dieser Analyse ist anzunehmen, dass es sich
56
3 E RGEBNISSE
bei HCA 1 und HCA 2 um die beiden Haupt-HCA-Derivate in Arabidopsis-Blättern, Sinapoylmalat und Sinapoylglukose, handelt (Ruegger und Chapple, 2001). Weitere Substanzen konnten anhand der vorliegenden Daten nicht identifiziert werden. Während Phenole, HCA-Derivate und Kaempferol-Derivate im Wildtyp 2,5 dpi kaum akkumulierten,
wurde eine Pathogen-abhängige Akkumulation der Quercetin-Derivate Q 1 und Q 2 in
allen untersuchten Genotypen bestimmt (Tabelle 3.4). Die Phenylpropangehalte in Kontrollblättern von pgm und sex1-1 unterschieden sich kaum vom Wildtyp, lediglich das
HCA-Derivat H 3 konnte in den Mutanten, nicht aber im Wildtyp, gemessen werden,
während das Phenol P 2 in geringen Mengen im Wildtyp, nicht aber in den Mutanten
detektiert wurde (Tabelle 3.4). Nach Infektion mit C. higginsianum nahmen die Gehalte der meisten analysierten Phenylpropane in pgm und sex1-1 gegenüber Col-0 ab, was
auf eine generell limitierte Kapazität zur Bildung von Phenylpropanen in den Mutanten
nach einer Infektion oder die Nutzung dieser Stoffe für die Synthese abwehrrelevanter
Sekundärmetabolite hindeutet (Tabelle 3.4). Eine direkte antimikrobielle Wirkung einer
der quantifizierten Substanzen erscheint nach Analyse der Daten unwahrscheinlich. In
Zellwandextrakten konnten lediglich zwei Phenylpropane detektiert werden, ein HCADerivat sowie ein einfaches Phenol. Beide Substanzen wiesen jedoch weder zwischen
Kontrollen und infizierten Blättern noch zwischen den untersuchten Genotypen Unterschiede auf (Tabelle 3.5).
57
3 E RGEBNISSE
Col-0
Kaempferol-Derivate
K 1 [nmol · g−1 FW]
K 2 [nmol · g−1 FW]
K 3 [nmol · g−1 FW]
Quercetin-Derivate
Q 1 [nmol · g−1 FW]
Q 2 [nmol · g−1 FW]
Q 3 [nmol · g−1 FW]
HCA-Derivate
H 1 [nmol · g−1 FW]
H 2 [nmol · g−1 FW]
H 3 [relativer Wert]
H 4 [relativer Wert]
Phenol-Derivate
P 1 [relativer Wert]
P 2 [relativer Wert]
P 3 [relativer Wert]
pgm
sex1-1
C. h.
K
C. h.
K
C. h.
K
8,55
± 2,15
5,23
± 0,64
3,60
± 0,90
11,18
± 2,05
4,92
± 0,93
5,47
± 1,00
11,99
± 1,75
3,88
± 0,59
5,14
± 0,79
7,93
± 1,04
2,55
± 0,61
3,55
± 0,90
8,88
± 1,52
3,31
± 0,61
4,50
± 0,82
5,60
± 0,90
1,09
± 0,44
3,17
± 0,40
0,00
± 0,00
0,00
± 0,00
0,04
± 0,04
10,54
± 1,74
0,91
± 0,15
0,00
± 0,00
0,00
± 0,00
0,00
± 0,00
0,08
± 0,08
7,85
± 0,69
0,26
± 0,09
0,00
± 0,00
0,00
± 0,00
0,00
± 0,00
0,04
± 0,04
11,07
± 1,01
0,31
± 0,11
0,00
± 0,00
72,45
± 17,45
8,63
± 1,27
0,00
± 0,00
6,07
± 1,19
90,70
± 9,41
9,59
± 1,93
0,84
± 0,84
8,22
± 1,12
88,21
± 8,28
12,95
± 1,43
8,99
± 3,47
6,92
± 1,02
49,23
± 12,25
3,64
± 2,13
0,00
± 0,00
2,85
± 1,49
104,80
± 7,82
11,31
± 1,11
2,92
± 1,17
8,59
± 0,45
81,59
± 10,61
5,33
± 0,71
1,30
± 1,30
12,10
± 1,97
8,08
± 1,66
0,90
± 0,37
0,00
± 0,00
11,63
± 1,82
0,00
± 0,00
3,73
± 1,06
7,31
± 0,95
0,00
± 0,00
0,00
± 0,00
6,09
± 1,02
0,00
± 0,00
8,34
± 0,28
5,41
± 0,53
0,00
± 0,00
0,00
± 0,00
6,98
± 0,84
0,00
± 0,00
15,05
± 4,46
Tabelle 3.4 Gehalt löslicher Phenylpropane in Arabidopsis nach einer Infektion mit
C. higginsianum. Lösliche Phenylpropane wurden 2,5 dpi aus wasserbehandelten Kontrollpflanzen (K) und C. higginsianum-infizierten Pflanzen (C. h.) extrahiert. Die identifizierten Substanzen
wurden anhand ihrer Absorptionsspektren Phenylpropan-Stoffklassen zugeordnet. Zur Quantifizierung der Phenylpropane diente die Absorption bei 325 nm. Die Kaempferol-, Quercetin- und
Hydroxyzimtsäure (HCA)-Derivate K 1, K 2, K 3, Q 1, Q 2, Q 3, H 1 und H 2 wurden jeweils
anhand von Standardsubstanzen der selben Stoffklasse mit vergleichbarer relativer Absorption
bei 325 nm quantifiziert und sind in [nmol · g−1 FW] angegeben. Die HCA- und Phenol-Derivate
H 3, H 4, P 1, P 2 und P 3 sind als relative Werte angegeben. Alle Werte sind Mittelwerte aus
vier biologischen Replikaten ± Standardfehler. Statistisch signifikante Unterschiede zu Col-0Proben der jeweiligen Behandlung sind in Fettschrift hervorgehoben (P < 0.05; Students t-Test).
Elutionszeiten und Absorptionsmaxima aller Substanzen sind in Tabelle A.3 aufgelistet.
58
3 E RGEBNISSE
Col-0
HCA 5
[nmol · g−1 FW]
Phenol 4
[relativer Wert]
pgm
sex1-1
C. h.
K
C. h.
K
C. h.
K
19,23
± 3,79
59,91
± 13,56
23,70
± 4,89
59,06
± 7,61
18,53
± 5,73
53,51
± 15,24
15,01
± 0,85
43,87
± 3,38
25,57
± 5,65
69,47
± 18,01
23,72
± 7,57
77,34
± 25,54
Tabelle 3.5 Gehalt zellwandgebundener Phenylpropane in Arabidopsis nach einer Infektion
mit C. higginsianum. Zellwandgebundene Phenylpropane wurden 2,5 dpi aus wasserbehandelten
Kontrollpflanzen (K) und C. higginsianum-infizierten Pflanzen (C. h.) extrahiert. Die identifizierten Substanzen wurden anhand ihrer Absorptionsspektren Stoffklassen zugeordnet. Zur Quantifizierung diente die Absorption bei 325 nm. Der Gehalt des Hydroxyzimtsäure (HCA)-Derivates
HCA 5 wurde relativ zu Sinapinsäure quantifiziert und ist in [nmol · g−1 FW] angegeben. Der
Gehalt des Phenolderivates Phenol 5 ist als relativer Wert angegeben. Alle Werte sind Mittelwerte
aus vier biologischen Replikaten ± Standardfehler. Elutionszeiten und Absorptionsmaxima der
Substanzen sind in Tabelle A.3 aufgelistet.
3.4 Die Penetrationsresistenz von Arabidopsis-Mutanten mit
beeinträchtigtem Stärkestoffwechsel gegen C. higginsianum ist
reduziert
Da der Besiedelungserfolg von C. higginsianum auf Arabidopsis während der nekrotrophen Phase der Interaktion aufgrund der massiven Akkumulation sekundärer Hyphen in
infizierten Blättern schnell und effektiv quantifizierbar ist, wurde die Messung der relativen Menge pilzlicher DNA in dieser Arbeit als Standardmethode zur Bewertung der Suszeptibilität unterschiedlicher Genotypen eingesetzt. Eine quantitative Messung der DNA
biotropher C. higginsianum Hyphen war hingegen nicht möglich, da (1) das Verhältnis
von pilzlicher DNA zu Wirts-DNA in diesem Stadium der Interaktion zu klein ist, (2) die
Menge extrahierbarer genomischer C. higginsianum-DNA während der ersten 24 Stunden
der Interaktion nicht substantiell ansteigt und (3) bereits ein geringer Anteil sekundärer
Hyphen den Gehalt an C. higginsianum DNA überproportional stark beeinflusst. Um zu
untersuchen, ob Unterschiede in der Suszeptibilität bereits zu frühen Zeitpunkten in der
biotrophen Interaktion zwischen Arabidopsis und C. higginsianum auftreten, wurden daher Infektionsstrukturen auf infizierten Blättern mit Trypanblau angefärbt, mikroskopisch
betrachtet, klassifiziert und quantifiziert. Dabei wurden alle Conidien bewertet, die ein
Appressorium ausgebildet hatten, da nicht auskeimende Conidien keine Einschätzung der
Penetrationsresistenz des Wirtes ermöglichen und zudem während der Färbung von der
Blattoberfläche abgespült werden können.
Während 1 dpi noch keine intrazellulären Infektionsstrukturen an der Basis melanisierter Appressorien sichtbar waren, hatten 8 % der Appressorien auf Col-0, 40 % der
59
3 E RGEBNISSE
Abbildung 3.8 Etablierung von C. higginsianum-Infektionsstrukturen während der frühen Interaktionsphase. Blätter der Genotypen Col-0, pgm und sex1-1 wurden 1, 2 und 3 dpi mit Trypanblau
angefärbt und mikroskopisch analysiert. (A) Fotos zeigen Beispiele für die ausgewerteten pilzlichen Infektionsstrukturen. Die Länge der Balken entspricht jeweils 10 µm. (B) Die relative Häufigkeit spezifischer Infektionsstrukturen wurde ausgewertet um die frühe in planta Entwicklung
von C. higginsianum zu untersuchen. Beginnend mit dem Auftreten von Appressorien, wurde
jeweils die fortgeschrittenste Infektionsstruktur eines Conidiums gezählt. Die Entwicklungsreihenfolge und die Zuordnung zu den Balken im Diagramm sind nachfolgend angegeben: Appressorien, schwarze Balken; Infektionsvesikel, hellgrüne Balken; Primärhyphen, dunkelgrüne Balken;
Sekundärhyphen, rote Balken. Abgebildet sind Mittelwerte aus drei biologischen Replikaten ±
Standardfehler. Je Replikat wurden Infektionsstrukturen ausgehend von 400-500 Conidien von
vier unabhängigen Blättern ausgewertet.
Appressorien auf sex1-1 und 56 % der Appressorien auf pgm 2 dpi Infektionsvesikel oder
Primärhyphen ausgebildet (Abbildung 3.8). In pgm wurde 2 dpi auch bereits ein Anteil
von 3 % Sekundärhyphen beobachtet. 3 dpi betrug der Anteil sekundärer Hyphen in Col0 30 %, in sex1-1 68 % und in pgm 74 %. Diese Daten zeigen, dass die Penetration der
Epidermiszellen von pgm und sex1-1 zu einem früheren Zeitpunkt nach der Infektion mit
C. higginsianum stattfindet als in Wildtyp Pflanzen. Die beschleunigte intrazelluläre Entwicklung des Pilzes führt darüberhinaus zu einem früheren Auftreten sekundärer Hyphen
und damit zu einem früheren Übergang in die nekrotrophe Phase der Interaktion.
Bednarek et al. (2009) und Hiruma et al. (2010) konnten zeigen, dass IndolGlucosinolate (IGS) an der pathogeninduzierten PEN2-abhängigen Penetrationsresistenz
60
3 E RGEBNISSE
3,0 dpi
3,5 dpi
Col-0
pgm
cyp79b2/b3
1,00
± 0,24
2,62
± 0,34
2,32
± 0,30
17,04
± 2,04
11,59
± 2,67
35,23
± 7,26
hig1-1
HIG1-1D
pad3
1,97
2,94
± 0,45 ± 1,01
13,09
8,87
± 1,53 ± 1,63
1,53
± 0,17
7,85
± 1,07
2,03
± 0,19
18,79
± 0,97
myb51/34
Tabelle 3.6 Suszeptibilität von Arabidopsis-Mutanten der Glucosinolat- und Camalexinbiosynthese. Fünf Wochen alte Pflanzen der Genotypen Col-0, pgm, cyp79b2/b3, myb51/34, hig1-1,
HIG1-1D und pad3 wurden in einem 12h/12h Licht-/Dunkelzyklus mit C. higginsianum infiziert. Die relative Menge genomischer Pilz-DNA wurde 3,0 und 3,5 dpi bestimmt. Alle Werte
sind Mittelwerte aus drei biologischen Replikaten ± Standardfehler. Für jedes Replikat wurde
Blattmaterial aus zwei unabhängigen Pflanzen vereinigt. Statistisch signifikante Unterschiede zu
Col-0-Proben des jeweiligen Zeitpunktes sind in Fettschrift hervorgehoben (P < 0.01; Students
t-Test).
gegen nicht-adaptierte Mehltaupilze und Colletotrichum spp. beteiligt sind. Es wurde daher untersucht, ob dieser Abwehrweg auch an der reduzierten Penetrationsresistenz in
pgm Mutanten beteiligt sein könnte.
Um zu prüfen, ob IGS generell die Suszeptibilität von Arabidopsis gegenüber
C. higginsianum beeinflussen, wurde zunächst die Suszeptibilität von beschriebenen
Mutanten untersucht, die in der Biosynthese von IGS beeinträchtigt sind. Die Mutante
cyp79b2/b3 ist in der Umwandlung von Tryptophan zu Indol-3-Aldoxim, dem Ausgangsstoff der meisten indolischen Tryptophan-Derivate wie z.B. Camalexin, beeinträchtigt
(Glawischnig et al., 2004). In der pad3 Mutante ist die Biosynthese von Camalexin beeinträchtigt (Zhou et al., 1999; Schuhegger et al., 2006), weshalb diese Mutante geeignet ist, um den Einfluss von Camalexin auf die Suszeptibilität von C. higginsianum von
dem Einfluss anderer fehlender Tryptophan-Derivate in cyp79b2/b3 zu trennen. MYB51
(HIG1) und MYB34 sind Transkriptionsfaktoren, welche die transkriptionelle Induktion
der meisten enzymatischen Schritte in der IGS-Biosynthese maßgeblich steuern (Celenza
et al., 2005; Gigolashvili et al., 2007). Es wurden hig1-1 Mutanten, myb51/34 Doppelmutanten und HIG1-1D activation-tagging-Mutanten analysiert. Die Suszeptibilität von
cyp79b2/b3 Mutanten war bereits 3 dpi im Vergleich zum Wildtyp stark erhöht, während
3,5 dpi eine gegenüber Wildtyp-Pflanzen signifikant erhöhte relative C. higginsianumDNA Menge in allen untersuchten Mutanten gemessen wurde (Tabelle 3.6). Die höchste Suszeptibilität zeigten auch 3,5 dpi cyp79b2/b3 Mutanten, gefolgt von pad3, pgm,
myb51/34, hig1-1 und HIG1-1D. Diese Daten zeigen deutlich, dass neben Camalexin
auch andere Tryptophan-Derivate die Resistenz gegen C. higginsianum erhöhen. Um zu
überprüfen, ob der beobachtete Grad an Suszeptibilität mit dem Gehalt an Glucosinolaten
61
3 E RGEBNISSE
korreliert, wurden die Gehalte aliphatischer und indolischer Glucosinolate in Blättern von
infizierten und von Kontrollpflanzen quantifiziert.
Es konnten vier aliphatische Glucosinolate detektiert werden, deren Gehalte 3 dpi mit
C. higginsianum jedoch nicht wesentlich verändert waren. Nur in pad3 Mutanten wurde
ein Anstieg aliphatischer Glucosinolate nach der Infektion gemessen, während alle anderen Mutanten tendenziell leicht reduzierte Gehalte aufwiesen (Abbildung 3.9 A-D). In
cyp79b2/b3 Mutanten konnten weder nach Kontroll-Behandlung noch nach Infektion mit
C. higginsianum IGS detektiert werden, in myb51/34 wurde hingegen eine pathogeninduzierte Akkumulation von I3M (indol-3-yl-methyl-GS) und 4MOI3M (4-methoxyindol3-ylmethyl-GS) gemessen, die allerings deutlich unter dem Wildtyp-Gehalt der Substanzen lag (Abbildung 3.9 E-G). Die Mutante hig1-1 hatte einen deutlich reduzierten I3M
und einen leicht reduzierten 4MOI3M-Gehalt und war in der pathogeninduzierten IGSAkkumulation beeinträchtigt. In HIG1-1D Pflanzen war besonders der I3M-Gehalt in
Kontrollen stark erhöht, nach Infektion wurde zusätzlich ein erhöhter Gehalt an 1MOI3M
(1-methoxyindol-3-ylmethyl-GS) gemessen. Die camalexinfreie pad3 Mutante hatten in
Kontrollen einen geringeren IGS-Gehalt als Col-0, während die pathogeninduzierte IGSAkkumulation dem Wildtyp entsprach (Abbildung 3.9 E-G). Zusammengenommen entsprechen die Glucosinolatgehalte von cyp79b2/b3, hig1-1 und HIG1-1D den beschriebenen Daten (Gigolashvili et al., 2007; Bednarek et al., 2009), während die Gehalte
von myb51/34 gut mit den Erwartungen aufgrund der Funktion der Transkriptionsfaktoren übereinstimmen. Lediglich die Glucosinolatgehalte in pad3 sind überraschend, da
der Verlust einer pathogeninduzierten Camalexin-Akkumulation nicht zu einer verstärkten Akkumulation der ebenfalls aus Indol-3-Aldoxim synthetisierten IGS führte. Stärkefreie pgm Mutanten hatten im Vergleich zum Wildtyp keine signifikant veränderten
IGS-Gehalte in Kontrollen, die Gehalte an I3M und 4MOI3M waren nach Infektion mit
C. higginsianum allerdings im Vergleich zu Col-0 um 50-60% reduziert (Abbildung 3.9
E-G).
62
3 E RGEBNISSE
63
3 E RGEBNISSE
Abbildung 3.9 (vorausgehende Seite) Glucosinolat- und Raphanusamsäuregehalt in Arabidopsis
nach einer Infektion mit C. higginsianum. Der Gehalt der aliphatischen Glucosinolate (GS)
(A) 3MSOP, (B) 4MSOB, (C) 5MSOP und (D) 4MTB, der Indolglucosinolate (E) I3M, (F)
4MOI3M und (G) 1MOI3M, sowie des vermutlichen Abbauproduktes indolischer Glucosinolate, Raphanusamsäure, wurde 3 dpi in wasserbehandelten Kontrollpflanzen (graue Balken) und C. higginsianum-infizierten Pflanzen (schwarze Balken) bestimmt. Abgebildet sind
Mittelwerte aus vier biologischen Replikaten ± Standardfehler, die untersuchten Genotypen sind unter den Diagrammen angegeben. Sternchen zeigen einen signifikanten Unterschied zu Col-0 (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; Students t-Test). 3MSOP: 3methylsulfinylpropyl-GS, 4MSOB: 4-methylsulfinylbutyl-GS, 5MSOP: 5-methylsulfinylpentylGS, 4MTB: 4-methylthiobutyl-GS, I3M: indol-3-yl-methyl-GS, 4MOI3M: 4-methoxyindol-3ylmethyl-GS, 1MOI3M: 1-methoxyindol-3-ylmethyl-GS.
Das Cystein-Derivat Raphanusamsäure (RA) ist vermutliche ein Abbauprodukt der indolischen Glucosinolate I3M und 4MOI3M und damit ein mutmaßliches Nebenprodukt
der durch die Aktivität der atypischen Myrosinase PEN2 gebildeten Indolamine, denen
teilweise eine bislang ungeklärte, aber wichtige Bedeutung bei der Etablierung der Penetrationsresistenz zukommen soll (Bednarek et al., 2009). In Übereinstimmung mit der
Analyse von Bednarek et al. (2009), wurde eine pathogenresponsive Akkumulation von
RA in allen untersuchten Genotypen gemessen (Abbildung 3.9 H). In den Genotypen
cyp79b2/b3, myb51/34, hig1-1 und HIG1-1D korreliert die RA-Akkumulation mit dem
IGS-Gehalt. In pad3 und pgm Mutanten war dagegen keine Korrelation zu erkennen.
Beide Mutanten akkumulierten nach Infektion mit C. higginsianum mehr RA als Col0. Dies könnte durch einen erhöhten Abbau von IGS erklärt werden, wobei nicht untersucht werden konnte welche Indolamine gebildet wurden. Lediglich das Abbauprodukt
von 4MOI3M wurde als antimykotisch beschrieben (Bednarek et al., 2009), die Akkumulation von RA in infizierten pgm Mutanten ist hingegen deutlich geringer als die Verringerung der Gehalte an I3M und 4MOI3M in infizierten pgm Pflanzen im Vergleich zum
infizierten Wildtyp.
Da anhand der analysierten IGS-Biosynthesemutanten gezeigt wurde, dass Beeinträchtigungen der IGS-Biosynthese die Suszeptibilität gegenüber C. higginsianum erhöhen,
deuten diese Daten zusammengenommen auf einen Einfluss der reduzierten pathogeninduzierten IGS-Gehalte für die Suszeptibilität von pgm hin. Aus der Analyse des vermutlichen Nebenproduktes der IGS-Spaltung, RA, konnten hingegen keine klaren Schlüsse
gezogen werden.
Der IGS-Biosyntheseweg und 4MOI3M sind auch für die MAMP-induzierte Akkumulation von Callose notwendig (Clay et al., 2009). Callose ist ein β -1,3-Glukan und
ein häufiger Bestandteil von Zellwandauflagerungen, die eine erste Infektionsbarriere an
Infektionsstellen von Pathogenen darstellen (Underwood, 2012). In der Interaktion mit
64
3 E RGEBNISSE
Abbildung 3.10 Callosehaltige Papillen unter C. higginsianum Appressorien. Um die
Häufigkeit der Ablagerung papillärer Callose an der Wirtszellwand unterhalb von
C. higginsianum Appressorien zu quantifizieren, wurden Blätter der Genotypen Col-0, pgm
und sex1-1 3 dpi mit Anilinblau inkubiert und
unter Fluoreszenzlicht betrachtet. Mindestens
100 Appressorien je Replikat wurden mikroskopisch ausgewertet. Abgebildet sind Mittelwerte aus acht biologischen Replikaten ±
Standardfehler. Sternchen zeigen einen signifikanten Unterschied zu Col-0 (*P < 0.05; Students t-Test).
C. higginsianum lagert Arabidopsis bereits vor der Penetration durch den Pilz Papillen an
der Innenseite der Zellwand unterhalb der Infektionsstelle auf, im Verlauf der Infektion
wird Callose in diesen Papillen abgelagert (Kleemann et al., 2012). Callose ist daher einige Tage nach der Infektion ein guter Marker für Papillen. Eine mikroskopische Analyse der Häufigkeit von papillärer Callose unter Appressorien 3 dpi ergab einen um 30
% gegenüber Col-0 verringerten Anteil unter pilzlichen Infektionsstellen bei pgm und
sex1-1 (Abbildung 3.10). Allerdings sind die großen Unterschiede in der Penetrationsgeschwindigkeit zwischen Col-0, pgm und sex1-1 vermutlich nicht allein auf die Unterschiede in der Ablagerung von Papillen zu erklären, da bislang kein direkter Zusammenhang
zwischen callosehaltigen Ablagerungen und dem Penetrationserfolg von C. higginsianum
festgestellt werden konnte (Birker et al., 2009; Narusaka et al., 2004). Huser et al. (2009)
haben zudem gezeigt, dass die Pathogen-induzierbare Isoform der Callose Synthase,
PMR4/GSL5, nicht zur Penetrationsresistenz von Col-0 gegen C. higginsianum beiträgt.
3.5 Die Zellwand-Monosaccharid Zusammensetzung stärkefreier
Arabidopsis-Mutanten ist verändert
Die Geschwindigkeit und Effizienz der Penetration phytopathogener Pilze kann außer
durch induzierbare Abwehrreaktionen auch durch die Beschaffenheit der Zellwand des
Wirtes beeinflusst werden, wie bereits für die biotrophen Pilze Erysiphe cichoracearum
und Erysiphe orontii, sowie die nekrotrophen Pilze Plectosphaerella cucumerina und Botrytis cinerea gezeigt wurde (Vogel et al., 2002, 2004; Hernández-Blanco et al., 2007;
Raiola et al., 2011; Manabe et al., 2011). Um zu untersuchen, ob die enzymatische Verdaubarkeit der Zellwand in pgm, adg1-1 oder sex1-1 im Vergleich zu Col-0 verändert ist,
wurde die Freisetzung von Protoplasten aus Blattproben während der Inkubation auf einer
Lösung zellwandabbauender Enzyme quantifiziert. Dieser protoplast release assay liefer-
65
3 E RGEBNISSE
te keine Hinweise auf eine unterschiedliche Effizienz bei der enzymatischen Degradation
von Zellwandpolymeren (Tabelle 3.7).
Col-0
pgm
adg1-1
sex1-1
30 min
60 min
110 min
3,2 ± 1,4
10,7 ± 1,7
6,0 ± 0,8
6,7 ± 2,6
100,7 ± 14,6
98,7 ± 28,0
93,8 ± 16,4
75,2 ± 14,5
196,7 ± 38,6
178,8 ± 35,5
221,4 ± 35,0
142,4 ± 9,7
Tabelle 3.7 Protoplast Release Assay der Genotypen Col-0, pgm, adg1-1 und sex1-1. Blattexplantate fünf Wochen alter Pflanzen aus der Anzucht in einem 12h/12h Licht-/Dunkelzyklus wurden
auf einer Lösung Zellwand-degradierender Enzyme inkubiert. Die Freisetzung von Protoplasten
in die Lösung wurde zu den angegebenen Zeitpunkten in 2 µl Aliquots quantifiziert. Angegeben
sind Mittelwerte aus sechs biologischen Replikaten ± Standardfehler.
Die Beschaffenheit der Zellwand könnte sich alternativ direkt auf die Widerstandsfähigkeit gegen die mechanische Kraft der Appressorien von C. higginsianum auswirken. Da
die Zellwand während des Wachstums und der Differenzierung verschiedener Zelltypen
unterschiedliche Grade an Flexibilität benötigt, wird die Steifheit der Wand durch Kreuzvernetzungen und Modifikationen unterschiedlicher Polymere reguliert (Keegstra, 2010).
Eine besonders wichtige Rolle in der Regulation der Zellwand-Flexibilität wird Pektin zugeschrieben (Caffall und Mohnen, 2009). Bläsing et al. (2005) hatten eine vergleichende
diurnale Transkript-Expressionsanalyse von Col-0 und pgm veröffentlicht. Eine Untersuchung dieses Datensatzes zeigte, dass herabregulierte Transkripte Zellwand-bezogener
Gene in pgm zum Ende der Dunkelphase zweifach überrepräsentiert waren (Tabelle A.4).
Sowohl unter den heraufregulierten, als auch unter den herabregulierten Transkripten befinden sich Transkripte Pektin- und Hemicellulose-modifizierender Enzyme. Es erscheint
daher wahrscheinlich, dass der nächtliche Kohlenhydratmangel in pgm Mutanten die Zusammensetzung und die strukturellen Eigenschaften der Zellwand beeinträchtigen könnte.
Um Hinweise zu der Zusammensetzung der Zellwand in pgm zu bekommen, wurden Monosaccharide aus Zellwandextrakten analysiert und mit Wildtyp-Daten verglichen. Darüberhinaus wurden aus einer Kollektion bereits beschriebener Zellwandmutanten (Reiter et al., 1997) drei Mutanten, mur4-1, mur8-1 und mur11-1, mit charakteristischen Veränderungen in der Zellwandzusammensetzung in die vergleichende Analyse mit
einbezogen. MUR4 kodiert für eine UDP-D-Xylose 4-Epimerase (Burget et al., 2003),
mur11-1 trägt eine Mutation in SAC9, das für eine Phosphoinositid-Phosphatase kodiert
(Austin et al., 2011), während der genomische Lokus von MUR8 bislang unbekannt ist.
Die Analyse von pgm Zellwänden ergab eine Verringerung der relativen Gehalte an
Arabinose und Galaktose zu Gunsten von Fucose, Rhamnose, Xylose und Mannose (Abbildung 3.11 A). Auf die Analyse von Glukose wurde aus methodischen Gründen verzich-
66
3 E RGEBNISSE
Abbildung 3.11 Zellwand-Monosaccharid Zusammensetzung von pgm und mur Mutanten. Der
Gehalt der Monosaccharide Fucose (Fuc), Rhamnose (Rha), Arabinose (Ara), Galactose (Gal),
Xylose (Xyl) und Mannose (Man) in Zellwandextrakten von Arabidopsis ist (A) als das molare Verhältnis der einzelnen Zucker in den einzelnen Genotypen (mol %) und (B) in Prozent des
Gesamt-Monosaccharid Gehaltes in Wildtyp-Zellwandextrakten (normalisiert auf das Blattfrischgewicht) dargestellt. Col-0, weiße Balken; pgm, schwarze Balken; mur4-1, dunkelgraue Balken;
mur8-1, hellgraue Balken; mur11-1, blassgraue Balken. Abgebildet sind Mittelwerte aus sechs
biologischen Replikaten ± Standardfehler.
tet, da eine potentielle Kontamination mit Glukose aus der Blattstärke befürchtet wurde.
Vergleichbar wie von Reiter et al. (1997) beschrieben, wiesen die Zellwände von mur4-1
weniger Arabinose bei einem erhöhten Anteil von Galaktose und Xylose auf, während in
den Zellwänden von mur8-1 der Anteil an Rhamnose verringert und der Anteil an Xylose
erhöht war. Die Mutante mur11-1 zeigte hingegen anders als berichtet unter den verwendeten Anzuchtbedingungen keine Unterschiede in der relativen Zusammensetzung der
Zellwand im Vergleich zu Col-0.
Da die Betrachtung der molaren Anteile einzelner Monosaccharide in einer Zellwandpräparation eine gute Einschätzung der Zellwandzusammensetzung, aber keinen direkten Vergleich der Absolutmengen einzelner Zucker zwischen verschiedenen Genotypen
ermöglicht, wurden die einzelnen Monosaccharidgehalte in Zellwandextrakten im Vergleich zum Wildtyp berechnet. Der Absolutgehalt an Arabinose und Galactose war nach
Normalisierung auf das Blatt-Frischgewicht in pgm um 40% bzw. 30% gegenüber Col-0
verringert, während sich die Gehalte der anderen Zucker nicht unterschieden (Abbildung
3.11 B). Die Mutante mur4-1 enthielt spezifisch weniger Arabinose, während in mur8-1
neben einer Reduktion an Rhamnose auch ein deutlich, wenngleich mathematisch insignifikant, verringerter Gehalt an Galactose messbar war. In mur11-1 war der Gehalt aller
gemessenen Monosaccharide durchschnitlich um 70 % gegenüber Col-0 erhöht, was auf
ein deutlich erhöhtes Zellwand zu Zytosol Verhältnis hinweist und sich in der kleinen
Rosettengröße der Mutante widerspiegelt (Abbildung 3.12 B).
67
3 E RGEBNISSE
3.6 Veränderungen der Zellwand-Zusammensetzung können die
Suszeptibilität für C. higginsianum beeinflussen
Um den möglichen Einfluß der Zellwandzusammensetzung von Arabidopsis auf die Interaktion mit C. higginsianum zu untersuchen, wurde die Suszeptibilität der ZellwandMutanten mur4-1, mur8-1 und mur11-1 (siehe Kapitel 3.5 und Reiter et al., 1997) für
C. higginsianum bestimmt.
Während die Mutanten mur4-1 und mur11-1 keine veränderte Suszeptibilität für
C. higginsianum zeigten, ergab die Quantifizierung pilzlicher DNA 3,5 dpi eine stark
erhöhte pilzliche Proliferation und einen ausgeprägten Krankheitsphänotyp in mur8-1
(Abbildung 3.12 A-B). Bemerkenswerterweise war nicht nur das relative Ausmaß der
nekrotrophen Besiedelung von mur8-1 und pgm sehr vergleichbar, sondern auch die Geschwindigkeit der Etablierung biotropher Pilzstrukturen. Bereits 1,5 dpi hatten 19 % der
Appressorien auf pgm und 13 % der Appressorien auf mur8-1 Infektionshyphen ausgebildet, während auf Col-0 noch keine Penetration stattgefunden hatte (Abbildung 3.12
C). Die beschleunigte Etablierung von C. higginsianum war daher in beiden Mutanten
bereits in der Penetrationsphase evident, setzte sich aber auch, wie bereits in Kapitel 3.4
gezeigt, in einem beschleunigten Übergang in die nekrotrophe Wachstumsphase und somit einem schnelleren Krankheitsverlauf fort. Die veränderte Zellwandzusammensetzung
in mur8-1 ist im Gegensatz zu pgm nicht auf Beeinträchtigungen des zentralen Kohlenhydratmetabolismus zurückzuführen, da die diurnale Akkumulation von löslichen Zuckern
und Stärke gegenüber Wildtyp-Pflanzen kaum verändert ist (Abbildung 3.13). Zudem sind
mur8-1 Mutanten nicht kleinwüchsig, sondern wachsen auf eine vergleichbare Rosettengröße wie Col-0 (Abbildung 3.12 B). Die Blätter von mur8-1 sind jedoch im Gegensatz
zu Col-0 und pgm stärker zur abaxialen Seite gebogen und weisen eine leicht spiralige
Anordnung auf.
Um zu untersuchen, ob der reduzierte Gehalt an Arabinose und Galactose in pgm
durch Unterschiede im Anteil löslicher Arabinogalactan-Proteine (AGPs) oder durch Veränderungen in der Zellwand-Matrix aus Hemicellulose und Pektin bedingt ist, wurden
Zellwand-Präparationen in Puffer-lösliche und -unlösliche Polymere fraktioniert. Außerdem wurde Zellwandmaterial von mur8-1 fraktioniert, um zu untersuchen, ob innerhalb
dieser Fraktionen Unterschiede zu Col-0 deutlich werden. Interessanterweise war der
Gehalt an Arabinose und Galactose in der unlöslichen Matrix-Fraktion gegenüber dem
Wildtyp in beiden Mutanten signifikant reduziert, in pgm auf 47 % Arabinose bzw. 53 %
Galactose und in mur8-1 auf 82 % Arabinose bzw. 83 % Galactose der Wildtyp-Gehalte
(Abbildung 3.12 D). Darüberhinaus wurde ein reduzierter Gehalt an Galacturonsäure fest-
68
3 E RGEBNISSE
Abbildung 3.12 Suszeptibilität von mur Mutanten gegenüber C. higginsianum und Zellwandanalyse von pgm und mur8-1. (A) Der relative Gehalt an C. higginsianum-DNA in Blattproben
von Col-0, pgm, mur4-1, mur8-1 und mur11-1 wurde 3,5 dpi bestimmt. Mittelwerte wurden aus
drei biologischen Replikaten berechnet und sind ± Standardfehler angegeben. Für jedes Replikat
wurde Blattmaterial aus zwei unabhängigen Pflanzen vereinigt. Sternchen zeigen einen signifikanten Unterschied zu Col-0 (*P < 0.01; Students t-Test). (B) Krankheitssymptome der über den
Fotos der Pflanzen angegebenen Genotypen zum Zeitpunkt der Probennahme (untere Reihe) im
Vergleich mit nicht infizierten Pflanzen des selben Alters (obere Reihe). (C) Die frühe in planta
Entwicklung von C. higginsianum wurde durch eine mikroskopische Auswertung der Infektionsstrukturen auf Col-0, pgm und mur8-1 analysiert. Beginnend mit dem Auftreten von Appressorien, wurde jeweils die fortgeschrittenste Infektionsstruktur eines Conidiums gezählt. BeispielFotos der Infektionsstrukturen sind in Abbildung 3.8 A gezeigt und die Entwicklungsreihenfolge
ist nachfolgend angegeben: Appressorien, schwarze Balken; Infektionsvesikel, hellgrüne Balken;
Primärhyphen, dunkelgrüne Balken; Sekundärhyphen, rote Balken. Abgebildet sind Mittelwerte aus drei biologischen Replikaten ± Standardfehler. Je Replikat wurden Infektionsstrukturen
ausgehend von 600-800 Conidien von vier unabhängigen Blättern ausgewertet. (D) Fraktionierung von Zellwandextrakten der Genotypen Col-0 (weiße Balken), pgm (schwarze Balken) und
mur8-1 (hellgraue Balken). Es wurde der Gehalt an Arabinose (Ara), Galactose (Gal) und Galacturonsäure (GalA) in der unlöslichen Zellwand- Matrix Fraktion (linkes Feld) und der Gehalt an
Arabinose (Ara) und Galactose (Gal) in der löslichen Zellwand Fraktion (rechtes Feld) bestimmt.
Alle Werte sind Mittelwerte aus sechs biologischen Replikaten und relativ zu Wildtyp Daten ±
Standardfehler angegeben.
69
3 E RGEBNISSE
gestellt, der Anteil dieser Uronsäure betrug in pgm 77 % und in mur8-1 69 % des WildtypGehaltes. Während in den löslichen Zellwandfraktionen keine Unterschiede im Gehalt an
Galactose zwischen den untersuchten Genotypen gemessen wurden, war der Gehalt an
Arabinose in pgm gegenüber Col-0 etwas verringert und in mur8-1 leicht erhöht (Abbildung 3.12 D). Es scheint daher, dass in mur8-1 Gesamt-Zellwandextrakten ein leicht
erhöhter Gehalt an Arabinose den reduzierten Gehalt dieses Zuckers in der Matrix der
Zellwand ausgleicht. Da Galacturonsäure, Galactose, Arabinose und Rhamnose die vorwiegenden Zucker in Pektin sind, während Hemicellulose in Arabidopsis vorwiegend aus
Xylose, Galactose und Fukose aufgebaut ist (Zablackis et al., 1995), deuten die erhobenen
Daten klar auf eine veränderte Pektin-Zusammensetzung in pgm und mur8-1 hin. Obwohl
diese Unterschiede im Vergleich zu Col-0 unterschiedliche Ursachen und auf Ebene der
Monosaccharidgehalte unterschiedliche Ausprägungen haben, kann aus der vergleichbar
erhöhten Suszeptibilität für C. higginsianum abgeleitet werden, dass die Pektinstruktur
ein Suszeptibilitätsfaktor in der Interaktion zwischen Arabidopsis und C. higginsianum
darstellt.
70
3 E RGEBNISSE
Abbildung 3.13 Diurnaler Umsatz von
Kohlenhydraten in mur8-1. Der Gehalt an
(A) löslichen Zuckern und (B) Stärke in
mur8-1 Blattproben (schwarze Dreiecke)
wurde zum Ende der Dunkelphase (ED)
und zum Ende der Lichtphase (EL) in
einem 12h/12h Licht-/Dunkelzyklus mit
dem Gehalt in von Col-0 (schwarze Kreise)
und pgm (weiße Kreise) verglichen. (C) Der
diurnale Umsatz an Kohlenhydraten wurde
aus den Daten in (A) und (B) berechnet.
Kohlenhydrat-Akkumulation, weiße Balken;
Kohlenhydrat-Mobilisierung,
schwarze
Balken. Abgebildet sind Mittelwerte aus vier
biologischen Replikaten ± Standardfehler.
3.7 Kohlenstoffmangel bewirkt eine Reduktion spezifischer
Monosaccharide in der Zellwand von Arabidopsis
Die Analyse der Zellwandzusammensetzung von pgm hatte einen verringerten Anteil an
Arabinose und Galactose in der Zellwandmatrix gezeigt. Da diese Zucker über separate
Stoffwechselwege synthetisiert werden, die jedoch alle auf die Bereitstellung von UDPD-Glukose angewiesen sind (Reiter, 2008), ist anzunehmen, dass die limitierte Verfügbarkeit an Kohlenhydraten ursächlich für die gezeigten Veränderungen in der pgm Zellwand ist. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurde die Monosaccharidzusammensetzung von Gesamt-Zellwandextrakten und Fraktionen löslicher und unlöslicher Polymere in den Genotypen adg1-1, sex1-1, cca1/lhy und MEm4, welche ebenfalls diurnalen
71
3 E RGEBNISSE
Kohlenstoffmangel zeigen (siehe Kapitel 3.1 und 3.2), analysiert. MEm4-Pflanzen waren
dabei von besonderem Interesse, da der Kohlenstoffmangel und die Suszeptibilität gegenüber C. higginsianum in diesen Pflanzen von der Tageslänge abhängt (Abbildung 3.5).
Tatsächlich war der Gehalt an Arabinose und Galactose, wie für pgm beschrieben, in
Zellwandextrakten von adg1-1, sex1-1, cca1/lhy und unter Kurztag-Bedingungen angezogenen MEm4 gegenüber den jeweiligen Kontrollen signifikant reduziert (Abbildung
3.14 A). Darüberhinaus war der Gehalt an Fucose und Xylose in cca1/lhy und der Gehalt an Xylose in MEm4 reduziert, was auf zusätzliche Veränderungen in HemicellulosePolymeren hindeutet. MEm4-Pflanzen, welche in einem 12 h / 12 h Licht- / Dunkelzyklus
angezogen worden waren, wiesen keine signifikanten Unterschiede zu Col-0 auf.
Eine Fraktionierung der Zellwandextrakte in Puffer-lösliche und -unlösliche Bestandteile zeigte darüberhinaus, dass der verringerte Galactosegehalt vollständig und der verringerte Arabinosegehalt größtenteils auf Unterschieden in Matrix-Polymeren beruhen
(Abbildung 3.14 B). Lediglich in cca1/lhy war die Reduktion des Arabinosegehaltes in
der löslichen Fraktion mit 80 % des Kontrollwertes signifikant. Der Gehalt an Galacturonsäure war in allen beschriebenen Genotypen mit Kohlenstoffmangel tendenziell reduziert, wegen starker Schwankungen der Werte zwischen den biologischen Replikaten
waren diese Unterschiede jedoch mathematisch nicht signifikant.
72
3 E RGEBNISSE
Abbildung 3.14 Zellwand-Monosaccharid Zusammensetzung von Genotypen mit periodischem
Kohlenstoffmangel. (A) Der relative Gehalt der Monosaccharide Fucose (Fuc), Rhamnose (Rha),
Arabinose (Ara), Galactose (Gal), Xylose (Xyl) und Mannose (Man) in Zellwandextrakten
von Arabidopsis ist in Prozent des Gesamt Zellwand-Monosaccharid Gehaltes des jeweiligen
Kontroll-Genotyps (normalisiert auf Blatt-FG) dargestellt. (B) Fraktionierung von Zellwandextrakten. Der Gehalt an Arabinose (Ara), Galactose (Gal) und Galacturonsäure (GalA) in der unlöslichen Zellwand- Matrix Fraktion (linkes Feld) und der Gehalt an Arabinose (Ara) und Galactose
(Gal) in der löslichen Zellwand Fraktion (rechtes Feld) sind in Prozent der jeweiligen KontrollGenotypen dargestellt. Col-0, weiße Balken; pgm, schwarze Balken; adg1-1, dunkelgraue Balken; sex1-1, hellgraue Balken; MEm4, blassgraue Balken; cca1/lhy Kontrolle, schraffierte weiße
Balken; cca1/lhy, schraffierte graue Balken; Col-0 Kurztag, horizontal schraffierte weiße Balken;
MEm4 Kurztag, horizontal schraffierte graue Balken. Alle Werte sind Mittelwerte aus sechs biologischen Replikaten ± Standardfehler. Sternchen zeigen einen signifikanten Unterschied zu den
entsprechenden Kontrollen (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; Students t-Test).
73
3 E RGEBNISSE
3.8 Stärkefreie Arabidopsis haben eine erhöhte Resistenz gegen
Erysiphe cruciferarum
Der Lebenszyklus hemibiotropher phytopathogener Pilze wird gemeinhin per definitionem als sequentielle Abfolge einer biotrophen Interaktionsphase mit der Wirtspflanze unmittelbar nach der Penetration und einer nachfolgenden nekrotrophen Interaktionsphase
betrachtet (Oliver und Ipcho, 2004). Dies impliziert eine physiologisch ähnlichen Bedeutung der biotrophen Phase bei biotrophen und hemibiotrophen Pilzen.
Um zu untersuchen, ob die veränderte Zusammensetzung der Zellwandmatrix in pgm
und mur8-1 auch die Suszeptibilität gegenüber biotrophen Pathogenen beeinflusst, wurden die Mutanten mit dem obligat biotrophen Mehltaupilz Erysiphe cruciferarum konfrontiert. In Voruntersuchungen konnten keine klaren Unterschiede zwischen Pflanzen,
welche zu Beginn oder am Ende der Lichtphase infiziert wurden, festgestellt werden.
In der ersten Analyse wurden daher zwei Experimente mit beiden unterschiedlichen Infektionszeitpunkten gemeinsam ausgewertet. Die Suszeptibilität von mur8-1 gegenüber
E. cruciferarum war im Vergleich zum Wildtyp nicht verändert, interessanterweise wurde allerdings eine stark verringerte Proliferation des Pilzes auf pgm beobachtet (Abbildung 3.15). Die Veränderungen in der Zusammensetzung von Pektin stellen daher offensichtlich keinen Suszeptibilitätsfaktor für die Interaktion zwischen Arabidopsis und
E. cruciferarum dar.
Die Suszeptibilität von pgm Mutanten schien allerdings bei einer Infektion zu Beginn
der Lichtphase etwas deutlicher reduziert zu sein, als bei einer Infektion zum Ende der
Lichtphase. Daher könnte der Kohlenhydratmangel zu Beginn der Lichtphase entscheidend für die Suszeptiblität gegenüber E. cruciferarum sein. Jain et al. (2004) hatten bereits gezeigt, dass der Infektionserfolg des Gersten-Mehltau Pilzes auf photosythetisch
inaktivem Blattgewebe der variegierten Gersten albostrians Mutanten reduziert ist. FolgAbbildung 3.15
Proliferation
von
E. cruciferarum auf Col-0, pgm und
mur8-1. Arabidopsis-Pflanzen wurden zu
Beginn und am Ende der Lichtphase mit
E. cruciferarum infiziert und Blattproben
7 dpi angefärbt. Der relative Anteil der
Blattfläche der von pilzlichem Mycel bedeckt
war wurde mikroskopisch ausgewertet.
Dargestellt sind Mittelwerte aus jeweils drei
biologischen Replikaten (n=6) je Infektionszeitpunkt ± Standardfehler. Sternchen zeigen
einen signifikanten Unterschied zu Col-0 (*P
< 0.001; Students t-Test).
74
3 E RGEBNISSE
Abbildung 3.16
Suszeptibilität
von
Arabidopsis Stärkestoffwechsel- Mutanten
gegenüber E. cruciferarum. ArabidopsisPflanzen wurden zu Beginn der Lichtphase mit
E. cruciferarum infiziert. (A) Die relative Menge genomischer E. cruciferarum DNA wurde
6 dpi auf Blättern von Col-0, pgm, adg1-1 und
sex1-1 bestimmt. (B) Der Gehalt an freier Salicylsäure (SA, dunkelgraue Balken), GesamtSA (freie SA + SA- Glucoside, leere Balken)
und Camalexin (hellgraue Balken) wurde 6 dpi
mit E. cruciferarum bestimmt. Alle Werte sind
Mittelwerte aus drei biologischen Replikaten
± Standardfehler. Sternchen zeigen einen
signifikanten Unterschied zu Col-0 (*P < 0.05;
**P < 0.001; Students t-Test).
lich könnte sich eine reduzierte Kohlenhydratverfügbarkeit in albostrians Mutanten direkt negativ auf die Proliferation von Mehltaupilzen auswirken. Um die Proliferation des
Mehltaupilzes genauer quantifizieren zu können, wurde eine Analyse der relativen DNA
Menge, analog zu der Quantifizierung von C. higginsianum-DNA, etabliert. Eine Analyse
von zu Beginn der Lichtphase infizierten Col-0, pgm, adg1-1 und sex1-1 Pflanzen 6 dpi
zeigte, dass die stärkefreien Mutanten eine im Vergleich zum Wildtyp um 60% reduzierte
Besiedelung mit E. cruciferarum aufwiesen (Abbildung 3.16 A). Auf sex1-1 war die relative Menge E. cruciferarum DNA um etwa 20% gegenüber Wildtyp-Pflanzen reduziert,
der Unterschied war allerdings mathematisch nicht signifikant.
Nach der Infektion mit E. cruciferarum akkumulierten weder freie Salicylsäure noch
Camalexin wesentlich in Col-0, pgm, adg1-1 oder sex1-1, was auf eine effiziente Unterdrückung der induzierten Abwehrantwort des Wirtes durch das adaptierte Pathogen
hindeutet (Abbildung 3.16 B). Wie bereits in Kapitel 3.3 gezeigt wurde, ist die Gesamtmenge an akkumulierter SA und Camalexin in stärkefreien Mutanten gegenüber Col-0
allerdings reduziert, obwohl das Blattgewebe durch eine Infektion mit E. cruciferarum
im Gegensatz zu einer Infektion mit C. higginsianum nicht stark geschädigt wird. Diese
unterschiedliche Kapazität für die Synthese von Abwehrmolekülen ist daher vermutlich
metabolisch limitiert.
75
3 E RGEBNISSE
3.9 Identifizierung von Suszeptibilitäts-Suppressor-Mutationen
mittels Vorwärtsgenetik
Arabidopsis ist aufgrund einer kurzen Generationszeit, eines hohen Samenertrages und
eines kleinen, diploiden Genomes sehr gut für vorwärtsgenetische Ansätze geeignet. Dabei wird die genetische Variation in einer Pflanzenpopulation durch Mutagenese massiv
erhöht und diese Population in der Folge auf Phänotypen durchmustert, welche einem
definierten Selektionskriteritum entsprechen (Page und Grossniklaus, 2002). Zwei Fragestellungen sollten in dieser Arbeit mit einem vorwärtsgenetischen Ansatz addressiert
werden. Zum einen wurde nach Genfunktionen gesucht, deren Verlust die erhöhte Suszeptibilität der stärkefreien pgm Mutanten für C. higginsianum spezifisch supprimiert. Dabei
könnten Modifikationen des Wirtsstoffwechsels oder Veränderungen in der Signalübertragung zwischen Stoffwechsel und Abwehr des Wirtes eine Rolle spielen. Vergleichbare
Ansätze wurden beispielsweise für Suppressoren des NPR1-abhängigen Abwehrsignalweges und des Gene Silencing am Arabidopsis SUPERMAN-Lokus beschrieben (Li et al.,
1999; Lindroth et al., 2001). Zum anderen wurde nach Genfunktionen gesucht, die unabhängig von der spezifischen genetischen Beeinträchtigung in pgm die Suszeptibilität von
Arabidopsis reduzieren. Dabei wurde der hypersuszeptible Krankheitsphänotyp von pgm
ausgenutzt, um Verminderungen in der Ausprägung von Krankheitssymptomen deutlicher
makroskopisch zu erkennen. Eine vergleichbare Strategie wurde erfolgreich in der Interaktion von Arabidopsis mit dem Erreger des sogenannten Falschen Mehltau, Hyaloperonospora parasitica durchgeführt. Eine mutagenisierte Kollektion der hypersuszeptiblen
Arabidopsis Linie Ler enhanced disease susceptibility1-2 (eds1-2) wurde nach Individuen durchmustert, die eine Reduktion der Krankheitssymptome für das Pathogen zeigten
(van Damme et al., 2005). Bereits zuvor wurde ein erfolgreiches Experiment beschrieben,
in welchem aus einer mutagenisierten Arabidopsis Col-0 Population sechs unabhängige
Mutanten mit einer Resistenz gegen den obligat biotrophen Mehltaupilz Erysiphe cichoracearum isoliert wurden (Vogel und Somerville, 2000; Vogel et al., 2002).
3.10 Chemische Mutagenese und Durchmusterung von Arabidopsis
pgm Mutanten
Die Mutagenese von pgm (N210) Saatgut wurde mit EMS durchgeführt, einer Verbindung, die alkylierend auf Nukleotide wirkt, was während der Replikation der DNA zu
Nukleotidfehlpaarungen führt (Kim et al., 2006). Insgesamt wurden in der M1 Generation 15 Parentalgruppen gebildet, von denen 9 Gruppen durchmustert wurden. Aus diesen
76
3 E RGEBNISSE
1. Durchmusterung
2. Durchmusterung
3. Durchmusterung
4. Durchmusterung
ParentalGruppe
Samen je
Gruppe
6
5
1
2
3
4
7
8
9
200 mg
300 mg
100 mg
100 mg
100 mg
100 mg
100 mg
100 mg
100 mg
Kandidaten
M2 selektiert M2 analysiert
12
105
53
28
10
64
53
47
12
0
52
25
14
7
48
26
37
12
M3
0
2
9
4
3
15
10
18
2
Tabelle 3.8 Selektierte Kandidaten aus der Durchmusterung chemisch mutagenisierter
Arabidopsis pgm Mutanten. In vier aufeinanderfolgenden Durchmusterungen von M2 Pflanzen
wurde die angegebene Zahl an Kandidaten pro Parentalgruppe selektiert. In Abhängigkeit von
der Stärke des Phänotyps wurde nur eine Teilmenge dieser Kandidaten weiter analysiert. Nach
einer erneuten Durchmusterung der Kandidaten in der M3 Generation konnte die angegebene
Anzahl an Individuen selektiert werden.
9 Parentalgruppen wurden in vier separaten Durchmusterungen insgesamt rund 100.000
M2 Pflanzen nach Infektionen mit C. higginsianum durchmustert und 384 fruchtbare Kandidaten mit einem Hypersuszeptibilitätssuppressorphänotyp selektiert, wobei der Grad
der erworbenen Resistenz bewertet wurde. Nach einer erneuten Durchmusterung der 222
Kandidaten mit der stärksten Resistenz in der M3 Generation, wurden 75 Kandidaten
behalten. Schließlich konnten nach dem Ausschluss von 12 stärkehaltigen Kontaminanten (11 aus Gruppe 5, 1 aus Gruppe 8) 63 Kandidaten der M3 Generation aus 8 unabhängigen Parentalgruppen selektiert werden (Tabelle 3.8). Die Anzahl der Kandidaten je
Parentalgruppe variiert deutlich. Dies kann mit unterschiedlichen Infektionsbedingungen
bei der Durchmusterung der verschiedenen Parentalgruppen im Zuge der experimentellen
Optimierung und eventuell mit mehrfacher Selektion starker Kandidaten aus einer Parentalgruppe zusammenhängen. An dem Verhältnis der selektierten Kandidaten in der M3
Generation zu dem in der M2 Generation eingesetzten Samengewicht ist deutlich zu erkennen, dass die Effizienz der Durchmusterung im Zuge einer Optimierung zwischen der
ersten und der vierten Runde gesteigert wurde (Tabelle 3.8).
Um die selektierten Kandidaten in Suppressormutanten der pgm Hypersuszeptibilität
und in pgm-unabhängige Mutanten mit erhöhter Resistenz zu unterteilen, wurden möglichst viele der Kandidatenlinien in der M4 Generation mit Col-0 gekreuzt. Parallel wurden Kandidaten aus unterschiedlichen Parentalgruppen zur Erstellung von Kartierungspopulationen mit der Arabidopsis Linie N4351 ausgekreuzt, welche eine Deletion in PGM
im genetischen Hintergrund von Ler trägt (Kofler et al., 2000). Dieses parallele Verfahren
wurde aufgrund zeitlicher Überlegungen gewählt, um möglichst schnell auf Kartierungs-
77
3 E RGEBNISSE
Linie
x Col-0
1-31-1
1-33-1
1-38-4
1-42-1
1-52-1
1-53-3
1-54-3
1-56-2
1-58-1
2-1-1
2-5-2
2-9-2
2-10-1
3-1-1
3-2-2
3-6-8
4-1-2
4-4-2
4-8-2
4-11-1
4-19-2
x
x
x
x
x
x
x
x N4351
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
Linie
4-20-2
4-21-1
4-23-2
4-35-3
4-51-1
4-54-4
4-57-1
4-63-2
4-65-1
4-69-3
5-64-1
5-107-1
7-1-1
7-2-1
7-10-1
7-11-2
7-12-4
7-14-1
7-15-1
7-16-2
7-18-3
x Col-0
x N4351
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
Linie
7-43-2
8-2-2
8-4-1
8-10-2
8-13-1
8-18-1
8-20-4
8-21-1
8-22-2
8-23-2
8-25-2
8-27-2
8-29-3
8-30-2
8-31-1
8-32-1
8-38-2
8-39-2
8-40-2
9-7-10
9-13-2
x Col-0
x N4351
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
Tabelle 3.9 Übersicht der 63 pgm Suszeptibilitäts-Suppressor Kandidaten und Informationen zu
Kreuzungen. Alle Linien der selektierten pgm Suszeptibilitäts-Suppressor Kandidaten (pSSK)
aus der M4 Generation sind nach Parentalgruppen sortiert aufgelistet. pSSK wurden mit Col0 gekreuzt, um den Einfluss der Mutationen in stärkehaltigen Pflanzen auf Infektionen mit
C. higginsianum zu testen. Kreuzungen von pSSK mit pgm Mutanten im Hintergrund des Ökotypen Ler (N4351) wurden durchgeführt, um Kartierungspopulationen für die Analyse mit genetischen Markern anzulegen. Kreuze in der Tabelle zeigen erfolgreiche Kreuzungen mit Col-0 bzw.
N4351, die in der F2 Generation vorliegen.
populationen zurückgreifen zu können. Es wurde darauf geachtet, dass sowohl Kandidaten mit stark, als auch intermediär ausgeprägtem Resistenzphänotyp für die Kreuzung mit
N4351 ausgewählt wurden, um die Wahrscheinlichkeit der Identifizierung unterschiedlich wirkender Resistenzmechanismen zu erhöhen. Die erfolgreiche Kreuzung der unterschiedlichen Genotypen wurde in der F1 Generation mittels PCR Analyse überprüft.
Da Nachkommen der Kreuzungen von Col-0 mit pgm Suszeptibilitäts-Suppressor Kandidaten (pSSK) außer der Mutation in PGM (Periappuram et al., 2000) und unbekannten chemisch induzierten Mutationen keine genomischen Unterschiede aufweisen, wurde ein Einzelnukleotidpolymorphismus (SNP, single nucleotide polymorphism) des PGM
Gens in der pgm N210 Mutante ausgenutzt, um einen PCR-amplifizierten Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (CAPS, cleaved amplified polymorphic sequence) zu erzeugen (Abbildung 3.17). F1 Pflanzen aus Kreuzungen der pgm Genotypen N210 und
N4351 wurden mit PCR-abhängigen Markern für einfache Längenpolymorphismen zwischen genomischen Sequenzen der Ökotypen Col-0 und Ler (SSLP, simple sequence
78
3 E RGEBNISSE
Abbildung 3.17 CAPS Marker zur Identifizierung von pgm N210. (A) Um Kreuzungen
zwischen Col-0 und pgm N210 in der F1 Generation zu testen wurde eine EMS induzierte
Punktmutation in pgm ausgenutzt, welche von
Periappuram et al. (2000) charakterisiert worden war. Die Mutation in Exon 7 führt zu einem Austausch von Guanin zu Adenin und auf
Ebene der Translation zu einem Stop- Codon.
(B) Durch das Adenin entsteht in pgm eine
Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease DdeI (CTNAG). Mit den angezeichneten Oligonukleotid-Primern (P1, P2) wurde
via PCR ein 303 bp langes DNA- Fragment
amplifiziert, welches in pgm durch DdeI in 2
Fragmente (64 bp, 239 bp) gespalten werden
kann. Die Sequenzen der verwendeten Primer
sind in Tabelle A.1 angegeben (TE 167/168).
length polymorphisms) überprüft. Alle erfolgreichen Kreuzungen sind in Tabelle 3.9 markiert.
Nach einer Selbstbefruchtung der Col-0 / pSSK F1 Pflanzen wurde die F2 Generation
9 Tage nach der Aussaat mit C. higginsianum infiziert. Es wurden möglichst selektive
Infektionsbedingungen gewählt, um die Überlebensrate der Col-0 Keimlinge nach der
Infektion zu verringern. Überlebende Pflanzen wurden 10 dpi ausgezählt und mit Col0- und pgm-Kontrollen verglichen. Aus dem Anteil der überlebenden Col-0 / pSSK F2
Pflanzen und der überlebenden Col-0 Kontrollen wurde ein Resistenzquotient ermittelt,
der eine Einschätzung zu dem Einfluss der untersuchten Mutationen für die Suszeptibilität
gegenüber C. higginsianum im stärkehaltigen Col-0 Hintergrund ermöglicht. Die Anzahl
der angewachsenen Keimlinge aller Col-0 und Col-0 / pSSK F2 Linien je Topf korrelierte
nicht mit dem entsprechenden Anteil überlebender Keimlinge (Abbildung 3.18 A). Es
konnte daher ausgeschlossen werden, dass eine überdurchschnittlich hohe Anzuchtdichte
die Infektionseffizienz verschlechtert.
Um pSSK nach dem in Kapitel 3.11 beschriebenen Verfahren kartieren zu können, ist
ein verlässlich starker Resistenzphänotyp der Mutanten unabdingbar. Daher wurde auch
der Grad der Resistenz der Mutanten im stärkefreien pgm Hintergrund bewertet. Die besonders selektiven Infektionsbedingungen in diesem Experiment waren geeignet, um Unterschiede in der erworbenen Resistenz der verschiedenen pSSK hervorzuheben. Gute
pSSK sollten idealerweise eine schwache bis mittlere Resistenz in Col-0, aber eine mittlere bis starke Resistenz in pgm bewirken. In Anbetracht der experimentellen Ergebnisse
sind die 8 Linien 4-54-4, 7-18-3, 4-51-1, 3-2-2, 9-7-10, 9-13-2, 7-10-1 und 2-10-1 besonders vielversprechende pSSK (Tabelle 3.10, in Fettschrift hervorgehoben; Abbildung 3.18
79
3 E RGEBNISSE
Abbildung 3.18 Korrelationsanalysen zur Untersuchung der Infektionseffizienz und der Resistenz in pgm Suszeptibilitäts-Suppressor Kandidaten (pSSK)). (A) Die Anzahl an Col-0 und Col0 / pSSK F2 Pflanzen Keimlingen je Topf wurde gegen den prozentualen Anteil überlebender
Keimlinge je Topf nach der Infektion mit C. higginsianum aufgetragen, um einen Einfluss der
Wachstumsdichte in den einzelnen Töpfen auf die Infektionseffizienz des Pilzes auszuschließen.
(B) Um zu überprüfen ob eine Korrelation zwischen der Resistenz selektierter pgm Mutanten und
dem berechneten Resistenz-Quotienten der eingekreuzten Mutationen in Col-0 / pSSK F2 Pflanzen besteht, wurde der Resistenzquotient im Col-0 Hintergrund gegen den prozentualen Anteil
überlebender Keimlinge im pgm Hintergrund aufgetragen. Für weitere Analysen besonders interessante pSSK sind im Diagramm benannt und werden im Text diskutiert. Das Bestimmtheitsmaß
einer linearen Korrelationsanalyse ist jeweils in den Diagrammen angegeben.
B). Schwache Resistenz in Col-0 zeigten insgesamt 9 Linien (19 %), mittlere Resistenz
16 Linien (33 %) und starke Resistenz 23 Linien (48 %). Der Resistenzquotient der untersuchten Kandidaten im Col-0 Hintergrund korreliert nicht mit der Überlebensrate der
Kandidaten im pgm Hintergrung (Abbildung 3.18 B). Dies deutet klar auf eine Mischung
pgm-abhängiger und -unabhängiger Resistenzphänotypen hin.
80
3 E RGEBNISSE
Linie
4-54-4
7-18-3
1-53-3
4-35-3
4-51-1
1-52-1
3-2-2
9-7-10
4-63-2
8-39-2
4-65-1
4-69-3
4-57-1
9-13-2
8-2-2
4-20-2
1-54-3
1-58-1
4-21-1
7-10-1
8-29-3
2-10-1
4-19-2
1-38-4
8-25-2
3-6-8
2-5-2
8-30-2
4-4-2
1-31-1
8-38-2
1-42-1
8-27-2
7-11-2
8-21-1
7-12-4
8-18-1
1-33-1
5-107-1
7-14-1
4-8-2
8-22-1
5-64-1
4-11-1
2-9-2
8-32-1
2-1-1
4-1-2
Quotient F2 / Col-0
Replikat A Replikat B
0,57
0,52
0,75
0,53
0,73
0,78
0,59
0,73
0,83
0,75
0,66
0,63
0,88
0,87
0,84
0,86
0,90
0,95
0,68
0,90
1,18
0,76
1,00
1,24
1,10
0,88
0,95
0,82
0,98
1,21
1,04
0,87
1,18
1,15
1,25
1,17
1,29
0,98
0,85
1,12
1,00
1,32
0,95
1,06
1,15
1,26
1,27
1,06
0,55
0,72
0,65
0,88
0,72
0,69
0,89
0,76
0,71
0,86
0,96
1,00
0,81
0,84
0,89
0,89
0,86
0,81
1,10
0,95
0,66
1,09
0,95
0,75
0,89
1,14
1,07
1,25
1,11
0,88
1,08
1,28
0,97
1,04
0,95
1,04
0,94
1,28
1,41
1,15
1,28
0,99
1,43
1,32
1,32
1,23
1,33
1,64
Resistenz in
Col-0
schwach
schwach
schwach
schwach
schwach
schwach
schwach
schwach
schwach
mittel
mittel
mittel
mittel
mittel
mittel
mittel
mittel
mittel
mittel
mittel
mittel
mittel
mittel
mittel
mittel
stark
stark
stark
stark
stark
stark
stark
stark
stark
stark
stark
stark
stark
stark
stark
stark
stark
stark
stark
stark
stark
stark
stark
Überlebende in pgm (%)
Replikat A Replikat B
10,6
62,5
1,0
0,0
9,9
0,0
39,0
63,2
0,0
0,0
0,0
2,1
0,0
2,5
0,0
3,3
2,1
1,3
1,9
66,7
0,0
100,0
0,0
5,1
6,1
43,8
2,8
8,5
0,0
2,9
0,0
0,7
1,7
49,6
0,0
0,0
11,4
3,4
1,4
6,8
37,7
6,1
1,0
0,0
71,4
0,8
1,1
61,7
13,8
57,1
1,1
0,0
23,5
0,0
32,7
55,7
0,0
5,7
0,0
10,7
0,0
16,7
0,0
5,2
2,2
0,0
0,8
33,3
2,5
66,7
2,6
0,0
6,0
23,2
6,1
3,4
9,1
1,4
8,1
0,8
2,0
82,0
0,0
6,3
6,1
0,0
1,7
16,4
55,7
0,0
3,2
0,0
76,9
3,7
0,0
46,6
Resistenz in
pgm
mittel
stark
schwach
schwach
mittel
schwach
mittel
stark
schwach
schwach
schwach
schwach
schwach
mittel
schwach
schwach
schwach
schwach
schwach
stark
schwach
stark
schwach
schwach
schwach
mittel
schwach
schwach
schwach
schwach
schwach
schwach
schwach
stark
schwach
schwach
schwach
schwach
schwach
mittel
mittel
schwach
schwach
schwach
stark
schwach
schwach
stark
81
3 E RGEBNISSE
Tabelle 3.10 (vorausgehende Seite) Tabellarische Auflistung des Resistenzgrades der selektierten EMS Mutanten im Col-0 und pgm Hintergrund. Der Resistenzquotient der untersuchten Mutationen im stärkehaltigen Col-0 Hintergrund wurde wie in Kapitel 2.10 beschrieben berechnet
und ist für beide Replikate der angegebenen Linien aufgelistet. Die Resistenz, welche die Mutation in Col-0 vermittelt, wurde anhand des (in der Tabelle nicht dargestellten) Mittelwertes der
Replikate wie folgt bewertet: < 0,8 = schwach; 0,8 bis 1,0 = mittel; > 1,0 = stark. Alle Linien
in dieser Tabelle sind anhand dieser Bewertung nach aufsteigender Resistenz in der Col-0 F2Population sortiert. Der Anteil der überlebenden Parentallinien im stärkefreien pgm Hintergrund
ist für beide Replikate in Prozent angegeben. Der Grad der Resistenz, welche die jeweilige Mutation in pgm bewirkt, wurde anhand der Mittelwerte beider Replikate bewertet (Mittelwerte sind
nicht gezeigt): 0 % bis 9 % = schwach; 10 % bis 49 % = mittel; 50 % bis 100 % = stark. Besonders vielversprechende pgm Suszeptibilitäts-Suppressor Kandidaten werden im Text diskutiert
und sind in Fettschrift hervorgehoben.
3.11 Genetische Charakterisierung potentieller Suppressormutanten
Von 12 verfügbaren Kartierungspopulationen potentieller Suppressormutanten (Tabelle
3.9) wurden 4 Kandidaten aus unterschiedlichen Parentalgruppen durchmustert. Kartierungspopulationen der Linien 3-6-8 (34 mg Samen), 7-16-2 (34 mg Samen), 8-181 (15 mg Samen) und 9-7-10 (42 mg Samen) wurden zusammen mit Col-0 und pgm
Kontrollen gleichmäßig auf Pflanzschalen ausgebracht und im Alter von 11 Tagen mit
C. higginsianum infiziert (Abbildung 3.19 A). Die Selektion überlebender Kandidaten
erfolgte 11 dpi entsprechend ihres Grades an Resistenz. Nach der Überführung der Kandidaten in neue Schalen (Abbildung 3.19 B) wurden Blattproben der einzelnen Individuen
für die Extraktion genomischer DNA und zur Analyse der Abwesenheit von Blattstärke
genommen (Abbildung 3.19 C). Insgesamt konnten 321 Individuen der Linie 3-6-8, 393
Individuen der Linie 7-16-2, 38 Individuen der Linie 8-18-1 und 264 Individuen der Linie
9-7-10 selektiert werden.
Um erste Hinweise auf den genomischen Lokus der für den Resistenzphänotyp relevanten Mutation zu erhalten, wurde eine PCR Analyse mit vereinigten DNA Extrakten mehrerer Individuen einer Linie (bulked segregant analysis) durchgeführt. Im ersten Durchgang wurden die Linie 3-6-8 mit intermediärem Resistenzphänotyp und die Linie 7-16-2
mit starkem Resistenzphänotyp untersucht. Vereinigte DNA Extrakte von je 42 Individuen wurden wie von Lukowitz et al. (2000) beschrieben mit SSLP Markern analysiert.
Da die Mutagenese an pgm Mutanten im Col-0 Hintergrund durchgeführt worden war,
ist eine Anreicherung von Col-0 spezifischen genomischen Sequenzen im Bereich der
gesuchten Mutation zu erwarten, die mit SSLP Markern nachgewiesen werden können.
Für beide Linien wurde eine starke Akkumulation des Col-0 spezifischen Fragmentes des
Markers nga 168 beobachtet (Abbildung 3.20 A), eine Analyse der einzelnen Individuen
82
3 E RGEBNISSE
Abbildung 3.19 Durchmusterung von Kartierungspopulationen. (A) Selektierte Mutanten der
M4 Generation wurden mit pgm Mutanten im Ler Hintergrund (N4351) gekreuzt. Nach Selbstbefruchtung der F1 Pflanzen wurden Pflanzen der F2 Generation mit C. higginsianum infiziert
und auf den Suszeptibilitätsphänotyp durchmustert. Diese F2 Pflanzen bildeten die Kartierungspopulation und wurden gleichmäßig auf Pflanzschalen angezogen. Im Randbereich der Schalen
dienten pgm (blau) und Col-0 (weiß) als Kontrollen. (B) Selektierte Pflanzen des Durchmusterungsexperimentes wurden zur weiteren Untersuchung in ein System mit 96 Kennungen überführt. (C) Der stärkefreie pgm Phänotyp von Blättern der selektierten Pflanzen wurden mit einer
Stärkefärbung bestätigt.
zeigte jedoch, dass Col-0 spezifische Fragmente an diesem Lokus nicht angereichert sind
(Tabellen A.5 und A.6). Der Marker nga 168 ist folglich nicht für bulked segregant Analysen geeignet. Im vereinigten Extrakt der Linie 3-6-8 war zudem eine Anreicherung des
Col-0 Fragmentes der Marker nga 162 und ciw 11 auf Chromosom 3 zu erkennen (Abbildung 3.20 A), die auch in weiteren Analysen bestätigt werden konnte (Tabelle A.5).
Die Analyse des DNA Extraktes der Linie 7-16-2 ergab hingegen deutliche Hinweise auf
eine Anreicherung von Col-0 Erbgut im Bereich der Marker ciw 8, PHYC und ciw 9 auf
Chromosom 5.
Analog wurden Kartierungspopulationen der Linie 8-18-1 mit intermediärem
Resistenzphänotyp und der Linie 9-7-10 mit starkem Resistenzphänotyp untersucht.
Die Analyse des vereinigten DNA Extraktes von 42 Individuen der Linie 9-7-10 ergab
eine Anreichung von Col-0 Fragmenten der Marker ciw 11, ciw 4 und nga 6 auf Chromosom 3, während keine eindeutigen Hinweise auf den gesuchten Lokus in der Linie 8-18-1
gefunden werden konnten (Abbildung 3.20 B).
Mit einer markergestützten Kartierung (Lukowitz et al., 2000; Jander et al., 2002) wurde der genomische Lokus der gesuchten Mutationen basierend auf den Ergebnissen der
bulked segregant analysis weiter eingegrenzt. Sofern keine genetische Kopplung zwischen der selektierten Mutation und einem genetischen Marker besteht, ist eine zufällige Segregation der genomischen Abschnitte aus den Ökotypen Col-0 und Ler während
83
3 E RGEBNISSE
Abbildung 3.20 Bulked segregant analysis von Kartierungspopulationen. Um Hinweise auf den
genomischen Lokus der für den Selektionsphänotyp relevanten Mutation in Pflanzen der Kartierungspopulationen zu erhalten, wurden DNA Extrakte von je 42 (Linien 3-6-8, 7-16-2, 9-7-10)
bzw. 38 (Linie 8-18-1) Individuen vereinigt und via PCR mit simple sequence length polymorphism (SSLP) Markern analysiert. Es wurde auf eine publizierte Kollektion von 22 SSLP Markern
zurückgegriffen, die relativ gleichmäßig über das Arabidopsis-Genom verteilt sind (Lukowitz
et al., 2000). (A) Bulked segregant analysis von Kartierungspopulationen der Linien 3-6-8 und 716-2. Für jeden Marker wurde, jeweils von links nach rechts, (1) Arabidopsis pgm N210 / N4351
F1 DNA als Kontrolle für einen gleichmäßigen Anteil an Col-0 und Ler DNA, (2) N4351 / 3-6-8
F2 DNA, (3) N4351 / 7-16-2 F2 DNA und (4) eine Wasserkontrolle untersucht und auf einem
2,5 % Agarosegel aufgetrennt. (B) Bulked segregant analysis von Kartierungspopulationen der
Linien 9-7-10 und 8-18-1. Für jeden Marker wurde (1) Arabidopsis pgm N210 / N4351 F1 DNA,
(2) 9-7-10 / N4351 F2 DNA, (3) 8-18-1 / N4351 F2 DNA und (4) eine Wasserkontrolle untersucht
und auf einem 2,5 % Agarosegel aufgetrennt. Sternchen markieren jeweils die Fragmentgröße
von Col-0 Transkripten.
84
3 E RGEBNISSE
der meiotischen Rekombination bei einer Selbstbefruchtung der F1 Pflanzen zu erwarten.
Da alle untersuchten Mutationen im genetischen Hintergrund des Ökotyps Col-0 erzeugt
wurden, erfolgte die Berechnung der Rekombinationsfrequenz eines betrachteten Lokus
mit folgender Formel:
R(%) =
A NZAHL HEZ · 1 + A NZAHL Ler · 2
G ESAMTZAHL · 2
Ein Lokus, welcher keine genetische Kopplung mit der Mutation aufweist auf deren
Phänotyp eine Pflanze selektiert wurde, hätte demnach eine Rekombinationsfrequenz von
50 %. Je niedriger die Rekombinationsfrequenz bei einem analysierten Lokus ist, desto
stärker ist die genetische Kopplung dieses Lokus mit der gesuchten Mutation.
Die weitere Kartierung der Linie 3-6-8 gestaltete sich aufgrund vieler potenziell falschpositiver Individuen schwierig und der Mutationsort konnte bislang lediglich auf einen
Bereich von circa 6 Megabasenpaaren (Mb) am oberen Arm von Chromosom 3 eingegrenzt werden (Tabelle A.5). Da in der bulked segregant analysis keine Hinweise für den
Lokus der Mutation der Linie 8-18-1 gewonnen werden konnten, wurden die einzelnen
selektierten Individuen mit Markern auf allen fünf Chromosomen getestet. Die Rekombinationsfrequenz lag lediglich am unteren Ende des zweiten Chromosoms unter 30 %,
für eine weitere Eingrenzung des Lokus wäre eine zusätzliche Kartierungspopulation notwendig (Tabelle A.7).
In der Linie 7-16-2 konnte eine niedrige Rekombinationsfrequenz im Bereich zwischen
den Markern ciw 8 und PHYC bestätigt werden. Ein relatives Minimum lag bei dem Marker nga 139 bei 8,43 Mb auf Chromosom 5 (Abbildung 3.21 A). Da in unmittelbarer
Nähe bei 8,38 Mb das Gen DMR6 lokalisiert ist, welches van Damme et al. (2005) in
einer Analyse H. parasitica-resistenter Mutanten gefunden hatten (siehe Kapitel 3.10),
wurde eine Sequenzierung dieses Genes in der Linie 7-16-2 durchgeführt. Es konnte eine Mutation im dritten Exon von DMR6 identifiziert werden, welche bei der Translation
zu einem Austausch von Aspartat zu Asparagin an Position 214 führt (Abbildung 3.21
B). DMR6 wurde als 2-Oxoglutarat-Fe(II) Oxygenase (Pfam PF03171) beschrieben, bei
der das katalytische Zentrum die drei Eisen-bindenden Aminosäuren Histidin 212, Aspartat 214 und Histidin 268 beinhaltet (Abbildung 3.21 C; Roach et al., 1997; van Damme
et al., 2008). Die Autoren beschrieben die Nullmutante dmr6-1 im genetischen Hintergrund von Ler/eds1-2 sowie die Mutante dmr6-2 mit einer T-DNA Insertion in Intron 2 im
genetischen Hintergrund von Ws-4. Die induzierte Mutation in Linie 7-16-2 führt durch
den D214N-Austausch vermutlich zur Zerstörung des katalytischen Zentrum in DMR6
(Abbildung 3.21 C), weshalb das Allel dieser Mutation als dmr6-3 bezeichnet wurde.
85
3 E RGEBNISSE
Abbildung 3.21 Linie 7-16-2 trägt eine Mutation im katalytischen Zentrum des DMR6-Gens. (A)
Die Kartierung der Mutation in 7-16-2, welche Resistenz gegen C. higginsianum vermittelt, ergab ein relatives Rekombinationsminimum für den genetischen Marker nga 139 auf Chromosom
5. Die Position verwendeter Marker auf Chromosom 5 ist schematisch dargestellt, detaillierte
Ergebnisse der Kartierung sind in Tabelle A.6 aufgelistet. (B) Bei einer Sequenzierung des 50
Kilobasenpaare entfernten Gens DMR6 wurde eine Punktmutation in Exon 3 identifiziert, die zu
einem Aminosäureaustausch von Aspartat 214 zu Asparagin im katalytischen Zentrum der mutmaßlichen Oxidoreduktase DMR6 führt. (C) In diesem Modell nach Roach et al. (1997, PDB
1BK0) sind die Aminosäuren Histidin 212, Aspartat 214 und Histidin 268 hervorgehoben, welche ein Eisenatom im katalytischen Zentrum der 2-Oxoglutarat-Fe(II) Oxygenase Isopenicillin N
Synthase koordinieren.
Birker (2008) hatte bereits gezeigt, dass dmr6-1 auch eine starke Resistenz gegenüber
C. higginsianum aufweist. Die Genfunktion von DMR6, welche die Resistenz gegenüber
den untersuchten Pathogenen vermittelt, ist jedoch unbekannt.
Während dmr6-3 eine PGM unabhängige Resistenz gegen C. higginsianum vermittelt,
wurde die Linie 9-7-10 als pSSK identifiziert (Tabelle 3.10). Die stärkefreie Linie 9-7-10
weist einen Wachstumsphänotyp mit schmalen, gezähnten Blättern und einem reduzierten Rosettendurchmesser auf (Abbildung 3.22). Eine Marker- gestützte Kartierung dieser
Linie ergab eine sehr niedrige Rekombinationsfrequenz zwischen den Markern ciw 4 und
nga 6 auf dem unteren Arm von Chromosom 3 (Abbildung 3.23). Da im Bereich zwischen ciw 4 und nga 6 das Gen PMR6 liegt, welches für eine Pektatlyase kodiert deren
Verlust eine reduzierte Suszeptibilität für Mehltau bedingt (Vogel et al., 2002), wurde eine
Sequenzierung von PMR6 in 9-7-10 durchgeführt. Es konnte eine Punktmutation in Exon
zwei festgestellt werden, die einen Aminosäureaustausch von Prolin 129 zu Glutamin
bewirkt (Abbildung 3.24 A). Eine Modellierung von PMR6 auf Basis der Struktur von
Pektatlyase E aus Erwinia chrysanthemi (PDB 1AIR; Lietzke et al., 1996) zeigte jedoch
86
3 E RGEBNISSE
Abbildung 3.22 Wachstums-Phänotyp der resistenten stärkefreien Linie 9-7-10.
(A) Resistenzphänotyp von Keimlingen der
Linie 9-7-10. Keimlinge der pgm Mutante
(oben) und der Linie 9-7-10 (unten) wurden
im Alter von 9 Tagen mit C. higginsianum
infiziert und 10 dpi fotografiert. (B) Wachstumsphänotyp der pgm Mutante (oben) und
der Linie 9-7-10 (unten) im Alter von 4 Wochen in einem 12h/12h Licht-/Dunkelzyklus.
(C) Stärke in Blättern von Col-0 (links) sowie
der in (B) gezeigten Rosetten von pgm (mitte) und 9-7-10 (rechts) wurde zum Ende der
Lichtphase mit Jod-Kaliumjodid angefärbt.
keine strukturelle Veränderung von PMR6 aufgrund des Austausches (Abbildung 3.24 B).
Zudem ist die betroffene Aminosäure räumlich nicht in der Nähe des mutmaßlichen katalytischen Zentrums oder der Calcium-Bindestelle des Enzyms lokalisiert (Scavetta et al.,
1999; Vogel et al., 2002). Mit weiteren SSLP Markern konnte im Bereich zwischen 21,3
und 21,7 Mb eine Rekombinationsfrequenz von unter 1 % bestimmt werden (Abbildung
3.23).
Der Bereich der angrenzenden Marker 3-9081 und 3-9336 umfasst den Bereich zwischen 21,1 und 21,9 Mb auf Chromosom 3. In diesem genomischen Bereich liegen 310
Gene, von denen 13 Gene und ein Gen-Cluster mögliche Kandidaten für eine erhöhte
Resistenz in der Linie 9-7-10 darstellen könnten (Tabelle A.9). Darunter sind 3 Gene,
welche für β -1,3-Glucanasen kodieren. BGL2/PR2 (At5g57260) und BG3 (At5g57240)
sind im Apoplasten lokalisiert (Boudart et al., 2005) und könnten an der Erkennung von
PAMPs beteiligt sein. BG1 (At5g57270) ist homolog zu BG3 und kodiert ebenfalls für ein
vermutlich apoplastisch lokalisiertes Protein. Zudem könnten 6 potentiell für zellwandmodifizierende Enzyme kodierende Gene des betrachteten Genombereichs den Resistenzphänotyp von 9-7-10 begründen. Diese sind als Polygalacturonasen (At3g57510, ADPG3; At3g57790), Pektinmethylesterase (At3g59010, PME35), Galacturonosyltransferase (At5g58790, GAUT15), extrazellulär lokalisierte Glycosyltransferase (At3g57380)
bzw. als potentielles Arabinogalactanprotein (At3g57690, AGP23) annotiert. Da Callose
und Callose Synthasen an zahlreichen Abwehreaktionen beteiligt sind (Luna et al., 2011),
könnten auch die mutmaßliche Callose Synthase GSL11 (At3g59100) und das Glukan-
87
3 E RGEBNISSE
Abbildung 3.23 Genetische Kartierung der EMS Mutante 9-7-10. Schematisch dargestellt ist
die Rekombinationsfrequenz genetischer Marker in einem Abschnitt auf dem unteren Chromosomenarm von Chromosom 3. Die niedrigste Rekombinationsfrequenz wurde im Bereich zwischen 21,3 und 21,7 Megabasenpaaren (Mb) festgestellt. Die beiden Individuen #50 und #109 der
Kartierungspopulation zeigen Rekombination innerhalb dieses Bereiches, ergeben jedoch widersprüchliche Resultate in Bezug auf den Marker pss 7. Die Position des suszeptibilitätsassoziierten
Pekatlyasegens PMR6 ist zum Vergleich angegeben. Detaillierte Ergebnisse der einzelnen Marker
für die Kartierung sind in Tabelle A.8 aufgelistet.
bindende Protein PDCB5 (At3g58100) die Interaktion mit phytopathogenen Pilzen beeinflussen. Die Transkriptionsfaktoren BZIP61 (At3g58120) und WRKY69 (At3g58710)
sind generell pathogenresponsiv (Genevestigator, Zimmermann et al., 2004; Grewal et al.,
2012) und in der Interaktion mit C. higginsianum differentiell reguliert (Microarray Expressionsdaten aus Engelsdorf, 2008).
Innerhalb des Genombereiches zwischen 21,1 und 21,9 Mb auf Chromosom 3 befindet sich zudem ein genomischer Abschnitt der für 18 TRAF (tumor necrosis factor receptor associated factor)-ähnliche Proteine mit MATH Domäne kodiert (Cosson et al.,
2010). Durch einen Sequenzvergleich der Ökotypen Col-0 und Ler konnten vier weitere
Marker entworfen werden, um die Kartierung weiter zu verbessern. Mit zwei SSLP Markern (pss 2, pss 3) und zwei SNP Markern (pss 7, pss 8) wurden die Individuen #50 und
#109 weiter untersucht. Überraschenderweise wurde in #50 ein Rekombinationsereignis
centromerisch von pss 7 und in #109 ein Rekombinationsereignis telomerisch von pss 7
gefunden, was eine übereinstimmende an Col-0 gekoppelte Mutation in beiden Individuen ausschließen müsste (Abbildung 3.23). Bemerkenswerterweise liegen 9 der Gene des
TRAF-Clusters centromerisch und 9 der Gene telomerisch von pss 7. Dies könnte bedeuten, dass in den Kartierungsindividuen #50 und #109 jeweils Mutationen in einer Hälfte
88
3 E RGEBNISSE
Abbildung 3.24 PMR6 ist in der EMS
Mutante 9-7-10 nicht strukturell beeinträchtigt. (A) Eine Sequenzierung des
suszeptibilitätsassoziierten
Pekatlyasegens
PMR6 in der Mutante 9-7-10 zeigte eine
Punktmutation in Exon 2, welche zu einem
Austausch von Prolin 129 gegen Glutamin
führt. (B) Eine Modellierung von PMR6 auf
Basis der Struktur von Pektatlyase E aus
Erwinia chrysanthemi (PDB 1AIR; Lietzke
et al., 1996) mit SWISS-MODEL (Arnold
et al., 2006) ergab jedoch keine Hinweise
für strukturelle Veränderungen von PMR6
aufgrund des Austausches. Glutamin 129 ist
in gelb hervorgehoben, während die vorhergesagten Reste des katalytischen Zentrums
und der Calcium-Bindestelle nach Vogel et al.
(2002) in rot und blau dargestellt sind.
des Clusters zu dem beobachteten Resistenzphänotyp von 9-7-10 führen könnten. TRAFs
haben in Säugetierzellen wichtige Funktionen in der angeborenen und der adaptiven Immunantwort (Chung et al., 2002). Nach einer Vorhersage der AtPID (Arabidopsis thaliana
Protein Interactome Database, Cui et al., 2008) interagieren zweimal 2 TRAF-ähnliche
Proteine und eine Gruppe von 7 TRAF-ähnlichen Proteinen miteinander (Abbildung 3.25
C). Interessanterweise sind 5 der Proteine der großen Interaktionsgruppe centromerisch
von pss 7 (At3g58210, At3g58240, At3g58250, At3g58260, At3g58270) und 2 der Proteine telomerisch von pss 7 (At3g58350, At3g58380) kodiert. Auch die beiden Gene einer
Interaktionspaarung (At3g58290, At3g58410) liegen dies- bzw. jenseits des Markers (Abbildung 3.25 C).
Eine Analyse mit der Gen-Coexpressionsdatenbank ATTED-II (Obayashi et al., 2009)
zeigte eine Coexpression zweier TRAF-ähnlicher Gene mit Genen, welche für wichtige
Proteine des Kohlenhydratstoffwechsels und der Stressreaktion von Arabidopsis kodieren.
Zum einen ist das TRAF-ähnliche Gen At3g58290 mit den Zuckertransportergenen STP2
(Truernit et al., 1999; Fotopoulos et al., 2003) und SWEET8 (Chen et al., 2010) sowie
dem Phosphattransporter PHT1;6 (Mudge et al., 2002) coexprimiert (Abbildung 3.25 A).
Zum anderen ist das von Cosson et al. (2010) charakterisierte TRAF-ähnliche Gen RTM3
(At3g58350) mit den Saccharose Synthase Genen SUS5 und SUS6 (Baud et al., 2004;
Baroja-Fernández et al., 2012), mit zwei Genen des Redox Metabolismus (At4g35970,
APX5; At1g02950, GSTF4), sowie den beiden Reticulon (Pfam PF02453)-ähnlichen
89
3 E RGEBNISSE
Genen RTLNB9 (At3g18260) und RTLNB14 (At1g68230) coexprimiert (Abbildung 3.25
B). Vor kurzem hatten Lee et al. (2011) gezeigt, dass die Proteine RTLNB1 und RTLNB2
mit dem Flagellinrezeptor FLS2 interagieren. Das TRAF-ähnliche Protein RTM3 ist an
der Resistenz von Arabidopsis gegen Potyviren beteiligt und interagiert mit sich selbst
sowie dem Potyvirus-Resistenzprotein RTM1 (Chisholm et al., 2000; Cosson et al.,
2010). Der rund 61 Kilobasen große Cluster TRAF-ähnlicher Gene am unteren Arm
des Arabidopsis Chromosom 3 ist ein besonders interessanter Kandidat für die weitere
Analyse der EMS-Mutante 9-7-10, da die genetische Kartierung die am dichtesten beieinander liegenden Rekombinationsereignisse in diesem Bereich ergab und die potentielle Co-Regulation mit Kohlenhydratstoffwechselgenen und stressresponsiven Genen eine
pgm-spezifische Resistenz gegen C. higginsianum erklären könnte.
90
3 E RGEBNISSE
Abbildung 3.25 in silico Coexpressions- und Interaktionsanalyse TRAF-ähnlicher Gene im Bereich der resitenzvermittelnden Mutation in 9-7-10. In der Gen-Coexpressionsdatenbank ATTEDII (Obayashi et al., 2009) wurde nach der Coexpression bekannter Gene des Kohlenhydratstoffwechsels und der Stressantwort in Arabidopsis mit TRAF-ähnlichen Genen des TRAF-Clusters
am untern Arm von Chromosom 3 gesucht. (A) Das TRAF-ähnliche Gen At3g58290 ist mit
den Zuckertransportergenen STP2 (At1g07340) und SWEET8 (At5g40260), sowie dem Phosphattransporter PHT1;6 (At5g43340) coexprimiert. (B) Das TRAF- ähnliche Gen RTM3 (At3g58350)
ist mit den Saccharose Synthase Genen SUS5 (At5g37180) und SUS6 (At1g73370), mit zwei Genen des Redox-Metabolismus (At4g35970, APX5; At1g02950, GSTF4), sowie den beiden potentiell an der MTI-abhängigen Abwehrantwort beteiligten Reticulon (Pfam PF02453)-ähnlichen
Gene RTLNB9 (At3g18260) und RTLNB14 (At1g68230) coexprimiert. Die Sucheingabe ist jeweils gelb hinterlegt, oben genannte coexprimierte Gene sind grün umrandet. Farbige Punkte
markieren Gene, die zu übereinstimmenden Stoffwechselwegen zugeordnet wurden. (C) Interaktionsvorhersage TRAF-ähnlicher Proteine, welche in dem untersuchten TRAF-Cluster codiert
sind. Die Vorhersage durch die Arabidopsis thaliana Protein Interactome Database (Cui et al.,
2008) basiert auf einer phylogenetischen Methode zur Vorhersage von Coevolution oder auf einer Genfusionsmethode, welche die Fusion von homologen Proteinen in anderen Organismen als
Indiz für eine Interaktion wertet.
91
4 Diskussion
Spezifische Erkennungs- und Abwehrmechanismen gegenüber Pathogenen wurden in den
letzten Jahren intensiv untersucht. Diese Bemühungen führten zu einer deutlich erweiterten Kenntnis über die Rolle von Rezeptor-ähnlichen Kinasen und Pathogen-exprimierten
Effektormolekülen, welche das Resultat mikrobieller Infektionen wechselseitig beeinflussen (Jones und Dangl, 2006; Boller und Felix, 2009). Über die Rolle des primären
Stoffwechsels von Wirtspflanzen für die Etablierung von Suszeptibilität oder Resistenz
ist hingegen wenig bekannt, obwohl schon früh ein Einfluss veränderter Metabolitgehalte
des Wirtes auf Pflanze-Pathogen-Interaktionen beobachtet wurde. Horsfall und Dimond
(1957) berichteten, dass die chemisch induzierte Akkumulation löslicher Zucker in Tomatenblättern die Suszeptibilität für obligat biotrophe Pilze erhöhte, während nekrotrophe Pilze von einem chemisch induzierten Zuckermangel profitierten. Nach Pathogenbefall akkumulieren zudem in vielen Pflanze-Pathogen-Interaktionen lösliche Zucker in
infiziertem Gewebe (Berger et al., 2007).
4.1 Die Kohlenhydratverfügbarkeit in Arabidopsis beeinträchtigt die
Suszeptibilität für C. higginsianum
Stärkefreie Arabidopsis-Mutanten akkumulieren hohe Gehalte löslicher Zucker während
der Lichtphase, wohingegen die diurnale Kohlenhydratverfügbarkeit in diesen Mutanten
gegenüber Wildtyp-Pflanzen stark reduziert ist (Caspar et al., 1985; Lin et al., 1988).
Analysen der diurnalen Kohlenhydratgehalte in den stärkefreien Mutanten pgm und
adg1-1 in der vorliegenden Arbeit ergaben einen zehnfach erhöhten Gehalt löslicher Zucker in einem 12 h / 12 h Licht- / Dunkelzyklus, während die Kohlenhydratakkumulation
in der Lichtphase um 60% gegenüber dem Wildtyp verringert war. Trotz der stark erhöhten Akkumulation löslicher Zucker war das diurnale Kohlenhydratbudget aufgrund der
fehlenden transitorischen Stärke daher stark reduziert. In einem 12 h / 12 h Licht- / Dunkelzyklus sind stärkefreie pgm Mutanten einer nächtlichen Hungerphase ausgesetzt, die
zu einer Repression von Stoffwechselprozessen und Wachstum zum Ende der Dunkelphase und zu Beginn der folgenden Lichtphase führen (Gibon et al., 2004b; Wiese et al.,
2007). Die Anzucht von pgm Mutanten in einer verlängerten Lichtphase von 20 h konnte
92
4 D ISKUSSION
die Wachstumsrepression nahezu aufheben, während die Gehalte löslicher Zucker in der
Lichtphase hoch und das diurnale Kohlenhydratbudget niedrig blieben. Unabhängig von
der Dauer der Lichtphase wurde eine positive Korrelation zwischen der Akkumulation
löslicher Zucker in der Lichtphase und der Suszeptibilität für C. higginsianum beobachtet. Im Gegensatz dazu wurde eine starke negative Korrelation zwischen der Akkumulation an Gesamt-Kohlenhydraten in der Lichtphase und der Suszeptibilität für das Pathogen
festgestellt, da sowohl stärkefreie Mutanten als auch Mutanten mit einer beeinträchtigten
Stärkemobilisierung eine stark erhöhte Suszeptibilität gegenüber C. higginsianum zeigten. In Anbetracht dieser Beobachtungen stellte sich die Frage, welcher dieser Aspekte
des veränderten Kohlenhydratstoffwechsels kausal für die erhöhte Suszeptibilität stärkefreier Mutanten gegenüber C. higginsianum verantwortlich war.
Durch den Vergleich der relativen pilzlichen Proliferation in Mutanten des Stärkestoffwechsels und Wildtyp-Pflanzen in Lichtphasen mit einer Dauer von 12 h bzw. 20 h konnte
gezeigt werden, dass die erhöhte Suszeptibilität der Mutanten unabhängig von der Dauer
des nächtlichen Kohlenhydratmangels war. Darüberhinaus deuten diese Daten darauf hin,
dass auch die Dauer der täglichen Verfügbarkeit löslicher Zucker die Suszeptibilität der
Stärkestoffwechsel-Mutante relativ zum Wildtyp nicht beeinflusst.
Eine Untersuchung der pathogeninduzierten Kohlenhydratakkumulation verschiedener
Mutanten des Kohlenhydratstoffwechsels ergab keine klaren Korrelationen zwischen der
Akkumulation einzelner Zucker und der Suszeptibilität der unterschiedlichen Genotypen. Während Fruktose und Saccharose in allen untersuchten Genotypen nach Infektion
mit C. higginsianum akkumulierten, veränderten sich die Glukosegehalte uneinheitlich.
In den stärkefreien Mutanten pgm und adg1-1 wurde ein verringerter Glukosegehalt nach
Infektion gemessen, während im Wildtyp keine Änderung festgestellt wurde. Da im Wildtyp jedoch der Gehalt an Stärke nach Infektion deutlich reduziert ist, scheint der Glukosespeicher stärkefreier Mutanten in der Interaktion mit C. higginsianum anstelle des fehlenden Stärkespeichers reduziert zu werden. Die im Infektionsverlauf sinkenden Gehalte
von Stärke im Wildtyp, bzw. von Glukose in pgm und adg1-1 könnten entweder durch die
erhöhte Zuckeraufnahme pilzlicher Hyphen oder durch einen erhöhten Kohlenstoffbedarf
induzierter Wirts-Abwehrantworten verursacht werden.
Dunkel-induzierter Kohlenhydratmangel erhöhte sowohl in stärkefreien Mutanten als
auch in Wildtyp-Pflanzen die Suszeptibilität gegenüber C. higginsianum. Daraus kann
gefolgert werden, dass sehr niedrige Gehalte löslicher Zucker das Wachstum von
C. higginsianum nicht begrenzen. Es erscheint daher wahrscheinlicher, dass der beobachtete erhöhte Kohlenstoffbedarf nach Infektion für Abwehrreaktionen des Wirtes aufgewendet wird. Durch systematische Verdunkelungen verschiedener Lichtphasen nach ei-
93
4 D ISKUSSION
ner Infektion konnte darüberhinaus gezeigt werden, dass sich ein Kohlenstoffmangel im
Wildtyp besonders während der nekrotrophen Wachstumsphase von C. higginsianum auf
die Suszeptibilität auswirkt. Eine um 24 h verlängerte Dunkelphase erhöhte die Suszeptibilität gegenüber C. higginsianum nur, wenn die dritte Lichtphase, nicht aber die erste
oder die zweite Lichtphase nach einer Infektion verdunkelt wurde. Während der nekrotrophen Interaktionsphase ist die pilzliche Proliferation stark erhöht, weshalb sich eine
Begrenzung von Abwehrreaktionen durch Kohlenhydratmangel in dieser Phase der Interaktion besonders stark auswirken könnte.
In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen wiesen zwei unabhängige ArabidopsisGenotypen mit nächtlichen Kohlenstoffmangelphasen eine erhöhte Suszeptibilität für
C. higginsianum auf. In Doppelmutanten der zentralen Regulatoren der circadianen
Rhythmik, CCA1 und LHY, ist der transitorische Stärkespeicher aufgrund eines verkürzten circadianen Zyklus vor Ende der Dunkelphase verbraucht (Graf et al., 2010). Diese
Mutanten hatten darüberhinaus ein reduziertes diurnales Kohlenhydratbudget und einen
kleinwüchsigen Phänotyp. Da der Kohlenhydratspeicher in cca1/lhy Mutanten, vergleichbar wie in pgm Mutanten, vor Ende der Dunkelphase verbraucht ist, ist anzunehmen, dass
auch die Kohlenhydratverwertung und die Wachstumsrhythmik, vergleichbar beeinträchtigt sind (Gibon et al., 2004b; Wiese et al., 2007). In cca1/lhy Mutanten konnte eine stark
erhöhte Suszeptibilität gegenüber C. higginsianum nachgewiesen werden. Die transgene
Überexpression des NADP-Malat Enzyms aus Mais (MEm) in Arabidopsis führt zu einem
reduzierten Gehalt an organischen Säuren und einer beeinträchtigten nächtlichen Zellatmung unter Kurztagbedingungen (Zell et al., 2010). Eine Infektion der MEm-Mutanten
unter verschiedenen Lichtbedingungen zeigte, dass die Suszeptibilität diser Mutanten
nur unter Kurztagbedingungen, nicht aber in einem 12h / 12h Licht- / Dunkelzyklus erhöht war. Dies deutet darauf hin, dass die Interaktion mit C. higginsianum auch in dieser
Mutante durch Kohlenstoffmangel beeinträchtigt wird.
Zusammengenommen konnte mit diesen Experimenten gezeigt werden, dass der reduzierte diurnale Kohlenhydratmangel und nicht der erhöhte Gehalt löslicher Zucker oder
die Dauer der Kohlenhydratmangelphase in stärkefreien Arabidopsis-Mutanten zu einer
erhöhten Suszeptibilität gegenüber C. higginsianum führt.
4.1.1 Die Kohlenhydratverfügbarkeit begrenzt das Ausmaß induzierter
Abwehrreaktionen
In Analysen zur Suszeptibilität von Mutanten mit Beeinträchtigungen in pathogeninduzierten Abwehrsignalwegen gegenüber C. higginsianum wurde gezeigt, dass SA- und ET-
94
4 D ISKUSSION
abhängige Abwehrsignale zu einer wirksamen Abwehrantwort beitragen, während JAabhängige Signale die Suszeptibilität nicht beeinflussten (O’Connell et al., 2004; Liu
et al., 2007). Allerdings wurde auch berichtet, dass Transkripte der JA/ET-abhängigen
PR-Gene PR-4 und PDF1.2 früher akkumulierten als Transkripte der SA-abhängigen PR2 und PR-5 (Narusaka et al., 2004). Es stellte sich daher die Frage, ob SA-abhängige
Abwehrreaktionen durch C. higginsianum unterdrückt werden, zumal diese, in Analogie
zu der Abwehr gegen obligat biotrophe Pilze, in der biotrophen Interaktionsphase besonders wirksam sein könnten.
Freie SA akkumulierte nach Infektion mit C. higginsianum in allen Genotypen und korrelierte positiv mit dem Grad der Symptomausbildung. Zu einem frühen Zeitpunkt nach
der Infektion war die Akkumulation freier und glycosilierter SA in stärkefreien Mutanten
stark erhöht. Im Gegensatz dazu wurden 4 dpi nur stark erhöhte Gehalte freier SA gemessen, während SA-Glucoside deutlich gegenüber dem Wildtyp reduziert waren. Die
SA-Gesamtmenge war in stärkefreien Mutanten 4 dpi um rund 40% reduziert. Zusammengefasst bedeutet dies, dass die SA-Akkumulation in stärkefreien Mutanten zu einem
späten Zeitpunkt der Infektion begrenzt war, während nahezu die gesamte SA in freier
Form vorlag. In Wildtyp-Pflanzen war der größte Teil der SA hingegen glycosiliert.
Die Glycosilierung freier SA wird durch pathogeninduzierte Glycosyltransferasen katalysiert (Vlot et al., 2009) und könnte in den Mutanten durch akuten Kohlenhydratmangel
begrenzt sein. In sex1-1 Mutanten lag sowohl der Gehalt an freier SA, als auch der Anteil
freier SA am Gesamt-SA Gehalt zwischen den Werten der stärkefreien Mutanten und des
Wildtyps, was gut mit dem intermediären Suszeptibilitätsphänotyp der Mutante in Verbindung zu bringen ist. Freie SA wird als die physiologisch aktive Form zur Induktion SAabhängiger Genexpression angesehen (Vlot et al., 2009). Obwohl freie SA in den stärkefreien Mutanten dreimal stärker akkumulierte als im Wildtyp, wurde jedoch keine erhöhte
Expression der SA-abhängigen PR-Gene PR-1 und PR-2 beobachtet. Da auch die Akkumulation der JA/ET-abhängig exprimierten PR-Gene PDF1.2 und PR-4 in stärkefreien
Mutante verzögert war, scheint das eingeschränkte Ansprechen SA-abhängiger Abwehrsignale nicht auf einem Antagonismus zwischen den Hormonsignalwegen zu beruhen.
Dagegen könnte der Kohlenhydratmangel stärkefreier Mutanten den Umfang an Abwehrsignalen hormonunspezifisch beeinflussen. Es ist bereits bekannt, dass SA-insensitive
Mutanten eine erhöhte Suszeptibilität gegenüber C. higginsianum haben, während keine veränderte Suszeptibilität von JA-insensitiven Mutanten beobachtet wurde (O’Connell
et al., 2004; Liu et al., 2007). Um zu überprüfen, ob JA/ET-abhängige Abwehrsignale die
Suszeptibilität in pgm beeinflussen wurden Doppelmutanten mit Mutationen in PGM und
COI1 untersucht. Interessanterweise war die Suszeptiblität von coi1/pgm Doppelmutan-
95
4 D ISKUSSION
ten gegenüber C. higginsianum im Vergleich zu pgm reduziert, während die Suszeptibilität von coi1 und Col-0 vergleichbar war. Dieses Ergebnis zeigt erstens, dass die JA/ETabhängige Abwehrantwort nicht an der Suszeptibilität von pgm beteiligt ist. Zweitens legt
es die Vermutung nahe, dass durch das Abschalten der JA/ET-abhängigen Abwehrantwort
andere Abwehrreaktionen in pgm weniger limitiert sind, welche eine größere Wirksamkeit gegen C. higginsianum aufweisen.
Das Pathogen-abhängig akkumulierende Phytoalexin Camalexin trägt zur Begrenzung
der Suszeptibilität von Arabidopsis gegenüber C. higginsianum bei (Narusaka et al.,
2004) und akkumulierte in stärkefreien Mutanten zu einem frühen Zeitpunkt der Interaktion stärker als in Wildtyp-Pflanzen. Die maximale Akkumulation von Camalexin war
in pgm und adg1-1 allerdings, analog zu den SA-Gehalten, geringer als im Wildtyp. Eine
Begrenzung der SA- und Camalexingehalte durch stärkere Nekrotisierung des Blattgewebes als in Wildtyp-Pflanzen kann ausgeschlossen werden, da die stärkefreien Mutanten
auch in der Interaktion mit dem obligat biotrophen Mehltaupilz E. cruciferarum signifikant geringere Mengen an SA- und Camalexin akkumulierten. Mit einer Analyse löslicher Phenylpropane wurde zudem gezeigt, dass auch die Gehalte nicht abwehrbezogener
Sekundärmetabolite in infizierten Blättern, nicht aber in Kontrollblättern der Mutanten
pgm und sex1-1 im Vergleich zum Wildtyp deutlich reduziert sind. Dies deutet auf eine
limitierte Kapazität zur Synthese von Sekundärmetaboliten in infizierten Mutanten mit
Kohlenhydratmangel hin, da sowohl die Gehalte nicht abwehrbezogener Phenylpropane,
als auch die pathogeninduzierte Akkumulation von SA und Camalexin in pgm gegenüber
Wildtyp-Pflanzen reduziert sind.
In Übereinstimmung mit diesen Beobachtungen zeigte eine mikroskopische Analyse
pilzlicher Penetrationsstellen unter Appressorien von C. higginsianum eine reduzierte Ablagerung des β -1,3-Glukans Callose in pgm und sex1-1. Obwohl der Anteil an Infektionsstellen mit Callose Ablagerungen in nicht-adaptierten Colletotrichum spp. gegenüber dem
adaptierten C. higginsianum deutlich erhöht ist, ist es bisher jedoch unklar ob diese Auflagerungen zu Penetrationsresistenz gegen C. higginsianum beitragen oder ob sie vielmehr
eine Folge nicht erfolgreicher Penetration sind (Shimada et al., 2006).
Analysen der photorespiratorischen Mutanten shmt und cat2 unterstützen die Vorstellung einer kohlenstoffabhängig begrenzten Kapazität der Abwehrantwort in Arabidopsis
(Moreno et al., 2005; Chaouch et al., 2010). Hinweise auf eine Anpassung zwischen
der Kohlenhydratverfügbarkeit und Abwehrantworten wurden kürzlich von Wang et al.
(2011) veröffentlicht. Sowohl basale, als auch R-Gen-abhängige Abwehrsignale werden
von CCA1, einem zentralen Bestandteil der circadianen Uhr, beeinflusst und sind zu
Beginn der Lichtphase stärker ausgeprägt als zu Beginn der Dunkelphase. In Überein-
96
4 D ISKUSSION
stimmung mit dieser Beobachtung ist die Suszeptibiltät von Arabidopsis für den biotrophen Oomyceten Hyaloperonospora arabidopsidis bei Infektionen zu Beginn der Dunkelphase deutlich erhöht (Wang et al., 2011). In der Interaktion zwischen Arabidopsis
und C. higginsianum konnte eine vergleichbare Tendenz festgestellt werden. Bei einer
Infektion zu Beginn der Lichtphase war die quantifizierte Pilzmenge tendenziell geringer
als bei einer Infektion zu Beginn der Dunkelphase, ein statistisch signifikanter Unterschied wurde bei drei biologischen Replikaten allerdings nicht festgestellt. Die Suszeptibilität der stärkefreien pgm Mutante war im Gegensatz dazu tendenziell nach Infektionen
zu Beginn der Lichtphase erhöht, was darauf hindeutet, dass der akute Kohlenhydratmangel in dieser Mutante den Einfluss der circadianen Abwehrregulation überschreibt. In
pgm Mutanten ist neben der transkriptionellen Regulation kohlenstoffabhängig exprimierter Gene auch die Expression vieler Gene der circadianen Rhythmik gegenüber dem Wildtyp verändert. Die diurnale Expression von CCA1 ist im Vergleich zum Wildtyp allerdings kaum beeinträchtigt (Bläsing et al., 2005). In der Interaktion zwischen Arabidopsis
und E. cruciferarum war die Resistenz stärkefreier Mutanten gegenüber Wildtyp-Pflanzen
wiederum nach Infektionen zu Beginn der Lichtphase tendenziell stärker ausgeprägt, während im Wildtyp kein Einfluss der Infektionszeit auf das pilzliche Wachstum beobachtet
wurde. Folglich scheint auch in dieser Interaktion, in der die Kohlenhydratversorgung des
Pathogens durch pgm begrenzt ist, die Kohlenhydratverfügbarkeit von größerer Bedeutung zu sein, als die circadiane Regulation der Abwehrantwort.
Im Gegensatz zu der Interaktion mit C. higginsianum begünstigt die gedämpfte
Abwehrantwort in stärkefreien Arabidopsis-Mutanten das Wachstum von E. cruciferarum
nicht. Die Akkumulation freier SA war in allen Genotypen unterdrückt, was auf eine prinzipiell effektivere Unterdrückung der Wirts-Abwehrantwort durch das obligat biotrophe
Pathogen hindeutet. Obwohl die Akkumulation von SA und Camalexin in den Mutanten
im Vergleich zum Wildtyp reduziert war, hatten sie gegenüber dem Mehltaupilz eine deutlich reduzierte Suszeptibilität. Es ist daher anzunehmen, dass die begrenzte Kohlenhydratverfügbarkeit in den Mutanten das Wachstum des Pilzes direkt begrenzt und daher in der
Interaktion mit obligat biotrophen Pilzen als Resistenzfaktor betrachtet werden kann. Eine vergleichbare Beobachtung war für die Suszeptibilität der variegierten Gersten albostrians Mutanten gemacht worden. Während die photosynthetisch inaktiven Blätter eine
erhöhte Resistenz gegen den Gersten-Mehltaupilz Blumeria graminis aufwiesen, waren
sie hypersuszeptibel für den hemibiotrophen Pilz Bipolaris sorokiniana (Jain et al., 2004;
Schäfer et al., 2004). Die Kohlenhydratverfügbarkeit in Wirtspflanzen beeinflusst folglich sowohl die Abwehrantwort, als auch die Ernährung von Pathogenen, und kann sich
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4 D ISKUSSION
daher in unterschiedlichen Pflanze-Pathogen-Interaktionen völlig unterschiedlich auf die
Krankheitsentwicklung auswirken.
4.1.2 Die Penetrationsresistenz gegenüber C. higginsianum ist in Mutanten des
Stärkestoffwechsels beeinträchtigt - Welche Rolle spielen dabei
Glucosinolate?
Eine mikroskopische Analyse der Hyphenentwicklung von C. higginsianum zeigte, dass
Infektionsvesikel in den Stärkestoffwechsel-Mutanten pgm und sex1-1 früher gebildet
wurden als im Wildtyp. Diese frühe Entwicklung direkt nach der Penetration deutet darauf
hin, dass die Penetrationsresistenz in den Mutanten beeinträchtigt ist. An der Penetrationsresistenz gegen biotrophe Pilze und nicht adaptierte Colletotrichum spp. ist ein PEN2abhängiges Stoffwechselprodukt beteiligt, das durch Spaltung von Indol-Glucosinolaten
gebildet wird (Bednarek et al., 2009; Hiruma et al., 2010). Hiruma et al. (2010) zeigten,
dass in pen2 Mutanten besonders die Penetration durch nicht vollständig differenzierte Appressorien begünstigt war. Penetrationsereignisse ausgehend von nicht vollständig
differenzierten Appressorien konnten in der Interaktion zwischen Arabidopsis-Wildtypen
und C. higginsianum nicht beobachtet werden. Allerdings wurde auf pen2 Mutanten eine um rund 30% erhöhte Penetrationsrate von C. higginsianum bestimmt (Huser et al.,
2009).
Indol-Glucosinolate (IGS) werden wie Camalexin aus Tryptophan synthetisiert. Der
erste enzymatische Schritt in der Synthese indolischer Tryptophan-Derivate von Tryptophan zu Indol-3-Aldoxim (IAOx) wird durch die Cytochrom P450-Monooxygenasen
CYP79B2 und CYP79B3 katalysiert (Hull et al., 2000; Mikkelsen et al., 2000). RobertSeilaniantz et al. (2011) berichteten, dass die Akkumulation von IGS und Camalexin antagonistisch reguliert wird, was aufgrund der Konkurrenz um IAOx sinnvoll erscheint.
Allerdings war die Suszeptibilität von cyp79b2/b3 Mutanten gegenüber C. higginsianum
im Vergleich zu Camalexin-freien pad3 Mutanten deutlich erhöht, was auf einen Einfluss
weiterer Tryptophan-Derivate als nur Camalexin auf die Interaktion schließen ließ. Es
konnte gezeigt werden, dass auch die Mutanten hig1-1 und myb51/34, welche reduzierte
Gehalte an IGS aufweisen, eine erhöhte Suszeptibilität gegenüber C. higginsianum haben.
Das Pilzwachstum in myb51/34 war vergleichbar mit dem in pgm und pad3, was einen
starken Einfluss der IGS auf die Interaktion zwischen Arabidopsis und C. higginsianum
nahelegt. Einen deutlichen Hinweis auf den Zusammenhang zwischen IGS-Gehalten und
der Suszeptibilität ergab zudem der Vergleich mit der MYB51-Mutante hig1-1, in der
sowohl intermediäre IGS-Gehalte, als auch eine intermediäre Suszeptibilität, zwischen
98
4 D ISKUSSION
myb51/34 und dem Wildtyp beobachtet wurden. In der Doppelmutante myb51/34 konnten
unter Kontrollbedingungen kaum IGS detektiert werden, dennoch akkumulierte 4MOI3M
Pathogen-responsiv, was auf die Beteiligung zusätzlicher transkriptioneller Regulatoren
neben MYB51 und MYB34 in der IGS-Biosynthese hindeutet. Überraschenderweise war
auch die Suszeptibilität der Mutante HIG1-1D erhöht, in der erhöhte Gehalte an IGS,
aber deutlich reduzierte Gehalte an aliphatischen GS akkumulierten. Es wurde jedoch bereits gezeigt, dass neben CYP79B2/B3-abhängigen Tryptophan-Derivaten und Camalexin
auch aliphatische GS an der Resistenz von Arabidopsis gegen die nekrotrophen Pilze Botrytis cinerea und Sclerotinia sclerotiorum beteiligt sind (Kliebenstein et al., 2005; Stotz
et al., 2011). Darüberhinaus wäre es möglich, dass der Camalexin-Gehalt aufgrund der
antagonistischen Regulation mit IGS in HIG1-1D verringert ist. Der Gehalt an Camalexin
wurde in dieser Mutante allerdings nicht analysiert. Während Camalexin in der Interaktion mit Botrytis cinerea unmittelbar am Rand von Nekrosen akkumuliert, ist der Gehalt
indolischer und aliphatischer GS im Abstand von einigen Millimetern von der Läsion am
höchsten (Kliebenstein et al., 2005). Die umfassende Mutanten-Analyse von Bednarek
et al. (2009) legt zudem nahe, dass IGS und Camalexin zeitlich getrennt in der Penetrationsresistenz bzw. der Post-Penetrationsresistenz wirksam sind. Diese Daten deuten
zusammengenommen auf eine zeitliche und räumliche Regulation der Akkumulation von
Glucosinolaten und Camalexin in der induzierten Abwehrantwort gegen phytopathogene
Pilze hin.
In der stärkefreien pgm Mutante war die Pathogen-induzierte Akkumulation von
4MOI3M reduziert und die Pathogen-induzierte Reduktion von I3M im Vergleich mit
Wildtyp-Pflanzen verstärkt. Gleichzeitig wurde eine reduzierte Ablagerung der PEN2abhängig synthetisierten Callose an Infektionsstellen beobachtet für die auch 4MOI3M
eine Rolle spielen soll (Clay et al., 2009). Diese Daten deuten auf ein vermindertes Ansprechvermögen der IGS- und PEN2-abhängigen Abwehrantwort hin und unterstützen die
Hypothese einer generell von der Kohlenhydratverfügbarkeit begrenzten Pathogenabwehr
in pgm. Bednarek et al. (2009) präsentierten Hinweise dafür, dass Raphanusamsäure (RA)
ein Nebenprodukt der PEN2-abhängigen Synthese des antimykotischen Amines 4MOI3A
aus 4MOI3M darstellt. Da RA aber auch in IGS-freien cyp79b2/b3 Mutanten detektiert wurde, muss noch ein weiterer Syntheseweg für RA vorhanden sein. Die Pathogeninduzierte Akkumulation von RA war allerdings abhängig von PEN2 (Bednarek et al.,
2009). In der Interaktion mit C. higginsianum korrelierte die Pathogen-induzierte Akkumulation von RA weitgehend positiv mit den Gehalten an IGS. In pgm akkumulierte
RA hingegen trotz reduzierter IGS-Gehalte nach einer Infektion stärker als im Wildtyp.
Ein Vergleich der Differenzen zwischen den Gehalten an 4MOI3M und RA in infizierten
99
4 D ISKUSSION
Blättern von pgm und Col-0 zeigt jedoch, dass kein äquimolarer Umsatz von 4MOI3M zu
RA erfolgte. Diese Beobachtung stützt auch ein Vergleich der Gehalte an 4MOI3M und
RA nach einer Infektion mit Mehltaupilzen (Bednarek et al., 2009). Zudem ist unklar ob
der beobachtete Umsatz von I3M nach Infektionen über 4MOI3M zu 4MOI3A stattfindet
oder ob I3M stattdessen direkt PEN2-abhängig gespalten wird (Bednarek et al., 2009).
4.1.3 Veränderungen in der Zellwandzusammensetzung beeinflussen die
Interaktion von Pflanzen mit phytopathogenen Pilzen
Wie im vorhergehenden Abschnitt diskutiert, könnte die PEN2-abhängige Abwehrantwort
an der reduzierten Penetrationsresistenz von pgm Mutanten gegenüber C. higginsianum
beteiligt sein. Eine Analyse der diurnalen Transkriptom-Daten zu pgm und Col-0 aus
Bläsing et al. (2005) zeigte außerdem, dass Gene des Zellwandstoffwechsels in pgm
zum Ende der Dunkelphase vermehrt transkriptionell herabreguliert sind. Diese Daten deuteten darauf hin, dass sich die reduzierte Kohlenhydratverfügbarkeit in stärkefreien Arabidopsis-Mutanten auch auf die strukturelle Zusammensetzung der Zellwand auswirken könnte. Tatsächlich wurden spezifische Veränderungen in der ZellwandMonosaccharid Zusammensetzung in stärkefreien Mutanten und in allen untersuchten
Mutanten mit einer reduzierten Kohlenstoffverfügbarkeit beobachtet. Dies deutet darauf
hin, dass der nächtliche Kohlenstoffmangel in den untersuchten Mutanten die Zellwandzusammensetzung beeinflusst. Besonders stark waren die Gehalte an Arabinose und Galaktose in der unlöslichen Zellwandmatrix in allen Genotypen reduziert. In geringerem
Maße waren auch Galacturonsäure- und Xylosegehalte reduziert. In MEm-Pflanzen wurden diese Veränderungen der Zellwandzusammensetzung nur unter Kurztagbedingungen,
wenn Kohlenstoffknappheit herrschte, beobachtet. In einem 12 h / 12 h Licht- / Dunkelzyklus angezogene MEm-Pflanzen hatten dagegen eine Zellwandzusammensetzung wie
der Wildtyp.
Da die betroffenen Monosaccharide in unabhängigen biochemischen Reaktionen synthetisiert werden (Reiter, 2008), liegt die Vermutung nahe, dass kein spezifischer Syntheseweg, sondern vielmehr ein Zellwandpolymer in den Mutanten beeinträchtigt ist. Auch
eine generelle Begrenzung der Biosynthese von Zuckernukleotiden durch einen Mangel
an UDP-Glukose erscheint unwahrscheinlich, da in diesem Fall reduzierte Gehalte aller
Monosaccharide erwartet würden. Die geringen Gehalte an Arabinose, Galactose und Galacturonsäure deuten stark auf einen verringerten Pektinanteil in der Zellwand hin, da diese Zucker die Hauptbestandteile von Pektinpolymeren darstellen und in dieser Kombination in keinem anderen Matrixpolymer zu finden sind (Zablackis et al., 1995). Diese Inter-
100
4 D ISKUSSION
pretation wird von der Beobachtung gestützt, dass die Zellwandmutante mur8-1, welche
reduzierte Gehalte in den Pektin-Monosacchariden Rhamnose, Arabinose, Galactose und
Galacturonsäure aufweist, eine stark erhöhte Suszeptibilität gegenüber C. higginsianum
zeigt. Dagegen hatte die Arabinose-Synthese Mutante mur4-1 keine veränderte Suszeptibilität gegenüber C. higginsianum, was auf die Notwendigkeit komplexer struktureller
Veränderungen in der Zellwand für einen Einfluss auf die Suszeptibilität hindeutet. Es ist
zudem wichtig anzumerken, dass mur8-1 Mutanten keine nächtliche Kohlenstoffmangelphase aufweisen. Die Pektinzusammensetzung kann daher unabhängig von der Kohlenhydratverfügbarkeit in der Interaktion zwischen Arabidopsis und C. higginsianum als Kompatibilitätsfaktor angesehen werden. Da sowohl in pgm und sex1-1, als auch in mur8-1
die frühe Entwicklung biotropher Hyphen beschleunigt war, ist eine beeinträchtigte Penetrationsresistenz durch die veränderte Pektinzusammensetzung sehr wahrscheinlich. Beispielsweise könnte ein reduzierter Anteil an Arabinose und Galactose in den Seitenketten
des Pektinpolymers Rhamnogalacturonan-I die Flexibilität der Zellwand beeinträchtigen
(Caffall und Mohnen, 2009).
Da auch durch Verdunkelung induzierter Kohlenhydratmangel zu einer erhöhten Suszeptibilität von Arabidopsis gegenüber C. higginsianum führte, könnten auch unter diesen
Kohlenhydratmangel-Bedingungen Beeinträchtigungen der Zellwandstruktur eine Rolle
spielen. Eine Studie von Lee et al. (2007) zeigte, dass der Gehalt an allen Monosacchariden der Zellwandbestandteile Pektin und Hemicellulose mit Ausnahme von Mannose
nach zwei Tagen des Kohlenstoffmangels stark reduziert war. Das erhöhte Wachstum von
C. higginsianum auf Pflanzen mit induziertem Kohlenhydratmangel könnte daher ebenfalls durch strukturelle Zellwandveränderungen begünstigt sein. Ein akuter Kohlenstoffmangel scheint allerdings zu einer eher unspezifischen Mobilisierung von Monosacchariden aus der Zellwand zu führen, während der periodisch wiederkehrende Kohlenstoffmangel in den untersuchten Mutanten vermutlich spezifische Polymere der Zellwand in
besonderem Maße betrifft.
Es ist nicht auszuschließen, dass auch die induzierte Abwehrantwort durch eine reduzierte oder veränderte Freisetzung von DAMPs beeinträchtigt sein könnte. Besonders gut
untersuchte DAMPs sind Oligogalacturonide, welche durch lytische Enzyme phytopathogener Pilze aus Pektin herausgelöst werden können und infolge einer spezifischen Erkennung durch die Rezeptorkinase WAK1 Abwehrreaktionen in Arabidopsis auslösen (Ferrari et al., 2007; Galletti et al., 2008; Brutus et al., 2010; Galletti et al., 2011). Da eine reduzierte Kohlenstoffverfügbarkeit allerdings vor allem zu reduzierten Arabinose- und Galactosegehalten führt, ist es unwahrscheinlich, dass das Pektinpolymer Homogalacturonan
101
4 D ISKUSSION
stark beeinträchtigt ist, welches die Quelle von OGs darstellt (Hématy et al., 2009). Allerdings könnten auch bislang nicht identifizierte Zellwandfragmente als DAMPs wirken.
Hinweise auf einen Einfluss der Pektinzusammensetzung für die Suszeptibilität gegen
phytopathogene Pilze konnten bereits in verschiedenen Pathosystemen gesammelt werden. Ein erhöhter Pektingehalt in den Arabidopsis-Mutanten pmr5 und pmr6 führte zu
Resistenz gegen den adaptierten Mehltaupilz Erysiphe cichoracearum (Vogel et al., 2002,
2004). Vogel et al. (2002) berichteten, dass PMR6 für ein Pektatlyase-ähnliches Protein
kodiert. In pmr5/pmr6 Doppelmutanten ist der Gehalt an Galacturonsäure, Arabinose und
Galactose erhöht (Vogel et al., 2004). Interessanterweise weisen beide Mutanten eine erhöhte Resistenz gegenüber C. higginsianum auf (Birker, 2008), was zusammen mit den
zuvor diskutierten Daten auf eine negative Korrelation zwischen dem Pektingehalt in der
Wirtszellwand und der Suszeptibilität gegenüber C. higginsianum hinweist. Da jedoch
keine beeinträchtigte Suszeptibilität der mur8-1 Mutanten gegenüber E. cruciferarum beobachtet wurde, scheint die Pektinzusammensetzung der Zellwand verschiedene Pathogeninteraktionen unterschiedlich zu beeinflussen. Es ist daher nicht auszuschließen, dass
die erhöhte Resistenz stärkefreier Arabidopsis-Mutanten für E. cruciferarum auch auf die
Zellwandstruktur der Mutanten zurückzuführen ist.
Die Suszeptibilität von Arabidopsis für das nekrotrophe Pathogen Botrytis cinerea
ist abhängig von der O-Acetylierung von Pektin und Hemicellulose durch REDUCED
WALL ACETYLATION 2 (RWA2) (Manabe et al., 2011). Interessanterweise wird aufgrund struktureller Homologie zu O-Acetylasen vermutet, dass PMR5 ebenfalls an der
O-Acetylierung der Zellwand beteiligt ist (Gille und Pauly, 2012). Die biologische Funktion von O-Acetylierungen ist bisher unbekannt. Der Methylierungsgrad von Pektin beeinflusst stark die Spaltung durch Pektatlyasen und Endopolygalacturonasen und kann
durch Pektinmethylesterasen reguliert werden (Limberg et al., 2000). Kürzlich wurde gezeigt, dass eine sekretierte Pektatlyase von Colletotrichum coccodes an der Ausprägung
von Anthraknose-Symptomen auf Tomaten beteiligt ist (Ben-Daniel et al., 2012). B. cinerea sekretiert bei Kontakt mit Pektin neun pektinabbauende Enzyme und induziert in der
Interaktion mit Arabidopsis eine wirtskodierte Pektinmethylesterase (Shah et al., 2009;
Raiola et al., 2011). Im Genom von C. higginsianum wurden 86 mutmaßlich pektinabbauende Enzyme identifiziert, von denen 51 während der nekrotrophen Interaktionsphase
induziert sind (O’Connell et al., 2012). Folglich scheint der Verdau von Pektin auch in
nekrotrophen Interaktionen von zentraler Bedeutung zu sein.
102
4 D ISKUSSION
4.2 Die Kohlenhydratverfügbarkeit des Wirtes begrenzt das
Wachstum biotropher Hyphen von C. higginsianum nicht
In Interaktionen zwischen Pflanzen und Pathogenen herrscht ein ständiger Wettbewerb um
Primärmetabolite des Wirtes. Während Wirtspflanzen Metabolite in Abwehrreaktionen
der infizierten Zellen umleiten (Bolton, 2009), konkurrieren phytopathogene Pilze bei der
Besiedelung des Wirtes um Nährstoffe für ihr eigenes Wachstum (Divon und Fluhr, 2007).
Biotrophe Pathogene sind auf die Aufnahme von Nährstoffen aus lebenden Wirtszellen
angewiesen, während nekrotrophe Pathogene Abbauprodukte toter Zellen nutzen können
(Divon und Fluhr, 2007). Ein gutes Beispiel für die Abhängigkeit biotropher Pathogene
von Kohlenhydraten des Wirtes wurde in Untersuchungen zur Interaktion zwischen Reis
und Xanthomonas oryzae gefunden. Das Bakterium ist auf die Effektor-vermittelte Induktion des Saccharose-Transporters SWEET11 angewiesen, um eine kompatible Interaktion
mit der Wirtspflanze einzugehen (Yang et al., 2006; Chen et al., 2010, 2012). Bislang
konnte nicht gezeigt werden, ob hemibiotrophe Pathogene während der biotrophen Interaktionsphase auf die Aufnahme von Metaboliten des Wirtes angewiesen sind. Es wird
allgemein angenommen, dass hemibiotrophe Pathogene von einer hohen Kohlenhydratverfügbarkeit in ähnlicher Weise wie biotrophe Pathogene profitieren könnten (Münch
et al., 2008). Von 94 annotierten Zuckertransportern im Genom von C. higginsianum,
sind allerdings nur fünf vorzugsweise während der biotrophen Interaktionsphase induziert (O’Connell et al., 2012).
In dieser Arbeit wurden mehrere Anhaltspunkte dafür präsentiert, dass pilzliches Wachstum während der biotrophen Interaktionsphase zwischen Arabidopsis und
C. higginsianum nicht durch die Kohlenhydratverfügbarkeit im Wirtsgewebe begrenzt
ist. Drei Arabidopsis-Mutanten mit reduzierter nächtlicher Kohlenhydratverfügbarkeit
zeigten eine erhöhte Suszeptibilität gegenüber C. higginsianum. Da die untersuchten
Mutanten drei unabhängige genetische Defekte aufwiesen, ist es unwahrscheinlich,
dass sekundäre Ursachen für die erhöhte Suszeptibilität verantwortlich sind. Wäre
C. higginsianum während der biotrophen Wachstumsphase von der Aufnahme löslicher Zucker des Wirtes abhängig, so sollte die nächtliche Hungerphase in stärkefreien
Mutanten die pilzliche Proliferation ab der zweiten Dunkelphase nach Infektion einschränken, da zu diesem Zeitpunkt bereits biotrophe Infektionsvesikel und Primärhyphen
in den Wirtszellen ausgebildet sind. Der Kohlenhydratmangel zum Ende der Dunkelphase
ist in stärkefreien Mutanten so stark ausgeprägt, dass die Kohlenhydratverwertung und
das Wachstum noch einige Stunden zu Beginn der folgenden Lichtphase gehemmt sind
(Gibon et al., 2004b). Darüberhinaus wurde durch Dunkel-induzierten Kohlenhydrat-
103
4 D ISKUSSION
mangel während der biotrophen Wachstumsphase von C. higginsianum (DLP 1+2) die
pilzliche Proliferation in stärkefreien Mutanten und Wildtyp-Pflanzen erhöht. Bei einer
Abhängigkeit der biotrophen Hyphen von Kohlenhydraten des Wirtes wäre dagegen
eine erhöhte Resistenz des Wirtes durch mangelnde Verfügbarkeit von Kohlenhydraten
für das Pathogen während der frühen Interaktionsphase zu erwarten. Der induzierte
Kohlenhydratmangel könnte jedoch zu einem Abbau von Zellwandpolymeren führen.
Lee et al. (2007) hatten gezeigt, dass der Monosaccharidgehalt in Pektin und Hemicellulose von Arabidopsis-Zellwänden nach einer Verdunkelung von zwei Tagen um rund
40% reduziert ist. Dies deutet darauf hin, dass die Zellwand bei Kohlenstoffmangel als
Kohlenhydratquelle dient, wie es beispielsweise für Zellwand-Speicherpolysaccharide in
Samen und Keimblättern bekannt ist (Buckeridge, 2010). Tatsächlich wurden auch nach
einer Verdunkelung von zwei Tagen noch geringe Glukosegehalte in den untersuchten Genotypen gemessen. Es erscheint allerdings unwahrscheinlich, dass derart geringe Mengen
löslicher Zucker ausreichen, um die Versorgung biotropher Hyphen von C. higginsianum
substantiell zu begünstigen.
Verschiedene Arbeiten haben schon Hinweise darauf geliefert, dass die spezialisierten Infektionsstrukturen phytopathogener Pilze an der Unterdrückung induzierter Wirtsabwehrantworten beteiligt sind. Hiruma et al. (2010) zeigten, dass Appressorien von
Colletorichum spp. neben ihrer Funktion bei der Turgor-getriebenen Durchstoßung der
Wirts-Zellwand auch für die Unterdrückung der PEN2-abhängigen Penetrationsresistenz
notwendig sind. In einer ausführlichen mikroskopischen Analyse zu der Sekretion mikrobieller Effektoren von C. higginsianum konnte zudem gezeigt werden, dass sowohl
an der Basis von Appressorien, als auch an Grenzflächen zwischen biotrophen Hyphen
und der Plasmamembran des Wirtes Effektoren sekretiert werden, die an der Unterdrückung von Zelltod in den Wirtszellen beteiligt sind (Kleemann et al., 2012). Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass die biotrophe Wachstumsphase von
C. higginsianum eher für die Unterdrückung induzierter Abwehrreaktionen des Wirtes,
als für die Nahrungsaufnahme von Bedeutung ist. Das reduzierte Wachstum des obligat biotrophen Mehltaupilzes E. cruciferarum auf stärkefreien Mutanten zeigt hingegen,
dass biotrophe Pathogene direkt von der Verfügbarkeit von Metaboliten der Wirtszelle
abhängig sind. Die biotrophe Wachstumsphase von C. higginsianum scheint daher, trotz
morphologischer Parallelen zu Haustorien obligat biotropher Pilze, in erster Linie der
Vorbereitung des anschließenden nekrotrophen Wachstums zu dienen.
104
4 D ISKUSSION
4.3 Eine chemisch mutagenisierte Population stärkefreier Mutanten
beinhaltet Colletotrichum higginsianum-resistente Linien
Durchmusterungen genetisch veränderter Organismen stellen eine nützliche Strategie zur
Identifizierung unbekannter Genfunktionen dar. Die Selektion von Individuen basiert auf
der Betrachtung von Phänotypen, deren zugrunde liegende genetische Sequenz zunächst
unbekannt ist und durch genetische Kartierungen aufgeklärt werden kann. Die Charakterisierung eines unbekannten Genotyps in einer Mutante mit bekanntem Phänotyp wird als
Vorwärtgenetik bezeichnet.
Entscheidend für den Erfolg einer EMS-basierten vorwärtsgenetischen Analyse ist die
Gestaltung einer geeigneten Identifizierungsstrategie von erzeugten Mutanten. Diese kann
beispielsweise auf klar definierten Phänotypen einzelner Organe, physiologischen Veränderungen, der Expression oder Suppression von Reportergenen, oder der Verstärkung
bzw. Suppression eines primären Mutanten-Phänotypen durch eine sekundäre Mutation
basieren (Page und Grossniklaus, 2002). In dieser Arbeit wurde eine selektive Durchmusterung angewendet um Suppressormutanten des Hypersuszeptibilitätsphänotyps stärkefreier pgm Mutanten gegenüber C. higginsianum zu identifizieren. Die Infektionsbedingungen wurden so gewählt, dass lediglich Mutanten von Interesse wachsen sollten, um
ein sehr einfaches Selektionskriteritum anzulegen. Vergleichbare Ansätze wurden bereits
für die Interaktion von Arabidopsis mit Mehltaupilzen (Vogel et al., 2002), Oomyceten
(van Damme et al., 2005) und auch C. higginsianum (Birker, 2008) durchgeführt. Während diese Analysen allerdings auf der Reversion des Suszeptibilitätsphänotyps einer beliebigen hochsuszeptiblen Wirtspflanze beruhten, war es das Ziel der vorliegenden Arbeit, auch spezifisch pgm-abhängige Suppressormutanten zu identifizieren. Dafür war eine zweistufige Durchmusterung nötig, in der zunächst unspezifisch resistente Mutanten
selektiert wurden, welche in einer zweiten Durchmusterung auf die Spezifität für pgm getestet wurden. In der ersten Stufe der Analyse selektierte Mutanten wurden ausschließlich
nach erhöhter Resistenz gegenüber C. higginsianum bewertet. Diese Individuen können
daher in ganz unterschiedlichen Abwehrreaktionen der Pflanze beeinflusst sein. In der
zweiten Stufe der Analyse wurde der Suszeptibilitätsphänotyp der Mutanten in einem stärkehaltigen Hintergrund (Col-0) gestestet. Eine pgm-spezifische Suppressormutante sollte
ihre Resistenz im Col-0 Hintergrund verlieren. Da der Lokus der Mutationen in den selektierten pgm Suszeptibilitäts-Suppressor Kandidaten (pSSK) allerdings unbekannt war,
konnte die Suszeptibilität lediglich in segregierenden Col-0 / pSSK F2 Populationen untersucht werden. Die Berechnung eines Resistenzquotienten diente der Näherung auf Basis
der statistisch zu erwartenden Rekombinationsereignisse in diesen F2 Pflanzen. Es konn-
105
4 D ISKUSSION
ten deutliche Unterschiede zwischen den Resistenzquotienten unterschiedlicher Linien
beobachtet werden. Da der Resistenzquotient dieser Col-0 / pSSK F2 Pflanzen nicht mit
der Stärke der Resistenz der parentalen pSSK Linien korrelierte, ist anzunehmen, dass
sowohl pgm-unabhängig, als auch pgm-abhängig resistente Mutanten selektiert wurden.
Dabei stellen letztere echte Suppressormutanten dar.
4.3.1 Die angewandte Durchmusterung ermöglicht die Kartierung einer Teilmenge
der selektierten Mutanten
Eine wichtige Grundvoraussetzung einer guten Durchmusterung ist ein niedriger Anteil
Falsch-Positiver unter den selektierten Individuen. Diese werden durch eine Fehlinterpretation des Phänotyps in einem Experiment mit unklaren oder variablen Selektionskriterien ausgewählt. Eine bewährte Vorgehensweise um die Anzahl falsch-positiver Kandidaten zu reduzieren ist es, Mutanten nach einer Durchmusterung in der M2 Generation erneut in der M3 Generation zu analysieren. In einer Durchmusterung EMS-mutagenisierter
Arabidopsis Col-0 wurden aus 26.000 analysierten M2 Pflanzen 20 Kandidaten mit erhöhter Mehltauresistenz selektiert, die 6 unabhängige powdery mildew resistant (pmr)-Loci
beinhalteten (Vogel und Somerville, 2000; Vogel et al., 2002). Aus rund 100.000 analysierten Ler/eds1-2 M2 Pflanzen isolierten van Damme et al. (2005) ebenfalls 20 Kandidaten mit 6 unabhängigen downy mildew resistant (dmr)-Loci. Von diesen 12 beschriebenen Mutanten beider Versuchsansätze konnte bisher in der Hälfte die zugrunde liegende
Mutation kartiert werden (Vogel et al., 2002, 2004; Nishimura et al., 2003; Consonni
et al., 2006; van Damme et al., 2008, 2009). In der Durchmusterung von über 200.000
mutagenisierten Pflanzen auf eine erhöhte Resistenz gegenüber C. higginsianum identifizerte Birker (2008) 36 Kandidaten, die allerdings aufgrund eines zu schwachen Resistenzphänotyps und dem daraus folgenden großen Anteil falsch-positiver Kandidaten nicht
für eine verlässliche Durchmusterung geeignet waren. Die in dieser Arbeit durchgeführte
Durchmusterung von rund 100.000 M2 Individuen führte zur Selektion von 63 M3 Kandidaten, die jedoch noch nicht auf Allelismus getestet wurden. Darüberhinaus sollten alle
Kandidaten auf eine eventuelle konstitutive Expression SA-abhängiger PR-Gene getestet
werden, da in den oben beschriebenen Analysen Linien mit konstitutiver PR-1 Expression gefunden wurden. Mutanten mit einer konstitutiven SA-Akkumulation weisen häufig
einen sehr starken Wachstumsphänotyp auf, wie es beispielsweise für mpk4 Mutanten beschrieben wurde (Petersen et al., 2000). Ein starker Zwergwuchs kann daher ebenfalls als
Erkennungsmerkmal von Mutanten mit konstitutiv erhöhten Abwehrreaktionen dienen.
Von vier Linien, die in einer markergestützten Kartierung untersucht wurden, konnten
106
4 D ISKUSSION
nur die beiden Mutanten mit einem starken Resistenzphänotyp (7-16-2, 9-7-10) auf einen
engen genomischen Abschnitt eingegrenzt werden, während die Mutationen der beiden
Linien mit einem schwächeren Resistenzphänotyp (3-6-8, 8-18-1) aufgrund einer hohen
Zahl falsch-positiver Individuen, bzw. einer niedrigen Zahl selektierter Individuen, nicht
näher lokalisiert werden konnten. Dieser Vergleich der durchgeführten vorwärtsgenetischen Analyse mit bestehenden Literaturdaten zeigt, dass die Ergebnisse im Rahmen der
zuvor in vergleichbaren Durchmusterungen beobachteten Größenordnungen liegen. Interessanterweise konnte in dieser Analyse ein neues Allel von dmr6 isoliert werden (Linie
7-16-2), was die biologische Validität der Analyse belegt, da dmr6 bereits als toleranter
gegenüber C. higginsianum beschrieben worden ist (Birker, 2008). Um die Kartierung
von Mutanten mit einem schwächeren Resistenzphänotyp zu ermöglichen, müsste die Selektivität der Durchmusterung optimiert werden.
4.3.2 Welche Mutationen könnten zu einer generellen Resistenz gegenüber
C. higginsianum beitragen?
Grundsätzlich würden zwei unterschiedliche Klassen von Mutanten erwartet werden, die
zu einer generellen Resistenz gegen C. higginsianum führen. Zum einen könnten dies
Mutanten mit einer erhöhten Abwehrantwort sein, in denen entweder die Aktivierung eines zentralen Abwehrweges oder die Akkumulation einer toxisch wirkenden Substanz
Resistenz vermittelt. Zum anderen könnten Mutationen aufgrund struktureller Veränderungen des Wirtes oder aufgrund des Fehlens einer für die Kompatibilität essentiellen
Substanz den Verlust von Suszeptibilität bewirken. Beispielsweise wurde berichtet, dass
die Mutanten pmr5 und pmr6, welche einen erhöhten Pektinanteil in der Zellwand aufweisen, resistent gegenüber C. higginsianum sind (Birker, 2008). Induzierbare Abwehrreaktionen waren in diesen Mutanten jedoch nicht beeinträchtigt, weshalb vermutlich die
veränderte Zellwandzusammensetzung zur Pathogenresistenz beiträgt (Vogel et al., 2002,
2004).
Im Gegensatz dazu ist die Transkription von PR-Genen in dmr6 Mutanten erhöht (van
Damme et al., 2008). Außerdem ist die Transkription von DMR6 nach Infektion mit Hyaloperonospora parasitica und C. higginsianum induziert (van Damme et al., 2008, eigene
Beobachtung), was auf eine Funktion des Genproduktes in der Abwehrantwort hindeutet.
DMR6 kodiert für eine 2-Oxoglutarat-Fe(II) Oxygenase unbekannter Funktion (van Damme et al., 2008). Bislang konnten jedoch keine Hinweise auf den Resistenzmechanismus
der dmr6 Mutanten gefunden werden. Aufgrund einer hohen Homologie zu Flavanon 3Hydroxylasen wurde eine Funktion von DMR6 in der Flavonoidbiosynthese in Betracht
107
4 D ISKUSSION
gezogen. Aktuelle Arbeiten deuten allerdings darauf hin, dass die Synthese löslicher Phenylpropane in diesen Mutanten nicht beeinträchtigt ist (Renz und Voll, unveröffentlicht).
In weiteren Analysen sollen die Gehalte an Glucosinolaten und Cutin bestimmt werden,
da Oxoglutarat-abhängige Dioxygenasen in der Biosynthese dieser Substanzen eine Rolle
spielen könnten und da sowohl Glucosinolate, als auch Cutin an der Penetrationsresistenz
gegen phytopathogene Pilze beteiligt sind (Bessire et al., 2007; Bednarek et al., 2009;
Hiruma et al., 2010).
4.3.3 Die Suszeptibilität stärkefreier Mutanten kann durch induzierte Mutationen
spezifisch supprimiert werden
In einer zweistufigen Durchmusterung chemisch mutagenisierter pgm Pflanzen konnten
63 Mutanten mit einer erhöhten Resistenz gegenüber C. higginsianum identifiziert werden, von denen 25 Linien einen schwachen bis mittelstarken Resistenzphänotyp in Col-0
erzeugten. In acht dieser Mutanten wurde wiederum ein Resistenzphänotyp im pgm Hintergrund beobachtet, der ausreichend selektiv für die Durchmusterung einer Kartierungspopulation sein könnte. Da es sich bei der Bestimmung des Resistenzquotienten im Col-0
Hintergrund wegen der Betrachtung segregierender Col-0 / pSSK F2 Pflanzen allerdings
nur um eine Näherung handelt und beispielsweise Auswirkungen der induzierten Mutationen auf die Fertilität der Pflanzen nicht bekannt sind, konnten nur relative Unterschiede
zwischen den einzelnen Mutanten verglichen werden. Eine Wiederholung dieser zweiten
Selektionsstufe der Durchmusterung wäre sinnvoll, um die beobachteten Resistenzphänotypen zu überprüfen.
Generell stellt sich die Frage, welche genetischen Veränderungen zu einer spezifischen
Suppression der Hypersuszeptibilität gegenüber C. higginsianum in stärkefreien Pflanzen
führen könnten. Da in dieser Arbeit gezeigt wurde, dass die Kohlenhydratverfügbarkeit
Abwehrreaktionen gegen C. higginsianum begrenzt, könnte eine veränderte Balance zwischen Wachstum und Abwehr die Resistenz in pSSK beeinflussen. Auch strukturelle Veränderungen der Zellwandzusammensetzung könnten zu einer erhöhten Resistenz führen,
da Defekte in Pektin an der Penetrationsresistenz gegen C. higginsianum beteiligt zu sein
scheinen. In beiden Fällen könnte die Suszeptibilität von pgm supprimiert werden, während sich die Veränderungen auf den Krankheitsphänotyp der Mutante im stärkehaltigen
Col-0 Hintergrund nicht deutlich auswirken würden, da beide Faktoren die Interaktion
zwischen Col-0 und C. higginsianum nicht einschränken. Es wäre darüberhinaus möglich,
dass die Wahrnehmung zuckerabhängiger Signale verändert wird. Aufgrund der großen
Unterschiede in der Kohlenhydratverteilung von Col-0 und pgm könnte die Suszeptibi-
108
4 D ISKUSSION
lität beider Genotypen dadurch unterschiedlich beeinträchtigt werden. Es konnte bereits
gezeigt werden, dass zuckerabhängige Signale pathogenresponsive Hormonsignalwege
und Abwehrantworten beeinflussen (Bolouri Moghaddam und Van den Ende, 2012).
Die EMS-Mutante 9-7-10 zeigte eine starke Resistenz im pgm Hintergrund, während
ihre Suszeptibilität im Col-0 Hintergrund nicht beeinträchtigt zu sein schien. Die Mutation in dieser Linie, welche mit dem Resistenzphänotyp gegenüber C. higginsianum gekoppelt vererbt wurde, konnte auf den unteren Arm von Chromosom 3 kartiert werden.
In einem 800 kb umfassenden Bereich liegen mehrere Gene, die an der Modifikation der
Zellwand, der Erkennung von MAMPs oder der Induktion von Abwehrreaktionen beteiligt sein könnten. In diesem genomischen Abschnitt befindet sich darüberhinaus auch ein
Gen-Cluster mit 18 TRAF (tumor necrosis factor receptor-associated factor)-ähnlichen
Genen (Cosson et al., 2010). TRAF-Proteine haben in Säugertieren wichtige Funktionen
in der Signalweiterleitung von Stresssignalen der Immunantwort. Es wurde gezeigt, dass
TRAF-Proteine mit PRRs interagieren und an der Aktivierung von MAP-Kinase Signalwegen beteiligt sind (Häcker et al., 2011). Darüberhinaus interagieren TRAF-Proteine
in Säugerzellen miteinander, weshalb die Vermutung naheliegt, dass auch Genprodukte
des TRAF-Clusters in der Arabidopsis Mutante 9-7-10 miteinander interagieren könnten. In zwei der selektierten Individuen der Kartierungspopulation der Mutante 9-7-10
ergab sich eine ungewöhnliche Kopplung des Resistenzphänotyps an zwei unterschiedliche Bereiche in diesem TRAF-Cluster. Es kann daher spekuliert werden, dass zwei unabhängige Mutationen innerhalb des TRAF-Clusters zu der beobachteten Resistenz der
Mutante 9-7-10 führen könnten. Es ist ebenfalls möglich, dass in der Durchmusterung
der Kartierungspopulation ein falsch-positives Individuum selektiert wurde. Allerdings
ist es viel unwahrscheinlicher als die zuvor dargelegte Erklärung, dass dieses Individuum
zufällig in unmittelbarer Nähe der gesuchten Mutation ein Rekombinationsereignis aufweist. Auf der Basis in silico bestimmter phylogenetischer Profile wird eine funktionelle
Verbindung der Genprodukte von 11 der TRAF-ähnlichen Gene vorausgesagt (Pellegrini et al., 1999; Cui et al., 2008). Bemerkenswerterweise liegt jeweils ein Teil der Gene
in einem der zwei zuvor erwähnten Bereiche der selektierten Individuen. Unter der Annahme, dass das TRAF-Cluster an der Resistenz in 9-7-10 beteiligt ist, impliziert dies
entweder die Notwendigkeit einer Interaktion TRAF-ähnlicher Proteine oder die funktionelle Redundanz mehrerer TRAF-ähnlicher Proteine dieses Clusters. Unter diesen Genen befindet sich das bereits beschriebene RTM3 (Cosson et al., 2010). Eine Abfrage der
Gen-Coexpressionsdatenbak ATTED-II ergab eine mögliche Coexpression von RTM3 mit
zwei Genen des Redox-Metabolismus und zwei Reticulon-ähnlichen Genen (RTLNB9,
RTLNB14). Kürzlich wurde berichtet dass die Reticulon-ähnlichen Proteine RTLNB1 und
109
4 D ISKUSSION
RTLNB2 mit dem MAMP-Rezeptor FLS2 interagieren und an dem Transport von FLS2
an die Plasmamembran beteiligt sind (Lee et al., 2011). RTM3 könnte daher am intrazellulären Vesikeltransport oder an der MTI beteiligt sein. Darüberhinaus wurde eine Coexpression von RTM3 mit zwei Saccharose Synthase Genen vorausgesagt, die an der Biosynthese von Cellulose und Stärke aus Saccharose beteiligt sind (Baroja-Fernández et al.,
2012). Saccharose Synthasen katalysieren die Umwandlung von Saccharose in Fruktose und UDP-Glukose, dem Ausgangspunkt für die Synthese von UDP-Monosacchariden
in der Zellwandbiosynthese (Reiter, 2008). Es wäre daher möglich, dass die Zellwandabhängig beeinträchtigte Penetrationsresistenz in 9-7-10 durch strukturelle Zellwandveränderungen supprimiert wird. Cosson et al. (2010) identifizierten RTM3 in einer vorwärtsgenetischen Analyse zu Resistenz gegenüber Potyviren und konnten zeigen, dass
RTM3 an der Begrenzung der Verbreitung von Potyviren in Arabidopsis beteiligt ist. Interessanterweise wurde von ATTED-II außerdem die Coexpression des TRAF-ähnlichen
Gens At3g58290 mit dem Phosphattransportergen PHT1;6, sowie den Zuckertransportergenen STP2 und SWEET8 vorausgesagt. Es wurde berichtet, dass SWEET8 nach Infektion
mit dem Bakterium Pseudomonas syringae in Arabidopsis-Blättern exprimiert wird, während in unbehandelten Pflanzen keine Transkripte detektiert werden konnten (Chen et al.,
2010). Es könnte daher spekuliert werden, dass das TRAF-ähnliche Gen At3g58290 an
der Regulation des Zuckertransportes oder der Erfassung zuckerabhängiger Signale nach
Infektionen beteiligt ist. In der Interaktion zwischen Arabidopsis und C. higginsianum
war bereits die transkriptionelle Induktion mehrerer Zuckertransporter beobachtet worden (Engelsdorf, 2008). Eine Sequenzierung des TRAF-Clusters in der EMS-Linie 9-7-10
könnte nun klären, ob dieser Lokus an der Suppression des Hypersuszeptibilitätsphänotyps von pgm beteiligt ist.
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132
Abbildungsverzeichnis
1.1
1.2
Lebenszyklus von Colletotrichum higginsianum auf Arabidopsis . . . . .
Schematische Darstellung des zentralen Blatt-Kohlenhydratstoffwechsels
in Arabidopsis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
18
2.1
Durchmusterung chemisch mutagenisierter Arabidopsis pgm Mutanten . .
41
3.1
Suszeptibilität von Arabidopsis-Mutanten des zentralen Kohlenhydratstoffwechsels für C. higginsianum . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Diurnaler Umsatz von Kohlenhydraten in Arabidopsis und Korrelationsanalysen mit der Suszeptibilität für C. higginsianum . . . . . . . . . . . .
Korrelationsanalysen zwischen Veränderungen des Kohlenhydratgehaltes in infizierten Blättern und Kontrollen mit der Suszeptibilität für
C. higginsianum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Suszeptibilität von Arabidopsis für C. higginsianum nach induziertem
Kohlenhydratmangel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Suszeptibilität von Arabidospsis-Mutanten mit Kohlenstoffmangel für
C. higginsianum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Induzierte Abwehrantwort in Arabidopsis nach Infektion mit
C. higginsianum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Suszeptibilität von coi1/pgm Doppelmutanten für C. higginsianum . . . .
Etablierung von C. higginsianum-Infektionsstrukturen während der frühen Interaktionsphase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Glucosinolat- und Raphanusamsäuregehalt in Arabidopsis nach einer
Infektion mit C. higginsianum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Callosehaltige Papillen unter C. higginsianum Appressorien . . . . . . .
Zellwand-Monosaccharid Zusammensetzung von pgm und mur Mutanten
Suszeptibilität von mur Mutanten gegenüber C. higginsianum und Zellwandanalyse von pgm und mur8-1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Diurnaler Umsatz von Kohlenhydraten in mur8-1 . . . . . . . . . . . . .
Zellwand-Monosaccharid Zusammensetzung von Genotypen mit periodischem Kohlenstoffmangel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Proliferation von E. cruciferarum auf Col-0, pgm und mur8-1 . . . . . . .
Suszeptibilität von Arabidopsis Stärkestoffwechsel- Mutanten gegenüber
E. cruciferarum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
CAPS Marker zur Identifizierung von pgm N210 . . . . . . . . . . . . .
Korrelationsanalysen zur Untersuchung der Infektionseffizienz und der
Resistenz in pgm Suszeptibilitäts-Suppressor Kandidaten (pSSK) . . . . .
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
3.8
3.9
3.10
3.11
3.12
3.13
3.14
3.15
3.16
3.17
3.18
14
44
46
48
50
52
54
56
60
64
65
67
69
71
73
74
75
79
80
133
A BBILDUNGSVERZEICHNIS
3.19
3.20
3.21
3.22
3.23
3.24
3.25
Durchmusterung von Kartierungspopulationen . . . . . . . . . . . . . . .
Bulked segregant analysis von Kartierungspopulationen . . . . . . . . . .
Linie 7-16-2 trägt eine Mutation im katalytischen Zentrum des DMR6-Gens
Wachstums-Phänotyp der resistenten stärkefreien Linie 9-7-10 . . . . . .
Genetische Kartierung der EMS Mutante 9-7-10 . . . . . . . . . . . . . .
PMR6 ist in der EMS Mutante 9-7-10 nicht strukturell beeinträchtigt . . .
in silico Coexpressions- und Interaktionsanalyse TRAF-ähnlicher Gene
im Bereich der resitenzvermittelnden Mutation in 9-7-10 . . . . . . . . .
83
84
86
87
88
89
91
134
Tabellenverzeichnis
2.1
Verwendete Arabidopsis thaliana Genotypen . . . . . . . . . . . . . . .
Suszeptibilität von Col-0 und pgm bei Infektionen zu verschiedenen Tageszeiten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2 Gehalt an löslichen Zuckern und Stärke in Arabidopsis-Blättern nach verlängerten Dunkelphasen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3 Gehalt an löslichen Zuckern und Stärke in cca1/lhy . . . . . . . . . . . .
3.4 Gehalt löslicher Phenylpropane in Arabidopsis nach einer Infektion mit
C. higginsianum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.5 Gehalt zellwandgebundener Phenylpropane in Arabidopsis nach einer
Infektion mit C. higginsianum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.6 Suszeptibilität von Arabidopsis-Mutanten der Glucosinolat- und Camalexinbiosynthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.7 Protoplast Release Assay der Genotypen Col-0, pgm, adg1-1 und sex1-1 .
3.8 Selektierte Kandidaten aus der Durchmusterung chemisch mutagenisierter Arabidopsis pgm Mutanten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.9 Übersicht der 63 pgm Suszeptibilitäts-Suppressor Kandidaten . . . . . . .
3.10 Tabellarische Auflistung des Resistenzgrades der selektierten EMS
Mutanten im Col-0 und pgm Hintergrund . . . . . . . . . . . . . . . . .
25
3.1
A.1 Liste der verwendeten Oligonukleotide . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A.2 Kohlenhydratgehalte in Arabidopsis nach Infektion mit C. higginsianum
und Kontrollbehandlung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A.3 Elutionszeiten und Absorptionsmaxima analysierter Phenlypropane . . .
A.4 Analyse von Transkript-Daten von Genen des Zellwand-Metabolismus in
pgm im Vergleich zu Col-0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A.5 Kartierung der Linie 3-6-8. Tabellarische Auflistung der Rekombinationsereignisse im Bereich genetischer Marker . . . . . . . . . . . . . . . . .
A.6 Kartierung der Linie 7-16-2. Tabellarische Auflistung der Rekombinationsereignisse im Bereich genetischer Marker . . . . . . . . . . . . . . .
A.7 Kartierung der Linie 8-18-1. Tabellarische Auflistung der Rekombinationsereignisse im Bereich genetischer Marker . . . . . . . . . . . . . . .
A.8 Kartierung der Linie 9-7-10. Tabellarische Auflistung der Rekombinationsereignisse im Bereich genetischer Marker . . . . . . . . . . . . . . .
A.9 Liste der Gene auf Chromosom 3 von Arabidopsis im Bereich von 21,1
Mb bis 21,9 Mb . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
45
51
53
58
59
61
66
77
78
82
139
141
142
144
144
145
145
146
153
135
Abkürzungsverzeichnis
AGP Arabinogalactan-Protein
A. thaliana Arabidopsis thaliana
ATP Adenosintriphosphat
AtPID Arabidopsis thaliana Protein Interactome Database
CAPS cleaved amplified polymorphic sequence
C. higginsianum Colletotrichum higginsianum
Col-0 Columbia
DAMP damage-associated molecular pattern
E. cruciferarum Erysiphe cruciferarum
EHM extrahaustorielle Membran
EHMx extrahaustorielle Matrix
EMS Ethylmethansulfonat
ET Ethylen
HPAEC-PAD Hochleistungsanionenaustauschchromatographie mit gepulster amperometrischer Detektion
HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
H. parasitica Hyaloperonospora parasitica
HR hypersensitive response
IGS Indol-Glucosinolat
JA Jasmonsäure
JA-Ile Jasmonyl-Isoleucin
Ler Landsberg erecta
MAMP microbe-associated molecular pattern
H2 Odd doppelt destilliertes Wasser
MTI MAMP-triggered immunity
o-ANI Ortho-Anissäure
PCR Polymerase-Kettenreaktion
pSSK pgm Suszeptibilitäts-Suppressor Kandidat
PR pathogenesis related
PRA protoplast release assay
PRR pattern recognition receptor
RGR relative growth rate
RLK receptor like kinase
RLP receptor like protein
ROS reactive oxygen species
SA Salicylsäure
SAR systemic acquired resistance
SDS Natriumlaurylsulfat
SEX starch excess
SSLP simple sequence length polymorphism
SNP single nucleotide polymorphism
TFA Trifluoressigsäure
TRAF tumor necrosis factor receptor-associated factor
136
Anhang
A.1 Verwendete Oligonukleotide
Nummer
Name
Sequenz (5’-3’)
Verwendung
TE 15
TE 16
RH 166
RH 167
TE 74
TE 75
TE 173
TE 177
TE 112
TE 113
TE 114
TE 115
TE 118
TE 119
TE 122
TE 123
TE 167
TE 168
TE 153
TE 154
TE 155
TE 156
TE 157
TE 158
TE 159
TE 160
TE 161
TE 162
TE 178
TE 179
TE 180
TE 181
TE 182
TE 183
TE 184
TE 185
TE 186
TE 187
TE 188
TE 189
TEM 3
TEM 4
TEM 5
TEM 6
ChTrpC_fw
ChTrpC_rv
PA7-P19 qPCR rv
PA7-P19 qPCR fw
AtRBCS1A-fw2
AtRBCS1A-rv2
Ec-Q_fw1
Ec-Q_rv
PR1-probe-fw
PR1-probe-rv
PR2-probe-fw
PR2-probe-rv
PR4-probe-fw
PR4-probe-rv
Pdf1.2a-probe-fw
Pdf1.2a-probe-rv
N210_CAPS-fw
N210_CAPS-rv
dmr6 fw, dmr6_78,5 fw
dmr6 rv, dmr6_82,5 rv
dmr6_78,5 rv
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dmr6_79,5 rv
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pmr6_1 fw
pmr6_1 rv
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pmr6_6 fw
pmr6_6 rv
2-AC004697-8295 fw
2-AC004697-8295 rv
3-AB022217-2402 fw
3-AB022217-2402 rv
AGGTTCAGACTGCCGAAGAG
TCAGCCTGCTTGTTGTGTTC
CGAAGGATAGTGGGATTGTGCGTC
CCATCATTGCGATAAAGGAAAGGC
TGATGGACGGTACTGGACAA
GAAGCTTGGTGGCTTGTAGG
TGACAGCCCGGAATGAGT
TTGTCTTCGTTTCCCAGGTC
CTAAGGGTTCACAACCAGGC
CGTTCACATAATTCCCACGA
CCACTGACACCACCACTGATAC
CGACACCACGATTTCCAAC
GAGCCGTGAGTGCTTATTGC
AATATCAAACGCGATCAATGG
TTGCTTCCATCATCACCCTT
AACAACAACGGGAAAATAAACATT
CTCACAGGCAAATGGAGGAT
CAGGCTGACCACTGCTGTAA
CATTAACCAAATTAACCAAGAACC
CACGAAATCCACCCATCATAC
GACGGCCACTCATTGACATA
CAGACGATCCAACGAAGACA
AAACCAAATGGGACCACAAG
CGATTCGATTTGTTTGAAGGA
CGAAGAATTTGTGGCGAATA
GGAAGAGACGTCACTGTACAC
GGGCCGGATCACATTTATTT
GGTTGGTTTCGACTTCAACTTT
TGCTTTAGCGACGACTTTGA
GGGTTTGTTGGGTTGTTGTC
ACCCAACACCAGGAACACTC
CTCTTTGGCGCTAGGATCAG
CTGATCCTAGCGCCAAAGAG
ATTCACCATCGTCCTTCGAG
ATTGTTTGCTGATCGGTGGT
AGAACCTCAAACAAGAAAGAACC
GGTTCTTTCTTGTTTGAGGTTCT
GAATTGCCACTCTGACCTTGA
GGGTTAGGGATGATCAAGGTC
TCGCTATTAGCATCACTTGAAGA
ATGAACGGAGTAGCTATC
CGCGTAGAACATAATCTGTA
ACCTGTTCAGTCTATGTTAC
GGGAATTATTAACATTATCA
C. h. qPCR
C. h. qPCR
C. h. qPCR
C. h. qPCR
E. c. qPCR
E. c. qPCR
E. c. qPCR
E. c. qPCR
Nb-Sonde
Nb-Sonde
Nb-Sonde
Nb-Sonde
Nb-Sonde
Nb-Sonde
Nb-Sonde
Nb-Sonde
N210 CAPS
N210 CAPS
DMR6 Seq
DMR6 Seq
DMR6 Seq
DMR6 Seq
DMR6 Seq
DMR6 Seq
DMR6 Seq
DMR6 Seq
DMR6 Seq
DMR6 Seq
PMR6 Seq
PMR6 Seq
PMR6 Seq
PMR6 Seq
PMR6 Seq
PMR6 Seq
PMR6 Seq
PMR6 Seq
PMR6 Seq
PMR6 Seq
PMR6 Seq
PMR6 Seq
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
137
A NHANG
TEM 7
TEM 8
TEM 15
TEM 16
TEM 17
TEM 18
TEM 19
TEM 20
TEM 31
TEM 32
TEM 33
TEM 34
TEM 35
TEM 36
TEM 37
TEM 38
TEM 39
TEM 40
TEM 41
TEM 42
TEM 43
TEM 44
TEM 47
TEM 48
TEM 49
TEM 50
TEM 51
TEM 52
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TEM 96
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3-AL353032-9255 rv
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F21M12 fw
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ciw 12 rv
ciw 1 fw
ciw 1 rv
nga 280 fw
nga 280 rv
nga 111 fw
nga 111 rv
ciw 2 fw
ciw 2 rv
ciw 3 fw
ciw 3 rv
nga 1126 fw
nga 1126 rv
nga 168 fw
nga 168 rv
ACTGCACATTGCACGAACA
GGATGGCAACTTAGGCTGAA
CAATCTAACAAGGCAAAAG
CTCGCAACCAACCTACAAG
GTCGGCAAAATAAAGAGGAA
CATGGAAATCTTTGAAAGTT
CAATGGGAAGAAGGTGTGAG
CGCATTTCCATAAGTTTGTT
CCGAATGGCACAAACATA
AACCACCAAACTCCAAATAA
ACGAATATTGATTGTCTAAG
AACCTAAGGGAAGGCTAC
TGTGTGAATCGTGATTGA
CACCACCATGTAAAACTTAG
AGCCCTCCCTCTACAAAAAC
CAAAGCACATACCTGGGAAC
GCCAGGACCAGACGATATT
AGCCATTTCACTTTGTAAGG
TCTTTTCTGTACCCTGAG
ATGTTGCTTATGAGTCTG
ATGTTCACGATTTCGTACAC
TGCTAGCCATAACAATACAC
TGTCGGCAAAATAGGACC
GCGGGAATACACTACCAC
CGTTTGTGTTATGACTTAT
ATGTTTTTGAAGTTGTTGT
TATGTGGCAAATCAGAGCTT
TTTTGAATGTTGCCAATTTA
ACGTCGTCGTTTCTTAAACA
AACCCAGCTTTTGGAACTTG
GTATTTGAATTATTTACTAAAGAG
GATTAGTAACAAACGGTTAAAC
TGGCATTATAATCAAACTGAAAC
GCTAGACAAACTAATTTAATGCC
TTTTCAAAACCCCATCCGGG
TTGGGTTTTCTTGCAGGCGT
CTCTGGACCATTTGGAGGGT
GGAAAGCTACCGCATGATTGT
TTACTTTTTGCCTCTTGTCATTG
GGCTTTCTCGAAATCTGTCC
AGGTTTTATTGCTTTTCACA
CTTTCAAAAGCACATCACA
ACATTTTCTCAATCCTTACTC
GAGAGCTTCTTTATTTGTGAT
GGCTCCATAAAAAGTGCACC
CTGATCTCACGGACAATAGTGC
TGTTTTTTAGGACAAATGGCG
CTCCAGTTGGAAGCTAAAGGG
CCCAAAAGTTAATTATACTGT
CCGGGTTAATAATAAATGT
GAAACTCAATGAAATCCACTT
TGAACTTGTTGTGAGCTTTGA
GCACAGTCCAAGTCACAACC
CGCTACGCTTTTCGGTAAAG
GAGGACATGTATAGGAGCCTCG
TCGTCTACTGCACTGCCG
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SNP
SNP
SNP
SNP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
138
A NHANG
nga 162 fw
nga 162 rv
ciw 11 fw
ciw 11 rv
ciw 4 fw
ciw 4 rv
nga 6 fw
nga 6 rv
ciw 5 fw
ciw 5 rv
ciw 6 fw
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nga 1107 fw
nga 1107 rv
CTR 1 fw
CTR 1 rv
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ciw 8 rv
PHYC fw
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nga 151 rv
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nga 139 rv
nga 76 fw
nga 76 rv
CTCTGTCACTCTTTTCCTCTGG
CATGCAATTTGCATCTGAGG
CCCCGAGTTGAGGTATT
GAAGAAATTCCTAAAGCATTC
GTTCATTAAACTTGCGTGTGT
TACGGTCAGATTGAGTGATTC
ATGGAGAAGCTTACACTGATC
TGGATTTCTTCCTCTCTTCAC
GGTTAAAAATTAGGGTTACGA
AGATTTACGTGGAAGCAAT
CTCGTAGTGCACTTTCATCA
CACATGGTTAGGGAAACAATA
AATTTGGAGATTAGCTGGAAT
CCATGTTGATGATAAGCACAA
CGACGAATCGACAGAATTAGG
GCGAAAAAACAAAAAAATCCA
CCACTTGTTTCTCTCTCTAG
TATCAACAGAAACGCACCGAG
TAGTGAAACCTTTCTCAGAT
TTATGTTTTCTTCAATCAGTT
AAACTCGAGAGTTTTGTCTAGATC
CTCAGAGAATTCCCAGAAAAATCT
CAGACGTATCAAATGACAAATG
GACTACTGCTCAAACTATTCGG
CCACATTTTCCTTCTTTCATA
CAACATTTAGCAAATCAACTT
CAGTCTAAAAGCGAGAGTATGATG
GTTTTGGGAAGTTTTGCTGG
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AGAGCTACCAGATCCGATGG
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SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
SSLP
Tabelle A.1 Liste der verwendeten Oligonukleotide. Die Sequenzen sind in 5’-3’ Leserichtung angegeben. Sofern vorhanden, ist neben dem Namen der Oligonukleotide auch eine Lager-Nummer
angegeben. Die Liste ist nach dem Verwendungszweck der Oligonukleotide sortiert. C. h.: Colletotrichum higginsianum, E. c.: Erysiphe cruciferarum, Seq: Sequenzierung, Nb: Northernblot,
SSLP: simple sequence length polymorphism, SNP: single nucleotide polymorphism.
139
A NHANG
A.2 Kohlenhydratgehalte in Arabidopsis nach Infektion mit
C. higginsianum und Kontrollbehandlung
Glukose
Fruktose
Saccharose
lösliche
Zucker
Stärke
Gesamt
3,90
± 0,82
3,28
± 0,21
49,23
± 1,48
15,76
± 3,16
0,75
± 0,42
0,27
± 0,27
0,30
± 0,18
0,00
± 0,00
0,00
± 0,00
0,24
± 0,24
0,27
± 0,27
0,00
± 0,00
109,16
± 5,23
169,97
± 7,43
130,84
± 6,84
190,84
± 38,19
0,76
± 0,38
6,34
± 3,75
33,82
± 2,03
8,15
± 0,91
4,79
± 1,83
1,72
± 0,38
46,26
± 1,37
12,90
6,22
± 0,74
10,48
± 1,14
53,97
± 1,74
27,74
± 6,23
1,62
± 0,36
9,29
± 4,69
11,75
± 1,00
15,46
± 0,44
1,09
± 0,06
5,14
± 0,67
14,72
± 0,82
12,15
± 4,88
110,48
± 5,21
174,87
± 8,51
135,25
± 6,74
206,36
± 36,08
2,36
± 0,40
16,64
± 5,11
37,23
± 2,25
16,09
± 1,78
6,81
± 1,78
5,90
± 1,55
49,73
± 1,17
23,55
(µmol · g−1 FW)
Col-0
3,5 dpi
Kontrolle
infiziert
4 dpi
Kontrolle
infiziert
pgm
3,5 dpi
Kontrolle
infiziert
4 dpi
Kontrolle
infiziert
adg1-1
3,5 dpi
Kontrolle
infiziert
4 dpi
Kontrolle
infiziert
sex1-1
3,5 dpi
Kontrolle
infiziert
4 dpi
Kontrolle
infiziert
mur8-1
3,5 dpi
Kontrolle
infiziert
4 dpi
Kontrolle
infiziert
MEm4
3,5 dpi
Kontrolle
infiziert
4 dpi
Kontrolle
infiziert
0,96
± 0,24
1,92
± 0,38
2,01
± 0,45
2,68
± 1,05
0,84
± 0,17
1,85
± 0,90
7,49
± 0,71
2,98
± 0,75
1,09
± 0,06
1,35
± 0,36
9,72
± 0,43
1,98
± 0,89
1,23
± 0,12
1,48
± 0,16
2,66
± 0,22
4,76
± 0,39
0,86
± 0,04
1,27
± 0,07
1,31
± 0,30
1,02
± 0,28
0,82
± 0,20
1,67
± 0,47
1,04
± 0,14
1,75
0,10
± 0,02
1,37
± 0,16
0,29
± 0,07
1,91
± 0,66
0,00
± 0,00
2,71
± 1,35
1,32
± 0,20
3,83
± 0,44
0,00
± 0,00
2,20
± 0,41
1,73
± 0,42
3,40
± 2,13
0,00
± 0,00
1,32
± 0,08
0,22
± 0,04
4,42
± 0,18
0,07
± 0,02
1,60
± 0,20
0,13
± 0,02
1,92
± 0,46
0,11
± 0,03
0,55
± 0,08
0,19
± 0,04
1,55
0,63
± 0,03
1,96
± 0,35
1,22
± 0,15
3,69
± 0,73
0,02
± 0,02
2,23
± 1,38
1,32
± 0,12
4,33
± 0,38
0,00
± 0,00
0,67
± 0,19
1,50
± 0,09
3,38
± 1,13
0,04
± 0,02
0,89
± 0,38
0,77
± 0,06
3,17
± 0,95
0,34
± 0,02
3,72
± 0,87
0,98
± 0,04
2,50
± 0,59
0,55
± 0,08
0,98
± 0,47
1,12
± 0,03
3,67
2,32
± 0,26
7,20
± 0,97
4,74
± 0,74
11,98
± 3,09
0,87
± 0,15
9,02
± 4,92
11,45
± 1,13
15,46
± 0,44
1,09
± 0,06
4,90
± 0,43
14,46
± 0,92
12,15
± 4,88
1,32
± 0,10
4,58
± 0,70
4,41
± 0,28
15,52
± 2,11
1,60
± 0,02
10,30
± 1,68
3,41
± 0,27
7,95
± 1,49
2,02
± 0,12
4,17
± 1,17
3,47
± 0,20
10,65
140
A NHANG
tpt1-2
3,5 dpi
Kontrolle
infiziert
4 dpi
Kontrolle
infiziert
Col-0 SD
3,5 dpi
Kontrolle
infiziert
4 dpi
Kontrolle
infiziert
MEm4 SD
3,5 dpi
Kontrolle
infiziert
4 dpi
Kontrolle
infiziert
N9808
3,5 dpi
Kontrolle
infiziert
4 dpi
Kontrolle
infiziert
cca1/lhy
3,5 dpi
Kontrolle
infiziert
4 dpi
Kontrolle
infiziert
± 0,10
1,59
± 0,14
0,89
± 0,16
3,49
± 0,53
0,82
± 0,08
2,80
± 0,73
0,95
± 0,44
3,44
± 1,03
4,07
± 0,47
1,03
± 0,37
0,58
± 0,08
1,81
± 0,74
2,76
± 0,54
1,72
± 0,14
7,43
± 1,15
2,45
± 0,29
8,06
± 0,55
0,55
± 0,35
0,72
± 0,08
2,20
± 0,30
3,68
± 1,18
± 0,14
0,43
± 0,06
0,79
± 0,06
0,40
± 0,07
0,96
± 0,27
0,53
± 0,17
0,50
± 0,03
1,11
± 0,68
2,95
± 0,16
0,21
± 0,12
0,20
± 0,06
0,14
± 0,03
2,06
± 0,33
0,09
± 0,05
3,50
± 0,46
0,28
± 0,22
5,99
± 0,74
0,45
± 0,30
1,07
± 0,15
1,82
± 0,26
6,16
± 1,50
± 0,48
1,09
± 0,25
1,93
± 0,53
1,26
± 0,01
2,11
± 0,18
0,63
± 0,11
0,02
± 0,01
1,05
± 0,21
1,62
± 0,19
0,55
± 0,02
0,18
± 0,10
0,76
± 0,11
3,72
± 1,01
0,44
± 0,07
0,80
± 0,14
0,98
± 0,08
2,40
± 0,14
0,14
± 0,12
0,48
± 0,23
1,56
± 0,27
2,49
± 0,66
± 0,79
4,20
± 0,35
5,54
± 0,86
6,41
± 0,57
6,00
± 0,66
4,59
± 1,12
1,49
± 0,44
6,65
± 2,12
10,27
± 0,08
2,35
± 0,46
1,13
± 0,22
3,48
± 0,71
12,26
± 2,48
2,70
± 0,10
12,52
± 1,77
4,69
± 0,27
18,84
± 1,23
1,28
± 0,88
2,75
± 0,56
7,14
± 1,07
14,82
± 3,80
± 2,23
9,26
± 2,70
10,50
± 1,34
57,94
± 3,77
18,19
± 2,85
5,71
± 1,04
1,39
± 0,01
40,49
± 2,69
20,80
± 5,37
5,06
± 0,94
0,93
± 0,53
38,87
± 1,84
11,41
± 1,95
3,90
± 0,59
6,20
± 1,04
51,29
± 3,47
28,95
± 3,74
0,74
± 0,38
2,40
± 1,21
28,08
± 6,08
7,50
± 2,75
± 1,49
13,46
± 3,04
16,05
± 2,05
64,35
± 3,96
24,19
± 3,21
10,30
± 1,96
2,87
± 0,43
47,13
± 0,88
31,07
± 5,44
7,41
± 1,38
2,06
± 0,39
42,35
± 2,35
23,67
± 3,42
6,61
± 0,50
18,72
± 2,16
55,99
± 3,44
47,79
± 3,46
2,02
± 1,21
5,14
± 1,41
35,22
± 6,97
22,32
± 3,81
Tabelle A.2 Kohlenhydratgehalte in Arabidopsis nach Infektion mit C. higginsianum und Kontrollbehandlung. Der Gehalt an Glukose, Fruktose, Saccharose, löslichen Zuckern (Summe aus
Glukose, Fruktose, Saccharose), Stärke und Gesamt-Kohlenhydraten (Summe aus löslichen Zuckern und Stärke) wurde 3,5 dpi und 4 dpi in den angegebenen Arabidopsis Genotypen nach
Infektion mit C. higginsianum bzw. nach Kontrollbehandlung analysiert. Alle Werte sind Mittelwerte aus drei biologischen Replikaten ± Standardfehler.
141
A NHANG
A.3 Elutionszeiten und Absorptionsmaxima analysierter
Phenlypropane
lösliche Kaempferol-Derivate
K1
K2
K3
lösliche Quercetin-Derivate
Q1
Q2
Q3
lösliche HCA-Derivate
H1
H2
H3
H4
lösliche Phenol-Derivate
P1
P2
P3
zellwandgebundene Phenylpropane
HCA 5
Phenol 4
Elutionszeit (min)
Absorptionsmaxima (nm)
36,8
35,9
28,2
197, 265, 343
198, 266, 346
197, 266, 347
37,3
33,9
25,3
209, 262, 354
211, 263, 357
200, 260, 355
38,4
36,0
25,6
37,9
197, 239, 330
197, 238, 329
198, 220sh, 330
199, 232sh, 330
20,5
24,3
41,4
210, 232sh, 319
206, 242sh, 307
204, 237, 303
8,8
9,6
193, 238, 324
200, 314
Tabelle A.3 Elutionszeiten und Absorptionsmaxima analysierter Phenlypropane. Die Elutionszeiten und Absorptionsmaxima der löslichen Kaempferol-, Quercetin-, Hydroxyzimtsäure (HCA)
und Phenol-Derivate aus Tabelle 3.4 und der zellwandgebundenen Phenylpropane HCA 5 und
Phenol 4 aus Tabelle 3.5 sind aufgelistet. Schultern (sh) der Spektren sind entsprechend gekennzeichnet.
142
A NHANG
A.4 Analyse von Transkript-Daten von Genen des
Zellwand-Metabolismus in pgm im Vergleich zu Col-0
Kennung
Gen-Modell
247866_at
247925_at
260568_at
263565_at
253666_at
endoxyloglucan transferase
TCH4 protein
endochitinase isolog
unknown protein
xyloglucan endo-1,4-beta-D-glucanase
precursor
hypothetical protein
putative pectinesterase
chitinase
hevein-like protein precursor (PR-4)
putative chitinase
putative protein kinase
putative endochitinase
basic chitinase
hypothetical protein
putative glucan synthase
pectinesterase - like protein
cytochrome P450
putative protein
trehalose-6-phosphate synthase
pectinesterase precursor-like protein
allergen like protein
class I chitinase
putative indole-3-acetate
beta-glucosyltransferase
putative glycosyl transferase
putative pectin methylesterase
hypothetical protein
putative UDP-N-acetylmuramoylalanylD-glutamate-2,6-diaminopimelate ligase
hypothetical protein
putative cytochrome P450
putative glucosyltransferase
putative xyloglucan endotransglycosylase
putative xyloglucan endo-transglycosylase
polygalacturonase PG1
pectin methylesterase - like protein
putative protein
pectinesterase - like protein pectinesterase
unknown protein
cytochrome P450 - like protein
subtilisin-like serine protease
cellulose synthase catalytic subunit
endo-xyloglucan transferase
putative beta-expansin/allergen protein
expansin 10
cellulose synthase catalytic subunit
hypothetical protein
putative protein
unknown protein
266156_at
245148_at
259443_at
258791_at
255595_at
255844_at
260556_at
256243_at
259553_x_at
263183_at
253370_at
247949_at
247487_at
263136_at
251509_at
245463_at
261279_at
264873_at
257816_at
264573_at
265175_at
260292_at
260867_at
264052_at
265824_at
257203_at
263841_at
260727_at
250490_at
247563_at
252255_at
260857_at
252827_at
253218_at
252886_at
261825_at
253815_at
261266_at
250505_at
262109_at
253925_at
259763_at
d0
d4
d8
d 12
d 16
d 20
11,16
7,11
6,49
3,85
3,75
3,33
2,87
8,38
1,79
2,22
0,97
1,55
6,51
1,60
1,15
1,83
1,33
6,76
1,32
1,57
8,45
6,80
7,10
3,06
2,71
8,38
8,40
5,88
3,23
4,05
3,64
3,58
3,44
2,87
2,73
2,57
2,55
2,46
2,41
2,41
2,22
2,08
2,07
-2,00
-2,02
-2,03
-2,05
-2,05
1,54
1,57
2,32
2,69
6,31
4,00
2,48
2,54
1,61
2,41
1,27
1,05
1,82
0,78
0,87
0,62
0,83
1,28
1,76
0,84
1,78
2,01
2,89
2,00
2,25
2,56
2,01
1,78
1,29
0,87
1,54
0,85
0,93
1,24
0,92
1,47
1,88
1,04
1,48
2,44
1,26
1,94
1,57
3,16
2,30
1,52
1,82
0,74
2,60
1,00
0,96
1,40
0,79
1,15
1,94
1,87
3,21
2,91
1,87
2,52
2,52
2,53
2,03
1,65
1,37
1,88
1,86
0,61
0,70
0,99
0,92
0,92
4,56
2,99
3,57
3,98
2,86
2,75
3,53
3,82
2,50
2,66
1,30
3,78
2,56
0,43
0,42
0,55
0,65
0,48
-2,12
-2,20
-2,20
-2,23
0,97
0,63
0,90
1,08
1,04
0,91
1,02
0,98
1,18
0,80
0,76
0,90
0,63
0,91
1,04
0,72
0,44
0,49
0,46
0,76
-2,31
-2,35
-2,42
-2,43
-2,43
-2,50
-2,50
-2,53
-2,59
-2,59
-2,64
-2,71
-2,73
-2,76
-2,77
-2,83
-2,84
-2,87
-3,07
-3,10
0,58
1,14
1,10
0,83
0,64
0,43
0,84
1,11
0,98
1,00
3,06
1,46
0,89
1,02
0,53
0,94
1,43
0,38
0,96
1,25
0,78
0,79
0,90
0,67
1,02
0,55
1,05
1,25
0,97
1,10
2,76
1,34
1,08
0,77
1,36
0,86
1,56
0,70
0,63
1,13
0,99
0,85
0,92
1,05
0,72
1,11
1,11
0,87
0,96
1,38
2,32
0,80
0,61
0,73
0,95
0,57
0,93
0,85
0,69
0,86
0,75
1,00
0,86
0,47
0,59
0,77
0,72
0,86
0,36
0,67
0,81
0,55
0,72
0,34
1,60
0,58
0,58
0,82
0,70
0,83
0,47
0,65
0,72
0,38
0,50
0,43
0,48
0,52
0,32
0,33
0,47
0,57
0,51
0,23
0,51
0,44
0,38
0,52
0,58
0,38
143
A NHANG
266790_at
258003_at
252607_at
248085_at
261834_at
267595_at
259736_at
250892_at
253040_at
expansin AtEx6
expansin At-EXP5
xyloglucan endo-transglycosylase
putative protein
polygalacturonase PG1
putative glucanse
endo-beta-1,4-glucanase
putative protein beta-(1-3)-glucosyl
transferase
endo-xyloglucan transferase - like protein
-3,24
-3,41
-3,87
-3,88
-4,11
-4,20
-4,34
-4,41
1,02
1,13
0,31
1,12
0,69
1,01
0,73
0,91
1,51
1,31
0,80
0,98
1,65
1,38
0,98
1,17
1,26
0,90
0,32
1,00
1,29
1,05
0,83
0,66
0,84
0,52
0,30
0,77
0,93
0,81
0,37
0,48
0,43
0,28
0,16
0,42
0,21
0,29
0,16
0,16
-6,82
0,95
0,97
1,31
0,86
0,15
Tabelle A.4 Analyse von Transkript-Daten von Genen des Zellwand-Metabolismus in pgm im
Vergleich zu Col-0. Die vergleichende Transkript-Analyse von Col-0 und pgm aus Bläsing et al.
(2005) wurde re-analysiert um transkriptionelle Unterschiede in der Expression von Genen des
Zellwand-Metabolismus zwischen den Genotypen zu identifizieren. Gene wurden nach Zellwandbezogenen Gene Ontology (GO) Bezeichnungen selektiert. Aufgelistet sind Expressionsunterschiede von Transkripten in pgm gegenüber Col-0 mit einer mindestens zweifachen Deregulation. Die Zeitpunkte d 4, d 8 und d 12 entsprechen 4 h, 8 h und 12 h nach Beginn der Lichtphase,
die Zeitpunkte d 16, d 20 und d 0 entsprechen 4 h, 8 h und 12 h nach Beginn der Dunkelphase
in einem 12 h/12 h Licht-/Dunkelzyklus. Die Daten sind nach Unterschieden in pgm gegenüber
Col-0 am Ende der Dunkelphase (d 0) sortiert.
A.5 Kartierungsergebnisse der pgm EMS Linien 3-6-8, 7-16-2, 8-18-1
und 9-7-10
Marker
Chromosom
Position (bp)
Gesamt (n)
Col-0
HEZ
Ler
R (%)
nga 168
2-AC004697-8295
2
2
16298919
16339214
35
41
20
18
10
18
5
5
28,6
34,1
3-AC009325-0089
3-AC009540-0422
3-AC011623-0832
nga 162
3-AB022217-2402
3-AB028622-3297
ciw 11
3
3
3
3
3
3
3
209239
989952
1951552
4608284
5634662
7734158
9775545
19
29
74
114
113
115
29
16
26
71
112
111
112
23
1
1
2
1
1
1
5
2
2
1
1
1
2
1
13,2
8,6
2,7
1,3
1,3
2,2
12,1
Tabelle A.5 Kartierung der Linie 3-6-8. Tabellarische Auflistung der Rekombinationsereignisse
im Bereich genetischer Marker. Alle SSLP Marker wurden von Lukowitz et al. (2000) oder auf
http://amp.genomics.org.cn veröffentlicht. Angegeben ist der genaue Lokus jedes Markers, die
jeweilige Anzahl an Rekombinationsereignissen, sowie die berechnete Rekombinationsfrequenz
(R) des Markers. Die Anzahl an getesteten Individuen mit den verschiedenen Markern variierte.
Zunächst wurden stets Individuen mit einem starken Phänotyp bevorzugt. Da bei der Analyse zusätzlicher Individuen der Anteil an Falsch- Positiven anstieg, wurden potentiell Falsch- Positive
Individuen nicht berücksichtigt, um einen Vergleich der Rekombinationsfrequenzen zu ermöglichen.
144
A NHANG
Marker
Chromosom
Position (bp)
Gesamt (n)
Col-0
HEZ
Ler
R (%)
nga 168
2-AC004697-8295
2
2
16298919
16339214
42
40
14
13
23
22
5
5
39,3
40,0
nga 151
ciw 8
nga 139
nga 76
PHYC
ciw 9
5
5
5
5
5
5
4669929
7485588
8428133
10418610
14025127
17061229
42
42
42
42
41
41
23
37
40
35
29
20
17
5
2
7
11
15
2
0
0
0
1
6
25,0
6,0
2,4
8,3
15,9
32,9
Tabelle A.6 Kartierung der Linie 7-16-2. Tabellarische Auflistung der Rekombinationsereignisse im Bereich genetischer Marker. Alle SSLP Marker wurden von Lukowitz et al. (2000), auf
http://www.arabidopsis.org oder auf http://amp.genomics.org.cn veröffentlicht. Angegeben ist der
genaue Lokus jedes Markers, die jeweilige Anzahl an Rekombinationsereignissen, sowie die berechnete Rekombinationsfrequenz (R) des Markers.
Marker
Chromosom
Position (bp)
Gesamt (n)
Col-0
HEZ
Ler
R (%)
F21M12
ciw 1
nga 111
1-AC007396-9378
1-AC018848-9929
1
1
1
1
1
3212189
18363881
27353212
28533866
30211403
31
23
33
32
31
9
5
9
7
7
11
12
23
23
22
11
6
1
2
2
53,2
52,2
37,9
42,2
41,9
ciw 3
2-AC004697-8295
2-AC005662-8750
2-AC005309-9927
2
2
2
2
6402846
16339214
17235779
19554916
20
32
29
22
8
14
13
12
8
14
15
9
4
4
1
1
40,0
34,4
29,3
25,0
ciw 11
ciw 4
3
3
9775545
18890837
25
32
5
9
14
20
6
3
52,0
40,6
ciw 5
nga 1107
4
4
737954
18096137
33
32
13
10
11
17
9
5
43,9
42,2
CTR 1
ciw 9
5
5
979764
17061229
30
31
6
5
17
15
7
11
51,7
59,7
Tabelle A.7 Kartierung der Linie 8-18-1. Tabellarische Auflistung der Rekombinationsereignisse
im Bereich genetischer Marker. Alle SSLP Marker wurden von Lukowitz et al. (2000) oder auf
http://amp.genomics.org.cn veröffentlicht. Angegeben ist der genaue Lokus jedes Markers, die
jeweilige Anzahl an Rekombinationsereignissen, sowie die berechnete Rekombinationsfrequenz
(R) des Markers.
145
A NHANG
Marker
Chromosom
Position (bp)
Gesamt (n)
Col-0
HEZ
Ler
R (%)
ciw 4
3-AL049655-8652
3-AL132970-8703
3-AL138655-8996
3-AL133248-9081
pss 2
pss 3
pss 7
pss 8
3-AL353032-9255
3-AL356014-9336
3-AL138642-9749
nga 6
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
18890837
20297877
20415935
21104151
21303420
21437350
21509856
21589833
21608191
21713192
21903190
22871575
23031050
38
37
104
103
96
16
81
4
4
180
38
35
37
31
30
97
101
95
15
80
2
2
179
37
32
33
7
3
7
2
1
1
1
2
1
1
1
3
4
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
9,2
4,1
3,4
1,0
0,5
CTR 1
5
979764
41
18
16
7
36,6
0,6
0,3
1,3
4,3
5,4
Tabelle A.8 Kartierung der Linie 9-7-10. Tabellarische Auflistung der Rekombinationsereignisse
im Bereich genetischer Marker. Verwendete Marker wurden von Lukowitz et al. (2000) bzw. auf
http://amp.genomics.org.cn veröffentlicht (nur SSLP Marker), oder auf Basis von Polymorphismen in der genomischen Sequenz von Col-0 (TAIR10) bzw. Ler (Gan et al., 2011) entworfen
(SSLP: pss 2, pss 3; SNP: pss 7, pss 8). Angegeben ist der genaue Lokus jedes Markers, die
jeweilige Anzahl an Rekombinationsereignissen, sowie die berechnete Rekombinationsfrequenz
(R) des Markers. Die Anzahl an getesteten Individuen mit den verschiedenen Markern variierte.
Zunächst wurden stets Individuen mit einem starken Phänotyp bevorzugt. Da bei der Analyse
zusätzlicher Individuen der Anteil an Falsch-Positiven anstieg, wurden potentiell falsch-positive
Individuen nicht berücksichtigt, um einen Vergleich der Rekombinationsfrequenzen zu ermöglichen.
146
A NHANG
A.6 Liste der Gene zwischen 21,1 Mb und 21,9 Mb auf Chromosom 3
von Arabidopsis
Lokus
AGI
Gen-Modell: Beschreibung
21109614-21111432
21111700-21114636
21111700-21114643
21111700-21114662
21114798-21121051
21114867-21121113
21121338-21122569
21121346-21121878
21123924-21125647
21125699-21125836
21125857-21127636
21128530-21130189
21133013-21134482
21134924-21135334
21138905-21140610
21147558-21148664
21147835-21150027
21150422-21153507
21150422-21153596
21153973-21156009
21157011-21157247
21157610-21158816
21159407-21163184
21163545-21166138
21166403-21168376
21169265-21172316
21172827-21174172
21174455-21177119
21177423-21180932
21177710-21180874
21181742-21183075
21186719-21187251
21188517-21189859
21191237-21193189
21193780-21195716
21196550-21199183
21199488-21207885
AT3G57040.1
AT3G57050.3
AT3G57050.2
AT3G57050.1
AT3G57060.1
AT3G57060.2
AT3G57062.2
AT3G57062.1
AT3G57070.1
AT3G57072.1
AT3G57080.1
AT3G57090.1
AT3G57100.1
AT3G57110.1
AT3G57120.1
AT3G57130.2
AT3G57130.1
AT3G57140.1
AT3G57140.2
AT3G57150.1
AT3G57157.1
AT3G57160.1
AT3G57170.1
AT3G57180.1
AT3G57190.1
AT3G57200.1
AT3G57210.1
AT3G57220.1
AT3G57230.1
AT3G57230.2
AT3G57240.1
AT3G57250.1
AT3G57260.1
AT3G57270.1
AT3G57280.1
AT3G57290.1
AT3G57300.1
21199488-21207885
AT3G57300.2
21208200-21208511
AT3G57310.1
21209957-21210863
21209957-21210863
21211456-21216375
21218973-21220485
21219008-21220485
21220387-21225305
21225540-21226692
21226839-21228475
AT3G57320.2
AT3G57320.1
AT3G57330.1
AT3G57340.1
AT3G57340.2
AT3G57350.1
AT3G57360.1
AT3G57370.1
ARR9:response regulator-like protein
CBL
CBL
CBL
unknown protein
unknown protein
unknown protein
unknown protein
Glutaredoxin family protein
unknown protein
NRPE5:Nuclear DNA-dep. RNA polymerase V subunit
BIGYIN:similarity to yeast FIS proteins
Protein of unknown function (DUF677)
unknown protein
Protein kinase superfamily protein
BOP1
BOP2
SDP1-LIKE:sugar-dependent 1-like
SDP1-LIKE:sugar-dependent 1-like
NAP57:putative pseudouridine synthase
other RNA
unknown protein
N-acetylglucosaminyl transferase component family protein
BPG2:BRZ INSENSITIVE PALE GREEN 2
peptide chain release factor, putative
unknown protein
Protein of unknown function (DUF626)
Glycosyl transferase family 4 protein
AGL16:MADS-box transcription factor
AGL16:MADS-box transcription factor
BG3:glycosyl hydrolase family 17
Emsy N Terminus (ENT) domain-containing protein
BGL2:beta 1,3-glucanase
BG1:glycosyl hydrolase family 17
Transmembrane proteins 14C
EIF3E:eif3 complex protein
INO80:Arabidopsis INO80 ortholog of the
SWI/SNF ATPase family
INO80:Arabidopsis INO80 ortholog of the
SWI/SNF ATPase family
Bifunctional inhibitor/lipid-transfer protein/
seed storage 2S albumin superfamily protein
unknown protein
unknown protein
ACA11:autoinhibited Ca2+-ATPase 11
Protein of unknown function (DUF1977)
Protein of unknown function (DUF1978)
Nucleoporin interacting component (Nup93/Nic96-like)
unknown protein
Cyclin family protein
147
A NHANG
21229802-21231729
21233701-21235911
21233716-21235907
21238433-21240228
21243136-21251100
21252419-21255276
21255635-21258480
21258680-21260596
21261934-21262622
21263086-21265797
21269261-21276013
21269261-21276013
21269270-21276013
21277936-21279354
21279666-21280948
21281848-21282591
21283338-21285941
21288765-21293158
21288765-21293158
21288765-21293158
21296554-21299591
21301397-21303061
21306723-21309464
21306723-21309464
21310825-21312312
AT3G57380.1
AT3G57390.1
AT3G57390.2
AT3G57400.1
AT3G57410.1
AT3G57420.1
AT3G57430.1
AT3G57440.1
AT3G57450.1
AT3G57460.1
AT3G57470.2
AT3G57470.1
AT3G57470.3
AT3G57480.1
AT3G57490.1
AT3G57500.1
AT3G57510.1
AT3G57520.1
AT3G57520.2
AT3G57520.3
AT3G57530.1
AT3G57540.1
AT3G57550.2
AT3G57550.1
AT3G57560.1
21312444-21320365
21312498-21320299
21320491-21322379
21322564-21329357
21330182-21331396
21332783-21333863
AT3G57570.2
AT3G57570.1
AT3G57580.1
AT3G57586.1
AT3G57590.1
AT3G57600.1
21334284-21336674
21337564-21339301
21339302-21343152
21339302-21343796
21344800-21346057
21346342-21347204
21349507-21353174
AT3G57610.1
AT3G57620.1
AT3G57630.2
AT3G57630.1
AT3G57640.1
AT3G57645.1
AT3G57650.1
21353746-21362814
AT3G57660.1
21370903-21373446
21381054-21383629
21384204-21384572
21384676-21387399
21384917-21385939
21387722-21389726
21389964-21391562
21392671-21393744
21393979-21395244
21394024-21395288
21395593-21397244
21395617-21397242
21395618-21397242
AT3G57670.1
AT3G57680.1
AT3G57690.1
AT3G57710.1
AT3G57700.1
AT3G57720.1
AT3G57730.1
AT3G57740.1
AT3G57750.2
AT3G57750.1
AT3G57760.1
AT3G57760.3
AT3G57760.2
Glycosyltransferase family 61 protein
AGL18:MADS-box containing protein
AGL18:MADS-box containing protein
unknown protein
VLN3:high homology to animal villin
Protein of unknown function (DUF288)
OTP84:chloroplast RNA editing factor
unknown protein
unknown protein
catalytics;metal ion binding
Insulinase (Peptidase family M16)
Insulinase (Peptidase family M16)
Insulinase (Peptidase family M16)
zinc finger (C2H2 type, AN1-like)
Ribosomal protein S5 family protein
unknown protein
ADPG1:polygalacturonase protein
SIP2:seed imbibition 2
SIP2:seed imbibition 3
SIP2:seed imbibition 4
CPK32:Calcium-dependent Protein Kinase
Remorin family protein
AGK2:guanylate kinase
AGK2:guanylate kinase
NAGK:N-acetylglutamate kinase, involved in arginine
biosynthesis
ARM repeat superfamily protein
ARM repeat superfamily protein
F-box-containing protein
transposable element gene; non-LTR retrotransposon family
F-box and associated interaction domains-containing protein
encodes a member of the DREB subfamily A-2 of ERF/AP2
transcription factor family
ADSS:adenylosuccinate synthetase
glyoxal oxidase-related protein
exostosin family protein
exostosin family protein
Protein kinase superfamily protein
U2.2:snRNA; ATU22 Arabidopsis thaliana U2 RNA gene
LPAT2:endoplasmic reticulum localized protein with
lysophosphatidyl acyltransferase activity
NRPA1:subunit of RNA polymerase I
(aka RNA polymerase A)
NTT:NO TRANSMITTING TRACT (NTT)
Peptidase S41 family protein
AGP23:putative arabinogalactan-protein
Protein kinase superfamily protein
Protein kinase superfamily protein
Protein kinase superfamily protein
Protein kinase superfamily protein
Protein kinase superfamily protein
Protein kinase superfamily protein
Protein kinase superfamily protein
Protein kinase superfamily protein
Protein kinase superfamily protein
Protein kinase superfamily protein
148
A NHANG
21397262-21398132
21397542-21398853
21399766-21402899
21404574-21405217
21405387-21407624
21407789-21411612
21407809-21411721
21415784-21417948
21415799-21417948
21416083-21417948
21418281-21418824
21419517-21422546
21422823-21423287
21424377-21424791
21425479-21425926
21426314-21428253
AT3G57765.1
AT3G57770.1
AT3G57780.1
AT3G57785.1
AT3G57790.1
AT3G57800.1
AT3G57800.2
AT3G57810.2
AT3G57810.1
AT3G57810.3
AT3G57820.1
AT3G57830.1
AT3G57840.1
AT3G57850.1
AT3G57854.1
AT3G57860.1
21428496-21430200
21430983-21434600
AT3G57870.1
AT3G57880.1
21438084-21441888
21438203-21442021
21442281-21442574
21442748-21444312
21444321-21446035
21447107-21447959
21447109-21448690
21449298-21455961
21449444-21455961
21460423-21460968
21462681-21462881
21463091-21464194
21464702-21466627
21465226-21466677
21466919-21469148
21470002-21471486
21474950-21475477
21475805-21477569
21479480-21481349
21484156-21487054
21484467-21487042
21484469-21487010
21484479-21487051
21487317-21487398
21488516-21491488
AT3G57890.2
AT3G57890.1
AT3G57900.1
AT3G57910.1
AT3G57920.1
AT3G57930.2
AT3G57930.1
AT3G57940.1
AT3G57940.2
AT3G57950.1
AT3G57958.1
AT3G57960.1
AT3G57965.1
AT3G57970.1
AT3G57980.1
AT3G57990.1
AT3G58000.1
AT3G58010.1
AT3G58020.1
AT3G58030.4
AT3G58030.1
AT3G58030.3
AT3G58030.2
AT3G58035.1
AT3G58040.1
21492539-21497157
21497778-21499676
21506613-21507654
21510306-21510562
21512319-21514281
21515199-21516487
AT3G58050.1
AT3G58060.1
AT3G58070.1
AT3G58080.1
AT3G58090.1
AT3G58100.1
21516745-21519862
21516745-21519862
21520974-21523327
AT3G58110.1
AT3G58110.2
AT3G58120.1
U2.3:encodes a small nuclear RNA
Protein kinase superfamily protein
unknown protein
unknown protein
Pectin lyase-like superfamily protein
basic helix-loop-helix (bHLH) DNA-binding superfamily
basic helix-loop-helix (bHLH) DNA-binding superfamily
Cysteine proteinases superfamily protein
Cysteine proteinases superfamily protein
Cysteine proteinases superfamily protein
60S ribosomal protein L21 (RPL21F), pseudogene
Leucine-rich repeat protein kinase family protein
Plant self-incompatibility protein S1 family
unknown protein
pseudogene similar to self-incompatibility
UVI4-LIKE:Encodes a protein that controls entry into
the second meiotic division
SCE1:SUMO ligase
Calcium-dependent lipid-binding (CaLB domain) plant
phosphoribosyltransferase family protein
Tubulin binding cofactor C domain-containing protein
Tubulin binding cofactor C domain-containing protein
unknown protein
D111/G-patch domain-containing protein
SPL15:Encodes a putative transcriptional regulator
unknown protein
unknown protein
Domain of unknown function (DUF1726)
Domain of unknown function (DUF1726)
unknown protein
unknown protein
Emsy N Terminus (ENT) domain-containing protein
Potential natural antisense gene
Emsy N Terminus (ENT)/plant Tudor-like
DNA-binding bromodomain-containing protein
unknown protein
VQ motif-containing protein
PGL34:plastoglobulin 34kD
Chaperone DnaJ-domain superfamily protein
RING/U-box superfamily protein
RING/U-box superfamily protein
RING/U-box superfamily protein
RING/U-box superfamily protein
pre-tRNA; tRNA-Ser (anticodon: GCT)
SINAT2:RING finger domain containing protein
that interacts with AtRAP2.2
unknown protein
Cation efflux family protein
GIS:Putative transcription factor, contains C2H2 domain
unknown protein
Disease resistance-responsive (dirigent-like protein) family
PDCB5:member of the X8-GPI family of proteins
predicted to bind callose
unknown protein
unknown protein
BZIP61:member of the BZIP TF family
149
A NHANG
21527640-21529905
AT3G58130.1
21527641-21529905
AT3G58130.2
21529731-21532572
21532813-21534089
21534797-21541877
21542282-21542352
21542359-21543974
21544097-21546180
21548484-21549558
21559060-21559139
21559244-21559320
21559893-21561465
21562442-21564067
21564450-21566482
21564450-21566482
21566860-21567396
21568530-21569827
21570745-21572143
21573754-21575369
21575887-21577845
AT3G58140.1
AT3G58150.1
AT3G58160.1
AT3G58165.1
AT3G58170.1
AT3G58180.1
AT3G58190.1
AT3G58193.1
AT3G58196.1
AT3G58200.1
AT3G58210.1
AT3G58220.2
AT3G58220.1
AT3G58230.1
AT3G58240.1
AT3G58250.1
AT3G58260.1
AT3G58270.1
21575887-21577830
AT3G58270.2
21578512-21579767
AT3G58280.1
21580572-21581861
21580572-21581861
21580572-21581861
21582764-21583390
21584038-21585030
21585567-21586328
21587362-21588002
21589071-21590401
21591188-21591388
21591452-21592962
AT3G58290.1
AT3G58290.2
AT3G58290.3
AT3G58300.1
AT3G58310.1
AT3G58320.1
AT3G58330.1
AT3G58340.1
AT3G58347.1
AT3G58350.1
21593505-21594866
21595774-21596538
21597799-21599568
21600030-21601217
21602667-21604063
21604871-21606229
21609307-21612409
21613163-21616183
21618446-21621249
21621997-21623166
21622002-21623166
21623179-21626448
21623202-21626701
21626671-21628569
21629106-21631853
21632812-21635106
21632812-21635101
21635226-21639105
AT3G58360.1
AT3G58370.1
AT3G58380.1
AT3G58390.1
AT3G58400.1
AT3G58410.1
AT3G58420.1
AT3G58430.1
AT3G58440.1
AT3G58450.2
AT3G58450.1
AT3G58460.1
AT3G58460.2
AT3G58470.1
AT3G58480.1
AT3G58490.2
AT3G58490.1
AT3G58500.1
N-acetylglucosaminylphosphatidylinositol
de-N-acetylase family protein
N-acetylglucosaminylphosphatidylinositol
de-N-acetylase family protein
phenylalanyl-tRNA synthetase class IIc family protein
Optic atrophy 3 protein (OPA3)
XIJ:Class XI myosin gene
pre-tRNA; tRNA-Gly (anticodon: GCC)
BS14A:Bet1/Sft1-like SNARE protein
ARM repeat superfamily protein
LBD29:contains two auxin-responsive elements (AuxRE)
snoRNA
snoRNA
TRAF-like family protein
TRAF-like family protein
TRAF-like family protein
TRAF-like family protein
Ubiquitin-specific protease family C19-related protein
TRAF-like superfamily protein
TRAF-like family protein
TRAF-like family protein
Arabidopsis phospholipase-like protein (PEARLI 4)
with TRAF-like domain
Arabidopsis phospholipase-like protein (PEARLI 4)
with TRAF-like domain
Arabidopsis phospholipase-like protein (PEARLI 4
with TRAF-like domain
TRAF-like superfamily protein
TRAF-like superfamily protein
TRAF-like superfamily protein
Arabidopsis phospholipase-like protein (PEARLI 4) family
Protein of unknown function (DUF26)
Ubiquitin-specific protease family C19-related protein
Arabidopsis phospholipase-like protein (PEARLI 4) family
TRAF-like family protein
Pseudogene of AT3G58330
RTM3:RTM3 (Restricted Tobacco etch potyvirus
Movement), TRAF homology (MATH) domain
TRAF-like family protein
TRAF-like family protein
TRAF-like family protein
Eukaryotic release factor 1 (eRF1) family protein
TRAF-like family protein
TRAF-like family protein
TRAF-like superfamily protein
TRAF-like family protein
TRAF-like superfamily protein
Adenine nucleotide alpha hydrolases-like superfamily
Adenine nucleotide alpha hydrolases-like superfamily
RBL15:RHOMBOID-like protein 15
RBL15:RHOMBOID-like protein 16
nucleic acid binding;methyltransferases
calmodulin-binding family protein
Phosphatidic acid phosphatase (PAP2) family protein
Phosphatidic acid phosphatase (PAP2) family protein
PP2A-4:one of the isoforms of the catalytic subunit
150
A NHANG
21639978-21643795
21640010-21643795
21640045-21643795
21643770-21645486
21643770-21645486
21645547-21648368
21648593-21649390
21649364-21650287
AT3G58510.1
AT3G58510.3
AT3G58510.2
AT3G58520.1
AT3G58520.2
AT3G58530.1
AT3G58540.1
AT3G58550.1
21650596-21654200
21656504-21660532
AT3G58560.1
AT3G58570.1
21660598-21664095
21666082-21668625
21668515-21671167
21671433-21674841
21671433-21675090
21671434-21674800
21680326-21683135
AT3G58580.1
AT3G58590.1
AT3G58600.1
AT3G58610.1
AT3G58610.3
AT3G58610.2
AT3G58620.1
21683568-21685941
21686741-21693841
21686743-21693831
21696246-21699998
21701534-21703114
21703390-21706079
21703390-21706020
21703393-21706079
21706819-21706938
21707276-21708911
21709170-21711381
21711563-21712955
21715007-21716916
21715192-21716916
21716866-21717948
21716920-21717892
21718257-21719980
21720773-21723790
21724314-21727690
21728714-21731928
21732258-21735327
21738460-21741907
21738460-21741900
21738460-21742517
21742071-21746324
AT3G58630.1
AT3G58640.2
AT3G58640.1
AT3G58650.1
AT3G58660.1
AT3G58670.1
AT3G58670.2
AT3G58670.3
AT3G58676.1
AT3G58680.1
AT3G58690.1
AT3G58700.1
AT3G58710.1
AT3G58710.2
AT3G58720.2
AT3G58720.1
AT3G58730.1
AT3G58740.1
AT3G58750.1
AT3G58760.1
AT3G58770.1
AT3G58780.1
AT3G58780.2
AT3G58780.3
AT3G58790.1
21745707-21746545
21748228-21749928
21749966-21752006
21749966-21752008
21752533-21754615
21755053-21756641
21757312-21758772
21757499-21758714
21759352-21759942
AT3G58795.1
AT3G58800.1
AT3G58810.1
AT3G58810.2
AT3G58820.1
AT3G58830.1
AT3G58840.1
AT3G58840.2
AT3G58850.1
of protein phosphatase 2A
DEA(D/H)-box RNA helicase family protein
DEA(D/H)-box RNA helicase family protein
DEA(D/H)-box RNA helicase family protein
Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase family protein
Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase family protein
RNI-like superfamily protein
unknown protein
Bifunctional inhibitor/lipid-transfer protein/seed storage
2S albumin superfamily protein
DNAse I-like superfamily protein
P-loop containing nucleoside triphosphate hydrolases
superfamily protein
DNAse I-like superfamily protein
Pentatricopeptide repeat (PPR) superfamily protein
Adaptin ear-binding coat-associated protein 1 NECAP-1
ketol-acid reductoisomerase
ketol-acid reductoisomerase
ketol-acid reductoisomerase
TTL4:carboxylate clamp (CC)-tetratricopeptide
repeat (TPR) protein
sequence-specific DNA binding transcription factors
Mitogen activated protein kinase kinase kinase-related
Mitogen activated protein kinase kinase kinase-related
unknown protein
Ribosomal protein L1p/L10e family
Protein of unknown function (DUF1637)
Protein of unknown function (DUF1637)
Protein of unknown function (DUF1637)
unknown protein
MBF1B:multiprotein bridging factor 1
Protein kinase superfamily protein
Ribosomal L5P family protein
WRKY69:member of WRKY Transcription Factor
WRKY69:member of WRKY Transcription Factor
RING/U-box superfamily protein
RING/U-box superfamily protein
vacuolar ATP synthase subunit D (VATD)
CSY1:peroxisomal citrate synthase
CSY2:peroxisomal citrate synthase
Integrin-linked protein kinase family
unknown protein
SHP1:required for fruit dehiscence
SHP1:required for fruit dehiscence
SHP1:required for fruit dehiscence
GAUT15:protein with putative
galacturonosyltransferase activity
Potential natural antisense gene
unknown protein
MTPA2:Member of Zinc transporter (ZAT) family
MTPA2:Member of Zinc transporter (ZAT) family
F-box/RNI-like superfamily protein
haloacid dehalogenase (HAD) superfamily protein
Tropomyosin-related
Tropomyosin-related
PAR2:PHYTOCHROME RAPIDLY REGULATED2
151
A NHANG
21763742-21765306
21765879-21766823
21768188-21768367
21768485-21770167
21771046-21772577
21772813-21774044
21772838-21774743
21772838-21774743
21772857-21774743
21775306-21776079
21776293-21777988
21778210-21780433
21780785-21783663
21784116-21785840
21787146-21788807
21789332-21791359
21792142-21794029
21794445-21797006
21797058-21798303
21799276-21801743
21799276-21801743
21802805-21805214
21810260-21817555
21810260-21817555
21819071-21821440
21821349-21824312
21821349-21824348
21824696-21827509
21824696-21827509
21827978-21830507
21827978-21830097
21827978-21830507
21828005-21830507
21832343-21832701
21832364-21834514
AT3G58860.1
AT3G58865.1
AT3G58877.1
AT3G58880.1
AT3G58890.1
AT3G58900.2
AT3G58900.3
AT3G58900.4
AT3G58900.1
AT3G58910.1
AT3G58920.1
AT3G58930.1
AT3G58940.1
AT3G58950.1
AT3G58960.1
AT3G58970.1
AT3G58975.1
AT3G58980.1
AT3G58990.1
AT3G59000.2
AT3G59000.1
AT3G59010.1
AT3G59020.2
AT3G59020.1
AT3G59030.1
AT3G59040.2
AT3G59040.1
AT3G59050.1
AT3G59052.1
AT3G59060.4
AT3G59060.3
AT3G59060.2
AT3G59060.1
AT3G59068.1
AT3G59070.1
21836579-21838620
21836579-21838620
21839197-21842755
21839197-21842727
21839198-21842755
21843407-21853860
21854719-21858204
21857876-21860221
21860986-21862807
21863420-21868701
21872706-21874735
21875023-21876641
21878167-21879799
21880719-21882459
21884527-21886776
21887172-21889344
21889571-21891776
21889638-21891915
21889638-21891915
21889638-21891915
AT3G59080.2
AT3G59080.1
AT3G59090.1
AT3G59090.2
AT3G59090.3
AT3G59100.1
AT3G59110.1
AT3G59120.1
AT3G59130.1
AT3G59140.1
AT3G59150.1
AT3G59160.1
AT3G59170.1
AT3G59180.1
AT3G59190.1
AT3G59200.1
AT3G59210.1
AT3G59210.3
AT3G59210.4
AT3G59210.2
F-box/RNI-like superfamily protein
SADHU10-1:Sadhu non-coding retrotransposon family
unknown protein
F-box/RNI-like superfamily protein
RNI-like superfamily protein
F-box/RNI-like superfamily protein
F-box/RNI-like superfamily protein
F-box/RNI-like superfamily protein
F-box/RNI-like superfamily protein
F-box/RNI-like superfamily protein
F-box/RNI-like superfamily protein
F-box/RNI-like superfamily protein
F-box/RNI-like superfamily protein
F-box/RNI-like superfamily protein
F-box/RNI-like/FBD-like domains-containing protein
MGT6:Transmembrane magnesium transporter
pseudogene of F-box family protein
F-box family protein
IPMI1:isopropylmalate isomerase 1
F-box/RNI-like superfamily protein
F-box/RNI-like superfamily protein
PME35 (PME61):pectin methylesterase
ARM repeat superfamily protein
ARM repeat superfamily protein
TT12:proton antiporter
Tetratricopeptide repeat (TPR)-like superfamily protein
Tetratricopeptide repeat (TPR)-like superfamily protein
PAO3:polyamine oxidase 3
CPuORF18:Upstream open reading frame
PIL6:Myc-related bHLH transcription factor
PIL6:Myc-related bHLH transcription factor
PIL6:Myc-related bHLH transcription factor
PIL6:Myc-related bHLH transcription factor
Potential natural antisense gene
Cytochrome b561/ferric reductase transmembrane with
DOMON related domain
Eukaryotic aspartyl protease family protein
Eukaryotic aspartyl protease family protein
Protein of unknown function (DUF1084)
Protein of unknown function (DUF1084)
Protein of unknown function (DUF1084)
GSL11:protein similar to callose synthase
Protein kinase superfamily protein
Cysteine/Histidine-rich C1 domain family protein
Cysteine/Histidine-rich C1 domain family protein
MRP14:member of MRP subfamily
F-box/RNI-like superfamily protein
F-box/RNI-like superfamily protein
F-box/RNI-like superfamily protein
Protein with RNI-like/FBD-like domains
F-box/RNI-like superfamily protein
F-box/RNI-like superfamily protein
F-box/RNI-like superfamily protein
F-box/RNI-like superfamily protein
F-box/RNI-like superfamily protein
F-box/RNI-like superfamily protein
152
A NHANG
21894134-21895623
21896052-21897787
21898682-21900364
AT3G59220.1
AT3G59230.1
AT3G59240.1
PRN:cupin-domain containing protein
RNI-like superfamily protein
RNI-like superfamily protein
Tabelle A.9 Liste der Gene auf Chromosom 3 von Arabidopsis im Bereich von 21,1 Mb bis 21,9
Mb. Bei der Kartierung der pgm Suszeptibilitäts-supprimierenden Mutation in der Arabidopsis
EMS Linie 9-7-10 wurde der mit dem Phänotyp gekoppelte genomische Bereich auf diesen Abschnitt von Chromosom 3 eingegrenzt (Tabelle A.8). Die tabellarische Auflistung der Gene enthält
Angaben zu dem Lokus, dem AGI Code und dem Namen jedes Gen-Modells sowie gegebenenfalls eine Beschreibung der Funktion und Angaben zu Homologien. Alle Angaben stammen aus
der TAIR10 Annotation.
153
DANKSAGUNG
Danksagung
Ich danke Herrn Prof. Dr. Uwe Sonnewald für die Bereitstellung und Finanzierung des
bearbeiteten Projekts und der ausgezeichneten technischen Ausstattung.
Ganz besonders möchte ich mich bei Dr. Lars Voll bedanken, der auf dem Fahrrad stets
zahlreiche Ideen entwickelt hat und immer bereit war, diese auch kontrovers zu diskutieren. Danke Lars, für das über Jahre konstant tolle Klima in Deinem Labor, das ist zu
großen Teilen Dein Verdienst!
Vielen Dank an Dr. Ruth Stadler für die kurzfristige Übernahme des Zweitgutachtens
und an Dr. Reinhard Pröls von der TU München für die Durchführung von MehltauInfektionsexperimenten. Das Voll-Labor hat in den vergangenen Jahren eine große Vielfalt unterschiedlicher Charaktere beherbergt, vielen Dank an alle von ihnen! Besonders
hervorheben möchte ich Robin, Doreen, Alexandra, Pierre, Sabine und Anna, die die
langjährigsten Kollegen waren, aber auch Ümran, Susi, Conny, Marlene, Christine und
nochmal Susi, die tolle Arbeit während ihrer Bachelorarbeiten geleistet haben und deren
Ergebnisse zum Teil in die vorliegende Arbeit mit eingeflossen sind. Ein großer Dank geht
an Prof. Dr. Christian Koch und sein ganzes Labor, besonders Marlis, Martin, Johannes,
Susi und Johanna, für die große Kooperations- und Diskussionsbereitschaft und natürlich
für die Octi-Taq.
Ich möchte mich beim gesamten Lehrstuhl für Biochemie bedanken. Jeder Einzelne war
immer bereit für praktische und theoretische Hilfsleistungen. Besonderen Dank an Christine Hösl für die engagierte Organisation des Gewächshauses und Moritz Thran für die
unzähligen gemeinsamen Mittagspausen. Das Analytikteam um Dr. Jörg Hofmann und
Alfred Schmiedl hat immer mit großem Einsatz zu der Optimierung verschiedenster Methoden beigetragen, vielen Dank dafür! Vielen Dank für die kurzfristigen, überwiegend
nächtlichen, Korrekturen von Fehlern in dieser Arbeit durch Aga, Papa, Susan und Pierre.
Ein großer Dank gilt meiner gesamten Familie, den Engelsdorfs, Osers und Kochanskis.
Ganz besonders möchte ich meinen Eltern für ihre verlässliche Unterstützung danken.
Meiner Frau Agnieszka danke ich für all das was ich mit Worten nicht ausdrücken kann.
Lebenslauf
Persönliche Informationen
Name: Timo Engelsdorf
Geburtsdatum: 01.08.1982
Geburtsort: Braunschweig
Nationalität: deutsch
Ausbildung
1989 – 1992
Grundschule Besigheim
1992 – 1993
Grundschule Bretzfeld
1993 – 2002
Hohenlohe-Gymnasium Öhringen
2003 – 2008
Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg
Studium Biologie Diplom (Hauptfach Biochemie)
seit Oktober 2008
Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg
Dissertation am Lehrstuhl für Biochemie
Ersatzdienst
2002 – 2003
Evangelische Jugendhilfe Friedenshort GmbH Öhringen
Veröffentlichungen
Engelsdorf T, Horst RJ, Pröls R, Pröschel M, Dietz F, Hückelhoven R, Voll LM (2013)
Reduced carbohydrate availability enhances susceptibility of Arabidopsis towards
Colletotrichum higginsianum. Plant Physiology, doi: 10.1104/pp.112.209676
Vogelmann K, Drechsel G, Bergler J, Subert C, Philippar K, Soll Jr, Engelmann JC,
Engelsdorf T, Voll LM, Hoth S (2012) Early Senescence and Cell Death in Arabidopsis saul1
Mutants Involves the PAD4-Dependent Salicylic Acid Pathway. Plant Physiology 159, 14771487
Voll LM, Zell MB, Engelsdorf T, Saur A, Wheeler MG, Drincovich MF, Weber APM, Maurino
VG (2012) Loss of cytosolic NADP-malic enzyme 2 in Arabidopsis thaliana is associated with
enhanced susceptibility to Colletotrichum higginsianum. New Phytologist 195, 189-202
Horst RJ, Engelsdorf T, Sonnewald U, and Voll LM (2008) Infection of maize leaves with
Ustilago maydis prevents establishment of C4 photosynthesis. Journal of Plant Physiology 165,
19-28
Vorträge und Posterpräsentationen
The role of Arabidopsis carbohydrate metabolism for susceptibility towards Colletotrichum
higginsianum; Vortrag; 29.Wallenfelser Rundgespräch zur Pflanzenbiochemie; Wallenfels,
May 2012.
Arabidopsis thaliana carbohydrate metabolism represents a compatibility factor in the
interaction with Colletotrichum higginsianum; Posterpräsentation; Botanikertagung; Berlin,
September 2011.
Arabidopsis thaliana carbohydrate metabolism represents a compatibility factor in the
interaction with Colletotrichum higginsianum; Posterpräsentation; Communication in Plants
and their Responses to the Environment; Halle (Saale), May 2011.
Carbohydrate metabolism represents a compatibility factor in the Arabidopsis thaliana –
Colletotrichum higginsianum interaction; Vortrag; Tri-National Arabidopsis Meeting; Salzburg,
September 2010.
Arabidopsis thaliana carbohydrate metabolism is altered by Colletotrichum higginsianum and
represents a compatibility factor; Posterpräsentation; Botanikertagung; Leipzig, September
2009.