Über die Trennung der freien Aminosäuren aus Seidenspinner

Über die T r e n n u n g der freien Aminosäuren aus Seidenspinner-Blut
mittels der Hochspannungs-Papierelektrophorese
V o n J. M . DENUCÉ u n d HERBERT
ZUBER
Aus dem Laboratorium voor Zoologie der Universität Gent
und dem Chemischen Institut der Universität Heidelberg
(Z. Naturforschg. 11 b, 381—383 [1956]; eingegangen am 13. März 1956)
Im Blut der Seidenraupe (Bombyx mori) wurden durch Hochspannungs-Elektrophorese
Glycin, Alanin, Serin, Cystin, Histidin, Arginin, Lysin und Glutamin als freie Aminosäuren
nachgewiesen. Glycin, Alanin und Serin nehmen während des 5. Larvenstadiums ab, während
Histidin stark zunimmt. Peptide als mögliche Vorstufe von Proteinen der Spinndrüse (Fibroin
und Sericin) wurden im Blut von Bombyx mori nicht gefunden.
T T T i e seit langem bekannt, ist die Körperflüssigkeit
W der Insekten durch einen relativ hohen Gehalt an
freien Aminosäuren gekennzeichnet 1 . Von verschiedener Seite wurde auch versucht, die Schwankungen,
die der Aminosäure-Stickstoff im Laufe der Larvenentwicklung aufzeigt, mit bestimmten morphogenetischen und physiologischen Äußerungen der Larve
kausal zu verbinden.
Mit Einführung der papierehromatographischen Arbeitsmethoden wurden darüber hinaus neue Möglichkeiten geschaffen, auch analytisch speziellere Erkenntnisse hinsichtlich der in der Hämolymphe vorkommenden freien Aminosäuren zu gewinnen. Außerdem wurde versucht, die einzelnen Aminosäuren während der Larvenentwicklung auch quantitativ zu bestimmen. Es sei hier auf die Arbeiten von D r i 1 h o n und B u s n e 1 ä , A u c 1 a i r und P a 11 o n 3 ,
P r a t t 4 , A u c l a i r und D u b r e u i 1 5, außerdem
auf F u k u d a und Mitarbb. 6 hingewiesen.
In Zusammenhang mit früheren Lmtersuchungen
über die biochemischen Beziehungen zwischen Hämolymphe und Spinndrüse bei Insektenlarven, die einen
Proteinkokon spinnen (Bombyx mori, Galleria
mellonella), untersuchten wir das Verhalten der freien
Aminosäuren (und evtl. Peptide) im Blut der Seidenraupe Bombyx
mori mit Hilfe der HochspannungsElektrophorese. Diese neue Methode wurde bevorzugt wegen der erhöhten Trennschärfe der einzelnen
Aminosäuren. Zudem wird mit dieser Technik die bei
Literaturübersicht der letzten Jahre s. K. D. R o e d e r , Insect Physiology S. 174, John Wiley and Sons,
New York 1953.'
2 A. D r i 1 h o n u. R. G. B u s n e l , Rev. Ver ä Soie
1, 51 [1949].
3 J. L. A u c l a i r
u. R. L. P a t t o n , Rev. canad.
Biol. 9, 3 [1950],
4 J. J. P r a 11, Ann. Entom. Soc. Amer. 43, 573 [1950],
1
allen chromatographischen Verfahren erforderliche
Reinigung der biologischen Flüssigkeit umgangen.
Diese Vereinfachung bedeutet im Falle der Insektenhämolymphe mit ihrem nicht zu vernachlässigenden
Gehalt an Elektrolyten (z. B. N a " 14 mMol//; K~
3 3 — 4 0 mMol//) und anderen störenden Substanzen
einen erheblichen Vorteil.
Material und Methoden
Hämolymphe von Larven von Bombyx mori wurde
mit einer gläsernen Mikropipette aus der Körperhöhle
aufgesogen und sofort mit einem gleichen Volumen
m/200-KCN-Lösung verdünnt. Dadurch wird die spontan
auftretende Melaninbildung vermieden. Die Flüssigkeit
wird zentrifugiert, um die Zellen vom Serum abzutrennen. 10 ul Serum wurden als Strich an der Startlinie eines
puffer-getränkten Streifens von Filtrierpapier aufgetragen. Für die elektrophoretische Trennung wurde eine
Apparatur benützt, die von W e r n e r und W e s t p h a 1 7 und W e r n e r 8 beschrieben wurde. Bei einer
Spannung von 5000 V (5 bis 7 mA) konnte innerhalb
70 Min. eine sehr befriedigende Trennung erreicht werden. In den meisten Fällen betrug die Laufstrecke ungefähr 35—40 cm. Die Temperatur in der Kühlsole war
— 8° C. Als Puffer diente ein Gemisch von EssigsäureAmeisensäure (pH 1,93). Bei diesem tiefen p H -Wert wanderten alle in der Hämolymphe vorhandenen Aminosäuren kathodisch. Nach der Trennung wurden die Papierstreifen getrocknet und mit einer Ninhydrin-Lösung
angefärbt.
Die Untersuchungen erstreckten sich vom 1. Tag des
5. Larvenstadiums bis zu dem Stadium völlig eingespon5 J. L. A u c l a i r
u. R. D u b r e u i l , Canad. J.
Zool. 30, 109 [1952]; 31, 30 [1953].
6T.
F u k u d a , J. K i r i m u r a , M. M a t u d a u.
T. S u z u k i , J. Biochemistry [Tokyo] 42, 341 [1955];
Nature [London] 175, 1041 [1955],
7 G. W e r n e r
u. O. W e s t p h a 1 , Angew. Chem.
67, 251 [1955].
* G. W e r n e r , Recueil Trav. chim. Pays Bas, 74,
613 [1955].
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nener Tiere (Kokongewicht z. B. 300 mg). Es wurden auch
Aminosäuretrennungen mit der 2-dimensionalen, aufsteigenden papier-chromatographischen Methode durchgeführt. Als Lösungsmittel dienten Sekundärbutanol-Ameisensäure-Wasser in der ersten und Phenol-Wasser in der
zweiten Laufrichtung. Diese Trennungen waren durch
die im Blut vorhandenen Beimengungen meistens unscharf. Schließlich wurde auch in einer weiteren Versuchsreihe Hämolymphe mittels Niedervolt-Elektrophorese (220 V) auf Filtrierpapier getrennt. Über die dabei
aufgetrennten Proteinfraktionen soll in einer gesonderten
Arbeit berichtet werden.
Die folgenden freien Aminosäuren konnten aus der
durch
2. Auch der Gehalt an Serin wird schwächer; die
Aminosäure bleibt jedoch im Blut der spinnenden
Larve feststellbar.
3. Histidin nimmt stark zu von den ersten Tagen
des 5. Stadiums und weiter noch während des Einspinnens. In diesem Stadium übertrifft diese basische
Aminosäure alle übrigen Flecke durch ihre Intensität
(Ninhydrin und Kupplung mit diazotierter Sulfanilsäure).
Ergebnisse
Hämolymphe
1. Glycin und Alanin nehmen im Laufe des 5. Larvenstadiums bedeutend ab.
Hochspannungselektrophorese
getrennt und identifiziert werden: Cvstin, Serin, Ala-
4. Der Gehalt an den basischen Aminosäuren Arginin und Lysin bleibt gleich.
5. 1 oder 2 T a g e vor Anfang der Spinnaktivität
konnte eine bisher nicht näher definierte
Fraktion
(Peptid oder Protein?) nachgewiesen werden. Sie lokalisiert sich etwa 1 cm von der Auftragestelle und
wandert kathodisch. Der Fleck nimmt im L a u f e des
Spinnprozesses an Stärke zu.
6. Mit
der
(in
diesen
Versuchen
angewandten)
Hochspannungs-Elektrophorese konnten im Blut des
Seidenspinners keine Peptide nachgewiesen werden.
Auch wenn durch weitere Untersuchungen die unter
5. beschriebene Fraktion sich als Peptid identifizieren
läßt, so ist doch im allgemeinen feststellbar, daß in
der Periode, die als vorbereitend zum
0
Einspinnen
betrachtet werden darf, keine Peptide als mögliche
Vorstufen von Proteinen der Spinndrüse im Blut auf-
Abb. 1.
Abb. 2.
Abb. 1. Papierelektropherogramm von Hämolymphe aus
einer nicht spinnenden Larve von Bombyx mori (2. Tag
des 5. Stadiums, 1,768 g). pu 1,93; 5000 V; 7 mA; Soletemp. — 8 C; Laufzeit 70 Minuten.
Abb. 2. Papierelektropherogramm von Hämolymphe aus
einer spinnenden Larve von Bombyx mori (14. Tag des
5. Stadiums, 2,833 g). Als Vergleichssubstanzen liefen mit:
Cvstin, Lvsin, Glycin, Histidin, Serin, Glutaminsäure und
Alanin. p H 1,93; 5000 V; 6 mA; Soletemp. — 8° C; Laufzeit 70 Minuten.
treten.
Diskussion
D r i 1 h o n und B u s n e l Bombyx-Larven
folgende
fanden im Blut
Aminosäuren:
von
Glutamin-
säure, Glycin, Tyrosin, Leucin und Cystin.
Diese
Aminosäuren nahmen während der Spinnzeit im allgemeinen ab. Ungefähr 10 Tage nach dem Einspinnen stiegen sie jedoch wieder an. Gleichzeitig konnten die Verff. einige neu auftretende
Aminosäuren
nachweisen: Histidin, Serin, Diphenylalanin (?) und
nin, Glycin, Histidin (nach Kupplung mit dem Pauly-
Prolin. Unsere Untersuchungen haben gezeigt, daß
und
Histidin und Serin schon im 5. Larvenstadium reich-
Lvsin (Abb. 1 und 2). Ein Fleck zwischen Cvstin und
lich vorhanden sind. Es ist nicht unwahrscheinlich,
Serin ist entweder auf Glutaminsäure oder auf Glut-
daß diese Aminosäuren schon in früheren
amin zurückzuführen *.
vorkommen.
Reagenz besonders gut nachweisbar), Arginin
In quantitativer Hinsicht läßt die Beurteilung der
Mit
den Ergebnissen
Stadien
von F u k u d a und
Mit-
Fleckengröße bzw. Intensität der Ninhydrinfärbung
arbb.
folgende Feststellungen zu:
lichkeiten. F u k u d a konnte mit mikrobiologischen
* Auf 2-dimensionalen Chromatogrammen
konnte
keine Glutaminsäure, sondern nur Glutamin nachgewiesen
werden.
Hämolymphe des 5. Larvenstadiums nachweisen. Auf
6
zeigen unsere Untersuchungen größere Ähn-
Methoden sehr viel Histidin, Lysin und Serin in der
Grund von Versuchen mit Seidenraupen, bei denen
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•1 oo
OOO
sich durch Herauspräparieren der Spinndrüsen
wendigerweise die Aminosäuren
not-
daß die eigentliche Peptid- und Eiweißsynthese erst
des Fibroins bzw.
Sericins in der Körperflüssigkeit anhäuften, ist F u kuda
geneigt anzunehmen, daß Glycin, Threonin,
Prolin, Serin und Tyrosin gegen E n d e des 5. Stadiums
unmittelbar vor dem Einspinnen von der Spinndrüse
aus der Hämolymphe aufgenommen werden.
Das Fehlen von Peptiden im Blut der Seidenraupe
vor Beginn der Spinnaktivität läßt uns annehmen,
in der Spinndrüse stattfindet.
Für die gewährte Gastfreundschaft am Neuen Chemischen Institut der Universität Heidelberg ist einer von
uns (J. M. D.) Herrn Prof. Dr. K. F r e u d e n b e r g und
Herrn Prof. Dr. H. Z a l i n zu großem Dank verpflichtet.
Der Biologischen Forschungsanstalt für Kleintierzucht,
Celle, danken wir für die freundliche Überlassung von
Seidenraupen.
Die Bedeutung physikalischer Faktoren für die W i r k u n g
von Heptachlordioxan auf Drosophila melanogaster M E I G .
Von
KARL
HAYDUK
und
MANFRED
LÜDICKE
Aus dem Zoologischen Institut der Universität Heidelberg
(Z. Naturforschg. 11 b, 383
388 [1956]; eingegangen am 23. Februar 1956)
Die Bedeutung der physikalischen Faktoren bei der
von H a d a w a v und B a r l o w 1 zusammenfassend
versucht, einige dieser Faktoren bei Heptachlordioxan
1. Es wurde die Sublimations-Geschwindigkeit von
Wirkung von Kontaktinsektiziden wurde
dargestellt. In vorliegender Arbeit wird
aufzuklären.
Heptachlordioxan gravimetrisch ermittelt.
2. Die Giftwirkung von Heptachlordioxan und y-Hexachlorcyclohexan auf vier Altersstufen
von Drosophila melanogaster
M e i g. wurde untersucht und eine geringe erhöhte Resistenz
älterer Tiere gegenüber jüngeren festgestellt. In der Streuung der Effektzeiten ist ein statistisch
gesicherter Unterschied zwischen den Altersstufen vorhanden.
3. Das Intoxikationsbild von Heptachlordioxan zeigt in seinen einzelnen Phasen eine gewisse
Übereinstimmung mit dem von DDT.
4. Die Giftwirkung von Heptachlordioxan ist im Rahmen der Versuchsbedingungen umgekehrt proportional der Teilchengröße.
F
Material und Methode
ür die Durchführung der Versuche wurden zwei Insektizide verwendet: Heptachlordioxan und als Vergleichspräparat die reine y-Isomere des Hexachlorcyelohexans.
Als Versuchsobjekt wurde Drosophila
melanogaster
M e i g. vg. gewählt, da die Tiere infolge ihrer Flugunfähigkeit mit dem Präparat in Dauerkontakt bleiben.
Als Testverfahren wurde das Depositverfahren bevorzugt,
da sich dieses für die Bearbeitung des gestellten Problems
günstig zeigte.
Zur Erzielung eines gleichmäßigen Belages wurden
Cellophanfolien von je 132 cm- Fläche in eine 1-proz.
ätherische Lösung des Insektizides getaucht, wobei die
Substanz auf den Folien auskristallisierte. Die mit dem
Insektizid gleichmäßig bedeckten Mittelstücke der Folien
wurden mit Gummiringen auf Holzrähmchen gespannt
und diese zu einem Kästchen von 200 cm- Gesamtfläche
und 183,25 cm3 Inhalt zusammengesetzt, das gleichfalls
mit Gummiringen zusammengehalten wurde. Die Menge
des Belages pro cm- wurde durch Wägung von abge1 A. B. H a d a w a y u. F. B a r l o w , Trans. R. Soc.
trop. Med. Hyg. 46, 236 [1952].
trennten Streifen der verwendeten Folien vor und nach
der Sublimation des Belages in Wägegläschen auf einer
Sartorius-Analysen-Dämpfungswaage ermittelt.
Der Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, daß
alle Flächen homogen mit Belag versehen sind und
durch Auswechseln der Folien ein sauberes und sicheres Arbeiten ohne umständliche Reinigung der Versuchsgefäße ermöglicht wird.
1. D i e
Sublimations-Geschwindigkeit
von
Heptachlordioxan
Bei den ersten Untersuchungen über die kontaktinsektizide Wirkung dieser Substanz - war festgestellt
worden, daß bei längerem Offenstehen der Versuchsgefäße die insektizide Wirkung des Präparates deutlich abnahm. Daher war es zunächst von Interesse,
die Sublimations-Geschwindigkeit und die damit zusammenhängenden Vorgänge zu studieren.
- M. L ü d i c k e u. W. S t u m p f , Naturwissenschaften 40, 363 [1953].
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