Über die T r e n n u n g der freien Aminosäuren aus Seidenspinner-Blut mittels der Hochspannungs-Papierelektrophorese V o n J. M . DENUCÉ u n d HERBERT ZUBER Aus dem Laboratorium voor Zoologie der Universität Gent und dem Chemischen Institut der Universität Heidelberg (Z. Naturforschg. 11 b, 381—383 [1956]; eingegangen am 13. März 1956) Im Blut der Seidenraupe (Bombyx mori) wurden durch Hochspannungs-Elektrophorese Glycin, Alanin, Serin, Cystin, Histidin, Arginin, Lysin und Glutamin als freie Aminosäuren nachgewiesen. Glycin, Alanin und Serin nehmen während des 5. Larvenstadiums ab, während Histidin stark zunimmt. Peptide als mögliche Vorstufe von Proteinen der Spinndrüse (Fibroin und Sericin) wurden im Blut von Bombyx mori nicht gefunden. T T T i e seit langem bekannt, ist die Körperflüssigkeit W der Insekten durch einen relativ hohen Gehalt an freien Aminosäuren gekennzeichnet 1 . Von verschiedener Seite wurde auch versucht, die Schwankungen, die der Aminosäure-Stickstoff im Laufe der Larvenentwicklung aufzeigt, mit bestimmten morphogenetischen und physiologischen Äußerungen der Larve kausal zu verbinden. Mit Einführung der papierehromatographischen Arbeitsmethoden wurden darüber hinaus neue Möglichkeiten geschaffen, auch analytisch speziellere Erkenntnisse hinsichtlich der in der Hämolymphe vorkommenden freien Aminosäuren zu gewinnen. Außerdem wurde versucht, die einzelnen Aminosäuren während der Larvenentwicklung auch quantitativ zu bestimmen. Es sei hier auf die Arbeiten von D r i 1 h o n und B u s n e 1 ä , A u c 1 a i r und P a 11 o n 3 , P r a t t 4 , A u c l a i r und D u b r e u i 1 5, außerdem auf F u k u d a und Mitarbb. 6 hingewiesen. In Zusammenhang mit früheren Lmtersuchungen über die biochemischen Beziehungen zwischen Hämolymphe und Spinndrüse bei Insektenlarven, die einen Proteinkokon spinnen (Bombyx mori, Galleria mellonella), untersuchten wir das Verhalten der freien Aminosäuren (und evtl. Peptide) im Blut der Seidenraupe Bombyx mori mit Hilfe der HochspannungsElektrophorese. Diese neue Methode wurde bevorzugt wegen der erhöhten Trennschärfe der einzelnen Aminosäuren. Zudem wird mit dieser Technik die bei Literaturübersicht der letzten Jahre s. K. D. R o e d e r , Insect Physiology S. 174, John Wiley and Sons, New York 1953.' 2 A. D r i 1 h o n u. R. G. B u s n e l , Rev. Ver ä Soie 1, 51 [1949]. 3 J. L. A u c l a i r u. R. L. P a t t o n , Rev. canad. Biol. 9, 3 [1950], 4 J. J. P r a 11, Ann. Entom. Soc. Amer. 43, 573 [1950], 1 allen chromatographischen Verfahren erforderliche Reinigung der biologischen Flüssigkeit umgangen. Diese Vereinfachung bedeutet im Falle der Insektenhämolymphe mit ihrem nicht zu vernachlässigenden Gehalt an Elektrolyten (z. B. N a " 14 mMol//; K~ 3 3 — 4 0 mMol//) und anderen störenden Substanzen einen erheblichen Vorteil. Material und Methoden Hämolymphe von Larven von Bombyx mori wurde mit einer gläsernen Mikropipette aus der Körperhöhle aufgesogen und sofort mit einem gleichen Volumen m/200-KCN-Lösung verdünnt. Dadurch wird die spontan auftretende Melaninbildung vermieden. Die Flüssigkeit wird zentrifugiert, um die Zellen vom Serum abzutrennen. 10 ul Serum wurden als Strich an der Startlinie eines puffer-getränkten Streifens von Filtrierpapier aufgetragen. Für die elektrophoretische Trennung wurde eine Apparatur benützt, die von W e r n e r und W e s t p h a 1 7 und W e r n e r 8 beschrieben wurde. Bei einer Spannung von 5000 V (5 bis 7 mA) konnte innerhalb 70 Min. eine sehr befriedigende Trennung erreicht werden. In den meisten Fällen betrug die Laufstrecke ungefähr 35—40 cm. Die Temperatur in der Kühlsole war — 8° C. Als Puffer diente ein Gemisch von EssigsäureAmeisensäure (pH 1,93). Bei diesem tiefen p H -Wert wanderten alle in der Hämolymphe vorhandenen Aminosäuren kathodisch. Nach der Trennung wurden die Papierstreifen getrocknet und mit einer Ninhydrin-Lösung angefärbt. Die Untersuchungen erstreckten sich vom 1. Tag des 5. Larvenstadiums bis zu dem Stadium völlig eingespon5 J. L. A u c l a i r u. R. D u b r e u i l , Canad. J. Zool. 30, 109 [1952]; 31, 30 [1953]. 6T. F u k u d a , J. K i r i m u r a , M. M a t u d a u. T. S u z u k i , J. Biochemistry [Tokyo] 42, 341 [1955]; Nature [London] 175, 1041 [1955], 7 G. W e r n e r u. O. W e s t p h a 1 , Angew. Chem. 67, 251 [1955]. * G. W e r n e r , Recueil Trav. chim. Pays Bas, 74, 613 [1955]. Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschung in Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht: Creative Commons Namensnennung-Keine Bearbeitung 3.0 Deutschland Lizenz. This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution-NoDerivs 3.0 Germany License. Zum 01.01.2015 ist eine Anpassung der Lizenzbedingungen (Entfall der Creative Commons Lizenzbedingung „Keine Bearbeitung“) beabsichtigt, um eine Nachnutzung auch im Rahmen zukünftiger wissenschaftlicher Nutzungsformen zu ermöglichen. On 01.01.2015 it is planned to change the License Conditions (the removal of the Creative Commons License condition “no derivative works”). This is to allow reuse in the area of future scientific usage. nener Tiere (Kokongewicht z. B. 300 mg). Es wurden auch Aminosäuretrennungen mit der 2-dimensionalen, aufsteigenden papier-chromatographischen Methode durchgeführt. Als Lösungsmittel dienten Sekundärbutanol-Ameisensäure-Wasser in der ersten und Phenol-Wasser in der zweiten Laufrichtung. Diese Trennungen waren durch die im Blut vorhandenen Beimengungen meistens unscharf. Schließlich wurde auch in einer weiteren Versuchsreihe Hämolymphe mittels Niedervolt-Elektrophorese (220 V) auf Filtrierpapier getrennt. Über die dabei aufgetrennten Proteinfraktionen soll in einer gesonderten Arbeit berichtet werden. Die folgenden freien Aminosäuren konnten aus der durch 2. Auch der Gehalt an Serin wird schwächer; die Aminosäure bleibt jedoch im Blut der spinnenden Larve feststellbar. 3. Histidin nimmt stark zu von den ersten Tagen des 5. Stadiums und weiter noch während des Einspinnens. In diesem Stadium übertrifft diese basische Aminosäure alle übrigen Flecke durch ihre Intensität (Ninhydrin und Kupplung mit diazotierter Sulfanilsäure). Ergebnisse Hämolymphe 1. Glycin und Alanin nehmen im Laufe des 5. Larvenstadiums bedeutend ab. Hochspannungselektrophorese getrennt und identifiziert werden: Cvstin, Serin, Ala- 4. Der Gehalt an den basischen Aminosäuren Arginin und Lysin bleibt gleich. 5. 1 oder 2 T a g e vor Anfang der Spinnaktivität konnte eine bisher nicht näher definierte Fraktion (Peptid oder Protein?) nachgewiesen werden. Sie lokalisiert sich etwa 1 cm von der Auftragestelle und wandert kathodisch. Der Fleck nimmt im L a u f e des Spinnprozesses an Stärke zu. 6. Mit der (in diesen Versuchen angewandten) Hochspannungs-Elektrophorese konnten im Blut des Seidenspinners keine Peptide nachgewiesen werden. Auch wenn durch weitere Untersuchungen die unter 5. beschriebene Fraktion sich als Peptid identifizieren läßt, so ist doch im allgemeinen feststellbar, daß in der Periode, die als vorbereitend zum 0 Einspinnen betrachtet werden darf, keine Peptide als mögliche Vorstufen von Proteinen der Spinndrüse im Blut auf- Abb. 1. Abb. 2. Abb. 1. Papierelektropherogramm von Hämolymphe aus einer nicht spinnenden Larve von Bombyx mori (2. Tag des 5. Stadiums, 1,768 g). pu 1,93; 5000 V; 7 mA; Soletemp. — 8 C; Laufzeit 70 Minuten. Abb. 2. Papierelektropherogramm von Hämolymphe aus einer spinnenden Larve von Bombyx mori (14. Tag des 5. Stadiums, 2,833 g). Als Vergleichssubstanzen liefen mit: Cvstin, Lvsin, Glycin, Histidin, Serin, Glutaminsäure und Alanin. p H 1,93; 5000 V; 6 mA; Soletemp. — 8° C; Laufzeit 70 Minuten. treten. Diskussion D r i 1 h o n und B u s n e l Bombyx-Larven folgende fanden im Blut Aminosäuren: von Glutamin- säure, Glycin, Tyrosin, Leucin und Cystin. Diese Aminosäuren nahmen während der Spinnzeit im allgemeinen ab. Ungefähr 10 Tage nach dem Einspinnen stiegen sie jedoch wieder an. Gleichzeitig konnten die Verff. einige neu auftretende Aminosäuren nachweisen: Histidin, Serin, Diphenylalanin (?) und nin, Glycin, Histidin (nach Kupplung mit dem Pauly- Prolin. Unsere Untersuchungen haben gezeigt, daß und Histidin und Serin schon im 5. Larvenstadium reich- Lvsin (Abb. 1 und 2). Ein Fleck zwischen Cvstin und lich vorhanden sind. Es ist nicht unwahrscheinlich, Serin ist entweder auf Glutaminsäure oder auf Glut- daß diese Aminosäuren schon in früheren amin zurückzuführen *. vorkommen. Reagenz besonders gut nachweisbar), Arginin In quantitativer Hinsicht läßt die Beurteilung der Mit den Ergebnissen Stadien von F u k u d a und Mit- Fleckengröße bzw. Intensität der Ninhydrinfärbung arbb. folgende Feststellungen zu: lichkeiten. F u k u d a konnte mit mikrobiologischen * Auf 2-dimensionalen Chromatogrammen konnte keine Glutaminsäure, sondern nur Glutamin nachgewiesen werden. Hämolymphe des 5. Larvenstadiums nachweisen. Auf 6 zeigen unsere Untersuchungen größere Ähn- Methoden sehr viel Histidin, Lysin und Serin in der Grund von Versuchen mit Seidenraupen, bei denen •1 oo OOO sich durch Herauspräparieren der Spinndrüsen wendigerweise die Aminosäuren not- daß die eigentliche Peptid- und Eiweißsynthese erst des Fibroins bzw. Sericins in der Körperflüssigkeit anhäuften, ist F u kuda geneigt anzunehmen, daß Glycin, Threonin, Prolin, Serin und Tyrosin gegen E n d e des 5. Stadiums unmittelbar vor dem Einspinnen von der Spinndrüse aus der Hämolymphe aufgenommen werden. Das Fehlen von Peptiden im Blut der Seidenraupe vor Beginn der Spinnaktivität läßt uns annehmen, in der Spinndrüse stattfindet. Für die gewährte Gastfreundschaft am Neuen Chemischen Institut der Universität Heidelberg ist einer von uns (J. M. D.) Herrn Prof. Dr. K. F r e u d e n b e r g und Herrn Prof. Dr. H. Z a l i n zu großem Dank verpflichtet. Der Biologischen Forschungsanstalt für Kleintierzucht, Celle, danken wir für die freundliche Überlassung von Seidenraupen. Die Bedeutung physikalischer Faktoren für die W i r k u n g von Heptachlordioxan auf Drosophila melanogaster M E I G . Von KARL HAYDUK und MANFRED LÜDICKE Aus dem Zoologischen Institut der Universität Heidelberg (Z. Naturforschg. 11 b, 383 388 [1956]; eingegangen am 23. Februar 1956) Die Bedeutung der physikalischen Faktoren bei der von H a d a w a v und B a r l o w 1 zusammenfassend versucht, einige dieser Faktoren bei Heptachlordioxan 1. Es wurde die Sublimations-Geschwindigkeit von Wirkung von Kontaktinsektiziden wurde dargestellt. In vorliegender Arbeit wird aufzuklären. Heptachlordioxan gravimetrisch ermittelt. 2. Die Giftwirkung von Heptachlordioxan und y-Hexachlorcyclohexan auf vier Altersstufen von Drosophila melanogaster M e i g. wurde untersucht und eine geringe erhöhte Resistenz älterer Tiere gegenüber jüngeren festgestellt. In der Streuung der Effektzeiten ist ein statistisch gesicherter Unterschied zwischen den Altersstufen vorhanden. 3. Das Intoxikationsbild von Heptachlordioxan zeigt in seinen einzelnen Phasen eine gewisse Übereinstimmung mit dem von DDT. 4. Die Giftwirkung von Heptachlordioxan ist im Rahmen der Versuchsbedingungen umgekehrt proportional der Teilchengröße. F Material und Methode ür die Durchführung der Versuche wurden zwei Insektizide verwendet: Heptachlordioxan und als Vergleichspräparat die reine y-Isomere des Hexachlorcyelohexans. Als Versuchsobjekt wurde Drosophila melanogaster M e i g. vg. gewählt, da die Tiere infolge ihrer Flugunfähigkeit mit dem Präparat in Dauerkontakt bleiben. Als Testverfahren wurde das Depositverfahren bevorzugt, da sich dieses für die Bearbeitung des gestellten Problems günstig zeigte. Zur Erzielung eines gleichmäßigen Belages wurden Cellophanfolien von je 132 cm- Fläche in eine 1-proz. ätherische Lösung des Insektizides getaucht, wobei die Substanz auf den Folien auskristallisierte. Die mit dem Insektizid gleichmäßig bedeckten Mittelstücke der Folien wurden mit Gummiringen auf Holzrähmchen gespannt und diese zu einem Kästchen von 200 cm- Gesamtfläche und 183,25 cm3 Inhalt zusammengesetzt, das gleichfalls mit Gummiringen zusammengehalten wurde. Die Menge des Belages pro cm- wurde durch Wägung von abge1 A. B. H a d a w a y u. F. B a r l o w , Trans. R. Soc. trop. Med. Hyg. 46, 236 [1952]. trennten Streifen der verwendeten Folien vor und nach der Sublimation des Belages in Wägegläschen auf einer Sartorius-Analysen-Dämpfungswaage ermittelt. Der Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, daß alle Flächen homogen mit Belag versehen sind und durch Auswechseln der Folien ein sauberes und sicheres Arbeiten ohne umständliche Reinigung der Versuchsgefäße ermöglicht wird. 1. D i e Sublimations-Geschwindigkeit von Heptachlordioxan Bei den ersten Untersuchungen über die kontaktinsektizide Wirkung dieser Substanz - war festgestellt worden, daß bei längerem Offenstehen der Versuchsgefäße die insektizide Wirkung des Präparates deutlich abnahm. Daher war es zunächst von Interesse, die Sublimations-Geschwindigkeit und die damit zusammenhängenden Vorgänge zu studieren. - M. L ü d i c k e u. W. S t u m p f , Naturwissenschaften 40, 363 [1953].