Untersuchungen zur Immunisierung gegen die Equine Virale Arteritis

Aus der Medizinischen Tierklinik
der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig
Untersuchungen zur Immunisierung gegen die
Equine Virale Arteritis
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des Grades eines
Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.)
durch die Veterinärmedizinische Fakultät
der Universität Leipzig
eingereicht von
Cornelia Mohr
aus Eisenach
Leipzig, 2006
Mit Genehmigung der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig
Dekan:
Prof. Dr. Karsten Fehlhaber
Betreuer:
Prof. Dr. Gerald Fritz Schusser
Gutachter:
Prof. Dr. Gerald Fritz Schusser, Medizinische Tierklinik,
Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig
Prof. Dr. Uwe Truyen, Institut für Tierhygiene und Öffentliches
Veterinärwesen, Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig
Dr. Werner Eichhorn, Institut für Medizinische Mikrobiologie,
Infektions- und Seuchenmedizin, Ludwig-Maximilians-Universität München
Tag der Verteidigung:
25.04.2006
Für Wieke Sofie
Inhaltsverzeichnis
1
EINLEITUNG
1
2
LITERATURÜBERSICHT
1
2.1
Taxonomie, Morphologie, Genomorganisation
1
2.2
Pathogenese, Pathologie, Klinik
8
2.3
Immunologie
12
2.4
Epidemiologie
14
2.5
Prophylaxe und Therapie
20
2.6
Gesetzliche Vorschriften
23
2.7
Messung zytotoxischer T-Zell-Aktivität (CTL-Test)
25
3
TIERE, MATERIAL UND METHODEN
27
3.1
Pferde
27
3.1.1
Untersuchungen der Pferde des Brandenburgischen Haupt- und
Landgestütes
27
3.1.2
Untersuchungen der Pferde der ersten Impfstofftestung
29
3.1.3
Untersuchungen der Pferde der zweiten Impfstofftestung
30
3.1.4
Untersuchungen der Pferde der dritten Impfstofftestung
30
3.2
Material
32
3.2.1
Geräte und Verbrauchsmaterial
32
3.2.2
Biologische Materialien
33
3.2.3
Vorgefertigte Systeme (Test-Kits) und Transfektionsreagentien
34
3.2.4
Chemikalien, Lösungen, Medikamente, Medien und Puffer
35
3.3
Methoden
37
3.3.1
Zellkultur
37
3.3.2
Herstellung einer inaktivierten Vakzine
39
3.3.3
Nachweis der Immunantwort
40
3.3.4
Statistik
46
4
ERGEBNISSE
47
4.1
Ergebnisse der Untersuchungen der Pferde des Brandenburgischen
Haupt- und Landgestütes
47
4.1.1
Ergebnisse der Untersuchungen der Aborte und Abortursachen
47
4.1.2
Ergebnisse der serologischen Untersuchung der Pferde
51
4.1.3
Ergebnisse der Untersuchung der Spermaproben der Deckhengste
53
4.2
Ergebnisse der Untersuchung der Pferde der ersten Impfstofftestung
54
4.3
Ergebnisse der Untersuchung der Pferde der zweiten Impfstofftestung 55
4.3.1
SNT mit EAV-Stamm Bucyrus
55
4.3.2
SNT mit Stamm EAV-Gi 2592
57
4.4
Ergebnisse der Untersuchung der Pferde der dritten Impfstofftestung
59
4.4.1
Ergebnisse der Antikörperuntersuchung im SNT
60
4.4.2
Ergebnisse der Vorversuche für den CTL-Test
63
4.4.3
Ergebnisse der Untersuchung im CTL-Test
70
5
DISKUSSION
79
6
ZUSAMMENFASSUNG
91
7
SUMMARY
93
8
LITERATURVERZEICHNIS
95
ANHANG
A1
Abkürzungen
°C
Grad Celsius
3`(5`)
3`(5`)-Ende eines Nukleinsäure-Strangs
Ag
Antigen
AK
Antikörper
Aqua bidest.
Doppelt destilliertes Wasser
AS
Aminosäuren
BHK-21
Zelllinie von juvenilen Hamsternieren (baby hamster kidney
cells)
CPE
zytopathogener Effekt (cytopathic effect)
CTL
zytotoxische T-Lymphozyten (cytotoxic T-lymphocytes)
DMEM
Dulbecco’s modified Eagle medium
DNA
Desoxyribonukleinsäure
d. p. i.
Tage nach Infektion (days post infection)
E
Hüllprotein (envelop protein)
EAV
Equines Arteritisvirus (Equine arteritis virus)
E. coli
Escherichia coli
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
ELISA
Enzym-Immunassay (enzyme-linked immuno sorbent assay)
EHV
Equines Herpesvirus (Equine herpes virus)
FKS
Fetales Kälberserum
GFP
grünes fluoreszierendes Protein (green fluorescent protein)
GH
Gestütshengst
GL
großes Glykoprotein (large glycoprotein)
GnRH
Gonadotropin freisetzendes Hormon (Gonadotropin releasing
hormone)
GS
kleines Glykoprotein (small glykoprotein)
IFT
Immunfluoreszenztest
IL-2
Interleukin 2
IMEM
Iscove’s modified Eagles medium
kb
Kilobasen
KGW
Körpergewicht
KBR
Komplementbindungsreaktion
kDa
Kilodalton
kGy
Kilogray
KY-84
EAV-Stamm Kentucky 1984
LDH-V
Lactatdehydrogenasevirus
M
molar
M
Membranprotein (membran protein)
MEM
Minimum Essential Medium (Eagle)
MHC
Haupthistokompatibilitätskomplex (major histocompatibiliy
complex)
mM
millimolar
Mo
Monat
mRNA
Boten-RNA (messenger RNA)
µCi
Mikrocurie
µg
Mikrogramm
µl
Mikroliter
µM
Mikromolar
nm
Nanometer
Nsp
Nichtstrukturprotein (non structural protein)
n. g.
nicht gemessen
n. u.
nicht untersucht
ORF
offener Leserahmen (open reading frame)
p. i.
nach Infektion (post infectionem)
PBMC
periphere mononukleäre Blutzellen (peripheral blood
mononuclear cells)
PCR
Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction)
pfu
Plaque-bildende Einheiten (plaque forming units)
PRRSV
porcine reproductive and respiratory syndrome virus
PWM
pokeweed mitogen
RK-13
Kaninchennierenzelllinie (rabbit kidney cells)
RNA
Ribonukleinsäure
rpm
Umdrehungen pro Minute (rotation per minute)
RT
Raumtemperatur
SHFV
Simian haemorrhagic fever virus
SNT
Serumneutralisationstest
SVLUA
Staatliches Veterinär- und Lebensmitteluntersuchungsamt
TCR
T-Zell-Rezeptor (T-cell receptor)
TRS
transcription-regulating Sequenz
UV-Licht
ultraviolettes Licht
Zpkt.
Zeitpunkt
1
Einleitung
Im Frühjahr 1995 fiel in dem Brandenburgischen Haupt- und Landgestüt
Neustadt/Dosse eine hohe Abortrate der Stuten auf. Mehrmals gelang es im
Institut für Hygiene- und Infektionskrankheiten der Justus-Liebig-Universität
Gießen, das Equine Arteritisvirus (EAV) aus Nachgeburten zu isolieren, welches
somit ursächlich mit den Aborten in Zusammenhang gebracht wurde. Da es noch
keine zugelassene Vakzine gegen EAV auf dem deutschen Markt gab, wurde
dieses Projekt 1997 im Rahmen einer Dissertation ins Leben gerufen, um eine in
den USA erhältliche, eine Feld- und eine DNA-Vakzine hinsichtlich ihrer Fähigkeit
zur Immunitätsausbildung und Verträglichkeit miteinander zu vergleichen.
2
Literaturübersicht
Das Equine Arteritisvirus
2.1
Taxonomie, Morphologie, Genomorganisation
Die Equine Virale Arteritis ist eine Viruserkrankung der Pferde, Esel und Zebras
und seit dem 19. Jahrhundert besonders in Europa bekannt. Sie ist unter
Synonymen wie „Equine Influenza“, „pinkeye“, „fièvre typhoide“, „Pferdestaupe“,
„Rotlaufseuche“,
„acute
septicaemia“,
„epizootic
cellulitis“
und
„influenza
erysipelatosa“ in der Literatur beschrieben. Damals wurde die Erkrankung
aufgrund der respiratorischen und/oder abortogenen Komponente mit Influenzaund Herpesviren der Pferde in Verbindung gebracht. Frühe Berichte liegen
besonders über die Verbreitung der Erkrankung durch Deckhengste vor (Bergman
1913, Clark 1892, Doll et al. 1956, Grimme 1903, Jensen 1894).
1953 gelang erstmals die Isolierung des Virus aus dem Lungengewebe von zwei
abortierten Feten eines Warmblut-Gestütes in der Nähe von Bucyrus, Ohio/USA.
Das Bycurus-Isolat wird international als Referenz-Stamm anerkannt (Doll et al.
1956).
Aufgrund der charakteristischen Gefäßveränderungen erhielt das Virus seinen
Namen, Equines Arteritisvirus (EAV).
Die taxonomische Zuordnung von EAV in eine der bekannten Virusfamilien
bereitete lange Zeit große Schwierigkeiten. Zunächst wurde es aufgrund der
1
Nukleinsäure (Einzelstrang-RNA mit positiver [messenger] Polarität) und der
viralen Struktur (behüllt, isometrisches Kapsid) der Familie der Togaviridae
(Horzinek et al. 1992), später aufgrund der Genomorganisation und des
Replikationsschemas der Familie der Coronaviridae (Hedges et al. 1996, Snijder
et al. 2001) zugeordnet. Erst während des 10. Internationalen Kongresses der
Virologie in Jerusalem, August 1996, ordnete das „International Commitee for the
Taxonomy of Viruses“ (ICTV) EAV zusammen mit dem Lactatdehydrogenasevirus
(LDH), Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) und
Simian Haemorrhagic Fever Virus (SHFV) in das Genus Arterivirus in die Familie
der Arteriviridae ein. Diese Familie bildet aufgrund von Ähnlichkeiten in
Replikationsmechanismen,
Genomorganisation,
Viruszusammensetzung
und
Genexpressionsstrategie zusammen mit den Coronaviridae (Genus Coronavirus
und Torovirus) die Ordnung der Nidovirales (Cavanagh 1997, Snijder et al. 1998).
Das Equine Arteritisvirus ist ein kleines sphärisches Viruspartikel mit einem
Durchmesser von 45-70 nm. Das ca. 35 nm große, ikosaedrisch aufgebaute
Nukleokapsid, ist von einer Hülle in Form einer Doppelllipidmembran mit
ringförmigen Untereinheiten (Peplomeren) auf der Oberfläche (12-15 nm im
Durchmesser) umgeben (Horzinek et al. 1992). Darin eingebettet sind sechs
Strukturproteine. Das Nukleokapsid besteht aus einer infektiösen unsegmentierten
positiven
Einzelstrang-RNA
(van
der
Zeijst
et
al.
1975)
mit
einem
Molekulargewicht von 12,704 kb und einem phosphorylierten Protein von 12-14
kDa (De Vries et al. 1992).
Die Dichte von EAV in Saccharose beträgt 1,17-1,2 g/ml. Die Tenazität des Virus
ist stark von der Temperatur abhängig (Tab. 1). Die lyophilisierte Bearbeitung
erhält das Virus wenig stabil bei 4 °C und hochstabil bei -20 °C. Schmitt (1990)
wies die Infektiösität des Virus im Gefriersperma bei -196 °C mindestens vier
Monate lang nach. Dies spielt eine wichtige Rolle im Übertragungsmodus. De
Vries (1994) fand in bei -20 °C aufbewahrten Organproben infektiöses Virus noch
nach fünf Jahren. Die Infektiösität sinkt stark mit zunehmender Temperatur. Ab 7080 °C ist das Virus nach 30 min vollständig inaktiviert (Konishi et al. 1975).
2
Tabelle 1: Infektiösität von EAV
Temperatur
Infektiösitätsdauer
-70 °C
Jahre
4 °C
mind. 75 Tage
37 °C
2-3 Tage
56 °C
20-30 min
EAV ist sehr sensitiv gegenüber niedrigen pH-Werten, so erfolgt ab pH-Werten
unter 3,0 eine starke Reduktion des Infektionstiters innerhalb von 30 min (Konishi
et al. 1975). EAV ist ebenfalls sehr empfindlich gegenüber Äther, Chloroform und
Phospholipase C (Hyllseth 1973). Das Virus kann auch innerhalb von 5 min durch
UV-Licht inaktiviert werden. Ferner ist eine Inaktivierung durch Gammastrahlung
möglich, hier wird jedoch eine sehr hohe Strahlendosis von minimal 1 kGy benötigt
(De Vries 1994, Dichtelmuller et al. 1993). EAV-Partikel überleben jegliche Form
der Spermakonservierung und bleiben dabei infektiös (Leyk et al. 1997).
EAV besitzt ein polyzistronisches Genom, dessen 3`Ende polyadenyliert ist. Am 5`
Ende befindet sich eine "cap Struktur". Das Genom besteht aus neun funktionellen
offenen Leserahmen (ORF), die sich teilweise überlappen. Nach den vom 5`Ende
ausgehenden ORF 1a und 1b folgt in Richtung des 3´Endes ein Set aus sieben
Genen, die verschiedene Strukturproteine (E, GS, GL, M, N, GP3 und GP4) (Abb. 1,
Tab. 2) kodieren (De Vries et al. 1992, Snijder et al. 1998, Zeegers et al. 1976).
Tabelle 2: Größe und Funktion der Virusproteine des EAV
ORF
Bezeichnung
Größe (MG in kDa)
Funktion
1a
1a
186,9-260
RNA-Polymerase
1a, 1b
1ab
345-421
2°
E
8
Hüllprotein
2b
GS
25
Hüllprotein
3
GP3
18,1
Hüllprotein
4
GP4
28
Hüllprotein
5
GL
30-42
Hüllprotein
6
M
16
Hüllprotein
7
N
14
Nukleokapsidprotein
3
Doppellipidmembran
Nukleokapsidprotein
GP4
GP3
GL -Protein
RNA
M-Protein
Nukleokapsid
E-Protein
GS -Protein
Abbildung 1: Aufbau des EAV
ORF1a und ORF1b
Diese ORF nehmen ¾ des gesamten Genoms ein. Sie liegen am 5`-Ende des
viralen Genoms, zwischen den Nukleotidpositionen 1 und 9807 (Tobiasch et al.
2001) und codieren das virale Replikasepolyprotein. Durch die Spaltung der
Polyproteine entstehen 12 Nichtstrukturproteine (Nsp).
Nsp 1 ist besonders für die Transkription wichtig. Es wird in frühen Stadien der
Infektion im Nukleus der Wirtszelle gefunden (Tijms et al. 2002).
Nsp 2 und Nsp 3 spielen nicht nur für die Proteolyse des ReplikaseVorläufermoleküls eine Rolle, sondern auch in der Membran-Assoziation des
Virusreplikationskomplexes.
Sie
scheinen
wichtig
für
die
Bildung
der
Doppelmembranstrukturen zu sein (Snijder et al. 2001).
Nsp9 stellt die RNA abhängige RNA Polymerase und Nsp10 die EAV Helikase dar
(Snijder et al. 2001).
Mehrere hydrophobe Domänen im ORF1a Polyprotein gewährleisten die
Verankerung des Replikationskomplexes in intrazellulären Membranen, welche
4
dann zu den typischen Doppelmembranvesikeln modifizieren (Molenkamp et al.
2000).
ORF 2a
ORF 2a codiert das Protein E (8 kDa), das ein nichtglykosiliertes Hüllprotein ist,
welches sehr stabil innerhalb der Zelle und des Virions ist. Zentral im Protein
befindet sich eine hydrophobe Domäne, C-terminal ein hydrophile. Dies spricht für
ein integrales Membranprotein. Zusammen mit dem kleinen Glykoprotein (GS) ist
das Protein E für ein infektiöses Virus wichtig. In der Wirtszelle ist es ähnlich wie
das M-Protein am Golgi-Apparat und am Endoplasmatischen Retikulum (ER)
lokalisiert. Es formt aber im Gegensatz zu diesem keine Disulfidbrücken mit
anderen Proteinen (Snijder et al. 1999).
ORF 2b
Das GS Protein (25 kDa), ein kleines N-glykosiliertes Hüllprotein, zählt zu den
Klasse I transmembranen Glykoproteinen. Fraktionen davon bilden in EAVinfizierten Zellen Homodimere über eine Disulfidbrücke und bleiben während der
Virusausschleusung im Virion. Dem gegenüber stehen die Monomere, welche im
ER der infizierten Zellen zurückbleiben und zur intrazellulären Zersetzung führen
(De Vries et al. 1995b). GS ist ein sehr instabiles Protein mit einer niedrigen
Immunogenität und nimmt nur 2 % der viralen Proteinmasse ein (Hedges et al.
1996, Lepage et al. 1996).
ORF 3
ORF 3 kodiert ein kleines Struktur-Glykoprotein GP3 (18,1 kDa), welches sich als
integrales Membranprotein erwies, das durch zwei hydrophobe Enddomänen
verankert ist. Während der Expression wird es ähnlich wie GP4 am ER gefunden
und nur in geringen Mengen im Virion eingebaut. Der größte Teil der
Oligosaccharide dieser Glykoproteine GP3 und GP4 bleibt biochemisch gesehen
unverändert (Wieringa et al. 2002).
ORF 4
Das durch ORF 4 kodierte kleine Struktur-Glykoprotein GP4 (28 kDa) zählt zu den
Klasse I Integralproteinen und besitzt drei funktionelle, N-glykosilierten Bereiche
und ein kleines, wenn überhaupt vorkommendes, freiständiges carboxyliertes
Ende. Es ist während der Expression am ER der EAV-infizierten Zelle zu finden
(Wieringa et al. 2002).
5
ORF 5
Das GL Protein (30-42 kDa) ist ein großes N-glykosiliertes Hüllprotein (De Vries et
al. 1992), das, so wird angenommen, ein Klasse IV Integralmembranprotein
darstellt.
Die
zwei
Hauptfunktionen
des
Proteins
liegen
in
der
Rezeptorbindungsstelle und im Membranfusionsprotein. Das große Glykoprotein
besitzt als einziges Protein des Virions eine große Ektodomäne und darin die
Neutralisationsdeterminante mit vier interaktiven Epitopen (Balasuriya et al. 1995,
Balasuriya et al. 1997). Wie bisher bekannt, binden alle neutralisierenden
Antikörper gegen EAV im Pferdeserum nur am GL-Protein, und an diesem an vier
verschiedene Stellen (Balasuriya et al. 2000, Chirnside et al. 1995, Deregt et al.
1994). Der Vergleich verschiedener Feldisolate zeigt deutliche Genvariationen im
Bereich der Epitope, dabei fällt auf, dass Unterschiede nicht nur zwischen Isolaten
verschiedener geographischer Herkunft zu verzeichnen sind, sondern auch
gleicher Areale, eines Jahres oder auch eines Ausbruchs. Das GL-Protein eignet
sich deutlich besser zur Darstellung phylogenetischer Stammbäume als das GSProtein bzw. ORF 3 oder 4 (Balasuriya et al.1997, Stadejek et al. 1999). Ebenfalls
wurden Veränderungen in den variablen Regionen von GL auch in Viren isoliert
aus dem Sperma persistent infizierter Hengste gefunden (Balasuriya et al. 1997,
Glaser et al. 1995).
ORF 6
ORF 6 kodiert das unglykosyliertes Hüllprotein M (16 kDa), welches dem
Membranprotein von Corona und Toroviren entspricht. Es ist hydrophob, und nur
19 Aminosäuren (AS) erscheinen auf der Virionoberfläche, so dass das M-Protein
nur schwach immunogen ist. Zusammen mit dem GL-Protein bildet das M-Protein
im Gegensatz zu den Homodimeren des M-Proteins über eine Disulfidbrücke
zusammenhängende Heterodimere, die in die Viruspartikel eingebaut werden
(Balasuriya et al. 2000). Es wird vermutet, dass der zytoplasmatische Teil des MProteins die viralen glykosilierten Hüllproteine so beeinflusst, dass diese weniger
an der Zelloberfläche exprimiert werden, um so die antivirale Immunantwort zu
reduzieren
(De
Vries
et
al.
1995a).
Wahrscheinlich
ist
es
in
die
Virusausschleusung involviert. Auch ORF 6 wurde für phylogenetische Analysen
genutzt. Es eignet sich jedoch nicht gut, um Verwandtschaften zwischen
verschiedenen Isolaten nachzuweisen (Sekiguchi et al. 1995).
6
ORF 7
Das
durch
ORF
7
codierte
N
Protein
(14
kDa)
ist
phosphoriliertes
Nukleokapsidprotein und bildet das isometrische Kapsid unter Assoziation mit PreGolgi-Membranen im Ausschleusungsprozess. In EAV infizierten Zellen wird es in
großen Mengen produziert und erweist sich als sehr stabil (Deregt et al. 1994). Die
Domänen des N-Proteins interagieren mit dem viralen Genom. Ebenfalls agiert ein
Teil
des
N-Proteins
durch
Kolokalisation
mit
dem
Replikationskomplex
(Magnusson et al. 1970, Molenkamp et al. 2000). In infizierten Zellen konnte eine
partielle Lokalisation im Kern gefunden werden, die durch einen aktiven
Proteintransporter (CRM1) vermittelt wurde (Tijms et al. 2002). Bei Mäusen,
immunisiert mit einer DNA-Vakzine basierend auf ORF 7, konnten im Serum
neutralisierende Antikörper gegen EAV nachgewiesen werden (Tobiasch et al.
2001).
L-ORF
Molenkamp erwähnt einen potentiell zehnten ORF (L-ORF), der sich in der
"leader-sequence" mit 14-124 Nukleotiden befindet (Molenkamp et al. 2000).
Dieser ORF codiert ein hypothetisches 37 AS haltiges Protein. Alle mRNAs von
EAV enthalten diesen Leserahmen in ihrer 5`terminalen Region. Da das L-ORF
Protein weder in der Replikation noch in der Transkription von EAV eine Rolle
spielt, geht man davon aus, dass es auf den gesamten EAV-Lebenszyklus keinen
Einfluss hat (Molenkamp et al. 2000).
Die RNA Synthese findet an virusinduzierten Doppelmembranstrukturen in der
Nähe des Kerns von infizierten Zellen statt. Diese Doppelmembranvesikel
entstehen
aus
der
Modifizierung
von
Wirtszell-Membrankompartimenten,
wahrscheinlich des ER (Pedersen et al. 1999), durch virale Replikaseproteine, mit
welchen sie einen Komplex bilden (Snijder et al. 2001).
Der Replikationszyklus von EAV beginnt mit der Expression der Replikasegene,
bestehend aus ORF 1a und 1b, direkt von der genomischen RNA. Protein 1ab
entsteht durch ribosomalen Leserahmenwechsel kurz vor Ende der ORF 1a
Expression. 1a (1727 AS) und 1ab (3175 AS) Replikase Polyproteine werden
durch drei ORF 1a codierende Proteinasen zu zwölf Nichtstrukturproteinen
bearbeitet (Snijder et al. 2001, van Dinten et al. 1997). Aus dem ORF 1a Protein
entstehen acht große Endprodukte, die Nsp 1-8. Das ORF 1ab Protein wird durch
7
die Nsp 4 Serinprotease zu den Nsp 9-12 mit 80, 50, 25 und 12 kDa gespalten (de
Vries et al. 2001, Snijder et al. 2001, Stadejek et al. 1999).
Es werden sechs bis acht subgenomische mRNAs, die jeweils am 5`Ende eine
„common leader“ Sequenz (206 Nukleotide) und eine "transcription-regulating"
Sequenz (TRS) besitzen, diskontinuierlich transkripiert (Pasternak et al. 2000).
Um die Expression der genetischen Information regulieren zu können, gibt es
mehrere Mechanismen. In eukaryotischen DNA-Genomen wird die Transkription
im Kern der Zellen kontrolliert. Im Kontrast dazu wird das Genom der eukaryoten
(+) RNA im Zytoplasma durch Regulation der RNA-abhängigen RNA-Synthese
reguliert. Letzteres kann auf dem (post)translationalen Level geschehen oder
direkt durch Regulation der Transkription. Die Nidovirionen haben die Strategie
der Nutzung von subgenomischen mRNAs gewählt. Hier spielt die Verbindung der
Leadersequenz am 3`Ende und der mRNA Körper am 5`Ende durch die TRS die
wichtige Rolle in der Regulation der diskontinuierlichen Transkription, deren
Mechanismen aber noch bis heute nicht eindeutig im Detail verstanden werden
(van Dinten et al. 1997, van Marle et al. 1999).
Mit Ausnahme der mRNA 7 sind die EAV-spezifischen mRNAs strukturell
polyzistronisch. Durch Translation nur des jeweils ersten, 5`gelegenen, ORF
entstehen aus diesen mRNAs sieben verschiedenen Strukturproteine. Daher sind
die mRNAs funktionell gesehen monozistronisch (De Vries et al. 1992, de Vries et
al. 2001). Zusammen mit der genomischen RNA entsteht das Virus und wird über
"budding"
aus
der
Wirtszelle
geschleust
(de
Vries
et
al.
2001).
Phospholipidkomponenten der Proteine spielen bei diesem Vorgang eine wichtige
Rolle (van Genderen et al. 1995).
2.2
Pathogenese, Pathologie, Klinik
Die Pathogenese der EAV-Infektion ist nur für die Infektion über den
Respirationstrakt genauer bekannt. Das Virus gelangt über die oberen Atemwege
in
die
Lunge.
Nach
der
initialen
Vermehrung
von
EAV
in
den
Alveolarmakrophagen kommt es schon am zweiten Tag nach der Infektion (d. p. i.)
zur Virusvermehrung in den Bronchiallymphknoten. Daraufhin erfolgt eine
Ausbreitung des Virus über das Blut als extrazelluläres Virion oder in EAVinfizierten Makrophagen. Ab dem dritten Tag beginnt das Virämiestadium, und
8
EAV kann in allen Körperflüssigkeiten und Geweben, mit Ausnahme des Gehirns,
nachgewiesen werden. Zielzellen für die weitere Vermehrung sind hierbei in erster
Linie Makrophagen und Endothelzellen. Erst in zweiter Linie erfolgt eine
Vermehrung in den Epithelien der inneren Organe, im Mesothelium und in den
Zellen der Tunica media der Blutgefäße. Durch generalisierte vaskuläre Nekrosen,
von denen besonders kleine muskuläre Arterien betroffen sind, kommt es somit
zur erhöhten Permeabilität der Gefäße (Estes et al. 1970). Daraus entstehen
Hämorrhagien und die für EAV so charakteristischen Ödeme. Die Tiere können
aufgrund von Hypovolämie und Hypotension sterben. Im Endstadium kann es zu
Infarkten in Milz, Lunge und Darm kommen, gefolgt von fibrinhaltigen
Flüssigkeitsansammlungen in den Körperhöhlen.
Mit Ausnahme der Gewebe des Geschlechtstraktes von männlichen Fohlen und
Hengsten kann das Virus nicht länger als 36 d. p. i. aus den Sekreten und
Geweben infizierter Tiere isoliert werden (Fukunaga et al. 1981, De Vries 1994).
Die durchschnittliche Dauer der Ausscheidung von EAV wird in Tabelle 3
dargestellt.
Tabelle 3: Dauer der EAV-Ausscheidung nach Infektion
Dauer der EAV-
Referenz
Ausscheidung p.i.
Augen-,
Nasensekret, 2-16 Tage
(Fukunaga et al. 1981)
Speichel
(McCollum et al. 1971)
Vaginal-, Uterussekret
2-9 Tage
Urin
5-19
Sperma
Tage
(Fukunaga et al. 1981)
(bis
wenige (Clayton 1987)
Monate)
(Fukunaga et al. 1981)
Tage bis Jahre
(Glaser et al. 1996)
(Neu et al. 1987)
Die Mechanismen des Abortes der Stuten werden auf unterschiedliche Weise
erklärt. Aufgrund von starken Schädigungen des Fetus, die histopathologisch in
vielen Fällen gefunden werden konnten, kann einerseits der viral induzierte Tod
des Fetus Grund für den Abort sein (Cheville 1980, Coignoul et al. 1984, Cole et
al. 1986, Doll et al. 1956, Doll et al. 1957, Golnik et al. 1986, Johnson et al. 1991).
9
MacLachlan et al. (1996) wiesen neben deutlichen Veränderungen des Fetus in
Leber und Milz, Antigen im Zytoplasma dieser Zellen und einen höheren
Antikörper-Titer im Blut des Fetus als im Blut der Mutter nach. Dem gegenüber
stehen jedoch auch Abortgeschehen, bei denen der Fetus kaum bzw. keine
gewebliche Schädigung aufwies. Bei diesen Fällen standen Veränderungen des
Uterus bzw. der Plazenta im Vordergrund. Hier führten wahrscheinlich eine
diskontinuierliche Blutversorgung des Fetus und der Plazenta durch mechanische
Kompression der Blutgefäße aufgrund einer nekrotisierenden Myometritis zum
Abort (Coignoul et al. 1984, Del Piero et al. 1997, Jones et al. 1957, Wada et al.
1996). Ein zusätzlicher Mechanismus der EAV-induzierten Aborte scheint die
Schädigung der Plazenta und dem daraus resultierenden Abfall von Progesteron
und der lokalen Freisetzung von Prostaglandinen zu sein (Coignoul et al. 1984).
Die Ausprägung der Klinik ist von vielen verschiedenen Faktoren abhängig.
Virusstamm und Menge der infektiösen Dosis spielen ebenso eine große Rolle wie
Alter und physiologische Kondition der Tiere sowie deren Haltungsbedingungen.
Auch der Weg der Übertragung scheint wichtig zu sein. So verlaufen Infektionen
über den respiratorischen Weg klinisch weit dramatischer als zum Beispiel
experimentell durchgeführte intravenöse Infektionen (Del Piero et al. 1997,
Timoney et al. 1993). Die meisten natürlichen Infektionen mit EAV verlaufen
asymptomatisch (Timoney et al. 1990). Experimentelle Infektionen verursachen je
nach Stamm und Infektionsweg unterschiedliche Symptome. So zeigten sich nach
intranasaler und intramuskulären Injektionen mit dem Bucyrusstamm schwere
klinische Symptome mit zum Teil hoher Mortalität (Estes et al. 1970, Fukunaga et
al. 1981), wohingegen der Kentucky-84 (KY-84),- Vienna- (Vienna 548 68(3)) und
TWH/TB-SS- Stamm mildere Symptome und keine Mortalität verursachen
(Fukunaga et al. 1997, Jaksch et al. 1973, McCollum et al. 1988, McCollum et al.
1994).
EAV-infizierte Tiere zeigen nach einer Inkubationszeit von drei bis 14 Tagen
besonders in der akuten Periode, die ein bis neun Tage dauert, hohes Fieber bis
zu 41°C, Inappetenz bis Anorexie und Apathie. Weiterhin sieht man oft Rhinitis mit
nasaler Sekretion, Schwellung der Mandibularlymphknoten und Konjunktivitis mit
starkem Augenausfluss und palpebralem Ödem (Doll et al. 1957). Der seröse
Nasenausfluss kann durch
Sekundärinfektionen
10
schnell purulent werden.
Aufgrund der Veränderungen der Augenschleimhaut, die von einer geringgradigen
Konjunktivitis bis zur Chemosis führen kann, wurde die Equine Arteritis auch unter
der Bezeichnung „pinkeye“ bekannt. Diese Tiere zeigen ebenfalls Lichtscheue,
Photophobie. Typisch sind besonders Ödeme an den (Hinter-) Gliedmaßen, am
ventralen Abdomen, Präputium, Skrotum und am Euter (Mayr et al. 1984).
Feldviren besitzen unterschiedlich hohe abortogene Potenz und können
Abortraten zwischen 10 % und 90 % verursachen (Cole et al. 1986, Golnik et al.
1986, Timoney et al. 1993). Aufgrund der kurzen Zeitspanne zwischen Infektion
und Abort, sieben bis 33 (bis 57) d (Coignoul et al. 1984, Cole et al. 1986,
Nowotny et al. 1992) sprach man früher fälschlicherweise von Frühaborten
(Nowotny et al. 1992). In der Regel liegt die durchschnittliche Tragezeit zwischen
dem 7. und 11. Trächtigkeitsmonat, bevor es bei bis zu 70 % aller infizierten
Stuten zum Abort kommt (Nowotny et al. 1992, Cole et al. 1986). Andere Quellen
geben Tragezeiten ab dem dritten Monat an, in der ein Abort durch EAV erfolgen
kann (De Vries 1994). Auch müssen die Stuten nicht unbedingt klinische
Symptome zeigen, bevor der Abort eintritt. Der Anteil EAV-verursachter Aborte
liegt zwischen 10 % und 50 %. Fertilitätsprobleme der Stuten nach einer EAVInfektion wurden bisher nicht gesehen. Hengste können dagegen drei bis vier
Monate nach der Infektion subfertil bleiben. Klinisch lässt sich eine Verringerung
der
Spermienzahl
und
–motilität
sowie
eine
Veränderung
der
Spermienmorphologie dokumentieren. Ursachen hierfür sind nicht nur Affektionen
der Hoden, Nebenhoden und akzessorischen Geschlechtsdrüsen, sondern auch
die erhöhte Körpertemperatur und Skrotalödeme, die zu einer Störung der
Spermiogenese führen. Fertilitätsstörungen chronisch infizierter Hengste sind nicht
bekannt (Timoney et al. 1993).
Seltener werden schwere respiratorische Störungen wie Dyspnoe, Laryngitis,
Pharyngitis, Pleuritis oder Pneumonie beobachtet. Auch intestinale Störungen von
Kolitis mit Diarrhoe und Obstipationen bis hin zu nekrotischen Veränderungen des
Darmes, eventuell verbunden mit einem Ikterus, sind weniger zu beobachten,
ebenso Hautveränderungen mit Urtikaria (Fukunaga et al. 1992), Stomatitis oder
Ulzerationen der Kornea (Doll et al. 1957, Fukunaga et al. 1981, Jaksch et al.
1973, McKinnon et al. 2000). In einigen Fällen werden auch Somnolenz bis hin zu
dummkollerartigem Verhalten beobachtet (Ahlswede et al. 2001). Liebermann et
11
al. (1988) berichten von Myelitiden, die durch trippelnde Bewegungen und
Nachhandschwäche gekennzeichnet sind. Auch ZNS-Symptome in Form von
Stumpfsinnigkeit, Fazialisparese und Penisvorfall kann auftreten.
Intrauterin
infizierte
Tiere
werden,
wenn
nicht
abortiert,
zu
früh
oder
lebensschwach geboren. Meist sterben sie aufgrund der schweren klinischen
Symptome wie interstitieller Pneumonie und nekrotisierender Kolitis wenige Tage
nach der Geburt (MacLachlan et al. 2000, Del Piero et al. 1997, Eichhorn et al.
1995, Golnik et al. 1981). Das Blutbild weist in den ersten drei Tagen eine
geringgradige Erythrozytopenie auf (Fukunaga et al. 1981). Zwischen dem 8. und
10. d. p. i. sinken die Leukozytenzahlen verbunden mit einer Linksverschiebung
der Granulozyten sowie einer Lymphopenie (Del Piero et al. 1997, Jaksch et al.
1973, McCollum et al. 1978).
2.3
Immunologie
Ein bis drei Wochen nach natürlichen oder experimentellen Infektionen entwickeln
Pferde neutralisierende AK gegen EAV. Der Antikörper-Titer kann in den ersten
vier Monaten ansteigen und bleibt dann über Monate bei natürlichen Infektionen z.
T. über Jahre konstant. Experimentelle Infektionen EAV-AK-positiver Tiere zeigen,
dass je nach Titer eine deutliche Reduktion der Symptome gelingt bzw. keine
Symptome auftreten (Balasuriya et al. 2000). So kann sich das Virus zwar initial
vermehren, Aborte oder die Persistenz von EAV im männlichen Geschlechtstrakt
scheinen aber verhindert werden zu können. Wahrscheinlich wird durch
Reinfektionen der AK-Titer und damit auch die Immunität auf einem hohen Niveau
gehalten (Cole et al. 1986, Fukunaga et al. 1981, Fukunaga et al. 1990, McCollum
et al. 1994).
Im Kolostrum EAV immuner Stuten sind neutralisierende AK in mehr als doppelt
so hoher Konzentration wie im Serum zu finden. Nach der Geburt nehmen Fohlen
über das Kolostrum diese AK auf und sind so ebenfalls vor schweren klinischen
Symptomen geschützt. Die AK gegen EAV sind jedoch nur bis zu einem Alter von
sechs Monaten nachweisbar, sodass Fohlen ab diesem Zeitpunkt nicht mehr
gegen eine EAV-Infektion geschützt sind. Das Auftreten klinischer Symptome bei
Tieren mit EAV-neutralisierenden AK nach experimenteller Infektion zeigt, dass
die humorale Immunantwort nicht vollständig gegen eine Erkrankung schützt
12
(Fukunaga et al. 1992, Jaksch et al. 1973, McCollum 1986). Über die zelluläre
Immunantwort gegen EAV liegen derzeit noch keine Untersuchungen vor.
Untersuchungen des Lactatdehydrogenasevirus bewiesen in ersten Experimenten
die Rolle von zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) in der spezifischen Lyse von
infizierten Makrophagen. Auch bei PRRSV wurde eine T-Zell-Antwort bei
Schweinen
vier
Wochen
nach
der
Infektion
gefunden.
Aufgrund
der
Verwandtschaft geht man von ähnlichen Verhältnissen bei EAV und SHFV aus
(Slater et al. 2000, Snijder et al. 1998).
Antikörpernachweis
Enzym-linked-immunosorbent-assay (ELISA)
Ein ELISA mit großer Spezifität wurde zur Erkennung von Antikörpern gegen das
GL-Protein von EAV entwickelt. Ein großes Problem ergab sich jedoch durch die
hohe unspezifische Bindung von Pferdeseren bzw. einzelner Pferde, die
Antikörper gegen andere Epitope als dem GL-Protein gebildet hatten. Diese
Pferdeseren zeigten hohe Antikörper-Titer im SNT, reagierten im ELISA jedoch
nur schwach positiv (Nugent et al. 2000).
Komplementbindungsreaktion (KBR)
Die KBR wurde ebenfalls zum Nachweis von spezifischen Antikörpern gegen EAV
angewendet. Jedoch ergab sich auch hier eine geringere Spezifität verglichen mit
dem SNT. Daher gewann sie nie eine Bedeutung als Nachweissystem (Fukunaga
et al. 1977).
Serumneutralisationstest (SNT)
Der SNT ist die Methode der Wahl, um routinemäßig neutralisierende Antikörper
gegen EAV nachweisen zu können. Zwar ist der Test sehr zeitaufwendig
(mindestens vier bis fünf Tage), jedoch gibt es bisher keine besser funktionierende
Alternative.
Seine
Sensitivität
kann
durch
die
Zugabe
von
Meerschweinchenkomplement verbessert werden (Hyllseth et al. 1970, Maess
1971). Es gibt sogar einige Stämme, bei denen die gegen sie gebildeten
Antikörper ohne Komplement nicht nachweisbar sind (McCollum et al. 1978,
Moraillon et al. 1978). Grundsätzlich gilt, dass alle Ergebnisse mit einem Titer von
größer gleich vier positiv sind. Um eine akute Infektion diagnostizieren zu können,
müssen Serumpaare im Abstand von 14 bis 21 Tagen gewonnen werden, die
einen signifikanten Titeranstieg oder eine Serokonversion zeigen. Da aufgrund der
13
Durchführung
des
Testes
Schwankungen
auftreten
können,
gelten
Titerschwankungen von einer Titerstufe noch nicht als beweisend. Einen
maximalen Titer erreichen die Tiere bis drei Monate nach der Infektion, welcher
dann über Jahre persistieren kann (Fukunaga et al. 1977, Senne et al. 1985).
2.4
Epidemiologie
Die natürlichen Wirte von EAV sind Pferde, Esel und deren Kreuzungen. Trotz
umfangreicher Untersuchungen gelang erst 2005 der Nachweis der natürlichen
Infektion bei Zebras (Barnard 1997, Glaser et al. 1997, Paweska et al. 1996,
Paweska et al. 1997a, Borchers et al. 2005). Die Übertragung von einem bei Eseln
isolierten EAV-Stamm gelang bisher nur experimentell. Die natürliche Ansteckung
zwischen Eseln und Pferden ist noch nicht völlig geklärt (Paweska et al. 1996,
Paweska et al. 1997c). Serologische Untersuchungen haben gezeigt, dass EAV in
vielen Ländern der Welt auftritt (Tab. 4). Der Unterschied in den Seroprevalenzen
bei verschiedenen Rassen lässt die Vermutung zu, dass der Genotyp für das
Zustandekommen einer Infektion wahrscheinlich auch eine Rolle spielt (De Vries
1994). Nach wie vor wird von einem Serotyp bei EAV ausgegangen, der
genotypisch jedoch zwischen den einzelnen Isolaten besonders im variablen
Bereich des großen Glykoproteins (GL-Proteins) starke Unterschiede zeigen kann
(St Laurent et al. 1997). Besonders bei den Zuchtrassen American Standardbred
(entspricht dem deutschen Warmblut), Warmblüter, Haflinger, Noriker und
Lipizzaner wurden vermehrt EAV-Infektionen diagnostiziert (Glaser et al. 1996).
Im Vergleich zu der hohen Seroprevalenz in vielen Ländern der Erde, wird über
Ausbrüche und Epizootien weit weniger berichtet. Nach dem ersten anerkannten
Ausbruch auf einem Gestüt in Bucyrus, Ohio, folgten Epizootien besonders in den
USA, aber auch in Deutschland, Italien, Österreich, Polen und in der Schweiz
(Liebermann 1988). Deren Symptome waren jedoch weit weniger dramatisch als
1953 in Ohio. Erkrankungen an EAV in den letzten Jahren sind in Tabelle 5
dargestellt. Die Diskrepanz zwischen der hohen Seroprevalenz und den wenigen
Ausbrüchen scheint einerseits durch viele subklinische Infektionen bedingt zu
sein, andererseits liegt sicherlich auch heute noch ein Schwachpunkt in der
richtigen
Diagnostik
der
Erkrankung
Erkrankungen (De Vries 1994).
14
und
Differenzierung
zu
anderen
Tabelle 4: Übersicht über die Seroprevalenz EAV-spezifischer AK
Land
Tierart/ Rasse/
Geschlecht
% sero-
Referenz
positiv
Argentinien
Pferde
9,2
(Nosetto et al. 1984)
Australien
Thoroughbred
6-8
(Huntington et al. 1990a, b)
Standardbred
71-73
(Cullinane 1994)
Pferde
20-30
(Eichhorn et al. 1995)
Deutschland
Westfalen
Frankreich
(Kaaden et al. 1995)
Stuten
27,6
(Ahlswede et al. 2001)
Pferde
4,4-15,2
(Moraillon et al. 1978)
(Zientara et al. 1997)
Großbritannien Thoroughbred
Standardbred
Japan
0,5-2,3
(McCollum et al. 1972)
18,5
(Moraillon et al. 1978)
Importierte Pferde
positiv
(Kondo et al. 1998)
Eigene Pferde
negativ
(Mumford 1985)
Irland
Pferde
<0,5
(Cullinane 1994)
Italien
Pferde
0,9
(Timoney et al. 1990)
Kanada
Pferde
16,2
(Kaaden et al. 1995)
Marokko
Pferde
38
(McCollum et al. 1995)
Esel
66
(Kaaden et al. 1995)
5-14
(de Boer et al. 1979)
Niederlande
Pferde
(Haas et al. 1989)
Neuseeland
Standardbred
54
(McKenzie 1990)
Österreich
Pferde
4,6-15,7
(Kölbl et al. 1991)
Polen
Vollblüter
5,3-67,5
(Golnik et al. 1994)
(Golnik et al. 1986)
Schweiz
Pferde
24
(Bürki et al. 1966)
(Weiss et al. 1997)
Senegal
Pferde
2,5
(Mumford, 1985)
Südafrika
Pferde
1,8-15,2
(Paweska et al. 1997a)
Esel
7,3-20,5
(Paweska et al. 1997b)
Tunesien
Pferde
8,75
(Ghram et al. 1994)
USA
Pferde
55
(Kaaden et al. 1995)
Standardbred
77-84
Thoroughbred
1,6
15
(McCollum et al. 1972)
Tabelle 5: Übersicht über EAV-Infektionen mit klinischen Symptomen in den
letzten Jahren weltweit
Jahr
Land
Referenz
Charakterisierung der
Erkrankungen
1999
Dänemark (Larsen et al. 2001)
90 Pferde mit klinischen Symptomen, ein Abort im 9. Monat
1997
Dänemark (Larsen et al. 2001)
drei Fohlen mit schweren respiratorischen Störungen starben kurz
nach Geburt, zehn weitere Pferde
mit Fieber und schweren
respiratorischen Symptomen
1997
USA
(Del Piero et al. 1997)
nicht detailliert beschrieben
1996
USA
Übertragung durch einen impor-
(Pennsyl-
tierten Hengst aus Europa
vania)
22 Pferde mit schweren klinischen Symptomen, ein Abort, drei
Fohlen starben
1996
Schweiz
1995-
Deutsch-
1997
land
1995
Großbri-
ein isolierter Abort
(Leyk et al. 1997)
4,4% der Aborte in NordrheinWestfalen waren EAV bedingt.
(Nugent et al. 2000)
tannien
1995
Spanien
(Nugent et al. 2000)
1995
Deutsch-
eine Stute mit klinischen Symp-
land
tomen, ein totgeborenes Fohlen,
ein Fohlen starb nach zwei Tagen,
zwei Aborte
1995
1995
Deutsch-
sieben Aborte, zwei Fohlen
land
starben mit klinischen Symptomen
Schweiz
Epizootie mit milden bis schweren
Symptomen
16
Die Übertragung von EAV kann über den respiratorischen Weg durch direkten
Kontakt mit infektiösen Aerosolen des Nasenausflusses akut infizierter Tiere
erfolgen. Dieser aerogene Weg kann jedoch nur durch sehr engen Kontakt der
Tiere, wie auf der Koppel oder in Laufstallhaltung, erfolgen (Ahlswede et al. 2001).
Die horizontale Verbreitung des Virus erfolgt ebenfalls über Tränenflüssigkeit, Blut,
Urin, Kot und vaginale Sekrete. Wird ein Abort durch EAV ausgelöst, so sind
Fruchtwasser, Fetus und Plazenta ebenfalls stark virushaltig und bedeuten eine
große Infektionsgefahr für andere Tiere. Ein zweiter, wichtiger Übertragungsweg
ist die venerische Verbreitung des Virus. Während der akuten Infektion scheiden
Stuten vaginal, Hengste mit der Samenflüssigkeit das Virus aus. Durch die weite
Verbreitung von künstlicher Besamung stellt nicht nur der Deckakt ein hohes
Infektionsrisiko dar. Auch die Möglichkeit der transplazentaren Übertragung des
Virus von der Stute auf das Fohlen ist bekannt. Andere Vektoren wie Menschen,
Arbeitsgeräte, Putzzeug und ähnliches spielen eine eher untergeordnete Rolle.
Eine Übertragung durch Insekten konnte nicht nachgewiesen werden (Bürki et al.
1972, Clayton 1987, Cole et al. 1986). Beim Menschen konnten AK gegen EAV
bisher ebenfalls nicht nachgewiesen werden (Bannister et al. 1989).
Schon seit Ende des 19. Jahrhunderts ist es Tierärzten bekannt, dass infizierte
Hengste über mehrere Jahre das Virus der „Pferdestaupe“ mit dem Sperma
ausscheiden können (Clark 1892, Jensen 1894). Der Ort der Persistenz des Virus
konnte durch Infektionsversuche nachgewiesen werden: Nebenhodenschwanz
(Fukunaga et al. 1992), Ampulla ductus deferentis, Glandula vesicularis und
Prostata (Bergman 1913, Grimme 1903, Jensen 1894).
Seit den achtziger Jahren des 20. Jahrhunderts galt die Aufmerksamkeit der
Forscher wiederum vermehrt den chronisch infizierten Tieren. Es wurde die
Abhängigkeit eines EAV Trägerstatus von der Testosteronbildung gefunden, so
dass bei Hengstfohlen vor der Pubertät selten, bei Wallachen und Stuten
(Paweska 1997) nach Abklingen der akuten Erkrankung nie Virus nachgewiesen
werden konnte (Glaser et al. 1996, Glaser et al. 1997, Holyoak et al. 1993,
McCollum et al. 1994). Es werden jedoch 30-60 % der EAV-positiven Hengste zu
chronischen Ausscheidern (Glaser et al. 1996). Man unterscheidet hierbei
aufgrund der Dauer der Virusausscheidung Kurzzeit- (2-5 Wochen), Intermediär(3-8 Monate) und Langzeitausscheider (Jahre bis lebenslang) (De Vries 1994,
17
Timoney et al. 1993). Bei Langzeitausscheidern kann Virus ausschließlich aus
dem Sperma isoliert werden. Nach der Kastration dieser Hengste sistiert die
Virusausscheidung, durch eine Testosteronbehandlung wird EAV jedoch weiterhin
über das Sperma ausgeschieden (Fukunaga et al. 1992, Little et al. 1992). Die
immunsuppressive Wirkung von Testosteron scheint die Persistenz von EAV im
männlichen Geschlechtssystem möglich zu machen (Little et al. 1992). EAV wird
von den persistent infizierten Tieren kontinuierlich ausgeschieden. Ob es auch
intermittierend EAV-ausscheidende Hengste gibt, wird noch diskutiert. Als
Ursache
hierfür
verantwortlich
könnte
sein
der
saisonal
oder
Fehler
schwankende
im
Testosteronspiegel
Probennahme-
und
Untersuchungsmanagement (Timoney 1986, Timoney et al. 1986, Timoney et al.
1987, Fukunaga et al. 1992, Horzinek et al. 1992). Diese Virus ausscheidenden
Hengste stellen das natürliche Virusreservoir dar und spielen damit eine
bedeutende epidemiologische Rolle.
Erregernachweis
Das
EAV
kann
aus
nasopharyngealen
Tupfern
oder
Spülungen
bzw.
Konjunktivaltupferproben und "buffy coat" Zellen isoliert werden. Um in
Spermaproben
der
Hengste
Virus
nachweisen
zu
können,
sollte
die
spermienreiche Fraktion des Ejakulates genommen werden. Um die Diagnose
eines EAV-induzierten Abortes stellen zu können, sollten fetale und plazentare
Flüssigkeiten und Gewebe zur Untersuchung eingesendet werden.
EAV hat ein breites Spektrum an Zellen, die in vitro infiziert werden können. Bisher
ist die Infektion primärer und sekundärer Nierenzellen von Pferden, Schweinen,
Katzen, Hamstern und Ratten sowie Hodenzellen der Pferde bekannt (Hyllseth
1969, Bürki 1966, McCollum et al. 1962b, McCollum et al. 1962a, Wilson et al.
1962). Empfängliche permanente Zelllinien sind in Tab. 6 dokumentiert. Zwischen
diesen Zelllinien ergeben sich Unterschiede in der Produktion der Virusmenge und
in der Zeit, in der sich ein zytopathischer Effekt (cpe) entwickelt (Konishi et al.
1975). Anhand von Verozellen konnte gezeigt werden, dass EAV in vitro Apoptose
auslöst (Archambault et al. 2000).
Für die Diagnostik werden besonders BHK-21, RK-13 und Verozellen eingesetzt
(Plagemann et al. 1992). Nicht immer kann das Virus in der Zellkultur isoliert
werden, selbst wenn deutliche klinische Symptome erkennbar und der
18
Infektionszeitpunkt bekannt sind. Gut adaptierte Zelllinien sind hier von Vorteil
(McCollum et al. 1978). Die Anzüchtung des Virus kann je nach Zelllinie und Virus
bis zu drei Wochen dauern. Primäre, equine Endothelzellen der Lungenarterien
konnten ebenfalls infiziert werden und stellen somit ein gutes in vitro Modell für die
Charakterisierung der Pathogenese von EAV und dessen Virulenzfaktoren dar
(Moore et al. 2002).
Tabelle 6: Permanente Zelllinien, die EAV infizieren kann
Internationale Abkürzung Herkunft der Zellen
der Zelllinie
Organ
Tierart
BHK-21
Niere
juvenile Hamster
BSC-1
Niere
Afrikanische Grüne Meerkatze
EO
Ovar
Pferd
HmLu
Lunge
Hamster
HS
Tumor
Hamster
JINET
Niere
Cynomolgus-Affe
LLC-MK2
Niere
Rhesusaffe
LLC-RK1
Niere
Kaninchen
NBL-6
Haut
Pferd
RK-13
Niere
Kaninchen
Vero (C1008)
Niere
Afrikanische Grüne Meerkatze
HAT-7
Durch die Immunfluoreszenz- und Immunperoxidasetechnik ergibt sich eine gute
Möglichkeit, Antigen von EAV nachzuweisen. Dieser Test wird zwar nicht für die
Routinediagnostik angewandt, ist jedoch für den Nachweis der Replikation von
EAV in verschiedenen Zelllinien von großer Bedeutung. Da polyklonale Antiseren
starke Hintergrundreaktionen verursachen können, empfiehlt sich die Anwendung
monoklonaler Antikörper (Chirnside et al. 1988, Inoue 1975, Inoue et al. 1975,
Leyk et al. 1997, Shinagawa et al. 1976, Starick 1996, van Berlo et al. 1980).
19
Anfang der neunziger Jahre wurde von Chirnside et al. (1990) die erste
Entwicklung einer PCR beschrieben, um EAV im Sperma nachweisen zu können.
Zu Beginn noch nicht sensitiv genug, wurden schnell "nested" PCRs entwickelt,
die mit einer Genauigkeit von fast 100 % arbeiten. So wurde die Nachweisgrenze
von ursprünglich 600 plaque forming units (pfu) auf unter 2,5 pfu gesenkt
(Cullinane 1993, Gilbert et al. 1997, Sekiguchi et al. 1995, St Laurent et al. 1994).
Damit ergibt sich ein deutlicher Vorteil gegenüber der Zellkultur (Lange-Herbst et
al. 1997). Die PCR arbeitet sensitiver, schnell, spezifisch und kann das Virus
heute in verschiedenen Geweben nachweisen (Starick 1999). Starick (1996)
beschrieb eine verbesserte Nachweistechnik der PCR durch Vorbehandlung des
Seminalplasmas mit Proteinase K und Chelex. Die phylogenetische Analyse
verschiedener Virusisolate hat in den letzten Jahren stark zugenommen und ist
somit der zweite wichtige Einsatzort der PCR.
2.5
Prophylaxe und Therapie
Da Infektionen mit EAV und Aborte immer wieder auftreten, empfiehlt sich der
Einsatz
eines
Impfstoffes.
Besonders
Stutenbesitzer,
die
einen
EAV-
ausscheidenden Hengst nutzen möchten, sollten auf eine Vakzinierung ihrer Stute
nicht verzichten. Derzeit sind jedoch Vakzinen für Stuten auf dem deutschen Markt
noch nicht zugelassen und nur mit Ausnahmegenehmigungen erhältlich. Für
Hengste steht eine Totvakzine (Artervac®) zur Verfügung. Weltweit werden
hingegen schon seit vielen Jahren unterschiedliche Impfstoffe genutzt.
Attenuierte Lebendvakzinen, z. B. das in den USA zugelassene Arvac®, erzeugen
eine gute belastbare Immunität von langer Dauer u. a. durch die Bildung von
zytotoxischen T-Lymphozyten. Sie beinhalten allerdings auch das Risiko einer
unkontrollierten Ausbreitung des Impfvirus. Das Virus wird in den ersten Tagen
nach
der
Immunisierung
ausgeschieden
und
kann
möglicherweise
zu
Erkrankungen führen. In jedem Fall weisen die Pferde Fieber und eine leichte
Leukopenie auf. Ebenfalls kann es zu einer kurzzeitigen Beeinträchtigung der
Spermaqualität kommen. (Scheepers und Müller 1997). Eine phylogenetische
Analyse von EAV deckte eine mögliche größere Gefahr auf. EAV wurde aus
einem abortierten Fetus isoliert, dessen Mutter fünf Tage zuvor mit Arvac®
vakziniert wurde. Das isolierte Virus war identisch zum Arvac®-Virus (Stadejek et
20
al. 1999, Timoney et al. 1988). Aufgrund dieser Tatsache sollte auf die
Anwendung eine Lebendvakzine in serologisch negativen Beständen verzichtet
werden. Da in den USA ein doch größerer Durchseuchungsgrad als in anderen
Ländern vorliegt, besteht hier eher die Notwendigkeit des Einsatzes dieses
Impfstoffes.
Aufgrund der Untersuchungen von Castillo-Ovlivares et al. (2003) ist eine
markierte Lebendvakzine aus einem strukturell veränderten Virus denkbar. In den
Untersuchungen wurde EAV das Antikörper induzierende GL-Protein entfernt,
womit in den Nachweisverfahren der AK eine Unterscheidung zwischen
vakzinierten Tieren und Tieren mit AK aufgrund einer EAV-Infektion getroffen
werden könnte.
Inaktivierte Vakzinen wie Artervac® induzieren meist eine weniger starke und
kürzer anhaltende Immunität, da eher nur AK gebildet werden, welche in der
Regel weniger wirksam bei viralen Infektionen sind als CTL. Diese Vakzinen
besitzen jedoch eine hohe biologische Sicherheit, d.h. das Virus ist im Impfstoff
abgetötet und kann sich somit nicht vermehren oder eine Erkrankung der Tiere
hervorrufen (Scheepers und Müller 1997). Artervac® sollte daher nach der
Grundimmunisierung jährlich zweimal verimpft werden. Diese Totvakzinen können
jedoch ebenfalls wie attenuierte Lebendvakzinen und Peptid- oder SubunitImpfstoffe keine persistierende Infektion von Hengsten unter Kontrolle bringen
(Slater et al. 2000).
Peptid oder "subunit" Vakzinen präsentieren nur die immunogenen Proteine der
Erreger. Sie besitzen somit ebenfalls eine hohe biologische Sicherheit (Stadejek et
al. 1999), erzeugen aber nur eine eingeschränkte Immunität. Diese Impfstoffart
könnte aus dem Target GL mit seinen vier neutralisierenden Epitopen hergestellt
werden. Eine derartige Vakzine wurde bisher allerdings für EAV noch nicht
entwickelt.
Vielversprechend erweist sich die Entwicklung und Anwendung der DNAImpfstoffe. Sie können zu einer lang andauernden humoralen und zellvermittelten
Immunität gegenüber zahlreichen Infektionskrankheiten bei Mensch und Tier
führen. Hinzu kommt die hohe biologische Sicherheit dieser Vakzine. Diese
Ergebnisse wurden vor allen Dingen experimentell in Mäusen untersucht. Erste
positive Resultate gelangen in letzter Zeit auch bei Großtieren. Das besondere
21
Prinzip der DNA-Impfstoffe ist die Verwendung von einzelnen Genen, die anstelle
von Proteinen verimpft werden. Diese Gene kodieren für die immunogenen
Proteine der Erreger. Die bessere Immunitätsausbildung beruht auf der Tatsache,
dass die endogen synthetisierten Antigene sowohl im Kontext mit dem MHC-I- als
auch dem MHC-II-Molekül den T-Zellen präsentiert werden. Die Vakzinierung mit
Hilfe der gene gun soll die DNA direkt zu den dendritischen Zellen in der Haut
bringen, welche wahrscheinlich die CD8+-T-Zellen stimulieren und daraus
resultierend eine T-Zell-Antwort hervorrufen können (Maecker et al. 1998).
Besonders erwähnenswert ist auch die Möglichkeit, Tiere schon in jungem Alter
impfen zu können, da maternale Antikörper keinen Einfluss auf die DNAImmunisierung haben (Gerdts et al. 2001). 2001 wurden die ersten Ergebnisse zur
Immunisierung von Mäusen mit einer DNA-Vakzine veröffentlicht (Tobiasch et al.
2001). Giese et al. (2002) berichtet von der ersten erfolgreichen Anwendung einer
DNA-Vakzine bei Pferden.
Um eine serologische Unterscheidung zwischen geimpften und infizierten Tieren
zu ermöglichen, steht derzeit eine Markervakzine gegen EAV in Utrecht,
Niederlande, in der Entwicklung. Dies ist besonders wichtig, da der Einsatz der
Impfstoffe ansteigt und daraus Probleme mit Zuchtbeschränkungen einiger Länder
entstehen. Dies ist z. B. in der Vollblutzucht von Großbritannien und Irland der Fall
(Cullinane 1994).
Prophylaktisch sollte in der Hengstaufzucht und später dann die Deckhengste
vakziniert werden. Soll eine EAV-negative Stute von einem EAV-ausscheidenden
Hengst gedeckt werden, so empfiehlt sich ebenfalls eine prophylaktische
Immunisierung gegen EAV. Während des Bedeckungszeitraums muss diese Stute
dann getrennt aufgestallt werden, um eine Infektion anderer Tiere zu vermeiden
(Leyk et al. 1997). Da viele Erkrankungen an EAV nicht erkannt werden, empfiehlt
sich grundsätzlich, auch bei Infektionen mit anderen Erregern, Tiere mit Anzeichen
einer akuten Infektion von den übrigen Tieren zu trennen, um eine Ansteckung
über Sekrete und Exkrete zu vermeiden. Der Tierverkehr sollte eingeschränkt und
die üblichen Desinfektionmaßnahmen beachtet werden (Cullinane 1994, Glaser et
al. 1996).
Die Therapie einer klinischen Erkrankung an EAV sollte vor allen Dingen
symptomatisch angegangen werden. Die erkrankten Pferde eines Bestandes
22
sollten isoliert und ruhiggestellt werden. Gegen das Fieber empfiehlt sich der
Einsatz von Antipyretika. Bei starken Ödemen kann die Anwendung eines
Diuretikums erfolgen. Um bakterielle Sekundärinfektionen zu verhindern, sollte ein
Breitbandantibiotikum eingesetzt werden (Mayr 1987). Bei schwerer Erkrankung
ist die ausreichende Gabe von Wasser und Elektrolyten zu sichern (Liebermann et
al. 1988).
Um EAV aus chronisch infizierten Deckhengsten eliminieren zu können, wird
folgende Möglichkeit diskutiert. Diese Hengste sollen in der vorsaisonalen Zeit
eine GnRH-Gabe erhalten, um so die testosteronabhängige Persistenz von EAV
unterdrücken zu können. Soll der Hengst züchterisch nicht mehr genutzt werden,
so wäre die Kastration eine sinnvolle Möglichkeit, den Hengst als Infektionsquelle
zu eliminieren (Cullinane 1994).
2.6
Gesetzliche Vorschriften
Anfang
der
neunziger
Serokonversionsraten
Jahre
und
mehrten
Erkrankungen
sich
an
Berichte
EAV
auch
über
in
hohe
deutschen
Pferdebeständen (Eichhorn et al. 1995, Herbst et al. 1985, Herbst et al. 1987,
Leyk et al. 1997). Daraufhin wurden Richtlinien für Maßnahmen auf nationaler und
europäischer Ebene überarbeitet und zum 01. April 1995 die Meldepflicht für die
Equine Virale Arteritis in der Bundesrepublik Deutschland eingeführt, d. h.
Tierärzte und die Leiter von tierärztlichen Untersuchungseinrichtungen sind zur
Meldung des positiven Virusnachweises sowie deutlicher klinischer Erscheinungen
verpflichtet
(Bätza
1995,
Bätza
1997)
(Verordnung
über
meldepflichtige
Tierkrankheiten vom 11. April 2001, BGBl. I Nr. 16 v. 20. April 2001). Nicht
meldepflichtig bleibt der positive AK-Titer gegen EAV ohne Virusnachweis bzw.
ohne klinische Erscheinungen.
Auch Großbritannien führte die Meldepflicht ein. In anderen Ländern wie Italien,
Finnland und Irland besteht Anzeigepflicht für EAV.
Weitere
wichtige
Bestimmungen
(Tab.
7)
beinhalten
den
Handel
mit
Equidensperma, Richtlinien für Besamungsstationen und Hengste sowie das
Verbringen von Equiden und deren Einfuhr aus Drittländern (Ahlswede et al.
2001).
23
Tabelle 7: Wichtige tierseuchenrechtliche Bestimmungen im Zusammenhang mit
EAV in der Europäischen Union
-90/426/EWGRichtlinie des Rates vom 26. Juni 1990 zur Festlegung der tierseuchenrechtlichen
Vorschriften für das Verbringen von Equiden und für ihre Einfuhr aus Drittländern
-92/65/EWGRichtlinie der Rates vom 13. Juli 1992 über die tierseuchenrechtlichen
Bedingungen für den Handel mit Tieren, Samen, Eizellen und Embryonen in der
Gemeinschaft
-92/260/EWGEntscheidung der Kommission vom 10. April 1992 über die tierseuchenrechtlichen
Bedingungen und die Beurkundung für die zeitweilige Zulassung registrierter
Pferde
-93/195/EWGEntscheidung
der
Kommission
vom
02.
Februar
1993
über
die
tierseuchenrechtlichen Bedingungen und die Beurkundung für die Wiedereinfuhr
von registrierten Renn-, Turnier- und für kulturelle Veranstaltungen bestimmten
Pferden nach vorübergehender Ausfuhr
-93/196/EWGEntscheidung
der
Kommission
vom
05.
Februar
1993
über
die
tierseuchenrechtlichen Bedingungen und die Beurkundung für die Einfuhr von
Schlachtequiden
-93/197/EWGEntscheidung
der
Kommission
vom
05.
Februar
1993
über
die
tierseuchenrechtlichen Bedingungen und die Beurkundung für die Einfuhr von
registrierten Equiden sowie Zucht- und Nutzequiden
-95/307/EGEntscheidung der Kommission vom 24. Juli 1995 zur Festlegung des Musters der
Veterinärbescheinigung für den Handel mit Equidensperma
-96/539/EGEntscheidung der Kommission vom 04. September 1996 zur Festlegung der
Veterinärbedingungen und der Veterinärbescheinigung für die Einfuhr von
Equidensperma
24
2.7
Messung zytotoxischer T-Zell-Aktivität (CTL-Test)
Nachweis EAV-spezifischer zytotoxischer T-Lymphozyten
Neben den angeborenen Mechanismen der Immunabwehr wird im Laufe einer
Infektion eine spezifische adaptierte Immunantwort entwickelt. Diese umfasst die
Antikörperbildung als Merkmal des humoralen Immunsystems und die, besonders
gegen Virusinfektionen wichtige, zelluläre Immunantwort, vertreten durch THelferzellen und zytotoxische T-Lymphozyten.
Jede (EAV-) infizierte Zelle präsentiert dem Immunsystem virale Proteine
(Peptidabschnitte)
mit
Hilfe
von
MHC-I-Molekülen
an
ihrer
Oberfläche.
Zytotoxische CD8+ T-Zellen erkennen die Fremdproteine anhand der Spezifität
ihres T-Zell-Rezeptors (TCR). In Assoziation mit dem TCR (CD3) und CD8+Korezeptoren gelingt den zytotoxischen T-Zellen die Anlagerung an die EAV
infizierten Zellen. Daraufhin werden zytotoxische Faktoren, Radikale und Perforine
abgegeben, um die als infiziert erkannten Zellen zu zerstören. Voraussetzung für
den ablaufenden Prozess ist die Stimulation der zytotoxischen T-Lymphozyten
durch verschiedene Zytokine wie IL-12 oder IFN-γ.
In einem CTL-Test werden zytotoxische Effektor T-Zellen nachgewiesen, indem
antigen-präsentierende Zielzellen mit Chrom 51 (51Cr) markiert werden und
aufgrund der spezifischen Lyse durch die in vivo generierten und in vitro
restimulierten T-Lymphozyten (Effektorzellen) zerstört werden und somit das frei
werdende Chrom im Kulturüberstand messbar ist (s. Abb. 2). Diese Markierung
erfolgt in den CTL-Tests mit der Menge von 100-500 µCi
51
Cr für 107 Zellen/ml
(Kumar et al. 2001). Die Inkubationszeit der Zielzellen mit 51Cr variiert zwischen 90
min (McGuire et al. 1994) und 120 min (Hammond et al. 1997, Kumar et al. 2001).
Als Antigen präsentierende Zielzellen werden Epithelzellen, Nierenzellen und
Lymphozyten (Hammond et al. 1998, Hammond et al. 1997) bevorzugt. Der
erfolgreiche Einsatz von Fibroblasten als Zielzellen im CTL-Test wird bei Katzen
(Hosie et al. 1998) beschrieben. Bei Pferden verlief der Test jedoch bisher ohne
Erfolg (McGuire et al. 1994). In Vorbereitung für den CTL-Test werden die Zellen
angezüchtet. Die Effektorzellen werden mit einem pflanzlichen Mitogen, pokeweed
mitogen (PWM), für einen oder zwei (Allen et al. 1995) Tage kultiviert und für das
Zellwachstum mit humanem Interleukin 2 (IL-2) stimuliert.
25
A) Zielzellen sind mit 51 Cr markiert , eine Zielzelle ist EAV infiziert
B) EAV-spezifischer T-Lymphozyt erkennt infizierte Zelle, bindet an
Rezeptor und setzt zytotoxische Substanzen frei
C) infizierte Zelle ist zerstört, freies 51Cr im Überstand
Abbildung 2: Schema der Lyse e iner EAV infizierten Zelle durch EAV
spezifische zytotoxische T-Lymphozyten
Experimentelle Erfahrungen zeigen, dass
einer in vivo Stimulation der
Effektorzellen durch den Impfstoff eine in vitro Stimulation im Vorfeld des CTLTests folgen sollte. Es können verschiedene Stimulanzien verwendet werden.
Vorwiegend
werden
Proteine
der
Viren
oder
virusinfizierte
Zellen,
die
virusspezifische Proteine den Effektorzellen präsentieren, eingesetzt (Hammond
et al. 1998, Kumar et al. 2001).
Ziel- und Effektorzellen müssen über einen bestimmten Zeitraum miteinander
kultiviert werden, damit die Effektorzellen über Rezeptorintraktionen die Zielzellen
erkennen. Diese Inkubationszeiten variieren je nach CTL-Test zwischen vier (Allen
et al. 1995, Kumar et al. 2001) und neun Stunden (Hammond et al. 1997,
Hammond et al. 1998).
26
3
Tiere, Material und Methoden
3.1
Pferde
3.1.1
Untersuchungen der Pferde des Brandenburgischen Haupt- und
Landgestütes
Für die Untersuchung des Abortgeschehens wurden freundlicherweise die Pferde
des Brandenburgischen Haupt- und Landgestütes Neustadt/Dosse und deren
Krankenblätter sowie das Zuchtbuch zur Verfügung gestellt. Die Ergebnisse der
Laboruntersuchungen stellten Frau Dr. Petra Schneller, Staatliches Veterinär- und
Lebensmitteluntersuchungsamt Potsdam, und Dr. Werner Herbst, Institut für
Hygiene- und Infektionskrankheiten der Tiere der Justus-Liebig-Universität
Gießen, zur Verfügung.
Anzahl, Aufstallung und serologische Untersuchung der Pferde
Auf dem Hauptgestüt standen Anfang des Jahres 1995 39 Zuchtstuten (Nr. 1-39)
des Jahrgangs 1991 und älter. Die Stuten standen in Laufställen, aufgestallt nach
dem erfolgreichen Decktermin 1994. Drei Stuten wurden nicht zur Zucht
verwendet und getrennt von den anderen Stuten in Einzelboxen aufgestallt.
Sieben Tage vor dem errechneten Geburtstermin wurden die Zuchtstuten getrennt
in Abfohlboxen aufgestallt, kamen jedoch tagsüber zusammen in einen Auslauf. In
den Boxen blieben sie sieben Tage mit ihrem Fohlen, bis sie zusammen mit den
anderen Müttern und Fohlen in einem gemeinsamen Laufstall untergebracht
wurden.
Die Stute Korona wurde zur Animation der Besamungshengste verwendet und
stand daher getrennt von den anderen Pferden in einem Stall gegenüber den
Zuchtstuten in einer Einzelbox.
Am 14.03. und 15.05.95 wurden Seren von zehn Pferden dieser Gruppe
gewonnen. Darunter waren sechs Stuten (5, 7, 10, 32, 34, 36) mit Aborten bzw.
lebensschwach geborenenen Fohlen, zwei Stuten (Nr. 2, 35), die 1994 nicht
tragend waren und ein zwei Monate altes Fohlen (von Stute Nr. 17). Mit Hilfe des
Serumneutralisationstestes wurde auf AK gegen EAV im Doppelansatz am
15.05.1995 untersucht (Tab. 14). Im November 1995 wurden alle Zuchtstuten und
27
deren Fohlen serologisch auf AK gegen EAV untersucht. Einzelne Fohlen, die
länger auf dem Gestüt verblieben, konnten ebenfalls im November der Jahre 1997
und 1999 untersucht werden.
Fünf Jungstuten des Jahrgangs 1992 wurden 1995 zur Zucht zugelassen. Sie
standen gemeinsam mit den Zuchtstuten, die 1994 nicht tragend wurden, in einem
Laufstall. Mit diesen wurden sie zusammen gynäkologisch untersucht und besamt.
Die Seren der Stuten wurden im November 1995 im SNT auf EAV-AK untersucht.
Die 36 einjährigen und zweijährigen Pferde standen jeweils getrennt nach Alter
und Geschlecht in Laufställen in 1 bis 2 km Entfernung des Hauptgestütes. Sie
wurden von eigenen Facharbeitern betreut und hatten auch auf den Koppeln
keinen Kontakt zu anderen Pferden. Alle Jungtiere wurden im November 1995
serologisch auf AK gegen EAV untersucht.
Von den 67 im Deckeinsatz stehenden Hengsten standen sieben Hengste in der
Besamungsstation des Hauptgestütes zur Nutzung in der künstlichen Besamung.
Diese Tiere hatten außer zu der Animierstute Korona keinen Kontakt zu anderen
Pferden. Serumproben dieser Hengste wurden am 23.05.1995 im Institut für
Hygiene- und Infektionskrankheiten der Tiere, Justus-Liebig-Universität Gießen,
auf AK gegen EAV untersucht. Die Blutproben dieser Hengste wurden mit Hilfe
der Anzüchtung auf Zellkulturen untersucht.
Alle anderen 60 Hengste wurden auf dem Landgestüt in 1,2 km Entfernung oder
auf Deckstellen untergebracht. Im November 1995 erfolgte die erneute
serologische Untersuchung aller in der Zucht eingesetzten Hengste auf AK gegen
EAV.
Fremde Stuten, die zur Besamung gebracht wurden, standen in Boxen in einem
Stall, der gegenüber dem der Zuchtstuten gelegen ist. Im Zeitraum des
Abortgeschehens
(Ende
Februar-März)
waren
neun
Pensionsstuten
zur
künstlichen Besamung auf dem Hauptgestüt eingestallt. Im Nachhinein konnten im
November 1995 fünf Stuten serologisch auf AK gegen EAV untersucht werden.
Daten über Stuten, die nur ambulant in der Besamung, räumlich getrennt von den
Hengsten, standen, liegen nicht vor.
28
Geburten, Aborte und Untersuchung der Abortursache
Auf dem Hauptgestüt kam es zu sieben Aborten und zwei Geburten
lebensschwacher Fohlen. 19 Fohlen wurden gesund geboren.
Die Feten bzw. Fohlen der Stuten Nr. 5, 7, 10, 34 wurden keiner Untersuchung
unterzogen. Eine Sektion der Fohlen der Stuten Nr. 1, 32, 36, 38, 39 erfolgte in
der
pathologischen
Abteilung
des
Staatlichen
Veterinär-
und
Lebensmitteluntersuchungsamtes (SVLUA) Potsdam. Im Zuge dessen wurde eine
Untersuchung hinsichtlich bakterieller und viraler Erreger durchgeführt.
Um Abortursachen ausgehend von den Futtermitteln ausschließen zu können,
wurden von Pferdepelletts, Mineralfutter und Getreide Proben gewonnen und in
der bakteriologischen Abteilung des SVLUA Potsdam untersucht.
Untersuchung der Spermaproben der Deckhengste
Von serologisch EAV-positiven Hengsten des Gestütes wurde das Sperma mit
Hilfe der RT-PCR auf EAV untersucht.
Spermaproben der Hengste, die auf dem Hauptgestüt in der Besamungsstation
untergebracht wurden, wurden am 23.05.1995 im Institut für Hygiene- und
Infektionskrankheiten der Tiere, Justus-Liebig-Universität Gießen, über die
Anzüchtung in der Zellkultur auf EAV untersucht.
3.1.2
Untersuchungen der Pferde der ersten Impfstofftestung
Für den ersten Impfversuch 1996 wurden zehn zweijährige, serologisch EAVnegative Stuten des Jahrgangs 1994 des Brandenburgischen Haupt- und
Landgestütes Neustadt/Dosse und deren Untersuchungsergebnisse der SNTs (Dr.
Petra Schneller, SVLUA Potsdam; Dr. Werner Herbst, Institut für Hygiene- und
Infektionskrankheiten der Tiere, Justus-Liebig-Universität Gießen) zur Verfügung
gestellt.
Die Stuten wurden getrennt von anderen Tieren für die Zeit des Impfversuches in
einem Laufstall gehalten. Zwei Tiergruppen, bestehend aus jeweils fünf Pferden,
wurden gebildet. Es wurden zwei Präparationen (A und B) der stallspezifischen
EAV-Vakzine mit unterschiedlichem Antigengehalt subkutan verimpft. Die
Vakzinen wurden aus dem Stamm EAV-Gi 2592 hergestellt, wobei Präparation A
mindestens 107 KID50/ml und Präparation B mindestens 108 KID50/ml vor der
Inaktivierung
enthielt.
Spuren
von Penicillin
29
und
Streptomycin
und
Aluminiumhydroxid als Adjuvans wurden beigefügt. Die Stuten wurden vor,
während und nach den Immunisierungen serologisch auf EAV-AK untersucht.
Während der Grundimmunisierung erfolgten drei Impfungen im Abstand von drei
und zwölf Wochen mit jeweils einer Impfdosis.
3.1.3
Untersuchungen der Pferde der zweiten Impfstofftestung
1999 wurden 40 zweijährige Pferde (Jahrgang 1997, serologisch EAV-negativ)
des Brandenburgischen Haupt- und Landgestütes Neustadt/Dosse in einem
zweiten Impfversuch genutzt. Der Genehmigungsbescheid für die Anwendung von
Artervac® wurde im April 1998 unter dem Aktenzeichen 47-3631/1-22 durch Dr.
Letz vom Ministerium für Ernährung, Landwirtschaft und Forsten des Landes
Brandenburg in Potsdam erstellt.
16 Stuten und vier Hengste wurden mit der stallspezifischen (EAV-Gi 2592)
subkutan und 20 Hengste mit Artervac®, einer kommerziellen Vakzine,
intramuskulär geimpft. Die Pferde standen getrennt nach dem Geschlecht in
Laufställen. Die Grundimmunisierung erfolgte im Abstand von drei und zwölf
Wochen. Nach einem Jahr erfolgte eine Revakzinierung. In bestimmten
Zeitabständen von den Pferden Serum gewonnen, welches im SNT auf EAV-AK
untersucht wurde. Die Untersuchung der gesamten Seren erfolgte parallel im
Doppelansatz. Als Referenzstamm im SNT wurden der EAV-Stamm Bucyrus,
Virologie, Veterinärmedizinischen Fakultät Leipzig, und der Stamm EAV-Gi 2592,
Institut für Hygiene- und Infektionskrankheiten, Justus-Liebig-Universität Gießen,
verwendet.
3.1.4
Untersuchungen der Pferde der dritten Impfstofftestung
In diesem Teil der Untersuchungen wurden an zwei verschiedenen Pferdegruppen
zwei unterschiedliche Impfstoffe getestet. Der Genehmigungsbescheid erfolgte
durch das Sächsische Staatsministerium für Soziales, Dresden, unter dem
Aktenzeichen 64-9155.21/1 A6/2000.
Die Medizinische Tierklinik der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität
Leipzig stellte für die DNA-Immunisierung fünf Pferde zur Verfügung (Tab. 8), die
unter gleichen Bedingungen in nebeneinanderliegenden Boxen aufgestallt waren.
Zur Vorbereitung der DNA-Immunisierung wurden 10x20 cm große Hautareale
Mitte der linken und rechten Halsseite rasiert. Anschließend wurden diese Partien
30
gewaschen und mit 70 %igem Alkohol desinfiziert. Da die Anwendung der gene
gun mit starken Geräuschen verbunden ist, wurden die Pferde zuvor mit 0,5 mg
Xylazin/kg KGW sediert. Die Applikation von 35 µg DNA/Pferd erfolgte mit Hilfe
der gene gun intrakutan und 1,4 mg DNA/Pferd unter Zugabe von DOTAP
Liposomal (Roche) 3 ml je Pferd BME oder Lifofection (Life Technology) 3ml je
Pferd BME wurden intramuskulär in die Semitendinosus-, Semimembranosusoder Glutaeusmuskulatur verimpft. Nach der ersten Verabreichung des Impfstoffes
erfolgten drei weitere Impfungen jeweils im Abstand von ca. 14 Tagen und
mehrmalige Blutentnahmen. Im Rahmen der intradermalen Applikation von
Impfstoffen mit Hilfe der gene gun kann es zu entzündlichen Reaktionen der Haut
kommen. Um diese protokollieren zu können, wurden vor, 24 h und 48 h nach der
gene gun Anwendung die Hautdicke im Halsbereich der Pferde mit Hilfe einer
Schieblehre gemessen (s. Anhang).
Das Serum der Pferde wurde serologisch im SNT auf AK gegen EAV untersucht.
Zusätzlich wurden autologe Fibroblasten durch Hautbiopsien und T-Lymphozyten
durch
Blutentnahmen
gewonnen,
welche
zum
Nachweis
der
zellulären
Immunantwort gegen EAV in CTL-Tests eingesetzt wurden.
Tabelle 8: Pferde der Medizinischen Tierklinik
Name des Pferdes
Alter in Jahren
Geschlecht
Rasse
Daggi
30
Stute
Warmblut
Frieda
16
Stute
Warmblut
Friedrich
10
Wallach
Warmblut
Jessy
16
Stute
Pony
Nelke
6
Stute
Warmblut
Für die Untersuchungen der kommerziellen Vakzine Artervac® wurden vier Pferde
von der Chirurgischen Tierklinik der Veterinärmedizinischen Fakultät der
Universität Leipzig zur Verfügung gestellt (Tab. 9). Diese Pferde standen
außerhalb der Klinik in einem Laufstall zusammen. Ihre Immunisierung erfolgte
nach dem Schema der im Kapital 3.1.3 erwähnten Pferde der zweiten
Impfstofftestung. Auch hier erfolgte parallel zur Immunisierung die Blutentnahme
und anschließend die Untersuchung der Seren auf AK gegen EAV im SNT. Um
31
die zelluläre Immunantwort gegen EAV im CTL-Test untersuchen zu können,
wurden auch bei diesen Pferden Fibroblasten und T-Lymphozyten gewonnen.
Tabelle 9: Pferde der Chirurgischen Tierklinik
Name des Pferdes
Alter in Jahren
Geschlecht
Rasse
Condor
6
Wallach
Englisches Vollblut
Grazie
3
Stute
Halbblüter
Sina
5
Stute
Warmblut
Strolch
2
Wallach
Warmblut
3.2
Material
3.2.1
Geräte und Verbrauchsmaterial
Geräte
Brutschränke (Heraeus, Hanau); Gel-Dokumentationssystem (Intas, Göttingen);
Horizontal-Gel-Elektrophoresekammer (von Keutz, Reiskirchen); Kühl- und
Gefrierschränke
(Liebherr,
Ochsenhausen),
Mehrkanalpipetten
(Costar);
Mikroskope: Umkehr-Mikroskope (Olympus), Fluoreszenz-Mikroskop (Olympus),
Pipettierhilfen (Hirschmann; Gilson, France; Eppendorf, Hamburg); Photometer
(Molecular
Devices);
Orbitalschüttler
Schüttler:
(Forma
Vortexer
Scientific);
(Bender
&
Sterilwerkbänke
Hobein,
(Heraeus,
Zürich);
Hanau);
Wasserbäder (GFL, Burgwedel); Zentrifugen: Tischzentrifuge, gekühlt (Heraeus,
Hanau),
Zellkulturzentrifuge
(Heraeus,
Hanau),
Großzentrifuge
"Avanti"
(Beckmann, München), Ultrazentrifuge (Beckmann, München)
Verbrauchsmaterial
Einfrierröhrchen, 1,8 ml (Nunc, Dänemark); Gewebekulturflaschen (25 cm2, 75
cm2),
-platten,
-schalen
(Greiner,
Frickenhausen);
Glaspipetten
(Brand);
Griffstopfen (Greiner, Frickenhausen); Heparinisierte Röhrchen, 10 ml (Greiner,
Frickenhausen); Reaktionsgefäße: 50 ml, 15 ml (Greiner, Frickenhausen);
Parafilm (American National Can); Pipettenspitzen (Greiner, Frickenhausen); PSRöhrchen, 2 ml (Greiner, Frickenhausen); Zentrifugenbecher (Beckmann,
München); Ultrazentrifugenröhrchen (Beckmann, München)
32
3.2.2
Biologische Materialien
Vakzinen
Artervac®
Impfstoffart:
formalin-inaktivierter Impfstoff
Hersteller:
Fort Dogde®
EAV-Stamm:
virulentes Feldisolat
Adjuvans:
metabolisierbares Öladjuvans
stallspezifische Vakzine aus EAV-Gi 2592
Impfstoffart:
formalin-inaktivierter Impfstoff,
Hersteller:
Eigenherstellung am Institut für Hygiene- und Infektionskrankheiten der Tiere, Justus-Liebig-Universität Gießen
EAV-Stamm:
EAV-Gi 2592
Adjuvans:
Aluminiumhydroxid
DNA Vakzine
EAV-Stamm:
Prof. Dr. H. Ludwig, Berlin (Tobiasch et al. 2001)
Plasmide:
ORF 2, 5, 7; equines IL-2 (Giese et al. 2002)
Zusatz:
DOTAP Liposomal oder Lifofection für die intramuskuläre
Injektion (Giese et al. 2002)
Zelllinien
Vero
Zelllinie aus Nierenzellen der afrikanischen grünen Meerkatze (Cercopithecus
aethiops)
Lymphozyten
aus dem Blut von Pferden über einen Gradienten gewonnene primäre Zellen
Fibroblasten
primäre Zellen, aus Hautbiopsien von Pferden gewonnene Zellen
Bakterien
Zur Klonierung von DNA wurde der Escherichia coli Stamm K12 verwendet
33
Viren
EAV Bucyrus
Der EAV Stamm Bucyrus wurde 1952 in Ohio/USA aus einem abortierten Fetus
isoliert und gilt seitdem als Referenzstamm in den verschiedenen Labors. Das in
den SNTs angewendete Virus stammt aus dem Institut für Virologie der
Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig.
EAV-Gi 2592
Das Virus wurde in Gießen aus der Nachgeburt eines Pferdes aus Neustadt/
Dosse isoliert und freundlicherweise von Herrn Dr. W. Herbst, Institut für Hygieneund Infektionskrankheiten, Justus-Liebig-Universität
Gießen zur Verfügung
gestellt.
Enzyme und Sonstiges
Restriktionsendonukleasen (AGS, Heidelberg; Hybaid)
Streptavidin-Peroxidase (Boehringer, Ingelheim)
Trypsin (Life Technologies, Karlsruhe)
Meerschweinchen-Komplement (Dade Behring, Marburg)
Interleukin-2, humanes, rekombinantes (Sigma-Aldrich, Deisenhofen; Amersham
Pharmacia Biotech, Buckinghamshire)
Lectin von Phytolacca Americana Zellen (Sigma-Aldrich, Deisenhofen)
Anti-rabbit-Biotin (Sigma-Aldrich, Deisenhofen)
Anti-horse-FITC (Sigma-Aldrich, Deisenhofen)
3.2.3
Vorgefertigte Systeme (Test-Kits) und Transfektionsreagentien
Plasmid Mini/ Midi/ Maxi Kit (Qiagen, Hilden)
BCA-Protein-Detektionsreagenz (Pierce)
DMRIE® Reagent (GibcoBRL)
Lipofectin® Reagent
LipofectAMINE™ Reagent
Plus®
34
3.2.4
Chemikalien, Lösungen, Medikamente, Medien und Puffer
AEC-Substrat
1 Tablette AEC in 5ml Dimethylformamid
AEC
1,5 ml
Natriumacetat (0,05mM)
28,5 ml
H2O2
0,15 ml (10 % in PBS)
Ampicillin
100 mg/ml
Amphotericin B
250 mg/ml
Chrom (51Cr)
(Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire)
Dimethylsulfoxid (DMSO)
DMEM
(Seromed®)
DNA-Ladepuffer, 10 x
Bromphenolblau
0,25 %
Glycerol
50 %
in TAE
Essigsäure
50 % in Methanol
Ethanol
absolut
70 % (v/v)
Ethidiumbromid
10 mg/ml
Fetales Kälberserum (FKS)
(Biochrom, Berlin)
Ficoll-Paque® Plus
Lidocain, 2%
(Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire)
(Jenapharm)
Kulturmedium für Verozellen
FKS
5 %(v/v)
Penicillin/Streptomycin
1 %(v/v)
in DMEM oder MEM
Kulturmedium für PBMC und Fibroblasten
FKS
Penicillin/Streptomycin
10 %(v/v)
1 %(v/v)
in IMDM
Kulturmedium für Hautbioptate
FKS
10 %(v/v)
Penicillin/Streptomycin
1 %(v/v)
Amphotericin B
1 %(v/v)
35
in IMDM
LB-Medium
Casein, hydrolysiert
1 % (w/v)
NaCl
1 % (w/v)
Hefeextrakt
0,5 % (w/v)
MEM-Earle
(Seromed®)
Methanol
absolut
Methanol in Essigsäure (50%)
IMEM
Opti-MEM®
PBS
PBS-Tween
(GibcoBRL®)
NaCl
136,9 mM
Na2HPO4
8,1 mM
KCL
2,7 mM
KH2PO4
1,5 mM
pH
7,2
Tween 20
0,05 % (v/v)
in PBS
Penicillin/Streptomycin
TAE, 50x
Penicillin
10.000 IU/ml
Streptomycin
10.000 UG/ml
Tris-Base
2M
Eisessig
5,7 % (v/v)
EDTA
100 mM
pH
8,5
Triton X-100
10 % (v/v)
Trypsin in Versen-Puffer
NaCl
136,9 mM
EDTA
0,5 mM
KCL
2,7 mM
Na2HPO4
8,1 mM
KH2PO4
1,5 mM
Trypsin
0,3 % (w/v)
Wasserstoffperoxid (H2O2)
10 % (v/v) in PBS
7,5 % (v/v) in Methanol
CEVA®
Xylazin, 2 %
36
3.3
Methoden
Die Durchführung der Untersuchungen und Experimente erfolgte im Institut für
Hygiene-
und
Infektionskrankheiten
der
Tiere
(Dir.
Prof.
Dr.
Baljer),
Veterinärmedizinische Fakultät, Justus-Liebig-Universität Gießen und im Institut
für Virologie (Dir. Prof. Dr. H. Müller), Veterinärmedizinische Fakultät der
Universität Leipzig.
3.3.1
Zellkultur
primäre Zelllinien
Fibroblasten
Um die zelluläre Immunantwort nachweisen zu können, bringt man in einem CTLTest Effektorzellen (T-Lymphozyten) und Zielzellen zusammen. Als Zielzellen
werden beim Pferd üblicherweise Lymphozyten oder Nierenzellen verwendet. In
dieser Arbeit wurden Fibroblasten der Haut als Zielzellen eingesetzt.
Im distalen Drittel des Halses wurde eine handtellergroße Fläche der Haut rasiert,
mit Alkohol und anschließend mit einer Jodverbindung desinfiziert. Die Anästhesie
erfolgte über die subkutane Injektion von 2 ml einer 2 %igen Lidocain-Lösung.
Steril wurde mit dem Skalpell ein 0,8 x 0,8 cm großes Hautstück mit
Bindegewebsanteil entnommen und in eine sterile Gewebekulturplatte gelegt. Die
Wunde wurde mit nicht resorbierbarem Nahtmaterial vernäht. Die Fäden konnten
nach 10 d gezogen werden.
Das aus der Hautbiopsie, unter Nutzung eines Skalpells, gewonnene Material
wurde schnellstmöglich steril in ca. 2 x 2 mm große Teile geschnitten und an die
innere Unterseite einer Gewebekulturflasche (25 cm2) geklebt. Nach Umdrehen
der Flasche wurden 5 ml IMEM unter Zusatz von 10 % hitzeinaktiviertem FKS,
1% Penicillin/Streptomycin und 0,4 % Amphotericin B hinzugegeben. Nach
Auswanderung der Zellen ab dem sechsten Tag konnten sie nach Ausbildung
eines 50 %igen Zellrasens umgesetzt werden. Hierzu wurde das Kulturmedium
entnommen, die Flasche mit 0,5 ml einer Trypsin-Versen Lösung gespült, erneut
die gleiche Menge an Trypsin-Versen hinzugefügt und bei 37 °C inkubiert. Die
abgelösten Zellen wurden bei 1000 rpm 5 min zentrifugiert, der Überstand
verworfen und die Zellen in 5-15 ml frischen Kulturmedium aufgenommen und
37
ausgesät. Einmal wöchentlich konnten die Zellen in einem Verhältnis von 1:6
verdünnt und umgesetzt werden.
Lymphozyten
Die zelluläre Immunantwort basiert auf der Bildung spezifischer, zytotoxischer TLymphozyten und T-Helferzellen. Zur Isolierung der Lymphozyten wurden
mehrmalige Blutentnahmen vorgenommen.
Die Blutentnahme erfolgte mittels Kanülen an der Vena jugularis. Jeweils 10 ml
Blut wurden in Heparinröhrchen aufgefangen. Diese wurden bei 1000 rpm 5 min
zentrifugiert, um das Plasma abnehmen zu können, welches in Reaktionsgefäßen
bei -20 °C eingefroren wurde. Die Blutzellen wurden mit 15 ml warmen PBS in 50
ml Reaktionsgefäßen gewaschen. 15 ml raumtemperiertes Ficoll Paque wurde
vorsichtig untergeschichtet und anschließend 30 min bei 1000 rpm zentrifugiert.
Die Bremse der Zentrifuge wurde bei diesem Lauf deaktiviert. Nach vorsichtiger
Entnahme der in der Interphase angereicherten Lymphozyten, wurden diese
erneut mit PBS, jetzt 50 ml, versetzt und bei 1500 rpm, 5 min zentrifugiert. Die
anschließende Behandlung des Pellets zum Zwecke des Einfrierens der Zellen
erfolgte vollständig auf Eis.
Zur Anzüchtung wurden die Zellen nach dem Auftauen in IMEM mit 10 % FKS und
1 % Penicillin/Streptomycin resuspendiert und 2,5 µg/ml Lectin von Phytolacca
americana (pokeweed mitogen) hinzugefügt. Nach 24-stündiger Inkubation bei 37
°C wurden die Zellen bei 1000 rpm 5 min zentrifugiert. 80 % des Mediums wurde
entfernt und durch frisches IMEM ersetzt. Die weitere Kultivierung der
Lymphozyten erfolgte unter Zugabe von 200 Einheiten humanes IL-2 pro ml
Medium.
permanente Zelllinien
Nierenzellen der afrikanischen grünen Meerkatze, ATCC-Nr.: CCL-81 werden im
SNT neben RK-13 Zellen als Standardzellen verwendet. In der vorliegenden Arbeit
wurden Vero 81 Zellen eingesetzt.
Die als Monolayer gewachsenen Zellen wurden mit auf 37 °C erwärmten VersenTrypsin zweimal gewaschen und anschließend mit dieser Lösung bei 37 °C
inkubiert, bis die Zellen sich ablösen ließen. Die Zellen wurden in einem Verhältnis
von 1:5 verdünnt und umgesetzt, wobei als Medium hier MEM bzw. DMEM mit 5%
38
FKS und 1 % Penicillin/ Streptomycin verwendet wurde. Bei drohender Gefahr
einer Infektion mit Mykoplasmen wurde Amphotericin B 1:100 hinzugefügt. Das
Medium wurde einmal in der Woche gewechselt, und die Zellen wurden bei einem
90 %igem Bewuchs der Flaschen umgesetzt bzw. trypsiniert, zentrifugiert (1500
rpm, 5 min), in kaltem FKS mit 10 % DMSO aufgenommen und in Einfrierröhrchen
a 1 ml aliquotiert. Diese wurden zunächst für 1 h bei 4 °C abgekühlt und dann in
einer Styroporbox für 24 h bei -80 °C eingefroren. Die endgültige Lagerung
erfolgte in flüssigem Stickstoff (-196 °C).
Das Auftauen der Zellen erfolgte schnellstmöglich im Wasserbad bei 37 °C. Nach
Zugabe von warmem PBS (10:1), wurden die Zellen bei 1500 rpm 5 min
zentrifugiert, der Überstand verworfen und die Zellen in warmem Kulturmedium
resuspendiert und ausgesät.
3.3.2
Herstellung einer inaktivierten Vakzine
Herstellung und Aufreinigung von Saatvirus
Nach
dem
Dekantieren
des
Nährmediums,
wurden
Verozellen
in
Gewebekulturflaschen (75 cm2) mit einem Monolayer von 85 % zweimal mit 5 ml
warmem (37 °C) PBS gewaschen. Erneut wurden 2 ml PBS hinzugegeben. Die
bei -80 °C eingefrorenen Viren wurden schnell im Wasserbad bei 37 °C aufgetaut.
Je 1 ml des Virus wurde der Zellkulturflasche hinzugegeben und diese für 1 min
geschwenkt. Nach der Inkubation im Brutschrank bei 37 °C für 1 h, wurde der
Überstand dekantiert und die Zellkultur erneut mit 5 ml PBS gewaschen. Der
Zellkultur wurden 15 ml DMEM mit 5 % FKS hinzugegeben. Während der
Inkubation im Brutschrank bei 37 °C, wurde in den nächsten 2-3 d der CPE täglich
begutachtet. Bei einem CPE von 80 %, wurde die Zellkultur zur Zerstörung der
Zellen bei -80 °C eingefroren und anschließend für 10 min im mit Eis gefüllten
Ultraschallbad behandelt. Nach der Zentrifugation in Spitzröhrchen bei 4 °C, 4000
rpm und 10 min zur Zellabtrennung, wurde die Virussuspension abgenommen. Zur
Anreicherung des Virus konnte die Suspension in Zentrifugenbecher für den Rotor
19 gefüllt und zentrifugiert werden. Nach Ultrazentrifugation bei 19000 rpm wurde
der Überstand vorsichtig dekantiert und das Pellet in 2-5 ml PBS aufgenommen.
39
Herstellung der inaktivierten Vakzine mit dem Stamm EAV-GI 2592
Die in der Zellkultur gewonnen Viren des Stammes Gießen 2592 wurden in einer
Zentrifuge des Typs Sorvall® RC5B bei 4000 rpm und 4°C für 30 min im Rotor
GS3 zentrifugiert. Nach vorsichtigem Dekantieren wurde der Überstand in einer
Zentrifuge des Typs Beckmann® L855 bei 19000 rpm und 4°C 2 h
ultrazentrifugiert. Das sich nun gebildete Pellet wurde in einer 1:8 verdünnten
PBS-Lösung resuspendiert. Die Zentrifugenröhrchen wurden für 12 h bei
Raumtemperatur mit einem Parafilm bedeckt stehengelassen und anschließend
wurde der Inhalt in Flaschen gefüllt. Nach der Behandlung des resuspendierten
Pellets im Ultraschallbad, wurde die Suspension mit Hilfe von 1,2 ml FKS in 250
ml MEM von einer Verdünnung von 10-1 auf 10-9 titriert. Das Virus wurde mit
1,5%igem Formaldehyd für 18 h bei 37 °C im Wasserbad inaktiviert. Daraufhin
wurde die Lösung zweimal gegen 5 l PBS für 6 h dialysiert. Anschließend wurden
drei Proben zur Kontrolle der Inaktivität des Virus und für eine aerobe und eine
anaerobe Kultur gewonnen. Nach dem negativen Verlauf der Anzüchtung des
Virus bzw. auf aerobe und anaerobe Kulturen konnte die Lösung 1:1 mit
Aluminiumhydroxid versetzt werden. Jeweils 5 ml der inaktivierten Vakzine wurden
in entsprechende Gefäße verbracht.
3.3.3
Nachweis der Immunantwort
Zum Nachweis der humoralen Immunantwort der Pferde gegen das EAV wurde in
der vorliegenden Arbeit der SNT angewendet.
SNT
Die gewonnenen Seren der Pferde der ersten, zweiten und dritten Immunisierung
wurden in einem SNT ausgewertet. Nach Inaktivierung der Seren bei 56 °C für 30
min, wurden diese in einer log2 Verdünnung mit MEM (5 % FKS) im Doppelansatz
in einer Mikrotiterplatte mit 96 Reaktionsvertiefungen aufgetragen. Ausgehend von
der ID50 wurde das Virus (Bucyrusstamm oder EAV-Gi 2592) mit Zusatz von 2 %
Meerschweinchenserum in der Gebrauchsverdünnung von 10-4 auf die Seren
gegeben. Nach Inkubation des Ansatzes für 1 h bei 37°C, 90 % Luftfeuchtigkeit
und 5 % CO2-Spannung, wurden Vero 81-Zellen hinzugefügt. 4-5 d später konnten
die Ergebnisse des Testes abgelesen werden.
40
Zum Nachweis der zellulären Immunantwort der Pferde gegen das EAV wurde in
der vorliegenden Arbeit ein CTL-Test aufgebaut.
CTL-Test
Transfektion
Um eine Expression von spezifischen Proteinen an der Zelloberfläche zu
erreichen, werden rekombinante Plasmide mittels eines Transfektionsreagenz in
die Zelle eingeführt.
Um DNA für die Transfektion in genügenden Mengen gewinnen zu können, stehen
ampicillinresistente E. coli K12 Bakterien zu Verfügung, die die drei EAV-Plasmide
in ihrer DNA tragen. Nach Vermehrung der Bakterien muss die DNA isoliert
werden.
Die Bakterien wurden mit einer Öse auf einer Agarplatte (Ampicillin-Konzentration
100 µg/ml) ausgestrichen und wuchsen bei 37 °C über Nacht im Brutschrank.
Einzelne Kolonien wurden von der Agarplatte genommen, in 25 ml LB-Medium mit
0,1 % Ampicillin gegeben und für 24 h inkubiert (37 °C, 190 rpm).
Die Bakterien wurden im Rotor JA 25-50 bei 6000 rpm bei 4 °C für 10 min
zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde in 4 ml Puffer P1
(Qiagen, Plasmid Purifikation Kit) resuspendiert. Nach dem zügigen, aber
vorsichtigen Mischen mit 4 ml Puffer P2 (Qiagen, Plasmid Purifikation Kit) und 5
min Inkubationszeit bei RT, wurden 4 ml von Puffer P3 zugefügt, gemischt und 15
min auf Eis inkubiert. Danach wurde die Lösung bei 12000 rpm 15 min
zentrifugiert, und der Überstand wurde auf die Qiagen-Tips-100, welche während
der Zentrifugation mit 4 ml von Puffer QBT equilibriert wurden, gegeben. Der
Qiagen-Tip wurde anschließend zweimal mit 10 ml Puffer QC gewaschen. Durch
den Puffer QF (5 ml) wurde die DNA gelöst und mit 3,5 ml 100 % Isopropanol (RT)
prezipitiert. Die DNA wurde 30 min bei 15000 rpm zentrifugiert und der Überstand
verworfen. Nach dem Herauslösen der Salze mit 70 %igem Ethanol (5 ml), wurde
die DNA erneut bei 15000 rpm für 5 min zentrifugiert, der Überstand verworfen
und das Pellet in 100 µl Aqua bidest aufgenommen. Die Lagerung der extrahierten
DNA erfolgte bei -20 °C.
Restriktionsendonukleasen
schneiden
DNA
sequenzabhängig.
Dies
wird
angewandt, um die Plasmide von EAV von der bakteriellen DNA zu trennen. Alle
Arbeitsschritte erfolgten auf Eis. Zu 5 µl DNA wurde der Prämix, aus 2 µl
41
Blaupuffer, 0,75 µl BamHI, 0,75 µl XbaI und 11,5 µl Aqua bidest bestehend,
hinzugefügt und 2 h bei 37 °C inkubiert. Der Verdau wurde mit dem Farbstoff
Xylenxyanol und zwei Markern auf ein 1,7 % Ethidiumbromid-Agarosegel
aufgetragen und elektrophoretisch getrennt, bis das Xylenxyanol die Hälfte des
Gels erreicht hatte. Unter UV-Licht konnte anhand der Marker abgelesen werden,
welche Größe die so gewonnenen Plasmide hatten.
Die Zellen sollen mit Hilfe der Transfektion als antigenpräsentierende Zielzellen für
den CTL-Test vorbereitet werden.
Gewebekulturflaschen mit einem zu 85 % konfluenten Zellrasen wurden trypsiniert
und zentrifugiert. Die Fibroblasten wurden in Konzentrationen von 1,5x104-3x105
Zellen pro Vertiefung in Mikrotiterplatten (24 Reaktionsvertiefungen) ausgesät und
für 24 h inkubiert. Der Transfektionsmix, bestehend aus Transfektionsreagenz,
DNA und Opti-MEM®, ein Medium ohne FKS und AB, wurde am nächsten Tag
hergestellt und für 15 min bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. In dieser Zeit
wurden die Zellen vorsichtig zweimal mit 1,5 ml warmen PBS gewaschen.
Anschließend wurde der Transfektionsmix vorsichtig auf die Zellen gegeben,
welche nun wiederum für 5 h bei 37 °C inkubiert wurden. Daraufhin erhielten die
Zellen 1,2 ml DMEM mit 10 % FKS und 1 % P/S. 24 h später wurde die Analyse
der Zellen durch Immunfluoreszenz durchgeführt.
Infektion von Zellen
Eine andere Möglichkeit die Exprimierung von Virus spezifischen Proteinen an
Zelloberflächen zu erreichen, ist die Infektion von Zellen mit diesem Virus.
Als Virus wurde bei diesen Experimenten der EAV-Stamm Bucyrus eingesetzt. Als
Zellart wurden die autologen Fibroblasten der Pferde im Hinblick auf die Nutzung
als Zielzellen beim CTL-Test verwendet. Während der Titrationsversuche wurden
Viruskonzentrationen von 1:1000, 1:100, 1:50, 1:10, 1:20 und 1:5 und sechs
verschiedene Fibroblastenkonzentrationen von 1x103 bis 5x105 Zellen/Vertiefung
einer Mikrotiterplatte mit 96 Kavitäten eingesetzt.
Die zur Infektion verwendeten Zellen wurden nach dem Auftauen 1-2 d vermehrt,
bis ein zu 90 % konfluenter Zellrasen entstand. Nach Trypsinierung und Zählung
wurden die Zellen in Mikrotiterplatten eingesät und zur Adhäsion für 1-2 h im
Brutschrank bei 37°C inkubiert. Nach Abnahme des Kulturmediums und
vorsichtiger Spülung mit warmem PBS wurde die Virussuspension mit dem FKS42
freien Kulturmedium in einer Menge auf die Zellen gegeben, dass diese gerade
bedeckt wurden. Nach einer Inkubationszeit von 1 h im Brutschrank wurden die
Zellen erneut mit PBS gespült und dann mit FKS-haltigem Kulturmedium
nochmals inkubiert. Die Entnahme von Überstand aus den 96-Lochplatten und
Fixation der Fibroblasten erfolgte nach 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20, 24, 36 und 40 h. Der
Überstand wurde auf Verozellen gegeben, um die Konzentration des frei
werdenden Virus nach seiner Vermehrung in den Zellen messen zu können.
Jeweils 4x25 µl Überstand wurden bis zu einer Verdünnung von 1:106 austitriert.
Dazu wurden 50 µl Verozellen, entsprechen ca. 5x103 Zellen, in eine Vertiefung
der Mikrotiterplatte gegeben. Nach 4-5 d wurde die ID50 abgelesen.
Die fixierten Zellen wurden unter dem Mikroskop auf das Vorhandensein von cpe
und mit Hilfe des IFT oder IPMA auf virusspezifische Proteine untersucht.
Nach der Transfektion oder Infektion wurde das Medium verworfen. Die Zellen
wurden mit warmem PBS gewaschen. Danach wurde eine eiskalte Lösung aus
Ethanol, Methanol oder 50 % Essigsäure und 50 % Methanol, auf die Zellen
gegeben, mit der die Platten dann 1 h bei 4 °C und mindestens 24 h bei -80 °C
inkubiert wurden. Im Anschluss an die Fixierung konnte ein IPMA oder ein IFT
durchgeführt werden.
Immunperoxidase-Monolayer-Assay (IPMA)
In diesem Test werden Antigene auf infizierten Zellen über eine Farbreaktion
nachgewiesen.
Fibroblasten wurden in Konzentrationen von 5x103 bis 5x105Zellen/ml in
Mikrotiterplatten ausgesät. Nach einer Anheftungszeit von 2-3 h wurden die Zellen
in Konzentrationen von 1:1000 bis 1:5 mit EAV, Stamm Bucyrus, infiziert. Anstelle
der Infektion kann auch eine Transfektion erfolgen. Die Fixation der Fibroblasten
mit reinem Ethanol erfolgte bis zur 12. Stunde alle 2 h, bis zur 24. Stunde alle 4 h
und bis zur 72. Stunde alle 12 h. Die Fixation wurde auch mit reinem Methanol,
bzw.
50/50
Methanol
und
Essigsäure
durchgeführt.
Nach
Zugabe
der
Fixationslösung wurden die Mikrotiterplatten 1 h bei 4°C und 24 h bei -80°C
inkubiert.
Um die endogenen Peroxidasen zu stoppen, wurden die Mikrotiterplatten nach der
Fixation mit PBS gespült und 5 min mit 7,5% H2O2 in Methanol bei RT inkubiert.
Danach erfolgte erneut eine Spülung mit PBS.
43
Als Antikörper gegen EAV wurde Serum von experimentell infizierten Kaninchen in
Konzentration von 1: 200-1:3200 in PBS/Tween hinzugefügt. Nach 1 h Inkubation
bei 37°C wurden die Mikrotiterplatten mit PBS/Tween zweimal und anschließend
mit Aqua bidest einmal gewaschen. Anti-rabbit-Biotin wurde in einer Verdünnung
von 1:750 in PBS/Tween auf die infizierten Zellen gegeben. Nach erneuter
Inkubation von 1 h bei 37°C wurde, wie oben beschrieben, gewaschen.
Streptavidin-Peroxidase-Konjugat wurde in einer Verdünnung von 1:500 in
PBS/Tween verwendet und die Mikrotiterplatten wurden wie oben inkubiert und
daraufhin gewaschen. Nach Zugabe von AEC-Substrat wurde die Reaktion unter
Lichtmikroskopie verfolgt und bei Rotfärbung der Zellen durch zweimaliges Spülen
mit PBS und einmaligem Spülen mit Aqua bidest gestoppt.
Immunfluoreszenztest (IFT)
Mit Hilfe des IFT lassen sich bestimmte Antigene durch einen fluoreszierenden
Farbstoff darstellen.
Die Behandlung der Zellen erfolgte bis einschließlich der Fixierung mit Ethanol wie
beim IPMA. Danach wurden die Mikrotiterplatten ausgeschlagen und für 5 min mit
PBS bei RT inkubiert, um so das Ethanol vollständig zu entfernen. Anschließend
wurde ein polyklonales Pferdeserum, gewonnen vom Pferd Frieda mit einem EAVTiter von 256, in einer Verdünnung von 1:100 in PBS/-Tween auf die fixierten
Zellen gegeben, welche dann für 60 min bei 37°C im Brutschrank inkubiert
werden. Daraufhin erfolgt erneut eine Waschung, zweimal mit PBS/Tween und
einmal mit Aqua bidest. Zu den Zellen wird nun der Fluoreszenzfarbstoff Antihorse-FITC 1:100 hinzugefügt und es erfolgt erneut ein Inkubation für 30-45 min
bei 37°C im Brutschrank. Das Ergebnis wird unter dem Fluoreszenzmikroskop im
Anschluss ausgewertet.
EAV-Ag-Herstellung
Die zytotoxischen T-Lymphozyten müssen für den CTL-Test nach der in vivo
Stimulation
auch
in
vitro
stimuliert
werden.
Hierzu
kann
man
antigenpräsentierende Zellen, Proteine oder auch inaktiviertes Virus verwenden.
Das Virus (Bucyrus-Stamm) wurde wie oben beschrieben vermehrt und
aufgereinigt. Die Virussuspension wurde in einem flachen Flüssigkeitsfilm in einer
Gewebekulturschale aufgetragen und 15 min unter UV-Licht, welches im Abstand
44
von 3 cm zu der Schale angebracht wurde, inaktiviert. Die vollständige
Inaktivierung
wurde
über
eine
Mikrotitration
mit
sechs
verschiedenen
Verdünnungen auf Vero- Zellen überprüft.
Die Proteinkonzentration wurde mit Hilfe des BSA-Kits gemessen.
Als Vergleichssubstanz wird zuerst BSA mit einer eingestellten Konzentration von
2 mg/ml verwendet. In eine Mikrotiterplatte (96 Kavitäten) wurden 10 µl BSA bzw.
die zu messenden Proben im Doppelansatz gegeben und im log2 bis zu einer
Verdünnung von 1:64 mit PBS verdünnt. Anschließend wurden pro Kavität 196 µl
Reagenz A und 4 µl Reagenz B des BSA-Kits hinzugefügt. Nach einer
Inkubationszeit von 30 min wurden die Gemische bei einer Wellenlänge von 562
nm photometrisch gemessen. Anhand der erhaltenen Werte für die optische
Dichte und der vorgegebenen Konzentration des BSA ließen sich die
Konzentrationen für die Proben bestimmen.
Messung zytotoxischer T-Zell-Aktivität
Nachweis EAV-spezifischer zytotoxischer T-Lymphozyten
Als Zielzellen wurden autologe Fibroblasten der Pferde eingesetzt. Auf die
Entnahme von Nierenepithelzellen wurde verzichtet, da eine Biopsie der Niere bei
Pferden mit starken Blutungen einhergehen kann. Ebenfalls wurden keine
Lymphozyten als Zielzellen eingesetzt, da zwei Pferde einen positiven AntikörperTiter gegen EAV aufwiesen und man nicht ausschließen konnte, dass diese Zellen
mit EAV infiziert sind.
In der Vorbereitung für den CTL-Test wurden die Effektorzellen aufgetaut, mit
PWM und IL-2 angezüchtet und für fünf Tage mit inaktiviertem Virus, 30 µg/ml,
stimuliert. Nach dreimaligem Waschen der Zellen wurden diese erneut für fünf
Tage unter Zusatz von IL-2 inkubiert. Parallel dazu wurden die Fibroblasten
aufgetaut und angezüchtet.
Am Tag des CTL-Tests wurden die Zielzellen in einer Konzentration von
7x104Zellen/ml infiziert, gewaschen und nach einer Inkubationszeit von 120 min
mit 400 µl Chrom51/107 Zellen markiert und erneut gewaschen. Im Anschluss
daran wurden die Zielzellen in einer Konzentration von 5x104 Zellen/ml in
Mikrotiterplatten mit geradem Boden ausgesät. Nach einer Stunde Anheftungszeit
wurden
die
Effektorzellen,
autologe
Lymphozyten
der
Pferde,
in
den
Konzentrationen 3:1, 25:1 und 50:1 zu den Fibroblasten hinzugegeben. Nach
45
einer Inkubationszeit von 8 h im Brutschrank bei 37 °C wurden die Platten 3 min
bei 1000 rpm zentrifugiert und die Überstände abgenommen. Diese Überstände
wurden in PS-Röhrchen pipettiert und ihr Chrom51-Gehalt wurde gemessen.
3.3.4
Statistik
Zur Berechnung der Signifikanz der SNT wurden der Mann-Whitney-U-Test und
der Exakt-Test nach Fisher angewandt. Der Mann-Whitney-U-Test ist ein nicht
parametrischer, d. h. ein verteilungsunabhängiger Test, der dem T-Test entspricht.
Es wird getestet, ob zwei unabhängige Stichproben aus der gleichen
Grundgesamtheit stammen. Der Exakt-Test nach Fisher, der ein Test auf
Unabhängigkeit in einer 2x2-Kreuztabelle darstellt, wird dann angewendet, wenn
der Umfang der gesamten Stichprobe und die erwarteten Werte klein sind. Es soll
hiermit dargestellt werden, ob die Pferde serologisch EAV-positiv oder -negativ
reagiert haben. Mit dem Programm SPSS 11 wurden diese Tests berechnet
(Sachs, 1992).
46
4
Ergebnisse
4.1
Ergebnisse der Untersuchungen der Pferde des Brandenburgischen Haupt- und Landgestütes
4.1.1
Ergebnisse der Untersuchungen der Aborte und Abortursachen
Im Zeitraum vom 07.01. bis 18.02.1995 fohlten fünf Stuten gesunde Fohlen in den
Abfohlboxen (Stuten Nr.14, 16, 17, 28, 30).
In der Zeit vom 28.02. bis 06.04.1995 ereigneten sich sieben Aborte und die
Geburten zweier nicht lebensfähiger Fohlen auf dem Gestüt. Acht der neun
erkrankten Stuten befanden sich zusammen im Laufstall, da der errechnete
Geburtstermin in der folgenden Zeit noch nicht bevorstand. Von 19 Stuten, die in
diesem Zeitraum schon in den Abfohlboxen aufgestallt waren, gebaren 18 Stuten
gesunde Fohlen. Die Ereignisse werden chronologisch in Tab. 10 dargestellt.
Tabelle 10: Chronologische Darstellung der Geburten und Aborte vom 07.01. bis
28.05.1995 auf dem Brandenburgischen Hauptgestüt Neustadt/Dosse (Quelle:
Zuchtbuch und Krankenblätter der Stuten des Hauptgestütes)
Datum
Ereignis
07.01.-18.02. fünf normale Geburten
Haltung
Nr. der Stuten
Abfohlboxen
14, 16, 17, 28, 30
28.02.
erster Abort
Laufstall
7
04.03.
zweiter Abort
Laufstall
10
06.03.
dritter Abort
Laufstall
32
07.03.
lebensschwaches Fohlen
Abfohlbox
5
Abfohlboxen
3, 6, 15, 23, 24
11.03.-18.03. fünf normale Geburten
11.03.
vierter Abort
Laufstall
34
12.03.
lebensschwaches Fohlen
Laufstall
36
20.03.
fünfter Abort
Laufstall
39
22.03.
sechster Abort
Laufstall
38
25.03.
eine normale Geburt
Abfohlbox
13
06.04.
siebter Abort
Laufstall
1
05.05.-28.05. acht normale Geburten
Abfohlboxen
47
9, 18, 19, 21, 25, 27, 29
Ab
Februar
1995
erfolgten
auch
die
ersten
Spermalieferungen
von
Fremdhengsten und deren Einsatz bei gestütseigenen Stuten (Tab. 11, 12).
Tabelle 11: Spermalieferung von Fremdhengsten 1995
(Quelle: Besamungsstation des Gestütes)
Art des Spermas
Hengst
Datum der Lieferung
EAV-Status 1995
Frischsperma
A
08.02., 10.04.,13.05.
nicht bekannt
Frischsperma
B
15.02., 12.03., 02.04.
nicht bekannt
Frischsperma
C
21.02.
nicht bekannt
Gefriersperma
D
21.02., 09.05.
nicht bekannt
Kursiv gedruckt: Spermalieferungen im Infektionszeitraum
Der EAV-Status der vier Hengste zum Zeitpunkt der Spermalieferungen konnte
nicht in Erfahrung gebracht werden. Der Hengst D wurde ein Jahr später als
Pachthengst auf diesem Gestüt genutzt. Bei der serologischen Untersuchung im
SNT fiel er EAV-AK positiv (Titer 1:64) aus.
Tabelle 12: Einsatz von Fremdsperma bei den Zuchtstuten 1995
(Quelle: Zuchtbuch und Krankenblätter der Stuten des Hauptgestütes)
Nr. d.
Anzahl
letztes
Stute
Besa-
Deck-
Hengst
EAV-Status Fohlen v.
EAV-Status
Stute (SNT) 1995
Fohlen v. 1995
mungen datum
(SNT)
12
1
21.02.95
C
positiv
n. t. von C
14
3
02.04.95
B
positiv
07.02.95
positiv
von B
17
2
09.05.95
D
positiv
22.01.95
positiv
v. GH
35
3
13.05.95
A
positiv
n. t. von A
GH = Gestütshengst; n. t. = nicht tragend
Die Stuten Nr. 7, 10, und 34 fohlten tote Fohlen drei bis sechs Wochen zu früh. Es
wurden keine Untersuchungen des Fetus oder der Nachgeburt durchgeführt.
48
Das Fohlen der Stute Nr. 32 wurde vier bis fünf Wochen zu früh geboren und starb
kurz nach der Geburt. In der pathologischen Abteilung des Staatlichen Veterinärund Lebensmitteluntersuchungsamtes Potsdam (SVLUA) wurden zahlreiche
petechiale bis ekchymöse Blutungen in der Trachea, der Lunge und im Herz
nachgewiesen. Histologisch und im IFT konnte das Equine Herpesvirus 1 (EHV1)
nicht nachgewiesen werden. Ebenfalls verlief die Anzüchtung bakterieller Erreger
negativ. In der Virologie der SVLUA konnte zwar ein Virusisolat angezüchtet
werden, dessen Bestimmung aber nicht möglich war. Im Institut für Hygiene- und
Infektionskrankheiten der Justus-Liebig-Universität Gießen wurde sowohl in der
Zellkultur als auch mit Hilfe der RT-PCR EAV nachgewiesen.
Die Stute Nr. 5 fiel nach Aussage des betreuenden Facharbeiters durch Fieber
und Apathie auf. Sie fohlte zum errechneten Geburtstermin. Das Fohlen war
lebensschwach und starb nach sechs Tagen. Es erfolgte keine Untersuchung.
Das Fohlen der Stute Nr. 36 wurde eine Woche vor dem errechneten
Geburtstermin lebensschwach geboren, hatte einen offenen Nabel und starb fünf
Tage später. In der Sektion konnten thrombotisch-embolische Dünndarminfarkte
festgestellt werden. Es erfolgte die Anzüchtung von E. coli und Sc. spp. EHV1 und
Influenzaviren konnten nicht nachgewiesen werden. Auf EAV wurde nicht
untersucht.
Die Stute Nr. 39 fohlte vier bis fünf Wochen zu früh. Das Fohlen wurde tot
geboren. Bei der pathologischen Untersuchung der Nachgeburt wurden keine
besonderen Befunde erhoben. Moraxella spp. konnten mit dem Hinweis auf
untergeordnete Bedeutung angezüchtet werden. Der Chlamydiennachweis im
ELISA war dreifach positiv. EHV1 konnte nicht nachgewiesen werden und auf eine
EAV-Infektion wurde nicht untersucht.
Auch das Fohlen der Stute Nr. 38 wurde vier Wochen zu früh geboren und starb
nach vier Tagen. Die Anzüchtung von Bakterien verlief negativ. Der Nachweis von
Chlamydien im ELISA war +/-. Auch der IFT im Hinblick auf EHV1 verlief negativ.
EAV konnte nicht angezüchtet werden.
Die Stute Nr. 1 fohlte drei bis vier Wochen zu früh. Das lebensschwache Fohlen
starb am selben Tag. Die Untersuchung der Nachgeburt ergab keine
pathologischen Befunde. In der SVLUA konnten Erwinia spp., Chlamydien und
vereinzelt Hefen nachgewiesen werden. Der IFT von EHV1 zeigte ebenfalls, wie
49
die zusätzliche Untersuchung auf EHV1 am Institut für Mikrobiologie der
Universität München, ein negatives Ergebnis. Im BFA, Standort Wusterhausen,
konnten zwar Chlamydien angezüchtet werden, der Chlamydien-Ag-ELISA verlief
jedoch negativ. In der SVLUA Potsdam konnte zuerst kein EAV angezüchtet
werden. Parallel dazu wurden Proben der Nachgeburt an das Institut für Hygieneund Infektionskrankheiten der Tiere, Justus-Liebig-Universität Gießen, geschickt.
Hier wurde sowohl in der Zellkultur als auch in der RT-PCR EAV nachgewiesen.
Das Virus erhielt die Kennzeichnung EAV-Gi 2592. Nach Umstellung der
Untersuchungsmethoden gelang es im Nachhinein auch der SVLUA Potsdam,
EAV anzuzüchten. Da im Laufe der Abortserie noch keine Ursache für die Aborte
gefunden werden konnte, wurden auch Futtermittelproben am 23.03.1995 zur
Untersuchung an die Abteilung Bakteriologie, Staatliches Veterinär- und
Lebensmitteluntersuchungsamt Potsdam, gesendet. Bei der Beurteilung (Tab. 13)
konnte aus veterinärhygienischer Sicht keine mikrobiologische Beanstandung
erfolgen.
Tabelle 13: Mikrobiologische Untersuchung von drei Futtermittelproben des
Hauptgestütes Neustadt/ Dosse am 23.03.1995 (Quelle: SVLUA Potsdam)
Futtermittel
Pferdepellets
Mineralfutter
Gesamtkeimzahl 41x103
9x102
<5x103
<5x101
Mikrokokken
<5x102
1x102
Aerobe
41x103
7x102
Gelbkeime
Getreide
Flavobakterien
Sporenbildner
in 1g nicht
<5x101
<5x101
nachweisbar
Anreicherung positiv
Anreicherung positiv
Klostridien
<102
<102
<102
Salmonellen
negativ
negativ
negativ
Enterobakterien
1x102 Streptokokken
andere Bakterien
Schimmelpilze
6x102
7x103 Cand. spp.
Asp. spp.
2x103Schwärzepilze
50
3x102 Asp. spp.
4.1.2
Ergebnisse der serologischen Untersuchung der Pferde
Aufgrund der ersten Aborte wurden am 14.03. und 15.05.1995 Seren von zehn
Pferden gewonnen. Darunter waren sechs Stuten (5, 7, 10, 32, 34) mit Aborten
bzw. lebensschwach geborenenen Fohlen, zwei Stuten (Nr. 2, 35), die 1994 nicht
tragend
waren
und
ein
zwei
Monate
altes
Fohlen.
Mit
Hilfe
des
Serumneutralisationstestes wurde auf AK gegen EAV im Doppelansatz am
15.05.1995 untersucht (Tab. 14). Die Negativ-Kontrolle hatte einen Titer von
kleiner als 2, die Positivkontrolle einen Titer von 256. Die Viruskontrolle erreichte
eine TCID von 102,5.
Bei drei von neun Pferden ergab sich ein deutlicher AK-Titer-Anstieg innerhalb von
zwei Monaten. Bei den anderen sechs Pferden war der AK-Titer jeweils um eine
Titerstufe erhöht oder gleichbleibend. Zusätzlich wurde am 15.05.1995 die Stute
Nr.1 untersucht, in deren Nachgeburt EAV nachgewiesen werden konnte.
Tabelle 14: EAV-AK-Titer im SNT von zehn Pferden des Brandenburgischen
Hauptgestütes Neustadt/Dosse während des Abortgeschehens 1995
(Quelle: SVLUA Potsdam)
Nr. des Pferdes
Geburtsjahr
AK-Titer 14.03.95
AK-Titer 15.05.95
2
1991
32
128
5
1984
64
128
7
1988
64
128
10
1989
128
256
32
1986
128
128
34
1990
16
128
35
1988
32
128
36
1990
128
256
a.d. 17
1995
32
64
1
1979
n.u.
128
n.u.= nicht untersucht
Im November 1995 wurden alle Pferde des Gestütes serologisch auf AK gegen
EAV untersucht (Tab. 15).
51
Tabelle 15: Überblick über die 1995 im SNT auf EAV untersuchten Pferde des
Haupt- und Landgestütes Neustadt/Dosse (Quelle: SVLUA Potsdam)
Pferde
Geburtsjahr
Zuchtstuten
1991 u. älter
Stuten
Anzahl
Anzahl sero-
serolog.
untersuchter
log. positiver
positive
Pferde
Pferde
Pferde in %
39
32
82,05
1992
5
5
100
Jungstuten
1993
9
0
0
Jungstuten
1994
10
0
0
Deckhengste
1993 u. älter
67
7
10,45
Junghengste
1994
17
0
Fohlen
1995
18
10
0
55,56
Von 39 Zuchtstuten hatten 32 Tiere einen positiven EAV-AK-Titer von 32 oder 64.
Alle Stuten, die bis zum 06.04.1995 fohlten wurden, sind serologisch EAV-positiv.
Alle Stuten, die 1994 nicht tragend wurden und 1995 bis zum 06.04. erstmalig
wieder besamt wurden, sind ebenfalls serologisch EAV-positiv. Fünf von sieben
Zuchtstuten (Nr. 9, 18, 19, 21, 29), die nach dem 06.04.1995 fohlten, blieben frei
von AK gegen EAV. Drei Zuchtstuten (Nr. 11, 22, 33) wurden nicht mehr in der
Zucht eingesetzt und standen 1995 getrennt von den anderen. Sie waren
serologisch EAV-negativ. Alle fünf im SNT untersuchten Jungstuten des
Jahrgangs 1992 hatten einen positiven EAV-AK-Titer (Tab. 15). Im Gegensatz
dazu reagierten alle 36 Pferde des Jahrgangs 1993 und 1994 im SNT serologisch
EAV-negativ. Von den 18 Fohlen, die 1995 geboren wurden, besaßen zehn Tiere
einen positiven AK-Titer, der auch in den Jahren 1997 und 1999 wieder
nachgewiesen werden konnte. Unter den serologisch negativen Tieren waren
sechs Fohlen, deren Mütter auch serologisch negativ waren. Ein Fohlen war
ebenfalls serologisch negativ, obwohl die Mutter (Nr. 25) positiv war und es wie
die anderen sechs nach dem 06.04.1995 geboren wurde. Ein zweites Fohlen der
EAV-positiven Stute Nr. 15 wurde am 18.03.95 geboren und im November 1995
konnten keine AK gegen EAV nachgewiesen werden.
52
Im November 1995 erfolgte die serologische Untersuchung aller in der Zucht
eingesetzten Hengste. Von den 67 zuchtaktiven Deckhengsten reagierten sieben
Hengste serologisch EAV-positiv (Tab. 16). Dies war seit mehreren Jahren von
sechs Hengsten bekannt. Hinzu kam ein neu erworbener Deckhengst.
Tabelle 16: Serologisch EAV-positive Deckhengste des Brandenburgischen
Haupt- und Landgestütes Neustadt/Dosse 1995 (Quelle: SVLUA Potsdam)
Name
Rasse
EAV-AK-Titer im SNT
RT-PCR d. Spermas
Achenpaß
Haflinger
64
negativ
Diamir
Edles Warmblut
64
negativ
Enorm
Kaltblut
256
negativ
Hydriot
Warmblut
8
negativ
Lesotho
Holsteiner
64
negativ
Orsini
Trakehner
64
negativ
Pacco III
Warmblut
64
negativ
Die Serumproben der Hengste, die auf dem Hauptgestüt in der Besamungsstation
untergebracht wurden, sind am 23.05.1995 im Institut für Hygiene- u.
Infektionskrankheiten der Tiere, Universität Gießen, untersucht worden. Sie hatten
keinen Kontakt zu anderen Pferden, da sie in der künstlichen Besamung genutzt
wurden. Alle Besamungshengste waren serologisch EAV-negativ und blieben es
auch.
Fünf der neun im Zeitraum des Abortgeschehens aufgestallten Pensionsstuten
konnten serologisch untersucht werden. Eine Stute zeigte einen positiven EAVAK-Titer von 64, die anderen reagierten serologisch negativ.
4.1.3
Ergebnisse der Untersuchung der Spermaproben der Deckhengste
Das Sperma der sieben serologisch EAV-positiven Hengste wurde mit Hilfe der
RT-PCR untersucht. Es konnte bei keinem dieser Hengste EAV im Sperma
nachgewiesen werden (Tab. 16). Die Spermaproben der Deckhengste, die in der
Besamungsstation des Hauptgestütes zur künstlichen Besamung standen, wurden
über die Anzüchtung in der Zellkultur auf EAV untersucht. Auch hier konnte bei
den Hengsten kein Virus nachgewiesen werden.
53
4.2
Ergebnisse der Untersuchung der Pferde der ersten
Impfstofftestung
Die zehn Jungstuten des Jahrgangs 1994 zeigten keine Reaktionen an den
Injektionsstellen. Die Untersuchung der Seren im SNT erfolgte parallel am
18.03.1997 im Doppelansatz (Tab. 17). Die Negativkontrolle war <2, die
Positivkontrolle hatte einen Titer von 128, und die Viruskontrolle des
Referenzstammes Bucyrus erreichte 103,0 TCID. Vier der Tiere zeigten schon drei
Wochen nach der ersten Immunisierung AK-Titer. Zwei Wochen nach der zweiten
Immunisierung waren alle Pferde, die mit Präparation B geimpft wurden,
serologisch positiv. Nur ein Pferd der mit Präparation A immunisierten Tiere hatte
einen positiven AK-Titer. Fünf Wochen nach der zweiten Immunisierung sanken
die AK-Titer ab und nach neun Wochen reagierten alle Pferde serologisch negativ.
Zwei Wochen nach der dritten Immunisierung reagierten alle Stuten serologisch
positiv.
Tabelle 17: EAV-AK der zehn zweijährigen Stuten des Brandenburgischen
Hauptgestütes Neustadt/Dosse im SNT während des ersten Impfversuches mit
der stallspezifischen Vakzine EAV-GI 2592 (Quelle: SVLUA Potsdam)
Nr. der
vor der 1.
3 Wo
2 Wo
5 Wo
9 Wo
2 Wo
Stuten
Impfung
nach 1.
nach 2.
nach 2.
nach 2.
nach 3.
Impfung
Impfung
Impfung
Impfung
Impfung
A1
0
0
2
0
0
16
A2
0
2
2
0
0
8
A3
0
0
2
2
0
8
A4
0
4
4
2
0
8
A5
0
0
0
2
0
4
B1
0
4
8
2
0
16
B2
0
0
4
4
0
8
B3
0
4
8
0
0
32
B4
0
0
4
0
0
16
B5
0
0
8
0
0
8
54
4.3
Ergebnisse der Untersuchung der Pferde der zweiten
Impfstofftestung
Bei der intramuskulären Injektion der kommerziellen Vakzine Artervac® wurden
keine Impfreaktionen beobachtet. In den Nachfolgeuntersuchungen 1999 konnten
zwei der 20 Artervac®-immunisierten Pferde wegen Verkaufes nicht im SNT
untersucht werden.
Pferde, die mit der stallspezifischen Vakzine subkutan geimpft wurden, zeigten an
den Injektionsstellen Unterhautreaktionen. Es entstanden im Durchmesser 5-8 cm
große Erhabenheiten, die geringgradig schmerzhaft waren und nach ca. einer
Woche verschwanden. Im Zuge der Bildung von Antikörpern wurde auch das
Serum dieser 20 Pferde toxisch für die im SNT verwendeten Verozellen. Diese
Toxizität war entsprechend der jeweiligen Antikörper-Titer bis jeweils zwei
Verdünnungsstufen niedriger als der Antikörper-Titer nachweisbar und gut von
diesem unterscheidbar. Ein Pferd musste aufgrund einer Verletzung im Zeitraum
des Versuches euthanasiert werden und wurde daher aus der Versuchsgruppe
genommen. Bei einem zweiten Pferd konnten nur am Anfang und Ende des
Versuches Blutproben entnommen werden.
Im SNT fiel der Titer des negativen Serum kleiner als zwei aus, der des positiven
Serums 256, der Bucyrusstamm erreichte eine TCID von 102,75, die Viruskontrolle
des Stamms EAV-Gi 2592 ebenfalls eine TCID von 102,75.
4.3.1
SNT mit EAV-Stamm Bucyrus
Artervac® immunisierte Tiere
Zum Zeitpunkt der ersten Impfung waren alle Tiere serologisch EAV-negativ
(Abb. 3). Vier Wochen nach der ersten Immunisierung zeigten zwei der 20
Artervac® immunisierten Tiere einen positiven AK-Titer. 90 % der Pferde blieben
serologisch negativ. 14 Tage nach der zweiten Immunisierung blieben nur zwei
Pferde serologisch negativ. Zwei Wochen später sanken die Titer bei 80 % der
Pferde auf 16 und kleiner, nur zwei Tiere behielten ihren Titer von 64, bzw. 10 %
blieben serologisch negativ. Knapp zwei Monate nach der zweiten Immunisierung
wurden 30 % der Tiere negativ getestet, bei 60 % der Tiere lagen die Titer
zwischen 4 und 8. Nach 16 Wochen stiegen die AK-Titer bei 80 % der Pferde auf
bis zu 512, ein Pferd blieb serologisch negativ und drei Pferde reagierten sehr
55
stark mit dem Titer von 1024. Ein Monat später fielen die AK-Titer bei 80 % der
Tiere auf 128 und kleiner. Zum Zpkt. der Revakzinierung, 13 Monate nach der
ersten Immunisierung, waren von 18 Tieren (zwei Tiere wurden verkauft) 50 % der
Tiere serologisch negativ. Zwei Wochen danach hatten alle Tiere Titer zwischen
64 und 1024.
600
500
AK- Titer
400
300
200
100
2. Impfung
4. Impfung
3. Impfung
1. Impfu ng
0
0
3
5
9
14
16
20
58
60
Zeitpu nkt der Blutentnahme in Wo
Artervac® immunisierte Pferde
EAV-Gi 2592 immunis ierte Pferde
A bbildung 3:
E rgebnisse des SNT mi t dem EAV-Stamm Bucyrus der 40 zweijährig en
®
P ferde in der zweiten Impfstofftestung (mit Artervac bzw. mit der Vakzine
aus dem Stamm EAV-Gi 2592), max. Höhe der AK-Titer bei 80 % der Tiere
EAV-Gi 2592 immunisierte Tiere
Zum Zeitpunkt der ersten Immunisierungen waren alle 19 Pferde serologisch
negativ (Abb. 3). Vier Wochen danach stiegen die AK-Titer bei 50 % der Pferde
auf 4, nur 10 % blieben serologisch negativ. Zwei Wochen nach der zweiten
Immunisierung hatten alle Pferde einen positiven AK-Titer. Ein Pferd fiel für die
nächsten fünf Untersuchungen aus. Zum Zeitpunkt der dritten Immunisierung war
kein Pferd serologisch negativ. 14 Tage später besaßen 50 % Pferde einen Titer
56
von 256. Nach 20 Wochen hatten, wie die andere Pferdegruppe auch, 80 % der
Tiere AK-Titer von 128 und kleiner. Am Tag der Revakzinierung wurden 15 % der
Pferde serologisch negativ getestet. Vierzehn Tage später besaßen 50 % der
Tiere einen Titer von 512, die anderen Pferde hatten einen Titer von 128 oder 256.
Vergleich der Artervac® und EAV-Gi 2592 immunisierten Pferde im SNT mit EAVStamm Bucyrus
Mit dem Mann-Whitney-U-Test (s. Anhang) wurden die AK-Titer beider Gruppen
hinsichtlich ihrer Höhe miteinander verglichen. Zum Zeitpunkt der zweiten Impfung
und neun Wochen nach der ersten Impfung konnte bei einer zweiseitigen
Fragestellung ein deutlicher Unterschied mit höchster Signifikanz (p≤ 0,001)
festgestellt werden. Am Tag der 3. Impfung wiesen die Ergebnis beider
Pferdegruppen einen Unterschied mit einer Signifikanz von p≤ 0,05 auf. Zu allen
anderen Zeitpunkten der Blutentnahme konnten keine Unterschiede zwischen den
beiden Gruppen hinsichtlich der AK-Bildung festgestellt werden.
Mit
Hilfe
des
Exakttestes
nach
Fisher
(s.
Anhang)
wurde
statistisch
veranschaulicht, ob die Pferde serologisch negativ oder positiv reagierten. Hier
konnten mit einer Signifikanz von p≤ 0,05 nach drei, fünf, neun, 14 und 58
Wochen Unterschiede festgestellt werden.
4.3.2
SNT mit Stamm EAV-Gi 2592
Artervac® immunisierte Pferde
Bis zum Zeitpunkt der dritten Impfung (Abb. 4) konnten keine neutralisierenden AK
in der Gruppe der mit Artervac® immunisierten Pferde festgestellt werden. Erst
zwei Wochen später besaßen 80 % der Tiere AK-Titer bis 64. Ein Pferd, das auch
schon im SNT mit EAV-Stamm Bucyrus serologisch negativ reagiert hatte, zeigte
hier das gleiche Ergebnis und blieb bis zur Revakzinierung serologisch negativ.
Sechs Wochen nach der dritten Impfung sanken die AK-Titer bei allen Pferden auf
32 oder kleiner. 13 Monate nach der ersten Immunisierung reagierten 60 % Tiere
serologisch negativ (Zwei Pferde wurden verkauft.). Sechs Pferde besaßen AKTiter von 4, 8 oder 16. Zwei Wochen nach der Revakzinierung stiegen die Titer bis
128 an.
57
200
180
160
AK- Titer
140
120
100
80
4. Impfung
60
3. Impfung
40
20
2. Impfung
1. Impfung
0
0
3
5
9
14
16
20
58
60
Zeitpunkt der Blutentnahme in Wo
Artervac® immunisierte P ferde
EA V-Gi 2592 immunisierte P ferde
A bbildung 4 :
E rgebnisse des SNT m it dem S tamm EAV-Gi 2592 der 40 zweijährigen
®
P ferde in der zweiten Impfstofftestung (mit Artervac bzw. mit der Vakzine
aus dem Sta mm EAV-Gi 2592), max. Höhe der AK-Titer bei 80 % d er Tiere
EAV-Gi 2592-immunisierte Tiere
Schon zum Zpkt. der zweiten Impfung ( Abb. 4) besaßen alle Tiere einen positiven
AK-Titer. 14 Tage danach stiegen die Titer bei 80 % der Tiere auf bis zu 64 an und
blieben auch 14 Tage später auf diesem Niveau. Am Tag der dritten
Immunisierung zeigten 80 % der Pferde AK-Titer zwischen 8 und 64. Zwei
Wochen später erreichten 80 % der Pferde einen Titer von 128. Sechs Wochen
nach der dritten Impfung blieben 70 % unverändert bei dem Titer 128. Am Tag der
Revakzinierung reagierte kein Pferd serologisch negativ. Die AK-Titer von 80 %
der Tiere stiegen 14 Tage nach der Revakzinierung auf 128. Aufgrund von
Widersetzlichkeiten eines Pferdes konnte sein Serum von der fünften bis zur 20.
Woche nicht untersucht werden (Die Immunisierung erfolgte dennoch planmäßig).
58
Vergleich der Artervac® und EAV-Gi 2592 immunisierten Pferde im SNT mit
Stamm EAV-Gi 2592
Im Mann-Whitney-U-Test (s. Anhang) ergaben sich ab der zweiten Impfung
deutliche Unterschiede hinsichtlich der Titerhöhen bei einer ein- und zweiseitigen
Fragestellung mit Signifikanzen von p≤ 0,001. Auch der Exakttest nach Fisher (s.
Anhang) bestätigte bei der Untersuchung, ob AK gegen EAV vorlagen, deutliche
Unterschiede zwischen den Artervac® und EAV-Gi 2592 immunisierten Pferden
drei, fünf, neun, 14 und 20 Wochen nach der ersten Impfung mit einer Signifikanz
von p≤ 0,001 bei einer einseitigen Fragestellung.
4.4
Ergebnisse der Untersuchung der Pferde der dritten
Impfstofftestung
In dieser Untersuchungsreihe wurden die kommerzielle EAV-Vakzine Artervac®,
angewendet an vier Pferden, und eine DNA-Vakzine, angewendet an fünf Pferden,
miteinander hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Induktion einer humoralen und
zellulären Immunantwort verglichen. Das hier angewendete Verfahren zum
Nachweis zellulärer Immunantworten wurde erst während der Untersuchungen
etabliert.
Die Applikation von Artervac® erfolgte intramuskulär, die der DNA-Vakzine mit
Hilfe der gene gun intradermal und ebenfalls intramuskulär.
Hautreaktionen der Pferde nach Anwendung der gene gun
Die Hautdicke der Tiere wurde vor der Immunisierung und nach 24 h bzw. 48 h
nach Anwendung der gene gun gemessen. Die Hautdicken der Tiere variierten
zwischen 0,2 cm bei dem Pferd Nelke und 0,4 cm bei dem Pony Jessy (Tab. 18).
Kurz nach der Vakzination wurden helle Ringe auf der Haut der Pferde sichtbar, in
diesem Bereich kam es innerhalb von 24-48 Stunden zu deutlichen Rötungen und
Bildung von Papeln bzw. Exkoriationen, wobei die Tiere sehr unterschiedliche
Reaktionen zeigten (s. Anhang).
Daggy und Frieda reagierten besonders auf die erste Vakzination sehr stark.
Neben deutlicher Hautverdickung und großem Durchmesser der Papeln wiesen
die betroffenen Hautstellen starke Rötung bis hin zur Ablösung des Epithels auf.
Zwar nahm die Hautverdickung und der Durchmesser im Vergleich zur ersten
59
Impfung bei den anderen Immunisierungen etwas ab, die Exkoriationen aber
traten jedes Mal wieder auf. Friedrich zeigte gleichbleibend wenig gerötete, im
Durchmesser sehr große aber wenig erhabene Papeln. Das Pony Jessy mit der
gegenüber den anderen Pferden verhältnismäßig dicken Haut reagierte zuerst auf
die
Rasur
mit
einer
Ödembildung.
Gleichzeitig
wiesen
viele
Stellen
Kriebelmückenstiche und starken Juckreiz auf. Die Applikationsstellen an sich
waren geringgradig verdickt, erhaben und leicht gerötet. Nelke, mit der dünnsten
Haut, reagierte nur geringgradig auf die Vakzination, d. h. nur kleine Papeln mit
geringer Hautverdickung ohne Rötung waren sichtbar, wenn überhaupt Stellen der
Applikation nachweisbar waren.
Tabelle 18: Hautdicken von fünf Pferden vor und nach der DNA-Vakzination
mittels der gene gun
Name
normale Hautdicke
Hautdicke nach
Durchmesser der
in cm
Vakzination in cm
Papeln in cm
Daggy
0,25-0,3
0,3-0,7
0,8-1,6
Frieda
0,3
0,3-0,6
0,5-1,3
0,3-0,35
0,4-0,6
0,9-1,8
Jessy
0,4
0,4-0,65
0,5-1,3
Nelke
0,2
0,2-0,45
0,5-1,2
Friedrich
Hautreaktionen der Pferde nach intramuskulärer Injektion
Sowohl die DNA-Vakzine als auch der Impfstoff Artervac® erzeugten bei den
Pferden keinerlei Reaktionen an den Einstichstellen.
4.4.1
Ergebnisse der Antikörperuntersuchung im SNT
DNA-immunisierte Tiere
Die Pferde wurden anhand ihrer AK vor der Immunisierung in zwei Gruppen, EAVpositive und EAV-negative Tiere, eingeteilt. Bis zur ersten Immunisierung blieben
Nelke, Jessy und Friedrich EAV-AK-frei (Abb. 5). Die Pferde Frieda und Daggi,
deren Infektionszeitpunkt unbekannt ist, wiesen Titer von 16 bzw. 8 und 64 auf
(Abb. 6).
60
2000
EAV-AK-Titer
1500
3. Impfung
4. Impfu ng
2. Impfung
1000
500
1. Im pfun g
0
-27 -14 -4
0
2
4
7
9
12 17 22 26 31 35 40 44 49 53
Zeit punkt der Blutentnahme in Wo
Nelk e
Jessy
Friedrich
Abbild ung 5:
Ergebnisse des SNT mit EAV-Stamm Bucyrus der serologis ch
EAV-negativen Pferde Nelke, Jessy und Friedrich
Alle fünf Pferde bildeten zwei Wochen nach der ersten Immunisierung
neutralisierende Antikörper mit teilweise relativ hohen Titern zwischen 256 und
2048. Durch weitere Immunisierungen nach zwei, vier und neun Wochen konnte
ein Anstieg der Titer bei Daggi und Jessy um eine Titerstufe erreicht werden, die
anderen Pferde zeigten konstante (Pferd Friedrich) oder sinkende Titer (Pferde
Nelke und Frieda). Nach der letzten Impfung wurde einmal monatlich Serum
gewonnen. Die Titer blieben bei vier Pferden relativ konstant und lagen
durchschnittlich bei 256 bzw. 128. Bei Pferd Nelke sank der Titer auf ein niedriges
Niveau von 16 bzw. 8 ab.
61
2000
EAV-AK-Titer
2. Impfung
1500
3. Impfung
1000
4. Impfung
500
1. Impfung
0
-27 -14 -4
0
2
4
7
9 12 17 22 26 31 35 40 44 49 53
Zeitpunkt der Blutentnahme in Wo
Abbildung 6:
Ergebnisse des SNT mit EAV-Stamm Bucyrus der serologisch
EAV-positi ven Pferde Frieda und Daggi
Frieda
Daggi
Artervac® immunisierte Tiere
Alle vier Tiere, die in diesem Experiment eingesetzt wurden, bildeten
neutralisierende Antikörper gegen EAV (Abb. 7). Bis zum Zeitpunkt der ersten
Immunisierung blieben alle vier Pferde serologisch EAV-negativ. Drei der vier
Pferde wiesen nach drei Wochen, Tag der 2. Immunisierung, einen Titer von vier
auf, nur Condor blieb negativ. Erneut drei Wochen später konnten Titer zwischen
8 und 32 ermittelt werden. Zwei Wochen danach sank bei zwei Pferden, Condor
und Sina, der Titer unter 4 ab. Grazie wies mit einem Titer von 64 einen deutlichen
Unterschied, auch zum Pferd Strolch, mit einem Titer von 16, auf. Zum Zeitpunkt
der dritten Impfung, 14 Wochen nach der ersten, sanken die Titer bei Grazie und
Strolch jeweils um eine Titerstufe ab. Drei Wochen nach der dritten Vakzination
kam es zu einem starken Anstieg der Titer bis zu 128. Ein bis zwei Monate später
fiel der Titer auf ein niedriges Niveau bei allen vier Pferden ab. Condor reagierte
62
während des gesamten Versuches mit nur niedrigen AK-Titern, die jungen Pferde
Grazie und Strolch bildeten deutlich höhere AK gegen den Impfstamm aus.
140
120
EAV-AK-Titer
100
80
60
3. Impfung
40
2. Impfung
20
1. Impfung
0
4-
0
3
6
8
14
17
21
24
Zeitpunkt der Blute ntnahme in Wo
Grazie
Condor
Sina
Strolch
Abbildung 7:
Ergebnisse des SNT mit EAV-Stamm Bucyrus bei Artervac®
immunisierten Pferden
4.4.2
Im
Ergebnisse der Vorversuche für den CTL-Test
CTL-Test
sollte
die
Reaktionen
der
T-Lymphozyten
auf
die
mit
unterschiedlichen ORFs transfizierten Fibroblasten gemessen werden. Daher
wurden
in
den
Vorversuchen
verschiedene
Transfektionsexperimente
durchgeführt, um die Transfektionsfähigkeit von equinen Fibroblasten zu
überprüfen und um eine optimale Transfektionsrate zu erzielen. Die Zellen wurden
zuerst mit der DNA des green fluorescent protein (GFP) transfiziert. Später
wurden diese Experimente mit den verschiedenen ORFs von EAV durchgeführt.
Als Transfektionsmedien standen Lipofectin®, DMRIE®, LipofectAMINE™ und
LipocfectAMINE plus™ zur Verfügung.
63
Lipofectin® als Transfektionsreagenz
Die Transfektionsexperimente wurden mit 5-20 µl Lipofectin® Reagent, 5-80 µg
DNA und der dementsprechenden Menge Opti-MEM® pro Vertiefungen der
Zellkulturplatte
(24
Kavitäten)
durchgeführt.
Eine
Erhöhung
der
Lipofectinkonzentration im Transfektionsmix und der DNA-Menge erbrachte eine
Steigerung der Transfektionsrate. Die höchste Effizienz in der Transfektion zeigten
Ansätze mit 12,5 µl Lipofektin und 80 µg DNA, diese konnten jedoch eine
Transfektionsrate von 10 % nicht überschreiten. Über 15 µl Lipofectin® Reagent
pro Kavität der Zellkulturplatte wirkten toxisch auf die Fibroblasten.
DMRIE® als Transfektionsreagenz
2-7,5 µl DMRIE® und 5-20 µg DNA wurden pro Kavität in Zellkulturplatten (24
Kavitäten) eingesetzt, um eine Transfektion der Fibroblasten durchführen zu
können. Weder eine Steigerung der DNA-Menge noch des Transfektionsreagenzes erbrachten eine Transfektionsrate von mehr als 5 %. Wurden mehr als 5 µl
DMRIE® pro Kavität eingesetzt, gingen die Zellen zugrunde.
LipofectAMINE™ als Transfektionsreagenz
2-8 µl LipofectAMINE™ Reagent und 5-20 µg DNA wurden während der
Experimente pro Kavität der Zellkulturplatte (24 Kavitäten) verwendet. 7,5 µl
LipofectAMINE™ Reagent und 10 µg DNA erwiesen sich sehr effizient mit einer
Transfektionsrate von 15-20 %. Mengen über 8 µl LipofectAMINE™-Reagent pro
Kavität wirkten zelltoxisch, Mengen über 10 µg DNA erbrachten keine bessere
Transfektionsrate. Die Experimente konnten auf die Anwendung in Zellkulturflaschen (25 cm2) entsprechend übertragen werden.
Die Anwendung von LipofectAMINE™ Reagent (2-8 µl) und Plus® (2,7-10,67 µl)
erbrachte keine Transfektionsrate von über 5 %.
Bei optimalen Bedingungen während der Transfektion der Fibroblasten konnte ein
Transfektionsrate von nur 20 % erreicht werden. Da die unspezifische Lyse der
Fibroblasten im CTL-Test bei 30 % liegt, wurde von den Transfektionsexperimenten abgesehen und Infektionsversuche durchgeführt, um mehr Antigen
präsentierende Zielzellen zu gewinnen.
64
Vor der Infektion der Fibroblasten wurde der Einfluss der Zellzahl, der
Chrommenge und der Einwirkzeit von Chrom auf die Fibroblasten untersucht.
Ebenso wurden Versuche mit und ohne FKS durchgeführt.
Die Experimente wurden in Flachbodenplatten durchgeführt, da bei Experimenten
mit Rundbodenplatten die spezifische Lyse im Bereich der Negativkontrolle lagen,
d. h. es wurden unabhängig von der Menge der Effektorzellen kaum Zielzellen
lysiert.
In
den
verschiedenen
Titrationsexperimenten
wurde
mit
nichtinfizierten
Fibroblasten gearbeitet. In der Negativkontrolle befanden sich Fibroblasten mit
Nährmedium, in dessen Überstand die Radioaktivität der zugeführten Cr51Konzentration gemessen wurde. In der Positivkontrolle wurden alle Fibroblasten
durch Triton X-100 10 % zerstört und anschließend im Überstand die
Radioaktivität gemessen.
8000
7000
Counts / 60 s
6000
5000
c
4000
c
Neg ativkon trolle
Posit ivkon trolle
3000
2000
1000
0
200
400
600
800
µCi Cr *51 / 1 0*7 Ze lle n
Abbildung 8:
Abhängigkeit der messbaren Radioaktivität bei equinen Fibroblasten
51
von der zugeführten Cr -Konzentration
Um die Abhängigkeit der Ergebnisse von der Cr51-Konzentration ermitteln zu
können, wurden in den Titrationsexperimenten Cr51-Konzentrationen von 200 µCi
bis 800 µCi pro 107 Zellen/ml eingesetzt. Es ergab sich eine lineare Abhängigkeit
65
in Bezug auf die im Überstand gemessene Radioaktivität (Abb. 8), d. h. wurde den
Fibroblasten mehr Cr51 zugeführt, so nahmen sie zwar mehr Chrom auf, gaben
aber gleichzeitig auch mehr ab. Das Verhältnis zwischen Positiv- und Negativkontrolle blieb gleich, nur die Werte befanden sich auf einem höheren Niveau. Es
wurden in den nachfolgenden Experimenten 400 µCi Cr51/107 Zellen/ml eingesetzt.
Die unspezifische Lyse, errechnet durch Negativkontrolle x 100/ Positivkontrolle
fiel bei der Verwendung von Fibroblasten, gegenüber permanenten Zelllinien,
relativ hoch aus und schwankte unabhängig von der zugeführten Cr51Konzentration zwischen 30 % und 50 % (Abb. 9). In weiteren Experimenten wurde
die unspezifische Lyse mit ca. 30 % bestätigt (Abb. 11).
100
90
80
% Lyse
70
60
50
40
30
20
10
0
200
4 00
60 0
800
µC i C r*51 / 1 0*7 Z el len
Abbild ung 9:
Unspezifische Lyse von e quinen Fibroblasten in Abhängigkeit von
der Cr51-Kon zentrat ion
Auch die Abhängigkeit der Ergebnisse von der Inkubationszeit der Fibroblasten
mit Cr51 wurde untersucht. Es wurden Inkubationszeiten von zwei, drei und vier
Stunden getestet. Wurde die Inkubationszeit von Cr51 erhöht, so stieg proportional
mit der Zeit der Einbau von Cr51 in die Zellen genauso wie die Abgabe aus den
Zellen. Es wurde dementsprechend zwar mehr Chrom aufgenommen, aber auch
mehr Chrom abgegeben (Abb. 10).
66
12000
10000
C ou nts / 60 s
8000
N egativc ko ntroll e
Po sit ivc ko ntroll e
6000
4000
2000
0
2
3
4
Inkub atio nszeit von Cr*51 in h
Abbildung 10:
Abhängigkeit de r messbaren Radioaktivität von der Cr5 1In kubationszeit bei equinen Fibroblasten
100
90
% unsp ezische Lyse
80
70
60
50
40
30
20
10
0
2
3
Inkubationszeit von Cr*51 in h
Abbildung 11:
Unspezifische Lyse von equinen Fibroblasten in Abhängigkeit
51
von der Cr -Inkubationszeit
67
4
Die unspezifische Lyse blieb unabhängig von der Inkubationszeit auf dem gleichen
Niveau bei ca. 30 % (Abb. 11), d. h. für den CTL-Test spielt die Inkubationszeit
von Cr51 eine untergeordnete Rolle. Für die Fibroblasten war die Inkubationszeit
jedoch sehr von Bedeutung, da sich die in einer Suspension befindlichen
adhärenten Zellen ab einer Inkubationszeit von zwei Stunden in den Röhrchen
anzuheften begannen. Um eine erneute Behandlung mit Trypsin/Versen zu
verhindern, wurde die Inkubationszeit der Fibroblasten mit Cr51 von zwei Stunden
gewählt.
Um den möglichen Einfluss von FKS auf die Reaktionen innerhalb des CTL-Tests
untersuchen zu können, wurden Experimente parallel mit und ohne FKS
durchgeführt. In den Ergebnissen zeichneten sich keine Unterschiede ab. Für alle
weiteren Experimente wurde auf die Zugabe von FKS verzichtet.
B
A
C
Abbildung 12:
Darstellung mit EAV-Stamm Bucyrus i nfizierter (A, B) und nichtinfizierter
(C) equiner Fibroblasten nach Durchführung eines IFT
68
Um den richtigen Zeitpunkt für die Inkubation von Ziel- und Effektorzellen
herauszufinden, wurden Infektionstests durchgeführt. Die Zielzellen wurden mit
dem EAV-Stamm Bucyrus infiziert und im Abstand von zwei Stunden wurde der
cpe, die Virusausscheidung und die Bildung von AK im Immunfluoreszenztest
untersucht (Abb. 12). Die Fibroblasten zeigten erst ab der 40. Stunde einen
zytopathischen Effekt (Tab. 19, Abb. 13). Die Virusausscheidung stieg jedoch
schon ab der 24. Stunde deutlich an. In der Viruskontrolle wurden 25 µl des
Bucyrusvirus (4x103,25TCID/ ml) zu 5x103 Verozellen gegeben. Parallel dazu
konnten im Immunfluoreszenztest ab der achten Stunde die ersten Proteine von
EAV nachgewiesen werden. Ab der 12. Stunde zeigten ca. 25 % aller Zellen
Virusproteine, die rund um den Zellkern gelagert wurden. Bis zur 36. Stunden
wurden alle Fibroblasten infiziert, und es erfolgte eine deutliche Proteinbildung.
A
B
Abbildung 13:
Darstellung mit EAV-St amm Bucyrus infizierter Fibroblasten nach 40 h
In kubationszeit, die Zellen werden kugelförmi g und sterben ab
(A) Nativaufnahme, (B) nach Durchführung ei nes IFT
69
Tabelle 19: Virusnachweis in infizierten Zellen, Virus 1:50
Inkubationszeit in h
messbarer Virustiter
Immunfluoreszenz in %
2
100,25
-
4.4.3
4
-
-
6
-
-
8
-
10
12
101,25
25
16
101,25
50-60
20
1,25
10
80
24
102,75
90
36
104,50
100
40
104,75
cpe
Ergebnisse der Untersuchung im CTL-Test
Berechnung der spezifischen Lyse (Y)
Im CTL-Test werden die in vivo und in vitro geprägten T-Lymphozyten auf
autologe Fibroblasten gegeben. Obwohl es sich jeweils um Zellen eines Pferdes,
also autologe Zellen, handelte, wurde auch der Einfluss der T-Lymphozyten auf
unbehandelte Fibroblasten gemessen. In den Experimenten zeigte sich, dass TLymphozyten autologe Fibroblasten zerstörten. Es konnte dementsprechend eine
Lyse der nichtinfizierten Zellen festgestellt werden. Daher wurden alle weiteren
Experimenten im Doppelansatz durchgeführt, d. h. der CTL-Test wurde mit
infizierten und nichtinfizierten Zielzellen durchgeführt.
Die Berechnung der Lyse der Zielzellen durch die Effektorzellen erfolgte zuerst
nach dem Protokoll von Hammond et al. (1998) (Abb. 14).
In der Positivkontrolle wurde den Fibroblasten Triton X-100 10 % hinzugefügt.
Dadurch
wurden
die
Zellen
vollständig
lysiert,
und
die
maximale
Chromkonzentration konnte ermittelt werden. In der Negativkontrolle befanden
sich ausschließlich Fibroblasten im Kulturmedium, in deren Überstand die
70
spontane Freisetzung von Cr51gemessen wurde, ohne dass die Zellen beeinflusst
wurden.
% Lyse
=
x
=
Positivkontrolle – Messwert
Positivkontrolle – Negativkontrolle
Abbildung 14: Berechnung der spezif ischen Lyse nach Ham mond et al. (1998)
Aufgrund der Lyse nichtinfizierter Zielzellen durch autologe Effektorzellen musste
die Gleichung zur Errechnung der spezifischen Lyse von Hammond et al. (1998)
verändert werden. Anhand des Pferdes Frieda werden die einzelnen Ergebnisse
und die Berechnung der spezifischen Lyse in den CTL-Tests dieser Arbeit
erläutert.
In der Abb. 15 werden die Ergebnisse der Lyse bei infizierten und nichtinfizierten
Fibroblasten durch die autologen T-Lymphozyten zu den verschiedenen
Zeitpunkten des Impfversuches dargestellt. Pro Zeitpunkt der Blutentnahme
wurden jeweils drei Werte pro infizierte bzw. nichtinfizierte Zielzellen angegeben,
welche dem Verhältnis zwischen T-Lymphozyten zu Fibroblasten entsprechen.
Wert eins entspricht T-Lymphozyten/Fibroblasten 3:1, Wert zwei 25:1 und Wert
drei 50:1.
71
70
60
% Lyse
50
3. Impfung 4. Impfung
2. Impfung
40
1. Impfung
30
20
10
0
-4
0
3
6
9
12
17
Zeitpunkt der Blutentnahme in Wo
22
26
Ni chtinfizie rte Zell en
Infizi erte Zellen
Abbildung 15:
Vergleich der durch autologe T-Lymphozyten lysierten nichtinfizierten und
infizierten Fibroblasten des Pferdes Frieda zu den verschiedenen
Zeitpunkten der Blutentnahme, wobei Effektorzellen zu Zielzellen im
Verhältnis 3:1, 25:1 und 50:1 eingesetzt wurden.
Um eine übersichtliche Darstellung dieser Vielzahl von Ergebnissen aus der
Abb. 15 zu bekommen, wurde eine neue Formel (Abb. 16) in der Abb. 17
angewandt.
Die
Werte
aus
den
unterschiedlichen
Effektor-zu-Zielzellen-
Verhältnissen wurden entsprechend ihrer Wertigkeit zusammengefasst und durch
drei dividiert.
X=
x1 (3:1) + x2 (25:1) + x3 (50:1)
3
Abb ildung 16:
Zusammenfassung der unterschiedlichen Effektor-Zielzellen-Verhältnisse
durchschnittliche Lyse, errechnet aus den Lysen der unt erschiedlichen
Effektor- zu -Zielzellen-Verhältnisse.
x 1-3: Einzelwerte, errechnet nach der Gleichung von Hammond et al. (1998)
X:
72
60
50
% Lyse
40
4. Impfung
3. Impfung
1. Impfung
30
2. Impfung
20
10
0
-4
0
3
6
9
12
17
22
26
Zeit punkt der Blute ntnahme i n Wo
Nichtinfizierte Zellen
Infizierte Zellen
Abbildung 17 :
Vergleich der Lyse bei nichtinfizierten und infizierten Fibroblasten des
Pferdes Frieda mit Zusamm enfassung des Effektor-ZielzellenVerhältnisses
Um aus diesen Ergebnissen die endgültige spezifische Lyse (Y) zu errechnen und
darstellen zu können, wurden die Werte der Lyse der nichtinfizierten Zielzellen von
denen der infizierten Zielzellen subtrahiert (Abb. 18).
Y= % Lyse infizierter Zielzellen – % Lyse nichtinfiziert er Zielzellen
Abbildung 18:
Berechnung der spezifischen Lyse unter Berücksichtigung der Forme ln
aus den Abb. 14 und 16
Diese Formel wurde zur Darstellung aller nachfolgenden Ergebnisse der
CTL-Tests angewendet.
73
Ergebnisse des CTL-Tests der DNA-vakzinierten Pferde
% spezifische Lyse
60
50
40
30
3. Impfung
1. Impfung
4. I mpfung
2. Impfung
20
10
0
-4
0
2
4
9
12
17
22
26
Zeitpunkt der B lutentnahme i n Wo
Abbildung 19:
Spezifische Lyse des serolo gisch EAV-positiven Pferdes Frieda nach de r
Formel aus Abb. 18; Impfstoff: DNA-Vakzine
Frieda, ein vor der Versuchsreihe EAV-AK-positives Pferd, (Abb. 19) zeigte schon
vor der ersten Immunisierung eine spezifische Lyse von ca. 10 %, die sich bis zur
3. Immunisierung kaum veränderte. In den Wochen danach wurde ein Anstieg der
spezifischen Lyse bis auf 21 % deutlich, der bis zur 26. Woche anhielt.
% spezische Lyse
60
50
40
2. Impfung
30
3. Impfung
4. Impfung
1. Impfung
20
10
0
-4
0
2
4
9
12
17
22
26
Zeitpunkt der Blutentnahme in Wo
Abbildung 20:
Spezifische Lyse des serologi sch EAV-positiven Pferdes Daggi nach der
Formel aus Abb. 18; Impfstoff : DNA-Vakzine
74
Das Pferd Daggi (Abb. 20), ebenfalls vor der ersten Immunisierung schon EAVAK-positiv, zeigte eine deutlich höhere spezifische Lyse schon vor Beginn des
Impfversuches gegenüber dem Pferd Frieda. Die spezifische Lyse erreichte im
Untersuchungszeitraum Werte zwischen 18 und 26 % mit zwei Spitzenwerten,
nach der zweiten Immunisierung mit 32 % und zwei Monate nach der dritten mit
54 %.
Das Pferd Nelke (Abb. 21), ein vor der Immunisierung EAV serologisch negatives
Pferd, zeigte im gesamten Zeitraum der Untersuchung kaum eine zelluläre
Immunantwort. Zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung stieg die
spezifische Lyse auf 14 %. Nur 12 Wochen nach der dritten Immunisierung konnte
erneut ein Wert von über 10 % (11 %) spezifischer Lyse erreicht werden.
Besonders auffällig sind die niedrigen Ergebnisse nach der vierten Immunisierung.
Hier erreichte Nelke deutlich weniger als 5 % spezifische Lyse.
% spezifische Lyse
30
25
20
3. Impfung
15
2. Impfung
1. Impfung
10
4. Impfung
5
0
-4
0
2
4
9
12
17
22
26
Zeitpunkt der Blutentnahme in Wo
Abbildung 21:
Spezifische Lyse des serologisch EAV-negativen Pferdes N elke nach
der Formel aus Abb. 18; Impfstoff: DNA-Vakzine
75
30
% spezifische Lyse
25
4. Impfung
20
1. Impfung
15
2. Impfung
10
3. Impfung
5
0
-4
0
2
4
9
12
17
22
26
Zeitpunkt der Blutentnahme in Wo
Abbildung 22:
Spezifische Lyse des serologisch EAV-negativen Pferdes Friedrich nach
der Formel aus Abb. 18; Impfsto ff: DNA-Vakzine
% Spezifische Lyse
30
25
20
15
2. Impfung
10
4. Impfung
1. Impfung
5
3. Impfung
0
-4
0
2
4
9
12
17
22
26
Zeitpunkt der Blutentnahme
Abbildung 23:
Spezifische Lyse des serol ogisch EAV-negativen Pferdes Jessy nach
der Formel aus Abb. 18; Impfstoff: DNA-Vakzin e
76
Die spezifische Lyse des Pferdes Friedrich (Abb. 22), ein ebenfalls vor der
Immunisierung serologisch EAV-negatives Pferd, war schon zum Zeitpunkt der
ersten Immunisierung bei ca. 18 % spezifischer Lyse und fiel danach zunächst ab.
Zu einem deutlichen Anstieg der spezifischen Lyse kam es nach der dritten
Immunisierung mit einem Wert von 24 %. Danach sank die spezifische Lyse
erneut ab und erreichte zwölf Wochen nach der dritten Immunisierung einen Wert
von unter 10 %.
Das Pony Jessy (Abb. 23), das dritte serologisch EAV-negative Tier in dieser
Pferdegruppe, wies vor bzw. zum Zeitpunkt der ersten Immunisierung spezifische
Lysen unter 5 % auf. Anstiege auf ca. 12 % wurden nach der ersten und dritten
Immunisierung deutlich. Zu allen anderen Untersuchungszeitpunkten bewegte sich
die spezifische Lyse unter 8 %.
Ergebnisse des CTL-Tests der Artervac® immunisierten Pferde
Die Artervac® immunisierten Tiere zeigten in den durchgeführten CTL-Tests keine
spezifischen Lysen, die den Wert von 10 % erreichten bzw. überschritten. Die
Ergebnisse des Pferdes Condor konnten nicht ausgewertet werden. Die
Messwerte der drei anderen Pferde lagen z. T. im Schwankungsbereich bei CTLTests.
% spezi fische Lyse
10
8
6
4
3. Impfung
2
1. Impfung
2. Impfung
0
3
0
-4
12
15
Zeitpunkt der Blutentnahme in Wo
Abbildung 24:
Spezifische Lyse des serologisch EAV -negativen Pferdes Strolch nach
®
der Formel aus Abb. 18; Impfstoff: Artervac
77
% spezifische Lyse
10
8
3. Impfung
6
1. Impfung
4
2
2. Impfung
0
-4
0
3
12
15
Zeitpunkt der B lutentnahme in Wo
Abbildung 25:
Spezifische Lyse des serologisch EAV-negativen Pferdes Sina nach der
Formel aus Abb. 18; Impfstoff: Artervac®
10
% spezifische Lyse
8
1. Impfung
6
4
3. Impfung
2
2. Impfung
0
-4
0
3
12
15
Zeitpunkt der B lutentnahme in Wo
Abbildung 26:
Spezifische Lyse des serologisch EAV-negativen Pferdes Grazie nach
der Formel aus Abb. 18; Impfstoff: Artervac®
78
5
Diskussion
In der Zeit von Februar bis April 1995 kam es auf dem Gestüt zu Aborten und
Geburten lebensschwacher Fohlen, welche kurze Zeit später starben. Nur eine der
Stuten zeigte Symptome einer systemischen Erkrankung. Da jedoch die Tiere
keiner genaueren Untersuchung durch einen Tierarzt unterzogen wurden, kann
nicht ausgeschlossen werden, dass Fieber, Konjunktivitis und andere Symptome
wirklich nicht auftraten oder diesen keine weitere Beachtung geschenkt wurde.
Ödeme an den Extremitäten oder am Kopf fielen nicht auf. Unterbauchödeme
konnten bei den Stuten verzeichnet werden, kommen aber auch bei normaler
Trächtigkeit vor. Dies entspricht nicht (ganz) den Beobachtungen anderer EAVAusbrüche der letzten Jahre. Es wurden meist milde klinische Symptome
beschrieben, wohingegen Aborte eher selten zu verzeichnen waren (Larsen et al.
2001, Ahlswede et al. 2001). Vermutlich liegt die Ursache darin, dass der Bestand
des Gestütes vor 1995 weitgehend keinen Kontakt zu EAV hatte bzw. nur wenige
Tiere schützende AK-Titer besaßen, zumal keine EAV-ausscheidenden Hengste
bis 1995 zur Zucht eingesetzt wurden.
Die
pathologische
Untersuchung
zweier
Fohlen
ergab
Ekchymosen
in
verschiedenen Organen bzw. thrombotisch-embolische Dünndarminfarkte. Ein
Hinweis auf eine EAV-Infektion, da intrauterin mit EAV infizierte Tiere
hauptsächlich wie in diesem Fall an Veränderungen des Darmes bishin zur
nekrotisierenden Kolitis oder an interstitieller Pneumonie erkranken (MacLachlan
et al. 2000, Del Piereo et al. 1997, Eichhorn et al. 1995, Golnik et al. 1981). Zwei
Aborte wurden im Institut für Hygiene- und Infektionskrankheiten der JustusLiebig-Universität Gießen auf EAV untersucht. Sowohl in der Zellkultur als auch
mit Hilfe der RT-PCR konnte EAV nachgewiesen werden. Alle anderen Aborte
bzw. gestorbenen Fohlen wurden entweder nicht oder nicht auf EAV untersucht.
EHV1 konnte als Abortursache bei den meisten Aborten ausgeschlossen werden
und
auch
die
anderen
nachgewiesenen
Erreger
scheiden
in
der
Gesamtbetrachtung als Aborterreger aufgrund des seuchenartigen Charakters
dieses Geschehens, des nur vereinzelten Nachweises und im Hinblick auf den
positiven EAV-Nachweis aus.
Die
AK-Untersuchungen
auf
EAV
ergaben
einen
weiteren
Anhaltspunkt
hinsichtlich der Ursache des Abortgeschehens. Stuten, die abortierten, bzw. Tiere
79
die in engem Kontakt mit diesen standen bzw. deren Fohlen besaßen einen
positiven AK-Titer. Der Großteil der Pferde, bei denen Serumpaare gewonnen
werden konnten, zeigte einen Titeranstieg. Tiere, ohne Kontakt zu den erkrankten
Stuten, blieben serologisch EAV-negativ. Es konnte so eine deutliche räumliche
und zeitliche Grenze auf dem Gestüt hinsichtlich der Virusinfektion gezogen
werden. Alle Stuten, die bis zum 06.04.1995 fohlten und deren Fohlen, mit
Ausnahme eines Fohlens, bzw. Stuten, die in diesem Zeitraum besamt wurden,
sind serologisch positiv. Von den anderen serologisch negativen Fohlen wurden
sieben von acht nach dem 06.04.1995 geboren. Das EAV-negative Fohlen ist
entweder nicht mit EAV infiziert worden oder hat zum Zeitpunkt der Infektion
schon maternale AK besessen, die dann aber bis zum November 1995, Zeitpunkt
der Blutentnahme aller Gestütspferde, abgebaut worden sind. Auch die Mütter
dieser sieben Fohlen blieben bis auf eine Stute EAV-negativ. Die räumliche
Grenze kann ebenfalls gut nachvollzogen werden. Die Infektion betraf nur den
Gebäudekomplex, in denen die zur Zucht verwendeten Stuten und deren Fohlen
untergebracht wurden. Hengste, Jährlinge und Zweijährige standen 1 km entfernt
von diesen Tieren und blieben serologisch negativ. Selbst die aus der Zucht
genommenen Stuten, die im gegenüberliegenden Stall in der Nähe der
Pensionsstuten aufgestallt waren, blieben negativ. Die in der serologischen
Untersuchung auf EAV positiv getesteten Deckhengste waren in der PCRUntersuchung ihres Spermas negativ. Da diese Hengste unter ständiger Kontrolle
standen und stehen, kommen sie als intermittierende Ausscheider und somit als
EAV-Überträger mit großer Wahrscheinlichkeit nicht in Frage. Zudem gelangten im
Zeitraum des Abortgeschehens nur serologisch negative Tiere des Gestütes zum
Deckeinsatz. Ungeklärt ist der Infektionsweg über das Frisch- und Gefriersperma
gestütsfremder Hengste, welches bei den Zuchtstuten des Gestütes eingesetzt
wurde. Der EAV-Status dieser Tiere konnte trotz eindringlicher Nachfrage nicht in
Erfahrung gebracht werden. Zudem wurde 1996 einer dieser Hengste vom Gestüt
gepachtet und fiel zumindest in der serologischen Untersuchung EAV-positiv aus.
Das Virus hält sich sehr gut im gekühlten, noch besser im gefrorenen Sperma, und
so ist zumindest theoretisch ein Infektion der Stuten über das gelieferte Sperma
denkbar (Schmitt 1990, Konishi et al. 1975). Ein Infektionsweg, der ebenfalls
möglich ist, ist die Übertragung durch direkten Kontakt von Stute zu Stute im
80
Rahmen der gynäkologischen Untersuchung bzw. der Besamung. Zwar wurden
die Pensionsstuten getrennt von den anderen Pferden aufgestallt, aber im
Untersuchungsraum war ein Kontakt zwischen Gestütsstuten, ambulanten Stuten
und Pensionsstuten möglich.
Die Frage des Infektionsweges bleibt unklar, dass eine Infektion mit EAV
stattgefunden hat, wurde sicher im Institut für Hygiene- und Infektionskrankheiten
der Justus-Liebig-Universität in Gießen und später auch durch veränderte
Nachweismethoden im Staatlichen Veterinär- und Lebensmittelüberwachungsamt
des Landes Brandenburg nachgewiesen. Es konnten EAV und deren AK mit zum
Teil ansteigenden AK-Titern nachgewiesen werden. Hinzu kommen Klinik und
pathologische Untersuchungsergebnisse, die eine weitere Bestätigung der EAVInfektion liefern. Anzumerken ist die unzureichende serologische Untersuchung
der Tiere, besonders die Nachfolgeuntersuchungen der serologisch EAV-positiven
Pferde. Es hätten von jedem Pferd Serumpaare gewonnen werden müssen.
Zudem hätten alle abortierten bzw. lebensschwachen Fohlen im Hinblick auf die
möglichen Ursachen in einem dafür etablierten Labor untersuchen werden sollen.
Die am weitesten verbreitete Abortursache, die Infektion mit equinen Herpesviren,
konnte in keinem untersuchten Material nachgewiesen werden. Zudem wurden
alle Stuten gegen Herpesvirusinfektionen vollständig geimpft.
Dieser Ausbruch von EAV scheint einer der wenigen in den vergangenen Jahren
gewesen zu sein, bei dem die Pferde eine so schwerwiegende Klinik zeigten
(Larsen et al. 2001, de Vries 1994). Das hat sicherlich einerseits seine Ursache im
Auftreten abgeschwächter Viren, andererseits aber auch in der Überwachung des
Pferdetransportes und des Spermas von Zuchthengsten (Metcalf 2001, Kaaden et
al. 1995, Glaser et al. 1996). Die Verhinderung einer solchen Infektion wird schwer
möglich sein. Eine bessere Kontrolle der Tiere sollte man jedoch anstreben,
besonders, wenn tragende Stuten im Bestand stehen.
Aufgrund
dieses
Abortgeschehens
und
der
Situation
1996,
dass
kein
zugelassener Impfstoff gegen EAV in Deutschland erhältlich war, wurde aus dem
isolierten Virus (EAV-Gi 2592) in Gießen eine erste stallspezifische Vakzine
hergestellt. Dieser Impfstoff musste eine Totvakzine sein, da auf einem Gestüt der
Einsatz einer Lebendvakzine hinsichtlich der Ausbreitung des Virus viel zu
gefährlich gewesen wäre. Besonders da der Großteil der Tiere keine
81
neutralisierenden Antikörper gegen EAV besaß. Die stallspezifische Vakzine fand
zuerst Einsatz bei zehn serologisch negativen Jungstuten des Jahrgangs 1994. Es
gelangten zwei Präparationen des Stammes EAV-Gi 2592 mit unterschiedlichem
Virusgehalt zum Einsatz. Das Impfschema wurde von dem des Impfstoffs
Artervac® übernommen. Die Ergebnisse der SNTs zeigen, dass der Virusgehalt
nicht ausreichend ist, um einen ausreichend hohen AK-Titer zum Schutz vor
klinischen Erscheinungen bei Infektion der Tiere hervorzurufen. Die Tendenz der
AK-Bildung ist aber schon ersichtlich. So wurden nach den ersten beiden
Immunisierungen keine bzw. nur wenige AK gebildet. Erst eine dritte
Immunisierung erzielte eine höhere Bildung von AK mit allerdings niedrigen
Titerstufen. Schon bei dieser Immunisierung zeigt sich, dass die Pferde
unterschiedlich reagieren, aber zumindest alle AK gebildet haben. Ebenso lassen
die
Ergebnisse
erkennen,
dass
mit
inaktivierten
Impfstoffen
öfter
Wiederholungsimpfungen durchzuführen sind, da die AK schnell abfallen und dass
der Virusgehalt der Vakzine selbst ausreichend hoch gewählt werden muss.
Ebenso sollte das Adjuvans der Vakzine beachtet werden. Aluminiumhydroxid
verstärkt
die
Gewebsentzündung
am
Injektionsort,
es
werden
mehr
Entzündungszellen angezogen und dadurch die Immunantwort erhöht.
Aufgrund der Erfahrungen aus der ersten Impfstofftestung wurde erneut die
stallspezifische Vakzine, diesmal mit einem höheren Virusgehalt, hergestellt, um
sie ein zweites Mal testen und mit einer kommerziellen Vakzine vergleichen zu
können. In der Vorbereitung der Anwendung der Impfstoffe wurden möglichst
gleiche Gruppen für den Versuch ausgewählt. Die Tiere glichen sich hinsichtlich
Rasse, Haltung und Alter. Den einzigen Unterschied stellte das Geschlecht dar,
welches bei diesen Untersuchungen jedoch außer Acht gelassen wurde, da
derzeit keine Unterschiede hinsichtlich der Bildung der AK bekannt sind (de Vries
1994). In den Serumneutralisationstests unter Verwendung des EAV-Stammes
Bucyrus konnten signifikante Unterschiede von p ≤ 0,001 zwischen den Artervac®
bzw. EAV-Gi 2592 immunisierten Pferden dargestellt werden. Die mit der
stallspezifischen Vakzine immunisierten Tiere bildeten nach der Immunisierung
demnach schneller AK als die der Artervac® immunisierten Tiere. 13 Monate nach
der ersten Immunisierung konnte im Exakttest nach Fisher ein Unterschied mit p ≤
0,05 dargestellt werden, wohingegen im U-Test keine Signifikanz nachgewiesen
82
werden konnte. Dies ergab sich aufgrund der Tatsache, dass die Pferde nach
Anwendung der stallspezifischen Vakzine zwar in der Gesamtheit keine deutlich
höheren AK-Titer besaßen, jedoch nur 15 % der Tiere serologisch negativ
reagierten
während
50
%
der
Artervac®
immunisierten
Pferde
keine
neutralisierenden AK besaßen. Aufgrund der starken Diskrepanz bezüglich der
Ergebnisse im SNT mit den unterschiedlichen EAV-Stämmen Artervac®
immunisierter Pferde, kann man mutmaßen, dass sich die heute zirkulierenden
EAV-Stämme bedeutend vom EAV-Stamm Bucyrus unterscheiden. EAV-Gi 2592
wurde 1995 in Deutschland isoliert. Der Bucyrus-Stamm wurde 1952 in Ohio
isoliert. Es werden zwar neutralisierende AK gegen den Bucyrus-Stamm in hohem
Maße gebildet, gegen den Stamm EAV-GI 2592 jedoch nur sehr wenige. Es liegen
keine phylogenetischen Analysen zum Stamm EAV-GI 2592 vor. Untersuchungen
anderer,
derzeit
weltweit
auftretender
Stämme
zeigen
jedoch
deutliche
Unterschiede zum Referenzstamm Bucyrus (Balasuriya et al. 1997, Glaser et al.
1995, Hedges et al. 1996, Sekiguchi 1995, St Laurent 1997). Auch hinsichtlich der
Applikation ergab sich ein Unterschied zwischen den angewendeten Vakzinen.
Während Artervac® den 20 Pferden intramuskulär injiziert wurde, erhielten die 20
Pferde der anderen Gruppe den stallspezifischen Impfstoff subkutan. Als
gewebeverträglicher erwies sich die intramuskulär verabreichte Artervac®Injektion. Bei der subkutanen Injektion der stallspezifischen Vakzine kam es
teilweise zu starken Unterhautreaktionen, die zwar einerseits über die lokale
Entzündung die Immunantwort verstärken können, andererseits aber z. B. zu
Lahmheiten führen können, wenn der Impfstoff im Bereich der Vorderbrust
appliziert und eine starke Entzündung der Muskulatur hervorgerufen wird. Beide
Impfstoffe
zeigen,
dass
mindestens
eine
halbjährliche
Wiederholungsimmunisierung sinnvoll ist, da die AK schon nach einem Monat auf
niedrigere Titerstufen abfallen und im Falle von Artervac© einige Tiere sogar
wieder serologisch negativ getestet werden konnten. Dies ist ein großer Nachteil
von Totvakzinen. Sie stimulieren gegenüber anderen Impfstoffarten deutlich
schwächer die AK-Bildung, zudem hält diese Stimulation auch nur sehr kurz an.
Hier zeigt sich der große Nachteil von Totvakzinen, sie rufen zwar die Bildung von
AK hervor, ausreichend hohe Titer werden allerdings kaum erreicht, bzw. werden
nur
durch
ständige
Reimmunisierungen
83
gesichert.
Vorteil
beider
hier
angewendeter Impfstoffe ist aber die hohe biologische Sicherheit. Eine Infektion
kann nicht hervorgerufen werden, wodurch der Einsatz auch in Zuchtbeständen
möglich ist.
Nach Abschluss dieser Impfstoffuntersuchungen konnte eine weitere Vakzine
getestet werden. Eine DNA-Vakzine wurde mit der kommerziellen Totvakzine
Artervac® hinsichtlich der humoralen und zellulären Immunitätsausbildung
verglichen. Der DNA-Impfstoff enthält die Nucleinsäuresequenzen der für die
Immunitätsausbildung gegen EAV wichtigen Strukturproteine E, GS, GL und N.
Zusätzlich wurde als Immunmodulator das Plasmid für das equine IL-2 eingefügt.
Da es derzeit kein Routineverfahren für den Nachweis von zytotoxischen TLymphozyten bei EAV gibt, wurde in dieser Dissertation ein CTL-Test entwickelt.
Bei der Wahl der Zellen für den CTL-Test mussten verschiedene Kompromisse
eingegangen werden. Für die Anwendung der DNA-Vakzine standen fünf Pferde
zur Verfügung, von denen zwei Tiere schon Kontakt zum EAV hatten. Bei diesen
beiden Pferden konnte also eine Prägung der Lymphozyten hinsichtlich EAV nicht
ausgeschlossen werden, weshalb der Einsatz von Lymphozyten als Zielzellen
nicht in Frage kommen konnte. Als zweite Wahl hätten, wie der Einsatz bei
anderen Tieren erfolgreich beschrieben wurde, Nierenzellen als Zielzellen
verwendet werden können (McGuire et al. 1995, Hammond et al. 1998, Hammond
et al. 1997). Die Gewinnung dieser Zellen stellt jedoch bei Pferden einen Eingriff
dar, der mit dem Risiko von starken Nierenblutungen verbunden ist. Daher wurde
auf die Verwendung von Nierenzellen verzichtet. Bei Katzen wurde ein
erfolgreicher Einsatz von Fibroblasten als Zielzellen berichtet (Hosie et al. 1998).
Zwar konnte dies bei Pferden noch nicht bestätigt werden (McGuire et al. 1994),
aber die Gewinnung und Anzüchtung dieser Zellen stellt ein einfaches Verfahren
dar. Deshalb wurden in diesem CTL-Test Fibroblasten, gewonnen aus der Haut
des Pferdes, als Zielzellen eingesetzt.
Die Infektion von Fibroblasten des Pferdes wurde bis jetzt in der Literatur noch
nicht erwähnt. Diese Untersuchungen zeigen, dass ihr Verhalten hinsichtlich der
Infektion denen der RK-13-Zellen (Golnik et al. 1986) entspricht. Golnik et. al
beschreibt Versuche mit RK-13-Zellen, in denen der CPE zwischen der 36. und
48. Stunde p. i. auftritt. Dies deckt sich mit den Ergebnissen der Fibroblasten, die
in der 40. Stunde den ersten CPE zeigen. Bei anderen Zellen, die mit EAV
84
infizierbar sind (Tab. 6), gibt es deutliche Unterschiede (De Vries 1994). Abhängig
von der Passagezahl, Inkubationszeit des Virus und verschiedenen Zusätzen des
Kulturmediums können die Zellen hinsichtlich der Infektionsfähigkeit stark
beeinflusst werden. Fibroblasten zeigen ihre beste Infektionsfähigkeit in frühen
Passagen, d. h. 4. -6. Passage. Ab der 12. Passage sinkt diese, im Gegensatz zu
permanenten Zelllinien, deutlich, und um die 20. Passage sind die Zellen kaum
noch infizierbar. Fibroblasten können in DMEM mit 5 % FKS angezüchtet werden,
ein deutlich besseres Wachstum ergibt sich jedoch durch die Verwendung von
IMEM mit 10 % FKS. Ebenso ist mit IMEM die Ausbeute aus den Hautbiopsien
deutlich besser. Als Effektorzellen für den CTL-Test gelangten Lymphozyten, die
über einen Ficoll-Gradienten gereinigt wurden, zum Einsatz. Hier stellt sich die
Frage, ob wirklich nur die gewünschten Lymphozyten isoliert werden konnten oder
eine Mischpopulation verschiedener mononukleärer Zellen gewonnen wurden.
Dies spielt im Hinblick auf die Zerstörung der Fibroblasten eine große Rolle, weil
ein Teil dieser Zellen zum unspezifischen Immunsystem gehört und keine Virus
spezifische Immunität vermitteln kann. Da in den Tests eine große unspezifische
Lyse stattfand, kann dies eine Ursache dafür sein. Um weitere Störfaktoren
auszuschließen,
wurde
versucht,
Ziel-
und
Effektorzellen
in
demselben
Nährmedium anzuzüchten, um so gleiche Bedingungen für sie zu schaffen. Die
Stimulation der Effektorzellen kann wie erwähnt mit Virus spezifischen Proteinen
oder mit Virus infizierten Zellen, die an ihrer Oberfläche Virus spezifische Proteine
exprimieren, durchgeführt. In der vorliegenden Arbeit wurde die in vitro Stimulation
der Lymphozyten durch abgetötetes, gereinigtes Virus vorgenommen, da die
Gewinnung von Proteinen nicht möglich war. Nachdem die Abtötung von EAV
durch Gamma-Strahlen einer Caesium-Quelle nur unzureichend durchgeführt
werden konnte, wurde das Virus unter UV-Licht inaktiviert. Nach der Anzüchtung
der Ziel- und Effektorzellen wurde ein Protokoll für den Ablauf des CTL-Tests
entwickelt. Die Zielzellen wurden in den Vorversuchen infiziert oder mit den ORFs
2,
5
und
7
transfiziert.
Transfektionsmedien
nur
Da
schlecht
sich
Fibroblasten
transfizieren
trotz
ließen,
verschiedener
wurden
infizierte
Fibroblasten für den Test gewählt. Zudem konnten die Ergebnisse der
Transfektion im Hinblick auf die relativ starke unspezifische Lyse wie sie auch in
anderen Experimenten (Hammond et al. 1997, Kumar et al. 2001) gemessen
85
wurde, nicht ausgewertet werden. Die Transfektion hätte eine wichtige Aussage
über die Funktion der verschiedenen ORFs treffen können, da man hier die
zelluläre Immunantwort einzeln, d. h. hinsichtlich jedes der drei ORFs messen
könnte. Die Infektion der Fibroblasten war so die einzige Alternative, um eine
spezifische Lyse der an ihren Oberflächen Virusproteine tragenden Fibroblasten
darstellen zu können. Dabei wurde die Inkubationszeit der Fibroblasten und
Lymphozyten so gewählt, dass die infizierten Fibroblasten Proteine produzierten,
ein CPE aber noch nicht nachgewiesen werden konnte. Um ein Anheften der
adhärenten Fibroblasten während des CTL-Test zu umgehen, wurde ohne FKS im
Nährmedium gearbeitet und die Zellen regelmäßig geschwenkt. Somit bestand
auch nicht die Möglichkeit, dass die Rezeptoren der T-Lymphozyten unspezifisch
mit Molekülen des FKS reagieren und dadurch besetzt werden.
Es ist sehr wichtig, dass die Menge an Cr51 pro Zellen nicht zu klein bemessen
wird, da sonst die Unterschiede zwischen Positiv- und Negativkontrolle zu gering
ausfallen und so die spezifische Lyse nicht deutlich erkennbar ist. Andererseits
fordert der Strahlenschutz aber eine möglichst niedrige Dosis. Da der Einsatz
unterschiedlicher Chrommengen in den Vorexperimenten keinen Einfluss auf die
spezifische Lyse zeigte, wurden daher 400 µCi Cr51/107 Zellen/ml eingesetzt.
Um den richtigen Zeitpunkt für das Zusammenbringen von Effektor- und Zielzellen
zu finden, wurden die Zielzellen infiziert. Alle vier Stunden wurde der CPE
untersucht und Proben für eine Virusanzüchtung entnommen. Anschließend
wurde von den jeweiligen Zeitpunkten ein Immunfluoreszenztest durchgeführt. So
konnte die Virusproduktion, Zerstörung der Fibroblasten und Freisetzung des
Virus genau verfolgt werden.
Die Immunisierung der Pferde mit der kommerziellen Vakzine Artervac stellt für die
Tiere
keine
besondere
Beeinträchtigung
dar.
Die
Anwendung
erfolgte
intramuskulär, und es konnten keine klinischen Symptome der Unverträglichkeit
festgestellt werden. Weder Schwellungen an der Injektionsstelle noch Fieber oder
andere Anzeichen konnten vermerkt werden. Im Gegensatz dazu ist die
Vakzinierung der Pferde mit dem DNA-Impfstoff mit Hilfe der gen gun ein Vorgang
mit größerem Aufwand und stärkerer Beeinträchtigung der Pferde. Die intrakutane
Injektion erfolgt erst nach längerer Vorbereitung. Die Haut musste geschoren,
gereinigt und gut desinfiziert werden. Da der Vorgang der Applikation mit Hilfe des
86
Helium-Gases ein sehr lauter Vorgang ist, mussten die Tiere gut sediert werden.
Trotz der Sedation reagierten drei der fünf Tiere sehr empfindlich auf die
Anwendung der gene gun. Es kam hinzu, dass teilweise mäßige bis starke
Hautveränderungen entstanden, die erst nach Tagen abheilten bzw. durch
Insektenstiche sogar noch verstärkt wurden. In Anbetracht der aufwendigen
Durchführung
ist
die
intrakutane
Applikation
des
Impfstoffes
noch
entwicklungsbedürftig, da die Pferde die Lautstärke nicht tolerieren und der
gesamte materielle Aufwand für eine Massenanwendung nicht praktikabel ist.
Hinzu kommt, dass noch nicht bewiesen wurde, ob der Impfstoff wirklich zu den
antigenpräsentierenden Zellen, u. a. dentritische Zellen, gelangt oder in tiefere
Gewebeschichten. In den Messungen der Hautdicke der Pferde zeigten sich
innerhalb der Versuchsgruppe große Unterschiede, die Tiere wurden jedoch mit
gleichen Gasdrücken beschossen. Es sollten demnach vor der neuerlichen
Anwendung der intrakutanen Vakzine histologische Schnitte der Haut und des
subkutanen Gewebes beschossener Pferde angefertigt werden, um den richtigen
Sitz der Plasmide demonstrieren zu können. Die intramuskuläre Injektion der
DNA-Vakzine ist hinsichtlich der Anwendung der des kommerziellen Impfstoffes
gleichzusetzen, birgt aber den großen Vorteil, dass die Muskelzellen als eine Art
Depot für das Antigen fungieren können. Da diese Zellen keine oder nur
geringfügig MHC-Klasse-I-Moleküle besitzen, werden sie kaum über das zelluläre
Immunsystem angegriffen, d. h., sie sind in der Lage, sehr lange Antigen zu
produzieren (Giese et al. 2002). Dies ist vielleicht eine Begründung für die
langanhaltend hohen AK-Titer der mit der DNA-Vakzine immunisierten Pferde im
Gegensatz zu denen, die mit Artervac® geimpft wurden. Diese Tiere entwickelten
erst sehr spät neutralisierende Antikörper, d. h. mehrere Impfungen waren nötig,
um eine Immunantwort hervorzurufen. Auch die Höhe der Titer unterschied sich
deutlich. Zudem fielen die Titer nach den Immunisierungen bei den Artervac®
geimpften Tieren sehr schnell ab, wohingegen die anderen Pferde eine über
mindestens 53 Wochen andauernde Immunität aufwiesen.
Die Ergebnisse des Nachweises der zellulären Immunität sollten vorsichtig
bewertet werden, da eine große unspezifische Lyse in den Experimenten zu
verzeichnen
war.
Diese
konnte
zwar
unter
Einhaltung
aller
etablierter
Bedingungen herabgesetzt werden, dennoch war die Zerstörung der autologen,
87
nicht infizierten Fibroblasten durch die T-Lymphozyten ein wichtiger Faktor in der
Ermittlung der spezifischen Lyse, der diese stark senkte. Wie in anderen
Experimenten wurde deutlich, dass ein größeres Effektor-zu-Zielzellen-Verhältnis
eine stärkere Zerstörung der Zielzellen verursachte. Fraglich ist, warum die
Zerstörung autologer Zellen in so großem Umfang stattfand. Möglich wäre eine
Veränderung der Zellen in Abhängigkeit von Medium und Passagezahl. Um dem
entgegen zu wirken, wurden die Zellen, sowohl Fibroblasten als auch TLymphozyten in einem gleichen Nährmedium kultiviert. Die Fibroblasten wurden in
niedrigen Passagezahlen eingesetzt. Die Zellen jeden Pferdes wurden getrennt
voneinander behandelt, um mögliche Kontaminationen mit Fremdzellen zu
vermeiden und die Experimente wurden ohne FKS durchgeführt, da dieses für das
Hervorrufen von unspezifischen Lysen bekannt ist.
Die Ergebnisse der CTL-Tests der Pferde, die mit der DNA-Vakzine immunisiert
wurden, liegen zwar auf einem sehr niedrigen Niveau, doch durch den Vergleich
zwischen nichtinfizierten und infizierten Fibroblasten ergibt sich ein deutlich
erkennbarer Unterschied. Aufgrund der Erfahrung aus anderen Experimenten
(Gerdts et al. 2001) muss man davon ausgehen, dass der DNA-Impfstoff zelluläre
Immunität hervorruft. Dieses Nachweissystem war jedoch zu schwach, um diese
Immunität deutlich darzustellen. Die vorliegende Arbeit beschreibt zum ersten Mal
die Entwicklung eines CTL-Tests, um EAV-spezifische zytotoxische CD8+-T-Zellen
zu messen. Da diese durch T-Zellen vermittelte Immunantwort für die Immunität
gegenüber EAV-Infektionen eine bedeutende Rolle spielt, ist die Entwicklung
dieser Testsysteme sehr wichtig, um zukünftige Immunisierungsstrategien und
Impfstoffe besser beurteilen zu können. Wie eingehend beschrieben, sollten
zukünftige
Arbeiten
darauf
gerichtet
sein,
das
vorliegende
Testsystem
weiterzuentwickeln, um deutlichere CD8+-T-Zell-vermittelte spezifische Lysen von
Zielzellen messen zu können.
Allein die AK-Bildung der Tiere, die mit der DNA-Vakzine immunisiert wurden,
zeigt jedoch schon, wie stark das Immunsystem auf den Impfstoff reagiert. Es
werden so hohe AK-Titer erzeugt, dass sie vor einer schweren Erkrankung des
Organismus im Falle einer Infektion schützen können. Zudem bleiben die Titer
auch über einen längeren Zeitraum auf einem gleichbleibend hohem Niveau, so
dass eine Revakzination nur in größeren Abständen erfolgen muss, als es bei den
88
anderen beiden Impfstoffen der Fall ist. Interessant wäre die Anwendung der
DNA-Vakzine als therapeutischer Impfstoff bei EAV dauerausscheidenden
Hengste, da hier bis jetzt nur die Kastration ultimo ratio war. Schon vor der
Erprobung des Artervac®-Impfstoffes war davon auszugehen, dass keine zelluläre
Immunantwort hervorgerufen werden kann. Die Ergebnisse des CTL-Tests zeigen
dies sehr deutlich. Es konnte keine spezifische Lyse nachgewiesen werden. Auch
die AK-Bildung erfolgte in nur geringem Maße und das auch erst nach
mehrmaligem Wiederholen der Immunisierung. Die DNA-Vakzine besitzt somit
durch die stark Immunitätsausbildung und die Sicherheit deutliche Vorteile
gegenüber den anderen zur Verfügung stehenden Impfstoffen gegen EAV und
sollte bei der Wahl des Impfstoffes in Zukunft an der Spitze stehen.
89
90
6
Zusammenfassung
Mohr, Cornelia
Untersuchungen zur Immunisierung gegen die Equine Virale Arteritis
Medizinische Tierklinik, Veterinärmedizinischen Fakultät, Universität Leipzig
Eingereicht im November 2004
93 Seiten mit 26 Abbildungen, 19 Tabellen, 172 Literaturangaben und 19 Seiten
Anhang
Schlüsselwörter: EAV, Impfstoff, CTL-Test, DNA-Vakzine, Abort, SNT
Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde ein EAV-Ausbruch auf einem Gestüt
und dessen Untersuchung dokumentiert. Innerhalb von sieben Wochen kam es zu
sieben Aborten und der Geburt von zwei lebensschwachen Fohlen, die kurze Zeit
später starben. Einige untersuchte Pferde zeigten im SNT einen milden bis
deutlichen Antikörpertiteranstieg. Zwei abortierte Feten wurden untersucht. Aus
beiden wurde EAV angezüchtet. Die Ausbreitung der Infektion auf dem Gestüt
konnte zeitlich und räumlich begrenzt nachvollzogen werden.
Aus dem Feldisolat wurde im zweiten Teil der Arbeit eigenständig eine
stallspezifische Vakzine hergestellt, welche in Bezug auf die AK-Bildung im
Vergleich mit der kommerziellen Vakzine Artervac® jeweils an 20 Pferden getestet
wurde. Die mit der stallspezifischen Vakzine immunisierten Tiere zeigten zu
verschiedenen Zeitpunkten signifikante Unterschiede in der AK-Bildung im SNT
mit den Stämmen Bucyrus und EAV-GI 2592 gegenüber der anderen Testgruppe.
Im letzten Teil der Dissertation wurde die Anwendung der kommerziellen Vakzine
(Artervac®) mit einer DNA-Vakzine gegen das Equine Arteritisvirus getestet und
hinsichtlich der zellulären und humoralen Immunantwort untersucht. Im Rahmen
der AK-Bildung wiesen die mit der DNA-Vakzine immunisierten Tiere deutlich
höhere Titer auf als die Artervac®-immunisierten Pferde. Zum Nachweis der
zellulären Immunantwort wurde eine CTL-Test entwickelt, der mit autologen
Fibroblasten als Zielzellen arbeitet. Nur die mit der DNA-Vakzine immunisierten
Pferde zeigten spezifische Lysen der Fibroblasten durch autologe T-Lymphozyten.
91
92
7
Summary
Mohr, Cornelia
Investigation of immunity from equine arteritis virus
Large Animal Clinic for Internal Medicine, Faculty of Veterinary Medicine,
University of Leipzig
Submitted in November 2004
93 pages; 26 figures; 19 tables, 172 references and 19 pages appendix
Keywords: EAV, vaccine, CTL-assay, DNA-vaccine, abortion, SNT
The first section of this dissertation documents an EAV-outbreak within a particular
stud. In the course of seven weeks, seven mares aborted. Two foals were born in
poor condition and died shortly after. The initial aborts gave reason to collect
serum samples from some horses of this stud. These samples were tested with
SNT for EAV-antibodies and showed a mild up to a substantial increase in titer.
Two of the aborted foetuses were examined and it was possible to culturing EAV.
From this field isolate a stable-specific vaccine could produce, which was then
tested on 20 horses, in conjunction with the commercial vaccine Artervac®, which
was also tested on 20 horses. Blood samples taken at different intervals led to the
conclusion that the vaccine made from the field isolate, compared to Artervac®,
was significantly different in provoking antibody-production in SNT using the strain
Bucyrus and strain EAV-GI 2592.
The last part of this dissertation concentrates on tests that were done using a
commercial vaccine (Artervac®) and a DNA-vaccine against the equine arteritis
virus. Both were examined for their capacity to provoke a cellular and humoral
immune response. Animals having been inoculated with the DNA-vaccine proved
to have higher antibody-titers than those animals having had the Artervac®vaccination. In order to illustrate the cellular immune response, a CTL-assay using
autologous fibroblasts as target cells was developed. Only horses having been
vaccinated with DNA-vaccine showed specific lysis of fibroblasts by autologous
T lymphocytes.
93
94
8
Ahlswede
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110
Anhang
Fohlen des Jahrgangs 1995 des Brandenburgischen Hauptgestütes
Nr.
Mutter
Geschlecht
Geburtsdatum
AK d.
Bemerkung
Mutter
AK 11/95
AK 11/97
AK 11/99
11/95
30
m
07.01.95
64
32
4
n. g.
17
m
22.01.95
64
64
4
n. g.
28
m
26.01.95
64
64
n. g.
n. g.
14
w
07.02.95
64
64
8
16
16
m
18.02.95
32
32
n. g.
n. g.
7
n. b.
28.02.95
Abort
64
10
n. b.
04.03.95
Abort
64
32
n. b.
06.03.95
Abort
64
5
w
07.03.95
n. l.
64
6
m
11.03.95
64
8
n. g.
34
m
11.03.95
Abort
64
36
w
12.03.95
n. l.
64
24
w
14.03.95
64
64
8
n. g.
3
w
14.03.95
64
64
8
n. g.
23
m
17.03.95
64
32
4
n. g.
15
w
18.03.95
32
0
0
0
39
n. b.
20.03.95
Abort
64
38
m
22.03.95
Abort
32
13
w
25.03.95
64
16
64
1
n. b.
06.04.95
21
w
05.05.95
0
0
0
0
18
w
09.05.95
0
0
0
0
19
w
13.05.95
0
0
0
0
27
m
16.05.95
0
0
0
n. g.
29
w
21.05.95
0
0
0
0
9
w
22.05.95
0
0
0
n. g.
25
w
28.05.95
64
0
0
n. g.
64
64
Abort
64
n. b. = nicht bekannt
n. g. = nicht gemessen
n. l. = nicht lebensfähiges Fohlen
A1
Zuchtstuten des Brandenburgischen Hauptgestütes
Nr. Geb. Deck- Foh- A Deck- EAV AK-Titer zu bestimmten Zeitpunkten
Jahr datum
len
datum
1994 1995 n.l. 1995 03/95 05/95 11/95 11/96 11/97 11/99 11/00 01/02
1
1979 30.5.
6.4.
A
2
1991
n.t.
12.4.
3
1990 15.4. 14.3.
20.4.
64
4
1978
n.t.
10.4.
64
5
1984 2.4.
7.3. n.l. 28.4.
6
1987 14.4. 11.3.
7
1988 5.5.
8
1991
n.t.
20.5.
64
9
1989 17.6. 22.5.
7.7.
0
10
1989 30.4.
15.4.
64
11
1985 n.g.
-
0
12
1989
n.t.
21.2.
64
13
1978 14.5. 25.3.
20.5.
64
14
1990 21.3.
7.2.
2.4.
64
15
1987 6.4.
18.3.
26.3.
32
16
1989 22.3. 18.2.
29.4.
32
17
1984 19.2. 22.1.
9.5.
64
18
1991 4.6.
19.5.
19
1989 28.6. 13.5.
20
1983
21
1983 6.6.
22
1983 n.g.
23
1988 7.4.
32
64
128
64
128
64
128
23.4.
28.2. A
4.3.
6.7.
A
-
128
16
64
64
64
pos.
32
32
32
0
0
pos.
64
16
64
128
pos.
8
32
pos.
4
8
32
pos.
16
32
32
64
pos.
32
0
0
0
?
0
0
0
14.4.
64
16
32
?
0
8
-
0
0
0
17.3.
18.4.
64
32
128
pos.
64
24
1988 11.4. 14.3.
29.3.
64
64
25
1989 2.7.
?
64
8
32
pos.
16
26
1984
n.t.
z
64
27
1991 28.5. 16.5.
16.6.
64
28
1982 12.2. 26.1.
30.3.
64
29
1990 4.6.
21.5.
?
0
30
1988 8.2.
7.1.
13.4.
64
31
1982
12.4.
64
09.5.
n.t.
n.t.
05.5.
28.5.
A2
32
32
64
8
32
32
64
64
Nr. Geb. Deck- Foh- A Deck- EAV AK-Titer zu bestimmten Zeitpunkten
Jahr datum
len
datum
1994 1995 n.l. 1995 03/95 05/95 11/95 11/96 11/97 11/99 11/00 01/02
32
1986 5.5.
6.3.
A
33
1976 n.g.
3.6.
34
1990 28.4. 11.3. A
27.4.
16
128
64
35
1988
13.5.
32
128
64
36
1990 20.4. 12.3. n.l. 20.4.
128
256
64
37
1989
38
39
n.t.
n.t.
1.5.
128
128
64
16
0
0
14.4.
32
1986 23.5. 22.3. A
6.5.
32
1985 30.5. 20.3. A
28.6.
64
n.t.
=
Stute wurde gedeckt, war aber nicht tragend
-
=
Stute wurde nicht gedeckt
8
16
32
16
32
64
32
pos. =
positiver AK-Titer ohne genaue Angabe der Höhe des Titers
A
=
Stute verfohlte
n. l.
=
Fohlen war nach Geburt nicht lebensfähig
z
=
Stute ist zuchtuntauglich
A3
pos.
32
Ergebnisse der SNT der 2. Impfstofftestung
Ergebnisse der Artervac® immunisierten Pferde im SNT EAV-Bucyrus
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
27.2.98
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
20.3.98
0
0
0
0
0
0
0
0
0
4
0
0
0
0
0
0
4
0
0
0
07.4.98
64
16
256
128
64
32
64
0
0
64
64
32
8
128
64
16
64
64
8
64
24.4.98
4
4
4
8
64
8
8
0
0
4
16
16
0
8
16
4
64
16
4
8
29.5.98
4
0
4
4
8
4
0
0
0
4
4
0
4
8
8
0
16
16
8
4
15.6.98
512
0
256
128
128
1024
128
256
16
1024
128
128
256
512
128
512
512
1024
256
256
10.7.98
256
4
128
32
64
64
8
32
16
1024
32
8
64
32
32
32
128
1024
32
64
26.3.99
0
0
32
8
0
16
0
0
0
0
n. g.
n. g.
4
16
4
16
0
128
0
8
12.4.99
1024
512
512
256
128
64
64
128
64
64
n. g.
n. g.
128
512
64
512
256
512
128
256
n. g. = nicht gemessen
Ergebnisse der Artervac® immunisierten Pferde im SNT EAV-Gi 2592
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
27.2.98
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
20.3.98
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
07.4.98
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
24.4.98
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
29.5.98
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
n. g. = nicht gemessen
A4
15.6.98
8
0
128
8
8
32
8
8
8
128
128
8
16
32
32
32
16
64
8
8
10.7.98
8
0
32
4
8
4
4
4
4
32
32
8
4
16
16
32
16
32
4
8
26.3.99
0
8
4
4
0
0
0
0
0
16
n. g.
n. g.
0
0
0
0
8
4
0
0
12.4.99
64
128
128
64
128
128
32
64
8
64
n. g.
n. g.
32
64
64
128
32
128
32
64
Ergebnisse der mit einer stallspezifischen Vakzine immunisierten Pferde im SNT
EAV-Bucyrus
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
32
33
34
35
36
37
38
39
40
27.2.98
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
20.3.98
32
0
0
0
4
4
4
4
16
4
8
16
4
8
8
4
8
4
4
07.4.98
64
32
16
32
16
32
64
128
128
16
256
8
64
32
64
64
128
64
n. g.
24.4.98
32
32
32
16
16
8
64
16
64
64
16
16
32
16
16
16
32
16
n. g.
29.5.98
4
8
4
4
4
4
8
16
64
16
8
4
8
4
8
16
8
4
n. g.
15.6.98
128
32
256
128
256
256
256
256
128
256
256
256
128
256
128
32
256
64
n. g.
10.7.98
32
32
128
16
32
128
256
64
64
256
128
32
32
32
64
8
32
64
n. g.
26.3.99
4
2
32
4
4
4
32
8
4
2
8
8
8
4
16
2
16
32
32
12.4.99
256
128
512
256
512
128
512
512
256
128
512
512
128
128
512
128
512
512
512
n. g. = nicht gemessen
Ergebnisse der mit einer stallspezifischen Vakzine immunisierten Pferde im SNT
EAV-Gi 2592
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
32
33
34
35
36
37
38
39
40
27.2.98
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
20.3.98
8
8
8
8
8
4
4
4
8
4
4
4
8
4
4
4
4
4
4
07.4.98
32
128
32
128
32
32
32
64
32
16
32
32
16
8
64
64
32
16
n. g.
24.4.98
8
64
64
64
32
16
32
16
32
64
32
16
32
32
64
32
64
4
n. g.
29.5.98
4
16
32
32
8
8
8
8
8
16
8
8
16
16
32
32
32
8
n. g.
n. g. = nicht gemessen
A5
15.6.98
128
64
128
128
128
128
128
128
128
128
128
128
128
128
128
128
128
128
n. g.
10.7.98
128
32
128
128
64
64
128
128
128
128
128
128
128
64
128
128
128
128
n. g.
26.3.99
4
16
32
4
16
16
32
16
16
32
16
128
32
16
32
16
64
128
32
12.4.99
128
128
512
256
128
128
256
128
128
128
128
128
128
128
128
128
128
256
128
Exakttest nach Fisher
Kreuztabellen
Gruppe * A1
Kreuztabelle
A1
<4
Gruppe
Artervac
Giessen
Gesamt
Anzahl
% von Gruppe
Standardisierte Residuen
Anzahl
% von Gruppe
Standardisierte Residuen
Anzahl
% von Gruppe
Gesamt
20
100,0%
20
100,0%
,0
19
100,0%
,0
39
100,0%
19
100,0%
39
100,0%
Gruppe * A2
Kreuztabelle
A2
Gruppe
Artervac
Giessen
Gesamt
Anzahl
% von Gruppe
Standardisierte Residuen
Anzahl
% von Gruppe
Standardisierte Residuen
Anzahl
% von Gruppe
<4
>=4
18
90,0%
2,2
3
15,8%
-2,3
21
53,8%
2
10,0%
-2,4
16
84,2%
2,4
18
46,2%
Gesamt
20
100,0%
19
100,0%
39
100,0%
Chi-Quadrat-Tests
Wert
Chi-Quadrat nach
Pearson
Kontinuitätskorrektura
Likelihood-Quotient
Exakter Test nach Fisher
Zusammenhang
linear-mit-linear
Anzahl der gültigen Fälle
21,592
18,709
24,257
Asymptotisch
e Signifikanz
(2-seitig)
df
b
1
,000
1
1
,000
,000
Exakte
Signifikanz
(2-seitig)
Exakte
Signifikanz
(1-seitig)
,000
21,038
1
,000
39
a. Wird nur für eine 2x2-Tabelle berechnet
b. 0 Zellen (,0%) haben eine erwartete Häufigkeit kleiner 5. Die minimale erwartete Häufigkeit
ist 8,77.
A6
,000
Gruppe * A3
Kreuztabelle
A3
<4
Gruppe
Artervac
Giessen
Gesamt
Anzahl
% von Gruppe
Standardisierte Residuen
Anzahl
% von Gruppe
Standardisierte Residuen
Anzahl
% von Gruppe
>=4
2
10,0%
,9
0
,0%
-1,0
2
5,3%
18
90,0%
-,2
18
100,0%
,2
36
94,7%
Gesamt
20
100,0%
18
100,0%
38
100,0%
Chi-Quadrat-Tests
Wert
Chi-Quadrat nach
Pearson
Kontinuitätskorrektura
Likelihood-Quotient
Exakter Test nach Fisher
Zusammenhang
linear-mit-linear
Anzahl der gültigen Fälle
Asymptotisch
e Signifikanz
(2-seitig)
df
1,900
b
,424
2,667
1
,168
1
1
,515
,102
Exakte
Signifikanz
(2-seitig)
,488
1,850
1
,174
38
a. Wird nur für eine 2x2-Tabelle berechnet
b. 2 Zellen (50,0%) haben eine erwartete Häufigkeit kleiner 5. Die minimale erwartete
Häufigkeit ist ,95.
Gruppe * A4
Kreuztabelle
A4
<4
Gruppe
Artervac
Giessen
Gesamt
Anzahl
% von Gruppe
Standardisierte Residuen
Anzahl
% von Gruppe
Standardisierte Residuen
Anzahl
% von Gruppe
A7
3
15,0%
1,1
0
,0%
-1,2
3
7,9%
>=4
17
85,0%
-,3
18
100,0%
,3
35
92,1%
Gesamt
20
100,0%
18
100,0%
38
100,0%
Exakte
Signifikanz
(1-seitig)
,270
Chi-Quadrat-Tests
Wert
Chi-Quadrat nach
Pearson
Kontinuitätskorrektura
Likelihood-Quotient
Exakter Test nach Fisher
Zusammenhang
linear-mit-linear
Anzahl der gültigen Fälle
Asymptotisch
e Signifikanz
(2-seitig)
df
2,931
b
1,231
4,082
1
,087
1
1
,267
,043
Exakte
Signifikanz
(2-seitig)
,232
2,854
1
Exakte
Signifikanz
(1-seitig)
,135
,091
38
a. Wird nur für eine 2x2-Tabelle berechnet
b. 2 Zellen (50,0%) haben eine erwartete Häufigkeit kleiner 5. Die minimale erwartete
Häufigkeit ist 1,42.
Gruppe * A5
Kreuztabelle
A5
Gruppe
Artervac
Giessen
Gesamt
Anzahl
% von Gruppe
Standardisierte Residuen
Anzahl
% von Gruppe
Standardisierte Residuen
Anzahl
% von Gruppe
<4
>=4
6
30,0%
1,6
0
,0%
-1,7
6
15,8%
14
70,0%
-,7
18
100,0%
,7
32
84,2%
Gesamt
20
100,0%
18
100,0%
38
100,0%
Chi-Quadrat-Tests
Wert
Chi-Quadrat nach
Pearson
Kontinuitätskorrektura
Likelihood-Quotient
Exakter Test nach Fisher
Zusammenhang
linear-mit-linear
Anzahl der gültigen Fälle
Asymptotisch
e Signifikanz
(2-seitig)
df
6,413
b
4,355
8,714
1
,011
1
1
,037
,003
Exakte
Signifikanz
(2-seitig)
,021
6,244
1
,012
38
a. Wird nur für eine 2x2-Tabelle berechnet
b. 2 Zellen (50,0%) haben eine erwartete Häufigkeit kleiner 5. Die minimale erwartete
Häufigkeit ist 2,84.
A8
Exakte
Signifikanz
(1-seitig)
,014
Gruppe * A6
Kreuztabelle
A6
<4
Gruppe
Artervac
Giessen
Gesamt
Anzahl
% von Gruppe
Standardisierte Residuen
Anzahl
% von Gruppe
Standardisierte Residuen
Anzahl
% von Gruppe
1
5,0%
,7
0
,0%
-,7
1
2,6%
>=4
19
95,0%
-,1
18
100,0%
,1
37
97,4%
Gesamt
20
100,0%
18
100,0%
38
100,0%
Chi-Quadrat-Tests
Wert
Chi-Quadrat nach
Pearson
Kontinuitätskorrektura
Likelihood-Quotient
Exakter Test nach Fisher
Zusammenhang
linear-mit-linear
Anzahl der gültigen Fälle
Asymptotisch
e Signifikanz
(2-seitig)
df
,924
b
,000
1,308
1
,336
1
1
1,000
,253
Exakte
Signifikanz
(2-seitig)
1,000
,900
1
,343
38
a. Wird nur für eine 2x2-Tabelle berechnet
b. 2 Zellen (50,0%) haben eine erwartete Häufigkeit kleiner 5. Die minimale erwartete
Häufigkeit ist ,47.
Gruppe * A7
Kreuztabelle
A7
>=4
Gruppe
Artervac
Giessen
Gesamt
Anzahl
% von Gruppe
Standardisierte Residuen
Anzahl
% von Gruppe
Standardisierte Residuen
Anzahl
% von Gruppe
Chi-Quadrat-Tests
Wert
Chi-Quadrat nach
Pearson
Anzahl der gültigen Fälle
a
,
38
a. Es werden keine Statistiken
berechnet, da A7 eine Konstante ist
A9
20
100,0%
,0
18
100,0%
,0
38
100,0%
Gesamt
20
100,0%
18
100,0%
38
100,0%
Exakte
Signifikanz
(1-seitig)
,526
Gruppe * A8
Kreuztabelle
A8
Gruppe
Artervac
Giessen
Gesamt
Anzahl
% von Gruppe
Standardisierte Residuen
Anzahl
% von Gruppe
Standardisierte Residuen
Anzahl
% von Gruppe
<4
>=4
9
50,0%
1,3
3
15,8%
-1,3
12
32,4%
9
50,0%
-,9
16
84,2%
,9
25
67,6%
Gesamt
18
100,0%
19
100,0%
37
100,0%
Chi-Quadrat-Tests
Wert
Chi-Quadrat nach
Pearson
Kontinuitätskorrektura
Likelihood-Quotient
Exakter Test nach Fisher
Zusammenhang
linear-mit-linear
Anzahl der gültigen Fälle
4,937
Asymptotisch
e Signifikanz
(2-seitig)
df
b
3,499
5,099
1
,026
1
1
,061
,024
Exakte
Signifikanz
(2-seitig)
Exakte
Signifikanz
(1-seitig)
,038
4,803
1
,028
37
a. Wird nur für eine 2x2-Tabelle berechnet
b. 0 Zellen (,0%) haben eine erwartete Häufigkeit kleiner 5. Die minimale erwartete Häufigkeit
ist 5,84.
Gruppe * A9
Kreuztabelle
A9
>=4
Gruppe
Artervac
Giessen
Gesamt
Anzahl
% von Gruppe
Standardisierte Residuen
Anzahl
% von Gruppe
Standardisierte Residuen
Anzahl
% von Gruppe
A10
18
100,0%
,0
19
100,0%
,0
37
100,0%
Gesamt
18
100,0%
19
100,0%
37
100,0%
,030
Kreuztabellen
Gruppe * B1
Kreuztabelle
B1
<4
Gruppe
Artervac
Giessen
Gesamt
Anzahl
% von Gruppe
Standardisierte Residuen
Anzahl
% von Gruppe
Standardisierte Residuen
Anzahl
% von Gruppe
Gesamt
20
100,0%
20
100,0%
,0
19
100,0%
,0
39
100,0%
19
100,0%
39
100,0%
Gruppe * B2
Kreuztabelle
B2
<4
Gruppe
Artervac
Giessen
Gesamt
Anzahl
% von Gruppe
Standardisierte Residuen
Anzahl
% von Gruppe
Standardisierte Residuen
Anzahl
% von Gruppe
20
100,0%
3,0
0
,0%
-3,1
20
51,3%
>=4
0
,0%
-3,1
19
100,0%
3,2
19
48,7%
Gesamt
20
100,0%
19
100,0%
39
100,0%
Chi-Quadrat-Tests
Wert
Chi-Quadrat nach
Pearson
Kontinuitätskorrektura
Likelihood-Quotient
Exakter Test nach Fisher
Zusammenhang
linear-mit-linear
Anzahl der gültigen Fälle
39,000
Asymptotisch
e Signifikanz
(2-seitig)
df
b
35,100
54,040
1
,000
1
1
,000
,000
Exakte
Signifikanz
(2-seitig)
Exakte
Signifikanz
(1-seitig)
,000
38,000
1
,000
39
a. Wird nur für eine 2x2-Tabelle berechnet
b. 0 Zellen (,0%) haben eine erwartete Häufigkeit kleiner 5. Die minimale erwartete Häufigkeit
ist 9,26.
A11
,000
Gruppe * B3
Kreuztabelle
B3
<4
Gruppe
Artervac
Giessen
Gesamt
Anzahl
% von Gruppe
Standardisierte Residuen
Anzahl
% von Gruppe
Standardisierte Residuen
Anzahl
% von Gruppe
>=4
20
100,0%
2,9
0
,0%
-3,1
20
52,6%
0
,0%
-3,1
18
100,0%
3,2
18
47,4%
Gesamt
20
100,0%
18
100,0%
38
100,0%
Chi-Quadrat-Tests
Wert
Chi-Quadrat nach
Pearson
Kontinuitätskorrektura
Likelihood-Quotient
Exakter Test nach Fisher
Zusammenhang
linear-mit-linear
Anzahl der gültigen Fälle
Asymptotisch
e Signifikanz
(2-seitig)
df
38,000
b
34,095
52,574
1
,000
1
1
,000
,000
Exakte
Signifikanz
(2-seitig)
Exakte
Signifikanz
(1-seitig)
,000
37,000
1
,000
38
a. Wird nur für eine 2x2-Tabelle berechnet
b. 0 Zellen (,0%) haben eine erwartete Häufigkeit kleiner 5. Die minimale erwartete Häufigkeit
ist 8,53.
Gruppe * B4
Kreuztabelle
B4
<4
Gruppe
Artervac
Giessen
Gesamt
Anzahl
% von Gruppe
Standardisierte Residuen
Anzahl
% von Gruppe
Standardisierte Residuen
Anzahl
% von Gruppe
A12
20
100,0%
2,9
0
,0%
-3,1
20
52,6%
>=4
0
,0%
-3,1
18
100,0%
3,2
18
47,4%
Gesamt
20
100,0%
18
100,0%
38
100,0%
,000
Chi-Quadrat-Tests
Wert
Chi-Quadrat nach
Pearson
Kontinuitätskorrektura
Likelihood-Quotient
Exakter Test nach Fisher
Zusammenhang
linear-mit-linear
Anzahl der gültigen Fälle
Asymptotisch
e Signifikanz
(2-seitig)
df
38,000
b
34,095
52,574
1
,000
1
1
,000
,000
Exakte
Signifikanz
(2-seitig)
Exakte
Signifikanz
(1-seitig)
,000
37,000
1
,000
,000
38
a. Wird nur für eine 2x2-Tabelle berechnet
b. 0 Zellen (,0%) haben eine erwartete Häufigkeit kleiner 5. Die minimale erwartete Häufigkeit
ist 8,53.
Gruppe * B5
Kreuztabelle
B5
<4
Gruppe
Artervac
Giessen
Gesamt
Anzahl
% von Gruppe
Standardisierte Residuen
Anzahl
% von Gruppe
Standardisierte Residuen
Anzahl
% von Gruppe
20
100,0%
2,9
0
,0%
-3,1
20
52,6%
>=4
0
,0%
-3,1
18
100,0%
3,2
18
47,4%
Gesamt
20
100,0%
18
100,0%
38
100,0%
Chi-Quadrat-Tests
Wert
Chi-Quadrat nach
Pearson
Kontinuitätskorrektura
Likelihood-Quotient
Exakter Test nach Fisher
Zusammenhang
linear-mit-linear
Anzahl der gültigen Fälle
Asymptotisch
e Signifikanz
(2-seitig)
df
38,000
34,095
52,574
b
1
,000
1
1
,000
,000
Exakte
Signifikanz
(2-seitig)
,000
37,000
1
Exakte
Signifikanz
(1-seitig)
,000
,000
38
a. Wird nur für eine 2x2-Tabelle berechnet
b. 0 Zellen (,0%) haben eine erwartete Häufigkeit kleiner 5. Die minimale erwartete Häufigkeit
ist 8,53.
A13
Gruppe * B6
Kreuztabelle
B6
<4
Gruppe
Artervac
Giessen
Gesamt
Anzahl
% von Gruppe
Standardisierte Residuen
Anzahl
% von Gruppe
Standardisierte Residuen
Anzahl
% von Gruppe
>=4
1
5,0%
,7
0
,0%
-,7
1
2,6%
19
95,0%
-,1
18
100,0%
,1
37
97,4%
Gesamt
20
100,0%
18
100,0%
38
100,0%
Chi-Quadrat-Tests
Wert
Chi-Quadrat nach
Pearson
Kontinuitätskorrektura
Likelihood-Quotient
Exakter Test nach Fisher
Zusammenhang
linear-mit-linear
Anzahl der gültigen Fälle
Asymptotisch
e Signifikanz
(2-seitig)
df
,924
b
,000
1,308
1
,336
1
1
1,000
,253
Exakte
Signifikanz
(2-seitig)
1,000
,900
1
,343
38
a. Wird nur für eine 2x2-Tabelle berechnet
b. 2 Zellen (50,0%) haben eine erwartete Häufigkeit kleiner 5. Die minimale erwartete
Häufigkeit ist ,47.
Gruppe * B7
Kreuztabelle
B7
<4
Gruppe
Artervac
Giessen
Gesamt
Anzahl
% von Gruppe
Standardisierte Residuen
Anzahl
% von Gruppe
Standardisierte Residuen
Anzahl
% von Gruppe
A14
1
5,0%
,7
0
,0%
-,7
1
2,6%
>=4
19
95,0%
-,1
18
100,0%
,1
37
97,4%
Gesamt
20
100,0%
18
100,0%
38
100,0%
Exakte
Signifikanz
(1-seitig)
,526
Chi-Quadrat-Tests
Wert
Chi-Quadrat nach
Pearson
Kontinuitätskorrektura
Likelihood-Quotient
Exakter Test nach Fisher
Zusammenhang
linear-mit-linear
Anzahl der gültigen Fälle
Asymptotisch
e Signifikanz
(2-seitig)
df
,924
b
,000
1,308
1
,336
1
1
1,000
,253
Exakte
Signifikanz
(2-seitig)
1,000
,900
1
Exakte
Signifikanz
(1-seitig)
,526
,343
38
a. Wird nur für eine 2x2-Tabelle berechnet
b. 2 Zellen (50,0%) haben eine erwartete Häufigkeit kleiner 5. Die minimale erwartete
Häufigkeit ist ,47.
Gruppe * B8
Kreuztabelle
B8
<4
Gruppe
Artervac
Giessen
Gesamt
Anzahl
% von Gruppe
Standardisierte Residuen
Anzahl
% von Gruppe
Standardisierte Residuen
Anzahl
% von Gruppe
12
66,7%
2,6
0
,0%
-2,5
12
32,4%
>=4
6
33,3%
-1,8
19
100,0%
1,7
25
67,6%
Gesamt
18
100,0%
19
100,0%
37
100,0%
Chi-Quadrat-Tests
Wert
Chi-Quadrat nach
Pearson
Kontinuitätskorrektura
Likelihood-Quotient
Exakter Test nach Fisher
Zusammenhang
linear-mit-linear
Anzahl der gültigen Fälle
Asymptotisch
e Signifikanz
(2-seitig)
df
18,747
15,828
23,712
b
1
,000
1
1
,000
,000
Exakte
Signifikanz
(2-seitig)
,000
18,240
1
Exakte
Signifikanz
(1-seitig)
,000
,000
37
a. Wird nur für eine 2x2-Tabelle berechnet
b. 0 Zellen (,0%) haben eine erwartete Häufigkeit kleiner 5. Die minimale erwartete Häufigkeit
ist 5,84.
A15
Gruppe * B9
Kreuztabelle
B9
>=4
Gruppe
Artervac
Giessen
Gesamt
Anzahl
% von Gruppe
Standardisierte Residuen
Anzahl
% von Gruppe
Standardisierte Residuen
Anzahl
% von Gruppe
A16
18
100,0%
,0
19
100,0%
,0
37
100,0%
Gesamt
18
100,0%
19
100,0%
37
100,0%
Hautreaktionen
Hautreaktionen der Pferde nach der ersten Immunisierung (24 h p.i.)*
Daggy
Frieda
Nelke
Friedrich
Jessy
Anzahl der
li: 6
li: 4
li: 2
li: 5
li: 6
Papeln
re: 6
re: 6
re: 1
re: 5
re: 6
Aussehen der
hgr. erhaben,
mgr. - hgr.
ggr. erhaben,
ggr. erhaben,
ggr. - mgr.
Papeln
Epithel abgelöst erhaben, Epithel
Str. c. o. b. B
Str. c. o. b. B.
erhaben,
Str. c. schuppig
in Ablösung
Hautdicke in cm li:
re:
li:
re:
li:
re:
li:
re:
li:
re:
a) normal
0,25
0,3
0,3
0,3
0,2
0,2
0,3
0,35
0,4
0,4
b) Papel
0,6
0,6
0,6
0,6
0,45
0,4
0,4
0,4
0,6
0,6
Durchmesser
li: 1,1 - 1,2
li: 0,8 - 1,0
li: 0,6 - 0,8
li: 1,0 - 1,1
li: 0,5 - 0,6
in cm
re: 1,0
re: 0,7 - 0,8
re: 0,7
re: 0,9 - 1,2
re: 0,5
1 Papel mit 1,0
Besonderhei-
bds. Kriebelmük-
sehr dünne
ten
kenstiche mit al-
Haut, li 2 weiße, ggr. faltig und
deutliche
lergischem Ödem
kreisrunde
Ödembildung und
1 Papel: Str. c.
gerötet
Ringe
Excoriation,
starker Juckreiz
li: linke Halsseite; re: rechte Halsseite; Str. c.: Stratum corneum; o.b.B.: ohne besonderen Befund
ggr.: geringgradig; mgr.: mittelgradig; hgr.: hochgradig
*Immunisierung am 23.05.00, Dokumentation der Hautreaktionen am 24.05.00
Hautreaktionen der Pferde nach dem ersten Booster (24 h p.i.)*
Daggy
Frieda
5
Nelke
li:
Papeln
re: 5
re: 6
re: 5
Aussehen der
ggr. erhaben
ggr. erhaben
nicht erhaben, ggr. erha-
ggr. - mgr.
rötlich, ggr.
ben, rötlich,
erhaben, Str. c.
schorfig
leicht faltig
schuppig
li:
li:
Papeln
5
li:
6
Jessy
Anzahl der
li:
6
Friedrich
li:
re: 6
4
re: 6 (8)
Hautdicke in cm li:
re:
li:
re:
li:
re:
li:
re:
a) normal
0,25
0,3
0,3
0,3
0,2
0,2
0,3
0,35 0,4
0,4
b) Papel
0,4
0,4
0,35
0,35
0,25
0,2
0,6
0,5
0,65
Durchmesser
li: 1,0 - 1,3
li: 0,5 - 1,1
li: 0,7
li: 1,0 - 1,5 li: 0,7
in cm
re: 1,0 - 1,3
re: 0,7 - 1,1
re: 0,8 - 1,0
re: 1,0 - 1,5
re: 0,5 –1,3
Besonderheiten
re: Epithel löst keine
keine
keine
re: rötlich-
0,65
re:
sich an 2
schorfige Papeln,
Stellen ab
allergisches Ödem
li: linke Halsseite; re: rechte Halsseite; ggr.: geringgradig; mgr.: mittelgradig; Str. c.: Stratum corneum,
*1. Booster am 06.06.00, Dokumentation der Hautreaktionen am 07.06.00
A17
Hautreaktionen der Pferde nach dem zweiten Booster (24 h p.i.)*
Daggy
Frieda
5
Nelke
li:
Papeln
re: 7
re: 6
re: 6
Aussehen der
mgr. erhaben
nicht–ggr.
nicht erhaben, nicht-mgr.
nicht-mgr.
erhaben
rötlich, ggr.
erhaben,
erhaben,
schorfig
rötlich, leicht
rötlich, Str. c.
faltig
schorfig
Papeln
li:
2
Jessy
Anzahl der
li:
3
Friedrich
li:
5
li:
re: 6
re: 6
Hautdicke in cm li:
re:
li:
re:
li:
re:
li:
re:
a) normal
0,25
0,3
0,3
0,3
0,2
0,2
0,3
0,35 0,4
b) Papel
0,4-0,6
0,5
0,3
0,35
Durchmesser
li: 1,3-1,5
in cm
re: 1,3
Besonderheiten
Epithel in
li,re: 0,8
li:
re:
0,4
0,25 0,45-0,6 0,55 0,45-0,65 0,5
re: 0,5-0,6
keine
4
keine
Ablösung
li: 1,4 - 1,8
li: 0,5-1,3
re: 1,3 - 1,6
re: 0,5-0,7
re: Epithel
keine
abgelöst
li: linke Halsseite; re: rechte Halsseite; ggr.: geringgradig; mgr.: mittelgradig; Str. c.: Stratum corneum
*2. Booster am 21.06.00, Dokumentation der Hautreaktionen am 22.06.00
Hautreaktionen der Pferde nach dem dritten Booster (24 h p.i.)*
Daggy
Frieda
4
Nelke
li:
Papeln
re: 6
re: 5
re: 4
re: 6
re: 4
Aussehen der
nicht - ggr.
li, re: nicht
li, re: rötlich,
ggr. erhaben
nicht - ggr.
Papeln
erhaben
erhaben
nicht erhaben
re: rötlich,
erhaben,
leicht faltig
leicht rötlich
li:
li:
6
Jessy
Anzahl der
li:
3
Friedrich
li:
6
li:
5
Hautdicke in cm li:
re:
li:
re:
li:
re:
li:
re:
a) normal
0,25
0,3
0,3
0,3
0,2
0,2
0,3
0,35 0,4
0,4
b) Papel
0,35
0,35
0,3
0,3
0,2
0,2
0,45
0,45 0,55
0,5
Durchmesser
li: 1,0 - 1,3
li: 0,6- 1,0
li: 0,8-1,2
li: 1,0
li: 0,5-0,8
in cm
re: 0,8 - 1,2
re: 0,8
re: 0,6
re: 1,3
re: 0,6-0,7
Besonderheiten
re: Epithel löst
keine
keine
keine
keine
sich an einer
Stelle ab
li: linke Halsseite; re: rechte Halsseite; ggr.: geringgradig
*3. Booster am 14.07.00, Dokumentation der Hautreaktionen am 15.07.00
A18
re:
Ergebnisse der SNT der 3. Impfstofftestung
SNTder Pferde der Medizinischen Tierklinik
Datum
Name
Frieda
Daggy
Nelke
Jessy
Friedrich
Datum
Name
Frieda
Daggy
Nelke
Jessy
Friedrich
20.10.99
02.03.00
23.03.00
22.05.00
05.06.00
20.06.00
13.07.00
28.07.00
25.08.00
16
64
0
0
0
8
64
0
0
0
16
64
0
0
0
16
64
0
0
0
264
2048
1024
512
264
264
1024
128
1024
264
264
512
128
1024
264
512
512
1024
512
264
512
512
128
128
264
22.09.00
25.10.00
17.11.00
15.12.00
19.01.01
16.02.01
16.03.00
12.04.01
11.05.01
264
264
128
128
512
264
264
64
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SNT der Pferde der Chirurgischen Tierklinik
Datum
Name
06.11.00
28.11.00
19.12.00
07.01.01
23.01.01
20.02.01
13.03.01
23.04.01
17.05.01
Grazie
Conti
Sina
Strolch
0
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0
0
0
0
0
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4
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A19
Danksagung
Herrn Prof. Dr. G. F. Schusser, Direktor der Medizinische Tierklinik der
Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig, danke ich herzlich für die
Betreuung meiner Dissertation.
PD Dr. Dr. T. Vahlenkamp, Friedrich-Loeffler-Institut, Insel Riems, danke ich
besonders für die Unterstützung und intensive Betreuung meiner Arbeit.
Dr. Petra Schneller vom Landesamt für Verbraucherschutz, Landwirtschaft und
Flurneuordnung danke ich für das Thema des ersten Teils dieser Arbeit und für die
großartige Unterstützung auf dem Gestüt und bei der Untersuchung der Proben.
Dr. Werner Herbst vom Institut für Hygiene- und Infektionskrankheiten der Tiere
der Justus-Liebig-Universität Gießen danke ich für die Bereitstellung des
Virusstammes EAV-GI 2592, für die Hilfe bei der Herstellung des Impfstoffes und
bei der Untersuchung der Proben.
Für die Möglichkeit der Untersuchung und Vakzination der Pferde des
Brandenburgischen Haupt- und Landgestütes Neustadt/Dosse möchte ich dem
Direktor Dr. Jürgen Müller danken. Mein Dank gilt ebenso den Mitarbeitern des
Gestütes für die Unterstützung im Umgang mit den Pferden.
Besonders möchte ich mich auch bei Monika Herold, Mitarbeiterin des Instituts für
Virologie der Veterinärmedizinische Fakultät, für die Unterstützung in der
Laborarbeit bedanken.