Hüllproteine endogener Retroviren interferieren mit der

Hüllproteine endogener Retroviren interferieren mit der
allostimulatorischen Aktivität dendritischer Zellen
Human endogenous retrovirus envelope proteins target dendritic
cells to modulate T-cell activation
Dissertation zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades
der Graduate School of Life Sciences,
Julius-Maximilians-Universität Würzburg,
Klasse Infektion und Immunität (GK-520)
Vorgelegt von
Jonas Florian Hummel
aus
Bergisch Gladbach
Würzburg, Juni 2015
http://d-nb.info/107873335X
INHALTSVERZEICHNIS
3
Inhaltsverzeichnis
1.
Ginleitung
1.1. Humane endogene Retroviren
1.1.1. Struktur der HERV-Hüllproteine
1.2. Rolle der HERV-Proteine in der menschlichen Plazenta
1.2.1. Struktur der menschlichen Plazenta
1.2.2. Plazenta-exprimierte HERV-Hüllproteine und deren Funktionen
1.2.3. Immunzellen in der Plazenta
1.2.4. Immunologische Synapse
1.3. Immuntoleranz in der Plazenta
1.4. Fragestellung
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2.
Materialien
2.1. Zellen
2.1.1. Zelllinien
2.1.2. Primäre Zellen
2.2. Bakterien
2.3. Plasmide
2.4. Primer
2.5. siRNAs
2.6. Antikörper
2.6.1. Unmodifizierte Primärantikörper
2.6.2. Sekundärantikörper
2.6.3. Modifizierte Primärantikörper
2.7. Fluoreszierende Farbstoffe
2.8. Zellkulturmedien und Zusätze
2.8.1. Eukaryotische Zellen
2.9. Bakterien
2.10. Puffer und Lösungen
2.11. Kits
2.12. Chemikalien und Reagenzien
2.13. Plastikware und Verbrauchsmaterialien
2.14. Geräte
2.15. Software
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3.
Methoden
3.1. Zellkultur
3.1.1. Zellkultur von Zelllinien
3.1.2. Bestimmung der Lebendzellanzahl
3.1.3. Einfrieren und Auftauen von Zellen
3.1.4. Isolation peripherer Blut mononukleärer Zellen (PBMCs)
3.1.5. Differenzierung dendritischer Zellen aus Monozyten in vitro
3.1.6. Aufreinigung und Aktivierung von T-Zellen
3.2. RNA-Methoden
3.2.1. RNA-Extraktion
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3.2.2. cDNA-Synthese
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3.3. Molekularbiologische Methoden
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3.3.1. Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
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3.3.2. DNA-Agarose-Gelelektrophorese & DNA-Aufreinigung
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3.3.3. Restriktionsverdau und Ligation von DNA-Fragmenten
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3.3.4. Transformation kompetenter Bakterien und Maxi-Präparation von Plasmid-DNA
und Sequenzierung
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3.4. Zellbiologische Methoden
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3.4.1. Polyethylenimin (PEI)-Transfektion
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3.4.2. siRNA-Protein Knock-down in Chorionkarzinom-Zelllinien
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3.4.3. Fusionsassay
3.4.4. DC Ko-Kultivierung mit Effektorzellen und Zytokinmessung
3.4.5. T-Zell-Proliferation
3.4.5.1. T-Zell-Proliferation mittels CFSE-Färbung
3.4.5.2. T-Zell-Aktivierung mittels a-CD3- und a-CD-28-Antikörper-Stimulation
3.4.5.3. Mixed Leukocyte Reaction (MLR)
3.4.6. Durchflusszytometrie
3.4.6.1. Oberflächenexpression
3.4.6.2. Intrazelluläre Proteinexpression
3.4.7. Immunfluoreszenzfärbung
3.4.8. Quantifizierung von DC/T-Zell-Konjugaten mittels Durchflusszytometrie
3.4.9. Ca2+-Mobilisierung in DC/T-Zell-Konjugaten
3.4.10. DC/T-Zell-Interface Analyse
3.5. Statistik
4.
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Ergebnisse
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4.1. Expression der HERV-Hüllprotein-Rezeptoren auf Immunzellen
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4.2. Expression der HERV-Hüllprotein-Rezeptoren auf Effektorzellen
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4.3. Funktionelle Überprüfung der HERV-Hüllprotein-exprimierenden Effektorzellen
50
4.4. Modulatorische Eigenschaften der HERV-Hüllproteine
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4.4.1. Chorionkarzinom-Zelllinien, aber keine HERV-Hüllprotein-exprimierende
Effektorzellen inhibierten die T-Zell-Proliferation
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4.4.2. Chorionkarzinom-Zelllinien und HERV-Hüllprotein-exprimierende
Effektorzellen hatten keinen Effekt auf die LPS-vermittelte phänotypische DC-Reifung
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4.4.3. Differentielle Regulation der LPS-DC-Zytokin-Produktion durch
Chorionkarzinom-Zelllinien und HERV-Hüllprotein-exprimierende Effektorzellen
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4.4.4. Chorionkarzinom-Zelllinien und HERV-Hüllprotein-exprimierende
Effektorzellen veränderten die LPS-DC-induzierte allogene T-Zell-Proliferation
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4.4.5. Blockierung der HERV-Hüllproteinexpression auf den ChorionkarzinomZelllinien
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4.4.6. Chorionkarzinom-Zelllinien und HERV-Hüllprotein-exprimierende
Effektorzellen hemmten die DC/T-Zell-Konjugatbildung
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4.4.7. Chorionkarzinom-Zell linien und HERV-Hüllprotein-exprimierende
Effektorzellen hemmten die Aktivität der immunologischen Synapse
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INHALTSVERZEICHNIS | 5
5.
Diskussion
85
6.
Zusammenfassung
98
7.
Summary
99
8.
Literaturverzeichnis
100
9.
Abkürzungsverzeichnis
112
10.
Abbildungsverzeichnis
117
11.
Tabellenverzeichnis
120
12. Publikationen und Präsentationen
12.1. Publikationen
12.2. Präsentationen
12.2.1. Vorträge
12.2.2. Poster
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13.
Danksagung
123
14.
Lebenslauf
124
15.
Eidesstattliche Erklärung
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