INAUGURAL - DISSERTATION zur Erlangung der Doktorwürde der

INAUGURAL - DISSERTATION
zur
Erlangung der Doktorwürde
der
Naturwissenschaftlich-Mathematischen
Gesamtfakultät
der
Ruprecht - Karls - Universität
Heidelberg
vorgelegt von
Diplom- Biologin Cosima Christina Kretz
aus: Bad Kreuznach
Juli 2009
Tag der mündlichen Prüfung:. . . . . . . . . . . . . . .
Apoptose im systemischen Lupus erythematodes
Einfluss auf Immunantwort und periphere Toleranz
Gutachter Prof. Dr. Lutz Gissmann
Abteilung Genomveränderungen und Karzinogenese
Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg
Prof. Dr. Peter H. Krammer
Abteilung Immungenetik
Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg
Wir glauben, Erfahrungen zu machen,
aber die Erfahrungen machen uns.
von Eugène Ionesco
(26.11.1909 - 28.03.1994)
Danksagung
Wissenschaft lebt vom Austausch und deswegen möchte ich den Menschen danken,
ohne die diese Arbeit niemals zu Stande gekommen wäre.
An erster Stelle möchte ich Prof. Dr. Annegret Kuhn für die Überlassung des Themas, die unzähligen Hilfestellungen bei klinischen und organisatorischen Fragen, ihren
stetigen Expertenrat zum Thema Lupus und ihre Betreuung danken.
Prof. Dr. Peter H. Krammer danke ich für die Aufnahme in seine Gruppe, die unermüdliche Hilfe bei der Planung und Auswertung der Experimente, seine ständige
Bereitschaft zur wissenschaftlichen Diskussion und seine Unterstützung. Seine kritische analytische Auffassung von Wissenschaft hat mich geprägt.
Prof. Dr. Lutz Gissmann danke ich für die Übernahme der Betreuung von Seiten der
Universität und das Interesse.
Meinen Kooperationspartnern in der Klinik Prof. Dr. Hanns-Martin Lorenz, Dr. Regina
Max, Prof. Dr. Ulf Müller-Ladner, Dr. Ingo Tarner und Prof. Dr. Andreas Schwarting
gilt mein besonderer Dank für die gute Zusammenarbeit. Ebenso danke ich Prof. Dr.
Lutz Edler für die Hilfestellungen bei der statistischen Auswertung.
Für ihren Enthusiasmus und ihr offenes Ohr bei allen kleineren und größeren Problemen möchte ich PD Dr. Elisabeth Suri-Payer danken.
Meinen Kollegen aus der Annexin-Gruppe Heiko, Lucie, Andrea und Björn möchte ich
für die vielen Anregungen danken. Und natürlich gilt mein Dank den Mitgliedern der
Bad side“ Sandra und Michael, die mir den Laboralltag mit ihrer humorvollen Sicht
”
der Dinge versüßt haben.
Ohne die aufgeweckte Diskussion mit dem Rest der Gruppe wären viele Probleme nicht
gelöst worden, deshalb geht ein großes Dankeschön an: Angelika, Annette, Carina, Daniel, Dirk, Eva-Maria, Gernot, Inna, Jennifer, Jie, Julia, Karsten, Marcin, Mareike,
Markus, Min, Nina, Olga, Rüdiger, Sabine und Thomas, sowie Christine und Daniela
für technische Hilfestellungen.
Zum Schluss gilt mein besonderer Dank denen, die mir am Herzen liegen: mein Vater Wolfgang Kretz, der mir früh beigebracht hat, neugierig zu sein, Dinge kritisch
zu hinterfragen, mir die Freude am Lernen vermittelt hat und mir bedingungslosen
Rückhalt bei der Suche nach meinem eigenen Weg gegeben hat; meinem Bruder Matthias, der sich von meinem Interesse für Naturwissenschaften hat anstecken lassen und
meinem Freund Ralph Rieger, der alle Höhen und Tiefen mit mir durchgestanden hat.
Danke für die Geduld und die Unterstützung.
1
Zusammenfassung
Das Immunsystem hat die Aufgabe, körperfremde Substanzen abzuwehren und Toleranz gegenüber körpereigenen Strukturen zu gewährleisten. In Autoimmunerkrankungen, wie z.B. dem systemischen Lupus erythematodes (SLE), ist der Mechanismus der Toleranz gegenüber körpereigenen Strukturen gestört. Eines der wesentlichen
phänotypischen Merkmale des SLE ist das Auftreten von Antikörpern gegen zellintrinsische Strukturen, wie z.B. gegen Bestandteile des Zellkerns oder doppelsträngige
DNA. In diesem Zusammenhang wurde von verschiedenen Gruppen beschrieben, dass
sich im peripheren Blut von Patienten mit SLE vermehrt apoptotische Leukozyten
nachweisen lassen, die zur Bildung von Antikörpern beitragen könnten. Da jeden Tag
Körperzellen in großer Zahl unter apoptotischen Bedingungen sterben, muss das Immunsystem gewährleisten, dass intrazelluläres Material nicht nach außen dringt und
dort als Gefahrensignal Zellen des Immunsystems aktiviert. In der Regel wird dies
durch die Aufnahme apoptotischer Zellen durch phagozytierende Zellen, wie z.B. dendritische Zellen (DC) und Makrophagen, erzielt. Außerdem werden insbesondere DC
nach Phagozytose von apoptotischem Material in einen weniger reaktiven Zustand
versetzt, sezernieren nach Stimulation weniger pro-inflammatorische Zytokine und exprimieren weniger kostimulatorische Moleküle auf der Zelloberfläche. Dadurch wird
die Aktivierung von autoreaktiven T-Zellen durch diese DC verhindert. Sowohl eine
erhöhte Apoptoserate als auch eine gestörte Interaktion von DC mit apoptotischen
Zellen könnten diesen Mechanismus der peripheren Toleranzinduktion aufheben.
In dieser Arbeit wurde untersucht, in wieweit Zellen von Patienten mit SLE ein verändertes Apoptoseverhalten aufweisen, und ob die Interaktion von apoptotischen Zellen
und DC dahingehend verändert ist, dass dies zu einer verminderten peripheren Toleranz führt. Hierbei konnte festgestellt werden, dass sich neutrophile Granulozyten
von Patienten mit SLE in Bezug auf die Anzahl und den zeitlichen Verlauf der Apoptose neutrophiler Granulozyten nicht von denen gesunder Kontrollen unterscheiden.
Weiterhin zeigen apoptotische neutrophile Granulozyten von Patienten mit SLE ein
vergleichbares Verhalten wie neutrophile Granulozyten von gesunden Kontrollen hinsichtlich ihrer suppressiven Eigenschaften auf DC. Außerdem ist die Stimulierbarkeit
von DC mit Lipopolysaccharid (LPS) in beiden Gruppen vergleichbar. Zusätzlich ist
die Suppression von DC durch apoptotische Zellen von Patienten mit SLE und gesunden Kontrollen nicht unterschiedlich. Ein zellintrinsischer Defekt von neutrophilen
Granulozyten und DC in Patienten mit SLE konnte somit nicht nachgewiesen werden.
Annexin 1 ist ein Molekül, das in der Abteilung von Prof. Krammer auf der Oberfläche
apoptotischer Zellen gefunden wurde und einen suppressiven Effekt auf DC ausübt. In
den durchgeführten Experimenten wurde die Expression auf der Oberfläche apoptoti-
2
scher neutrophiler Granulozyten untersucht, und die Ergebnisse deuten nicht darauf
hin, dass diese bei Patienten mit SLE gestört ist. Jedoch finden sich im Serum von
Patienten mit SLE vermehrt Antikörper gegen Annexin 1. Diese haben aber nur einen
geringen Effekt auf die Suppression von DC und die Phagozytose apoptotischer Zellen
durch DC. Es scheint deswegen unwahrscheinlich, dass dieses System beim SLE zu
Veränderungen der peripheren Toleranz führt.
Des Weiteren wurden regulatorische T-Zellen (Treg) im Blut von Patienten mit SLE
und gesunden Kontrollen quantifiziert und charakterisiert. Die Anzahl und die phänotypischen Eigenschaften von Treg erwiesen sich bei Patienten mit SLE und gesunden
Kontrollen als vergleichbar. Zusammenfassend geben diese Ergebnisse Einblick in die
Interaktion von apoptotischen Zellen und DC im Bezug auf die periphere Toleranzinduktion beim SLE.
3
Abstract
The immune system has to guarantee a strong defense against exogenous substances and has to concomitantly assure tolerance against the body´s own structures. In
autoimmune diseases, such as systemic lupus erythematosus (SLE), the mechanisms
of tolerance are often disturbed. One of the main phenotypical features of SLE is the
occurrence of antibodies against cell intrinsic structures such as anti-nuclear or antidouble stranded DNA antibodies. Several groups described elevated levels of apoptotic
leukocytes in peripheral blood of patients with SLE which could account for the generation of antibodies against cell intrinsic structures. Since apoptosis of cells is necessary
to sustain tissue homeostasis, it is essential to avoid release of intracellular material, which can act as a danger signal on immune cells. This is generally established
by phagocytosis of apoptotic cells by surrounding cells, e.g. dendritic cells (DC) and
macrophages. Furthermore, the uptake of apoptotic material enables activated DC to
secrete less proinflammatory cytokines and to express less costimulatory molecules on
their surface and thereby prevents activation of autoreactive T cells. This mechanism
can be disrupted by a higher rate of apoptotic cells or an altered interaction of DC and
apoptotic cells.
The aim of this study was to analyze if patients with SLE show alterations in apoptosis of leukocytes or the interaction of DC with apoptotic cells, which can lead to the
abrogation of peripheral tolerance. The results demonstrate that in patients with SLE,
the apoptosis rate of neutrophils seems not to be altered compared to healthy controls.
Moreover, suppressive capacity of these cells on DC is comparable between patients
with SLE and healthy controls. DC of patients with SLE show similar activation capacity after stimulation with lipopolysaccharid (LPS) compared to healthy controls,
which can be suppressed to an equal amount by apoptotic cells. The results do not account for a cell intrinsic defect of the investigated cells. In the group of Prof. Krammer,
it was recently found that annexin 1 is a molecule on the surface of apoptotic cells,
which has a suppressive effect on DC. In this study, surface expression of annexin 1
on apoptotic neutrophils was tested and shows similar results in patients with SLE
compared to healthy controls. However, elevated levels of antibodies against annexin 1
were detected in the serum of patients with SLE. Phagocytosis and suppressive effects
of apoptotic cells on DC are not altered by these antibodies making it unlikely to have
a major impact on the mechanism of tolerance induction in this disease. In addition,
regulatory T cells (Treg) were quantified and phenotypically characterized. These properties are comparable in patients with SLE and healthy controls. In summary, the
results of this study provide insight into the interaction of apoptotic cells and DC
relating to peripheral tolerance induction in SLE.
4
Abkürzungsverzeichnis
AIRE
ANA
anti-dsDNA Antikörper
ACR
APS
BCA
BILAG
C1q
cTEC
CD
CD95L
CLE
CpG DNA
CTLA-4
DC
DISC
DNA
ECLAM
ELISA
FC
FoxP3
FPR
FPRL1
GITR
HLA-DR
HMGB-1
ICOS
IDO
Ig
IL
IL-2Rβ
INFα
IPEX
iTreg
LAG-3
Autoimmunregulatorisches Element
Antinukleäre Antikörper
Autoantikörper gegen doppelsträngige DNA
American College of Rheumatology
Ammoniumpersulfat
Bicinchoninsäure
british isle lupus assesment group index
complement component 1 subcomponent q
Epithelzelle des Thymuscortex
cluster of differentiation
CD95-Ligand
cutaneous lupus erythematosus
Cytosin-Guanin-reiche DNA Sequenzen
cytotoxic T-lymphocyte activation antigen 4
dendrtitische Zelle
death inducing signaling complex
desoxyrybonucleic acid
european consensus lupus activity measurement index
enzyme-linked immunosorbent assay
fragment crystallizable
forkhead box protein 3
Formylpeptidrezeptor
Formylpeptidrezeptor Ligand 1
glucocorticoid induced TNF-α-related protein
human leukocyte antigen complex DR
high mobility box binding protein 1
induzierbarer T-Zelle Kostimulator
Indolamin-2,3-Dioxygenase
Immunglobulin
Interleukin
Interleukin 2 Rezeptor β
Interferon α
immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked
induzierte regulatorische T-Zellen
lymphocyte activation gene 3
5
LPS
Lta
MBL
MCP-1
MerTK
MFG-E8
MFI
MHC
min
mTEC
NK-Zelle
NKT-Zelle
NSAID
nTreg
PAMP
PBMC
PD-L1
PMA
PS
RAGE
RNA
RT
SLAM
SLE
SLEDAI
t
Tcon
Teff
TEMED
TGFβ
Th
TLR
TNF
Tr1
Treg
VDRL-Test
VG
Lipopolysaccharid
Lipoteichonsäure
mannosebindendes Lektin
monocyte chemoattractive protein-1
Mer-Tyrosin-Kinase
milk fat gobular protein E8
mean fluorescence intensity
major histocompatibilty complex
Minuten
Epithelzelle der Thymusmedulla
natürliche Killerzelle
natürliche Killer-T-Zelle
non-steroidal anti-inflammatory drugs
natürlich vorkommende regulatorische T-Zelle
pathogen-associated molecular pattern
peripheral blood mononuclear cell
Programmed Death Ligand 1
Phorbolmyristatacetat
Phosphatitylserin
receptor for advanced glycation endproducts
ribonucleic acid
Raumtemperatur
systemic lupus activity measure index
systemischer Lupus erythematodes
SLE disease activity index
Tag
konventionelle T-Zelle
T-Effektor-Zelle
Tetramethylethylendiamin
transforming growth factor beta
T-Helfer-Zelle
Toll-like-Rezeptor
tumor necrosis factor
regulatorische T-Zelle, die IL-10 sezerniert
regulatorische T-Zelle
venereal disease research laboratory-test auf SyphilisErreger
Vertrauensgrenze (exakt)
6
Inhaltsverzeichnis
Danksagung
1
Zusammenfassung
2
Abstract
4
Abkürzungsverzeichnis
5
1 Einleitung
1.1 Das Immunsystem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.2 Zentrale Toleranz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.3 Periphere Toleranz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.4 Regulatorische T-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.5 Tolerogene dendritische Zellen . . . . . . . . . . . . . . .
1.6 Zelltod: Apoptose und Nekrose . . . . . . . . . . . . . .
1.7 Die Rolle apoptotischer Zellen bei der Toleranzinduktion
1.8 Annexin 1 als anti-inflammatorisches Molekül . . . . . .
1.9 Systemischer Lupus Erythematodes (SLE) . . . . . . . .
1.10 Zielsetzung der Arbeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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2 Material und Methoden
2.1 Patienten- und Kontrollkollektiv . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.2 Material . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.2.1 Chemikalien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.2.2 Häufig verwendete Puffer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.2.3 Eukaryotische Zelllinien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.2.4 Verwendete Antikörper . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.2.5 Reagenzien und Geräte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.3 Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.3.1 Aufreinigung von rekombinantem Annexin 1 . . . . . . . . . . .
2.3.2 Zytokin-ELISA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.3.3 Annexin 1-ELISA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.3.4 Aufreinigung von Autoantikörpern gegen Annexin 1 aus humanem Serum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.3.5 Bestimmung der Proteinkonzentration in Lösung . . . . . . . . .
2.3.6 Immunopräzipitation von Annexin 1 durch Autoantikörper im
Serum von Patienten mit SLE . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.3.7 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) . . . . . . .
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10
10
11
13
17
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23
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34
34
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37
37
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40
41
43
43
44
45
46
46
47
47
7
2.3.8
2.3.9
2.3.10
2.3.11
2.3.12
2.3.13
2.3.14
2.3.15
2.3.16
2.3.17
2.3.18
2.3.19
2.3.20
2.3.21
Western Blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Kultivierung eukaryotischer Zellen . . . . . . . . . . . . . .
Präparation primärer humaner neutrophiler Granulozyten
Präparation primärer humaner Monozyten . . . . . . . . .
Präparation primärer humaner Lymphozyten . . . . . . . .
Differenzierung primärer humaner DC . . . . . . . . . . .
Differenzierung von U937-Zellen . . . . . . . . . . . . . . .
Apoptose-Induktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Kokultur-Experimente mit apoptotischen Zellen . . . . . .
Vybrant DiD-Markierung von J16 T-Zellen . . . . . . . . .
Phagozytose-Experimente . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Durchflusszytometrische Analyse . . . . . . . . . . . . . .
Bestimmung der Apoptose nach Nicoletti . . . . . . . . . .
Statistische Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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53
53
54
55
3 Ergebnisse
3.1 Das Apoptoseverhalten neutrophiler Granulozyten von
Patienten mit SLE zeigt keine pathologische Veränderung . . . . . . . .
3.2 Apoptotische neutrophile Granulozyten haben einen
suppressiven Effekt auf U937-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3 Primäre DC von Patienten mit SLE weichen im Bezug auf ihre Stimulierbarkeit durch Gefahrensignale nicht von DC aus gesunden Kontrollen
ab . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.4 Die Supprimierbarkeit durch apoptotische Zellen ist
bei DC von Patienten mit SLE im Vergleich zu gesunden
Kontrollen nicht vermindert . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.5 Apoptotische Zellen von Patienten mit SLE und
gesunden Kontrollen zeigen keine Unterschiede in
der Oberflächenexpression von Annexin 1 . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.6 Etablierung eines Nachweissystems für Antikörper gegen Annexin 1 im
Serum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.7 Antikörper aus dem Serum von Patienten mit SLE binden an apoptotische Jurkat T-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.8 Antikörper haben einen geringen Einfluss auf die
Supprimierbarkeit von U937-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.9 Antikörper haben einen geringen Einfluss auf die
Phagozytoserate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
56
56
57
59
62
64
66
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71
71
8
3.10 Die Anzahl der Treg unterscheidet sich nicht in Patienten mit SLE und
gesunden Kontrollen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
72
4 Diskussion
4.1 Apoptotische neutrophile Granulozyten von Patienten mit SLE und gesunden Kontrollen unterscheiden sich weder in ihrem Apoptotseverhalten noch in der Fähigkeit, die
Aktivierung von U937-Zellen zu supprimieren . . . . . . . . . . . . . .
4.2 DC von Patienten mit SLE lassen sich in gleichem Maße wie DC von gesunden Kontrollen durch Gefahrensignale stimulieren und werden durch
die Aufnahme apoptotischer Zellen supprimiert . . . . . . . . . . . . .
4.3 Das Serum von Patienten mit SLE enthält Autoantikörper gegen Annexin 1
4.4 Treg sind in Anzahl und Phänotyp nicht verändert . . . . . . . . . . .
4.5 Die Auswahl der Patienten spielt möglicherweise eine
Rolle für die erzielten Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.6 Zytokine und andere lösliche Faktoren haben einen
Einfluss auf die Toleranzinduktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.7 Modell der Krankheitsentwicklung im SLE . . . . . . . . . . . . . . . .
4.8 Ausblick . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
78
Abbildungsverzeichnis
94
Literaturverzeichnis
95
Erklärung
79
82
83
84
86
87
89
91
115
9
Cosima Kretz
1
1.1
1 Einleitung
Einleitung
Das Immunsystem
Alle Organismen sind ständig den Einflüssen der Umwelt ausgesetzt, von denen einige eine schädliche Wirkung haben können. Insbesondere Bakterien, Viren, Pilze und
Parasiten können das physiologische System des Organismus zum Erliegen bringen.
Das Immunsystem ist mit Hilfe von zellulären und humoralen Elementen in der Lage,
Erreger aus dem Organismus zu entfernen. Um eine effektive Abwehr eingedrungener
Krankheitserreger zu gewährleisten und einer Schädigung körpereigener Strukturen
vorzubeugen, dienen in Vertebraten sowohl angeborene als auch erworbene Mechanismen zur Unterscheidung von Fremd“ und Selbst“. Die Komponenten der erworbenen
”
”
Immunität weisen im Gegensatz zu den Komponenten des angeborenen Immunität eine
große Anpassungsfähigkeit ihrer Rezeptoren auf, mit denen sie eingedrungene Erreger
erkennen können. Diese Anpassungsfähigkeit birgt jedoch die Gefahr, dass körpereigene
Strukturen erkannt werden und sich das Immunsystem gegen den eigenen Organismus
richtet. Deswegen wird durch die Mechanismen der Toleranzinduktion die Nichtreaktivität der Immunzellen gegenüber körpereigenen Strukturen wirksam überwacht. Diese
Kontrolle erfolgt sowohl zentral im Knochenmark und im Thymus als auch in den peripheren Geweben.
1.2
Zentrale Toleranz
Die Zellen des Immunsystems entstehen aus Vorläuferzellen im Knochenmark. Weil
autoreaktive B- und T-Zellen eine große Gefahr für den Organismus darstellen, ist eine frühe Eliminierung besonders wichtig. Die meisten autoreaktiven B-Zellen werden
bereits im Knochenmark eliminiert (Goodnow et al. 1988; Wardemann et al. 2003),
während autoreaktiven T-Zellen im Thymus, dem Organ der zentralen T-Zell-Toleranz,
beseitigt werden (Übersicht in Kyewski and Klein 2006). Täglich wandern 10-100 TZell-Vorläufer vom Knochenmark in den Thymus (Shortman et al. 1990), proliferieren
dort und exprimieren einen jeweils einzigartigen T-Zell-Rezeptor. T-Zell-Rezeptoren
sind darauf ausgelegt, an die Moleküle des Haupthistokompartibilitätskomplex (engl.:
Major Histokompatibility Complex, MHC) zu binden, die Peptide präsentieren. Da
Epithelzellen des Thymuscortex (engl.: cortical thymic epithelial cells, cTEC) diese
10
Cosima Kretz
1 Einleitung
Moleküle auf ihrer Oberfläche exprimieren, stellen sie natürliche Interaktionspartner
für T-Zellen im Thymus dar. Beim Prozess der positiven Selektion werden durch eine
erfolgreiche Bindung des T-Zell-Rezeptors an ein MHC-Molekül Überlebenssignale in
der T-Zelle angeschaltet, während die nicht interagierenden Zellen sterben.
T-Zellen, die stark an körpereigene Peptid-MHC-Komplexe binden, stellen eine Gefahr
für den Organismus dar und werden im zweiten Schritt, der so genannten negativen Selektion, eliminiert (Abb. 1). Dazu wandern positiv selektierte Zellen vom Cortex in die
Medulla des Thymus. Hier treffen sie auf residente dendritische Zellen (DC) und thymische Epithelzellen (engl.: medullary thymic epithelial cells, mTEC), die körpereigene
Peptide auf ihren MHC-Molekülen präsentieren. Um ein möglichst breites Repertoire
körpereigener Peptide zu generieren, ist die gewebe- und entwicklungsspezifische Regulation der Genexpression in den mTEC teilweise aufgehoben und steht unter der
Kontrolle des Transkriptionsfaktors AIRE (Autoimmunregulatorisches Element) (Derbinski et al. 2001; Anderson et al. 2002). Durch diese promiskuitive Genexpression
kann auch gegen Proteine zentrale Toleranz aufgebaut werden, die nicht für die Physiologie der Thymuszellen benötigt werden. Wenn ein T-Zell-Rezeptor stark an einen
MHC-Peptid-Komplex bindet, wird die Apoptose der T-Zelle induziert. Jedoch ist die
negative Selektion kein Prozess der ein vollständiges Ergebnis erreicht. Schwach autoreaktive Zellen werden häufig nicht erkannt und entgehen der Eliminierung (Bouneaud
et al. 2000). Um dennoch einen Schutz vor Autoimmunität zu gewährleisten, existieren
die Mechanismen der sogenannten peripheren Toleranz.
1.3
Periphere Toleranz
Die periphere Toleranz stellt ein Kontrollsystem zum Schutz vor Autoimmunreaktionen dar, bei dem unterschiedliche Mechanismen eine Rolle spielen (Abb. 1). Diese
Überwachung ist wichtig, da T-Zellen, die der negativen Selektion im Thymus entgangen sind und autoreaktives Potenzial besitzen, auf Körperzellen treffen können, die
ihr spezifisches Antigen auf der Oberfläche präsentieren. Es kommt zur Bindung des
T-Zell-Rezeptors an das Antigen, und eine Signaltransduktionskaskade wird in Gang
gesetzt. Um eine vollständige Aktivierung der T-Zelle hervorzurufen, werden jedoch
zusätzlich Signale von kostimulatorischen Rezeptoren benötigt, die sich in der Regel
nur auf Immunzellen befinden. Das unvollständige Signal führt zu einer Inaktivierung
der T-Zelle. Man spricht vom Zustand der Anergie (Greenwald et al. 2005; Macian
11
Cosima Kretz
1 Einleitung
et al. 2004).
Daneben stellt die immunologische Ignoranz ein natürliches Hindernis der Autoreaktivität von T-Zellen dar. Darunter versteht man den Umstand, dass sehr viele körpereigene Peptide nur in geringen Mengen vorhanden oder für T-Zellen unzugänglich sind
(Kurts et al. 1999).
Im Mausmodell konnte gezeigt werden, dass ein weiterer Mechanismus existiert, der
dem der zentralen Toleranzinduktion sehr ähnlich ist. Stromazellen des Lymphknotens
transkribieren durch die Aktivität des Transkriptionsfaktors AIRE promiskuitiv Gene,
die physiologisch in unterschiedlichen Geweben aktiv sind und deren Produkte teilweise nur intrazellulär vorkommen. Nach der Translation präsentieren sie die Peptide, die
aus diesen Proteinen entstehen, auf MHC II-Molekülen und eliminieren T-Zellen, die
in diesem Kontext mit ihnen interagieren (Lee et al. 2007).
Da dennoch manchmal autoreaktive T-Zellen aktiviert werden, existiert zusätzlich die
Möglichkeit, eine bereits bestehende Aktivierung zu unterdrücken. Dies spielt auch bei
der Feinsteuerung von Entzündungsreaktionen im Kontext der Abwehr von Pathogenen eine Rolle. T-Zellen, die andere T-Zellen abschalten können, werden regulatorische
T-Zellen (Treg) genannt. Die durch Treg vermittelte Toleranz ist dominant und kann
durch T-Zell-Transfer auf andere Individuen übertragen werden (Kyewski and Derbinski 2004).
Des Weiteren existiert ein Mechanismus, um Toleranz gegenüber intrazellulären Antigenen aufrecht zu erhalten. Dies ist notwendig, da im Zuge der Gewebshomöostase täglich
ca. acht Milliarden Zellen sterben, aus denen intrazelluläre Proteine freigesetzt werden
könnten (Vaux and Korsmeyer 1999). Die sterbenden Zellen werden von umliegenden
Zellen und professionellen Phagozyten wie dendritischen Zellen (DC) und Makrophagen
aufgenommen, ohne diese dabei zu aktivieren. Im zweiten Schritt wandern insbesondere
die DC zu den Lymphknoten und präsentieren Antigene aus den phagozytierten Zellen
in MHC-Molekülen auf ihrer Oberfläche. T-Zellen, die in diesem Umfeld an die MHCMoleküle mit Selbst-Antigenen binden, verlieren ihre Effektorfunktion (Huang et al.
2000). Da Antigene, die über den Weg der Aufnahme aus dem Extrazellularraum in
die Zelle gelangt sind, überwiegend in Verbindung mit MHC Klasse II präsentiert werden, sind von diesem Mechanismus in erster Linie CD4+ T-Zellen betroffen. Vor allem
in DC existiert aber auch eine Verbindung zwischen den Mechanismen der Beladung
von MHC Klasse I und II, sodass körpereigene Peptide auch in MHC I-Molekülen an
CD8+ T-Zellen präsentiert werden können. Dieser Prozess wird als Kreuzpräsentation
12
Cosima Kretz
1 Einleitung
bezeichnet (Kurts et al. 1997; Albert et al. 2001). Der Aktivierungszustand der DC
ist entscheidend für die Toleranzinduktion (Lutz and Schuler 2002). DC können bei
einer Interaktion mit Pathogenen durch spezifische Signale, wie z.B. Bestandteile der
Bakterienmembran, aktiviert werden und durchlaufen einen Reifungsprozess. Ebenso
kann auch der Einfluss pro-inflammatorischer Zytokine zur Aktivierung und Reifung
der DC führen. Generell spricht man bei Signalen, die pro-inflammatorisch wirken,
von Gefahrensignalen, da sie den Organismus in einen Zustand der Abwehrbereitschaft
versetzten. DC, die nach Aufnahme von Antigenen in Abwesenheit von Gefahrensignalen nicht vollständig gereift sind, können T-Zell-Toleranz induzieren. Verschiedene
Mechanismen wie Deletion der T-Zellen, Anergisierung oder Erzeugung von Treg wurden für die Toleranzinduktion beschrieben. Es ist wahrscheinlich von der jeweiligen
Situation abhängig, welche Mechanismen eine Rolle spielen, bzw. welcher Mechanismus überwiegt.
1.4
Regulatorische T-Zellen
Bereits vor über 30 Jahren wurde die Hypothese aufgestellt, dass es eine T-ZellPopulation mit suppressiven Eigenschaften gibt (Droege 1971; Gershon et al. 1972).
Nishizuka und Sakakura (1969) beschrieben bereits vorher, dass es sich dabei um einen
Mechanismus der dominanten Toleranz handelt. Sie zeigten, dass T-Zell-vermittelte
Autoimmunerkrankungen in Mäusen auftreten, wenn den Tieren drei Tage nach der
Geburt der Thymus entfernt wurde. Die Subpopulation von T-Zellen, die normalerweise Autoimmunerkrankungen verhindert, konnte nur in Anwesenheit des Thymus
entstehen. In den darauffolgenden Jahre entbrannte ein Streit über die Existenz dieser
Subpopulation, der erst von Sakaguchi und Kollegen durch die Beschreibung muriner CD4+ T-Zellen mit suppressiven Eigenschaften (Sakaguchi et al. 1995) beigelegt
wurde. Diese Zellen exprimieren die Interleukin-2-Rezeptor-α-Kette (CD25) auf ihrer
Oberfläche und unterscheiden sich dadurch von den konventionellen CD4+ T-Zellen
(engl.: conventional T cells, Tcon). CD4+ CD25+ T-Zellen waren in der Lage Autoimmunerkrankungen zu verhindern, wenn sie in neonatal thymektomierte Mäusen
injiziert wurden (Sakaguchi et al. 1995; Suri-Payer et al. 1998). Auf Grund des regulatorischen Phänotyps wurden diese Zellen Treg genannt. Im Jahre 2001 wurde eine
T-Zell-Population mit ähnlichem Phänotyp auch im Menschen beschrieben (Dieckmann
13
Cosima Kretz
1 Einleitung
Abbildung 1: Zentrale und periphere Toleranz in Bezug auf T-Zellen. Schematische Darstellung
der Toleranzinduktion im Thymus und in der Peripherie. Autoreaktive unreife T-Zellen erkennen
im Thymus Selbstantigene im Zusammenhang mit MHC auf mTEC. Dies führt zur Induktion von
Apoptose oder konvertiert die Zellen zu Treg, die in die Peripherie auswandern und dort ihrerseits
autoreaktive T-Zellen supprimieren können. Ein Teil der autoreaktiven unreifen T-Zellen gelangt
in die Peripherie, und dort verhindern die Mechanismen der peripheren Toleranz eine schädliche
Wirkung: der Kontakt von T-Zellen mit dem Selbst-Antigen ohne kostimulatorisches Signal führt
zu Anergie. Als weitere Möglichkeit der peripheren Toleranz wird eine Reaktion gegen Selbstantingen verhindert, indem diese für die T-Zellen nicht zugänglich sind (Ignoranz). Außerdem besteht
die Möglichkeit der Induktion von Apoptose durch erneute Stimulation des T-Zellrezeptors sowie eine nachfolgende Sensitivierung durch erhöhte CD95-Expression und Stimulation von CD95
durch CD95L (CD95-Ligand).
14
Cosima Kretz
1 Einleitung
et al. 2001; Jonuleit et al. 2001). Obwohl später für bereits aktivierte Effektor-T-Zellen
(Teff) gezeigt werden konnte, dass diese ebenfalls CD25 exprimieren, ist diese Expression transient und fällt sehr viel schwächer aus.
Kokulturexperimente von Treg und Tcon in vitro zeigten, dass Treg in der Lage sind,
die Aktivierung und die Zytokin-Produktion sowie die Proliferation von CD4+ und
CD8+ T-Zellen zu unterdrücken (Piccirillo and Shevach 2001; Thornton and Shevach 1998). Die Hemmung der Aktivierung und/oder Expansion naiver T-Zellen wird
als die Hauptfunktion von Treg angesehen. Daneben können sie aber auch Teff und
Gedächtnis-T-Zellen supprimieren und B-Zellen an der Proliferation, der Produktion von Antikörpern, sowie am Wechsel der Antikörperklasse hindern (Levings et al.
2001; Suvas et al. 2003; Lim et al. 2005; Nakamura et al. 2004; Lim et al. 2005). Des
Weiteren wurde eine Hemmung zytotoxischer Zellen, wie natürlicher Killerzellen (NKZellen) und natürlicher Killer-T-Zellen (NKT-Zellen), sowie Antigen-präsentierender
Zellen wie DC beobachtet (Ghiringhelli et al. 2005; Azuma et al. 2003; Misra et al.
2004). Im Gegensatz zu Tcon proliferieren Treg nach Aktivierung nicht, da sich die
Zellen in einem Zustand der Anergie befinden.
Die Population der Treg beträgt in der Maus 5-10 % aller CD4+ -T-Zellen, während
im Menschen nur 1-2 % der CD4+ -T-Zellen einen Treg-Phänotyp aufweisen (BaecherAllan et al. 2001). Neben den natürlich vorkommenden Treg (nTreg), die im Thymus
entstehen (Sakaguchi et al. 1995, 1996), eine erhöhte Affinität zu Selbst-Peptiden aufweisen und nicht durch die negative Selektion eliminiert werden (Apostolou et al. 2002;
Gounari et al. 2001; Jordan et al. 2001; Sakaguchi et al. 2003), findet man auch induzierte Treg (iTreg). Diese können in der Peripherie aus naiven T-Zellen durch die
Blockade von CD40L in Kombination mit einer Stimulation von CD4 oder CD8, sowie durch die Stimulation mit hohen Konzentrationen von TGFβ (engl.: transforming
growth factor beta) und/oder suboptimale Stimulation des T-Zell-Rezeptors entstehen (Chen et al. 2003; Cobbold et al. 2004; Fantini et al. 2004; Fu et al. 2004; Rao
et al. 2005; Waldmann et al. 1998). Ob diese Konversion von Tcon zu Treg auch unter
physiologischen Bedingungen in nennenswertem Maße im Menschen stattfindet, ist Gegenstand der aktuellen wissenschaftlichen Debatte. Jonuleit et al. (2002) beobachteten,
dass Treg nicht nur die Proliferation von Tcon unterbinden, sondern die Zellen auch
zur Differenzierung in sogenannte Tr1- oder Th3-Zellen bringen. Diese Zellen weisen
ebenfalls einen regulatorischen Phänotyp auf und hemmen weitere Tcon über die Sekretion anti-inflammatorischer Zytokine wie Interleukin-10 (IL-10) und TGFβ. Dieses
15
Cosima Kretz
1 Einleitung
Phänomen der Übertragung des tolerogenen Phänotyps wird als infektiöse Toleranz
bezeichnet.
Der Mechanismus der Konversion von Tcon zu Treg ist weitgehend ungeklärt. In der
Maus spielen in vivo neben Zytokinen (TGFβ)(Chen et al. 2001) Antigen-präsentierende
Zellen eine wichtige Rolle, da Mäuse, die keine B7-Moleküle besitzen, keine Treg gegen
periphere Antigene erzeugen können (Lohr et al. 2003). In den meisten experimentellen
Modellen ist daher die Erzeugung von iTreg eng mit dem Auftreten tolerogener DC
verknüpft.
Phänotypisch zeichnen sich nTreg nicht nur durch die Positivität für CD4 und CD25
aus, sondern auch durch eine konstitutive intrazelluläre Expression von CTLA-4 (engl.:
cytotoxic T-lymphocyte activation antigen 4)(Read et al. 2000) und des Transkriptionsfaktors FoxP3 (engl.: forkhead box protein 3) als essentiell wichtige Faktoren für
die Aufrechterhaltung der regulatorischen Aktivität (Übersicht in Sakaguchi 2004).
CTLA-4- oder FoxP3-defiziente Mäuse entwickeln schon nach kurzer Zeit schwere
Autoimmunerkrankungen, wie z.B. Thyroiditis, Gastritis, Insulitis, Sialoadenitis, Adrenalitis, Oophoritis, Glomerulonephritis, and Polyarthritis (Waterhouse et al. 1995;
Brunkow et al. 2001; Sakaguchi et al. 1995). Nach der Aktivierung exprimieren sowohl Teff als auch Treg CTLA-4 auf der Zelloberfläche, jedoch ist die Expression auf
Treg stärker. Patienten mit Mutationen in der DNA-Bindedomäne von FoxP3 leiden
am IPEX-Syndrom (engl.: immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy,
X-linked)(Bennett et al. 2001). Das genetische Equivalent zum IPEX-Syndrom ist die
Scurfy-Maus. Es handelt sich dabei um einen Mausstamm mit X-gekoppelten rezessiven Mutationen im foxp3 -Gen, der durch lymphoproliferative Störungen charakterisiert
ist. Besonders auffällig ist dabei die exzessive Proliferation von CD4+ T-Zellen und die
starke Infiltration von Immunzellen in multiple Organe (Brunkow et al. 2001).
In den letzten Jahren wurde im Zuge der Charakterisierung von Treg verstärkt nach
einem eindeutigen Treg-Oberflächenmarker gesucht. Da die Expression von CD25 auf
menschlichen Zellen nicht sehr hoch ist, ist die Gewinnung einer reinen Treg-Population
in ausreichender Menge schwierig. Nur 1-3 % der CD4+ T-Zellen mit der höchsten
CD25-Expression haben suppressive Eigenschaften. Hinzu kommt, dass alle CD4+ TZellen nach Stimulation des T-Zell-Rezeptors CD25 exprimieren (Baecher-Allan et al.
2001). In funktionellen Kokulturexperimenten erwiesen sich jedoch nur die Zellen mit
einer sehr starken CD25-Expression als suppressiv. In weiteren Untersuchungen wurde
eine erhöhte Expression der folgenden Moleküle auf humanen Treg gefunden: GITR
16
Cosima Kretz
1 Einleitung
(engl.: glucocorticoid induced TNF-α-related protein), CD71, HLA-DR (engl.: human
leukocyte antigen complex DR), LAG-3 (engl.: lymphocyte activation gene 3), IL2Rβ (engl.: interleukin 2 receptor β, CD122), IL-2Rγ (engl.: interleukin 2 receptor γ,
CD132), PD-L1 (engl.: programmed death ligand 1), ICOS (engl.: inducible T-cell costimulator), sowie CD45RO, das auch einen Marker für Gedächtnis-T-Zellen darstellt
(Baecher-Allan et al. 2004). Die meisten der genannten Moleküle werden jedoch auch
von aktivierten T-Zellen exprimiert und eignen sich dadurch nicht als alleinige Marker
für Treg. Ein spezifischer Zelloberflächenmarker für Treg, der nicht auf aktivierten TZellen exprimiert wird, wurde bislang nicht beschrieben. In den letzen Jahren wurde
die Verwendung von IL-7Rα (engl.: interleukin 7 receptor α, CD127) in Kombination
mit CD25 zur Aufreinigung von intakten Treg vorgeschlagen, da humane Treg im Gegensatz zu aktivierten Teff kein IL-7Rα auf der Oberfläche exprimieren (Seddiki et al.
2006; Liu et al. 2006; Hartigan-O’Connor et al. 2007). Jedoch exprimierten nur ca. 60 %
der aufgereinigten IL-7Rα-negativen Population FoxP3. Außerdem ist eine nicht unbeträchtliche Population von Treg positiv für die Expression von CD127 (Klein 2007).
Bis jetzt wird der intrazelluläre Transkriptionsfaktor FoxP3 als einziger eindeutiger
Marker für Treg angesehen. FoxP3 wird jedoch auch von aktivierten T-Zellen im Menschen kurzzeitig schwach exprimiert, wodurch nur eine hohe Expression als eindeutiges
Merkmal für Treg angesehen wird.
Der molekulare Mechanismus der Hemmung durch Treg ist bisher nicht geklärt. Während in vitro- und in einigen in vivo-Modellen ein Zellkontakt zwischen Treg und Tcon
erforderlich ist, wird die Hemmung in anderen in vivo-Modellen offenbar durch die Sekretion anti-inflammatorischer Zytokine wie TGFβ und IL-10 vermittelt (Übersicht in
Vignali et al. 2008). Auffällig ist, dass die Aktivierung der Treg antigenspezifisch über
den T-Zell-Rezeptor erfolgt, die Antigenspezifität bei der anschließenden Hemmung der
Tcon jedoch keine Rolle mehr spielt (Thornton and Shevach 2000). Wenn Treg einmal
aktiviert wurden, können sie eine polyklonale T-Zell-Aktivierung unterdrücken.
1.5
Tolerogene dendritische Zellen
Neben T-Zellen spielen DC eine entscheidende Rolle für die Aufrechterhaltung der
Toleranz. Als professionelle Antigen-präsentierende Zellen sind sie in vielen Geweben und interstitiellen Räumen zu finden (Banchereau et al. 2000). Dort nehmen
17
Cosima Kretz
1 Einleitung
sie infektiöses Material durch Phagozytose oder Makropinozytose auf und verdauen es anschließend lysosomal. Die Aktivierung der DC durch das aufgenommene infektiöse Material führt zu einer Abnahme der Phagozytose-Kapazität und einer vermehrten Expression von MHC-Molekülen und kostimulatorischen Molekülen der B7Familie. Die DC präsentieren vermehrt Antigene aus dem phagozytierten Material und
wandern in die Lymphknoten, wo T-Zellen mit den präsentierten Antigenen in Kontakt kommen. Eine Aktivierung der T-Zellen hängt von den Signalen ab, die DC zur
Verfügung stellen (Lutz and Schuler 2002). Neben dem Signal durch die Bindung des
Peptid-MHC-Komplexes benötigen T-Zellen auch eine Kostimulation durch Moleküle
der B7-Familie (hauptsächlich CD80 und CD86), an die sie mit ihren Liganden, wie
z.B. CD28, binden. Auf der Seite der T-Zelle existieren aber auch inhibitorische B7Liganden, wie z.B. CTLA-4, deren Bindung in einem späteren Stadium der Immunantwort zu einer Abschaltung der Singalkaskade und damit zu einer Herunterregulation
der Entzündungsreaktion führt. Neben diesen Faktoren spielt auch der Einfluss von
Zytokine eine Rolle (Greenwald et al. 2005; Corthay 2006). DC sind z.B. in der Lage,
nach Aktivierung pro-inflammatorische Zytokine, wie z.B. TNF (engl.: tumor necrosis
factor), IL-12 und IL-6, zu sezernieren.
Meist werden DC über Toll-like-Rezeptoren (TLR) aktiviert. Diese Moleküle gehören
zum System der angeborenen Immunität. Im Menschen sind 11 und in der Maus 13 Vertreter dieser Familie beschrieben. TLR 1, 2, 4, 5 und 6 befinden sich in der äußeren Plasmamembran und erkennen so genannte pathogenassoziierte molekulare Muster (engl.:
pathogen-associated molecular pattern = PAMP) auf Zellwänden von Bakterien, z.B.
Lipopolysaccharid (LPS), Lipoteichonsäure (Lta) oder Flagellin (Janeway 1989). TLR
3, 7, 8 und 9 sind in intrazellulären Membranen lokalisiert und ragen mit der Rezeptordomäne ins Zytosol. Sie erkennen intrazelluläre Gefahrenmoleküle, wie z.B. doppelsträngige virale RNA oder bakterielle CpG DNA-Sequenzen (Lasker and Nair 2006).
DC phagozytieren nicht nur Pathogene, sondern sind auch an der Aufnahme apoptotischer Körperzellen beteiligt. Da DC im Kontext einer Infektion leicht aktiviert werden
und dadurch autoreaktive T-Zellen stimulieren können, liegt die Überlegung nahe, dass
es in diesem Zusammenhang auch tolerogene Mechanismen geben muss. In der Tat
wurde beobachtet, dass DC, die apoptotisches Material aufgenommen haben, Toleranz
hervorrufen, indem sie in T-Zellen Anergie induzieren (Hawiger et al. 2001; Kawahata
et al. 2002), Treg induzieren (Chen et al. 2003; Apostolou and von Boehmer 2004) oder
durch wiederholte Stimulation der T-Zellen diese in die Apoptose führen (deletierender
18
Cosima Kretz
1 Einleitung
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Induktion tolerogener DC. Durch Phagozytose von
apoptotischen Zellen werden DC in einen tolerogenen Zustand versetzt und unterstützen durch
Nichtreaktivität gegenüber den aufgenommenen körpereigenen Strukturen die periphere Toleranz.
Durch Gefahrensignale wie Pathogene werden DC aktiviert und und führen zu Immunität.
T-Zell-Proliferation durch aktivierungsinduzierten Zelltod) (Albert et al. 2001). Auch
hier findet also offenbar eine Unterscheidung zwischen Selbst“ und Fremd“ statt,
”
”
die eine differenzierte Reaktion der DC zur Folge hat und zur Aufrechterhaltung der
Toleranz gegen körpereigenes apoptotisches Material führt (Abb. 2).
Für tolerogene DC wurden folgende Eigenschaften in unterschiedlichen Systemen beschrieben: Antigenpräsentation, niedrige Expression von MHC und kostimulatorischen
Molekülen, wie z.B. CD80 und CD86, bei hoher Expression von PD-L1. Außerdem eine
geringe Produktion von IL-12p70 und hohe Produktion von IL-10 und IDO (Indolamin2,3-Dioxygenase), sowie Resistenz gegenüber Reifung nach Stimulation mit Gefahrensignalen über z.B. TLR. Sie können die Fähigkeit besitzen, alloantigen-spezifische nTreg
zu generieren, zu selektieren und/oder zu expandieren. Sie können außerdem Apoptose
in T-Zellen fördern und auf Treg mit Hochregulation der Expression inhibitorischer
Moleküle reagieren und rufen damit eine inhibitorische Rückkopplung hervor (Fallarino et al. 2003). Zudem sind sie in der Lage, zu den T-Zell-Zonen in den sekundären
lymphatischen Organen zu wandern. Außerdem sind sie gegenüber NK- und T-Zellvermittelter Apoptose resistent.
Zunächst wurde angenommen, dass das Reifestadium der DC eine entscheidende Rolle
in der Toleranzinduktion dieser Zellen spielt. Da Jonuleit et al. (2000) zeigen konnten,
dass Treg in vitro durch längere Kokultur von Tcon mit unreifen DC entstehen und
Huang et al. (2000) berichteten, dass mit Selbst-Antigen beladene unreife DC in der
Lage sind, in den Lymphknoten zu wandern, wurde die Hypothese aufgestellt, dass
unreife DC tolerogen sind und reife DC inflammatorisch wirken. Dieser Standpunkt
hat sich aber dahingehend gewandelt, dass ein gewisser Grad an Reife notwendig ist,
19
Cosima Kretz
1 Einleitung
um ein effizientes Prozessieren und Präsentieren der Selbstantigene zu gewährleisten.
Man spricht hier von semireifen DC, die sich durch eine erhöhte Expression von MHC
II, CD80 und CD86, sowie eine vermehrte Expression von IL-10 im Vergleich zu unreifen DC auszeichnen, aber kein TNF und IL-12 sezernieren (Lutz and Schuler 2002).
Außerdem sind diese semireifen DC in vitro im humanen System in der Lage, Tcon
in Treg zu konvertieren (Lutz and Schuler 2002). Das Zytokinmilieu spielt hierbei eine
entscheidende Rolle.
Die tolerogenen DC erweitern also das Spektrum der Zellen, die in den peripheren
Geweben für eine Aufrechterhaltung der Toleranz sorgen. Offensichtlich interagieren
sie dabei eng mit Treg, wobei positive Rückkopplungsmechanismen eine wichtige Rolle
spielen. In einer Vielzahl von Experimenten konnte sowohl gezeigt werden, dass tolerogene DC Treg induzieren (Akbari et al. 2001; McGuirk et al. 2002; Menges et al.
2002; Faunce et al. 2004), als auch umgekehrt tolerogene DC von Treg induziert werden
können (Chang et al. 2002).
1.6
Zelltod: Apoptose und Nekrose
Apoptotische Zellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Toleranzinduktion. Jeden
Tag sterben zahlreiche Zellen unter apoptotischen Bedingungen, das heißt die Zellen
werden durch bestimmte Reize dazu angeregt, ein kontrolliertes Zelltodprogramm zu
durchlaufen. Ihre Beseitigung erfolgt ohne Anzeichen einer Entzündung und trägt sogar zur peripheren Toleranz gegen Selbst-Antigene bei.
Der Begriff Apoptose leitet sich vom griechischen Wort απóπτ ωσισ ab, das das Herabfallen, z.B. der Blätter im Herbst, bezeichnet. Der Begriff wurde von Kerr et al. (1972)
geprägt, die das Prinzip des programmierten Zelltods als Gegengewicht zur kontrollierten Zellteilung erkannten. Die erste morphologische Beschreibung war bereits 130 Jahre
vorher publiziert worden (Vogt and Vogt 1842). Mikroskopisch lässt sich zunächst ein
Schrumpfen der Zelle beobachten, gefolgt von der Fragmentierung des Zellkerns und
Membranveränderungen, die zum Ausstülpen und Abschnüren apoptotischer Vesikel
(Zeiose) führen. Phagozytierende Zellen nehmen die Überreste apoptotischer Zellen
in vivo innerhalb weniger Stunden auf, sodass die Freisetzung zytoplasmatischer Bestandteile verhindert wird (Savill et al. 1993).
Eine Vielzahl externer und interner Stimuli, wie z.B. ultraviolette (UV)- oder γ-Strahlung, Entzug von Wachstumsfaktoren, Chemotherapeutika oder die Stimulation soge-
20
Cosima Kretz
1 Einleitung
nannter Todesrezeptoren sind in der Lage, Apoptose auszulösen. Ein sehr gut untersuchtes System ist das CD95-Rezeptorsystem (Peter and Krammer 2003). Durch Bindung von CD95-Ligand kommt es zur Trimerisierung des CD95-Rezeptors (Apo-1/Fas),
und dadurch kann das Adaptermolekül FADD an den intrazellulären Teil des Rezeptors
binden. FADD rekrutiert nachfolgend Procaspase-8 und der Tod-induzierenden Signalkomplexes (engl.: death-inducing signaling complex, DISC) wird gebildet. Die Aggregation von CD95 ermöglicht eine lokale Anhäufung von Caspasen. Die vorhandene
intrinsische katalytische Aktivität führt zur proteolytischen Spaltung und Aktivierung
von Caspase-8. Diese frühen apoptotischen Signale werden von den Initiatorcaspasen-8,
-9 und -10 übermittelt, die nachfolgend die Effektorcaspasen-3, -6, und -7 aktivieren.
Effektorcaspasen führen zur Spaltung der sogenannten Todessubstrate und dadurch
zum Tod der Zelle (Lavrik et al. 2003). Dieser Weg wird auf Grund seiner Abhängigkeit
von einer externen Stimulation der Todesrezeptoren als extrinsischer Apoptoseweg bezeichnet.
Dem gegenüber steht der intrinsische Apoptoseweg, der durch interne Stimuli ausgelöst
wird. Dabei führen intrazelluläre Stress- und Schadenssensoren, wie zum Beispiel die
Proteine Bim, Bax und Bak, zur Bildung von Poren in der inneren Mitochondrienmembran (Huang et al. 2000), wodurch Cytochrom c und weitere proapoptotische Moleküle
aus den Mitochondrien in das Zytosol übertreten (Green and Reed 1998). Cytochrom c
bildet dort mit dem Adaptormolekül Apaf-1 (engl.: apoptotic protease activating factor
1) und Procaspase-9 einen multimeren Komplex, der als Apoptosom bezeichnet wird
(Zou et al. 1997; Adams and Cory 2002). Nachfolgend wird Procaspase-9 gespalten
und aktiviert und führt wiederum zu einer Aktivierung der Effektorcaspasen. Durch
anschließende Spaltung struktureller Bestandteile des Zellgerüsts kommt es dann zu
mikroskopisch sichtbaren Veränderungen der Zellmembran und zur Bildung apoptotischer Vesikel (Janicke et al. 1998).
Im Gegensatz dazu stellt die Nekrose einen Caspase-unabhängigen Zelltod dar, der
entsteht, wenn die Zelle physikalisch so stark geschädigt wird, dass ein Einleiten der
Apoptose nicht mehr möglich ist. Dies ist z.B. der Fall, wenn durch Hitze oder Frosteinwirkung die Proteine der Zelle denaturieren oder Salze auskristallieren. Auch durch
starke UV-Strahlung kann dieser Zustand ausgelöst werden, wenn die DNA quervernetzt wird und die Transkription von Proteinen, die für die Apoptose benötigt werden,
nicht mehr stattfinden kann.
Nekrose ist mikroskopisch betrachtet durch ein schnelles Anschwellen der Zelle und
21
Cosima Kretz
1 Einleitung
nachfolgend durch den Verlust der Membranintegrität, der zu einem Ausschütten des
Zellinhalts führt, gekennzeichnet. Dadurch werden Epitope für T-Zellen zugänglich, mit
denen sie sonst nicht in Berührung kommen, da sie durch die Zellmembran geschützt
sind. Zudem werden Substanzen freigesetzt, die als Gefahrensignale (Janeway 1992;
Matzinger 1994) auf Zellen des Immunsystems wirken, unter anderem ATP, Harnsäure,
Hitzeschockproteine und HMGB-1 (engl.: high mobility box binding protein 1) (Hanley et al. 2004; Shi et al. 2003; Binder et al. 2000; Scaffidi et al. 2002), das in der
intakten Zellen an DNA bindet, bei der Nekrose jedoch auch ungebunden freigesetzt
wird. HMGB-1 kann zu einer Aktivierung von DC, Macrophagen, Monozyten und
neutrophilen Granulozyten durch Bindung an TLR 2 und 4 und RAGE (engl.: receptor for advanced glycation endproducts) führen. Nekrotische Zellen können auch zur
Stimulation autoreaktiver T-Zellen führen, besonders da die intrazelluläre Epitope im
Kontext einer Immunaktivierung erkannt werden. Da nekrotische Zellen auch sekundär
aus apoptotischen Zellen entstehen können, die nicht schnell genug phagozytiert wurden (Wyllie et al. 1980), stellen sie eine Gefahr für die Aufrechterhaltung der Toleranz
dar und dies kann zur Entstehung von Autoimmunerkrankungen führen.
1.7
Die Rolle apoptotischer Zellen bei der Toleranzinduktion
Phagozytierende Zellen können apoptotische Zellen erkennen und aufnehmen (Franc
2002; Parnaik et al. 2000). Aber wie können sie sterbende von lebenden Zellen unterscheiden? Durch Forschungsergebnisse der letzten Jahre wurde deutlich, dass apoptotische Zellen aktiv an ihrer eigenen Aufnahme beteiligt sind (Lauber et al. 2003). Durch
ein System an Signalen machen sie auf sich aufmerksam und initiieren ihre eigene
Phagozytose. Lebende Zellen tragen Strukturen auf ihrer Membran, die sie vor einer
Aufnahme schützen und die als Don´t-eat-me“-Signale bezeichnet werden. Zu ihnen
”
gehören CD31 und CD47. CD31 interagiert mit nativ gefalteten CD31-Molekülen der
Phagozyten und führt zu einer Abstoßung der Zellen (Brown et al. 2002). CD47 interagiert mit SIRPα (engl.: signal regulatory protein alpha), und diese Interaktion führt
auch zu einer Abstoßung von lebender Zelle und Phagozyt. Apoptotische Zellen verlieren oder modifizieren diese Signale, sodass es zur Bindung der Zellen durch Phagozyten
kommt (Brown et al. 2002; Gardai et al. 2005). Zusätzlich wird ihre Aufnahme durch
die Präsentation von so genannten Eat-me“-Signalen positiv beeinflusst (Übersicht in
”
22
Cosima Kretz
1 Einleitung
Fadok et al. 1992). Außerdem sezernieren sie Moleküle, die Phagozyten anlocken und
dadurch die Aufnahme beschleunigen. Diese werden als Find-me“-Signale bezeichnet,
”
zu denen z.B. Lysophosphatidylcholin gehört (Lauber et al. 2003).
Die Systeme zur Aufnahme apoptotischer Zellen weisen eine hohe Redundanz auf. Das
spiegelt sich in der Beobachtung wider, dass Antikörper gegen einzelne Komponenten
die Phagozytose nur teilweise blockieren (Verbovetski et al. 2002; Devitt et al. 1998;
Moffatt et al. 1999; Chang et al. 1999; Ogden et al. 2001). Allerdings hat sich im
Maussystem gezeigt, dass schon das Fehlen eines einzelnen Moleküls die Phagozytose
erheblich vermindern und zu Autoimmunerkrankungen führen kann. Dies wurde für
die Moleküle MerTK (Mer-Tyrosin-Kinase), MFG-E8 (engl.: milk fat gobular protein
E8), C1q (engl.: complement component 1 subcomponent q), CD14 und MBL (Mannosebindendes Lektin) nachgewiesen (Cohen et al. 2002; Hanayama et al. 2004; Sen
et al. 2007).
Die Phagozytose apoptotischer Zellen führt in der Regel nicht zu einer Aktivierung
von Makrophagen und DC. Im Gegenteil lässt sich sogar beobachten, dass nach einer späteren Stimulation mit LPS die Sekretion pro-inflammatorischer Zytokine wie
TNF, IL-12 und IL-6 vermindert und die Sekretion anti-inflammatorischer Zytokine
wie TGFβ und IL-10 erhöht ist (Voll et al. 1997; Kim et al. 2004; Byrne and Reen
2002; Fadok et al. 1998). Dies geht mit einer verminderten Expression kostimulatorischer B7-Moleküle einher (Ip and Lau 2004; Stuart et al. 2002). Außerdem wurde
gezeigt, dass sterbende Lymphozyten IL-10 und apoptotische Thymozyten TGFβ sezernieren (Gao et al. 1998; Chen et al. 2001). Das anti-inflammatorische Zytokinmilieu
ist offensichtlicht notwendig für die Toleranzinduktion in Phagozyten, scheint aber allein nicht ausreichend zu sein, da die Inhibition durch Zellkontakt mit der apoptotischen
Zelle erfolgt und nicht von löslichen Faktoren abhängt (Cvetanovic and Ucker 2004;
Weyd 2006).
1.8
Annexin 1 als anti-inflammatorisches Molekül
Die Familie der Annexine stellt eine Gruppe von evolutionär konservierten Kalziumund Lipid-bindenden Proteinen dar. Ihre Vertreter finden sich in Wirbeltieren, Pflanzen, Pilzen und Protisten, jedoch nicht in Hefen und Prokaryoten (Benz and Hofmann
1997; Morgan and Fernandez 1997). Bislang sind über 160 Annexine bekannt, die in
23
Cosima Kretz
1 Einleitung
mehr als 65 Spezies vorkommen.
In Wirbeltieren sind zwölf Annexine beschrieben worden, die wahrscheinlich durch
Genduplikationen entstanden sind. Jedoch sind nicht alle Vertreter in allen Geweben
vorhanden. Die gewebespezifische Expression wird auch als Annexin-Fingerabdruck bezeichnet (Gerke and Moss 2002).
Strukturell weisen Annexine einen hochkonservierten C-terminalen Kern und einen für
das jeweilige Familienmitglied spezifischen N-Terminus auf (Übersicht in Gerke and
Moss 2002). Der Kern enthält kalziumbindende Domänen, mit denen das Molekül nach
seiner Externalisierung über eine Interaktion mit Phosphatidylserin-gebundenem Kalzium an die Oberfläche der Zelle binden kann. Diese Externalisierung wurde bei Annexin 1, 2, 4 und 5 unter anderem im Rahmen früher apoptotischer Ereignisse beobachtet
(Weyd 2006; Gerke and Moss 2002). Der Mechanismus der Translokation ist ungeklärt.
Weiterhin ist unklar, ob es sich um ein aktives oder passives Ereignis handelt. Generell wurden für die Annexine mehrheitlich intrazelluläre Funktionen beschrieben, z.B.
wird ihnen eine Rolle bei der Aggregation von Membranen, bei der Organisation von
Membranstrukturen und beim Vesikeltransport zugeschrieben.
Allgemein ist die Funktion der Annexine unzureichend untersucht, jedoch lässt sich
darüber spekulieren, dass diese Proteinfamilie grundlegende Aufgaben übernimmt.
Dafür spricht ihre starke evolutionäre Konservierung. Zudem kann man annehmen,
dass die Familienmitglieder eine gewisse funktionale Redundanz aufweisen, da knockout-Mäuse für die Annexine 5, 6 und 7 keinen starken Phänotyp zeigen (Brachvogel
et al. 2003; Hawkins et al. 1999; Herr et al. 2001).
Wie alle Annexine kann Annexin 1 strukturell und funktionell in den lipid- und kalziumbindenden Kern und den spezifischen N-Terminus unterteilt werden. Der N-Terminus
besteht aus 40 Aminosäuren und bildet in Abwesenheit von Kalzium eine α-Helix, die
in die Kerndomäne inseriert (Rosengarth et al. 2001). In Anwesenheit von Kalzium
wird der N-Terminus freigegeben und steht für Interaktionen mit anderen Molekülen
zur Verfügung. Der N-Terminus ist sehr anfällig für proteolytische Spaltung. Dies kann
z.B. spontan, nach Stimulation mit Phorbolestern oder im Verlauf der Apoptose geschehen (Liu et al. 1995; Debret et al. 2003). Möglicherweise spielt hierbei eine membranständige Metalloprotease eine Rolle (Movitz and Dahlgren 2000). Die funktionelle
Bedeutung der Abspaltung des N-Terminus ist unklar.
Eine konstitutive Expression von Annexin 1 findet sich vor allem in Zellen des Immunsystems, im Nervensystem und in verschiedenen Epithelien (Morand et al. 1995; Dreier
24
Cosima Kretz
1 Einleitung
et al. 1998). Bei neutrophilen Granulozyten kann Annexin 1 1-4 % der zytosolischen
Proteine ausmachen. T-Zellen, Makrophagen, NK-Zellen und DC besitzen ebenfalls eine hohe Annexin 1-Expression, während das Protein in B-Zellen und Erythrozyten nicht
oder nur in geringem Maße nachweisbar ist. In anderen Geweben beobachtete man eine differenzierungs- oder stressabhängige Induktion. In der Leber kann Annexin 1 zum
Beispiel in der Embryonalentwicklung und während der Regeneration nachgewiesen
werden (Della Gaspera et al. 2001; Masaki et al. 1994).
Annexin 1 wurde seit seiner Entdeckung mit anti-inflammatorischen Effekten in Verbindung gebracht. Dabei werden der N-Terminus und eine als Antiflammin bezeichnete
Sequenz im Kernbereich als aktive Domänen diskutiert (Miele 2000). Glukokortikoide,
die therapeutisch zur Entzündungshemmung eingesetzt werden, tragen in vitro und in
vivo zu einer erhöhten Expression von Annexin 1 bei (Solito et al. 1994; Castro-Caldas
et al. 2002). Im Zusammenhang mit Glukokortikoiden wurde auch eine Externalisierung von Annexin 1 an die Zelloberfläche beschrieben (Castro-Caldas et al. 2002). Die
anti-inflammatorischen Eigenschaften von Annexin 1 beruhen zum Teil auf Inhibition
der Phospholipase A2 (Wallner et al. 1986). Neueren Erkenntnissen zu Folge handelt
es sich wahrscheinlich um eine unspezifische Hemmung, da Annexin 1 durch seine Bindung an negativ geladene Phospholipide die Substrate der Enzyme maskiert (Bastian
et al. 1993; Raynal et al. 1993).
Die glukokortikoid-assoziierten Wirkungen wurden auch in der Annexin 1 knock-outMaus bestätigt. Diese zeigt eine verminderte anti-inflammatorische Reaktion auf Glukokortikoide (Hannon et al. 2003). Perretti et al. (1993) und Duncan et al. (1993)
bestätigten diese Ergebnisse, indem sie in mehreren Entzündungsmodellen die Wirkung
von Glukokortikoiden durch die Injektion von Antikörpern gegen Annexin 1 aufheben
konnten. Im Allgemeinen lässt sich eine erhöhte Sensitivität der Annexin 1-knock-outMaus gegenüber Entzündungen feststellen (Hannon et al. 2003; Roviezzo et al. 2002;
Yang et al. 2004). Des Weiteren ist die Expression von Adhäsionsmolekülen auf Lymphozyten gestört, und polymorphkernige Granulozyten zeigen eine vermehrte spontane
Einwanderung ins Gewebe. Dieser Effekt wurde bereits von Getting et al. (1997) beschrieben, die nachweisen konnten, dass extrazelluläres Annexin 1 auf neutrophilen
Granulozyten die Adhäsion an aktiviertes Endothel und damit die Extravasation in
entzündetes Gewebe vermindert. Mechanistisch kann die Adhäsion zum einen durch
das Abwerfen (engl.: shedding) von L-Selektin-Molekülen von der Oberfläche von neutrophilen Granulozyten, zum anderen über eine Interaktion mit dem Formylpeptidre25
Cosima Kretz
1 Einleitung
zeptor (FPR) oder dem verwandten Protein FPRL1 (Formylpeptidrezeptor Ligand 1)
auf Endothelzellen verringert werden (Walther et al. 2000; Perretti et al. 2001; Gavins
et al. 2003).
Annexin 1 hat auch einen Effekt auf Monozyten und Makrophagen, indem es die Migration von Monozyten hemmt (Getting et al. 1997) und die Stickstoffmonoxid-Produktion
der murinen Makrophagen-Zellinie J774 in vitro nach Stimulation mit LPS reduziert
(Ferlazzo et al. 2003). Zudem wird von einer weitergehenden tolerogenen Wirkung
ausgegangen. In unserer Arbeitsgruppe konnte nachgewiesen werden, dass Annexin 1
die TNF-Sekretion von primären DC nach Stimulation mit LPS hemmt. Ähnliche Ergebnisse ergaben sich für die monozytische Zellinie U937, die sich zu Zellen mit DCEigenschaften differenzieren lässt. Apoptotische Zellen üben denselben Effekt aus, und
es konnte nachgewiesen werden, dass Annexin 1 in einem frühen Stadium der Apoptose
externalisiert wird und an Phosphatidylserin (PS) auf der Oberfläche bindet. Mit Antikörpern gegen Annexin 1 kann der Effekt teilweise aufgehoben werden (Weyd 2006;
Dörner 2007). Eine Rolle als Eat-me“-Signal bei der Phagozytose, wie von Arur et al.
”
(2003) beschrieben, konnte in unserem Labor nicht bestätigt werden. Annexin 1 stellt
somit einen vielversprechenden Kanditaten für die Toleranzvermittlung durch apoptotische Zellen dar.
1.9
Systemischer Lupus Erythematodes (SLE)
Der systemische Lupus erythematodes (SLE) ist eine heterogene humane Autoimmunerkrankung, über deren Ätiologie und Pathogenese noch wenig bekannt ist. Die ersten
Beschreibungen von Symptomen dieser Erkrankung datieren wahrscheinlich zurück ins
Mittelalter, unter anderem erwähnt Rogerius, ein berühmter Chirurg des 12. Jahrhunderts, erstmals 1230 die charakteristischen rötlichen Hautläsionen in seinen Aufzeichnungen (Hepburn 2001). Der Name der Krankheit wurde jedoch durch Cazénave (1851)
geprägt, der die Bezeichnung lupus érythémateaux“ verwendete, um die verschiede”
nen Formen des Lupus erythematodes von der kutanen Tuberkulose (Lupus vulgaris)
abzugrenzen (Kuhn and Beissert 2005). Die Bezeichnung leitet sich von lat.: lupus =
Wolf“ und griech.: ρύθηµα = Röte“ ab und beschreibt die typischen Hautläsionen
”
”
( Schmetterlingserythem“), die angeblich Wolfbissen ähneln sollen. Kaposi beschrieb
”
1872 den Lupus erythematodes als eine Erkrankung, die auch systemische Organe be-
26
Cosima Kretz
1 Einleitung
fallen kann (Isenberg et al. 2008).
Mit einer Inzidenz von 2,0 bis 7,6 Fällen von 100.000 Personen pro Jahr und einer
Prävalenz von 17 bis 48 von 100.000 Personen gehört der SLE, zumindest in Deutschland, zu den seltenen Erkrankungen (Tebbe and Orfanos 1997). Frauen sind häufiger
betroffen als Männer, es wird ein Verhältnis zwischen Frauen und Männern von neun zu
eins beschrieben (Kuhn and Beissert 2005; Masi and Kaslow 1978). Das hormonelle Milieu spielt in der Pathogenese des SLE wahrscheinlich eine Rolle, da Neuerkrankungen
häufig im Zuge der pubertären Hormonumstellung auftreten und nach der Menopause
selten sind (Wilder 1998; Costenbader et al. 2007). Berghofer et al. (2006) konnten im
Gegensatz dazu zeigen, dass die Produktion von Interferon alpha (IFNα) bei Frauen
nach Stimulation von TLR 7 doppelt so hoch ist wie bei männlichen Kontrollen, und
dass diese Beobachtung nicht im Zusammenhang mit Östrogenen oder einer schlechten
Kontrolle des stillgelegten zweiten X-Chromosoms steht.
Um der Heterogenität des SLE gerecht zu werden (Abb. 3) und trotzdem eine weitgehend gesicherte Diagnose zu ermöglichen, wurden die elf Kriterien der amerikanischen
Gesellschaft für Rheumatologie (engl.: American College of Rheumatology, ACR) 1982
entwickelt und 1997 modifiziert (Tan et al. 1982; Hochberg 1997). Mindestens vier der
folgenden Kriterien müssen gleichzeitig oder sequentiell erfüllt sein, um die Diagnose
eines SLE als bestätigt anzusehen:
Tabelle 1: Die 11 Kriterien zur Klassifikation des SLE von dem amerikanischen College für
Rheumatologie (ACR), 1982 herrausgegeben.
Kriterium/Beschreibung
1. Schmetterlingserythem
2. Diskoide Hautläsionen
3. Photosensitivität
4. Orale Ulzera
5. Nicht deformierende Athritis
6. Serositis
7. Funktionsstörung der Niere
Persistierend mehr als 0,5 g Eiweiß pro Tag im Urin oder krankhafte Harnsedimente wie Blutreste oder Harnzylinder
8. Funktionsstörung des Zentralnervensystems
9. Hämatologische Symptome
27
Cosima Kretz
1 Einleitung
Hämolytische Anämie mit Retikulozytose, Leukopenie (weniger als 4.000 Leukozyten pro mm bei mindestens zwei Messungen), Lymphopenie (weniger als
1.500 Lymphozyten pro mm bei mindestens zwei Messungen), Thrombozytopenie
(weniger als 100.000 Trombozyten pro mm in Abwesenheit von beeinflussenden
Medikamenten)
10. Immunologische Funktionsstörungen
Anti-dsDNA Antikörper gegen native DNA gerichtet, anti-Sm Antikörper, antiPhospholipid Antikörper (positive Reaktion an mindestens zwei Messungen, die
mindestens sechs Wochen auseinander liegen),erhöhte IgG- oder stark erhöhte
IgM-anti-Cardiolipin Antikörper, Lupus-Antikoagulans Antikörper oder positiver
serologischer Test auf Syphilis (VDRL-Test, engl.: Venereal Disease Research
Laboratory Test)
11. Autoantikörper gegen Zellkernbestandteile
Erhöhte Titer von ANA (engl.: antinuclear antibodies = ANA) nachgewiesen
durch Immunfluoreszenz oder equivalente Tests zu jedem beliebigen Zeitpunkt
in Abwesenheit von Medikamenten, die für eine Assoziation mit Medikamenteninduziertem Lupus erythematodes bekannt sind
SLE ist eine Erkrankung, bei der die Symptome oft in Schüben auftreten und die
lebensbedrohlich verlaufen kann. Nicht selten kann es zur Zerstörung lebenswichtiger
Organe wie z.B. der Nieren im Laufe einer Krankheitsgeschichte kommen. Um den
Aktivitätsstatus der Erkrankung zu bestimmen, bedient man sich unterschiedlicher
Bewertungssysteme. Es werden z.B. der SLE disease activity index“ (SLEDAI), der
”
Systemic Lupus Activity Measure“ - Index (SLAM), der British Isles Lupus Assess”
”
ment Group“-Index (BILAG) und der European Consensus Lupus Activity Measure”
ment“-Index (ECLAM) verwendet (Bencivelli et al. 1992; Vitali et al. 1992; Gladman
et al. 1992). Die einzelnen Bewertungssysteme unterscheiden sich in den evaluierten
Parametern, korrelieren aber bezüglich der ermittelten Aktivität des SLE miteinander
(Aringer and Smolen 2006). Mit dem ECLAM werden 17 klinische Parameter und 8
Laborparameter erfasst, wobei sich die Laborparameter in 6 organbezogene und 2 aktivitätsbezogene unterteilen (Aringer and Smolen 2006). Dieser Index eignet sich am
besten, um die Aktivität des SLE retrospektiv zu beurteilen. Mit dem SLEDAI werden insgesamt 15 klinische Parameter, sowie 5 organbezogene und 2 aktivitätsbezogene
Laborparameter evaluiert. Dieser Bewertungsindex wurde bereits in vielen Studien zur
28
Cosima Kretz
1 Einleitung
Abbildung 3: Krankheitsmerkmale des SLE. (A) Schmetterlingserythem, (B) Arthritis
(Röntgenaufnahme einer Hand), (C) Orale Ulzera und (D) ANA (Antikörper aus dem Serum von
Patienten mit SLE binden an Zellkerne und wurden mit einem fluoreszierenden Antikörper gegen
humanes IgG sichbar gemacht). Quellen: (A) und (C) (Kuhn et al. 2007) Aufnahmen wurden von
der Hautklinik Münster freundlicherweise zur Verfügung gestellt, (B) Aufnahme wurden von PD
Dr. Becker und der Radiologie der Universitätsklinik Münster freundlicherweise zur Verfügung
gestellt,(D) eigene Aufnahmen Prof. Dr. Kuhn, Münster.
Analyse von Treg bei Patienten mit SLE verwendet und auf Grund der besseren Vergleichbarkeit mit diesen Studien auch in diese Arbeit einbezogen.
Einzelne Merkmale wie das Auftreten von Autoantikörpern spielen eine große Rolle in
der Pathogenese der SLE, da sie schon häufig Jahre vor der klinischen Manifestation
nachweisbar sein können und ihr Titer mit dem Aktivitätsstatus der Erkrankung korrelieren kann. Dies gilt insbesondere für Autoantikörper gegen doppelsträngige DNA
(anti-dsDNA Antikörper), deren Titer oft mit der Aktivität der Krankheit ansteigt.
Auch kann die Anwesenheit solcher Antikörper mit einer Beteiligung bestimmter Organe wie z.B. den Nieren korrelieren (Riboldi et al. 2005; Weitzman and Walker 1977).
Das sehr heterogene Krankheitsbild und die systemischen Entzündungsreaktionen erschweren jedoch die Untersuchung der Phathogenese des SLE teilweise erheblich, sodass wenige Ursachen dieser Krankheit bis heute definiert werden konnten. Auch ist zu
29
Cosima Kretz
1 Einleitung
erwähnen, dass primäre krankheitsauslösende Zustände häufig von sekundären Symptomen, die sich im Verlauf der Erkrankung ausbilden können, schwierig zu unterscheiden
sind.
Mit Hilfe von in vitro- und ex vivo-Experimenten ist versucht worden, die immunologischen Veränderungen von Patienten mit SLE folgendermaßen zu erklären: Bei Patienten mit SLE sind die B-Zellen hyperreaktiv (Tanaka et al. 1988; Folzenlogen et al.
1997; Grammer et al. 2004), und die Anzahl aktivierter B-Zellen ist erhöht; demzufolge
kommt es zur Bildung von zirkulierenden IgM- und IgG-Antikörpern (Klinman et al.
1991). Weiterhin ist die Signaltransduktion des B-Zell-Rezeptors gestört (Liossis et al.
1996), und die Zellen sind anfälliger für eine unspezifische polyklonale Aktivierung
(Mok et al. 2004). Erhöhte IL-6- und IL-10-Konzentrationen im Serum begünstigen
einen Wechsel der Antikörperklasse von IgM zu IgG und die Differenzierung der BZellen zu Antikörper-produzierenden Plasmazellen (Linker-Israeli et al. 1991; Monneaux and Muller 2002; Mok et al. 2004; Rousset et al. 1995; Tyrrell-Price et al. 2001;
Fairhurst et al. 2006). Zusätzlich ist die Anzahl der aktivierten T-Zellen im Blut erhöht,
jedoch produzieren die Zellen wenig IL-2 (Landry 1977; Alcocer-Varela and AlarconSegovia 1982). Weiterhin differenzieren die CD4+ T-Zellen vornehmlich zu Th2-Zellen,
die die B-Zell-Hilfe und den Wechsel der Antikörperklasse zu IgG begünstigen (LinkerIsraeli et al. 1991).
Eine der häufigst genannten Hypothesen zur Pathogenese des SLE besagt, dass neutrophile Granulozyten, Monozyten und Makrophagen eine reduzierte Phagozytose apoptotischer Zellen aufweisen, die in geringerem Maße von Komplement vermittelt und von
Fc-Rezeptoren verstärkt wird (Landry 1977; Bijl et al. 2006; Shoshan et al. 2001; Salmon et al. 1984). Weiterhin sind DC, die apoptotisches Material aufgenommen haben,
im Vergleich zu DC von gesunden Kontrollen in der Lage, T-Zellen zu aktivieren (Blanco et al. 2001). Im Immunsystem eines Patienten mit SLE werden plasmazytoide DC
aktiviert und sezernieren als Folge IFNα (Lovgren et al. 2004; Blanco et al. 2001).
Daneben sind ebenfalls die Serum-Spiegel der Zytokine IL-1β, IL-6, IL-10, IL-15, IL-16
und IL-18 erhöht (Mok and Lau 2003; Fairhurst et al. 2006). Zusätzlich enthält das
Serum große Mengen Antikörper, z.B. gegen nukleäre Antigene, doppelsträngige DNA,
Komponenten des endoplasmatischen Retikulums, C1q, Phospholipide und Annexin 1
(Tan et al. 1997; Tan and Kunkel 2006; Harris 1990; Casciola-Rosen et al. 1994; Goulding et al. 1989). Auf Grund dieser Veränderungen ist das Serum von Patienten mit
SLE in der Lage, die Differenzierung von Monozyten zu DC zu induzieren (Blanco et al.
30
Cosima Kretz
1 Einleitung
2001).
Aus diesen Beobachtungen lässt sich die folgende hypothetische Pathogenese des SLE
herleiten: Im Gewebe treten vermehrt apoptotische Zellen auf, da entweder mehr Zellen sterben oder die apoptotischen Zellen weniger effizient von umliegenden Zellen
oder professionellen Phagozyten aufgenommen werden. Die Aufnahme verzögert sich,
die Zellen verlieren ihre Membranintegrität, intrazelluläre Gefahrensignale werden ins
umliegende Gewebe abgegeben. Phagozyten nehmen apoptotisches Material in diesem Kontext auf und werden aktiviert. Nachfolgend sezernieren Makrophagen und DC
pro-inflammatorische Zytokine und exprimieren kostimulatorische Moleküle für die Interaktion mit T-Zellen. Danach wird die Reifung der DC eingeleitet und nicht wie im
Normalzustand unterdrückt. Daraufhin wandern die DC in den Lymphknoten und aktivieren autoreaktive CD4+ T-Zellen. Die T-Zellen aktivieren nachfolgend autoreaktive
B-Zellen und induzieren einen Wechsel der Antikörperklasse. Diese autoreaktiven BZellen produzieren IgM- sowie IgG-Antikörper gegen körpereigene Antigene aus den
apoptotischen Zellen.
Falls erneut vermehrt apoptotische Zellen auftreten, setzt eine positive Rückkopplung
ein, die auf Dauer zur klinischen Manifestation einer Autoimmunerkrankung führt.
Die autoreaktiven Antikörper erkennen Epitope auf der Oberfläche der apoptotischen
Zellen oder im Inneren der sekundär nekrotischen Zellen. Es kommt zu einer vermehrten Aufnahme über Fc-Rezeptoren, die zusätzlich durch eine geringe Konzentration an
Komplementproteinen begünstigt wird. Die Aufnahme über Fc-Rezeptoren ist mit der
Opsonisierung eines Pathogens assoziiert und bewirkt eine Aktivierung des Phagozyten (Kavai and Szegedi 2007). Weiteres apoptotisches Material wird im Lymphknoten
präsentiert und führt potenziell zur Aktivierung weiterer autoreaktiver B-Zellen und
der Produktion weiterer autoreaktiver Antikörper. Die Antikörper bilden mit ihren
Antigenen Immunkomplexe, die von den Phagozyten in nicht ausreichendem Maße
entsorgt werden und zu entzündlichen Ablagerungen in verschiedenen Organen, wie
z.B. den Nieren, führen. Die chronische Aktivierung des Immunsystems führt im Extremfall zur Zerstörung des Organs.
Das oben beschriebene Modell legt nahe, dass mehrere Kontrollstellen der peripheren Toleranz ausgeschaltet sind, die bei unterschiedlichen Patienten verschieden sein
können. ANA sind bei fast 5 % der älteren Bevölkerung nachweisbar, ohne dass dieser
Befund mit einem starken Risiko für eine Autoimmunerkrankung verbunden ist (Ruffatti et al. 1990). Es müssen also weitere Faktoren hinzukommen, um das Immunsystem
31
Cosima Kretz
1 Einleitung
zu beinflussen, eigenes Gewebe anzugreifen. Eine Möglichkeit ist eine weitreichende
Störung der Aufnahme apoptotischer Zellen. Menschen mit einer C1q-Defizienz, denen
somit das erste Protein der Komplementkaskade fehlt, entwickeln mit einer Penetranz
von 95 % SLE (Petry 1998).
Darüber hinaus besitzt SLE eine genetische Komponente. Mehrere Chromosomenabschnitte werden mit einem erhöhten Risiko, an SLE zu erkranken, in Verbindung gebracht. Der Zwilling eines Patienten erkrankt mit 25-50 % Wahrscheinlichkeit auch an
einem SLE (Fairhurst et al. 2006; Mok et al. 2004), sodass davon ausgegangen werden
kann, dass einige der beobachteten zellulären Defekte auf genetische Prädisposition
zurückzuführen sind, während andere Unregelmäßigkeiten durch Umwelteinflüsse wie
Infektionen oder Allergene zu erklären sind.
Apoptotische Zellen können nach der aufgezeigten Hypothese die Hauptquelle für Autoantigene in Patienten mit SLE darstellen. Die Aufnahme dieser Zellen würde in Patienten mit SLE statt zu einer immunologisch unauffälligen oder vorteilhaften Entsorgung
zu einer Entzündungsreaktion gegenüber apoptotischen Antigenen führen, wodurch
die periphere Toleranz gegen diese Antigene aufgehoben würde (Casciola-Rosen et al.
1994; Rosen and Casciola-Rosen 1999; Voll et al. 1997). Die Untersuchung der Zellen
von Patienten mit SLE kann daher möglicherweise Aufschluss darüber geben, wie bei
gesunden Menschen die Toleranz gegenüber apoptotischem Material aufrechterhalten
wird. Besondere Beachtung verdient in diesem Zusammenhang die Tatsache, dass einige Patienten mit SLE Antikörper gegen Moleküle aufweisen, die bei der Interaktion
von Phagozyt und apoptotischer Zelle eine Rolle spielen, wie zum Beispiel C1q, Phospholipide und Annexin 1.
1.10
Zielsetzung der Arbeit
Die Interaktion von apoptotischen Zellen und DC spielt eine entscheidende Rolle bei
der Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz. Ist diese gestört, so kann es zu Autoimmunreaktionen kommen. Es wurde beschrieben, dass sich vermehrt apoptotische
Zellen im Blut von Patienten mit SLE finden. ANA und anti-dsDNA Antikörper sind
bei der Mehrheit der Patienten eine phänotypische Ausprägung der Krankheit. Da diese Strukturen normalerweise nur beim Absterben von Zellen zugänglich werden, könnte
im SLE ein Defekt auf Seiten der apoptotischen Zelle oder der phagozytierenden DC
32
Cosima Kretz
1 Einleitung
vorliegen.
Ziel der Arbeit war es, das Apoptoseverhalten von neutrophilen Granulozyten aus dem
peripheren Blut von Patienten mit SLE im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen zu
charakterisieren. An Hand eines in vitro-Systems sollte die suppressive Wirkung auf
U937, eine monozytische Zellinie mit DC ähnlichen Eigenschaften, analysiert werden.
Des Weiteren sollten DC aus monozytischen Vorläuferzellen in beiden Gruppen auf ihre
Stimulierbarkeit und Supprimierbarkeit mit apoptotischen Zellen untersucht werden.
Ein besonderes Augenmerk sollte auf dem Einfluss von Annexin 1 in diesen Systemen gelegt werden. Daneben sollten Treg quantifiziert und charakterisiert werden, um
einen Einblick in die Regulationsmechanismen auf Seiten der T-Zellen zu bekommen.
Auf diese Weise sollten unterschiedliche Aspekte analysiert werden, die Rückschlüsse
auf die in vivo Mechanismen der peripheren Toleranz beim SLE zulassen könnten.
33
Cosima Kretz
2
2.1
2 Material und Methoden
Material und Methoden
Patienten- und Kontrollkollektiv
Im Zeitraum von Juni 2006 bis August 2008 wurden in Frage kommende Patienten
aus der Abteilung Rheumatologie der Medizinischen Klinik V der Universitätsklinik
Heidelberg (Leiter: Prof. Dr. Hanns-Martin Lorenz) und der Abteilung Rheumatologie der Kerkhoff-Klinik Bad Nauheim (Direktor: Prof. Dr. Ulf Müller-Ladner), sowie
der Abteilung Nephrologie der I. Medizinischen Klinik der Universitätsklinik Mainz
(Direktor: Prof. Dr. Andreas Schwarting) auf eine Teilnahme an der Studie angesprochen. Die Studie wurde von der Ethikkommission der Universität Heidelberg bewilligt
(Ethikantrag 202/2005) und gemäß des Helsinki-Abkommes durchgeführt. Alle Patienten und Kontrollpersonen, denen Blut abgenommen wurden, erteilten schriftlich ihr
Einverständnis zur freiwilligen Teilnahme an der Studie.
Das wichtigste Einschlusskriterium für die Auswahl der Patienten für alle Studien war
die gesicherte Diagnose eines SLE, d.h. die Erfüllung von mindestens 4 der ACRKriterien. In dieser Studie wurden der ECLAM und der SLEDAI verwendet, um die
Patienten aus unterschiedlichen Kliniken miteinander vergleichen zu können. Für die
Untersuchung zum Einfluss von Apoptose auf die periphere Toleranz wurden insgesamt
19 Patienten mit SLE und 19 gesunde Kontrollpersonen eingeschlossen. Der ECLAM
wurde als Maß für die Aktivität der Krankheit verwendet, da er eine hohe Akzeptanz
in Europa genießt und auch retrospektiv erhoben werden kann. Um die Vergleichbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten, wurden zusätzlich sechs SLE Patienten an zwei
unabhängigen Terminen und bei einem Patienten an drei unabhängigen Terminen analysiert. Als gesunde Kontrollen wurden nach Möglichkeit Spender mit gleichem Alter
und Geschlecht verwendet, um die Vergleichbarkeit der Daten zu gewährleisten.
Das durchschnittliche Alter der Patienten mit SLE betrug 39,1 ± 13,6 Jahre (17 weibliche, 2 männlich) und bei den Kontrollpersonen 30,1 ± 8 Jahre (17 weiblich, 2 männlich).
Die demographischen und klinischen Daten finden sich in Tabelle 1, aus datenschutzrechtlichen Gründen wurden die Namen durch Nummern ersetzt.
34
Cosima Kretz
2 Material und Methoden
Tabelle 2: Demographische und klinische Daten der Patienten mit SLE, die in Apoptose- und
Suppressionsexperimente eingeschlossen wurden.
No.
Alter
m/w
Serologie
Therapie
1
33
2
ECLAM
w
ANA, dsDNA
AM
5
21
m
ANA, dsDNA
IS, CSm
2
3
39
w
ANA, dsDNA
-
1
4
18
w
ANA, dsDNA, Ro/SSA, La/SSB
IS , CSm
3
5
74
w
ANA, dsDNA, Ro/SSA
IS, CSn
3
6
58
w
ANA, dsDNA
IS, CSn
1
7
62
w
ANA, RNP
AM, CSn
3
8
42
w
ANA, dsDNA, Ro/SSA
IS , CSn
2
9
39
w
ANA, dsDNA, ACA, La/SSB
IS, AM, CSn
3,5
10
35
w
ANA, dsDNA
AM, CSn
2,5
11
43
m
ANA, dsDNA, RNP
IS, CSm
1
12
27
w
ANA, ds DNA, Ro/SSA, La/SSB
IS, AM
0
13
37
w
ANA, dsDNA, Scl 70
-
1
14
42
w
ANA, dsDNA
IS, CSn
3
15
45
w
-
IS
2
16
32
w
ANA, dsDNA
AM, CSn
17
30
w
ANA, dsDNA
CSh
18
24
w
ANA, dsDNA
AM, CDn
1,5
19
42
w
ANA
AM, CSn
0
0,5
2
ANA: antinukleäre Antikörper; dsDNA: anti-doppelsträngige DNA Antikörper; ACA: antiCardiolipin Antikörper; AM: Antimalariamittel; CS: Glucocorticosteroide (n = niedrig:
< 10 mg/Tag, m = medium: 10-20 mg/Tag, h = hoch > 20 mg/Tag); IS: Immunsuppressiva
Für die Untersuchungen zur Charakterisierung von Treg beim SLE wurden 20 Patienten und 20 gesunde Kontrollen eingeschlossen. Um die Vergleichbarkeit mit anderen
Studien zu gewährleisten, wurde der SLEDAI als Aktivitätsindex verwendet. Die Patienten wurden nach SLEDAI in die Gruppe mit passiver Erkrankung (SLEDAI ±4;
12 Patienten) bzw. mit aktiver Erkrankung (SLEDAI >4; 8 Patienten) eingeteilt. Das
durchschnittliche Alter der Patienten mit SLE betrug 41,9 ± 12,9 Jahre (18 weiblich,
2 männlich) und das der gesunden Kontrollen lag bei 39,6 ± 13,2 Jahre (8 weiblich, 12
männlich). Die demographischen und klinischen Daten finden sich in Tabelle 2.
35
Cosima Kretz
2 Material und Methoden
Tabelle 3: Demographische und klinische Daten der Patienten mit SLE, die in Treg-Experimente
eingeschlossen wurden.
No.
Alter
m/w
Serologie
Therapie
1
52
2
SLEDAI
w
ANA, dsDNA, Ro/SS-A, RNP
medium CS, IS
2
33
w
ANA, dsDNA, ACA
CSn , AM
0
3
33
w
ANA, dsDNA
CSn , IS, AM
0
4
44
w
ANA; dsDNA
-
4
5
43
w
ANA, dsDNA, ACA
AM
2
6
41
m
ANA, dsDNA, nRNP, CL
CSh , IS
1
7
25
w
ANA, dsDNA, H, Scl-70, CL
CSn , IS, NSAR
9
8
26
w
ANA*, dsDNA, ACA, LA
CSn , IS
4
9
34
w
ANA, dsDNA
CSm , IS
4
10
46
w
ANA, dsDNA*
CSn , IS
0
11
73
w
ANA, dsDNA, Ro/SS-A, La/SS-B
CSn
8
12
41
w
ANA, dsDNA*, SM, nRNP
CSn , IS, AM
2
13
69
w
ANA, dsDNA, ACA, LA, low C3
-
16
14
20
w
ANA, dsDNA, N, H
CSn , IS, AM
2
15
44
m
ANA, dsDNA, low C4
CSm , IS
18
16
38
w
ANA, dsDNA, Scl-70
CSm , AM
4
17
40
w
ANA, dsDNA, La/SS-B, CL, low C3
CSn , IS
7
18
25
w
ANA, dsDNA, N, low C3
CSn , AM
5
19
57
w
ANA, dsDNA, N
CSm , IS, NSAR
15
20
65
w
ANA, dsDNA, N
CSn
8
*positiv in früheren Tests; ANA: antinukleäre Antikörper; ANCA: anti-Neutrophilen Zytoplasma
Antikörper; ACA: anti-Cardiolipin Antikörper; dsDNA: anti-doppelsträngige DNA Antikörper;
H: anti-Histon Antikörper; LA: Lupus Anticoagulant; La/SS-B: anti-La/SS-B Antikörper; N:
anti-Nucleosomen Antikörper; Ro/SS-A: anti-Ro/SS-A Antikörper; AM: Antimalariamittel; CS:
Glucocorticosteroide (n = niedrig: < 10 mg/Tag, m = medium: 10-20 mg/Tag, h = hoch
> 20 mg/Tag); IS: Immunosuppressiva (Azathioprin, Cyclosporin A, Cyclophosphamid, Methotrexat, Mycophenolat Mofetil), NSAID: nicht steroide anti-entzündliche Medikamente (engl.:
non-steroidal anti-inflammatory drugs)
Für die Untersuchungen zum Nachweis von Antikörpern gegen Annexin 1 im Serum
wurden Seren von 42 Patienten mit SLE (37 weiblich, 5 männlich, Alter: 41,7±13,0; 18
Patienten entsprechen den Patienten in Tabelle 1), 65 Patienten mit CLE (46 weiblich,
19 männlich, Alter: 49,9±14,8) und 56 gesunde Kontrollen (33 weiblich, 23 männlich,
Alter: 29,9±9,2) verwendet.
36
Cosima Kretz
2.2
2 Material und Methoden
Material
2.2.1
Chemikalien
Chemikalien wurden, wenn nicht anders angegeben, von den Firmen Serva (Heidelberg), Fluka (NeuUlm), Sigma (München), Roth (Karlsruhe), und Merck (Darmstadt)
bezogen.
2.2.2
Häufig verwendete Puffer
Puffer
Zusammensetzung
Annexin-Bindepuffer
10 mM
HEPES
140 mM
NaCl
2,5 mM
CaCl2 (pH 7,4)
100 mM
Natriumcarbonat (pH 9,6)
Beschichtungspuffer
(ELISA)
Blockierungspuffer 1
(ELISA)
PBS
10 % (v/v)
Blockierungspuffer 2
(ELISA)
FCS
TBS
5 % (v/v)
Blockierungspuffer 3
BSA
PBS
(Western Blot)
5 % (w/v)
Milchpulver
Citratpuffer
0,03 M
Zitronensäure
(ELISA)
0,07 M
Natriumcitrat (pH 5,0)
Elutionspuffer
0,1 M
Glycin (pH 4,0)
FACS-Puffer
PBS
10 % (v/v)
FCS
Laufpuffer
25 mM
TrisHCl
(SDSPAGE)
0,19 M
Glycin
1 % (w/v)
SDS
Lysepuffer
150 mM
NaCl
(eukaryotisch)
30 mM
TrisHCl (pH 7,5)
1 mM
PMSF
10 %(w/v)
Glycerol
1 %(w/v)
TritonX100
37
Cosima Kretz
2 Material und Methoden
1 Tablette
Complete
Proteaseinhibitor
/500 ml Puffer
Lysepuffer
500 mM
NaCl
(prokaryotisch)
50 mM
NaH2 PO4
10 mM
Imidazol
5 mM
TrisHCl (pH 7,0)
0,5 mg/ml
Lysozym
1 % (w/v)
Complete
Proteaseinhibitor-
Cocktail
MACS-Puffer
PBS
0,5 % (w/v)
HSA
2 mM
EDTA
Neutralisationspuffer
1M
TrisHCl (pH 8,0)
Nicolettipuffer
0,1 % (w/v)
Natriumcitrat
0,1 % (w/v)
Triton X100
50 µg/ml
Propidiumiodid
0,5 mg/ml
o-Phenylendiamin
0,1 % (v/v)
H2 O2
137 mM
NaCl
8,1 mM
Na2 HPO4
2,7 mM
KCl
1,5 mM
KH2 PO4 (pH 7,4)
Probenpuffer reduz. (5x)
50 % (v/v)
Glycerol
(SDS-PAGE)
10 % (w/v)
SDS
50 mM
TrisHCl (pH 6,8)
25 % (v/v)
β-Mercaptoethanol
0,25 mg/ml
Bromphenolblau
Sammelgel
24 mM
TrisHCl(pH 6,8)
(SDSPAGE)
5 % (w/v)
Acrylamid
0,1 % (w/v)
SDS
0,1 % (w/v)
APS
0,1 % (w/v)
TEMED
Spaltungspuffer
50 mM
TrisHCl(pH 7,0)
(Proteinaufreinigung)
150 mM
NaCl
OPD-Lösung (ELISA)
PBS
38
Cosima Kretz
2 Material und Methoden
1 mM
EDTA
1 mM
DTT
20 mM
TrisHCL (pH 7,4)
120 mM
NaCL
Transferpuffer
25 mM
TrisHCl
(Western Blot)
0,19 M
Glycin
20 % (v/v)
Methanol
0,037 % (w/v)
SDS
Trenngel
37,5 mM
TrisHCl (pH 8,8)
(SDS-PAGE)
10 % (w/v)
Acrylamid
0,1 % (w/v)
SDS
0,03 % (w/v)
APS
0,1 % (w/v)
TEMED
TST
50 mM
TrisHCl (pH 7,6)
(Proteinaufreinigung)
150 mM
NaCl
0,05 %(v/v)
Tween 20
TBS
Waschpuffer 1
PBS
(Zytokin-ELISA)
0,05 % (v/v)
Waschpuffer 2
Tween 20
TBS
(Annexin 1-ELISA)
0,05 % (v/v)
Waschpuffer 3
Tween 20
PBS
(Western Blot)
0,05 % (w/v)
Tween 20
HAc
0,5 M
Essigsäure (pH 3,4)
5 mM
Ammoniumacetat (pH 5)
Proteinaufreinigung)
NH4 Ac
(Proteinaufreinigung)
2.2.3
Eukaryotische Zelllinien
Zellinie
Herkunft
Referenz
Jurkat
Humanes T-Zell-Lymphom
Schneider and Schwenk 1977
U937
Humanes Histiocytom
Sundstrom and Nilsson 1976
39
Cosima Kretz
2.2.4
2 Material und Methoden
Verwendete Antikörper
Name
Antigen
Herkunft/Referenz
DAC5
Annexin 1
(Weyd 2006)
Annexin 1
BD Pharmingen, Heidelberg
CCR6
BD Pharmingen, Heidelberg
CD4
BD Pharmingen, Heidelberg
CD11b
Immuno Tools, Friesoythe
CD11b
Caltag Laboratories, Burlingame,
Maus (IgG2a)
anti-Annexin 1
Maus (IgG1)
anti-CCR6 Alexa 647
Maus (IgG1)
anti-CD4 PerCP
Maus (IgG1)
anti-CD11b FITC
Maus (IgG2a)
anti-CD11b PE
USA
Maus (IgG1)
anti-CD11c FITC
CD11c
Caltag Laboratories, Burlingame,
USA
Maus (IgG1)
anti-CD14 FITC
CD14
BD Pharmingen, Heidelberg
CD25
BD Pharmingen, Heidelberg
CD27
eBioscience, San Diego, USA
CD31
Immunotech, Marseille, Frankreich
CD45RO
BD Pharmingen, Heidelberg
CD62L
BD Pharmingen, Heidelberg
CD80
BD Pharmingen, Heidelberg
CD83
BD Pharmingen, Heidelberg
Maus (IgG2a)
anti-CD25 APC-Cy7
Maus (IgG1)
anti-CD27 APC
Maus (IgG)
anti-CD31 FITC
Maus (IgG1)
anti-CD45RO PE-Cy7
Maus (IgG2a)
anti-CD62L PE
Maus (IgG1)
anti-CD80 FITC
Maus (IgG1)
anti-CD83 APC
40
Cosima Kretz
2 Material und Methoden
Maus (IgG1)
anti-CD86 PE
CD86
BD Pharmingen, Heidelberg
FoxP3
eBioscience, San Diego, USA
HLA-DR
BD Pharmingen, Heidelberg
IgG
BD Pharmingen, Heidelberg
IgG
BD Pharmingen, Heidelberg
Erk 1
R&D Systems, Wiesbaden
Tubulin
Sigma, München
Maus IgG
Santa Cruz, Santa Cruz, USA
-
BD Pharmingen, Heidelberg
-
BD Pharmingen, Heidelberg
-
eBioscience, San Diego, USA
-
BD Pharmingen, Heidelberg
Maus (IgG2b)
anti-FoxP3 PE
Maus (IgG2a)
anti-HLA-DR APC
Maus (IgG2b)
anti-human IgG APC
Maus (IgG1)
anti-human IgG HRP
Maus (IgG1)
anti-Erk
Maus (IgG1)
anti-Tubulin
Maus (IgG1)
anti-Maus IgG HRP
Ziege polyklonal
Maus IgG1 Isotyp APC
Maus (IgG1)
Maus IgG1 Isotyp FITC
Maus (IgG1)
Maus IgG2a Isotyp PE
Maus (IgG2a)
Maus IgG2b Isotyp APC
Maus (IgGb)
2.2.5
Reagenzien und Geräte
Gerät/Reagenz
Hersteller
7-AAD (7-Aminoactinomycin D)
Sigma, München
Ammoniumperoxodisulfat
Sigma, München
Annexin 5 FITC
Caltag Laboratories, Burlingame, USA
BCA-Kit
Pierce, Rockford, IL, USA
Benzonase
Merck, Darmstadt
41
Cosima Kretz
2 Material und Methoden
Biocoll-Lösung
Biochrom, Berlin
Bovines Serumalbumin (BSA)
Sigma, München
Complete Proteaseinhibitor
Roche, Mannheim
Durchflusszytometer FACS-DIVA
Becton Dickinson, San Jose, USA
Vybrant DiD
Molecular Probes, Eugene, USA
ELISA-Photometer
Victor, Wallac, Gaithersburg, USA
ECL-Lösungen
Amersham, Little Chalfont, England
Fix/Perm Konzentrat
eBioscience, San Diego, USA
Fix/Perm Verdünner
eBioscience, San Diego, USA
Fötales Kälberserum (FCS)
Gibco BRL, Karlsruhe
Gefrierschrank -20◦ C
Liebherr, Ochsenhausen
Gefrierschrank -80◦ C
Forma Scientific (Thermo), Dreieich
Glutamax
Gibco BRL, Karlsruhe
GSH-Sepharose-Kügelchen
Amersham, Little Chalfont, England
Humanes GMCSF
R Schering, Berlin
Leukine,
Humanes IL4
Immunotools, Friesoythe
Humanes Serumalbumin (HSA)
Baxter, Unterschleißheim
IgG-Sepharose
Amersham, Little Chalfont, England
Inkubator für die Zellkultur
Steri-Cult, Forma Scientific (Thermo),
Dreieich
IPTG
Roth, Karlsruhe
Kanamycin
Sigma, München
Kühlzentrifuge Megafuge 3.0 RS
Heraeus (Thermo), Dreieich
LB-Medium
Invitrogen, Carlsbad, USA
LPS (aus E. coli 026:B6)
Sigma, München
LS-Säulen
Miltenyi, Gladbach
Magnetische Kügelchen
Miltenyi, Gladbach
gekoppelt an anti-CD14
Mausserum
Dako, Glostrup, Dänemark
β-Mercaptoethanol
Neolab, Heidelberg
Mikroskop Axiovert 25
Zeiss, Jena
OptiEIA Zytokin-ELISA Kit
BD Pharmingen, Heidelberg
42
Cosima Kretz
2 Material und Methoden
Pepsin-Agarose
Pierce, Rockford, USA
Permeabilisierungspuffer
eBioscience, San Diego, USA
Phorbol Myristat Acetat(PMA)
Sigma, München
Polymorphprep
Axis Shield, Oslo, Norwegen
PreScission Protease
Amersham, Little Chalfont,England
Protein-A-Sepharose
Amersham, Little Chalfont,England
RPMI-Medium
Gibco BRL, Karlsruhe
SDS-PAGE und Westernblot-Apparatur
Mini Protean II, BioRad, München
sterile Werkbank SteriGARD Hood
Baker, Sanford, USA
Tetramethylendiamin (TEMED)
Sigma, München
Tischzentrifuge Biofuge Fresco
Heraeus (Thermo), Dreieich
Trypsin/EDTA
Gibco BRL, Karlsruhe
UV-Strahler Stratalinker 2400
Stratagene, La Jolla, USA
Zählkammer n. Neubauer
HBG, Lützellinden
2.3
2.3.1
Methoden
Aufreinigung von rekombinantem Annexin 1
Humanes Annexin 1 wurde freundlicherweise von Björn Linke aus der Abteilung Immungenetik, Schwerpunkt Tumorimmunologie, Deutsches Krebsforschungszentrum, Leiter Prof. Dr. Peter H. Krammer, zur Verfügung gestellt. Die Präparation erfolgte nach
dem folgenden Protokoll: Im Rahmen der Masterarbeit von Isabel Vogler aus derselben Abteilung wurden die Konstrukte zur bakteriellen Expression von rekombinantem
humanen und murinen Annexin 1 hergestellt und ein Protokoll zur Aufreinigung entwickelt (Vogler 2005). Für die Aufreinigung wurde die DNA-Sequenz von Annexin 1
zunächst um die Sequenz für einen Abschnitt aus bakteriellem Protein A ergänzt. Das
veränderte Annexin 1 wurde in BL21(DE3)pLysS pTK1 E. coli-Zellen mit Hilfe des
bakteriellen Expressionsvektors pET41a(+) exprimiert. Insgesamt wurden 300 ml Vorkultur in LB-Medium mit 50 µg/ml Kanamycin angeimpft und über Nacht bei 37◦ C
unter Schütteln (220 rpm) inkubiert. Anschließend wurde die Vorkultur 1:10 verdünnt
und bis zu einer OD600 von 0,6 unter Schütteln kultiviert. Die Expression von Annexin 1 wurde durch Zugabe von 1 mM IPTG induziert. Nach 4 h wurden die Bakterien
30 min bei 2.070 x g und 4◦ C pelletiert und einmal mit PBS gewaschen. Das Pellet wur-
43
Cosima Kretz
2 Material und Methoden
de gewogen und in einem vierfachen Volumen bakteriellen Lysepuffer unter Schütteln
30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lyse erfolgte durch fünfmaliges Einfrieren in
flüssigem Stickstoff und anschließendes Auftauen im Wasserbad bei 37◦ C. Unterdessen
wurden pro Milliliter Lysat 200 µl Protein-G-Sepharose-6-Kügelchen in einem Zentrifugenröhrchen mit je 50 ml der folgenden Puffer für 10 min bei 4◦ C rollend äquilibriert:
2 x TST, 1 x HAc, 1 x TST 1 x HAc, 2 x TST. Die Zentrifugationen erfolgten für 5 min
bei 2.500 x g und 4◦ C. Nach Beendigung der Lyse wurde das Bakterienlysat mit Benzonase im Verhältnis 1:2000 versetzt und 30-60 min bei Raumtemperatur geschüttelt, bis
die Lösung flüssig wurde. Nach Zentrifugation für 30 min bei 13.300 x g und 4◦ C wurde
der Überstand des Bakterienlysats auf die äquilibrierten Sepharose-Kügelchen gegeben
und 12 h bei 4◦ C rollend inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Kügelchen 5 min
bei 2500 x g und 4◦ C zentrifugiert und nach vollständigem Entfernen des Überstandes
mit je 50 ml der folgenden Puffer je 10 min bei 4◦ C rollend gewaschen: 3 x TST,
1 x NH4 Ac, 1 x Spaltungspuffer. Zu je 100 µl Kügelchen wurden 250 µl Spaltungspuffer und 8 Einheiten PreScission-Protease gegeben, um das Annexin 1-Konstrukt
von der Protein A-Domäne zu trennen, die an den Kügelchen verblieb. Die Proteolyse
erfolgte rollend über Nacht bei 4◦ C. Danach wurden die IgG-Kügelchen 10 min bei
1.840 x g und 4◦ C zentrifugiert und der Überstand in ein neues Röhrchen überführt.
Die Kügelchen wurden ein weiteres Mal mit einem kleinen Volumen Spaltungspuffer
gewaschen. Die Überstände beider Zentrifugationen wurden vereinigt. Die PreScissionProtease trug ein GST-Tag und wurde im folgenden Schritt über eine Inkubation mit
GSH-Kügelchen aus der Präparation entfernt. Für 3 Liter Ursprungskultur wurde 4 ml
GSH-Kügelchen 5 min bei 460 x g und 4◦ C pelletiert und der Überstand vollständig
entfernt. Die Äquilibrierung der Kügelchen erfolgte durch zweimaliges Waschen mit
50 ml kaltem PBS. Die Proteinlösung wurde zugegeben, und das Gemisch 2 h bei 4◦ C
rollend inkubiert. Die anschließende Zentrifugation erfolgte für 5 min bei 460 x g und
4◦ C und wurde mehrfach wiederholt, um in der Lösung verbliebene GSH-Kügelchen zu
entfernen. Schließlich wurde die Proteinlösung gegen PBS dialysiert (MWCO 10.000)
und bei 4◦ C gelagert.
2.3.2
Zytokin-ELISA
Der ELISA (engl.: enzyme-linked immunosorbent assay) ist eine Methode zum Nachweis löslicher Proteine. Die spezifische Erkennung erfolgt durch Antikörper und kann
44
Cosima Kretz
2 Material und Methoden
durch eine Enzymreaktion detektiert und quantifiziert werden. Ein Vorteil dieser Methode gegenüber dem Western Blot ist, dass das Protein in seiner nativen Struktur
erkannt wird und der Nachweis quantitativ erfolgt. Zur Bestimmung der Konzentration
von TNF wurden OptiEIA-Kits der Firma BD Pharmingen verwendet, die nach dem
Sandwich-ELISA-System aufgebaut sind. Protein-Standards und Antikörper wurden
nach Herstellerangaben verdünnt. Das Volumen der Proben und des Standards betrug
abweichend von den Angaben des Herstellers 50 µl pro Loch, da 96-Loch-Platten mit
der Hälfte der Standard-Fläche verwendet wurden. Die Beschichtung der Platten mit
Fänger-Antikörper in Beschichtungspuffer erfolgte über Nacht bei 4◦ C. Danach wurden
die Platten fünfmal mit Waschpuffer 1 gewaschen und zur Absättigung unspezifischer
Proteinbindungsstellen für 1 h bei Raumtemperatur (RT) mit Blockierungspuffer 1
inkubiert. Nach fünfmaligem Waschen wurde der Zellkulturüberstand auf die Platten
gegeben und 1,5 h inkubiert. Im Anschluss wurden die Platten fünfmal gewaschen
und für 1 h bei RT mit dem Detektions-Antikörper und Streptavidin-Peroxidase inkubiert. Nach achtmaligem Waschen erfolgte die Entwicklung mit OPD-Substratlösung
(5-10 min). Die Reaktion wurde mit 25 µl 1,5 M H2 SO4 abgestoppt und die Farbintensität bei 490 nm im ELISA-Photometer bestimmt.
2.3.3
Annexin 1-ELISA
Zum Nachweis von Autoantikörpern gegen Annexin 1 in humanem Serum wurde ein
ELISA-System etabliert. Dabei wurde 96-Well-Platten mit 5 µg/ml rekombinantem
Annexin 1 in Annexin-Bindepuffer 2 h bei RT beschichtet. Zur internen Kontrolle der
Spezifität wurde nur die Hälfte der Wells mit Annexin 1 inkubiert, die andere Hälfte
wurde nur mit Annexin-Bindepuffer behandelt. Anschließend wurde die Platte dreimal mit Waschpuffer 2 gewaschen und anschließend mit Blockierungspuffer 2 für 2 h
inkubiert, um unspezifische Bindungsstellen abzusättigen. Danach wurde die Platte erneut dreimal mit Waschpuffer 2 gewaschen. Die zu testenden Serum wurden in einer
Verdünnung von 1:20 in Blockierungspuffer 2 verdünnt und sowohl auf die mit Annexin 1 beschichtete Seite, als auch auf die unbeschichetet Seite aufgetragen. Durch
die Werte der unbeschichteten Seite ließ sich bei der Detektion die unspezifische Bindung der einzelnen Seren bestimmen und dieser Wert wurde vom Wert auf der Seite
mit Annexin 1-Beschichtung abgezogen. Als Referenz wurde ein positives Serum verwendet, das in 1:10, 1:20 und 1:40 Verdünnung aufgetragen wurde, und als weitere
interne Kontrollen wurden drei negative Seren auf jeder Platte mitgeführt, die eben45
Cosima Kretz
2 Material und Methoden
falls 1:20 verdünnt wurden. Nach einer Inkubation von 40 min bei RT wurde die Platte
fünfmal mit Waschpuffer 2 gewaschen und dann mit anti-human IgG HRP-Antikörper
für 40 min bei RT inkubiert, in einer 1:1000 Verdünnung in Blockierungspuffer 2.
Nach achtmaligem Waschen mit Waschpuffer 2 erfolgte die Entwicklung mit OPDSubstratlösung (3 min). Die Reaktion wurde mit 25 µl 1,5 M H2 SO4 abgestoppt und
die Farbintensität bei 490 nm im ELISA-Photometer bestimmt. Nach Abzug der individuellen Hintergrundwerte von der nciht beschichteten Seite der Platte, wurd die 1:10
Verdünnung des positiven Serums als 100 %-Wert gesetzt und alle weiteren Messwerte
prozentual darauf bezogen.
2.3.4
Aufreinigung von Autoantikörpern gegen Annexin 1 aus humanem
Serum
Im Serum ist neben Antikörpern auch eine Vielzahl von anderen Proteinen enthalten.
Um die Eigenschaften der Antikörperfraktion zu untersuchen, ist es notwendig diese
vom restlichen Serum abzutrennen. Eine Möglichkeit besteht darin, zur Aufreinigung
Protein A-Sepharose zu verwenden. Protein A bindet spezifisch Immunglobuline. Die
Isotypen IgG 1, 2 und 4 werden mit hoher Affinität gebunden, während IgG3, IgA, IgE
und IgM mit niedriger Affinität gebunden werden. Da Autoantikörper überwiegend
dem IgG-Typ angehören, eignet sich Protein A gut zur Aufreinigung dieser Fraktion.
Durch die Immobilisierung auf Sepharose-Kügelchen lassen sich die gebundenen Antikörper durch Zentrifugation abtrennen.
Zur Aufreinigung wurden 100 µl Serum mit 100 µl TBS und 50 µl Protein A-Sepharose
für 2 h bei 4◦ C unter Rotieren gebunden. Danach wurde mit TBS viermal gewaschen
(Zentrifugation 1 min, 4000 x g, 4◦ C) und zur Elution 100 µl Elutionspuffer zugegeben
und erneut zentrifugiert. Anschließend wurden 50 µl des Überstandes abgenommen und
mit 25 µl Neutralisationspuffer gemischt. Zu den Sepharose-Kügelchen wurden weiter
50 µl Elutionspuffer gegeben und nach erneuter Zentrifugation 50 µl des Überstandes
abgenommen und mit dem ersten Eluat vereinigt. Anschließend wurde die Proteinkonzentration mit BCA-Assay bestimmt.
2.3.5
Bestimmung der Proteinkonzentration in Lösung
Die Konzentration von Proteinen in Lösung kann über verschiedene Verfahren bestimmt werden. Eine einfache Methode ist der Nachweis mit Hilfe von Kupfersulfat
46
Cosima Kretz
2 Material und Methoden
und Bicinchoninsäure (BCA). Zunächst reduzieren die Peptidbindungen des Proteins
Cu2+ zu Cu1+ . Die Cu1+ -Ione werden von je zwei Molekülen Bicinchoninsäure chelatiert; es entsteht ein dunkelvioletter löslicher Komplex, dessen Absorbtion bei 560
nm bestimmt werden kann. Die Reaktion wird durch Detergenzien und reduzierende
Reagenzien gestört.
Die Bestimmung wurde mit einem BCA-Kit der Firma Pierce nach den Angaben des
Herstellers durchgefuhrt. 100 µl BCA-Färbelösung wurden in 96-Loch-Platten mit 10 µl
der Proteinlösungen bzw. eines BSA-Standards versetzt und fur 15 min bei 37◦ C inkubiert. Die Intensität der Färbung wurde über die Messung der Absorption bei einer
Wellenlänge von 560 nm im ELISA-Photometer bestimmt.
2.3.6
Immunopräzipitation von Annexin 1 durch Autoantikörper im
Serum von Patienten mit SLE
Um herauszufinden, ob Autoantikörper gegen Annexin 1 im Serum von Patienten mit
SLE vorhanden sind, kann man neben dem ELISA auch die Methode der Immunopräzipitation verwenden. Dazu wird Serum mit Annexin 1 und Protein A-Sepharose
inkubiert, wobei die Antikörper aus dem Serum an die Protein A-Sepharose-Kügelchen
binden. Falls Antikörper gegen Annexin 1 enthalten sind, wird Annexin 1 durch diese
auf den Sepharose-Kügelchen immobilisiert und kann nach der Elution mit SDS-PAGE
und Westernblot nachgewiesen werden.
Zur Immunopräzipitation werden pro Serumprobe 100 µl mit 1 µg Annexin 1 vorgemischt und aus dem Mastermix in 100 µl Aliquots verteilt. Dann werden diese mit 100 µl
Serum und 100 µl Annexin-Bindepuffer gemischt und 1 h bei 4◦ C rollend inkubiert.
Danach werden die Proben fünfmal mit Annexin-Bindepuffer gewaschen (Zentrifugation 1 min, 4000 x g, 4◦ C) und mit 20 µl reduzierendem Probenpuffer (1:5 verdünnt mit
TBS) für 10 min bei 95◦ C aufgekocht und anschließend auf ein SDS-Gel aufgetragen.
2.3.7
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Die Polyacrylamid-Gelelekrophorese dient der Auftrennung von Proteingemischen nach
Größe (Laemmli 1970). Das Gel besteht aus einem polymerisierten Gemisch aus Acrylamid und Bisacrylamid. Durch das Verhältnis der beiden Chemikalien kann die Porengröße des entstehenden Gels variiert und dem Molekulargewicht der aufzutrennenden
47
Cosima Kretz
2 Material und Methoden
Proteine angepasst werden. Die denaturierten Proteine werden mit Natriumdodecylsulfat (SDS) beladen, das sich mit seinem hydrophoben Rest an die Aminosäurekette
anlagert. Die Anzahl der angelagerten SDS-Moleküle ist annähernd proportional zum
Molekulargewicht des Proteins. Da jedes Dodedylsulfat-Molekül eine negative Ladung
besitzt, wandern die Proteine im Gel Richtung Anode. Die Laufweite verhält sich umgekehrt proportional zum Logarithmus der Masse.
Die Gele bestanden aus einem 5-prozentigen Trenngel und einem 10- bis 12-prozentigen
Sammelgel. Die Gelzusammensetzung ist bei den Puffern aufgeführt.
Die Polymerisation wurde mit Tetramethylethylendiamin (TEMED) und Ammoniumpersulfat (APS) gestartet. Die Proteinproben wurden mit reduzierendem Probenpuffer
(5x) im Verhältnis 1:5 versetzt und für 5 min bei 95◦ C denaturiert. Die Auftrennung
erfolgte bei 80 V. Die Gele wurden direkt für Western Blot verwendet.
2.3.8
Western Blot
Der Western Blot ist eine Methode zum Nachweis spezifischer Proteine in einem nach
Größe aufgetrennten Proteingemisch. Die in einem SDS-Gel aufgetrennten Proteine
werden elektrophoretisch auf eine Nitrozellulose-Membran transferiert und mit Hilfe
von Peroxidase-gekoppelten Antikörpern und einem chemilumineszenten Substrat mit
Hilfe einer CCD-Kamera sichtbar gemacht.
Das Ergebnis der Immunopräzipitation wurde durch SDS-PAGE aufgetrennt und mit
dem Semi-Dry-Verfahren geblottet. Gel und Membran befinden sich zwischen zwei horizontalen Metallplatten (Anode und Kathode), der Kontakt zu Kathode und Anode
wird durch je drei Lagen mit Transferpuffer benetztem Filterpapier hergestellt. Der
Transfer erfolgte uber einen Zeitraum von 1 h 45 min bei 0,8 mA/cm2 Membran.
Nach dem Transfer wurden die freien Bindungsstellen der Membran durch einstündige
Inkubation in Blockierungslösung 3 abgesättigt. Die Inkubation mit dem Erstantikörper
(anti-Annexin 1) erfolgte für 1 h. Nach drei zehnminütigen Waschschritten mit Waschpuffer 3 wurde die Membran für ca. 1 h mit einem HRP-gekoppelten Zweitantikörper
inkubiert (anti-Maus IgG HRP, Verdünnung 1:10.000 in Waschpuffer 3). Nach dreimaligem Waschen folgten die Zugabe chemilumineszenter ECL-Lösung und die Aufnahme
mit der CCD-Kamera.
48
Cosima Kretz
2.3.9
2 Material und Methoden
Kultivierung eukaryotischer Zellen
Alle Arbeiten zur Kultivierung eukaryotischer Zellen wurden unter einer sterilen Werkbank durchgeführt. Eukaryotischen Zellen wurden im Brutschrank bei 37◦ C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 kultiviert. Als Zellkulturmedium wurde RPMI 1640 verwendet, das vor Gebrauch mit 10 % (v/v) FCS und 1 % (v/v) Glutamax supplementiert
wurde (supplementiertes RPMI). Für die Differenzierung und Aktivierung primärer
Zellen wurden verschiedene Zytokine verwendet. Nach Erhalt wurden die Zytokine in
sterilem, LPS-freiem PBS mit 0,1 % (w/v) BSA gelöst und bis zur Verwendung bei
-80◦ C gelagert.
2.3.10
Präparation primärer humaner neutrophiler Granulozyten
Im Körper eines Erwachsenen werden jeden Tag ca. 1x 1011 neutrophile Granulozyten produziert: sie machen somit 50-65 % aller Lymphozyten aus. Mittels gradueller
Dichtezentrifugation über Histopaque lassen sich die neutrophilen Granulozyten aus
humanem Blut aufreinigen. In vitro sterben sie innerhalb von vier Tagen auf Grund
fehlender Überlebenssignale durch Zytokine. Dies spiegelt die kurze Lebensdauer der
neutrophilen Granulozyten in vivo wider, die etwa 6 Stunden im peripheren Blut beträgt. Somit stellen sie ein gutes zelluläres Modell zur Untersuchung des spontanen
Apoptoseverhaltens von Leukozyten dar.
Primäre humane neutrophile Granulozyten wurden durch eine Dichte-Zentrifugation
aus 80 ml heparinisiertem Vollblut isoliert. 4 ml Polymorphprep wurden mit 5 ml
Blut vorsichtig überschichtet und zentrifugiert (40 min bei 470 x g und 20◦ C, ohne
Bremse). Nach der Zentrifugation flotieren die mononukleären Lymphozyten auf dem
Polymorphprep, während sich die polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten als
Ring in der Interphase sammeln. Die Erythrozyten werden unter diesen Bedingungen
pelletiert. Der obere Ring aus mononukleären Lymphozyten wurde vorsichtig entfernt
und für die Präparation von Monozyten verwendet. Die neutrophilen Granulozyten des
unteren Ringes wurden vereint und zum Ausgleich der Molarität in ein gleiches Volumen 0,45 % NaCl-Lösung gegeben. Nach Zentrifugation (10 min bei 820 x g und 20◦ C)
wurde der Überstand verworfen und die verbliebenen Erythrozyten durch einminütige
Inkubation in eiskalter 0,2 % NaCl-Lösung hypoton lysiert. Die Lyse wurde durch
Zugabe von 5 ml eiskalter 1,6 % NaCl-Lösung gestoppt, und die neutrophilen Granulozyten nach erneuter Zentrifugation in einer Konzentration von 2 x 106 Zellen/ml in
49
Cosima Kretz
2 Material und Methoden
supplementierten RPMI-Medium in 6-Loch-Zellkulturplatten (3 ml pro Loch) ausgesät
und bis zur weiteren Verwendung im Brutschrank inkubiert.
2.3.11
Präparation primärer humaner Monozyten
Die Präparation von Monozyten erfolgte aus Vollblut nach Präparation von neutrophilen Granulozyten mit einem CD14-Magnetic-Bead-Kit der Firma Miltenyi. Die Isolation erfolgte nach den Angaben des Herstellers, jedoch wurden die Volumina der
Antikörperlösung und der Kügelchen-Suspension halbiert, um eine CD14+ -Population
besonders hohen Reinheitsgrads zu erhalten.
Die Lymphozyten wurden je 1 x 107 Zellen in 80 µl MACS-Puffer resuspendiert und
nach Zugabe von 10 µl anti-CD14-Kügelchen-Suspension je 1 x 107 Zellen für 15 min
bei 4◦ C unter Schütteln inkubiert. Die Zellen wurden mit 2 ml MACS-Puffer je 1 x 107
Zellen gewaschen und für 10 min bei 300 x g und 4◦ C pelletiert. Das Pellet wurde in
500 µl MACSPuffer je 1 x 108 Zellen resuspendiert und über eine LS-Säule in einem
magnetischen Zellseparator gegeben. Die Säule wurde dreimal mit je 3 ml MACS-Puffer
gewaschen. Die Säule wurde aus dem Magnetfeld entfernt und die CD14+ Monozyten
mit 5 ml MACS-Puffer eluiert. Die Monozyten wurden gezählt, pelletiert (10 min bei
300 x g und 20◦ C) und in einer Konzentration von 1,5 x 106 Zellen in supplementiertem
RPMI-Medium in 6-Loch-Platte ausgesät (3 ml pro Loch).
2.3.12
Präparation primärer humaner Lymphozyten
Zur Quantifizierung und Charakterisierung von Treg mittels Durchflusszytometrie wurden Lymphozyten aus 80 ml Vollblut isoliert. Das Vollblut wurde auf 200 ml mit PBS
aufgefüllt. Je 15 ml Ficoll (Biochrom) wurden langsam mit 30 ml Blut überschichtet
und anschließend bei 2420 rpm und 20◦ C für 20 min ohne Bremse zentrifugiert. Die
Lymphozytenringe in der Interphase wurden vereinigt, mit 50 ml PBS aufgefüllt und
bei 1500 rpm und 20◦ C für 10 min abzentrifugiert. Die Zellen wurden einmalig mit PBS
gewaschen und anschließend in 50 ml supplementiertem RPMI resuspendiert. Durch
Inkubation für 20 min bei 37◦ C in einer Zellkulturflasche wurden die adhärenten Monozyten weitgehend depletiert. Der Überstand wurde abgenommen und für die durchflusszytometrischen Untersuchungen verwendet.
50
Cosima Kretz
2.3.13
2 Material und Methoden
Differenzierung primärer humaner DC
Die Differenzierung von DC erfolgte ausgehend von frisch isolierten Monozyten durch
sechstägige Kultivierung in GMCSF- und IL4-haltigem Medium (Sallusto and Lanzavecchia 1994). Die adhärenten Zellen wurden in 6-Loch Zellkulturplatten mit 3 ml supplementiertem RPMI-Medium kultiviert. Das Medium enthielt zusätzlich 1000 U/ml
GMCSF und 500 U/ml IL-4. Nach drei Tagen wurden pro Loch 0,5 ml Medium mit
3500 U/ml GMCSF und 1500 U/ml IL-4 zugegeben. Nach insgesamt sechs Tagen wurden die unreifen DC vorsichtig mit dem Zellkultur-Überstand abgenommen, und 1 x 105
Zellen pro Loch in 48-Loch-Zellkulturplatten umgesetzt.
2.3.14
Differenzierung von U937-Zellen
U937-Zellen sind humane monozytische Suspensionszellen, die durch verschiedene Substanzen zu adhärenten Zellen differenziert werden können, die in ihrem Phänotyp DC
ähneln. 45 x 106 U937-Zellen wurden in 30 ml supplementiertem RPMI in einer 75 cm2
Zellkulturflasche ausgesät und mit 10 µg/ml beziehungsweise 100 µg/ml Phorbolmyristatacetat (PMA) für drei bis vier Tage differenziert. Die differenzierten Zellen wurden
einmal mit PBS gewaschen und für 4 min mit Trypsin/EDTA vom Boden der Zellkulturflasche gelöst. Nach Abstoppen der proteolytischen Reaktion mit 12 ml Medium
wurden die Zellen pelletiert (5 min bei 460 x g und 4◦ C) und ohne Verzögerung in
48-Loch-Platten ausplattiert (1 x 105 Zellen pro Loch), um ein Aggregieren der Zellen
in Suspension zu verhindern.
2.3.15
Apoptose-Induktion
Um frühapoptotische Zellen zu erhalten, wurden Jurkat T-Zellen mit 50 mJ/cm2 UVCStrahlung bestrahlt (6-Loch-Platten, 2,5 ml Zellsuspension pro Loch) und für 4 h in
supplementiertem RPMI-Medium bei 37◦ C inkubiert. Primäre neutrophile Granulozyten sterben nach Entnahme aus dem Körper durch Entzug von Überlebenssignalen
spontan und zeigen etwa 24 h nach Blutentnahme die typischen Charakteristika frühapoptotischer Zellen.
51
Cosima Kretz
2.3.16
2 Material und Methoden
Kokultur-Experimente mit apoptotischen Zellen
Um zu untersuchen, ob apoptotische Zellen die Zytokinsekretion und Reifung von Phagozyten beeinflussen, wurden Kokultur-Experimente durchgeführt.
Je 1 x 105 (U937, bzw. DC) Phagozyten wurden in 500 µl supplementiertem RPMIMedium in 48-Loch-Platten ausgesät. Nachdem die Zellen adhäriert hatten (30-60 min),
wurde das Medium ausgetauscht und frühapoptotische Zellen wurden in einem Verhältnis von 1:5 (Phagozyten zu apoptotischen Zellen) zugegeben. Als frühapoptotische
Zellen dienten mit UVC bestrahlte J16 T-Zellen beziehungsweise primäre humane neutrophile Granulozyten an Tag 1 nach Isolation. Nach 3 h wurden die Zellen mit bakteriellem LPS (aus E. coli 026:B6) stimuliert. Nach ca. 18 h wurden 250 µl Überstand
entnommen und durch frisches Medium ersetzt. Die Überstände wurden im ELISA auf
TNF-Sekretion untersucht, die Zellen weiter im Brutschrank inkubiert und ca. 48 h
nach LPS-Zugabe in Bezug auf die Expression von Oberflächenmarkern im Durchflusszytometer untersucht. Wenn Annexin 1 auf den apoptotischen Zellen durch den Einsatz
von anti-Annexin 1 Antikörpern aus dem Serum von Patienten mit SLE blockiert wurde, wurden die apoptotischen Zellen vor ihrer Zugabe zu den Phagozyten 15 min mit
der Antikörperlösung vorinkubiert und dann mit sterilem PBS gewaschen und in supplementiertem RPMI zugegeben.
2.3.17
Vybrant DiD-Markierung von J16 T-Zellen
Vybrant DiD ist ein lipophiler Farbstoff, der sich in die Membranen lebender Zellen
einlagert und im Durchflusszytometer nachweisbar ist. Für die Markierung mit Vybrant DiD wurden J16 T-Zellen für 5 min bei 5000 x g und 20◦ C pelletiert und einmal
mit sterilem PBS gewaschen. Die Zellen wurden in 1 ml sterilem PBS resuspendiert
und mit 1 µl Vybrant DiD pro 1 x 106 Zellen 1 min bei 37◦ C inkubiert. Nach der
Inkubation wurden die Zellen 5 min bei 5000 x g und 20◦ C zentrifugiert und vorsichtig
in angewärmtem supplementiertem RPMI-Medium resuspendiert. Die Zellen wurden
einmal mit Medium gewaschen und bis zur weiteren Verwendung in einer Konzentration von 2 x 106 Zellen/ml im Brutschrank inkubiert.
52
Cosima Kretz
2.3.18
2 Material und Methoden
Phagozytose-Experimente
Um den Einfluss von Autoantikörpern aus dem Serum von Patienten mit SLE auf
die Aufnahme-Kapazität der Phagozyten zu untersuchen, wurden Phagozytose-Experimente mit DiD-markierten apoptotischen Zellen durchgeführt. J16 T-Zellen wurden
erst wie oben beschrieben mit UVC-Licht bestrahlt und anschließend mit Vybrant
DiD markiert. Phagozyten (U937-Zellen, bzw. DC) wurden in 24-Loch-Platten ausgesät
(2 x 105 Zellen pro Loch) und 12 h im Brutschrank inkubiert. Kurz vor Zugabe der
apoptotischen J16 T-Zellen (zwischen 2 x 105 und 1 x 106 ) wurden diese mit 3 µg
der Antikörperlösungen aus unterschiedlichen Seren für 15 min bei 37◦ C inkubiert und
mit PBS gewaschen, um nicht gebundene Antikörper zu entfernen. Danach wurden
die apoptotischen J16 T-Zellen in supplementiertem RPMI-Medium zugegeben, und
nach unterschiedlichen Zeitpunkten entsprechend der Kinetik auf Eis abgestoppt und
geerntet. Die Phagozyten wurden nach dem Abstoppen zusätzlich mit einem geeigneten
FITC-markierten Antikörper markiert (anti-CD31 Antikörper für U937, bzw. antiCD11b Antikörper für DC), so dass doppelt positive Zellen (FITC und DiD) leicht
identifiziert werden konnten. Die Phagozytose wurde im FACS bestimmt. Als interne
Kontrolle wurden unbestrahlte J16 T-Zellen verwendet, die analog zu den bestrahlten
Zellen behandelt wurden.
2.3.19
Durchflusszytometrische Analyse
Im Durchflusszytometer kann die Expression eines oder mehrerer Proteine auf oder
in einer Zelle quantifiziert werden. Dies geschieht durch die spezifische Bindung von
fluorochrommarkierten Antikörpern an die entsprechenden Epitope, die dann nach Anregung mit einem Laserstrahlt druch die Emission in dem für das Fluorochrom typischen Bereich quantifiziert werden kann. Die Zellen einer Suspension werden im Gerät
vereinzelt und mit ein oder zwei Laserstrahlen verschiedener Wellenlänge bestrahlt.
Durch das Forwärts- und Seitwärtsstreulicht werden Größe und Granularität der Zellen bestimmt, so dass sich Populationen mit unterschiedlichen Eigenschaften voneinander unterscheiden lassen. Ein Durchflusszytometer ermöglicht die gleichzeitige Analyse
mehrerer Oberflächenantigene auf Einzelzellebene. Durch eine Fixierung der Zellen ist
auch der Nachweis von intrazellulärer Proteine möglich.
Zur Analyse der Expression verschiedener Oberflächenmarker wurden 2 x 105 Zellen
durch fünfminütige Zentrifugation bei 460 x g und 4◦ C pelletiert. Die Überstände
53
Cosima Kretz
2 Material und Methoden
wurden verworfen, und die Zellen für 15 min mit 25 µl 20 % Maus- oder Rattenserum in FACS-Puffer inkubiert (je nach Ursprung der verwendeten Antikörper), um
Fc-Rezeptoren abzusättigen. Alle Inkubationen erfolgten auf Eis, um eine Internalisierung von Oberflächenmoleküle zu verhindern. Für die Antikörper wurde ein Mastermix
angesetzt (je 3 µl Antiköper pro 50 µl Färbevolumen) und in 25 µl Aliquots auf die
Proben verteilt. Nach 15 min Inkubation wurden die Zellen zweimal mit FACS-Puffer
gewaschen und in 100 µl FACS-Puffer für die Analyse im FACS aufgenommen.
Zum Nachweis von intrazellulärem FoxP3 wurden 5 x 106 Zellen verwendet und zuerst,
wie bereits beschrieben, mit Antikörpern gegen Oberflächenmarker gefärbt (Mastermix:
je 6 µl Antiköper pro 26 µl Färbevolumen, 15 µl/Probe, 20 min Inkubation). Danach
folgte ein Waschschritt mit PBS und eine fünfminütige Zentrifugation bei 460 x g
und 4◦ C. Nach Zugabe von 750 µl Fix/Perm-Puffer (Verdünnung nach Angaben des
Herstellers) wurden die Zellen für 30 min inkubiert. Nachfolgend wurden sie einmal
mit PBS und zweimal mit Permeabilisierungspuffer gewaschen in 98 µl Permeabilisierungspuffer mit 2 % Rattenserum für 15 min inkubiert und anschließend mit 20 µl
anti-FoxP3 Antikörper versetzt und weiter 30 min inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit Permeabilisierungspuffer wurden die Zellen in 250 µl PBS ausgenommen und
im Durchflusszytometer analysiert.
Um nachzuweisen, dass Autoantikörpern aus dem Serum von Patienten mit SLE an
apoptotische Zellen binden, wurden 2 x 105 Zellen für 15 min mit 5 µg Antikörperlösung
inkubiert und nach Waschen mit Annexin-Bindepuffer mit anti-human IgG APC als
Zweitantikörper für 15 min gefärbt. Nach erneutem Waschen in 100 µl Annexinbindepuffer für die Analyse aufgenommen.
Auch für die Analyse von Annexin 1 (DAC5) sowie die Analyse von Phosphatidylserin
(Anx5) wurde statt FACS-Puffer Annexin-Bindepuffer verwendet. Die Auswertung erfolgte mit der Software DIVA.
2.3.20
Bestimmung der Apoptose nach Nicoletti
Mit Hilfe einer von Nicoletti und Kollegen etablierten Methode lassen sich apoptotische Zellkerne aufgrund ihres geringeren DNA-Gehaltes von Zellkernen lebender Zellen
unterscheiden (Nicoletti et al. 1991). Der Fluoreszenzfarbstoff dringt in die Zellkerne
ein und interkaliert in die DNA, sodass die Kerne ihrem DNA-Gehalt entsprechend
fluoreszieren. Neben den vitalen diploiden und den in Teilung befindlichen tetraploi54
Cosima Kretz
2 Material und Methoden
den Zellkernen lassen sich die apoptotischen Zellkerne mit subdiploidem DNA-Gehalt
quantifizieren. 2 x 105 Zellen wurden in 250 µl Nicolettipuffer für 12-48 h bei 4◦ C unter
Lichtabschluss lysiert und im Durchflusszytometer analysiert. Die spezifische Apoptose
wurde folgendermaßen berechnet:
2.3.21
% experimentelleApoptose − % spontaneApoptose
100 % spontaneApoptose
× 100.
Statistische Analyse
Alle Daten dieser Arbeit werden als individuelle Werte sowie als Mediane dargestellt.
Der Mann-Whitney-U-Test wurde mit einem Konfidenzinterval von 95 % zur Prüfung
statistischer Signifikanz verwendet. Der Test wurde als signifikant angesehen, wenn p
kleiner als 0.05 war. Für die Berechnungen wurden die Programme GraphPad Prism 4
(GraphPad Software Inc.) und SPSS 12 (SPSS Inc.) verwendet.
55
Cosima Kretz
3
3.1
3 Ergebnisse
Ergebnisse
Das Apoptoseverhalten neutrophiler Granulozyten von
Patienten mit SLE zeigt keine pathologische Veränderung
SLE ist durch das Vorhandensein von Autoantikörpern gegen nukleäre Antigene und
gegen intrazelluläre Strukturen wie dsDNA gekennzeichnet. Diese Antikörper sind nicht
nur pathognomonisch, sondern spiegeln auch den Aktivitätsstatus der Erkrankung wider. Eine mögliche Ursache der Entstehung dieser Antigene sind apoptotische Zellen
(Casciola-Rosen et al. 1994; Rosen and Casciola-Rosen 1999; Voll et al. 1997). Daher
könnte ein vermehrtes Auftreten von apoptotischen Zellen im Blut in der Pathogenese
des SLE eine Rolle spielen. Eine größere Anzahl apoptotischer Zellen könnte durch
vermehrte oder beschleunigte Apoptose entstehen und somit die Kapazitäten der phagozytierenden Zellen überlasten. Durch die längere Verweildauer der Zellen würden
die sterbenden Zellen in einem Stadium der späten Apoptose oder der sekundären
Nekrose von DC aufgenommen werden und diese aktivieren (Janeway 1992; Matzinger 1994). Um zu untersuchen, ob Leukoozyten aus dem Blut von Patienten mit SLE
im Vergleich zu Leukozyten von gesunden Kontrollen vermehrt oder beschleunigt einen
apoptotischen Zelltod sterben, wurden neutrophile Granulozyten isoliert und ihre spontane Apoptose mittels durchflusszytometrischer Methoden untersucht.
Wie Abbildung 4 zeigt, exponieren an Tag 1 nach der Isolation bereits 40-50 % der
neutrophilen Granulozyten PS in der äußeren Membran. Die Externalisierung von PS
ist ein frühes Ereignis in der Apoptose. An Tag 2 und 3 nach der Präparation sind
alle Zellen PS-positiv. In der kumulativen Darstellung (Abb. 4A) lassen sich keine signifikanten Unterschiede in den Mittelwerten der durchschnittlichen Fluoreszenzstärke
(engl. mean fluorescence intensity = MFI) zwischen den Neutrophilen der Patienten
mit SLE und der gesunden Kontrollen erkennen. An Tag 1 lässt sich auch bereits
DNA-Fragmentierung nachweisen (Abb. 4B). Der Median liegt bei 51,3 % für gesunde Kontrollen und bei 22,3 % für Patienten mit SLE, ist aber auf Grund der hohen
Streuung nicht signifikant unterschiedlich. An Tag 3 ist dieser Wert bis auf 85,1 % bei
den gesunden Kontrollen und 78,4 % bei den Patienten mit SLE angestiegen. Auch
hier sind im statistischen Vergleich keine signifikanten Unterschiede zwischen Patienten mit SLE und gesunden Kontrollen messbar. Die anfänglichen Unterschied in diesen
Experimenten sind eher auf die hohe Streuung und die geringe Anzahl an Patienten
56
Cosima Kretz
3 Ergebnisse
zurückzuführen. Dies bestätigt sich auch dadurch, dass die Werte an Tag 2 und 3 vergleichbar sind. Der Verlust der Membranintegrität als spätes apoptotisches Ereignis
ist in vollem Ausmaß erst an Tag 3 zu beobachten (Abb. 4C). Auch hier lassen sich
keine signifikanten Unterschiede zwischen neutrophilen Granulozyten von Patienten
mit SLE und gesunden Kontrollen beobachten. Zusammenfassend können keine Unterschiede zwischen neutrophilen Granulozyten von Patienten mit SLE und gesunden
Kontrollen im Apoptoseverhalten festgestellt werden, weder quantitativ noch im Bezug
auf den zeitliche Verlauf.
3.2
Apoptotische neutrophile Granulozyten haben einen
suppressiven Effekt auf U937-Zellen
Apoptotische Zellen werden in vitro durch phagozytierende Zellen wie DC oder Makrophagen aufgenommen und verändern deren Verhalten dahingehend, dass diese Zellen
schlechter auf Aktivierungssignale reagieren. Dadurch wird verhindert, dass DC, die
apoptotische Zellen aufgenommen haben, nach Aktivierung ihrerseits selbstreaktive
T-Zellen durch körpereigene Peptide aktivieren. Dies könnte ein wichtiger Mechanismus zur Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz sein. Es wurde postuliert, dass bei
Patienten mit SLE die Toleranzinduktion durch apoptotische Zellen gestört ist. Zum
einen könnten die apoptotischen Zellen direkt diesen Effekt hervorrufen, indem die Anzahl zu groß ist und die Phagozytosekapazitäten überlastet sind. Zum anderen können
veränderte Signale der apoptotischen Zellen an die Phagozyten die gleiche Wirkung
hervorrufen und dadurch den tolerogenen Effekt apoptotischer Zellen verringern.
Um zu untersuchen, ob die Interaktion von apoptotischen neutrophilen Granulozyten
und DC in Patienten mit SLE verändert ist, wurde ein in vitro- System mit Zellen etabliert, die ein DC-ähnliches Verhalten aufweisen. Dadurch konnten spenderabhängige
Schwankungen der DC-Aktivität vermieden werden. Es wurde die monozytische Zelllinie U937 verwendet, die durch den Phorbolester PMA dahingehend differenziert werden
kann, dass die Zellen viele Eigenschaften unreifer DC aufweist: differenzierte U937Zellen exprimieren ähnliche Moleküle auf ihrer Oberfläche wie DC (Abb. 5A). Dazu
gehören CD11b und das DC-typische CD11c, sowie CD83 und HLA-DR. Auch zeigen
sie ähnlich wie DC keine Oberflächenexpression von CD14, CD80 und CD86. Nach
Stimulation der Zellen mit LPS werden die kostimulatorischen Moleküle CD80, CD83,
57
Cosima Kretz
3 Ergebnisse
Abbildung 4: Apoptosekinetik primärer neutrophiler Granulozyten von Patienten mit SLE im
Vergleich zu gesunden Kontrollen (K). (A) Neutrophile Granulozyten wurden mit Annexin 5
gefärbt und nach der Isolierung an vier aufeinanderfolgenden Tagen (Tag 0-3 = t0-3) im Durchflusszytometer analysiert, um den Anteil apoptotischer Zellen zu bestimmen (Mediane SLE bzw.
K t0: 480, 897, t1: 3125, 2413, t2: 2589, 3003, t3: 2276, 3884). (B) Primäre neutrophile Granulozyten wurden einer Färbung nach Nicoletti unterzogen und im Durchflusszytometer analysiert, um
fragmentierte DNA subgenomischer Größe nachzuweisen, die im Laufe der Apoptose auftritt. (C)
Neutrophile Granulozyten wurden mit 7AAD gefärbt und durchflusszytometrisch untersucht, um
den Verlust der Membranintegrität als spätes Apoptoseereignis zu quantifizieren. Links ist je ein
repräsentatives Beispiel gezeigt (grau gefüllt: Hintergrundfluoreszenz, graue Linie: t0, gepunktete
Linie: t1, gestrichelte Linie: t2, schwarze Linie: t3), rechts sind die kumulativen Daten dargestellt
(graue Punkte: gesunde Kontrollen, blaue Punkte: Patienten mit SLE).
58
Cosima Kretz
3 Ergebnisse
CD86, und HLA-DR stärker exprimiert, ebenso nimmt die Oberflächen-Expression von
CD14, CD31, CD11b und CD11c zu. Schließlich produzieren differenzierte U937-Zellen
nach Stimulation mit LPS konzentrationsabhängig pro-inflammatorische Zytokine wie
TNF (Abb. 5B). Auf Grund dieser Ergebnisse wurden U937-Zellen als DC-Modell in
Kokultur-Experimenten mit apoptotischen Zellen eingesetzt.
Als interner Standard wurden Jurkat T-Zellen (J16) verwendet, in denen durch Behandlung mit UV-C (256 nm) Apoptose induziert wurde. Vier Stunden nach Bestrahlung
weisen sie ein frühes Stadium der Apoptose auf (Abb. 5C). In diesem Zustand wurden
sie mit U937-Zellen kokultiviert.
Bei den durchgeführten Experimenten wurden U937-Zellen mit apoptotischen neutrophilen Granulozyten aus Patienten mit SLE oder gesunden Kontrollen für drei Stunden
vorinkubiert und anschließend mit LPS stimuliert. Um die Aktivierung der U937-Zellen
zu messen, wurde die TNF-Sekretion mittels ELISA bestimmt (Abb. 6A).
Es lässt sich beobachten, dass die Kokultur von apoptotischen neutrophilen Granulozyten zu einer verminderten Sekretion von TNF führt (Abb. 6B). Dieser suppressive
Effekt fällt mit zunehmender Aktivierung der U937-Zellen schwächer aus. Im Vergleich
sind apoptotische neutrophile Granulozyten von Patienten mit SLE in der Lage, U937Zellen zu supprimieren, ähnlich wie neutrophile Granulozyten von gesunden Kontrollen (Abb.6B). Die Mediane der Stimulation liegen bei 58 % für gesunde Kontrollen
und 54 % für Patienten mit SLE. Unter statistischen Gesichtspunkten lässt sich kein
signifikanter Unterschied feststellen (p-Wert K vs. SLE: 0,0789). Der Median der Stimulation nach Kokultur mit apoptotischen Jurkat T-Zellen, die als interne Kontrolle
verwendet wurden, liegt bei 56 %. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass apoptotische neutrophile Granulozyten von Patienten mit SLE eine vergleichbare Fähigkeit
zur Hemmung von U937-Zellen aufweisen. Diesbezüglich liegt also kein zellintrinsischer
Defekt der neutrophilen Granulozyten von Patienten mit SLE vor.
3.3
Primäre DC von Patienten mit SLE weichen im Bezug auf
ihre Stimulierbarkeit durch Gefahrensignale nicht von DC
aus gesunden Kontrollen ab
Da apoptotische neutrophile Granulozyten von Patienten mit SLE weder in ihrem
Apoptoseverhalten noch in ihrer Fähigkeit zur Suppression von U937-Zellen Unter59
Cosima Kretz
3 Ergebnisse
Abbildung 5: DC-ähnliche Differenzierung der monozytischen Zellinie U937. (A) Zellen der
monozytischen Zellinie U937 wurden für drei Tage mit PMA differenziert und dann mit 5 ng/ml
LPS stimuliert. Nach 48 Stunden wurden die stimulierten Zellen bzw. unstimulierte Zellen als
Kontrolle mit Antikörpern gegen CD11b, CD11c, CD14, CD31, CD80, CD83, CD86 und HLADR gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert (graue Füllung: Isotypkontrolle, graue Linie:
Tag 5 ohne Stimulation, schwarze Linie: Tag 5 mit Stimulation an Tag 3). (B) U937-Zellen wurden
an Tag 3 mit unterschiedlichen Konzentrationen LPS stimuliert, und die TNF-Sekretion wurde
an Tag 4 mittels ELISA quantifiziert.
schiede zu neutrophilen Granulozyten von gesunden Kontrollen aufweisen, besteht die
Möglichkeit, dass DC von Patienten mit SLE auf Grund eines abnormalen Verhaltens
sich nicht supprimieren lassen. Daher wurde getestet, ob die Stimulierbarkeit der DC
von Patienten mit SLE verändert ist. Wie bereits in Unterkapitel 3.2 erwähnt, hängt die
Supprimierbarkeit von U937-Zellen vom Grad ihrer Aktivierung ab, wobei starke Aktivierung den suppressiven Efffekt aufheben kann. Dies gilt auch für unreife DC, die aus
60
Cosima Kretz
3 Ergebnisse
Abbildung 6: Supprimierbarkeit von U937-Zellen durch apoptotische neutrophile Granulozyten.
(A) Schematische Darstellung des Experiments: Apoptotische neutrophile Granulozyten von Patienten mit SLE und gesunden Kontrollen (K) wurden mit DC kokultiviert, um die Suppression
LPS-induzierter Stimulation durch apoptotische Zellen zu testen. Apoptotische Jurkat T-Zellen
(J16) wurden als interne Kontrolle mitgeführt. (B) U937-Zellen wurden nach dem in A gezeigten
Schema mit apoptotischen neutrophilen Granulozyten oder J16 kokultiviert, 18 h später wurde
die Sekretion von TNF im ELISA gemessen. links: repräsentatives Ergebnis, rechts: kumulative
Daten für eine Stimulation mit 5 ng/ml LPS. Die TNF-Sekretion nach Stimulation ohne Kokultur
wurde jeweils auf 100 % gesetzt. Die Linien repräsentieren den Median der Population.
monozytischen Vorläuferzellen in vitro differenziert wurden (Daten nicht gezeigt). Eine
verstärkte Reaktion auf Aktivierungssignale könnte damit eine schwächere Toleranzinduktion in vivo erklären. Daher wurden in vitro differenzierte DC mit ansteigenden
LPS-Konzentrationen stimuliert und die Produktion von TNF im ELISA gemessen.
Ein Unterschied in der TNF-Produktion zwischen DC von Patienten mit SLE und DC
von gesunden Kontrollen ist jedoch nicht nachweisbar (Abb. 7A). Die Variabilität der
Messwerte der einzelnen Spender ist bei diesem Experiment sehr hoch; dies ist auch von
anderen Gruppen beschrieben worden (Sampaio et al. 1991). Die Streuung hat jedoch
keinen Einfluss auf die Mediane der Populationen, die im Vergleich keine signifikanten
Unterschiede zeigen.
Eventuelle Unterschiede in der Supprimierbarkeit von DC von Patienten mit SLE im
Vergleich zu gesunden Kontrollen müssen sich jedoch nicht zwangsläufig in der Sekre61
Cosima Kretz
3 Ergebnisse
Abbildung 7: Stimulierbarkeit primärer DC. (A) Primäre DC wurden mit der angegebenen LPSKonzentration stimuliert. Anschließend wurde die Sekretion von TNF mittels ELISA gemessen.
Links: ein representatives Ergebnis, rechts: kumulative Daten (blau: Patienten mit SLE, grau:
gesunde Kontrollen (K)).
tion pro-inflammatorischer Zytokine widerspiegeln. Um zu prüfen, ob sich Unterschiede
auf anderer Ebene finden, wurde die Expression kostimulatorischer Moleküle auf der
Oberfläche der DC untersucht. Ein exemplarisches Ergebnis ist in Abbildung 8 dargestellt. Die Expression von HLA-DR, CD86 und CD83 steigt nach Stimulation an.
Eine Quantifizierung ergibt auch hier keinen statistisch signifikanten Unterschied zwischen DC aus Patienten mit SLE und gesunden Kontrollen (Abb. 8B). Daraus lässt
sich schließen, dass das Verhalten der DC hinsichtlich TNF-Sekretion und Expression
kostimulatorischer Marker zwischen Patienten mit SLE und gesunden Kontrollen vergleichbar ist.
3.4
Die Supprimierbarkeit durch apoptotische Zellen ist
bei DC von Patienten mit SLE im Vergleich zu gesunden
Kontrollen nicht vermindert
Da sich DC von Patienten mit SLE in vergleichbarem Maße wie DC von gesunden
Kontrollen stimulieren lassen, stellte sich die Frage, ob sie sich auch in gleichem Maße durch apoptotische Zellen supprimieren lassen. Um dies zu überprüfen wurde ein
experimentelles System verwendet, in dem primäre humane DC mit apoptotischen
Jurkat T-Zellen für drei Stunden kokultiviert wurden, um nach anschließender LPSStimulation die TNF-Sekretion mittels ELISA zu messen (Abb. 9A).
Apoptotische Jurkat T-Zellen sind in der Lage, die TNF-Sekretion nach Aktivierung
62
Cosima Kretz
3 Ergebnisse
Abbildung 8: Expression von Aktivierungsmarkern auf der Oberfläche von DC nach Stimulation.
(A) Repräsentatives Ergebnis: In vitro gereifte DC aus monozytischen Vorläuferzellen wurden
mit 5 ng/ml LPS stimuliert und anschließend mit Antikörpern gegen HLA-DR, CD86 und CD83
gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert. (Grau gefüllt: Isotypkontrolle, graue Linie: Tag 7
unstimuliert, gestrichelte Linie: Tag 9 unstimuliert, schwarze Linie: Tag 9 stimuliert mit 5 ng/ml
LPS an Tag 7.) (B-D) Kumulative Daten für HLA-DR (B), CD86 (C) und CD83 (D) (blau:
Patienten mit SLE, grau: gesunde Kontrollen).
63
Cosima Kretz
3 Ergebnisse
der DC zu vermindern (Abb. 9 B). Die kumulative Auswertung ergibt, dass der Median der TNF-Sekretion bei supprimierten DC von gesunden Kontrollen bei 56 % liegt
und bei DC von Patienten mit SLE bei 70 % (nach einer Stimulation mit 5 ng/ml
LPS). Dieser Unterschied ist jedoch statistisch nicht signifikant (p-Wert: 0,9654). Auch
die Werte für 10 und 20 ng/ml LPS zeigen keine statistisch signifikanten Unterschiede
(Daten nicht gezeigt).
Auch in diesem Experiment wird deutlich, dass die Suppression der DC von der Stärke
ihrer Aktivierung abhängt und der suppressive Effekt durch eine starke Aktivierung
der DC aufgehoben werden kann (Abb. 9C). Das heißt, dass bei einer schwachen Aktivierung der DC der suppressive Effekt und damit die verminderte Sekretion proinflammatorischer Moleküle stärker ausfällt als bei einer starken Aktivierung. Wenn
die Aktivierung eine bestimmte Grenze überschreitet, tritt jedoch kein suppressiver
Effekt mehr auf.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass primäre DC von Patienten mit SLE gegenüber DC von gesunden Kontrollen keine signifikanten Unterschiede in ihrer Supprimierbarkeit durch apoptotische Zellen zeigen. Ein zellintrinsischer Defekt lässt sich
nicht nachweisen.
3.5
Apoptotische Zellen von Patienten mit SLE und
gesunden Kontrollen zeigen keine Unterschiede in
der Oberflächenexpression von Annexin 1
In der Abteilung von Prof. Krammer wurde nachgewiesen, dass das Protein Annexin 1
während der Apoptose externalisiert wird und dass es die Aktivierbarkeit humaner
DC hemmt (Weyd 2006; Dörner 2007). Daher stellte sich die Frage, ob dieses Molekül
bei Patienten mit SLE ein abweichendes Verhalten aufweist. Dabei könnten Expression oder Lokalisation verändert sein, oder der supprimierende Effekt könnte durch
eine Mutation vermindert oder aufgehoben werden. Um dies zu untersuchen, wurde
die Oberflächenexpression von Annexin 1 auf apoptotischen neutrophilen Granulozyten mittels Durchflusszytometrie quantifiziert und im zeitlichen Verlauf beobachtet. In
Abbildung 10A ist exemplarisch das Ergebnis einer solchen Messung über den Zeitraum
von vier Tagen dargestellt. Die kumulativen Daten zeigen keine signifikanten Unterschiede zwischen apoptotischen neutrophilen Granulozyten von Patienten mit SLE und
64
Cosima Kretz
3 Ergebnisse
Abbildung 9: Suppressiver Effekt apoptotischer Zellen auf DC. (A) Schematische Darstellung des Experiments: In vitro differenzierte DC aus monozytischen Vorläuferzellen wurden
mit apoptotischen Jurkat T-Zellen (J16) kokultiviert, um anschließend die Suppression LPSinduzierter Sekretion von TNF mittels ELISA zu quantifizieren. (B) Nachweis UV-C-induzierter
Apoptose in Jurkat T-Zellen (J16) nach Bestrahlung mit 50 mJ/cm2 . (Grau gefüllt: Hintergrundfluoreszenz, gepunktete Linie: lebende J16, schwarze Linie: J16 2h nach UV-Induktion, gestrichelte
Linie: J16 4h nach UV-Induktion, graue Linie: J16 6h nach UV-Induktion.) (C) Kokulturexperiment nach dem in (A) gezeigten Schema. Links: jeweils ein repräsentatives Ergebnis für einen
Patienten mit SLE und eine gesunde Kontrolle, rechts: kumulative Daten, (blau: Patienten mit
SLE, grau: gesunde Kontrollen). Stimulierte DC ohne Kokultur wurden auf 100 % gesetzt und
das Ergebnis der Kokultur prozentual darauf bezogen.
65
Cosima Kretz
3 Ergebnisse
Abbildung 10: Expression von Annexin 1 auf der Oberfläche apoptotischer neutrophiler Granulozyten. (A) Repräsentatives Ergebnis der durchflusszyotmetrischen Analyse von Annexin 1
auf der Oberfläche apoptotischer neutrophiler Granulozyten von Patienten mit SLE (SLE) oder
gesunden Kontrollen (K) (grau gefüllt: Hintergrundfluoreszenz, graue Linie: Tag 0, gepunktete
Linie: Tag 1, gestrichelte Linie: Tag 2, schwarze Linie: Tag 3) (B) Kumulatives Ergebnis (blau:
Patienten mit SLE, grau: gesunde Kontrollen).
gesunden Kontrollen bezüglich der Menge und dem zeitlichem Verlauf der Annexin 1
Externalisierung (Abb. 10B). Daraus lässt sich schließen, dass Expression und Externalisierung von Annexin 1 bei neutrophilen Granulozyten von Patienten mit SLE
nicht verändert sind. Da die apoptotischen neutrophilen Granulozyten von Patienten
mit SLE im Vergleich zu gesunden Kontrollen kein unterschiedliches Verhalten in der
Suppression aufweisen (siehe Abb. 6B), erscheint ein veränderter Einfluss auf die Suppression von DC durch Mutation von Annexin 1 unwahrscheinlich.
3.6
Etablierung eines Nachweissystems für Antikörper gegen
Annexin 1 im Serum
Autoantikörper spielen eine große Rolle in der Pathogenese des SLE. Bereits vor einigen
Jahren wurde gezeigt, dass im Serum von Patienten mit SLE Antikörper gegen verschiedene Annexine auftreten (Bastian et al. 1994; Goulding et al. 1989). Bei einigen
Patienten mit SLE wurden Antikörpertiter festgestellt, die über denen der Vergleichkohorte gesunder Kontrollen lagen. In diesem Zusammenhang stellte sich die Frage, ob
die Antikörper in der Lage sind, an Annexin 1 auf der Oberfläche apoptotischer Zellen
zu binden und dadurch den Effekt von Annexin 1 zu blockieren. Zudem könnten Antikörper gegen Annexin 1 ein diagnostisches Hilfsmittel darstellen und das Spektrum
der Laboruntersuchungen bei dieser Erkrankung erweitern. Da keine kommerziellen
66
Cosima Kretz
3 Ergebnisse
Systeme zum Nachweis von Annexin 1 zur Verfügung stehen, musste ein Nachweissystem für Antikörper gegen Annexin 1 etabliert werden. Dazu wurden verschiedene
Formen eines ELISA getestet (Daten nicht gezeigt). Ein ELISA mit einer direkten Bindung von rekombinantem Annexin 1 an die ELISA-Platte, nachfolgender Inkubation
mit humanen Seren und anschließender Detektion mit gegen humanes IgG gerichteter,
an Meerettich-Peroxidase gebundener Antikörper zeigte die besten Ergebnisse. Um die
Qualität des ELISA zu überprüfen, wurden Seren von Patienten mit SLE und gesunden
Kontrollen sowohl im ELISA, als auch in der Immunopräzipitation von aufgereinigtem
Annexin 1 getestet. Die nachgewiesenen Mengen an Antikörpern, die gegen Annexin 1
gerichtet sind, sind vergleichbar (Abb. 11A). Als Negativkontrolle wurden 56 Seren
von gesunden Kontrollen verwendet. Über die Häufigkeitsverteilung der Kontrollgruppe wurde eine untere Testgrenze bei 95 % der Population bestimmt (Abb. 11B). Werte,
die über dieser Grenze liegen, werden als positiv angesehen. Danach wurden Seren von
Patienten mit SLE analysiert und ein Serum, das sich als stark positiv erwies, als
positive Kontrollreferenz für alle nachfolgenden Tests verwendet. Um einen Überblick
über das Verhältnis von positiven zu negativen Patientenseren zu erhalten, wurde eine
Gruppe von 42 Patienten mit SLE untersucht (Abb. 11C). Von dieser Gruppe zeigen
12 Seren ein positives Testergebnis. Zum Vergleich wurden 65 Seren von Patienten mit
kutanem Lupus erythematodes (engl.: cutaneous lupus erythematosus = CLE) eingeschlossen. Beim CLE handelt es sich um eine nicht systemische Erkrankung, die sich
weitgehend auf die Haut beschränkt. Die Abgrenzung von SLE und CLE erfolgt mit
Hilfe der ACR-Kriterien. In den ACR-Kriterien ist die Haut als von der Krankheit betroffenes Organ durch vier Kriterien stark gewichtet. Dieser Umstand kann dazu führen,
dass Patienten mit CLE durch das Vorhandensein von unterschiedlichen Kriterien der
Haut fälschlicherweise als Patienten mit SLE eingestuft und damit überbewertet werden (Kuhn et al. 2007).
12 von 42 (29 %, exakte Vertrauensgrenze (VG): 15,72 %-44,58 %) Patienten mit SLE
zeigen ein positives Ergebnis für Autoantikörper gegen Annexin 1, während dies nur
auf 7 von 65 (11 %, VG: 4,44 %-20,94 %) Patienten mit CLE zutrifft. 3 von 56 (5 %,
VG: 1,12 %-14,87 %) gesunde Kontrollen sind positiv für Autoantikörper gegen Annexin 1. Daraus ergibt sich bei einer Spezifität (Wahrscheinlichkeitsmaß, Gesunde richtig
zu erfassen) von 95 % eine Sensitivität (Wahrscheinlichkeitsmaß, Kranke richtig zu
erfassen) des Tests von 29 % für SLE und von 11 % für CLE, sowie ein positiver Vorhersagewert (Wahrscheinlichkeit, dass eine Person mit positivem Test auch wirklich
67
Cosima Kretz
3 Ergebnisse
krank ist) von 80 % für SLE und 70 % für CLE. Der negative Vorhersagewert (Wahrscheinlichkeit, dass eine Person mit negativem Testergebnis auch wirklich gesund ist)
liegt für SLE bei 76 % und für CLE bei 48 %. Zusätzlich wurde eine Validierung
der Experiment-zu-Experiment-Abweichungen durchgeführt, indem auf jeder Platte 4
Kontrollseren mitgeführt wurden. Der Variationskoeffizient, der ein Maß für die InterExperiment-Schwankungen ist, liegt bei 12,2 %. Der Test gewährleistet damit einen
kleinen Schwankungsbereich und ein hohes Maß an Spezifität.
Aus den Ergebnissen lässt sich schließen, dass das Vorhandensein von anti-Annexin 1
Antikörpern ein besseres Vorhersagekriterium für SLE als für CLE ist, da mit nur 11 %
ein sehr geringer Anteil der Patienten mit CLE dieses Kriterium erfüllt, im Vergleich zu
29 % bei Patienten mit SLE. In Abbildung 11B kann man erkennen, dass nicht nur die
Anzahl der positiven Seren für Patienten mit SLE höher liegt, sondern dass sich auch
die Mediane von SLE und CLE signifikant vom Median der Seren gesunder Kontrollen
unterscheiden (SLE vs. CLE: p-Wert=0,0303, SLE vs. K: p-Wert¡0,0001, CLE vs. K:
p-Wert¡0,0001).
3.7
Antikörper aus dem Serum von Patienten mit SLE binden
an apoptotische Jurkat T-Zellen
Seren von Patienten mit SLE enthalten Antikörper gegen nukleäre Antigene, gegen
doppelsträngige DNA und, wie in Abbildung 11 gezeigt, teilweise auch gegen Annexin 1. Die Produktion von Antikörper gegen Annexin 1 könnte funktionelle Relevanz
haben, indem z.B. Antikörper gegen Annexin 1 die Funktion von Annexin 1 auf der
Oberfläche apoptotischer Zellen blockieren und damit zu einer verminderten suppressiven Wirkung apoptotischer Zellen führen könnten.
Um einen möglichen Zusammenhang zwischen Antikörpern gegen Annexin 1 und verminderter Suppression der DC zu untersuchen, wurde analysiert, ob Antikörper aus
dem Serum in der Lage sind, an apoptotische Zellen zu binden. Dazu wurden apoptotische Jurkat T-Zellen mit Seren von gesunden Kontrollen und Patienten mit SLE
inkubiert. Der Anteil der gebundenen Antikörper wurde mittels Durchflusszytometrie
quantifiziert. Um sicherzustellen, dass die Antikörper die apoptotischen Jurkat T-Zellen
und nicht lebenden Zellen binden, wurden die Zellen zusätzlich mit Annexin V und
7AAD gefärbt und die entsprechenden Populationen im Durchflusszytometer getrennt
68
Cosima Kretz
3 Ergebnisse
Abbildung 11: Nachweis von Autoantikörpern gegen Annexin 1 im Serum. (A) Nachweis von
Antikörpern gegen Annexin 1 im Serum (oben: ELISA-Ergebnis, grau: gesunde Kontrolle, blau:
Patienten mit SLE; unten: Westernblot der Immunopräzipitation von gereinigtem Annexin 1
der selben Seren) (B) Häufigkeitsverteilung der ELISA-Ergebnisse zum Nachweis von Autoantikörpern gegen Annexin 1 im Serum (grau: K, rot: CLE, blau: SLE). (C) Kumulatives Ergebnis
des ELISA (blau: Patienten mit SLE, rot: CLE-Patienten, grau: gesunde Kontrollen). Die untere
Testgrenze für die Positivität des Tests wurde bei 95 % der Verteilung des anti-Annexin 1 Antikörpergehalts der Seren gesunder Kontrollen gesetzt.(*: p-Wert=0,0303, ***: p-Wert<0,0001)
voneinander betrachtet. Dabei ergab sich, dass die Seren in keinem Fall an lebende
Jurkat T-Zellen binden (Abb.12A). Im Gegensatz zu den Seren von Patienten mit SLE
binden die Seren der gesunden Kontrollen auch nicht an apoptotische Jurkat T-Zellen.
Die Stärke der Bindung ist jedoch unabhängig von dem Ergebnis im Annexin 1 ELISA
(Abb.12B). Bei differenzierter Betrachtung früh- und spätapoptotischer Zellen kann
man erkennen, dass eine größere Fraktion von Antikörpern aus dem Serum von Patienten mit SLE an spätapoptotische Zellen bindet, die ihre Membranintegrität bereits
verloren haben (Daten nicht gezeigt). Dies ist nicht weiter verwunderlich, da bei allen
untersuchten Patienten anti-dsDNA Antikörper und ANA nachgewiesen wurden.
69
Cosima Kretz
3 Ergebnisse
Abbildung 12: Antikörper aus den Seren von Patienten mit SLE binden an apoptotische Jurkat T-Zellen. (A) Durchflusszytometrische Analyse lebender und apoptotischer J16 (B) nach
der Inkubation mit Protein A-aufgereinigtem Serum (30 µg/106 J16, grau gefüllt: Isotypkontrolle; schwarz: gesunde Kontrolle, blau: Patient mit SLE, negativ im ELISA für Annexin 1; pink:
Patient mit SLE, positiv im ELISA für Annexin 1). (C) Versuchsaufbau: Zugabe von Protein Aaufgereinigten Serumkomponenten zu J16, danach Entfernung des ungebundenen Anteils durch
Waschen, Kokultur mit U937-Zellen und anschließender Messung von TNF-Sekretion mittels ELISA. (D) Repräsentative Ergebnisse des in (C) beschriebenen Versuchs (weiß: U937 ohne Kokultur,
schwarz: Kokultur mit unbehandelten J16, grau: Seren von gesunden Kontrollen, blau: Seren von
Patienten mit SLE). Seren, die im ELISA als positiv für Autoantikörper gegen Annexin 1 gewertet
wurden, sind mit einem Kreis gekennzeichnet.
70
Cosima Kretz
3.8
3 Ergebnisse
Antikörper haben einen geringen Einfluss auf die
Supprimierbarkeit von U937-Zellen
Antikörper von Patienten mit SLE können an apoptotische Zellen binden (Abb.12B).
Im Folgenden wurde näher untersucht, ob diese Bindung auch funktionelle Konsequenzen bei der Suppression von DC hat. Um den Einfluss der Seren vergleichen zu können
und den Effekt der Antikörper zu testen, wurde die Antikörperfraktion aus dem entsprechenden Serum über Protein A-Sepharose aufgereinigt. Eine derartige AntikörperPräparation enthält auf Grund der Bindungseigenschaften von Protein A überwiegend
Antikörper der Isotypen IgG1 und IgG2 sowie IgM, IgA und IgE, die mit niedrigerer
Affinität gebunden werden.
Apoptotische Jurkat T-Zellen wurden mit der gleichen Menge von Antikörpern aus
Seren von Patienten mit SLE und gesunden Kontrollen vorinkubiert und in einem Kokulturexperiment mit U937-Zellen eingesetzt, das unter den gleichen Bedingungen wie
in 3.2 durchgeführt wurde (Abb. 12C). Die Antikörper beeinflussen die Suppression
der U937-Zellen hinsichtlich der TNF-Produktion nur minimal (Abb.12D). Die Effekte
lassen sich jedoch nicht eindeutig mit den serologischen Parametern (Vorhandensein
von anti-dsDNA Antikörpern, ANA oder Antikörper gegen Annexin 1) in Zusammenhang bringen. Zudem sind die Antikörper nicht in der Lage, den suppressiven Effekt
der apoptotischen Zellen aufzuheben.
Analoge Kokulturexperimente wurden mit primären humanen DC durchgeführt. In diesen zeigen sich keine Effekte, die durch das Vorhandensein bestimmter Autoantikörper
erklärt werden können, und im Vergleich zu den Experimenten mit U937-Zellen kann
auch hier der suppressive Effekt der apoptotischen Zellen nicht aufgehoben werden
(Daten nicht gezeigt). Insbesondere lässt sich weder mit U937-Zellen noch mit DC eine blockierende Funktion der Seren nachweisen, die für Annexin 1 Antikörper positiv
getestet wurden.
3.9
Antikörper haben einen geringen Einfluss auf die
Phagozytoserate
Um zu prüfen, ob die Antikörper aus Seren von Patienten mit SLE einen Einfluss auf die
Phagozytoserate haben, wurden apoptotische Jurkat T-Zellen direkt nach der Apoptoseinduktion durch UV-C mit einem fluoreszierenden Membranfarbstoff gefärbt und kurz
vor der Verwendung im Kokulturexperiment mit aufgereinigter Antikörperfraktion des
71
Cosima Kretz
3 Ergebnisse
entsprechenden Serums für 15 Minuten vorinkubiert. Die nicht gebundenen Bestandteile wurden durch Waschen entfernt. Diese Zellen wurden dann mit U937-Zellen oder
primären DC kokultiviert. Als bestes Verhältnis zwischen Phagozyten und apoptotischen Zellen erwies sich ein Verhältnis von 1:1, da eine größere Anzahl apoptotischer
Zellen im Verhältnis zu den Phagozyten die Aufnahme nicht weiter steigern kann (Daten nicht gezeigt). Im zeitlichen Verlauf konnte festgestellt werden, dass die Phagozytoserate bereits nach 15 Minuten ihr Maximum erreicht hat (Daten nicht gezeigt).
Um eventuelle Unreinheiten der primären DC auszuschließen und die aufgenommenen
Jurkat T-Zellen von den nicht aufgenommenen zu unterscheiden, wurden die Zellen
nach dem Abstoppen der Reaktion mit an FITC gekoppelten Antikörpern gegen CD31
(U937-Zellen) bzw. gegen CD11b (DC) gefärbt. Jurkat T-Zellen sind für beide Moleküle
negativ.
Dadurch lassen sich in der Auswertung der durchflusszytometrischen Daten die nicht
phagozytierten Jurkat T-Zellen und die nicht phagozytierenden DC leicht unterscheiden, da sie jeweils nur für ein Fluorophor positiv sind (Abb. 13A). Bei Zellen, die
positiv für beide Fluoreszenzen sind, handelt es sich um DC, die apoptotische Jurkat
T-Zellen inkorporiert oder an ihre Membran angelagert haben (Abb. 13B). Als Kontrolle werden lebende J16 T-Zellen verwendet, die teilweise auch inkorporiert werden,
aber zu einem weit geringeren Anteil als tote Zellen. Diese Aufnahme kann zum Teil
mit einem geringen Anteil apoptotischer Zellen in der Kultur und zum anderen durch
einen Anteil unspezifischer Phagozytose erklärt werden.
In diesen Experimenten lassen sich geringe Unterschiede zwischen den unterschiedlichen Seren von Patienten mit SLE und gesunden Kontrollen und im Vergleich zur ohne
Serum behandelten Kontrolle erkennen. Diese Unterschiede sind in ihrem Ausmaß aber
nicht signifikant und nicht ausreichend, um ein gestörtes Verhalten der DC zu postulieren, das zu einer verminderten Toleranzinduktion führen könnte in vivo (Abb. 13C).
3.10
Die Anzahl der Treg unterscheidet sich nicht in Patienten
mit SLE und gesunden Kontrollen
Die suppressiven Eigenschaften tolerogener DC zeigen sich nicht nur in einer Hemmung
der Expression pro-inflammatorischer und in der Induktion anti-inflammatorischer Zytokine, sondern beinhalten auch ein verändertes Verhalten hinsichtlich der Interaktion
72
Cosima Kretz
3 Ergebnisse
Abbildung 13: Antikörper aus dem Serum von SLE Patienten haben einen geringen Einfluss
auf die Phagozytoserate. (A) Repräsentatives Ergebnis eines Phagozytoseexperiments. Dot-Blot
vor Phagozytose (Phagozyten (FITC) und apoptotische Zellen (DID) lassen sich gut von einander trennen) (B) Dot-Blot nach 15 min Inkubation (doppelpositive Zellen (FITC und DID) repräsentieren phagozytierende Zellen)(C) Quantitatives Ergebnis eines Phagozytose-Experiments
(weiss: Kokultur mit lebenden J16, schwarz: apoptotische J16 ohne Behandlung mit Serumkomponenten, grau: Serumkomponenten von gesunden Kontrollen, blau: Serumkomponenten von Patienten mit SLE). Seren, die im ELISA als positiv für Antikörper gegen Annexin 1 gewertet
wurden, sind mit einem Kreis gekennzeichnet.
mit T-Zellen. Auf diese Weise können z.B. T-Zellen in vivo von tolerogenen DC zu
Treg umgewandelt werden (Min et al. 2003). In vitro ist es aus technischen Gründen
meistens schwierig, eine solche Umwandlung nachzuweisen.
Treg zeigen eine hohe Expression von CD25 auf der Oberfläche und eine intrazelluläre
Expression des Transkriptionsfaktors FoxP3 (dem zur Zeit einzigen gut nachweisbaren
Marker für Treg im humanen System). Zudem weisen Treg einen Phänotyp auf, der
dem von Gedächtnis-T-Zellen ähnelt. Auf der Oberfläche lässt sich CD45RO als charakteristisches Molekül dieses Phänotyps nachweisen.
Ein Hinweis für eine gestörte Induktion von Treg durch DC in Patienten mit SLE wäre
73
Cosima Kretz
3 Ergebnisse
Abbildung 14: Quantifizierung von Treg im Blut von Patienten mit SLE. Beispiele für die
Abgrenzung der einzelnen Populationen: (A) Lymphozytenpopulation, die T-Zellen enthält (P1),
(B) CD4+ T-Zellen (P2), (C) FoxP3+ CD25+/++ aus CD4+ (P3), bzw. FoxP3+ CD25++ aus
CD4+ (P4).(D) Quantitativer Vergleich von FoxP3+ CD25+/++ -Treg und FoxP3+ CD25++ Treg
(E) (SLEDAI ≤4: SLE inaktiv, SLEDAI >4: SLE aktiv, * p=0,0187, ** p=0,0012).
eine Reduktion der Anzahl von Treg im peripheren Blut. Um dies zu untersuchen, wurden Treg aus peripherem Blut von Patienten mit SLE und gesunden Kontrollen mittels
Durchflusszytometrie quantifiziert. Dazu wurde zunächst die Population eingegrenzt,
die T-Zellen enthält (P1, Abb. 14A). Dann wurden die CD4+ Zellen selektiert (P2,
Abb. 14B) und nachfolgend aus diesen die FoxP3+ Zellen quantifiziert (P3, Abb. 14C),
bzw. die Anzahl der FoxP3+ CD25++ bestimmt, indem die untere Grenze dieser Population über die Obergrenze für CD25 in der FoxP3− -Fraktion festgelegt wurde (P4,
Abb. 14C). Durch diese Technik konnten aktivierte Tcon weitgehend ausgeschlossen
werden, da diese zwar auch einen FoxP3+ -Phänotyp haben, aber im Unterschied zu
Treg CD25 schwächer und nur transient exprimieren.
Die Menge der FoxP3+ CD25+/++ Treg ist vergleichbar zwischen den inaktiven Patienten mit SLE (SLEDAI ≤ 4; Median: 5,6 %) und den gesunden Kontrollen (Median:
5,5 %; Abb. 14D). Die aktiven Patienten zeigen eine signifikant erhöhte Anzahl dieser
Zellen (Median: 8,3 %) gegenüber den beiden anderen Gruppen (K (gesunde Kon-
74
Cosima Kretz
3 Ergebnisse
trollen) vs. SLE SLEDAI > 4: p=0,0012, SLE SLEDAI ≤ 4 vs. > 4: p=0,0187). In
Bezug auf die Anzahl der FoxP3+ CD25++ Treg lassen sich jedoch keine signifikanten
Unterschiede nachweisen. Daher sprechen die Daten der Quantifizierung von Treg nicht
dafür, dass eine Reduktion der Anzahl der Treg für die verminderte periphere Toleranz
verantwortlich ist. Eine funktionale Veränderung der Treg wäre in diesem Falle möglich,
konnte aber auf Grund des zu geringen Ausgangsmaterials an peripherem Blut nicht
analysiert werden.
Um der Frage nachzugehen, ob Treg aus Patienten mit SLE durch veränderte phänotypische Eigenschaften zur Pathogenese von SLE beitragen können, wurden weitere
Marker durchflusszytometrisch analysiert. CD45RO ist ein Molekül, das auf GedächtnisT-Zellen und auch auf Treg vermehrt gefunden wird. Naive T-Zellen exprimieren dagegen die Isoform CD45RA auf der Oberfläche. Nach Aktivierung und durch den Einfluss
von IL-2 wird CD45RA herunterreguliert und CD45RO wird vermehrt exprimiert. Unterschiede in der Expression dieses Moleküls würden auf eine veränderte Voraktivierung
hindeuten. In den hier vorgestellten Experimenten wurde die Anzahl der CD45RO+
Zellen unter den CD4+ FoxP3+ CD25+/++ analysiert. Es zeigen sich jedoch keine Unterschiede in der Anzahl der Treg, die für diesen Marker positiv sind (Abb. 15A).
CD27 kann ebenfalls auf Gedächtnis-T-Zellen nachgewiesen werden. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass CD27+ Treg einen suppressiven Phänotyp aufweisen (Koenen
et al. 2005; Ruprecht et al. 2005). Für diesen Marker zeigen sich nur geringe quantitative Unterschiede. Die Mediane liegen bei 94,3 % für gesunde Kontrollen, 94,9 %
für SLE mit SLEDAI ≤4 und 89,4 % für SLE mit SLEDAI >4 (Abb. 15B), so dass
die Ergebnisse für CD45RO unterstrichen werden. Die Marker CD62L (L-Selektin) und
CCR6 spielen eine entscheidende Rolle beim sogenannten T-Zell-Homing“. Dabei wer”
den im Fall von CCR6 T-Zellen durch Bindung der entsprechenden Liganden (CCL20
und β-Defensin) zu Entzündungsorten rekrutiert (Yamazaki et al. 2008; Kleinewietfeld
et al. 2005). CD62L dirigiert die T-Zellen zu den Lymphknoten und wird nach Aktivierung des T-Zell-Rezeptors herunterreguliert (Ermann et al. 2005). In Bezug auf CD62L
können keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden (Abb. 15C). CCR6 zeigt in
der Gruppe der aktiven Patienten mit SLE einen signifikant höheren Wert im Vergleich
zu den inaktiven Patienten mit SLE (Abb. 15D; p=0,0312). Dieser Unterschied lässt
sich nicht in den Werten für diesen Marker in der Gruppe der Tcon (CD4+ CD25− )
finden (Abb. 15E). Dieses Ergebis erscheint nicht verwunderlich, da bei Patienten mit
SLE vermehrt Entzündungen auftreten und dadurch insgesamt eine größere Anzahl von
75
Cosima Kretz
3 Ergebnisse
Abbildung 15: Charakterisierung von Treg im Blut von Patienten mit SLE. (A) Durchflusszytometrische Analyse für die Marker CD45RO, (B) CD27, (C) CD62L und (D-E) CCR6 (SLEDAI
≤4: SLE inaktiv, SLEDAI >4: SLE aktiv, * p=0,0312).
76
Cosima Kretz
3 Ergebnisse
T-Zellen rekrutiert wird. Somit liefern die Untersuchungen von Treg keine Hinweise auf
pathologische Veränderungen bei dieser Autoimmunerkrankung. Über eine veränderte
Funktionalität der Treg als Ursache des SLE finden sich in der Literatur sehr widersprüchliche Daten und weitere Untersuchungen sind nötig, um die Beteiligung der Treg
bei dieser Erkrankung zu klären.
77
Cosima Kretz
4
4 Diskussion
Diskussion
Die Aufgabe des Immunsystems besteht in der Abwehr von Pathogenen bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung der Toleranz gegenüber körpereigenen Strukturen. Falls das
empfindliche Gleichgewicht zwischen Immunität und Toleranz gestört wird, kann es
zu Autoimmunreaktionen kommen. SLE ist eine heterogene Autoimmunerkrankung,
deren Pathogenese bis heute weitgehend ungeklärt ist. Verschiedene Studien berichten
über ein vermehrtes Auftreten von apoptotischen Zellen im Blut von Patienten mit
SLE (Courtney et al. 1999; Ren et al. 2003; Landry 1977; Bijl et al. 2006; Shoshan
et al. 2001; Salmon et al. 1984). Die apoptotischen Zellen werden unter anderem von
DC aufgenommen, die nachfolgend darin enthaltene Antigene T-Zellen präsentieren.
Den DC kommt eine besondere Stellung zu, da ihr Verhalten über Toleranz vs. Immunität entscheidet. Die hier vorgestellte Arbeit beschäftigt sich mit der Frage, ob und
in welcher Weise das natürliche Zusammenspiel von apoptotischen Zellen und DC in
Patienten mit SLE gestört sein könnte.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass bei Patienten mit SLE im Vergleich zu gesunden Kontrollen kein intrinsischer Defekt der apoptotischen Zellen nachweisbar ist.
Neutrophile Granulozyten, die aus dem Blut von Patienten mit SLE isoliert wurden,
verhalten sich wie neutrophile Granulozyten von gesunden Kontrollen im Bezug auf den
zeitlichen Verlauf der Apoptose und die Apoptoserate. Darüber hinaus zeigen sich keine Unterschiede in der Fähigkeit, die durch TLR-Liganden induzierte TNF-Produktion
in U937-Zellen zu supprimieren. DC von Patienten mit SLE produzieren in vergleichbarem Maße wie DC von gesunden Kontrollen nach Stimulation mit LPS TNF bzw.
exprimieren in vergleichbarem Maße kostimulatorische Marker. Es lassen sich auch
keine signifikanten Unterschiede in der Supprimierbarkeit durch apoptotische Zellen
erkennen.
Annexin 1 ist ein Molekül, das früh im Verlauf der Apoptose externalisiert wird und
auf der Zelloberfläche an Phosphatidylserin bindet. In unserer Arbeitsgruppe wurde
gezeigt, dass mit Annexin 1 behandelte DC schwächer durch Gefahrensignale wie z.B.
LPS aktiviert werden (Weyd 2006; Dörner 2007). Das lässt sich sowohl durch die verminderte Sekretion anti-inflammatorischer Zytokine, als auch durch die verminderte
Oberflächenexpression von kostimulatorischen Molekülen nachweisen. Die Zugabe von
Annexin 1 in das Kulturmedium übt den gleichen Effekt auf DC aus, wie die Kokultur mit apoptotischen Zellen. Es erscheint daher wahrscheinlich, dass Annexin 1 für
78
Cosima Kretz
4 Diskussion
diesen Effekt verantwortlich ist. Somit ist Annexin 1 ein Molekül, das bei der Interaktion zwischen apoptotischen Zellen und DC eine Rolle spielt. Eine Störung der durch
Annexin 1 ausgelösten Prozesse kann daher möglicherweise zur Entstehung von Autoimmunkrankheiten beitragen.
Die Oberflächenexpression von Annexin 1 auf neutrophilen Granulozyten während der
Apoptose ist bei Patienten mit SLE im Vergleich zu gesunden Kontrollen sowohl im
Ausmaß der Exposition als auch im zeitlichen Verlauf unverändert. Bei 29 % der Patienten mit SLE lassen sich Antikörper gegen Annexin 1 nachweisen. Diese Antikörper
haben jedoch einen geringen Einfluß auf die Supprimierbarkeit von DC durch apoptotische Zellen. Ebenso ist das Phagozytoseverhalten primärer DC in Anwesenheit dieser
Antikörper nicht signifikant verändert. Da die Seren von Patienten mit SLE häufig Antikörper unterschiedlicher Spezifität enthalten, die in der Lage sind, an apoptotische
Zellen zu binden, ist der Einfluss von Antikörpern gegen Annexin 1 nicht eindeutig
nachweisbar, die Effekte sind aber als gering einzuschätzen.
DC können nicht nur durch die Interaktion mit apoptotischen Zellen supprimiert werden, sondern auch durch die Interaktion mit Treg. Bei einer Störung dieses Mechanismus der peripheren Toleranz treten im Maussystem Autoimmunreaktionen auf. In
dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Anzahl der Treg im peripheren Blut von Patienten
mit SLE im Vergleich zu gesunden Kontrollen nicht erniedrigt ist. Die Analyse weiterer Marker zeigt eine signifikante Erhöhung von CCR6 sowohl bei aktiven als auch
bei inaktiven Patienten mit SLE. CCR6 ist für die Rekrutierung der Treg an Orte der
Entzündung notwendig. Die vermehrte Expression von CCR6 auf Treg von Patienten
mit SLE kann dadurch erklärt werden, dass diese im Vergleich zu gesunden Kontrollen
vermehrt unter Entzündungen leiden.
4.1
Apoptotische neutrophile Granulozyten von Patienten mit
SLE und gesunden Kontrollen unterscheiden sich weder in
ihrem Apoptotseverhalten noch in der Fähigkeit, die
Aktivierung von U937-Zellen zu supprimieren
Verschiedene Gruppen berschreiben ein vermehrtes Auftreten apoptotischer Leukozyten im Blut von Patienten mit SLE (Perniok et al. 1998; Courtney et al. 1999; Ren
et al. 2003; Landry 1977; Bijl et al. 2006; Shoshan et al. 2001; Salmon et al. 1984). Um
79
Cosima Kretz
4 Diskussion
diesen Sachverhalt zu untersuchen, wurden neutrophile Granulozyten aus dem Blut von
Patienten mit SLE und gesunden Kontrollen isoliert. Neutrophile Granulozyten sind
ein gutes Modell zur Untersuchung der spontanen Apoptose, da sie in Kultur durch
das Fehlen von zytokininduzierten Überlebenssignalen spontan sterben. In den durchgeführten Versuchen konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen neutrophilen
Granulozyten aus dem Blut von Patienten mit SLE und gesunden Kontrollen in Bezug
auf den zeitlichen Verlauf der Apoptose und die Anzahl apoptotischer Zellen festgestellt
werden. Die Zellen zeigen ein vergleichbares Verhalten hinsichtlich Phosphatidylserinexposition auf der Oberfläche, DNA-Fragmentierung und Membranpermeabilisierung.
In diesem Punkt widersprechen die Daten den Arbeiten von Courtney et al. (1999),
Perniok et al. (1998) und Ren et al. (2003). Dieser Umstand ist möglicherweise auf Unterschiede in der Isolierung der Zellen und den verwendeten Kulturmedien und Serumzusätzen zurückzuführen. Courtney et al. (1999) und Perniok et al. (1998) analysierten
die Zellen mit Annexin 5- und PI-Färbung direkt nach der Isolierung. Die gezeigte
Abgrenzung der unterschiedlichen Populationen von apoptotischen und lebenden Zellen in den Ergebnissen der durchflusszytometrischen Untersuchung unterscheidet sich
zudem von der in dieser Arbeit angewandten und kann daher zu abweichenden Ergebnissen führen. Ren et al. (2003) führten May-Giemsa-Färbungen für den Nachweis der
Apoptose in neutrophilen Granulozyten durch und werteten nachfolgend mikroskopische Bilder aus. Die Bewertungskriterien für die Einteilung in apoptotische und lebende
Zellen werden jedoch in dieser Publikation nicht genauer dargelegt. Diese Methode ist
daher ohne ausreichende Standardisierung fraglich und kann als wenig vergleichbar angesehen werden. Aus diesem Umstand ergeben sich Probleme beim Vergleich dieser
Studie mit der hier gezeigten Analyse.
In den Experimenten dieser Arbeit wurden keine Unterschiede im Apoptoseverhalten
zwischen neutrophilen Granulozyten von Patienten mit SLE und gesunden Kontrollen
beobachtet. Ein zellintrinsischer Unterschied in der Apoptose wird daher durch diese
Daten nicht unterstützt. Es ist jedoch anzumerken, dass eine erhöhte Apoptoserate von
neutrophilen Granulozyten, die aus dem peripheren Blut von Patienten mit SLE isoliert wurden, nicht auszuschließen ist, da die Situation in vivo sehr viel komplexer sein
kann, als es durch die in vitro Bedingungen wiedergegeben werden kann. Serumfaktoren wie Antikörper, Zytokine oder Liganden für Apoptoserezeptoren könnten in vivo
eine entscheidende Rolle spielen und die Anzahl apoptotischer Zellen erhöhen. Andere
Gruppen haben in diesem Zusammenhang die Steigerung der Apoptoserate in Anwe80
Cosima Kretz
4 Diskussion
senheit von Autoimmnunserum beschrieben (Bengtsson et al. 2004, 2008; Ren et al.
2003; Klint et al. 2000). Diese Möglichkeit scheint jedoch auf Monozyten beschränkt
zu sein und ist auf Grund der vorliegenden Daten zumindest für neutrophile Granulozyten unwahrscheinlich, da sich keine Unterschiede in der Anzahl der apoptotischen
neutrophilen Granulozyten direkt nach der Isolierung detektieren ließen. Man müsste
somit einen selektiven Mechanismus für einzelne Zellarten postulieren.
Eine erhöhte Apoptoserate, die zu sekundärer Nekrose und damit zu Entzündungsreaktionen führt, ist nur eine Hypothese zur Pathogenese des SLE und wurde bisher nicht
durch experimentelle funktionelle Analysen bestätigt. Dass sich diese in den dargestellten Experimenten nicht bestätigt hat, schließt den Einfluss eines veränderten Apoptoseverhaltens nicht aus. Apoptotische Zellen könnten hinsichtlich ihrer Interaktion mit
phagozytierenden Zellen wie DC ein verändertes Verhalten aufweisen. Die Phagozytose
apoptotischer Zellen und der damit einhergehende suppressive Effekt auf DC können
wichtige Faktoren in der peripheren Toleranzinduktion sein. Eine verminderte Aufnahme oder eine veränderte Interaktion von apoptotischer Zelle und Phagozyt müssten sich
in einer verminderten Suppression der DC nach Stimulation mit Gefahrensignalen widerspiegeln. Die Suppressivität apoptotischer neutrophiler Granulozyten von Patienten
mit SLE war im Vergleich zu neutrophilen Granulozyten aus gesunden Kontrollen nicht
signifikant unterschiedlich. Auch in diesem Zusammenhang kann nicht ausgeschlossen
werden, dass lösliche Serumkomponenten in vivo einen starken Einfluss ausüben und
das Millieu die Phagozytoserate der apoptotischen Zellen oder den suppressiven Effekt
vermindert. In vitro wurde in Migrationsexperimenten gezeigt, dass Seren von Patienten mit SLE die Fähigkeiten von apoptotischen Zellen hemmen können, Makrophagen
anzulocken, um die eigene Beseitigung zu beschleunigen (Gaipl et al. 2007).
Im Bezug auf Makrophagen wurden bei Patienten mit SLE Defizite in der Phagozytose
von apoptotischen Zellen nachgewiesen (Herrmann et al. 1998; Baumann et al. 2002;
Gaipl et al. 2007). Die experimentellen Daten dieser Studien wurden jedoch größtenteils
durch mikroskopische Untersuchungen an immunhistologischen Schnitten erhoben und
lassen daher Zweifel an der korrekten Quantifizierung aufkommen. Zudem ist der Einfluss von Makrophagen auf die periphere Toleranzinduktion im Vergleich zu DC als
geringer zu bewerten.
81
Cosima Kretz
4.2
4 Diskussion
DC von Patienten mit SLE lassen sich in gleichem Maße
wie DC von gesunden Kontrollen durch Gefahrensignale stimulieren und werden durch die Aufnahme apoptotischer Zellen supprimiert
Von verschiedenen Gruppen wurde postuliert, dass die Phagozytose apoptotischer Zellen in Patienten mit SLE gestört ist (Baumann et al. 2002; Gaipl et al. 2007). Die
Folge wäre eine verminderte Suppression der Phagozyten und eine erhöhte Produktion
pro-inflammatorischer Zytokine nach Stimulation und ein Übergang der suppressiven
frühapoptotischen Zellen in möglicherweise nicht-suppressive sekundär nekrotische Zellen. Diese Hypothese wird durch die vorliegenden Experimente nicht unterstützt. DC
von Patienten mit SLE weisen eine vergleichbare Supprimierbarkeit durch apoptotische
Zellen wie DC von gesunden Kontrollen auf. Weiterhin zeigen sich keine Unterschiede in der Stimulierbarkeit der DC von Patienten mit SLE und gesunden Kontrollen
durch Stimulation mit Gefahrensignalen, wie z.B. LPS. Das spricht dafür, dass kein
zellintrinsischer Defekt hinsichtlich Aktivierbarkeit durch Gefahrensignale und Supprimierbarkeit durch apoptotischen Zellen vorliegt. Da zur Differenzierung der DC in vitro
standartisiertes FCS verwendet wurde, kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass
sich DC von Patienten mit SLE, die während ihrer Differenzierung möglicherweise einem pro-inflammatorischen Millieu ausgesetzt waren, in vivo anders verhalten.
In den meisten Studien wurden Makrophagen und nicht DC in Bezug auf ihre Phagozytosekapazität untersucht (Baumann et al. 2002; Gaipl et al. 2007). Diese Zellen
spielen jedoch eine geringere Rolle bei der Aktivierung autoreaktiver T-Zellen, da ihre
Hauptaufgabe in der Phagozytose und nicht in der Auslösung primärer Immunantworten besteht. Das Phagozytoseverhalten der DC von Patienten mit SLE ist hingegen
kaum untersucht worden. Phagozytose könnte insofern beim SLE eine wichtige Rolle
spielen, als dass DC möglicherweise sekundär nekrotisches Material aufnehmen und
in den Lymphknoten präsentieren. Die vorliegenden Ergebnisse widersprechen aber einem solchen Mechanismus und den Ergebnissen der anderen Arbeitsgruppen nicht. Im
Gegenteil kann festgestellt werden, dass weder apoptotische neutrophile Granulozyten
noch primäre DC einen zellintrinsischen Defekt aufweisen und damit einen direkten
Weg für eine Verminderung der peripheren Toleranz in vivo aufzeigen. Da DC als
entscheidender Schalter für die periphere Toleranzinduktion wirken, ist nicht auszuschließen, dass in der Pathogenese des SLE weitere Faktoren auf DC einwirken und so
82
Cosima Kretz
4 Diskussion
Autoimmunreaktionen ermöglichen.
4.3
Das Serum von Patienten mit SLE enthält Autoantikörper
gegen Annexin 1
Annexin 1 wurde in der Arbeitsgruppe von Prof. Krammer als ein Molekül entdeckt,
das in einem frühen Stadium der Apoptose externalisiert wird und auf der Zelloberfläche kalziumabhängig an Phosphatidylserin bindet (Weyd 2006; Riess 2006). Wenn
es als rekombinantes Molekül zu primären DC zugefügt wird, hemmt es deren Aktivierung durch Gefahrensignale. Die Sekretion pro-inflammatorischer Zytokine und die
Expression kostimulatorischer Moleküle auf der Oberfläche der DC sind vermindert.
Dieser Effekt kann (im Maussystem) durch F(ab)2 -Fragmente eines polyklonalen Kaninchenserums gegen Annexin 1 aufgehoben werden (Dörner 2007). Annexin 1 könnte
damit eine Rolle bei der Induktion peripherer Toleranz spielen und eine Störung dieses
Mechanismus könnte an der Pathogenese des SLE beteiligt sein.
Die hier dargestellten Ergebnisse zeigen keinen Unterschied in der Quantität und
dem zeitlichem Verlauf der Exposition von Annexin 1 auf der Oberfläche apoptotischer neutrophiler Granulozyten von Patienten mit SLE und gesunden Kontrollen.
Dies passt sehr gut zu den Beobachtungen der anderen apoptotischen Ereignisse, die
in dieser Arbeit untersucht worden sind, wie z.B. Phosphatidylserinexposition, DNAFragmentierung und Membranpermeabilisierung und bestärkt die Aussage, dass neutrophile Granulozyten von Patienten mit SLE im Vergleich zu gesunden Kontrollen
keine intrinsischen Veränderungen hinsichtlich Apoptose aufweisen.
Das Annexin 1-System könnte aber auch indirekt beeinflusst sein. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass mit 29 % ein hoher Prozentsatz der Patienten mit SLE Antikörper gegen
Annexin 1 im Serum aufweisen. Hingegen wurden bei weniger als halb so vielen Patienten mit CLE (11 %), bei denen sich die Erkrankung primär auf die Haut beschränkt,
Antikörper gegen Annexin 1 nachgewiesen. Andere Antikörper wie z.B. ANA werden
im Vergleich dazu bei über 90 % der Patienten mit SLE nachgewiesen; anti-dsDNA
Antikörper, die beim SLE als pathognomonisch angesehen werden, treten bei 40-60 %
der Patienten mit SLE auf, ebenso wie anti-Ro/SSA Antikörper, die charackteristisch
für den subakut kutanen Lupus erythematodes sind. Anti-nRNP Antikörper finden
sich bei 20-30 % der Patienten und sind vergleichbar in der Häufigkeit zu Antikörpern
83
Cosima Kretz
4 Diskussion
gegen Annexin 1 (Übersicht der labordiagnostisch relevanten Antikörper im SLE in
Thumb 2001). Daneben werden anti-Sm Antikörper und anti-La/SSB Antikörper nur
in 10-15 %, bzw. 15-20 % der Patienten mit SLE nachgewiesen. Die Häufigkeit des
Auftretens von Antikörpern gegen Annexin 1 ist somit teilweise vergleichbar mit den
bereits bekannten Antikörpern bei Patienten mit SLE.
In den vorliegenden Experimenten zeigte sich, dass Seren von Patienten mit SLE Antikörper der IgG-Klasse besitzen, die spezifisch an apoptotische Zellen binden.
Hinsichtlich der funktionellen Wirkung von Antikörpern gegen Annexin 1 auf die Supprimierbarkeit von DC und deren Phagozytoserate wurde jedoch in in vitro-Experimenten kein signifikanter Unterschied im Vergleich von Seren mit und ohne Antikörper
gegen Annexin 1 festgestellt. Es zeigten sich kleinere Abweichungen in Hinsicht sowohl einer verringerten als auch einer verstärkten Suppression. Eine Erklärung hierfür
kann zum einen sein, dass die Annexine möglicherweise ein weitgehend redundantes
System darstellen und der Ausfall einzelner Annexine kompensiert werden kann. Zum
anderen handelt es sich trotz der Aufreinigung der Seren über Protein A-Sepharose
um Gemische von Antikörpern, die viele unterschiedliche Epitope erkennen können.
Um den Effekt der Antikörper gegen Annexin 1 getrennt zu untersuchen, müssten affinitätsgereinigte Antikörper verwendet werden. Dies ist auf Grund der geringen Menge
spezifischer Antikörper im Serum technisch schwierig. Jedoch kann daher vermutet
werden, dass Antikörper gegen Annexin 1 nicht der ursächliche Mechanismus sind, der
für den Einfluss des Immunserums verantwortlich ist.
Zusammenfassend haben Antikörper gegen Annexin 1 in den durchgeführten Experimenten weder einen blockierenden Effekt auf die Suppressivität apoptotischer Zellen
gegenüber DC noch auf die Phagozytose apoptotischer Zellen durch DC. Es erscheint
daher unwahrscheinlich, dass das Annexin 1-System für die Pathogenese des SLE eine
entscheidende Rolle spielt.
4.4
Treg sind in Anzahl und Phänotyp nicht verändert
Treg wurden als weiterer zellulärer Bestandteil der peripheren Toleranz bzw. als essentielle Komponenten zur Verhinderung von Autoimmunerkrankungen beschrieben
(Nishizuka and Sakakura 1969). Es konnte inbesondere im Mausmodell gezeigt werden,
dass nach Depletion dieser Zellen leichter Autoimmunerkrankungen induziert werden
84
Cosima Kretz
4 Diskussion
können, wie z.B. Diabetes mellitus, experimentelle Autoimmunenzephalitis, oder es
entsteht spontan eine scurfy-ähnliche Erkankung (Tritt et al. 2008; Reddy et al. 2005;
Lahl et al. 2007). Im Menschen gibt es Hinweise, dass im Zusammenhang mit Krebserkrankungen die lokale Verminderung der Anzahl der Treg hilfreich sein kann, um die
Toleranz gegen den Tumor, der die Merkmale köpereigenen Gewebes trägt, aufzuheben
(Morse et al. 2008; Rasku et al. 2008; Mahnke et al. 2007). In diesem Zusammenhang
wird das Risiko der Induktion von Autoimmunerkrankungen immer wieder diskutiert.
In der Pathogenese des SLE könnte das verminderte Auftreten von Treg eine Rolle
spielen, indem die T-Zellantwort bei einer Entzündung nicht ausreichend kontrolliert
ist und somit auch Tcon aktiviert werden, die Autoantigene erkennen. Ob es sich um
eine reduzierte Entstehung im Thymus oder eine verminderte Induktion in der Peripherie handelt, ist bei einer Quantifizierung zunächst nicht festzustellen. Experimente
mit MRL/lpr-Mäusen, bei denen ein Defekt im CD95 -Gen zur verminderten Expression von CD95 führt und die einen Lupus-ähnlichen Phänotyp mit erhöhten Mengen
von Autoantikörpern und zirkulierenden Immunkomplexen sowie nachfolgender LupusNephritis aufweisen, sprechen für eine defiziente Induktion in der Peripherie, bei der
ein verändertes Verhalten der Tcon und DC eine wichtige Rolle spielt (Yang et al.
2008). Die Mäuse zeigten eine verringerte Anzahl von Treg in der Peripherie, die durch
eine defiziente IL-2-Produktion von Teff und damit verbundenen Defekten von DC hervorgerufen wurde. Durch Zugabe von IL-2 konnte die suppressive Kapazität der Treg
wieder hergestellt und die SLE-ähnlich Symptomatik verringert werden.
In den durchgeführten Experimenten konnte keine erniedrigte Anzahl sowohl der FoxP3+
CD25+/++ als auch der FoxP3+ CD25++ Treg festgestellt werden. Weiterhin unterscheiden sich die Zellen von Patienten mit SLE hinsichtlich der Expression von CD45RO,
CD45RA, CD27 und CD62L phänotypisch nicht von gesunden Kontrollen. Es gibt sowohl Publikationen, die eine Erniedrigung der Treg bei Patienten mit SLE beschreiben
(Valencia et al. 2007; Miyara et al. 2005; Kuhn et al. 2009), als auch solche, die eine
Erhöhung der Anzahl der Treg im peripheren Blut postulieren (Suarez et al. 2006;
Lin et al. 2007; Kuhn et al. 2009). Die unterschiedliche Verwendung von Markern wie
CD25 und FoxP3, sowie unterschiedliche Auswertestrategien der Durchflusszytometrie
könnten einen Einfluss auf die Ergebnisse haben. Zusätzlich spielen der Aktivitätsstatus
der Erkrankung und die Medikation der untersuchten Patienten eine Rolle. In der Literatur wurde z.B. beschrieben, dass die Einnahme von Glukokortikosteroiden mit einem
Anstieg der Anzahl von Treg im peripheren Blut korreliert (Azab et al. 2008).
85
Cosima Kretz
4 Diskussion
In der Literatur wird auch kontrovers diskutiert, ob Treg von Patienten mit SLE einen
funktionalen Defekt aufweisen (Bonelli et al. 2008), oder ob eventuell ein Defekt der
Tcon besteht, sodass diese sich schlechter supprimieren lassen (Venigalla et al. 2008).
In der vorliegenden Arbeit konnte jedoch die Funktionalität der Zellen auf Grund der
geringen Menge an Ausgangsmaterial nicht untersucht werden. Zukünftige Studien sind
daher notwendig, um diesen Sachverhalt zu klären.
4.5
Die Auswahl der Patienten spielt möglicherweise eine
Rolle für die erzielten Ergebnisse
Da der SLE eine heterogene Autoimmunerkrankung ist, zeigen die Patienten unterschiedliche bzw. unterschiedlich stark ausgeprägte Symptome sowie eine Variabilität
im Ansprechen auf Medikamente. In die vorliegenden Arbeit wurden nur solche Patienten eingeschlossen, die neben einer gesicherten Diagnose auch Antikörper gegen
dsDNA aufwiesen, die als besonders spezifisch für einen SLE angesehen werden. Insgesamt wurden in dieser Arbeit Patienten mit niedrigen Aktivitätsgrad untersucht,
um mögliche zellintrinsische Effekte zu identifizieren. Zum einen wäre dies durch die
sekundären Effekte bei sehr aktivem Krankheitsbild schwerer möglich gewesen, zum
anderen werden aktive Patienten mit unterschiedlichen systemischen Medikamenten
therapiert, und damit könnten sich die zellintrinsischen Effekte ebenfalls verändern.
Das Auftreten bestimmter Antikörper spielt nicht nur für die Aktivität des SLE eine
Rolle, sondern kann auch zu weiteren phänotypischen Merkmalen führen. Häufig bilden sich Immunkomplexe aus Antigenen mit den gegen sie gebildeten Antikörpern, die
sich durch ihre Größe in den feinen Gängen der Niere festsetzen und dort Immunzellen
aus dem Blut aktivieren und dadurch zu einer sogenannten Lupus-Nephritis“ führen
”
können. Daneben wurde beschrieben, dass Immunkomplexe zu einer Reifung und Stimulation der DC führen und dadurch eine sterile Immunreaktion auslösen könnten
(Laborde et al. 2007). Antikörper und das Auftreten von Immunkomplexen spielen daher eine wichtige Rolle für den Krankheitsverlauf des SLE. Es kann nicht ausgeschlossen
werden, dass sie einen Einfluss auf die Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz haben.
Weiterhin kann die Medikation der Patienten mit SLE Einfluss auf die Analyse der untersuchten Zellen haben. Die Wirkung von Glukokortikosteroiden auf die Anzahl von
86
Cosima Kretz
4 Diskussion
Treg wurde bereits erläutert. Außerdem ist es nicht klar, wie lang z.B. die immunsuppressive Wirkung von Glukokortikosteroiden nach der Isolierung in vitro bei den
einzelnen Zellarten anhält. Ähnliches gilt für Immunsuppressiva und Antimalariamittel. Unter den Patienten mit SLE, die in die Arbeit eingeschlossen worden sind, waren
nur zwei Patienten ohne systemische Behandlung. Die mit diesen Zellen gewonnenen
Ergebnisse unterscheiden sich jedoch nicht von denen der Patienten, die eine systemische Behandlung erhielten. Um die Auswirkungen einzelner therapeutischer Strategien
zu vergleichen, wären wesentlich größere Patientenzahlen dieser seltenen Autoimmunerkrankung nötig gewesen.
4.6
Zytokine und andere lösliche Faktoren haben einen
Einfluss auf die Toleranzinduktion
Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten funktionellen Experimente haben sich
als geeignet erwiesen, um die Interaktion zwischen apoptotischen Zellen und DC zu
untersuchen. Derselbe Versuchsaufbau kann verwendet werden, um auch den Einfluss
weiterer Faktoren zu analysieren.
Das Zytokinmilieu wurde von vielen Autoren als wichtiger Faktor für die Pathogenese
des SLE dargestellt. So konnten die Zytokine IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-17,
IL-18, MCP-1 (engl.: monocyte chemoattractive protein-1) und IFNα im Vergleich zu
gesunden Kontrollen vermehrt im Serum von Patienten mit SLE nachgewiesen werden (al Janadi et al. 1993; Wong et al. 2000; Amerio et al. 2002; Alcocer-Varela et al.
1992; Nagahama et al. 2001; Asanuma et al. 2006; Suh et al. 2006; Lit et al. 2006;
Beebe et al. 2002; Rovin et al. 2002). Zur Expression von IFNγ und TNF beim SLE
finden sich widersprüchliche Aussagen in der Literatur (Miyake et al. 2002; Suh et al.
2006; Dean et al. 2000). Für IL-1β wurde beschrieben, dass es nicht nur im Serum
von Patienten mit SLE erhöht ist, sondern auch PBMC (mononukleäre Zellen des peripheren Bluts, engl.: peripheral blood mononuclear cells) eine erhöhte Expression auf
RNA-Ebene aufweisen, wenn diese mit Serum von Patienten mit SLE kultiviert wurden
(Means et al. 2005). Eine Blockade dieser mRNA-Expression führt zu einer Erniedrigung der spontanen IgG-Produktion; dies deutet darauf hin, dass IL-1β diese spontane
Produktion verstärkt (Jandl et al. 1987). Weiterhin ist beschrieben worden, dass IL6 von B-Zellen von Patienten mit SLE spontan produziert wird, und die Sekretion
87
Cosima Kretz
4 Diskussion
kann in PBMC durch die Zugabe von Serum von Patienten mit SLE induziert werden (Linker-Israeli et al. 1991). Die IL-10-Sekretion korreliert mit der Konzentration
von anti-dsDNA Antikörpern im Serum, und exogenes IL-10 kann die Produktion von
Antikörpern gegen einzel- oder doppelsträngige DNA erhöhen (Ronnelid et al. 2003;
Tyrrell-Price et al. 2001). Die Unterschiede in der IL-10-Sekretion sind vermutlich sowohl durch Umweltfaktoren als auch durch genetische Unterschiede bedingt (Grondal
et al. 2002; Nath et al. 2005). IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, IL-17, IL-18 und MCP-1 sind
pro-inflammatorische Zytokine, während IL-10 zu den anti-inflammatorischen Zytokinen gezählt wird.
Seit einiger Zeit konzentrieren sich die Untersuchungen beim SLE auf das Zytokin
IFNα, dem eine besondere Rolle in der Pathogenese dieser Autoimmunerkrankung zugeschrieben wird. IFNα führt zur Reifung und Voraktivierung von DC, wodurch die
Phagozytoserate sinkt und die Mobilität steigt. Im Serum von Patienten mit SLE
wurde IFNα in erhöhten Mengen nachgewiesen (Hooks et al. 1979). Bei Patienten,
die IFNα in hohen Dosen als Medikament gegen Krebserkrankungen oder chronische
Virusinfekte einnahmen, ist es zum Auftreten von Lupus-ähnlichen Symptomen und
erhöhten ANA Titern, sowie einer Anämie und Lyphopenie gekommen (Mehta et al.
1992; Ronnblom et al. 1991b,a; Schilling et al. 1991; Wandl et al. 1992). PBMC, die
mit Serum von Patienten mit SLE kultiviert wurden, produzierten vermehrt IFNα und
weisen eine verstärkte DC-Reifung auf (Blanco et al. 2001; Dall’era et al. 2005). Genexpressionsstudien zeigten, dass IFNα zur Expression eines bestimmten Spektrums
von IFNα-abhängigen Genen führt (Baechler et al. 2003, 2004; Bennett et al. 2003;
Crow and Wohlgemuth 2003; Han et al. 2003; Kirou et al. 2004, 2005) und dass diese
Interferon-Signatur“ in vielen Patienten mit SLE nachweisbar ist. IFNα ist also ein
”
wichtiger Kandidat, der für die Verminderung der peripheren Toleranz verantwortlich
sein könnte.
Es ist denkbar, dass die verschiedenen Faktoren im Serum von Patienten mit SLE
interagieren. Vallin et al. (1999a,b) zeigten, dass eine Kombination aus anti-dsDNA
Antikörpern und DNA eine IFNα-Produktion in PBMC hervorruft und Means et al.
(2005) wiesen nach, dass die IFNα-Produktion von PBMC vom Vorhandensein von
DNA im Serum abhängt. In diesem Zusammenhang spielen TLR 9 und FcγRIIa (engl.:
Fragment crystallizable-γ-Receptor IIa) eine wichtige Rolle. TLR 9 wurde als Rezeptor
beschrieben, der bakterielle DNA erkennt. FcγRIIa bindet die konstante Region von
IgGs; beide Rezeptoren kolokalisieren mit den Immunkomplexen auf der Oberfläche der
88
Cosima Kretz
4 Diskussion
Zelle, bevor die Sekretion von IFNα induziert wird (Means et al. 2005). Bisher konnte
jedoch keine direkte Korrelation zwischen Polymorphismen in diesen Molekülen und
dem Ausbruch der Krankheit festgestellt werden (De Jager et al. 2006; Hur et al. 2005;
Ng et al. 2005).
Eine besondere Bedeutung im Bezug auf die Produktion von IFNα kommt den plasmozytoiden DC (pDC) zu, die dadurch charakterisiert sind, dass sie nach Stimulation mit
mikrobieller DNA IFNα produzieren (Ronnblom and Alm 2001). Die Zellen reagieren
normalerweise nicht auf eukaryotische DNA, es wurden aber beschrieben, dass dieser
Mechanismus bei Autoimmunerkrankungen gestört ist und dass bei Patienten mit SLE
erhöhte Mengen von pDC nachgewiesen werden können (Jin et al. 2008).
Während die genannten Zytokine und Antikörper die periphere Toleranz stören könnten, wurde auch beschrieben, dass die Zellen von einigen Patienten mit SLE eine niedrigere Phagozytoserate aufweisen und dass dieser Umstand mit der erniedrigten Anzahl
von zirkulierenden Komplementfaktoren korreliert (Bijl et al. 2006). Die Komponenten der Komplementkaskade tragen durch ihre Fähigkeit zur Opsonisierung zu einer
beschleunigten Phagozytose bei und helfen damit bei der Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz (Gullstrand et al. 2009).
4.7
Modell der Krankheitsentwicklung im SLE
Die Pathogenese von SLE hat laut zahlreicher Studien vermutlich heterogene Ursachen.
Welche zellulären Komponenten für die Initiation verantwortlich sind, ist weitgehend
unklar. Abbildung 16 gibt einen Überblick über diese Zusammenhänge. Jede der dargestellten Komponenten wurde in einem Teil der Patienten mit SLE als verändert
beschrieben, und alle treten in einer Art Kreislauf miteinander in Wechselwirkung. So
lässt sich gut erklären, dass sich das System nach dem Auslösen der Krankheit selbst
erhält. Lösliche Serum-Komponenten wie z.B. Zytokine können sowohl zelluläre Bestandteile verändern als auch zur Aufrechterhaltung der Erkrankung beitragen.
Die Ergebnisse dieser Arbeit widersprechen der Hypothese, dass zellintrinsische Defekte für eine höhere Apoptoserate oder eine gestörte Interaktion von apoptotischen
Zellen sorgen. Die suppressive Wirkung von apoptotischen Zellen auf DC scheint in
Patienten mit SLE auf der zellulären Ebene unverändert zu sein. Dazu muss jedoch
angemerkt werden, dass diese Aussage nur für in vitro zu DC differenzierten Mono-
89
Cosima Kretz
4 Diskussion
Abbildung 16: Hypothetisches Modell der krankheitverlaufsfördernden Ereignisse im SLE. Es
ist ein Kreislauf dargestellt, bei dem der Anfangspunkt variabel ist und sich nach Initiation selbst
verstärkt. Apoptotische Zellen werden von myeloiden dendritischen Zellen (DC) aufgenommen
und üben einen suppressiven Effekt aus. Die Phagozytose kann durch Komplementfaktoren oder
Antikörper dahingehend verändert werden, dass DC autoreaktive T-Zellen aktivieren. Diese leisten autoreaktiven B-Zellen Hilfe und tragen zur deren Aktivierung bei. Autoreaktive B-Zellen
produzieren Autoantikörper, die mit Komponenten des Komplementsystems wechselwirken, es
aktivieren und zu einer Opsonisierung von apoptotische Zellen führen können. Komplementfaktoren können die Aufnahme von apoptotischen Zellen durch DC verstärken. Sind sie vermindet,
wie in einigen Patienten mit SLE beobachtet wurde, wird die Verweildauer apoptotischer Zellen
im Körper erhöht und die Exponierung von nukleären Antigenen begünstigt. pDC können durch
die Produktion von IFNα, das auf DC und B-Zellen aktivierend wirkt, beteiligt sein. (?: alle
Bestandteile dieses Systems, die in Patienten mit SLE potenziell verändert sein könnten.)
90
Cosima Kretz
4 Diskussion
zyten getroffen werden kann. Es ist ungeklärt, in wiefern lösliche Faktoren, wie z.B.
Zytokine oder spezifische Antikörper, einen modulierenden Effekt auf das Verhalten der
Zellen ausüben könnten. Ebenso spielt der Einfluss der Komponenten des KomplementSystems eine große Rolle für die Opsonisierung und Phagozytose apoptotischer Zellen.
Diese Einflüsse konnten in den durchgeführten Experimenten nicht untersucht werden.
Deswegen ist ein verändertes funktionales Verhalten der DC nach wie vor nicht auszuschließen, wobei jedoch der Einfluss löslicher Faktoren den Ausschlag geben würde.
Pro-inflammatorische Zytokine können durch plasmazytoide DC produziert werden, die
eine Untergruppe der DC darstellen. Sie reagieren in vivo auf die Stimulation durch
bakterielle DNA mit Expression von pro-inflammatorischen Zytokinen, wie z.B. IFNα.
Für diese Zellen wurde beschrieben, dass sie in Autoimmunerkrankungen wie dem
SLE in erhöhter Menge vorkommen und auf zellintrinsische DNA reagieren können.
Sie kommen daher als mögliche Quelle für IFNα in Frage. IFNα ist ein potentes
pro-inflammatorisches Zytokin, das DC voraktiveren kann und damit die Suppression apoptotischer Zellen aufheben kann. Zudem stimuliert es die Antikörperproduktion
von B-Zellen.
Neben den B-Zellen ist der Einfluss von T-Zellen von Bedeutung. Hier könnte die Interaktion von DC und T-Zellen gestört sein und nachfolgend zu B-Zellaktivierung und
zur Produktion von Autoantikörpern führen. Sowohl Treg als auch Tcon könnten durch
eine gestörte Funktionalität zu Pathogenese des SLE beitragen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass im SLE wahrscheinlich Defekte in unterschiedlichen zellulären Systemen eine Rolle spielen, die eine Unterteilung der Patienten in
Untergruppen notwendig machen.
4.8
Ausblick
SLE ist eine heterogene humane Autoimmunerkrankung mit einem komplexen klinischen Bild. Daher kann nicht ausgeschlossen werden, dass innerhalb des Patientenkollektivs Untergruppen mit unterschiedlichen Phänotypen existieren. Auf Grund der
relativ geringen Anzahl untersuchter Patienten in dieser Arbeit, lassen sich nur sehr
eingeschränkt Aussagen über mögliche Untergruppen der Patienten machen. Ob solche
Untergruppen in Hinsicht auf Defekte bei apoptotischen Zellen oder DC existieren,
kann nur mit ausreichender Gewissheit an einem sehr viel größeren Patientenkollektiv
91
Cosima Kretz
4 Diskussion
Abbildung 17: Hypothetische Phasen in der Krankheitsentwicklung des SLE. SLE lässt sich in
drei Phasen einteilen. Phase 1 entsteht durch den Verlust der Toleranz gegenüber nukleären Antigenen. Bei ca. 5% der Bevölkerung lassen sich ANA nachweisen. Ein Auftreten dieser Antikörper
geht dem Ausbruch der Krankheit oft lange Zeit voraus. Phase 2 stellt die Dysregulation des Immunsystems dar und ist durch pathogene Autoimmunität gekennzeichnet. Phase 3 repräsentiert
die Entzündung von End-Organen, sie zeichnet sich durch genetische Prädisposition in den drei
Systemen FcγR, Migration und IFNα aus. (Abbildung verändert nach Fairhurst 2006)
untersucht werden. Sollten solche Untergruppen jedoch tatsächlich existieren, müste es
sich jeweils um einen kleinen Teil der Patienten handeln, da sich eine vergleichsweise
große Untergruppe sonst bereits in der untersuchten Gruppe hätte nachweisen lassen
müssen.
Häufig lassen sich komplexe Zusammenhänge in vivo nur unvollständig unter reduzierten in vitro-Bedingungen nachvollziehen. Die Ergebnisse der Arbeit haben gezeigt,
dass lösliche Faktoren einen Einfluss auf das Verhalten der apoptotischen Zellen und
der DC haben. Da Zytokine eine große Rolle in der Modulation der Immunantwort spielen, könnte eine detailierte Analyse der Zusammensetzung und Menge der Zytokine im
Serum Aufschluss über das Milieu geben, das einen Einfluss auf die periphere Toleranzinduktion ausübt. Die in der Arbeit verwendeten funktionellen Experimente sind gut
geeignet, um durch Zytokine ergänzt zu werden. So könnte z.B. ein Zytokin zugesetzt
werden, und der Einfluss auf das Suppressionsverhalten untersucht werden. Außerdem
könnte das entsprechende Zytokin zum Differenzierungsmedium der Monozyten zugesetzt werden, um so den Einfluss auf den Aktivitätsstatus und die Supprimierbarkeit
der DC zu analysieren. Dies könnte zu neuen Therapie-Optionen durch den Einsatz
von blokierenden Antikörpern gegen das entsprechenden Zytokin führen.
92
Cosima Kretz
4 Diskussion
HMGB-1 wurde als ein weiteres Molekül beschrieben, dass die Reaktion der DC in
Richtung Entzündungsreaktion verschieben kann (Hanley et al. 2004; Shi et al. 2003;
Binder et al. 2000; Scaffidi et al. 2002). Der Einfluss von HMGB-1 ließe sich ebenfalls
in den verwendeten Kokultursystemen durch Zugabe des aufgereinigten Proteins untersuchen.
Neben den in dieser Arbeit untersuchten zellulären Systemen scheinen B-Zellen ebenfalls eine große Rolle in der Pathogenese des SLE zu spielen. In zukünftigen Experimenten könnten daher auch B-Zellen parallel untersucht werden und in Kokulturexperimenten mit T-Zellen von Patienten mit SLE analysiert werden.
Über die Verwendung von Treg in der Therapie des SLE wird schon seit längerem
nachgedacht. Um eine Immuntherapie auf zellulärer Ebene einzuführen, die z.B. über
in vitro expandierte Treg bewerkstelligt werden könnte, ist das Wissen über die mechanistischen Zusammenhänge im SLE jedoch noch zu gering. Weitere Untersuchungen
zur Interaktion von DC und Treg im Umfeld einer Autoimmunerkrankung sind notwendig und könnten nicht nur für Patienten mit SLE neue Wege zur therapeutischen
Intervention eröffnen. Andere Autoimmunerkrankungen, wie z.B. Diabetes mellitus,
könnten ebenfalls von diesem Wissen profitieren.
In zukünftigen Arbeiten sollte neben der Anzahl der untersuchten Patienten auch die
Auswahl der Patienten nach möglichst vergleichbarer phänotypischer Ausprägung der
Erkrankung einbezogen werden, um größtmögliche Vergleichbarkeit der Patienten zu
gewährleisten. Diese Untersuchungen müßten dann jedoch in Zusammenarbeit mit vielen Kliniken durchgeführt werden, da gerade dieser Aspekt organisatorisch schwierig
an einem Zentrum zu bewältigen ist.
Zukünftige Studien zur Pathogenese des SLE könnten auch zur weiteren Differenzierung von Subtypen des SLE beitragen und charakteristische Defizite in unterschiedlichen Zellsystemen, die an der Induktion und Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz
beteiligt sind, evaluieren.
93
Cosima Kretz
Abbildungsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
1
Zentrale und periphere Toleranz in Bezug auf T-Zellen . . . . . . . . .
14
2
Schematische Darstellung der Induktion tolerogener DC . . . . . . . . .
19
3
Krankheitsmerkmale des SLE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
29
4
Apoptosekinetik primärer neutrophiler Granulozyten von Patienten mit
SLE im Vergleich zu gesunden Kontrollen . . . . . . . . . . . . . . . . .
58
5
DC-ähnliche Differenzierung der monozytischen Zelllinie U937 . . . . .
60
6
Supprimierbarkeit von U937-Zellen durch apoptotische neutrophile Granulozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
61
7
Stimulierbarkeit primärer DC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
62
8
Expression von Aktivierungsmarkern auf der Oberfläche von DC nach
Stimulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
63
9
Suppressiver Effekt apoptotischer Zellen auf DC . . . . . . . . . . . . .
65
10
Expression von Annexin 1 auf der Oberfläche apoptotischer neutrophiler
Granulozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
66
11
Nachweis von Autoantikörpern gegen Annexin 1 im Serum . . . . . . .
69
12
Antikörper aus den Seren von Patienten mit SLE binden an apoptotische
Jurkat T-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
13
70
Antikörper aus dem Serum von SLE Patienten haben einen geringen
Einfluss auf die Phagozytoserate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
73
14
Quantifizierung von Treg im Blut von Patienten mit SLE . . . . . . . .
74
15
Charakterisierung von Treg im Blut von Patienten mit SLE . . . . . . .
76
16
Hypothetisches Modell der krankheitverlaufsfördernden Ereignisse im SLE 90
17
Hypothetische Phasen in der Krankheitsentwicklung des SLE . . . . . .
92
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Cosima Kretz
Erklärung
Erklärung
Hiermit versichere ich an Eides statt, dass ich die vorliegende Dissertation selbstständig
und ohne fremde Hilfe angefertigt habe. Diese Arbeit wurde bisher an keiner anderen Universität oder einem anderen Fachbereich als Dissertation eingereicht. Weiterhin erkläre ich, dass die Dissertation nicht schon als Diplomarbeit oder ähnliche
Prüfungsarbeit eingereicht wurde.
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Dipl. Biol. Cosima Kretz
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