Entwicklung
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Tierärztliche Hochschule Hannover Entwicklung und Struktur des Primitivknotens der Maus INAUGURAL-DISSERATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae – (Dr. med. vet.) vorgelegt von Nadia Femina Koo ´s-Gravenhage, Niederlande Hannover 2012 Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. S. Meinecke-Tillmann Institut für Reproduktionsbiologie Tierärztliche Hochschule Hannover Apl. Prof. Dr. B. Dworniczak Institut für Humangenetik Universitätsklinikum Münster der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster Dr. P. Pennekamp Institut für Humangenetik Universitätsklinikum Münster der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster 1. Gutachterin: Apl. Prof. Dr. S. Meinecke-Tillmann 2. Gutachter: Prof. Dr. W. Meyer Tag der mündlichen Prüfung: 22.02.2012 Für meinen Mann und meine Eltern I Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen ........................................................ V 1 Einleitung .............................................................................................................1 2 Schrifttum ............................................................................................................3 2.1 Körperachsenentwicklung und Lateralisationsdefekte...........................3 2.2 Achsenentstehung im frühen Mausembryo .............................................4 2.3 Der Organisator/Primitivknoten und seine Eigenschaften......................8 2.4 Links-Rechts-Körperachsenentwicklung und der Primitivknoten........11 2.4.1 Struktur des Primitivknotens bei der Maus .......................................13 2.5 Links-Rechts-Körperachsenentwicklung und die Nodal-Signalkaskade................................................................................17 2.6 Links-Rechts-Körperachsenentwicklung und Bruch der bilateralen Symmetrie .................................................................................................25 2.6.1 2.6.2 2.6.3 2.6.4 Nodal Flow .....................................................................................25 Bedeutung der planaren Zellpolarität .............................................27 Detektion des gerichteten nodal flow am Primitivknoten und Umsetzung in Signaltransduktion...................................................29 Signalübertragung vom Primitivknoten zum LPM und Stabilisierung der asymmetrischen Genexpression .......................34 2.7 Ausgewählte Proteine zur immunhistochemischen Analyse des Primitivknotens .........................................................................................36 2.7.1 Acetyliertes Tubulin ........................................................................38 2.7.2 γ-Tubulin ........................................................................................38 2.7.3 Tight Junction.................................................................................39 2.7.3.1 Claudin 1-5.....................................................................................40 2.7.3.2 JAM-A ............................................................................................41 2.7.3.3 PAR-3 und PAR-6 ..........................................................................42 2.7.3.4 Zo-1................................................................................................43 2.7.4 Adherens Junctions........................................................................43 2.7.4.1 β-Catenin und Phospho-β-Catenin.................................................44 2.7.4.2 E-Cadherin .....................................................................................44 2.7.4.3 N-Cadherin.....................................................................................45 2.7.5 Fokale Adhäsionen.........................................................................47 2.7.5.1 FAK ................................................................................................47 2.7.5.2 Paxillin............................................................................................48 2.7.6 Annexine ........................................................................................48 II 2.7.6.1 2.7.7 2.7.7.1 2.7.7.2 2.7.8 Inhaltsverzeichnis Annexin 2, Annexin 4, Annexin 6 ...................................................49 Signalmoleküle...............................................................................49 Smad 1-4........................................................................................49 Nkd1...............................................................................................52 p-Tyr (phosphoryliertes Tyrosin) ....................................................53 2.8 Zielsetzung ................................................................................................54 3 Material und Methoden .....................................................................................56 3.1 Versuchstiere ............................................................................................56 3.1.1 3.1.2 3.1.3 Versuchstierhaltung........................................................................56 Verpaarung, Tötung und Sektion der Versuchstiere ......................57 Aufbereitung der entnommenen Embryonen..................................60 3.2 Immunhistochemische Analysen mittels Immunfluoreszenz ...............61 3.2.2 3.2.3 3.2.3.1 3.2.3.2 3.2.3.3 3.2.3.4 Fixierlösungen für immunhistochemische Analysen.......................63 Versuchsdurchführung am Beispiel von Jam (Junctional-Adhesion Molecule) .....................................................64 Verwendete primäre Antikörper und sekundäre Antikörper............66 Verwendete Fixierungs- und Inkubationsprotokolle........................70 Negativkontrollen ...........................................................................71 Darstellung der asymmetrischen β-Catenin Verteilung ..................71 3.3 Herstellung der Semidünnschnitte..........................................................72 3.3.1 3.3.2 3.3.3 3.3.4 Fixierung des Embryos...................................................................72 Entwässerung und Einbetten .........................................................72 Schneiden ......................................................................................74 Färben............................................................................................74 3.4 Rasterelektronenmikroskopische Analysen ..........................................76 3.4.1 3.4.2 3.4.3 3.4.4 3.4.5 Präparation der Embryonen für die Rasterelektronenmikroskopaufnahmen..........................................76 Kritische-Punkt-Trocknung (KPT)...................................................76 Sputtern..........................................................................................77 Rasterelektronenaufnahmen, Filme, Filmentwicklung und Einscannen ....................................................................................78 Rasterelektronenaufnahmen des Knotens und der Zilien...............78 3.5 Darstellung der Primitivknotenzilienbewegung .....................................79 3.6 In-situ-Hybridisierung...............................................................................81 3.6.1 3.6.1.1 3.6.1.2 3.6.1.3 Gesamt-Embryonen In-situ-Hybridisierung ....................................81 Präparation der Mausembryonen...................................................81 Bleichen und Permeabilisierung der Embryonen ...........................81 Prähybridisierung und Hybridisierung.............................................82 3.7 Fotodokumentation ..................................................................................87 3.7.1 Programme zur Auswertung und Darstellung.................................88 III Inhaltsverzeichnis 3.8 Verwendete Chemikalien, Materialien, Geräte und Bezugsadressen .......................................................................................89 4 Ergebnisse .........................................................................................................95 4.1 Negativkontrollen......................................................................................95 4.2 Entwicklung des Primitivknotens............................................................95 4.3 Darstellung des Primitivknotens und der Zilien.....................................99 4.3.1 4.3.2 Rasterelektronenaufnahmen des Primitivknotens und der Zilien ........................................................................................99 Darstellung der Primitivknotenzilienbewegung.............................103 4.4 Immunhistochemische Analysen des Primitivknotens .......................104 4.4.1 Immunhistochemische Färbungen ziliärer Proteine .....................105 4.4.1.1 Lokalisation von acetyliertem Tubulin und γ-Tubulin im frühen Mausembryo ................................................................................105 4.4.2 Tight Junction...............................................................................110 4.4.2.1 Claudin 1-5 Lokalisation im frühen Mausembryo .........................110 4.4.2.2 JAM-A Lokalisation im frühen Mausembryo .................................112 4.4.2.3 PAR-3 und PAR-6 Lokalisation im frühen Mausembryo...............115 4.4.2.4 Zo-1 Lokalisation im frühen Mausembryo ....................................115 4.4.3 Adherens Junctions......................................................................116 4.4.3.1 β-Catenin Lokalisation im frühen Mausembryo ............................116 4.4.3.2 Phospo-β-Catenin Lokalisation im frühen Mausembryo ...............121 4.4.3.3 E-Cadherin Lokalisation im frühen Mausembryo..........................122 4.4.3.4 N-Cadherin Lokalisation im frühen Mausembryo .........................124 4.4.4 Fokale Adhäsionen.......................................................................126 4.4.4.1 p-Fak Lokalisation im frühen Mausembryo...................................126 4.4.4.2 p-Pax Lokalisation im frühen Mausembryo ..................................126 4.4.5 Annexine ......................................................................................128 4.4.5.1 Annexin 2, 4, 6 Lokalisation im frühen Mausembryo ....................128 4.4.6 Signalmoleküle.............................................................................133 4.4.6.1 Smad 1-4 Lokalisation im frühen Mausembryo ............................133 4.4.6.2 Nkd1 Lokalisation im frühen Mausembryo ...................................136 4.4.7 p-Tyr Lokalisation im frühen Mausembryo ...................................137 5 Diskussion .......................................................................................................139 5.1 Entwicklung des Primitivknotens und Differenzierung der Primitivknotenzellen ...............................................................................139 5.2 Zilien ........................................................................................................140 5.3 Immunhistochemische Nachweise........................................................144 5.3.1 5.3.1.1 5.3.1.2 5.3.1.3 Tight Junction...............................................................................145 Claudine 1-5.................................................................................145 JAM-A ..........................................................................................146 PAR-3 und PAR-6 ........................................................................147 IV 5.3.1.4 5.3.1.5 5.3.2.2 5.3.2.3 5.3.3 5.3.3.2 5.3.4.1 5.3.5 5.3.5.1 5.3.5.2 5.3.6 Inhaltsverzeichnis Zo-1..............................................................................................148 β-Catenin......................................................................................149 E-Cadherin ...................................................................................150 N-Cadherin...................................................................................151 Fokale Adäsionen ........................................................................153 p-Pax............................................................................................153 Annexin 2, 4 und 6 .......................................................................154 Signalmoleküle.............................................................................155 Immunhistochemischer Nachweis von Smad 1-4.........................155 Nachweis von Nkd1......................................................................157 Immunhistochemischer Nachweis von p-Tyr................................157 6 Zusammenfassung..........................................................................................159 7 Summary ..........................................................................................................162 Literaturverzeichnis ............................................................................................165 V Abkürzungsverzeichnins Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen Abb. Abbildung AJ Zonula adhaerens (Adherens Junction) Ak Antikörper Al Allantois AM Amnion AP anterior-posterior aPKC atypische Proteinkinase C Aqua dest. destilliertes Wasser AS Aminosäure Bmp knochenmorphogenetisches Protein (Bone morphogenetic protein) BSA Rinderserumalbumin (bovine serum albumin) bzw. beziehungsweise °C Grad Celsius ca. circa Ca2+ Kalzium CD1 Crl: CD1 (ICR) (outbred); Mauslinie CHAPS 3[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-propanesulfonic acid CHD kongenitale Herzdefekte (congenital heart disease) CPD Kritische-Punkt-Trocknung (Critical Point Dryer) Cy3 Carbocyanin Cx43 Connexin 43 D dorsal DBA 2-Dodecenylbernsteinsäureanhydrid D0.h. das heißt DIG Digoxigenin DNS Desoxyribonukleinsäure DMEM Dulbeccos Modified Eagle´s Medium VI Abkürzungsverzeichnins DMP 2,4,6-Tridimethylaminomethylphenol DMSO Dimethylsulfoxid DORV double outlet right ventricle dpc Tage nach Empfängnis (dies post conceptionem) DV dorso-ventral Dvl Dishevelled E Tag der Embryonalentwicklung E-Cadherin epidermales Cadherin ECM extrazelluläre Matrix (extracellular matrix) EF- spezifisches Aminosäurenmotiv in Proteinen, Name stammt aus der Handmotiv Nomenklatur bei der Untersuchung von Parvalbumin EMT Epithel-Mesenchym-Transition EP Ektoplazenta et al. und andere (et alli) FCS fötales Kälberserum (fetal calf serum) FAK fokale Adhäsionskinase Fc-Teil Bindungsstelle des Antikörpers zur Opsonierung FGF Fibroblastenwachstumsfaktor G Gramm γ-TuRC großer γ-Tubulin Ringkomplex p-Tyr phosphoriliertes Tyrosin γ-TuSc kleiner γ-Tubulin Komplex GAG sulfatierte Glykosaminoglykane GJC Nexus (Gap junction communication) H Stunde Hepes 2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)-ethansulfonsäure HF Kopffalte (headfold) HH Hamburger-Hamilton-Stadium Hnf-3β Hepatocyte nuclear factor 3-beta H2O2 Wasserstoffperoxid VII Abkürzungsverzeichnins ICR Institut für Krebsforschung (Institute for Cancer Research) IFT intraflagellarer Transport Iv inversus viscerum IVC-System einzeln ventilierte Käfige (individually ventilated cages) JAM Junctional Adhesion Molecule JNK c-Jun N-terminale Kinase Weg KCl Kaliumchlorid KH2PO4 Kaliumdihydrogenphosphat kDa Kilodalton KIF Kinesin Superfamilie LPM Seitenplattenmesoderm (lateral plate mesoderm) Lrd left-right dynein LR Links-Rechts Lsg. Lösung M Molar MABT Maleinsäurepuffer + Tween 20 (Malein acid buffer + Tween 20) MAGUK MAP Homologe von Membran-assoziierten Guanylat-Kinasen (membran associated guanylate kinase homologs) Mitogen-aktiviertes Protein MeOH Methanol MgCl2 Magnesiumchlorid min Minute Ml Milliliter mM Millimolar mmHg Millimeter Quecksilbersäule MNA 1–Methyl-5-Norbornen-2,3-Dicarbonsäureanhydrid MTOCs Nukleationsstellen für Mikrotubuli (microtubule organizing centers) NaCl Natriumchlorid Na2HPO4 Dinatriumhydrogenphosphat NaOH Natronlauge Nkd1 Naked cuticle 1 VIII Abkürzungsverzeichnins Nkx3.2 NK3 Homeobox 2 n.n. nicht nachweisbar NP Neuralplatte Nr. Nummer NTMT NVP alkalischer Phosphatasepuffer (Natriumchlorid, Tris-Chlorid, Magnesiumchlorid, Tween 20) Transportvesikel am Primitivknoten (nodal vesicular parcels) o.g. oben genannt PAR partitioning-defective-protein PBS Phosphat gepufferte Salzlösung (phosphate buffered saline) PBT PBS + Tween PC2 Polycystin 2 PCP planare Zellpolarität (planar cell polarity) PDZ PFA PSD95/SAP90, Septate junction-Protein Discs large, Tight junctionProtein Zonula occludentes-1 Paraformaldehyd p-Fak phosphorylierte fokale Adhäsionskinase pH potentia Hydrogenii PKD polyzystische Nierenerkrankung Pkd2 Pkd2 (polycystic-kidney-disease-2)-Gen der Maus p-Pax phosphoriliertes Paxillin PS Primitivstreifen (primitive streak) PSM präsomitisches Mesoderm (presomitic mesoderm) PTA persistierender Truncus arteriosus PTK Protein-Tyrosin-Kinase PTP Protein-Tyrosin-Phosphatase p-Tyr phosphoriliertes Tyrosin RA Retinsäure REM Rasterelektronenmikroskop RNS Ribonukleinsäure RT Raumtemperatur IX Abkürzungsverzeichnins RT-PCR Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion rpm Umdrehungen (rounds per minute) S Sekunde Shh Sonic hedgehog SSC Natriumcitratsalzlösung (saline sodium citrat) Tab. Tabelle TGA Transposition der großen Arterien Tgf transformierender Wachstumsfaktor (Transforming growth factor) TierSchG Tierschutzgesetz TJ Zonula occludens (Tight Junction) u.a. unter anderem U/min Umdrehungen pro Minute ü.N. über Nacht V ventral Vgl. vergleiche VN Ventralknoten (ventral node) VP Vaginalpfropf VSD Ventrikelseptendefekte Wnt wingless-related MMTV integration site WT Wildtyp WWU Westfälische Wilhelms-Universität (Münster) Xnr-1 Xenopus nodal related 1 z.B. zum Beispiel Zo-1 Zonula occludens 1 (Tight Junction Protein 1) % Prozent µ Mikro µg Mikrogramm µl Mikroliter 1 Einleitung 1. Einleitung Angeborene Herzdefekte (CHD) treten bei Neugeborenen mit einer Inzidenz von 8-10/1000 auf. Neben Umwelteinflüssen, Infektionskrankheiten oder Alkoholkonsum während der Schwangerschaft sind genetische Faktoren (spezifische Genmutationen, Chromosomenanomalien wie z.B. Trisomie 21, Aneuploiden) eine der häufigsten Ursachen. Trotz großer Bemühungen kann ein Teil dieser Herzfehlbildungen postnatal nicht korrigiert werden, was zum Tode des Neugeborenen führt. Insbesondere bei der großen Zahl an Fällen (über 90 %), bei denen eine Ursache nicht erkennbar und damit auch ein Wiederholungsrisiko bei einer erneuten Schwangerschaft nicht einschätzbar ist, führt dies zu einer hohen psychischen Belastung des Elternpaares. Die Entwicklung des Herzens ist ein komplizierter und derzeit unzureichend verstandener Prozess, der abhängig ist von der Links-Rechts (LR) Körperachsenentwicklung, gefolgt von der anschließenden Differenzierung der beteiligten Zell- und Gewebetypen. Die LR-Körperachsenentwicklung lässt sich grob in drei Phasen unterteilen: In der ersten Phase kommt es zum Bruch der Symmetrie im Bereich des Primitivknotens. In der zweiten Phase wird diese asymmetrische Information auf das Seitenplattenmesoderm übertragen, was in einer stabilen, asymmetrischen Expression spezifischer Signalmoleküle resultiert. In der dritten Phase wird diese asymmetrische Information auf die sich entwickelnden Organe übertragen. Über die erste Phase, den Bruch der Symmetrie, ist nach wie vor wenig bekannt. Derzeit wird als gesichert angenommen, dass die korrekte Funktion des Primitivknotens eine unabdingbare Vorraussetzung ist und folgerichtig haben Embryonen, die entweder funktionale oder strukturelle Defekte in diesem Bereich aufweisen, LR-Körperachsen- und Herzdefekte. Erstaunlicherweise gibt es gegenwärtig jedoch keine umfassende Analyse, die sowohl die Entwicklung (strukturell und funktional) dieser überaus wichtigen embryonalen Struktur als auch den Aufbau der hoch polarisierten Primitivknotenzellen beschreibt. 2 Einleitung Ziel dieser Arbeit ist daher die Darstellung der frühembryonalen Entwicklung des Primitivknotens mittels immunhistochemischer und elektronenmikroskopischer Analysen unter besonderer Beachtung von Zellpolaritätsmarkern. Anhand der in dieser Arbeit generierten Daten ist eine Darstellung der Entwicklung des Primitivknotens der Maus inklusive einer Charakterisierung der Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kontakte zu erwarten. Diese Daten können dazu beitragen, die Funktion dieser embryonalen Struktur weiter zu definieren und somit eine solide Grundlage für funktionale Untersuchungen zu bilden. Das Wissen um diese „normale Entwicklung“ ist eine unabdingbare Voraussetzung, um pathologische Prozesse zu erkennen und die Mechanismen zu verstehen, die zu einer fehlerhaften Körperachsenentwicklung und nachfolgend zu massiven kongenitalen Herzdefekten führen. 3 Schrifttum 2. Schrifttum 2.1 Körperachsenentwicklung und Lateralisationsdefekte Von außen betrachtet scheinen alle Wirbeltiere bilateral symmetrisch zu sein, d.h sie haben eine linke und rechte Körperhälfte, die äußerlich spiegelbildlich ausgebildet ist (Abb. 1A). Von innen betrachtet sind jedoch die meisten inneren Organe asymmetrisch positioniert. Das Herz, die Milz und die Bauchspeicheldrüse sind z.B. auf der linken Seite angeordnet, während die Gallenblase und der größte Teil der Leber auf der rechten Seite liegen (Situs solitus, Abb. 1B). Eine spiegelbildliche Umkehr der Organlagen (Abb. 1C) wird als Situs inversus totalis bezeichnet und zeigt beim Menschen eine Prävalenz von 1 : 10000 (SPLITT et al. 1996). Abb. 1: (A) Darstellung der menschlichen Symmetrie von Leonardo da Vinci (1492). (B) Anatomisch normale Anordnung der Organe (Situs solitus); das Herz, der Magen und die 2-fach gelappte Lunge sind links angeordnet, während die Leber, der Blinddarm und die 3-fach gelappte Lunge rechts positioniert sind. (C) Anatomisch spiegelbildliche Umkehr aller inneren Organe (Situs inversus totalis) (modifiziert nach CAPDEVILA et al. 2000). Diese LR-Achse ist neben der anterior-posterioren und dorso-ventralen Achse die dritte und letzte Achse des sich entwickelnden Embryos und findet sich nicht nur unter den Wirbeltieren, sondern auch bei primitiven Chordaten, Seeigeln, Schnecken, C. elegans und bei Drosophila wieder (HUTTER u. SCHNABEL 1995; SHIBAZAKI et al. 2004; DUBOC et al. 2005; HOZUMI et al. 2006; SPEDER et al. 2006). Morphologisch erkennbar wird diese LR-Asymmetrie als erstes durch die Schrifttum 4 Ausbildung der Herzschleife im frühen Embryo. Fehlsteuerungen der LR-Achsenentwicklung können zu schwerwiegenden Organdefekten führen. Bei dem in Abb. 1C gezeigten Beispiel der spiegelbildlichen Umkehr des Organsitus (Situs inversus totalis) ist häufig keine schwerwiegende Beeinträchtigung des Betroffenen zu erwarten, jedoch kann dieser Situs inversus totalis mit wiederkehrenden Infektionen des Respirationstraktes (OLBRICH et al. 2002) und auch mit Zystenbildung in beiden Nieren (MOCHIZUKI et al. 2002; OTTO et al. 2003) assoziiert sein. Zwischen diesen beiden Extremfällen - dem Situs solitus (Abb. 1B) und dem Situs inversus totalis (Abb. 1C) - gibt es vielfache Abstufungen, die als Situs ambiguus oder auch partieller oder inkompletter Situs inversus bezeichnet werden. In der Regel wird der Situs ambiguus auch von schweren kongenitalen Herzdefekten wie Transposition der großen Arterien (TGA), Ventrikelseptendefekten (VSD), persistierendem Truncus arteriosus (PTA) und Double outlet right ventricle (DORV) bis hin zur Ausbildung von nur einem funktionierenden Ventrikel begleitet (CASEY 1998; MURCIA et al. 2000; AYLSWORTH 2001; PENNEKAMP et al. 2002; RAMSDELL 2005; PEETERS u. DEVRIENDT 2006). 2.2 Achsenentstehung im frühen Mausembryo Die Entwicklung der definitiven drei Achsen eines Embryos (anterior - posterior [AP], dorsal - ventral [DV] und links - rechts [LR]) ist ein hochkomplexer Vorgang, der erst relativ spät im sich entwickelnden Embryo stattfindet. Studien in der Maus haben angedeutet, dass die Position des zweiten Polkörperchens und der Spermieneintrittspunkt (sperm entry point) in die befruchtete Eizelle die Achsenasymmetrie der Blastozyste definiert (PIOTROWSKA u. ZERNICKAGOETZ 2001; TAM et al. 2001). Hierbei wird der Bereich, in dem sich die Polkörperchen befinden als animaler Pol und der gegenüber liegende als vegetaler Pol bezeichnet (BEDDINGTON u. ROBERTSON 1999). Hingegen beschreiben der Spermieneintrittspunkt zusammen mit dem Polkörperchen die ungefähre Position der Grenze zwischen dem embryonalen und abembryonalen Teil der Blastozyste (PIOTROWSKA u. ZERNICKA-GOETZ 2001; TAM et al. 2001). Allerdings ist die Schrifttum 5 Rolle des Spermieneintrittspunktes für die Polarität umstritten (MOTOSUGI et al. 2005). Ob sich die Polarität in späteren Stadien wiederfindet bzw. Einfluss auf den sich entwickelnden Embryo besitzt, ist weiterhin Gegenstand vieler kontroverser Diskussionen (ROSSANT et al. 2004, 2009; GARDNER et al. 2005, 2007; HIIRAGI et al. 2005, 2006; MOTOSUGI et al. 2005; PIOTROWSKA-NITSCHE u. ZERNICKAGOETZ 2005; PLUSA et al. 2005; ZERNICKA-GOETZ 2005; HIIRAGI u. SOLTER 2006; BISCHOFF et al. 2008; GARDNER 2010). Die erste morphologisch sichtbare Polarität bzw. Achsenentwicklung des Mausembryos tritt erst am Tag 3,5 (E3,5) nach Befruchtung mit der Bildung der Blastozyste auf: Die Blastozyste entsteht durch Kompaktierung von Zellen und Ansammlung von interzellulärer Flüssigkeit aus der Morula, so dass die Blastozyste schließlich aus dem Trophoblasten (distaler Anteil bzw. abembryonaler Pol), der flüssigkeitsgefüllten Blastozystenhöhle und dem Embryoblasten, d.h. dem Embryonalknoten (proximaler Anteil bzw. embryonaler Pol), besteht (Abb. 2) (BEDDINGTON u. ROBERTSON 1999). proximal Embryoblast (Embryonalknoten) Zona pellucida Achse der bilateralen Symmetrie Blastozystenhöhle (Blastocoel) Trophoblast distal Abb. 2: „Polarität“ der Blastozyste. Die Blastozyste kann in einen morphologisch erkennbaren proximalen und distalen Bereich (embryonaler und abembryonaler Pol) eingeteilt werden. Der proximale Anteil bzw. der embryonale Pol der Blastozyste enthält den Embryonalknoten, der den gesamten Embryo sowie das extraembryonale Mesoderm und Entoderm bildet (modifiziert nach BEDDINGTON u. ROBERTSON 1999). Schrifttum 6 Im weiteren Verlauf der Entwicklung kann der Embryo in Gestalt des Eizylinders, der sich aus den Zellen des Embryonalknotens entwickelt, in einen proximalen und distalen Bereich unterteilt werden (Abb. 3). Der Eizylinder selbst gliedert sich in ein embryonales und extraembryonales Segment auf. Bis zu diesem Zeitpunkt behält der Embryo morphologisch seine radiale Symmetrie bei. Mit der Bildung des Entoderms ist der dorsale Bereich des Embryos, der in diesem Stadium vom embryonalen Ektoderm definiert ist, vom ventralen Bereich (Entoderm) unterscheidbar und somit kann die dorso-ventrale Achse (siehe Abb. 4B) bestimmt werden (BEDDINGTON u. ROBERTSON 1999). proximal Ektoplazentarer Konus Extraembryonales Ektoderm Extraembryonaler Anteil Embryonaler Anteil Entoderm Ektoderm distal Abb. 3: Schematischer Aufbau eines 6 Tage alten Mausembryos mit der Unterteilung in einen proximalen und einen distalen Bereich. Ausbildung des Ento- und Ektoderms (modifiziert nach BEDDINGTON u. ROBERTSON 1999). Diese zu diesem Zeitpunkt noch bestehende radiale Symmetrie wird durchbrochen, wenn die Gastrulation an der Übergangszone von embryonalem zu extraembryonalem Ektoderm beginnt, der Primitivstreifen gebildet wird und Zellen anfangen, nach der Epithel-Mesenchym-Transition (EMT) Mesoderm zu bilden (Abb. 4A). Dieser Ort der Gastrulation markiert die spätere posteriore Seite und somit eine der definitiven Achsen des Embryos, die anterior-posteriore (AP) Achse. Mit der Verlängerung des Primitivstreifens bis zur distalen Spitze des Embryos und der Bildung des dem Spe- Schrifttum 7 mann-Organisator äquivalenten Primitivknotens der Maus, wird diese AP-Achse, die zunächst insbesondere durch molekulargenetische und immunhistochemische Analysen festgelegt werden kann, auch morphologisch sichtbar (Abb. 4B) (TAM u. BEHRINGER 1997; BEDDINGTON u. ROBERTSON 1999; TAM et al. 2001). A B proximal proximal Ektoplazentarer Konus Ektoplazentarer Konus posterior anterior posterior Mesoderm Mesoderm Entoderm Primitivstreifen Ektoderm Ektoderm Entoderm distal Axiales Mesendoderm D Primitivstreifen Knoten V distal Abb. 4: (A) Schematischer Aufbau eines 6.5 Tage alten Mausembryos mit der anfänglichen Ausbildung des Mesoderms und des Primitivstreifens im posterioren Bereich, was die Unterteilung in einen anterioren und einen posterioren Bereich ermöglicht. (B) Schematischer Aufbau eines 7.5 Tage alten Mausembryos mit der zusätzlichen Unterteilung in einen dorsalen (D) und einen ventralen (V) Bereich und der anfänglichen Ausbildung des Primitivknotens auf der Ventralseite (modifiziert nach BEDDINGTON u. ROBERTSON 1999). Die dritte und letzte zu definierende Achse des Embryos ist die LR-Achse, die durch die Lage der AP- und DV-Achsen definiert und senkrecht zu beiden Achsen angelegt ist. Während die morphologisch erkennbare LR-Achse bereits frühzeitig zu unterscheiden ist, erfordert die „molekular“ determinierte LR-Achse, die verantwortlich für die regelrechte Entwicklung der Organe und Organlagen (Situs solitus) ist, den Bruch der bilateralen, „molekularen“ LR-Symmetrie am Primitivknoten und die Ausbildung einer stabilen, genetisch determinierten LR-Asymmetrie im Embryo. 8 Schrifttum 2.3 Der Organisator/Primitivknoten und seine Eigenschaften Lange bevor die induktiven Ereignisse beschrieben werden konnten, die für eine korrekte LR-Achsenentwicklung auf molekularer Ebene verantwortlich sind, wurde bereits gezeigt, dass der Primitivknoten bzw. Organisator für die Körperachsenbildung notwendig ist. Daher soll hier zunächst ein kurzer historischer Überblick über die Erforschung des Primitivknotens bzw. Organisators (Organizer) und dessen Eigenschaften gegeben werden. HANS SPEMANN und HILDE MANGOLD publizierten 1924 eine Studie über die Induktion von Embryonalanlagen durch Implantation artfremder Zellen aus dem Bereich des Urmundes von Molchembryonen. Mit Hilfe dieser Transplantationsexperimente konnten sie zeigen, dass der Urmund als organisierendes Zentrum fungiert, und dass er notwendig ist, um die grundlegende Struktur des gesamten Organismus zu definieren. Da diese Zellgruppe als embryonales Signalzentrum wirkt und die Entwicklung aller übrigen Zellen „organisiert“, wurde sie von Hans Spemann entsprechend als Organisator bezeichnet (SPEMANN u. MANGOLD 1924). Diese als Organisator bezeichnete Zellpopulation findet sich trotz unterschiedlicher Reproduktionsstrategien und verschiedener Eiformen in allen Vertebratenklassen wieder (JOUBIN u. STERN 2001): Beim Hühnerembryo wurden von WADDINGTON Transplantationsexperimente durchgeführt, bei denen man feststellte, dass bei Transplantationen der vorderen Hälfte des Primitivstreifens dieser Bereich neurales Gewebe im nicht neuralen und extra-embryonalen Ektoderm induzieren konnte (WADDINGTON 1930, 1932, 1934, zitiert nach JOUBIN u. STERN 2001). Damit war bewiesen, dass auch Amnioten eine Organisator-Aktivität besitzen. Bei der Maus konnte der Primitivknoten der späten Gastrula die Bildung einer zweiten Körperachse nach heterotopischer Transplantation hervorrufen und somit als Organisator identifiziert werden (BEDDINGTON 1994; TAM et al. 1997). VICTOR HENSEN entdeckte diese Organisator-Fähigkeit auch bei Embryonen höherer Vertebraten und bezeichnete die morphologischen Strukturen allgemein als Knoten (node) (HENSEN 1876, zitiert nach VIEBAHN 2000). 9 Schrifttum Um die Funktion des Primitivknotens und seiner Derivate weiter zu analysieren, wurden bereits früh chirurgische Entfernungen der Organisator-Region im Gastrulastadium und fate mapping-Studien vorgenommen und die Auswirkungen auf die Entwicklung der auf diese Weise manipulierten Embryonen in verschiedenen Vertebraten untersucht (TAM u. BEDDINGTON 1987; CLARKE et al. 1991; BEDDINGTON 1994; SULIK et al. 1994; PSYCHOYOS u. STERN 1996; SHIH u. FRASER 1996; DAVIDSON et al. 1999). Beim Huhn konnte frühzeitig gezeigt werden, dass unterschiedlichste Manipulationen des Hensenschen Knoten vom Hühnerembryo kompensiert werden konnten (ABERCOMBIE u. WADDINGTON 1937; ABERCROMBIE u. CAUSEY 1950; GRABOWSKI 1953; GALLERA 1965; BUTROS 1967; GALLERA u. NICOLET 1974; SCHOENWOLF u. YUAN 1995). GRABOWSKI (1953, 1956) führte Ablationen unterschiedlich großer Bereiche des Hensenschen Knotens bei Hühnerembryonen durch und analysierte diese Embryonen anschließend in unterschiedlichen Entwicklungsstadien. Er stellte fest, dass je nach Entwicklungsstufe des Hühnerembryos unterschiedlich große Bereiche des Hensenschen Knotens entfernt werden konnten, bevor der Eingriff vom Embryo nicht mehr kompensiert wurde (0,5 x 0,5 mm im Hamburger-Hamilton (HH) Stadium 4 (HAMBURGER u. HAMILTON 1992); 0,3 x 0,3 mm im HH 5-6 und 0,1 x 0,2 mm zwischen HH 6-8). Vierzig Jahre später wurden seine Experimente bei der Maus und beim Huhn reproduziert und erweitert durch cell fate-Studien über Carbocyanin-Farbstoffe, Transplantationsexperimente des sich nach Ablation neu entwickelten Knotens und Expressionsanalysen mittels wholemount-in-situ-Hybridisierungen (PSYCHOYOS u. STERN 1996; DAVIDSON et al. 1999). Die von GRABOWSKI (1953, 1956) publizierten Experimente wurden bestätigt, und es konnte zusätzlich gezeigt werden, dass A) auch die Expressionsmuster von Hepatocyte nuclear factor 3-beta (Hnf-3β) und Sonic Hedgehog (Shh), zweier typischer und wichtiger Mittellinienmarker, die im Primitivknoten exprimiert werden, von den manipulierten Hühnerembryonen wiederhergestellt werden konnten, und B) der nach Ablation der Knotenregion vom Hühnerembryo wiederhergestellte Knoten nach Transplantation an eine ektopische Stelle dort ebenfalls eine zweite Embryonalachse induzieren konnte. Die Autoren schlossen daraus, dass der Hensensche 10 Schrifttum Knoten, dass Äquivalent des bei Amphibien beschriebenen Spemann-Organisators, möglicherweise benachbarte Zellen davon abhält, ebenfalls zu einem organisierenden Zentrum zu werden. Ähnliche Experimente wurden auch bei der Maus durchgeführt. Vergleichbar zum Huhn ist der Primitivknoten der Maus im Gastrulastadium die Hauptquelle der Vorläuferzellen der Chorda dorsalis, der Bodenplatte und der entodermalen Zellen, insbesondere des Vorderdarms und schließlich des definitiven Darms (TAM u. BEDDINGTON 1987; BEDDINGTON 1994; SULIK et al. 1994). Im Gegensatz zum Hühnerembryo war jedoch keine vollständige Regeneration des Mausembryos nachweisbar: Nach Ablation der Primitivknotenregion im späten Gastrulastadium entwickelte sich nach einer de novo Rekrutierung des neuralen Ektoderms und des somitischen Mesoderms aus den umliegenden Gewebeschichten eine scheinbar intakte anterior-posteriore Körperachse mit morphologisch normalen Kopffalten, normalem Neuralrohr und Primitivstreifen. Die Köperachse war allerdings verkürzt, die Somitenbildung verlangsamt, in den meisten Embryonen fehlte ebenfalls die Chorda dorsalis, oder sie war unterbrochen und die Bodenplatte fehlte vollständig. Diese Defekte traten wahrscheinlich aufgrund des Verlustes der Bodenplattenvorläuferzellen oder aufgrund des Fehlens induktiver Signale aus der Chorda dorsalis auf (DAVIDSON et al. 1999). Folge dieser Fehlbildungen ist eine randomisierte Expression von Pitx2, einem Transkriptionsfaktor, der normalerweise während der LR-Achsen-Determinierung im linken Seitenplattenmesoderm exprimiert wird. Die Fehlexpression von Pitx2 führt schließlich zu Fehlbildungen der LR-Körperachse, insbesondere zur Ausbildung von Isomerismen (DAVIDSON et al. 1999). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Embryo nach Entfernung des Organisators in der Lage ist, seine operative Entfernung je nach Entwicklungsstadium durch erneute Entwicklung dieser Region zu kompensieren. Außerdem wirkt sich der Organisator offensichtlich restriktiv auf benachbarte Zellen aus und besitzt induktive Eigenschaften, insbesondere in Bezug auf die Achsenbildung des Embryos. 11 Schrifttum 2.4 Links-Rechts-Körperachsenentwicklung und der Primitivknoten Es wird derzeit angenommen, dass die Orientierung der Links-Rechts (LR)Körperachse durch unterschiedliche Prozesse in aufeinander folgenden Stufen determiniert wird, die sich gegenseitig beeinflussen und sich im Normalfall bis zur definitiven Festlegung der LR-Körperachse verstärken (SHIRATORI u. HAMADA 2006). Die zentrale morphologische Struktur für die Determinierung der LR-Achse der bisher analysierten Vertebraten, der Organisator, ist jedoch immer vergleichbar: Je nach Spezies wird diese „organisierende Region“ Primitivknoten („primitive node“, da der Knoten sich an der Spitze des Primitivstreifens befindet) (BONNET 1897), „ventral node“ (da sich der zilienbesetzte Primitivknoten der Maus auf der ventralen Seite befindet) (HIROKAWA et al. 2006), Kupffersche Vesikel beim Zebrafisch (ESSNER et al. 2005; OTEIZA et al. 2008), „dorsale Lippe“ des Urmundes bei den Amphibien (PSYCHOYOS u. STERN 1996; ESSNER et al. 2002; SCHWEICKERT et al. 2007) oder Hensenscher Knoten beim Huhn (WADDINGTON 1956) (Abb. 5) genannt. Da die Embryonen der verschiedenen Vertebraten morphologisch jedoch unterschiedlich aufgebaut sind (der Hühnerembryo und der Kaninchenembryo sind z.B. in frühen Stadien flache Blastodermscheiben, während der Mausembryo ein kelchförmiger Zylinder ist), sollte man zwischen „chick node“, „mouse node“ etc. unterscheiden (VIEBAHN 2001; Blum u. FISCHER 2003). Eine gemeinsame Eigenschaft der Zellen dieser Regionen in den unterschiedlichen Spezies ist das Vorhandensein von funktional relevanten und motilen Monozilien (Abb. 5). 12 B A Xenopus Zebrafisch a b C D Huhn c Maus d Schrifttum Abb. 5: Darstellung der Zilien in den Organisator-Regionen verschiedener Vertebraten. (A) Laterale Aufsicht eines Zebrafisch-Embryos im späten Gastrulastadium mit Lrd (left-right dynein) Expression (siehe Pfeil) in den dorsalen Vorläuferzellen vor der Organisator - Region. (B) Laterale Ansicht auf einen Xenopus Embryo im Stadium 13 mit einer Lrd Expression (siehe Pfeil) in den ventralen Zellen des dorsalen Urmundes. (C) Dorsale Betrachtung eines im Gastrulastadium [Hamburger-Hamilton Stadium 4 (HH)] befindlichen Hühnerembryos mit Lrd Expression (siehe Pfeil) im Hensenschen Knoten und im Primitivstreifen. (D) Frontalaufsicht auf einen 7.5 Tage alten Mausembryo mit Lrd Expression (siehe Pfeil) am Primitivknoten. (a,b,c,d) Schematische Transversalschnitte (dorsal ist oben; ventral ist unten) der Embryonen mit den mit Zilien (orange) besetzten Zellen (pink) unter Beachtung von Mesoderm (hellrosa), Ektoderm (hellblau) und Entoderm (grün). Dunkelblau in (d): Basalmembran (modifiziert nach ESSNER et al. 2002) 13 Schrifttum 2.4.1 Struktur des Primitivknotens bei der Maus Der Primitivknoten der Maus befindet sich am distalen Ende des Embryos von der Ektoplazenta gesehen auf der ventralen Außenseite (Abb. 5D, d; Abb. 6), während der Knoten des Kaninchens und des Huhnes (Abb. 5C, c) zentral auf dem scheibenförmigen Embryo lokalisiert ist (HIROKAWA et al. 2006). Der Primitivknoten der Maus besteht aus einer dorsalen (Ektoderm) und einer ventralen (Entoderm) Komponente, die durch eine Basalmembran getrennt ist (Abb. 5D, d; Abb. 6B). Diese ist am posterioren Ende des Primitivknotens unterbrochen, so dass die ventralen und dorsalen Komponenten an dieser Stelle in direktem Kontakt stehen. Der ventrale Bereich des Primitivknotens (Ventralknoten) ist charakterisiert durch eine relativ geringe Proliferationsrate von ca. 10 % im Vergleich zum übrigen mesodermalen und ektodermalen Gewebe (> 95 %). Der dorsale Bereich des Primitivknotens dagegen ist hoch proliferativ und seine Teilungsrate ist nicht von der des anliegenden Neuroektoderms, an das der dorsale Teil angrenzt, zu unterscheiden (BELLOMO et al. 1996). Im ventralen Primitivknoten können zwei Regionen erkannt werden (Abb. 6B, C): Zum einen gibt es die Grubenzellen (pit cells), die säulenartig sind und Monozilien tragen. Zum anderen liegen die Kronzellen (crown cells) vor, die die Grubenzellen umgeben und in einem hufeisenförmigen Umriss angeordnet sind. Diese Kronzellen erscheinen häufig nicht mit Monozilien besetzt und sind Ort der Nodal Expression, einem der wichtigsten Gene der LR-Körperachsendeterminierung (ZHOU et al. 1993; BELLOMO et al. 1996; MARSZALEK et al. 1999). Schrifttum 14 3 2 G K K B 1 B A G C A K C Abb.6: (A) Laterale Übersichtsaufnahme eines Embryos mit Anzeige der Schnittführung (weiße gepunktete Linie) für den Semidünnschnitt. (B) Frontaler Semidünnschnitt mit angedeuteter Basalmembran (schwarze gestrichelte Linie zwischen 1 und 3) im Primitivknotenbereich. 1: Entoderm; 2: Mesoderm; 3: Ektoderm; K: Kronzellen; G: Grubenzellen. Die schwarzen durchgezogenen Linien begrenzen die einzelnen Bereiche von 1, 2 und 3. (C) Konfokale laserscanning (ZEISS LSM 510) Aufnahme eines Primitivknotens der Maus. Die äußere gestrichelte Linie umrandet die Kronzellen, während der innere gepunktete Ring die Grubenzellen eingrenzt (KOO, unpublizierte Daten). A: 3,2-fache Objektiv-Vergrößerung mit der Stereolupe (Nikon SMZ 800); B: 20-fache Objektiv-Vergrößerung mit dem Lichtmikroskop (ZEISS Axiovert 25); C: 40-fache Objektiv-Vergrößerung mit dem konfokalen laserscanning Mikroskop (ZEISS LSM 510). Die Monozilien des Primitivknotens, die sich auch in Derivaten des Primitivnotens wieder finden, stellen erstaunliche Zellorganellen dar, die über lange Jahre ignoriert worden sind, jedoch eine überaus wichtige Funktion in der Determinierung der LR-Achse ausüben (NONAKA et al. 1998; TAKEDA et al. 1999). Abb. 7A und 7B zeigen eine grob schematische Darstellung von Zilien aus der Trachea (Abb. 7A) und von Monozilien des Primitivknotens (Abb. 7B) auf, um die wichtigsten Unterschiede dieser beiden Zilienarten, das Fehlen des zentralen Mikro- 15 Schrifttum tubulus-Paares, zu veranschaulichen. Bisher wurde davon ausgegangen, dass dieses zentrale Mikrotubuluspaar für die Motilität von Zilien wichtig ist, so dass entsprechend 9+2 Zilien als „motile“ Zilien, und 9+0 Zilien als „immotile“ Zilien klassifiziert worden sind. Lange war jedoch nicht bekannt, welche Funktion diese „immotilen“ Zilien ausüben. Mittlerweile weiß man, dass „immotile“ 9+0 Zilien, die besser als Primärzilien (primary cilia) bezeichnet werden, als einzelne Zilien in fast jeder bisher untersuchten Zellpopulation auftreten, und es wird angenommen, dass sie als Zellsensoren fungieren. Je nach Zelltyp können diese Zilien eine chemosensorische oder mechanosensorische Funktion bzw. beide Eigenschaften beinhalten (NONAKA et al. 1998; SHIRATORI u. HAMADA 2006). In einer Studie zur Entwicklung des Primitivknotens der Maus konnten SULIK et al. (1994) bereits aufführen, dass die primären Zilien des Primitvknotens der Maus motil sind, die Funktion war jedoch weiterhin unklar. Die Motilität dieser Monozilien wurde zwar zwei Jahre später noch von BELLOMO et al. (1996) aufgrund der 9+0 Struktur für unwahrscheinlich gehalten, aber weitere drei Jahre später konnten NONAKA et al. (1998) zeigen, dass die Motilität dieser 9+0 Monozilien nicht nur wichtig für die LR-Körperachsenentwicklung ist, sondern auch einen gerichteten Fluss von rechts nach links über den Primitivknoten generiert. Den endgültigen Beweis für die Relevanz dieser Motilität und der gerichteten Flüssigkeitsbewegung über den Primitivknoten erbrachten NONAKA et al. (2002) mit Hilfe eines in vitro Kulturansatzes, in dem der von rechts nach links gerichtete Flüssigkeitsstrom über den Primtivknoten mittels eines artifiziell generierten Flüssigkeitsstroms umgekehrt wurde, was zu einer Reversion der LR-Körperachse führte. AFZELIUS hatte 1976 aufgrund von Untersuchungen von Patienten mit KartagenerSyndrom, bei denen er immotile Zilien als Ursache des Syndroms identifizieren konnte, vermutet, dass ein Situs inversus ebenfalls durch immotile Zilien verursacht sein könnte (AFZELIUS 1976, 1995). Diese Assoziation wurde von HANDEL und KENNEDY (1984) nach ultrastrukturellen Untersuchungen von Tracheal-Zilien und Spermien von Mäusen, die homozygot für eine Situs inversus verursachende Mutation waren (iv/iv; iv = inversus viscerum), noch negiert. Es stellte sich jedoch 14 Jahre später heraus, dass diese iv-Mutation ein Motorprotein für Zilien, ein axonemales Schrifttum 16 Dynein (iv = lrd = left-right dynein) betrifft (SUPP et al. 1997). Wie man mittlerweile beweisen konnte, führt ein Funktionsverlust dieses Dyneins zur Immotilität der Monozilien des Primitivknotens bei iv/iv-Mutanten (OKADA et al. 1999), so dass die Vermutung von AFZELIUS (1976), dass ein Situs inversus durch immotile Zilien verursacht werden kann, schließlich bestätigt werden konnte. A 2 1 EPK AL B AM A P HF 3 4 PS NP VN Abb. 7: Schematische Abbildung eines Transversalschnittes der trachealen Zilie (A) und der Primitivknotenzilie der Maus (B). (A) Konventionelle motile Zilien weisen eine Zusammensetzung von 9x2+2 (9+2) Mikrotubuli auf. 9 Mikrotubuli-Paare (A-Tubulus: rosa; B-Tubulus: blau) mit Dyneinarmen (grün und gelb) sind chiral im Uhrzeigersinn angeordnet und umgeben das zentrale Mikrotubulipaar (lila). Die 9 Mikrotubuli-Paare sind untereinander durch Nexin-Bindeglieder (nicht angezeigt) verbunden und mittels Radialspeichen mit den zentralen Mikrotubuli (nicht angezeigt) verbunden. (B) Den primären Monozilien des Primitivknotens fehlt das zentrale Mikrotubulipaar, es liegt hier eine Zusammensetzung von 9x2+0 (9+0) vor (modifiziert nach HIROKAWA et al. 2006). (1) Seitliche Ansicht eines Embryos im Alter von 2 Somiten. (2) Rasterelektronenmikroskopaufnahme eines Mausembryos im 0-Somitenstadium mit Aufsicht auf den Primitivknoten. (3) Rasterelektronenmikroskopaufnahme des Ausschnittes des Primitivknotens der Maus. (4) Vergrößerte Rasterelektronenmikroskopaufnahme der Zilien im Primitivknoten. A: anterior; P: posterior; EPK: ektoplazentarer Konus; AL: Allantois; AM: Amnion; HF: Kopffalte (headfold); NP: Neuralplatte; VN: Ventralknoten (ventral node); PS: Primitivstreifen (primitive streak). (1-4: N.F.Koo und P. Pennekamp 2001; 2006, unpublizierte Daten). 17 Schrifttum 2.5 Links-Rechts-Körperachsenentwicklung und die NodalSignalkaskade Die Organisatoraktivität ist eines der bemerkenswertesten Beispiele für die Wichtigkeit der Zell-Zell-Kommunikation in der sich bildenden Gewebevielfalt während der Embryogenese (HOLTFRETER 1933, 1934; JOUBIN u. STERN 2001). Durch intensive Forschung an vielfältigen Modellorganismen (u.a. Maus, Huhn, Xenopus, Zebrafisch) konnte in den letzten Jahren gezeigt werden, dass die Nodal-Signalkaskade, die durch Aktivitäten in und um den Organisator bzw. seine äquivalenten Strukturen induziert wird, eine der am höchsten konservierten Signalkaskaden während der LR-Körperachsenentwicklung darstellt (OH u. LI 1997; BEDDINGTON u. ROBERTSON 1999; HAMADA et al. 2002; BURDINE u. SCHIER 2000). Schlüsselmoleküle dieser Nodal-Kaskade sind Nodal, Lefty-1, Lefty-2 und Pitx2, die in allen bisher untersuchten Organismen vergleichbar reguliert und exprimiert werden, während andere Faktoren, wie z.B. Shh und FGF8, deutliche Unterschiede in der Expression zeigen (BURDINE u. SCHIER 2000; MERCOLA u. LEVIN 2001) (Abb. 8a-c). Die Entwicklung der LR-Achse lässt sich in drei Phasen einteilen: (1) den Bruch der Symmetrie, (2) die Bildung und Stabilisierung der asymmetrischen Expression und (3) die Übertragung der asymmetrischen Information auf die sich entwickelnden Organe. In Abbildung 8 sind die wichtigsten Signalwege der LR-Determination von Huhn, Maus, Xenopus und Zebrafisch aufgezeigt, die sich vorwiegend auf die Phase 2 beziehen. Im Folgenden werden die wesentlichen Gemeinsamkeiten und Unterschiede der Signalwege unter den verschiedenen Tierarten erörtert. Zunächst die Gemeinsamkeiten: Nodal ist ein Mitglied der Tgfβ-Familie und besitzt wichtige Funktionen sowohl in der Induktion von Meso- und Entoderm als auch in der neuralen Entwicklung. Die Expression und Funktionen der Mitglieder der Nodal Genfamilie spielen eine zentrale und konservierte Rolle für das Nodalsignal in der LR-Achsenentwicklung von Vertebraten. Nodal wird während der Somitogenese sowohl beim Huhn als auch beim Zebrafisch, Frosch und bei der Maus asymmetrisch 18 Schrifttum im linken Seitenplattenmesoderm (LPM) exprimiert (LEVIN et al. 1995; COLLIGNON et al. 1996; LOWE et al. 1996; LUSTIG et al. 1996; REBAGLIATI et al. 1998; SAMPATH et al. 1998). Eine Fehlexpression von Nodal in frühen Embryonalstadien resultiert bei allen bisher analysierten Spezies in vielfältigen Situs-Defekten. Dabei ist es irrelevant, ob Nodal nicht exprimiert wird, heterolog zugefügt überexprimiert wird oder ob Nodal sekundär aufgrund von Mutationen in anderen Genen abnormal im Seitenplattenmesoderm exprimiert wird (COLLIGNON et al. 1996; LOWE et al. 1996; HEYMER et al. 1997; LEVIN et al. 1997; SAMPATH et al. 1997, 1998; DUFORT et al. 1998; KING et al. 1998; MELLOY et al. 1998; MENO et al. 1998; REBAGLIATI et al. 1998; GAIO et al. 1999; IZRAELI et al. 1999; MEYERS u. MARTIN 1999; TSUKUI et al. 1999; YAN et al. 1999). Weitere Mitglieder der Tgfβ-Familie sind die Lefty-Gene (BISGROVE et al. 1999; MENO et al. 1999). Die Lefty-Gene werden bei allen Vertebraten an der embryonalen Mittellinie (Lefty-1) und im linken Seitenplattenmesoderm (Lefty-2) exprimiert (MENO et al. 1996, 1997; BISGROVE et al. 1999; RODRIGUEZ ESTEBAN et al. 1999; YOKOUCHI et al. 1999; CHENG et al. 2000; ISHIMARU et al. 2000). Ein Funktionsverlust von Lefty-1 bei Mäusen hat zur Folge, dass es zu LR-Defekten mit symmetrischer Expression von Lefty-2 und linker pulmonaler Isomerie kommt (MENO et al. 1998). Ein Funktionsverlust von Lefty-2 zeigt bis zum E7.5 keine Auswirkungen. Im späteren Embryonalstadium bildete sich allerdings ein verbreiterter Primitivstreifen mit fehlender axialer Musterbildung aus, überhöhte Mesodermbildung und Fehlen von Kopffalte, Somiten, Herz und Notochord (MENO et al. 1999). Pitx2 ist bei allen Vertebraten ebenfalls im linken LPM asymmetrisch exprimiert (LOGAN et al. 1998; MENO et al. 1998; PIEDRA et al. 1998; RYAN et al. 1998; St. AMAND et al. 1998; YOSHIOKA et al. 1998; CAMPIONE et al. 1999; TSUKUI et al. 1999; YAN et al. 1999), wie auch Nodal und Lefty-2. Pitx2 ist ein Zielgen von Nodal im LPM, und einer der frühesten bekannten Transkriptionsfaktoren, der die dritte Phase der LR-Körperachsenausbildung bestimmt und die asymmetrische Information auf die sich entwickelnden Organe überträgt. Dabei induziert Nodal die Pitx2- 19 Schrifttum Transkription, während Lefty-Proteine die Überexpression von Pitx2 im LPM inhibieren (LOGAN et al. 1998; RYAN et al. 1998; YOSHIOKA et al. 1998; CAMPIONE et al. 1999; CHENG et al. 2000). Ein anderes wichtiges Gen ist Snail, das vor allem dadurch heraussticht, dass es das einzige Gen ist, das asymmetrisch überwiegend im rechten LPM exprimiert wird und gleichzeitig bei mehr als einem Vertebraten auftritt, hier beim Huhn und bei der Maus (ISAAC et al. 1997; SEFTON et al. 1998). Die Transkription des ZinkfingerTrankriptionsfaktors Snail wird durch das Nodalsignal unterdrückt und stellt einen „rechtsseitigen“ Faktor dar. Im Folgenden wird auf die Unterschiede der Signalwege von Huhn, Maus, Xenopus und Zebrafisch eingegangen, ausgehend von dem Signalweg des Huhnes, der am besten untersucht ist. ActivinßB und ActRIIA sind im Gegensatz zum Huhn, bei dem sie asymmetrisch auf der rechten Seite exprimiert werden, bei der Maus nicht asymmetrisch exprimiert (MATZUK et al. 1995). Ähnlich ist es mit Shh, das beim Huhn auf der linken Seite exprimiert ist, während es bei den anderen untersuchten Vertebraten nicht asymmetrisch (COLLIGNON et al. 1996; SAMPATH et al. 1997; SCHILLING et al. 1999), sondern an der embryonalen Mittelline exprimiert ist (CHEN u. SCHIER 2001). Bei Bmp4 (Bone morphogenetic protein 4) ist derzeit nicht bekannt, ob es eine konservierte Rolle in der LR-Körperachsenentwicklung in anderen Vertebraten als der Maus spielt. Beim Zebrafisch wird Bmp4 asymmetrisch exprimiert; eine symmetrische Expression resultiert in abnormaler Herzkrümmung und abnormalem „Herzjogging“ (linksgerichtete Verlagerung des Atrium primitivum, das dem „looping“ des Herzschlauches vorausgeht) (CHEN et al. 1997). Beim Xenopus wird dem BmpSignal eine Rolle für die LR-Entwicklung zugeschrieben. Dominant-negative BmpRezeptoren (ALK2), die heterolog bei Xenopus-Embryonen exprimiert wurden, verursachen bei der Hälfte der Embryonen einen veränderten Situs, sowie bilaterale Nodal-Expression (RAMSDELL u. YOST 1999). Dieses Ergebnis stimmt mit der vorgeschlagenen Rolle für Bmp als linksseitigem Repressor überein. Erstaunlicherweise hat eine Expression eines aktivierten Bmp-Rezeptors auf der linken Seite keine Repression der Nodal-Expression zur Folge, wie es aufgrund von vergleichbaren Ex- Schrifttum 20 perimenten beim Huhn zu erwarten wäre (RAMSDELL u. YOST 1999). Als indirekte Bestätigung einer konservierten Rolle für das Bmp-Signal während der LR-Achsenentwicklung bei der Maus weisen homozygote Mausmutanten für die Bmp-Kaskadenkomponente Smad 5 Herzkrümmungsdefekte auf und zeigen bilaterale Expressionsmuster von Nodal, Lefty2 und Pitx2 (CHANG et al. 2000). Möglicherweise ist die Bmp-abhängige Signaltransduktion auch in der Maus für die Repression des Nodal-Signals notwendig, wie es beim Huhn der Fall ist. Die Lefty-1 Expression an der Mittellinie dieser Embryonen ist stark reduziert oder gar nicht vorhanden. Daher könnte eine von Bmp abhängige Signaltransduktion während der LR-Achsenentwicklung für zwei Prozesse relevant sein: einerseits für die Inhibierung von Nodal im LPM, andererseits für die Induktion der Lefty-1 Expression an der Mittellinie (BURDINE u. SCHIER 2000). Der Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF) 8 scheint bei der Maus im Gegensatz zum Huhn, wo er auf der rechten Seite von Bedeutung ist, auf der linken Seite eine Rolle zu spielen. Trotz der fehlenden asymmetrischen Expression von FGF8 zeigt eine FGF8 knockout Maus einen Wegfall der Nodal und Pitx2 Expression, was FGF8 als eine Links-Determinante mit einbezieht (MEYERS u. MARTIN 1999; BURDINE u. SCHIER 2000). Weitere Phänotypen der FGF8 knockout Maus sind Defekte in der Herzkrümmung und rechte Lungen Isomerie (BURDINE u. SCHIER 2000). Das NK3 Homeobox 2 (Nkx3.2) ist beim Huhn auf der linken Seite Nodal nachgeschaltet, während Nkx3.2 bei der Maus auf der rechten Seite exprimiert wird und keinerlei Defekte in der LR-Entwicklung aufweist (LETTICE et al. 1999; RODRIGUEZ ESTEBAN et al. 1999; SCHNEIDER et al. 1999; TRIBIOLI u. LUFKIN 1999). Das Gap Junction Protein Alpha 1, auch Connexin 43 (Cx43) genannt, ist ein Transmembranprotein und Bestandteil von Gap Junctions. Gap Junctions erlauben einen Austausch von Molekülen zwischen zwei angrenzenden Zellen und stehen daher im Verdacht, eine Rolle in der LR-Achsenentwicklung beim Frosch und Huhn zu spielen, noch bevor der Knoten funktional relevant ist (BURDINE u. SCHIER 2000). Beim Xenopus besteht eine frühe Asymmetrie in der Funktion der Zell-Zell-Kanäle, die an der animalen Hälfte aktiver zu sein scheinen als auf der vegetalen Hälfte. Pharmakologische Beeinflussungen von Gap Junctions 21 Schrifttum oder der Fehlexpressionen von Connexinen haben einen Anstieg der Herzkrümmungsdefekte zur Folge (LEVIN u. MERCOLA 1998). Auch beim Huhn können ähnliche Effekte erzielt werden. Eine Behandlung mit Antikörpern oder AntisenseOligonukleotiden gegen die Cx43 Untereinheit kann die Gap Junction Kommunikation (GJC) inhibieren und eine bilaterale Expression von Shh und Nodal verursachen (LEVIN u. MERCOLA 1999). Diese Behandlungen hindern den Knoten daran, die normale asymmetrische Genexpression von Nodal und Shh zu induzieren und man vermutet daher, dass die GJCs für die Übertragung der LR-Information am Knoten wichtig sind (LEVIN u. MERCOLA 1999). Bei Cx43 Mausmutanten konnten bisher keinerlei LR-Defekte nachgewiesen werden (REAUME et al. 1995). Dies könnte allerdings daran liegen, dass andere Connexine den Verlust von Cx43 kompensieren (LO 1999). Wie genau die GJC in der LR-Achsenbildung funktioniert ist noch unklar und bedarf weiterer Untersuchungen. Jedoch ist es denkbar, dass Gap Junctions einen in eine Richtung verlaufenden Transport von Molekülen erlauben, der bewirkt, dass eine LR-Determinante auf einer Seite akkumuliert. Allerdings müsste eine Barriere in den Gap Junctions vorausgesetzt werden, die eine Diffusion der akkumulierten Determinanten zurück auf die andere Seite verhindert (BURDINE u. SCHIER 2000). Beim Xenopus ist diese Tatsache erfüllt, indem keine Gap Junction Kommunikation in den ventralen Blastomeren auftritt (LEVIN u. MERCOLA 1998), während beim Huhn dies durch ein Fehlen der Gap Junctions in der embryonalen Mittellinie erreicht wird (LEVIN u. MERCOLA 1999). Schrifttum 22 Huhn embryonale Mittellinienbildung ? ? Cx43 Shh ActivinßB Shh ActivinRIIa Nodal, Lefty* Lefty BMP BMP Caronte Caronte Nodal Pitx2 Nkx3.2 Lefty Späte Signale im Seitenplattenmesoderm und der Mittellinie FGF8 Lefty Frühe Signale in der Umgebung des Knotens von der Maus und von dem Huhn Nodal Lefty Snail-verwandtes (cSnR) *Die Induktion von Nodal und Lefty in der Knotenregion scheint beeinflusst zu sein durch die Antagonisierung von BMP durch Caronte, wie es im Seitenplattenmesoderm auftritt. . Abb. 8a: Schematische Darstellung des Signalweges der LR-Determination des Huhnes (modifiziert nach BURDINE u. SCHIER 2000). Schrifttum 23 Maus Zebrafisch embryonale Mittellinienbildung Knotenbildung Knotenasymmetrie [links-rechts Dynein (iv) Monozilie, Kif3A, Kif3B] BMP? Lefty1,2 Lefty2 Smad2,3 Fast Nodal Lefty Smad5 Nodal (cyc) Lefty1,2 ? ? FGF8 Shh Nodal Smad2,3 Fast Pitx2 Pitx2 SnR, Nkx3.2 Gestrichelte Pfeile zeigen auf mögliche Interaktionen im Gewebe der linken Seite des Embryos; diese Interaktionen sind möglicherweise nur relevant in frühen Stadien der Mesodermbildung (Essner et al. 2000). Abb. 8b: Schematische Darstellung des Signalweges der LR-Determination der Maus und des Zebrafisches (modifiziert nach BURDINE u. SCHIER 2000). Schrifttum 24 Xenopus embryonale Mittellinienbildung Frühe Signale ? ? Vg-1-artiges Kommunikation durch Signal? Gap Junctions Späte Signale im Seitenplattenmesoderm und der embryonalen Mittellinie im Xenopus und Zebrafisch und im Diencephalon des Zebrafisches Lefty Smad2, Fast Nodal (XNr1) Lefty ? ? Smad2, Fast Pitx2 Abb. 8c: Schematische Darstellung des Signalweges der LR-Determination des Xenopus (modifiziert nach BURDINE u. SCHIER 2000). 25 Schrifttum 2.6 Links-Rechts-Körperachsenentwicklung und Bruch der bilateralen Symmetrie 2.6.1 Nodal Flow Obwohl man sich bezüglich der Aktivierung der LR-Asymmetrie bei den übrigen Vertebraten noch nicht einig ist (siehe TABIN 2005), nimmt man bei der Maus an, dass der Bruch der LR-Asymmetrie höchstwahrscheinlich durch einen in eine Richtung verlaufenden Fluss der extraembryonalen Flüssigkeit im Primitivknoten erreicht wird. Diese Flüssigkeitsströmung wird als nodal flow bezeichnet (NONAKA et al. 1998) und tritt als linksgerichteter Fluss mit einer Geschwindigkeit von ca. 15 bis 20 µm/s beim Primitivknoten der Maus auf. Dieser extraembryonale Fluss wird durch rotierende Bewegungen der Primitivknotenzilien im Uhrzeigersinn ermöglicht. Diese Zilien sind einmal pro Zelle in der Primitivknotengrube vorhanden, ragen in den extraembryonalen Raum hinein (vgl. Abb. 5d) und besitzen eine 9+0-Struktur (vgl. Abb. 7B) (SHIRATORI u. HAMADA 2006). Im Gegensatz zu den konventionellen Zilien oder Flagellen mit einer Zusammensetzung von 9+2 Mikrotubuli (vgl. Abb. 7B) fehlt ihnen das zentrale Paar Mikrotubuli (HIROKAWA et al. 2006). Jede Monozilie ragt aus der Primitivknotengrube heraus. Der Basalkörper der Monozilie ist nach posterior positioniert, wodurch die Zilie nach hinten geneigt ist (Abb. 9). Durch den koordinierten Zilienschlag und die oben beschriebene ausgerichtete Position der bis zu 300 Monozilien ist ein linksgerichteter Fluss im Primitivknoten mit einer Geschwindigkeit von 600 rpm möglich (NONAKA et al. 1998; SHIRATORI u. HAMADA 2006; SMITH et al. 2008). Ventral Anterior Abb. 9: Jede Monozilie (schwarzer Strich) der Grubenzellen (grün) des Primitivknotens ist mit seinem Basalkörper (schwarzer Kreis) posterior positioniert, nach hinten geneigt und rotiert im Uhrzeigersinn (rote Pfeile) (modifiziert nach SHIRATORI u. HAMADA 2006). Posterior Dorsal 26 Schrifttum Der Flüssigkeitsstrom tritt allerdings nur vorübergehend auf, setzt im 1- bis 2Somitenstadium für einige Stunden ein und endet im 6-Somitenstadium. Die asymmetrische Nodal Expression beim LPM beginnt im 2-Somitenstadium und verschwindet zeitgleich mit dem nodal flow. Daher wurde angenommen, dass der nodal flow die asymmetrische Nodal Expression auf der linken Seite des Embryos zunächst im Primitivknoten und nachfolgend im linken LPM direkt oder indirekt initiiert (SHIRATORI u. HAMADA 2006). Verschiedene Mausmutanten, denen dieser nodal flow in Folge von strukturellen Defekten oder einer Unbeweglichkeit der Primitivknotenzilien fehlt, zeigen eine abnormale LR-Achsenentwicklung (OKADA et al. 1999). Die direkte Konsequenz des Fehlens des Flüssigkeitsstroms scheint die zufällige Anordnung der LR-Orientierung zu sein, die am besten durch die iv/iv (inversus viscerum) Mausmutante veranschaulicht wird, die immotile Zilien besitzt (SUPP et al. 1997, 1999). Dennoch verfügen die meisten Mausmutanten, denen Primitivknotenzilien fehlen, über komplexere Phänotypen, wie z.B. Links-Isomerie. Dies beruht auf funktionalen Defekten in der Mittellinienbarriere (SHIRATORI u. HAMADA 2006). Eine Umkehr der Richtung des nodal flow wiederum durch einen künstlich erzeugten Flüssigkeitsstrom über den Primitivknoten führt zu einer Umkehr des LR-Musters bei der Maus (NONAKA et al. 2002), was als Beweis dafür erbracht worden ist, dass der Fluss selbst für die korrekte Ausbildung der LR-Körperachse notwendig ist (SHIRATORI u. HAMADA 2006). Ein ähnlicher Mechanismus scheint auch bei anderen Vertebraten aktiv zu sein, wie jüngere Studien beim Zebrafisch, Xenopus, Huhn und Kaninchen zeigen (ESSNER et al. 2002, 2005; BISGROVE et al. 2005; KAWAKAMI et al. 2005; KRAMER-ZUCKER et al. 2005; OKADA et al. 2005). 27 Schrifttum 2.6.2 Bedeutung der planaren Zellpolarität Zellen zeigen eine morphologische planare Zellpolarität. Diese planare Zellpolarität (PCP) wird in verschiedenen Geweben während der Entwicklung der Vertebraten benötigt und führt bei einer Unterbrechung zu Anomalien, die die Entwicklung des Neuralrohrs, der Nieren, des Herzens und des Ohrs betreffen (ANTIC et al. 2010). So findet man bei einer Beeinträchtigung der PCP Neuralrohrdefekte, polyzystische Nieren, Herzdefekte und Taubheit vor (WANG u. NATHANS 2007; ETHERIDGE et al. 2008; SABURI et al. 2008; AXELROD 2009). Studien bei der Maus und beim Frosch lassen vermuten, dass eine konservierte Funktion für die PCP in der Bildung der LR-Asymmetrie bei Vertebraten vorliegt. Im Falle der Maus sind zwei wichtige Polaritätsproteine, nämlich Van Gogh like 1 (VANGL1) und PRICKLE2 (PK2) asymmetrisch entlang der AP-Achse im Knoten verteilt. Die asymmetrische Verteilung dieser Proteine in der anterioren kortikalen Domäne in den zentralen Knotenzellen findet wahrscheinlich vor der Determinierung der LR-Asymmetrie statt (ANTIC et al. 2010). Die Arbeitsgruppe von ANTIC (2010) vermutet, dass die frühe Entstehung der PCP im Primitivknoten der Maus und der Dachplatte des Gastrocoels für die posteriore Lokalisation der motilen Zilie, die für die Bildung des nodal flows wichtig ist, verantwortlich ist (SHIRATORI u. HAMADA 2006; MARSHALL u. KINTNER 2008; BLUM et al. 2009). HASHIMOTO et al. (2010) konnten zeigen, dass die durch den nichtkanonischen Wnt-Signaltransduktionsweg vermittelte Polarisierung verantwortlich ist für die Positionierung des Basalkörpers und die Neigung der Zilie. Untersuchungen des Forschungsteams von KIM (2010) bei Xenopus haben ergeben, dass das PCP-Protein Fritz zusammen mit den zytoskelettalen Proteinen Septin2 und Septin7 interagiert und die Zellbewegung und Ziliogenese kontrolliert. Ein knockdown von sowohl Fritz als auch Septin2 und 7 löst Defekte in der Ziliogenese aus, die sich in kürzeren und in einer geringeren Anzahl von Zilien zeigen. Expressionsunterbrechungen der Hedgehog Zielgene Nkx.2.2 treten auch beim Ausschalten von Septin2 und 7 in der Mittellinie auf. Eine Verbindung des PCP-Proteins Fritz und dem zytoskelettalen Protein Septin zum Meckel-Gruber- und Bardet-Biedl-Syndrom könnte gezogen werden, da diese beiden Krankheiten ebenfalls die Zellbewegung und 28 Schrifttum Ziliogenese beeinflussen (ROSS et al. 2005; SMITH et al. 2006; GERDES et al. 2007; LEITCH et al. 2008). Der Nachweis der homozygoten Mutation c.76-1G>t in Fritz und die Segregation dieser Mutation in der betroffenen Familie mit Bardet-BiedlSyndrom lässt vermutlich darauf schließen, dass Fritz loss-of-function Mutationen ausreichend sein könnten, um das Bardet-Biedl-Syndrom auszulösen (KIM et al. 2010). 29 Schrifttum 2.6.3 Detektion des gerichteten nodal flow am Primitivknoten und Umsetzung in Signaltransduktion Der gerichtete Flüssigkeitsstrom über dem Primitivknoten ist eine offensichtliche Vorraussetzung für die korrekte Ausbildung der LR-Körperachse. Dieses asymmetrische, mechanisch generierte Signal muss jedoch von den Zellen des Primitivknotens detektiert und in asymmetrische Signaltransduktion auf molekularer und zellulärer Ebene umgesetzt werden. Derzeit existieren drei sich gegenseitig nicht ausschließende, sondern aufeinander aufbauende und ergänzende Modelle, wie es zur Detektion und Umsetzung dieses asymmetrischen Signals kommt (NONAKA et al. 1998; MCGRATH et al. 2003; TANAKA et al. 2005). Plausibel scheint eine Kombination aus allen drei Modellen zu sein (CARTWRIGHT et al. 2007). Bei dem ersten und ältesten Modell, dem sogenannten Morphogen-Modell (Morphogen-Hypothese, siehe Abb.10A) geht man davon aus, dass der gerichtete Fluss einen Konzentrationsgradienten eines sezernierten Morphogens in der Grube des Ventralknotens erzeugt, welcher zur Anhäufung des Morphogens auf der linken Seite des Embryos und bei Überschreitung eines gewissen Schwellenwertes zur Induktion der Nodal-Signalkaskade führt (NONAKA et al. 1998; OKADA et al. 2005). Zur Diskussion stand jedoch immer, ob ein gerichteter Fluss mit einer Anhäufung eines Morphogens auf einer Seite physikalisch möglich ist. Da der Primitivknoten eine trianguläre, halbgeschlossene Grube ist, müsste der linksgerichtete Fluss theoretisch durch einen rechtsgerichteten Fluss kompensiert werden. Jedoch zeigte sich, dass der linksgerichtete Flüssigkeitsstrom mit ca. 5 µm über der Oberfläche die linke Seite erreicht und an der Seitenwand aufsteigt, um in einen rechtsgerichteten langsameren Rückfluss mit ca. 20 µm über der Oberfläche des Primitivknotens (OKADA et al. 2005) zu enden. Um zu überprüfen, ob ein Konzentrationsgradient auch unter diesen Bedingungen erzeugt werden kann, wurden fluoreszierende Proteine verschiedener Größen in die Primitivknotengrube eingeführt und deren Verteilung beobachtet (HIROKAWA et al. 2006). Interessanterweise produzierten nur Proteine mit einer Größe von 20 bis 40 kDa einen konstanten Konzentrationsgradienten. 30 Schrifttum Diese Größe stimmt mit Morphogenen wie FGF8 und Nodal überein. Daher könnten FGF8 (MEYERS u. MARTIN 1999), Nodal (BRENNAN et al. 2002) und auch growth differentiation factor 1 (GDF1) (RANKIN et al. 2000), die alle in der Primitivknotenregion produziert werden, als das entscheidende „Knoten“-Morphogen fungieren, was bis heute allderdings noch nicht bewiesen werden konnte. Das Zwei-Zilienmodell (siehe Abb.10B) wurde aufgestellt, nachdem festgestellt wurde, dass Polycystin 2, welches als selektiver Ionenkanal fungiert, Einfluss auf die korrekte Ausbildung der LR-Körperachse nimmt (MURCIA et al. 2000; PENNEKAMP et al. 2002; MCGRATH et al. 2003). In diesem Modell wird davon ausgegangen, dass zwei Arten von Monozilien, nämlich motile und immotile Zilien, im Primitivknoten vorhanden sind. Die motilen Zilien generieren den nach links gerichteten Flüssigkeitsstrom über den Primitivknoten, während die immotilen Zilien als Mechanosensor fungieren und den nach links gerichteten Fluss erkennen sollen (MCGRATH et al. 2003; TABIN u. VOGAN 2003). Das mechanisch detektierte Signal erzeugt einen Kalziumeinstrom in der linken Seite des Embryos und induziert darüber die linksspezifische Nodal-Signalkaskade. Dieses Zwei-Zilienmodell, in dem die Zilien als Mechanosensoren wirken, schließt jedoch eine chemosensorische Funktion dieser Monozilien nicht aus, so dass eine Kombination aus mechanischer und chemischer Reizung der Zilien durch Morphogene derzeit nicht außer Acht gelassen werden darf (MCGRATH et al. 2003). Das dritte Modell ist das sogenannte nodal vesicular parcel (NVP)-Modell (Abb. 10C). Durch Färbung der Oberflächenlipide der Embryonen durch fluoreszierende, lipophile Färbemittel und anschließenderder Analyse mit dem konfokalen Laser Scanning Mikroskop hat man zusätzlich zu den Bewegungen der Mikrovilli und der Zilien kleine Vesikel mit einem Durchmesser von 0,3 bis 5 µm entdeckt, die durch den nodal flow nach links transportiert werden (HIROKAWA et al. 2006). Dabei schien die Lipid-Färbung auf der linken Seite intensiver zu sein als auf der rechten Seite, was vermuten lässt, dass ein massiver Transport der Vesikel nach links stattgefunden hat. Man bezeichnet diese transportierten, kleinen Vesikel als nodal vesi- 31 Schrifttum cular parcels (NVPs). Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten das Vorhandensein vieler, freigegebener NVPs, die sich an die Oberfläche des Ventralknotens anhefteten (HIROKAWA et al. 2006). Der Durchmesser der NVPs betrug 1 bis 2 µm, was mit den Beobachtungen, die durch die Fluoreszenzmarkierung gemacht wurden, übereinstimmte. Jedes NVP enthielt viele kleinere elektronendurchsichtige Tröpfchen, die von einer äußeren Membran umhüllt waren. Diese Tröpfchen ähneln den Lipoproteinpartikeln, deren genaue chemische Zusammensetzung noch unbekannt ist. Das Freisetzen von NVPs ist anscheinend ein aktiver, von FGF8-abhängiger Prozess, der ca. 10 Sekunden benötigt (HIROKAWA et al. 2006). Die anfängliche Ausrichtung der NVP-Verteilung ist zufällig und manchmal gegen der Richtung des nodal flows. Es scheint, als ob die NVPs die Spitze einer stabförmigen Struktur (vielleicht der Mikrovilli) verlassen würden. Nach der Freisetzung gelangen die NVPs in die Mitte der laminaren Flüssigkeitsströmung, einige Mikrometer über der mit Zilien besetzen Oberfläche des Primitivknotens, wo die Strömungsrate am schnellsten ist. Das wiederum verhindert, dass die NVPs von den rotierenden Zilien in der Anfangsphase der Freisetzung der NVPs getroffen werden. Während der nächsten 10 Sekunden werden die NVPs durch den nodal flow nach links transportiert, treffen auf die mit Zilien besetzte Oberfläche und platzen. Durch diese Fragmentierung geben sie ihren Inhalt (Retinolsäure [RA], Sonic Hedgehog [Shh]) ab, induzieren ein linksspezifisches Kalziumsignal und in Folge die Nodal-Kaskade (TANAKA et al. 2005; SHIRATORI u. HAMADA 2006). Letztendlich werden die Überreste der NVPs über die Oberfläche der nodalen Kronzellen auf der linken Seite resorbiert (HIROKAWA et al. 2006). Die Arbeitsgruppe von CARTWRIGHT (2007) geht davon aus, dass die Freisetzung der NVPs durch einen aktiven, chemischen Freisetzungsmechanismus wie zum Beispiel durch den Kontakt der Vesikelmembran mit einer bestimmten Region des Knotens oder der Zilie ausgelöst wird. Hier wird vermutet, dass die zweite Population von Monozilien, nämlich die immotilen Monozilien an den Seiten des Knotens, wie sie im Zwei-Zilienmodell von MCGRATH (2003) beschrieben worden sind, mög-licherweise mit der Fragmentierung der NVPs in Zusammenhang stehen. Denn in mutanten 32 Schrifttum Mausembryonen, in denen NVPs freigesetzt wurden, aber Zilien immotil waren und keinen Fluss bilden konnten, trat trotzdem eine noch unbekannte biochemische Freisetzung der NVPs auf (TANAKA et al. 2005). Daher scheint eine Kombination aus allen drei Modellen plausibel zu sein: Die unbeweglichen Zilien könnten als Mechanosensoren (Zwei-Zilien-Modell) fungieren und gleichzeitig auch für die Freisetzung der NVPs verantwortlich sein, um die darin enthaltenden Morphogene zu entlassen (Morphogen-Hypothese) (CARTWRIGHT at al. 2007). 33 Schrifttum Abb. 10: Drei verschiedene Modelle zur schematischen Darstellung des nodal flow im ventralen Primitivknoten der Maus. (A) Morphogen- Hypothese. (B) Zwei- Zilienmodell. (C) NVP-Modell. = unbekanntes Morphogen; = nodal vesicular parcels (NVPs); = freigesetztes NVP; = unbekannter zweiter Rezeptor-LigandKomplex; = Zilie; = Drehung der Zilie im Uhrzeigersinn; = FibroblastenwachstumsfaktorSignal; = mechanosensorische Zilien; = Primitivknotengrube (modifiziert nach NONAKA et al. 1998; TABIN u. VOGAN et al. 2003; TANAKA et al. 2005; SCHLUETER u. BRAND 2007) 34 Schrifttum 2.6.4 Signalübertragung vom Primitivknoten zum LPM und Stabilisierung der asymmetrischen Genexpression Das am Primitivknoten mechanisch generierte Signal ist für die nachfolgende asymmetrische Nodal-Epxression im linken Seitenplattenmesoderm wichtig (OKI et al. 2007). Hierdurch ergeben sich jedoch zwei Fragen: Wie wird das asymmetrische Signal vom Primitivknoten zum Seitenplattenmesoderm transferiert und wie wird es dort stabilisiert? Es ist bereits bekannt, dass Nodal fähig ist, über längere Distanzen zu agieren (CHEN u. SCHIER 2001; YAMAMOTO et al. 2003). Unklar ist jedoch, über welchen Weg Nodal vom Primitivknoten zum LPM übertragen wird (OKI et al. 2007). Vermutet wird allerdings ein interner Weg (Abb. 11A), bei dem Nodal zur basolateralen Seite der perinodalen Kronzellen sezerniert wird. Danach wird das Nodal-Signal entweder direkt (Abb. 11B) oder indirekt (Abb. 11C) über das paraxiale Mesoderm zum LPM übertragen. Der genaue Mechanismus ist nicht bekannt, es gilt jedoch mittlerweile als gesichert, dass Nodal für seinen Transport vom Primitivknoten zum LPM auf sulfatierte Glykosaminoglykane (GAG) angewiesen ist, die zwischen dem Primitivknoten und dem LPM lokalisiert sind (OKI et al. 2007). Schrifttum 35 A B ventral rechts Direkter Transport links Nodal dorsal Node LPM C Indirekte Signalübertragung X1 Node X2 Xn Nodal LPM Abb. 11: Schematische Präsentation der möglichen Routen für die Nodalsignaltransmission vom Knoten zum LPM im Mausembryo. (A) Schematischer Transversalschnitt eines Embryos am E8.2; Entoderm (grün), Mesoderm (hellrosa), Ektoderm (hellblau); Knoten (gelb); Nodal exprimierende Zellen (dunkelblau); interne (roter Pfeil) mögliche Route der Nodalsignalübertragung. (B, C) Zwei hypothetische interne Mechanismen des Nodalsignalweges vom Knoten (blaues Quadrat) zum LPM (blaues Hexagon). Nodal (pink); Typ I und Typ II Aktivin Rezeptoren (grün und hellrosa); Cryptic (gelb). (B) Das direkte Transportmodell: Das im Knoten produzierte Nodal gelangt direkt zum LPM, wo es durch Cryptic eingefangen wird und dadurch die Nodal Expression induziert wird. (C) Das indirekte Signalübertragungsmodell: Das im Knoten produzierte Nodal bindet an Cryptic und induziert so die Expression der nachgeschalteten Genprodukte (X1, X2, Xn), die das Nodal-Signal übertragen, um die Nodal-Expression im LPM zu induzieren (adaptiert nach OKI et al. 2007). 36 Schrifttum 2.7. Ausgewählte Proteine zur immunhistochemischen Analyse des Primitivknotens Um eine solide Grundlage für eine Darstellung der Entwicklung des Primitvknotens der Maus inklusive einer Charakterisierung der Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kontakte zu erreichen, wurden für die immunhistochemischen Analysen einige bedeutende Polaritätsproteine ausgewählt. Die ausgesuchten Proteine sind entweder den Tight Junctions (Zonula occludens), den Adherens Junctions (Zonula adhaerens) oder den Focal Adhesions (Fokale Adhäsionen) zuzuordnen (vgl. Abb. 12), gehören zu den Annexinen, in den Bereich der Zilien oder sind an der Tgfβ/Bmp-Signaltransduktion beteiligt. Diese Proteine sind wichtig, da sie Zell-Zell-Kontakte und Zell-MatrixInteraktionen bilden und an vielen verschiedenen Zellprozessen, wie der Zellmigration und der Genexpression (LIU 2000) oder der Epithelproliferation beteiligt sind (BALDA et al. 2003). Schrifttum 37 Apikal Plasmamembran Tight Junction Proteinkomplex Cadherine und Catenine Adherens Junction Aktinfilamente Cadherin Desmosome Keratinfilamente Gap Junction Connexon Hemidesmosome Fokale Adhäsion Basalmembran Basal Abb. 12: Übersicht der unterschiedlichen Zell-Zell-Verbindungen (modifiziert nach BLONDER et al. 2004) 38 Schrifttum 2.7.1 Acetyliertes Tubulin Mikrotubuli sind obligate Strukturelemente eukaryotischer Zellen, die als röhrenförmige Elemente des Zytoskeletts auftreten und überwiegend aus hochkonservierten Tubulinen aufgebaut sind. Mikrotubuli bestehen aus α- und β-Tubulin und spielen bei vielen charakteristische Prozessen innerhalb der Zelle eine Rolle. Hierzu gehören die Bewegung der Chromosomen während der Mitose und Meiose, der intrazelluläre Transport, die Bildung und die Aufrechterhaltung der zellulären Morphologie, das Zellwachstum, die Zellmigration und die Morphogenese in multizellulären Organismen. α- und β-Tubulin gehören zusammen mit γ-Tubulin zur Familie der Tubuline. Bekannt ist, dass die hochkonservierten Tubuline nicht nur phosphoriliert und glutamyliert, sondern auch acetyliert werden können. Tubulin ist ca. 50 kDa groß und hat eine Länge von etwa 450 Aminosäuren. Die acetylierte Form von Tubulin ist in unterschiedlichen Mikrotubuli-Strukturen vertreten, die diese stabilisieren. Acetyliertes Tubulin ist unter anderem Bestandteil von Primärzilien, Zentriolen und mitotischen Spindeln. Daher wird anti-acetyliertes Tubulin häufig als Marker für Zilien verwendet (PIPERNO 1987; HAMMOND 2008). 2.7.2 γ-Tubulin Das zusammen mit α- und β-Tubulin zur Tubulin-Superfamilie gehörende γ-Tubulin (Tubg1), ist ca. 51 kDa groß und 451 AS lang und ubiqitär in den Eukaryoten vertreten. Aufgrund seiner geringen Menge wurde γ-Tubulin erst sehr spät in den Zellen entdeckt (OAKLEY u. OAKLEY 1989; STEARNS et al. 1991; ZHENG et al. 1991; OAKLEY 2000). Mittels γ-Tubulin-spezifischer Antikörper konnte γ-Tubulin bei Immunfluoreszenzstudien vor allem an den Zentrosomen von Drosophila, Maus und Mensch identifiziert werden (ZHENG et al. 1991) und wird daher als Marker für Zentrosomen verwendet. Eine große Anzahl von Studien hat bewiesen, dass γ-Tubulin eine unverzichtbare Komponente der Mikrotubuli organisierenden Zentren (MTOCs) ist, die für die Mikrotubuli-Nukleation und -Organisation verantwortlich ist (MORITZ u. AGARD 2001; JOB et al. 2003). So wird die Ausbildung eines Mikrotubuluszytoskeletts verhindert, wenn die Säugerzellen mit gegen γ-Tubulin gerichtete Antikörper behandelt werden (WOLF u. BÖHM 1997). Obwohl die Aktivität von 39 Schrifttum γ-Tubulin auf die MTOCs begrenzt ist, ist der Großteil des γ-Tubulins im Zytosol lokalisiert (OAKLEY 2000). Zytosolisches γ-Tubulin wurde in zwei Hauptkomplexen gefunden: Der große γ-Tubulin-Ringkomplex (γ-TuRC) und der kleine γ-TubulinKomplex (γ-TuSC) (WIESE u. ZHENG 1999; GUNAWARDANE et al. 2000; SCHIEBEL 2000). Dabei ist γ-Tubulin ein phylogenetisch konservierter TubulinIsotyp, der nicht in die Mikrotubuliwand eingebaut ist, sondern als γ-TubulinRingkomplex (γ-TuRC) die Polymerisation von α- und β-Tubulin zur Bildung der Mikrotubuli reguliert, indem es am Minus-Ende des Mikrotubulus (an der Basis des Mikrotubulusschafts) bindet (WIESE u. ZHENG 2006). 2.7.3 Tight Junction Die Tight Junction (TJ), die auch Zonula occludens genannt wird, besitzt zwei Funktionen: Erstens fungiert sie als eine Diffusionsbarriere, indem sie eine Versiegelung der Zwischenräume der Epithelzellen zwischen den einzelnen Zellen ausbildet. Hierdurch wird der parazelluläre Weg von Molekülen kontrolliert (barrier function). Zweitens verhindert die Zonula occludens die Bewegung von Membrankomponenten und hält somit die Polarität der Epithelzellen mit einem apikalen und basolateralen Bereich aufrecht (fence function) (ANDERSON et al. 1993; HOWARTH u. STEVENSON 1996; BALDA u. MATTER 1998; TSUKITA et al. 2001; ANDERSON et al. 2004; SCHULZKE u. FROMM 2009). Zu den Tight Junctions gehören unter anderem folgende Proteine: Claudin 1, Claudin 2, Claudin 3, Claudin 4 und Claudin 5, JAM-A, PAR-3, PAR-6 und Zo-1. 40 Schrifttum 2.7.3.1 Claudin 1-5 Die Claudine 1-5 gehören zur Familie der Claudine, von denen bisher 24 verschiedene Mitglieder entdeckt wurden (LAL-NAG u. MORIN 2009). Claudine bilden zusammen mit zwei weiteren Transmembranproteinen (JAM und Occludin) die Tight Junctions (TSUKITA et al. 2001; FURUSE et al. 1998). Die Claudine 1-5 sind ca. 210-230 Aminosäuren lang und ca. 22 - 25 kDa groß (aus Mouse Genome Informatics, http://www.informatics.jax.org). Sie spielen eine große Rolle als integrale Komponente der Tight Junctions, werden an den Tight Junctions als Hauptbestandteil lokalisiert und besitzen eine Abdichtungsfunktion (FURUSE et al. 1998; MORITA et al. 1999a; MORITA et al. 1999b; TSUKITA et al. 2001; VAN ITALLIE et al. 2001; FURUSE et al. 2002). Das Expressionsmuster der Claudine variiert unter den Geweben beträchtlich und einige Claudine sind ubiquitär aktiv (in fast allen endothelialen Geweben), andere sind primär in spezifischen Zelltypen exprimiert (vgl. Tab. 1, z.B. Claudin 5) und wieder andere wie z.B. Claudin 6 sind zeitlich begrenzt bei den Mäusen nur während der Embryogenese exprimiert (FURUSE et al. 1998; MORITA et al. 1999a; TSUKITA et al. 2001). Die meisten Zelltypen exprimieren allerdings mehr als zwei Claudinarten in verschiedenen Kombinationen, um Tight Junctions mit unterschiedlicher Durchlässigkeit bezüglich der Ladungs- und Größenselektivität zu bilden. Die Claudine sind dabei an zwei verschiedenen Protein-Protein-Interaktionen beteiligt. Innerhalb der verschiedenen Einzelstränge werden unterschiedliche Arten von Claudinen zusammen polymerisiert, um Heteropolymere zu bilden. Dagegen haften zwischen den angrenzenden Strängen innerhalb der verbundenen Stränge Claudine in einer sowohl homotypischen als auch heterotypischen Art und Weise aneinander an (FURUSE et al. 1999; KUBOTA et al. 1999; TSUKITA u. FURUSE 2000; TSUKITA et al. 2001; COLEGIO et al. 2003; SCHNEEBERGER 2003). Schrifttum 41 Tab. 1: Expression ausgewählter Claudine von Mensch und Maus (modifiziert nach TSUKITA et al. 2001) Claudine Herz Gehirn Lunge Leber Niere Hoden andere Claudin 1 + + + + + + Claudin 2 - - - + + - Claudin 3 - - + + + +/- Claudin 4 - - + - + - Claudin 5 + + + + + + Endothelzellen Claudin 6 - - - - - - Embryonales Gewebe Claudin 7 - - + - + +/- Claudin 8 - - + +/- + +/- Claudin 10 n.a.1 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. Claudin 11 - + - - - + Claudin 14 - - - + + n.a. Claudin 16 - - - - + n.a. Organe, Gewebe Oligodendrozyten, Sertolizellen Haarzellen im Corti-Organ Tubulus rectus distalis (aufsteigender Teil der Henleschen Schleife) 2.7.3.2 JAM-A JAM-A gehört zusammen mit JAM-B, JAM-C, ESAM, Car und A33 zur Immunglobulinfamilie. Das hier analysierte Junctional Adhesion Molecule A (JAM-A, auch F11 Rezeptor genannt) ist gekennzeichnet durch zwei extrazelluläre ImmunglobulinDomänen, eine Transmembrandomäne und eine intrazellulären PDZ-bindende Domäne (BAZZONI 2003). JAM-A ist 300 AS lang und ca. 32 kDa groß (aus Mouse Genome Informatics, http://www.informatics.jax.org). JAM-A ist speziell an den Tight 1 n.a. : nicht angegeben 42 Schrifttum Junctions (Zonula occludens) als interzelluläre Verbindung an der apikalen Seite sowohl in Endothel- als auch in Epithelzellen angereichert und zu einem geringeren Grad an den zirkulierenden Leukozyten und Blutplättchen sowie im Myokard exprimiert (MARTIN-PADURA et al. 1998; BAZZONI et al. 2000; BAZZONI 2003). Für JAM-A vermutet man, dass es über seine zytoplasmatische Domäne direkt mit Tight Junction-assoziierten Proteinen, wie z.B. Zo-1, in Kontakt tritt (BAZZONI et al. 2000) und über seine extrazelluläre Domäne mit Leukozyten assoziiert (EBNET et al. 2004). Somit besitzt JAM-A eine duale Funktion, wobei JAM-A zum einen zur adhäsiven Funktion der Tight Junctions beiträgt, und zum anderen eine wichtige Rolle bei der Entzündung spielt, vor allem während der Leukozytentransmigration (MARTINPADURA et al. 1998; BAZZONI 2003). Darüber hinaus wurde JAM-A auch als Kohlenhydrat-abhängiger Rezeptor für Reoviren entdeckt (BARTON et al. 2001). 2.7.3.3 PAR-3 und PAR-6 PAR-3 und PAR-6 gehören zur partitioning-defective-Protein (PAR)-Familie und bilden zusammen mit einem weiteren Polaritätsprotein, der atypischen Proteinkinase C (aPKC), einen dreigliedrigen PAR-3-aPKC-PAR-6-Komplex (SUZUKI u. OHNO 2006). Das Gerüstprotein PAR-3 ist 1333 Aminosäuren lang und ca. 149 kDa groß. PAR-6 ist 346 Aminosäuren lang und ca. 37 kDa groß (aus Mouse Genome Informatics, http://www.informatics.jax.org). Die evolutionär erhaltenen Polaritätsproteine PAR-3 und PAR-6 sind an der apikalen Domäne der Säugetierepithelzellen oberhalb der Adherens Junctions (Zonula adhaerens) lokalisiert, an der sich die TJs bilden. Dort kolokalisieren sie auch mit Zo-1 (IZUMI et al. 1998; JOHANSSON et al. 2000; SUZUKI et al. 2001; KNUST u. BOSSINGER 2002). Eine wichtige Funktion des PAR-3-aPKC-PAR-6-Komplexes ist es, die Entwicklung der TJs zu unterstützen und zur Bildung und Erhaltung der Zellpolarität in verschiedenen biologischen Kontexten beizutragen (SHIN et al. 2006; SUZUKI u. OHNO 2006; EBNET et al. 2008). Schrifttum 43 2.7.3.4 Zo-1 Das Tight Junction Protein 1 (Zo-1, Zonula occludens 1) gehört zur Familie der membran associated guanylate kinase homologs (MAGUK) und wird zu den TJ Proteinen gerechnet. Zo-1 ist ein 1745 AS langes und ca. 194 kDa großes intrazellulär lokalisiertes Phosphoprotein (aus Mouse Genome Informatics, http://www.informatics.jax.org), welches auf der zytoplasmatischen Seite der Zonula occludens vorkommt (STEVENSON et al. 1986, 1988). Durch kombinierte in vivo und in vitro Bindungsassays ist bekannt, dass das N-terminale Ende des Proteins in Kontakt mit Zo-2 und Occludin tritt. Die C-terminale Domäne interagiert mit dem F-Aktin des Zytoskeletts der Zelle (FANNING et al. 1998), wodurch zur Stabilität beigetragen wird. Zusammen mit Zo-2 und Zo-3 stellt Zo-1 über intramembranäre TJ Proteine (Occludin, Claudin, JAM) eine Verbindung zu Nachbarzellen her (FURUSE et al. 1993; MARTIN-PADURA et al. 1998; ANDERSON u. VAN ITALLIE 1999). 2.7.4 Adherens Junctions Adherens Junctions (AJs, auch Zonula adhaerens genannt) sind für die Bildung und Erhaltung der Epithelschichten wichtig, die zum Beispiel die Organoberflächen auskleiden. AJs vermitteln eine Adhäsion zwischen den Zellen und geben das Signal weiter, dass Nachbarzellen anwesend sind. Außerdem verankern sie das Aktinzytoskelett. In dieser Funktion regulieren AJs normales Zellwachstum und Zellverhalten. In einigen Stadien der Embryogenese, bei der Wundheilung und bei Tumorzellmetastasen, bilden und verlassen Zellen Epithelien. Dieser Prozess der epithelialen zu mesenchymalen Transition (EMT), der einen Abbau und die Wiederherstellung der Zell-Zell-Kontakte zur Folge hat, wird durch den Auf- und Abbau der AJs reguliert. AJs können auch in der Transmission von „Kontakt-Inhibierungs“-Signalen tätig sein, welche eine Terminierung der Zellteilung bewirken, sobald eine Epithelschicht vollständig ist. AJs sind direkt unterhalb der TJs positioniert und charakterisiert durch zwei aneinander gelegte Membranen, die durch einen schmalen Spalt von ca. 20 nm getrennt sind und über eine Länge von 0,2 - 0,5 µm parallel verlaufen (NIESSEN 44 Schrifttum 2007). Zu den Adherens Junctions gehören unter anderem folgende Proteine: β-Catenin, Phospho-β-Catenin, E-Cadherin und N-Cadherin. 2.7.4.1 β-Catenin und Phospho-β-Catenin Das auch unter dem Namen Ctnnb1 bekannte β-Catenin, gehört zur Familie der Catenine, wird zu den Adherens Junctions gerechnet, ist 781 AS lang und ca. 85 kDa groß (aus Mouse Genome Informatics, http://www.informatics.jax.org). Es fungiert in der Zelle als Ankermolekül für Kalzium-abhängige Cadherine in verschiedenen subzellulären Kompartimenten, welches intrazelluläre Aktinfilamente mit transmembranösen Cadherinen verbindet (GUMBINER 1995; ABERLE et al. 1996, 1997; MULLER et al. 2002). Zusätzlich zu dieser adhäsiven Funktion spielt β-Catenin im Zellkern eine wichtige Rolle in der Vermittlung von Wnt-abhängigen Signalen im Wnt/Signaltransduktionsweg (GUMBINER 1995; MULLER et al. 2002). Der Wnt/Signaltransduktionsweg ist für die Zelldifferenzierung, Proliferation und Apoptose, sowie für viele andere Aspekte der Entwicklung von großer Wichtigkeit. Auch Phospho-β-Catenin hat im Wnt/Signaltransduktionsweg eine große Bedeutung. In der Abwesenheit der Wnt-Liganden wird β-Catenin durch einen Destruktionskomplex phosphoriliert, so von einer Ubiquitin-Ligase erkannt und proteolytisch abgebaut. Hingegen wird bei Anwesenheit von Wnt der Wnt/Signaltransduktionsweg aktiviert, was zur Inhibierung des Destruktionskomplexes führt, sowie zur β-Catenin Stabilisierung und dem Eintritt von β-Catenin in den Zellkern. Dadurch kann nukleäres βCatenin mit Transkriptionsfaktoren assoziieren und die gezielte Genexpression in Gang setzen (JOHNSON u. KAMEL 2007; FUERER et al. 2008; TEVOSIAN u. MANUYLOV 2008). 2.7.4.2 E-Cadherin E-Cadherin (epidermales Cadherin), früher auch als Uvomorulin (HYAFIL et al. 1981) bezeichnet, gehört zur Familie der klassischen Cadherine des Typ I und wird zu den AJs gerechnet (TANEYHILL 2008; HULPIAU u. VAN ROY 2009). E-Cadherin ist ein 884 Aminosäuren langes und ca. 98 kDa großes kalziumabhängiges Glycoprotein, Schrifttum 45 welches bei allen Säugetierepithelien hauptsächlich an den AJs der angrenzenden Zellen exprimiert wird (aus Mouse Genome Informatics, http://www.informatics.jax.org; NOSE et al. 1988; YAP et al. 1997). E-Cadherin ist somit als homophil-bindendes Zelladhäsionsmolekül zusammen mit seinen assoziierten zytoplasmatischen Proteinen α-, β- und γ-Catenin für die epitheliale Zell-ZellAdhäsion und für die Aufrechterhaltung des Zytoskeletts von großer Bedeutung (NOSE et al. 1988; TAKEICHI 1991; TANEYHILL 2008). Störungen in der Expression oder Funktion irgendeines dieser Moleküle resultiert in dem Verlust der interzellulären Adhäsion mit möglicher nachfolgender Zelltransformation und Tumorentwicklung (EL-BAHRAWY u. PIGNATELLI 1998). Zusätzlich zur Kontrolle der epithelialen Zelladhäsion, scheint E-Cadherin im Cadherin-Catenin-Komplex als Regulationsund Signalmolekül für Polarität, Differenzierung, Proliferation, Apoptose, sowie Migration und Invasion zu fungieren (EL-BAHRAWY u. PIGNATELLI 1998). E-Cadherin spielt auch bei der EMT eine Rolle, bei der Epithelzellen während der Embryonalentwicklung mesenchymale Eigenschaften erlangen, indem E-Cadherin herunterreguliert wird (PLA et al. 2001). 2.7.4.3 N-Cadherin N-Cadherin, auch Cdh2 genannt, gehört zur Familie der klassischen kalziumabhängigen Cadherine und ist an den AJs lokalisiert (TANEYHILL 2008). N-Cadherin (neuronales Cadherin) ist benannt nach dem Neuralgewebe, in dem es ursprünglich gefunden wurde und ist 906 AS lang und ca. 99 kDa groß (aus Mouse Genome Informatics, http://www.informatics.jax.org; SHAPIRO et al. 1995). N-Cadherin trägt zur extrazellulären Adhäsion bei, welche die strukturelle Stabilität unterstützt und die Erkennung von extrazellulären Partnern wie N-Cadherin (bei der homophilen Bindung) und FGF (FibroblastenWachstumsfaktor)-Rezeptoren ermöglicht (CHRISTOFORI 2006). Des Weiteren spielt N-Cadherin eine Rolle bei der intrazellulären Signaltransduktion über die Interaktion mit zytoplasmatischen Proteinen, wie z.B. α-, β-, δ- und p120-Cateninen. Eine entscheidende Funktion hat N-Cadherin auch beim cadherinswitch bei der EMT, bei der E-Cadherin herunterreguliert wird und durch N-Cadherin ersetzt wird. Bei diesem Vorgang findet eine Reorganisation des Aktinzytoskeletts 46 Schrifttum statt, bei der die Zell-Zell-Kontakte unterbrochen werden und eine erhöhte Motilität erfolgt (MAEDA et al. 2005). Schrifttum 47 2.7.5 Fokale Adhäsionen Fokale Adhäsionskomplexe spielen eine entscheidende Rolle in wichtigen biologischen Prozessen, wie der Zellmotilität, Zellproliferation, Zelldifferenzierung, Regulierung der Genexpression und dem Zellüberleben. Fokale Adhäsionskomplexe finden sich an Stellen, an denen das Aktinzytoskelett einer Zelle mit der extrazellulären Matrix (ECM) verbunden ist. An diesen Positionen sind Aktinfilamentbündel an Transmembranrezeptoren der Integrinfamilie durch einen multizellulären Komplex aus junktionalen Plaque-Proteinen verankert. Einige der Bestandteile der fokalen Adhäsionskomplexe nehmen an der strukturellen Verbindung zwischen Membranrezeptoren und dem Aktinzytoskelett teil, während andere wiederum als Signalmoleküle fungieren, die unterschiedliche Proteinkinasen und Phosphatasen, sowie verschiedene Adapterproteine beinhalten (JOCKUSCH et al. 1995; YAMADA u. GEIGER 1997). Folgende Mitglieder der fokalen Adhäsionskomplexe wurden in dieser Arbeit analysiert: Fokale Adhäsionskinase (FAK) und Paxillin. 2.7.5.1 FAK Die Fokale Adhäsionskinase (FAK) gehört zur Protein Kinase Superfamilie und ist an den fokalen Adhäsionskomplexen lokalisiert. FAK ist ein ca. 124 kDa großes und 1090 Aminosäuren langes Protein (aus Mouse Genome Informatics, http://www.informatics.jax.org), das in den Integrin vermittelten Signaltransduktionsweg involviert ist (CLARK u. BRUGGE 1995; SCHWARTZ et al. 1995). Es assoziiert mit unterschiedlichen Signalproteinen, wie z.B. der Src-Familie, p130cas, PI 3 Kinase und Paxillin. Dieses ermöglicht FAK, innerhalb eines Netzwerkes von Integrinstimulierten Signalwegen tätig zu sein, welches zum Beispiel zur Aktivierung des Mitogen aktivierten Protein Kinasewegs (MAP) führt (SCHLAEPFER et al. 1999). FAK ist eine zytoplasmatische Nicht-Rezeptor-Protein-Tyrosin-Kinase, die für die Kontrolle von Zellmigration, Zellproliferation und für das Zellüberleben wichtig ist (ZHAI et al. 2003; VADALI et al. 2007). Schrifttum 48 2.7.5.2 Paxillin Paxillin gehört zur Familie der Paxilline und ist an den fokalen Adhäsionskomplexen lokalisiert. Sein Name stammt aus dem lateinischen paxillus und bedeutet soviel wie Haken. Die Funktion von Paxillin ähnelt der eines Zeltherings, in dem es Aktinstressfasern an die fokalen Adhäsionskomplexe verankert (TURNER et al. 1990; BROWN u. TURNER 2004). Paxillin ist ein ca. 64 kDa großes und 591 Aminosäuren langes Phosphotyrosin enthaltendes Protein (aus Mouse Genome Informatics, http://www.informatics.jax.org), das als Substrat für bestimmte Tyrosin-Kinasen wie z.B src oder FAK fungiert (GUAN 1997; GOZIN et al. 1998; SCHALLER 2001). Paxillin selbst dient mit seinen verschiedenen Motiven als Andock-/Adapterprotein, um Signalmoleküle zu den fokalen Adhäsionskomplexe zu rekrutieren und zusammen mit diesen die Veränderungen in der Zelladhäsion, zytoskelettalen Reorganisation und in der Genexpression zu kontrollieren, die für die Zellmigration und den Zellerhalt notwendig sind (SCHALLER 2001; DEAKIN u. TURNER 2008). 2.7.6 Annexine Annexine sind Kalzium-abhängige Phospholipid-bindende Proteine, die zur Familie der Annexine gehören und auch unter dem Namen Lipocortin bekannt sind (aus Mouse Genome Informatics; MOSS u. MORGAN 2004). Alle Annexine besitzen eine Basisstruktur, die aus einer hochkonservierten Kerndomäne am COOH-Ende und einer variablen Kopfdomäne am NH2-Ende besteht (GERKE u. MOSS 2002). Die Kerndomäne wiederum setzt sich bei allen Annexinen aus vier Annexinrepeats zusammen, die als Kalziumbindungsstellen verantwortlich und für die Interaktion mit Phospholipiden an der Plasmamembran wichtig sind (OLING et al. 2000). Jedes Annexinrepeat hat eine Länge von ca. 70-80 AS (MOSS u. MORGAN 2004). Annexin 6 bildet servierten hier eine Ausnahme, Annexinrepeats da aufgebaut seine ist (aus Kerndomäne Mouse aus Genome acht kon- Informatics, http://www.informatics.jax.org). Die N-terminale Region ist dagegen für die Bindungsstellen bei zytoplasmatischen Proteinen wichtig, wie z.B. S100A10 (p11) im 49 Schrifttum Fall von Annexin 2 (GERKE u. MOSS 2002; HE et al. 2008). Während der C-terminale Proteinkern die Grundeigenschaften jedes Annexinproteins repräsentiert, ist die N-terminale Kopfgruppe für die funktionelle Spezifität eines Annexins zuständig. Aus der Familie der Annexine wurden folgende Mitglieder analysiert: Annexin 2, Annexin 4 und Annexin 6. 2.7.6.1 Annexin 2, Annexin 4, Annexin 6 Annexin 2 ist 339 AS lang und hat ein Gewicht von ca. 39 kDa. Annexin 4 ist 319 AS lang und hat eine Masse von ca. 36 kDa. Annexin 6 hat aufgrund seiner zweifachen Kerndomäne eine Länge von 673 AS und ein Gewicht von ca. 76 kDa (aus Mouse Genome Informatics, http://www.informatics.jax.org). Annexine sind ubiquitär bei allen eukaryotischen Zelltypen vorhanden und an vielen intrazellulären und membranassoziierten Prozessen, wie zum Beispiel der Regulation in der Membranorganisation, dem Verkehr und der Organisation von Vesikeln, der Verknüpfung von Membranen mit dem Zytoskelett, der Organisation des Zytoskeletts selbst, der Exo- und Endozytose, beteiligt (GERKE u. MOSS 2002; GERKE et al. 2005). 2.7.7 Signalmoleküle 2.7.7.1 Smad 1-4 Smad-Proteine, von denen acht verschiedene Proteine bei den Säugetieren gefunden wurden, gehören zu einer Familie von Rezeptor-aktivierten Proteinen, die Signale von Transforming Growth Factor (TGF)-β Superfamilie Liganden vermitteln (HUANG et al. 2000; WEINSTEIN et al. 2000). Smads, die ursprünglich in wirbellosen Tieren entdeckt wurden und ihren Namen aus den Abkürzungen von C. elegans Sma und Drosophila Mad erhalten haben (DERYNCK et al. 1998), werden in drei Gruppen eingeteilt: 1) Rezeptor-aktivierte Smads (R-Smads), die durch die Smad Proteine 1, 2, 3, 5, und 8 repräsentiert werden, 2) einfache Smads, zu denen Smad 4 zählt und 3) die Smad-proteine 6 und 7, die zu den inhibitorischen Smads gerechnet 50 Schrifttum werden (HUANG et al. 2000; WEINSTEIN et al. 2000). Smads reagieren als Typ I Rezeptor-aktivierte Signaleffektoren, welche die Transkription von selektiven Genen als Antwort auf die Liganden regulieren. Ihre Rezeptoren sind Serin/Threonin Kinaserezeptoren, von denen es zwei Typen gibt, nämlich Typ I und Typ II Rezeptoren (DERYNCK u. FENG 1997; HELDIN et al. 1997; MASSAGUE 1998). Beim TGF-β/Smad Signaltransduktionsweg (siehe Abb. 13) interagieren Rezeptoraktivierte Smads vorübergehend mit dem aktivierten Rezeptorkomplex (Typ I und II Rezeptor) und werden durch den Rezeptor Typ I phosphoriliert. Während Smad 2 und Smad 3 durch die Liganden Aktivin und TGF-β phosphoriliert und aktiviert werden, werden Smad 1, Smad 5 und Smad 8 durch Bmp phosphoriliert und aktiviert. Die phosphorilierten und Rezeptor-aktivierten Smads bilden anschließend einen Komplex mit dem einfachen Smad 4, welcher dann in den Zellkern transloziert wird. Zusammen mit einem DNA-Bindungspartner bindet dieser Komplex an spezifische Verstärker in den Zielgenen, um die Transkription zu aktivieren (MASSAGUE 1998). Die Spezifität des Signaltransduktionsweges ist bestimmt durch die Kombination von Ligand, Rezeptor und den spezifischen Smad-Proteinen (HUANG et al. 2000). Alle Smad-Proteine bestehen aus zwei konservierten Domänen, der MH1 oder N-Domäne und der MH2 oder C-Domäne, die durch ein weniger konserviertes Verbindungselement (L) getrennt sind (DERYNCK et al. 1998; MASSAGUE 1998). In Tabelle 2 sind die Aminosäurenlängen und Massenangaben, sowie Funktion und Lokalisation der Smad-Proteine 1-4 aufgelistet. Schrifttum 51 P Kinase Kinase Kinase Kinase Ligand Typ I Typ II Rezeptor Rezeptor R-Smad R-Smad P Co-Smad Smad4 DNA-Bindungspartner (z.B. Fast-1) R-Smad R-Smad P P Smad4 Smad4 Zielgen Abb. 13: Der TGF-β/Smad pathway (modifiziert nach MASSAGUE 1998). Schrifttum 52 Tabelle 2: Aminosäurenlänge- und Massenangabe, sowie Funktion und Lokalisation von Smad-Proteinen Länge (AS) Masse (kDa) Funktion Lokalisation Smad 1 465 (aus Mouse Genome Informatics) Smad 2 467 (aus Mouse Genome Informatics) 52,119 52,266 (aus Mouse Ge(aus Mouse nome Informatics) Genome Informatics) Initiation und Auf- Gastrulation rechterhaltung (NOMURA u. LI der Spermatoge- 1998; nese (aus Mouse WALDRIP et al. Genome Informa- 1998; tics) WEINSTEIN et al. 1998) Zuerst im frühen embryonalen Mesoderm, später ubiquitär (WHITMAN 1998) Ubiquitär (WALDRIP et al. 1998) Smad 3 425 (aus Mouse Genome Informatics) 48,081 (aus Mouse Genome Informatics) Bildung der mukosalen Immunrekation, Entwicklung des Skeletts (ZHU et al. 1998; ASHCROFT et al. 1999; DATTO et al. 1999; YANG et al. 1999) Stark exprimiert im Gehirn und den Ovarien (KANO et al. 1999) Smad 4 551 (aus Mouse Genome Informatics) 60,417 (aus Mouse Genome Informatics) Gastrulation (SIRARD et al. 1998; YANG et al. 1998) Ubiquitär (YANG et al. 1998) 2.7.7.2 Nkd1 Nkd1 ist ein Homolog des Segmentpolaritätsgens naked cuticle (nkd) der Drosophila (ZENG et al. 2000) und gehört zur Nkd Familie (aus Mouse Genome Informatics, http://www.informatics.jax.org). Das Mausgen Nkd1 ist 461 Aminosäuren lang und 51,501 kDa groß (aus Mouse Genome Informatics, http://www.informatics.jax.org). Es enthält ein EF-Handmotiv (besteht aus einer Helix-Schleifen-Helix-Struktur und bindet Kalzium), das auch EFX-Domäne genannt wird. Über diese Domäne bindet Nkd1 an die PDZ Domäne des intrazellulären Proteins Dishevelled (Dvl1, Dvl2, Dvl3) und hemmt so den kanonischen Wnt-Signalweg (KATOH 2001; WHARTON et al. 2001; YAN et al. 2001; ZHANG et al. 2007). Eine weitere Funktion von Nkd1 ist die 53 Schrifttum Aktivierung des JNK (c-Jun N-terminale Kinase) Weges, einer Komponente des PCP (planar cell polarity) Weges (YAN et al. 2001). Des Weiteren ist Nkd1 an der Spermatogenese beteiligt (WHARTON et al. 2001; YAN et al. 2001; LI et al. 2005). Eine Besonderheit von Nkd1 liegt in seinem periodischen Expressionsmuster, das während der Embryonalentwicklung in drei Phasen unterteilt werden kann: Die Signalintensität von nkd1 beginnt langsam in der Schwanzknospe, steigt allmählich in der Mitte des präsomitischen Mesoderms (PSMs) zusätzlich zur Schwanzknospe und verlagert sich am Ende mehr nach anterior (WHARTON et al. 2001; YAN et al. 2001; ISHIKAWA et al. 2004; ZHANG et al. 2007). 2.7.8 p-Tyr (phosphoryliertes Tyrosin) Die Phosphorylierung von Tyrosin-Resten gehört zu den maßgeblichsten Regulationsmechanismen in der Genexpression und posttranslationalen Modifikation von sowohl Prokaryoten als auch Eukaryoten. Dabei spielt die Proteintyrosinphosphorylierung eine entscheidende Rolle in der Signaltransduktion, indem sie viele biologische Prozesse inklusive der Zellproliferation, Differenzierung und Beweglichkeit reguliert. Der Vorgang der Phosphorylierung, die insbesondere in den fokalen Adhäsionskomplexen an den Enden der Stressfasern stattfindet, wird durch Protein-TyrosinKinasen (PTK) und Protein-Tyrosin-Phosphatasen (PTP) gesteuert (NANDI u. BANERJEE 1995; GEIGER u. BERSHADSKY 2001; NOLLAU u. MAYER 2001). 54 Schrifttum 2.8 Zielsetzung In den letzten Jahren wurde eine Vielzahl von Genen identifiziert, welche die Körperachsen- und Herzentwicklung beeinflussen. Trotzdem sind die grundlegenden Mechanismen nach wie vor unbekannt. Einer der wichtigsten Schritte der Körperachsenentwicklung ist der Bruch der Symmetrie in der frühen Embryonalphase. Nach derzeitigem Wissensstand ist sowohl die Struktur als auch die Funktion des Primitivknotens der Maus ausschlaggebend für diesen Symmetriebruch, jedoch gibt es kaum Befunde über die Entwicklung und den exakten Aufbau des Primitivknotens. Ziel der Untersuchungen ist es daher, zum einen die Entwicklung (strukturell und funktional) der wichtigen Primitivknotenstruktur und seiner Primitivknotenzilien nachzuvollziehen und zum anderen den Aufbau der hoch polarisierten Primitivknotenzellen zu beschreiben. Die detaillierte Analyse dieses in der Embryonalentwicklung extrem wichtigen Gewebes ist eine unabdingbare Voraussetzung, um den Prozess der Lateralitätsentwicklung, insbesondere den Bruch der Symmetrie, besser verstehen zu können. Zur Darstellung der frühembryonalen Entwicklung des Primitivknotens wurden in der vorliegenden Arbeit immunhistochemische und elektronenmikroskopische Analysemethoden sowie In-situ-Hybridisierungen durchgeführt, Semidünnschnitte hergestellt und Videoaufnahmen von Primitivknotenzilien erstellt. Spezifische Fragen beinhalten: 1. Wie entsteht der Primitivknoten der Maus? 2. Wie entwickeln sich die Zilien in den verschiedenen Altersstufen in Wildtypembryonen? 3. Wie verläuft der durch die Knotenzilienbewegung gebildete Fluss in Wildtypembryonen? 4. Welche Polaritätsmarker sind im Primitivknoten vorhanden und wo sind sie lokalisiert? 5. Können diese Daten als Grundlage verwendet werden, um mutante Embryonen zu charakterisieren? 55 Schrifttum Mit diesen Untersuchungen soll eine solide Basis der Darstellung der Entwicklung des Primitivknotens der Maus inklusive der Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kontakte geschaffen werden, die für weiterführende Studien zur normalen und pathologischen Entwicklung, der strukturellen Beschaffenheit und Funktion des Primitivknotens wichtig ist. 56 Material und Methoden 3. Material und Methoden Alle verwendeten Materialien und Chemikalien sind mit Hersteller und Bezugsadresse in den Kapiteln 3.8 (Tab. 14 - 16) aufgelistet. Die verwendeten Geräte für die Fotodokumentation und die Programme zur Auswertung und Darstellung sind im Kapitel 3.7 (Tab. 13) aufgezählt. 3.1 Versuchstiere Der nachfolgend beschriebene Tierversuch wurde initial entsprechend des § 6 des Tierschutzgesetzes (TierSchG) vom Institut für Humangenetik der Westfälischen Wilhelms Universität Münster beantragt und mit der Nummer A 16/2006 genehmigt. In diesen Versuchen wurden CD 1-Wildtyp-Mäuse mit der Farbe Albino [Charles River (Sulzfeld, Deutschland)] verwendet. Auszuchtmäuse des Stammes CD 1 haben mehrere Vorteile: Sie besitzen eine starke Hybridvitalität mit langer Lebensspanne, hohe Krankheitsresistenz, frühe Fortpflanzungsfähigkeit, große und häufige Würfe, geringe neonatale Sterblichkeitsrate, rapides Wachstum mit einem Gewicht von ca. 34 Gramm beim Weibchen im Alter von 2 ½ Monaten und ca. 40 Gramm beim Mänchen im Alter von 2 ½ Monaten (SILVER 1995; Charles River Laboratories Katalog 2006). 3.1.1 Versuchstierhaltung Die ursprüngliche Kolonie der CD 1 Wildtyp (WT) Mäuse wurden von der Firma Charles River (Sulzfeld, Deutschland) bezogen. Diese wurden in der zentralen tierexperimentellen Einrichtung der medizinischen Fakultät der Westfälischen Wilhelms Universität Münster (WWU) in Makrolon-Standardkäfigen der Firma Tecniplast (L x B x H: 425 x 266 x 185 mm) mit 3-4 Mäusen pro Käfig in einem IVC-System (individually ventilated cages, einzeln ventilierte Käfige) gehalten und expandiert. Entkeimtes Trinkwasser aus Flaschen, sowie pelletiertes Diätfutter (altromin 1324, Altromin, Material und Methoden 57 Lage, Deutschland) stand den Mäusen ad libitum unter standardisierten Bedingungen (Raumtemperatur 22° +/- 2 C°, relative Luftfeuc htigkeit 50-60 %, Tag-NachtRhythmus 12 Stunden durch Kunstlicht von 7 - 19 Uhr) zur Verfügung. Bei diesem Tierversuch wurden 75 Weibchen verwendet. Es standen 15 Männchen für die Verpaarung der Versuchstiere zur Verfügung. 3.1.2 Verpaarung, Tötung und Sektion der Versuchstiere Drei Stunden vor Beginn der Nachtphase (gegen 16.00 Uhr) wurden östrische Weibchen vom CD1-Wildtyp, die man an der rötlich-geschwollenen und geöffneten Vulva erkennt (SILVER 1995), einzeln zum Männchen (CD1-Wildtyp) gesetzt. Wenn der Brunstzyklus nicht durch Trächtigkeit, Scheinträchtigkeit oder andere Ursachen wie Stress oder Wetterumschwung unterbrochen wird, kommt ein Weibchen alle 4 - 6 Tage in den Östrus (SILVER 1995). Die Paarung selbst findet in der Regel während der Dunkelphase statt. Am Morgen darauf wurde überprüft, ob ein Vaginalpfropf (VP) in der Vagina der Maus vorliegt. Da die VPs manchmal tiefer in der Vagina vorhanden sind und leicht übersehen werden, erfolgte bei Fehlen eines eindeutigen und von außen sichtbaren VPs die Überprüfung des selbigen mit Hilfe eines schmalen (2 mm breit), Spatels aus Metall, der einige mm in die Vagina eingeführt wird (SCHENKEL 2006). VPs bestehen aus Sekreten der akzessorischen Geschlechtsdrüsen männlicher Tiere, die die Vagina vom Gebärmutterhals bis zu den äußeren Geschlechtsteilen ausfüllen und nach der Kopulation bis zu 24 Stunden lang vorhanden sein können. Durch den Vaginalpfropf wird vermutlich ein Ausfließen des Spermas nach der Kopulation verhindert und dadurch eine bessere Befruchtungsrate erzielt (BUSCH u. HOLZMANN 2001; SCHENKEL 2006). Allerdings ist ein VP nur ein Anzeichen für eine stattgefundene Paarung, nicht aber eine Garantie für eine erfolgreiche Trächtigkeit. Dennoch kann dank der VPs bei Mäusen der Tierverbrauch erheblich reduziert werden, da man VP-negative, also mit höchster Wahrscheinlichkeit unbefruchtete Tiere, nicht unnötig töten muss. Der Zeitpunkt der Plug-Detektion (VP-Erkennung), wird als Tag 0,5 der Trächtigkeit (dies post conceptionem = dpc) definiert. Je nach gewünschtem Embryonalstadium 58 Material und Methoden fand die Tötung der trächtigen Weibchen ab Embryonaltag 7.5 - 8.5 zu verschiedenen Zeiten statt, um eine variable Bandbreite vom Neuralplattenstadium, Kopffaltenstadium bis zu mehreren Somiten zu erhalten. Da bei einer Betäubung der Muttertiere durch Anästhetika nicht ausgeschlossen werden kann, dass die funktionalen Analysen des Primitivknotens und die Genexpressionsanalysen durch die plazentagängigen Anästhetika verfälscht werden, tötet man die trächtigen Mäuse ohne Betäubung durch zervikale Dislokation. Anschließend wird die mit 70 % Ethanol desinfizierte Bauchdecke und das Peritoneum geöffnet, der Uterus vom Mesometrium frei präpariert, dieser an der Basis abgesetzt und der Uterus mit samt den Embryonen aus der Bauchhöhle entnommen und in eine mit 5 ml eisgekühlter Phosphat-gepufferten Salzlösung (1x PBS-Puffer) gefüllten Petrischale gegeben (vgl. Abb. 14). Die Präparation erfolgt nach den Methodenbeschreibungen von HOGAN (1994). Material und Methoden 59 Mit der Pinzette das Uterushorn hochziehen Benutze die Spitze der Schere oder Pinzette, um das Mesometrium vom Uterushorn zu trennen Mesometrium mit Blutgefäßen Mit der Schere den Uterus an der Basis abtrennen Das Uterushorn mit der Pinzette an die Seite ziehen Abb. 14: Schematische Darstellung der Uterusentnahme aus der Bauchhöhle der Maus (modifiziert nach HOGAN 1994). 60 Material und Methoden 3.1.3 Aufbereitung der entnommenen Embryonen Die Fruchtkammern enthaltenden Uterusabschnitte werden unter zu Hilfenahme von Pinzette und Schere vereinzelt, in eine mit 3 ml eisgekühltem 1x PBS-Puffer (1-fache Konzentration der Phosphat gepufferten Salzlösung) gefüllte Petrischale gegeben und auf einer Kühlplatte gelagert, bis alle Embryonen freipräpariert sind. Die Embryonen werden unter der Stereolupe (Nikon SMZ800) mit einer 1 bis 6,3-fachen Vergrößerung in eisgekühltem 1x PBS-Puffer mit der Schere, Pinzetten und einer Kanüle (27G) von sämtlichen Hüllen und Membranen (Uterusmuskulatur, Dezidua, Dottersack, Ektoplazenta, Reichertsche Membran) befreit, bis nur noch der Embryo selbst vorliegt (vgl. Abb. 15). Die freipräparierten Embryonen werden bis zur Analyse entweder in 1 ml 4 % Paraformaldehyd (PFA) in PBS über Nacht (12 h) bei 4° C fixiert und in 4 Well Multischalen gelagert oder in Methanol-Aceton (-20 C) im Verhältnis 2:1 für 15 min mit anschließender Überführung in 1 x PBS über eine Methanolreihe (vgl. Kapitel 3.2.2.) fixiert. Nach der Fixierung erfolgt die Lagerung in 1 x PBS bei 4° C. Für funktionelle Analysen, wie z.B. Videoaufn ahmen, werden die Embryonen abweichend in Dulbeccos Modified Eagle´s Medium (DMEM/F12) + 10 % fötales Kälberserum (FCS) (auf 37 °C vorgewärmt) präpariert . Die Instrumente wurden vor, während und nach der Präparation mit 70 %igem Alkohl desinfiziert und gereinigt. Die Dauer der Präparation eines ganzen Wurfes dauert je nach Größe des Wurfes ca. 20 - 30 min. 61 im Medium präparierter Uterus Muskulatur der Uteruswand deziduales Gewebe abgetrenntes Mesometrium Dezidua mit den Pinzetten durchstechen Material und Methoden übrig gebliebenes Mesometrium Pinzette vorsichtig öffnen, um zwei Hälften zu erhalten Ektoplazenta mit Trophoblast und roten Blutkörperchen extraembryonales Ektoderm embryonales Ektoderm Pinzette zwischen Muskelschicht und dezidualem Gewebe gleiten lassen Muskelschicht mit einer zweiten Pinzette entfernen Embryo ist in einer Hälfte erhalten Embryo vorsichtig mit der Pinzette herausschälen parietales Entoderm Allantois Abb. 15: Schematische Darstellung der Embryoentnahme aus dem Uterus und seinen Embryonalhüllen (modifiziert nach HOGAN 1994). 3.2 Immunhistochemische Analysen mittels Immunfluoreszenz In dieser Arbeit wurde der Nachweis ausgesuchter Polaritätsmarker (siehe Tab. 4) mittels indirekter Fluoreszenz durchgeführt. Bei der indirekten Immunfluoreszenz inkubiert man die Embryonen mit einem Antikörper, z.B. dem Anti-JAM-A (Junctional adhesion molecule) -Antikörper, der das gerichtete Epitop spezifisch erkennt und somit einen Antigen-Antikörper-Komplex bildet. Dieser sogenannte Primär-Antikörper stammt aus einem bestimmten Tier, im 62 Material und Methoden Falle des Anti-JAM-Antikörpers aus der Ratte. Nach der Inkubation der Embryonen mit dem primären Antikörper über Nacht (12 h) werden alle überschüssigen Antikörper, die nicht an das Epitop gebunden haben, mit einer geeigneten Pufferlösung ausgewaschen (mindestens 5-mal für jeweils 15 min in z.B. je 5 - 10 ml 1x PBSPuffer). Im zweiten Schritt erfolgt eine Inkubation mit einem geeigneten Sekundär-Antikörper, im Falle des Anti-JAM-Antikörpers, der in der Ratte generiert wurde, Anti-Ratte-Cy3. Dieser ist spezifisch gegen den Fc-Teil (Bindungsstelle des Antikörpers zur Opsonierung) des Ratten-Antikörpers gerichtet und bindet daher an den Primär-Antikörper. Der Sekundär-Antikörper ist in diesem Fall gekoppelt mit Cy3, einem rot fluoreszierendem Farbstoff. Bei der Betrachtung unter dem Fluoreszenzmikroskop kann man den hier roten Farbstoff mit Licht bestimmter Wellenlänge (353 - 550 nm) anregen und so die gesuchten Proteine sichtbar machen (aus Jackson Immuno Research). Die in dieser Arbeit durchgeführten Doppelimmunfluoreszenzen erfolgen auf gleiche Art und Weise mit dem Unterschied, dass die Primär-Antikörper in unterschiedlichen Tieren generiert worden sind (z.B. Maus und Ratte). Dabei ist auch zu beachten, dass die in einer Doppelimmunfluoreszenz-Färbung verwendeten SekundärAntikörper an unterschiedlich fluoreszierende Farbstoffe (z.B. Cy3 und AlexaFluor 488) gekoppelt sind (siehe Tab. 3), damit die nachzuweisenden Proteine in der Doppelfärbung später unter dem konfokalen Laser Sscanning Mikroskop differenziert werden können. Die verwendeten Sekundär-Antikörper wurden entweder im Huhn oder im Esel generiert. 63 Material und Methoden Tab. 3: Beispiel einer Doppelfärbung für die immunhistochemische Analyse mittels indirekter Immunfluoreszenz primärer Antikörper Acetyliertes Tubulin, 1 : 2000 SIGMA®, Nr. T 6793 produziert in Maus, monoklonal Beta-Catenin, 0,5 : 1000, 1 : 2000 SIGMA®, Nr. C2206 Kaninchen, polyklonal, sekundärer Antikörper Alexa Fluor 488 Huhn-AntiMaus, 1 : 250 Molecular Probes, A-21200 Esel-Anti-Kaninchen-Cy3, 1 : 250 Dianova, Nr. 711-165-152 3.2.2 Fixierlösungen für immunhistochemische Analysen Je nach für die Analysen ausgewählten Primär-Antikörpern werden die Embryonen in unterschiedlichen Lösungen in 4 Well Multischalen fixiert und bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C aufbewahrt. Entweder wird mit 4 % PFA in PBS über Nacht (12 h) bei 4 °C fixiert oder in Methanol-Aceton (-20 °C) im Verhältnis 2 : 1 für ca. 15 Minuten. Dabei muss bei letzterer Fixierung darauf geachtet werden, dass nach viertelstündiger Inkubation in MethanolAceton die Embryonen nicht sofort in 1x PBS überführt werden. Um die Embryonen nicht zu schädigen, wird daher eine Verdünnungsreihe (75 %, 50 %, 25 % Methanol in 1x PBS und zum Schluss in 100 % 1x PBS) hergestellt und die Embryonen werden über diese Verdünnungsreihe (jeweils 5 min Inkubation) bei 4 °C in einer 24 Well Multischale in 2 ml 1 x PBS überführt. Da die in Methanol-Aceton fixierten Embryonen die Eigenschaft besitzen, am Boden der Zellkulturplatten zu haften, werden die Well Multischalen für die Verdünnungsreihe vor der Zugabe der Verdünnunsreihenlösung mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA)-Lösung in PBS gespült. Die Überführung der Embryonen findet immer mit einer Pipette (200-1000 µl) und der dazugehörigen Cell-Saver-Pipettenspitze, die über eine vergrößerte Öffnung (2 mm) verfügt, statt. 64 Material und Methoden 3.2.3 Versuchsdurchführung am Beispiel von JAM (Junctional-Adhesion Molecule) Die einzelnen Schritte für die Immunfluoreszenzfärbung finden wie folgt statt: 1. Präparation 2. Fixierung 3. Waschen 4. Blocken 5. 1. Antikörper-Inkubation 6. Waschen 7. 2. Antikörper-Inkubation 8. Waschen 9. Eindeckeln 10. Analysieren Die Embryonen werden wie im Kapitel 3.1.3 nach der Anleitung aus „Manipulating the Mouse Embryo, a Laboratory Manual“ (HOGAN 1994) präpariert und in diesem Fall mit 1 ml Methanol-Aceton (-20 °C) im Verhältni s 2 : 1 für ca. 15 Minuten in einer 4 Well Multischale bei 4 °C fixiert. Bevor die fixi erten Embryonen mit 1x PBS bei Raumtemperatur gewaschen werden, überführt man diese in einer Verdünnungsreihe in 24 Well Multischalen (75 %, 50 %, 25 % Methanol in 1 ml 1x PBS und zum Schluss in 1 ml 100 % 1x PBS) für jeweils 5 Minuten bei Raumtemperatur. Nach Abschluss der Fixierung werden die Embryonen 3-mal für jeweils 5 Minuten in je 1 ml 1x PBS in einer 4 Well Multischale auf dem Tischschüttler (60 U/min) bei Raumtemperatur gewaschen. Nach den 3 Waschvorgängen werden die Embryonen in die jeweilige Blocklösung, im Falle der Antikörperfärbung mit JAM in 1x PBS + 1 % BSA + 10 % Lammserum, überführt. Damit wird ein Besetzen aller unspezifischen Bindungsstellen erreicht. Die Embryonen werden für ca. 3 - 4 Stunden in der Blocklösung (1 ml) in einer 4 Well Multischale in einem Kühlraum bei 4 °C auf dem Schü ttler (60 U/min) inkubiert. 65 Material und Methoden Anschließend erfolgt die Inkubation mit dem primären Antikörper. Hierzu werden 0,7µl Anti-JAM-Antikörper (generiert in Ratte) in 1000 µl Blocklösung in einem 1,5 ml Mikrozentrifugengefäß verdünnt und die Embryonen werden mithilfe der auf der Pipette aufgesetzten Cell-Saver-Pipettenspitze (1-200 µl) mit möglichst wenig Blocklösung in diese Antikörperlösung überführt. Dazu wird der Embryo nur bis zur Spitze der Cell-Saver-Pipettenspitze aufgesogen. Durch das oberflächliche Eintauchen der Pipettenspitze in die Antikörperlösung sinkt der Embryo in diese Lösung ab. Die Inkubation der Embryonen in der Antikörperlösung erfolgt auf dem Tischschüttler bei 4 °C und 60 U/min über Nacht (12 h). Am nächsten Tag werden die Embryonen in 5 - 10 ml 1x PBS 5-mal hintereinander jeweils für 15 Minuten in einer 6 Well Multischale bei Raumtemperatur gewaschen. Die Inkubation mit dem entsprechenden sekundären Antikörper, im Fall von JAM mit Esel-Anti-Ratte-Cy3, erfolgt lichtgeschützt in einem lichtundurchlässigen Behältnis (z.B. Instrumentenkasten aus Edelstahl mit Deckel). Hierzu wird 1 µl Esel-Anti-RatteCy3 mit 250 µl Blocklösung verdünnt, die Embryonen werden in diese Lösung überführt und über Nacht (12 h) bei 4 °C auf dem Schütt ler inkubiert. Anschließend erfolgt wieder ein Waschvorgang (5x in je 5 - 10 ml 1x PBS für jeweils 15 min auf dem Schüttler). Die gewaschenen Embryonen werden auf dem Superfrost-Objekträger mithilfe von Pinzetten und Kanüle so präpariert, dass sie aufgeklappt sind und mit der ventralen Seite nach oben zeigend mittig platziert werden. Der aufgeklappte Embryo wird mit dem Kopf nach links orientiert und mit einem Tropfen Eindeckelmedium DAKO-Antifade mit dem Deckglas vorsichtig und luftblasenfrei eingedeckelt. Nach Trocknung der Objektträger können die Embryonen unter dem Fluoreszenzmikroskop oder mittels Laser Scanning Mikroskopie ausgewertet und anschließend im Kühlschrank gelagert werden. 66 Material und Methoden 3.2.3.1 Verwendete primäre Antikörper und sekundäre Antikörper Um eine solide Grundlage für die funktionale Untersuchung zu bilden, wird versucht eine Darstellung der Entwicklung des Primitivknotens der Maus inklusive einer Charakterisierung der Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kontakte zu erreichen. Unter Einsatz von immunhistochemischen Färbungen wurden daher einige bedeutende Polaritätsproteine am Primitivknoten der Maus analysiert. Zu diesem Zweck wurden Polaritätsproteine ausgewählt, die den Tight Junctions (Zonula occludens), den Adherens Junctions (Zonula adhaerens) und den Focal Adhesions (Fokale Adhäsionskomplexe) zuzuordnen sind (Abb. 20), die zu den Annexinen, in den Bereich der Zilien oder zu den Signalmolekülen gehören. Diese Proteine sind insofern von großer Bedeutung, da sie Zell-Zell-Kontakte und Zell-Matrix-Interaktionen bilden und an vielen verschiedenen Zellprozessen, wie der Zellmigration und der Genexpression (LIU 2000) oder der Epithelproliferation beteiligt sind (BALDA et al. 2003). In folgender Tabelle 4 sind die verwendeten primären Antikörper in Verbindung mit den notwendigen sekundären Antikörpern (alle im Esel generiert, mit Ausnahme von Alexa Fluor 488 Huhn-Anti-Maus), sowie Angaben zum Hersteller mit Bestellnummer und Verdünnung aufgelistet. Material und Methoden 67 Tab. 4: Auflistung der verwendeten primären und sekundären Antikörper zum Nachweis von Markerproteinen im Primitivknoten Primäre Antikörper; Verdünnung; Hersteller und Bestellnummer Produziert in Optimale Fixierung in Acetyliertes Tubulin, 1 : 2000, SIGMA®, Nr. T 6793 Maus, monoklonal MethanolAceton Annexin 2, 1 : 50, freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Arseni Markoff, ZMBE2 Annexin 4, 1 : 250, freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Arseni Markoff, ZMBE Annexin 6, 1 : 1000, freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Arseni Markoff, ZMBE Maus, monoklonal PFA oder MethanolAceton Kaninchen, polyklonal PFA Maus, polyklonal PFA oder Methanol-Aceton β-Catenin, 0,5 : 1000; 1 : 2000, SIGMA®, Nr. C2206 Kaninchen, polyklonal MethanolAceton Claudin 1, 4 : 200, ZYMED Laboratories, Nr. 51-9000 Kaninchen, polyklonal MethanolAceton Claudin 2, 1 : 250, ZYMED Laboratories, Nr. 51-6100 Kaninchen, polyklonal MethanolAceton Claudin 3, 1 : 500, ZYMED Laboratories, Nr.34-1700 Kaninchen, polyklonal MethanolAceton 2 ZMBE: Zentrum für Molekularbiologie der Entzündung Sekundäre Antikörper; Verdünnung; Hersteller und Bestellnummer Alexa Fluor 488 Huhn-Anti-Maus, 1 : 250, Molecular Probes, A-21200 Anti-Maus-Cy3, 1 : 250, Dianova, Nr. 715-166-150 Anti-Kaninchen-Cy3, 1 : 250, Dianova, Nr. 711-165-152 Anti-Maus-Cy3, 1 : 250, Dianova, Nr. 715-166-150 Anti-Kaninchen-Cy3, 1 : 250, Dianova, Nr. 711-165-152 Anti-Kaninchen-Cy3, 1 : 250, Dianova, Nr. 711-165-152 Anti-Kaninchen-Cy3, 1 : 250, Dianova, Nr. 711-165-152 Anti-Kaninchen-Cy3, 1 : 250, Dianova, Nr. 711-165-152 Material und Methoden 68 Claudin 4, 1 : 250, ZYMED Laboratories, Nr. 32-9400 Maus, polyklonal PFA oder Methanol-Aceton Claudin 5, 1 : 250, ZYMED Laboratories, Nr. 34-1600 Kaninchen, polyklonal MethanolAceton Claudin 5, 2 : 200, ZYMED Laboratories, Nr. 35-2500 Maus, monoklonal MethanolAceton E-Cadherin, 0,5 : 2000, SIGMA®, Nr. U 3254 Ratte, Aszitesflüssigkeit PFA oder Methanol-Aceton γ-Tubulin, 1 : 2000, SIGMA®, Nr. T 5192 Kaninchen, AffinitätsAufreinigung Ratte PFA JAM-A, 0,7 : 1000, freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Klaus Ebnet, ZMBE N-Cadherin 0,5 : 250, 1 : 500, ZYMED Laboratories, Nr.33-3900 MethanolAceton oder PFA Maus, monklonal PFA oder Methanol-Aceton N-Cadherin, 1 : 500, Abcam, Nr.ab18203 Maus, polyklonal PFA PAR-3 ptc ,1 : 200, Affi 852 Ratte MethanolAceton PAR-6 ptc ,1 : 200, Santa Cruz, T20 Ziege MethanolAceton p-Fak, 1 : 100, BIOSOURCE, Nr. 44-624G Kaninchen, polyklonal PFA Anti-Maus-Cy3, 1 : 250, Dianova, Nr. 715-166-150 Anti-Kaninchen-Cy3, 1 : 250, Dianova, Nr. 711-165-152 Anti-Maus-Cy3, 1 : 250, Dianova, Nr. 715-166-150 Anti-Ratte-Cy3, 1 : 250, Dianova, Nr. 712-165-153 Anti-Kaninchen-Cy3, 1 : 250, Dianova, Nr. 711-165-152 Anti-Ratte-Cy3, 1 : 250, Dianova, Nr. 712-165-153 Anti-Maus-Cy3, 1 : 250, Dianova, Nr. 715-166-150 Anti-Maus-Cy3, 1 : 250 Dianova, Nr. 715-166-150 Anti-Ratte-Cy3, 1 : 250 Dianova, Nr. 712-165-153 Anti-Ziege-cy3, 1 : 250, Dianova, Nr. 705-165-147 Anti-Kaninchen-Cy3, 1 : 250, Dianova, Nr. 711-165-152 Material und Methoden 69 Phospho-β-Catenin, 1 : 100, Cell Signaling, Nr. 9561 Kaninchen, polyklonal PFA Phospho-β-Catenin, 1 : 100, Cell Signaling, Nr. 9565 Kaninchen, polyklonal PFA p-Pax, 1 : 200, BIOSOURCE, Nr. 44-722 Kaninchen, polyklonal PFA p-Smad 1, 1 : 50, Ziege, Santa Cruz Biotechnology Inc., polyklonal Sc-12353 PFA Maus, p-Tyr, 1 : 100, Santa Cruz Biotechnology Inc., monoklonal Sc-70-20 PFA oder Methanol-Aceton Smad 1, 1 : 250, ZYMED Laboratories Inc., Nr. 38-5400 Kaninchen, polyklonal PFA Smad 1, 1 : 100, CHEMICON, AB3815 Kaninchen, polyklonal PFA Smad 2, 1 : 100, Ziege, Santa Cruz Biotechnology Inc., polyklonal Sc-6200 PFA Smad 3, 1 : 250, ZYMED Laboratories Inc., Nr. 51-1500 Kaninchen, polyklonal PFA Smad 4, 1 : 100, Cell Signaling, Nr. 9515 Kaninchen, polyklonal PFA Smad 4, 1 : 100, Ziege, Santa Cruz Biotechnology Inc., polyklonal Sc-1909 PFA Anti-Kaninchen-Cy3, 1 : 250, Dianova, Nr. 711-165-152 Anti-Kaninchen-Cy3, 1 : 250, Dianova, Nr. 711-165-152 Anti-Kaninchen-Cy3, 1 : 250, Dianova, Nr. 711-165-152 Anti-Ziege-Cy3, 1 : 250, Dianova, Nr. 705-165-147 Anti-Maus-Cy3, 1 : 250, Dianova, Nr. 715-166-150 Anti-Kaninchen-Cy3, 1 : 250, Dianova, Nr. 711-165-152 Anti-Kaninchen-Cy3, 1 : 250, Dianova, Nr. 711-165-152 Anti-Ziege-Cy3, 1 : 250, Dianova, Nr. 705-165-147 Anti-Kaninchen-Cy3, 1 : 250, Dianova, Nr. 711-165-152 Anti-Kaninchen-Cy3, 1 : 250, Dianova, Nr. 711-165-152 Anti-Ziege-Cy3, 1 : 250, Dianova, Nr. 705-165-147 Material und Methoden 70 ZO-1, 3 : 300, ZYMED Laboratories, Nr. 61-7300 Kaninchen, polyklonal MethanolAceton Anti-Kaninchen-Cy3, 1 : 250, Dianova, Nr. 711-165-152 3.2.3.2 Verwendete Fixierungs- und Inkubationsprotokolle Je nach dem, welches Antigen dargestellt werden soll, müssen unterschiedliche Fixierungen verwendet werden. Dies liegt daran, dass verschiedenartige Reaktionsbedingungen benötigt werden, damit das Antigen erkannt wird. Nicht jedes Antigen ist mit jeder Fixierung nachweisbar. Daher wurden hier verschiedene Protokolle zur Fixierung der Embryonen angewendet. Bei der Verwendung der o.g. Antikörper haben sich in dieser Arbeit folgende Protokolle bewährt (Tab. 5 und 6): Tab. 5: Fixierungs- und Inkubationsprotokolle für die immunhistochemischen Analysen Fixierung 1. 4 % PFA in PBS 2. Methanol Aceton 3 x waschen (5 min mit 1 ml 1x PBS + 0,1 % Triton X 1x PBS Waschlösung) 1x PBS 1x PBS + 1 % BSA + 1 % BSA Blocken für 3 - 4 h mit 1 ml + 10 % Lammserum + 10 % Lammserum + 0,1 % Triton X inkubieren mit dem in der entsprechenden Blocklösung verInkubation mit dünnten primären Ak bei 4 °C über Nacht (12 h), sch üttelnd (60 primärem Ak U/min) 5 x waschen 1x PBS + (15 min in 5 - 10 0,1 % Triton X 1x PBS ml) inkubieren mit dem in der entsprechenden Blocklösung verInkubation mit dünnten sekundären Ak bei 4 °C ü.N., schüttelnd und lichtgesekundärem Ak schützt in einem Instrumentenkasten aus Edelstahl mit Deckel 5 x waschen 1x PBS (15 min in 5 - 10 + 0,1 % Triton X 1x PBS ml) Eindeckeln mit DAKO-Antifade und Deckglas auf Superfrost-Objektträger Material und Methoden 71 Tab. 6: Zusammensetzung der Wasch- und Blocklösungen für die immunhistochemischen Analysen Lösung 1. Waschlösung mit 1x PBS Zusammensetzung 10 x PBS Aqua dest. Volumen 50 ml 450 ml 2. Waschlösung mit 1x PBS und 0,1 % Triton X 10 x 50 ml 5 ml 445 ml 1. Blocklösung ohne Triton X 10 x 10 % 100 % PBS BSA Lammserum + Aqua dest. 2 2 2 14 ml ml ml ml 2. Blocklösung mit Triton X 10 x 10 % 100 % PBS BSA Lammserum + Aqua dest. Triton X 2 2 2 13,8 200 ml ml ml ml µl 10 % PBS Triton X Aqua dest. 3.2.3.3 Negativkontrollen Negativkontrollen wurden unter denselben Bedingungen an Mausembryonen (E.7.5) durchgeführt wie bei der oben beschriebenen Durchführung zur immunhistochemischen Analyse des Primitivknotens der Maus. Für die Negativkontrollen wurde unter Auslassung der primären Antikörper jeweils der sekundäre Antikörper Alexa Fluor 488 Huhn-Anti-Maus, Esel-Anti-Maus-Cy3, Esel-Anti-Kaninchen-Cy3, Esel-AntiRatte-Cy3 und Esel-Anti-Ziege-Cy3 verwendet. 3.2.3.4 Darstellung der asymmetrischen ß-Catenin Verteilung Die mit dem β-Catenin-Antikörper inkubierten Embryonen werden mit dem konfokalen Laser Scanning Mikroskop untersucht und anschließend mit Hilfe der LSM Image Browser Software (Carl Zeiss, Jena) ausgewertet. Hierzu wurden von den Embryonen rainbow-Aufnahmen angefertigt. Die grafische Auswertung wurde mittels Microsoft Excel erstellt. 72 Material und Methoden 3.3 Herstellung der Semidünnschnitte Die einzelnen Schritte für die Herstellung von Semidünnschnitten finden wie folgt statt: 1. Fixierung des Embryos 2. Entwässerung und Einbetten 3. Schneiden 4. Färben 3.3.1 Fixierung des Embryos Durch die Fixierung über Nacht (12 h) bei 4 °C mit 2 % Glutaraldehyd in 0,1 mol Cacodylatpuffer werden die Proteine über Methylbrücken vernetzt und das Gewebe erhält eine semi-elastische Konsistenz. Anschließend wird das Präparat für weitere 2 Stunden in 2 %ige Osmiumtetroxid (OsO4) Lösung (Fixation nach PALADE 1952) unter dem Abzug bei Raumtemperatur (20 - 24 °C) nac hfixiert. Osmiumtetroxid dient hier als Kontrastmittel zum Anfärben des Präparates, welches sich nach der Fixierung schwarz darstellt. 3.3.2 Entwässerung und Einbetten Um überschüssiges Fixierungsmittel zu entfernen, wurde als nächstes die fixierte Probe 1 Stunde lang mit dem Phosphatpuffer nach Sörensen (siehe Tab. 8) ausgewaschen. Im weiteren Verlauf erfolgte die schrittweise Entwässerung des Embryos, da das Einbettungsmedium (hier Epon 812) nicht wasserlöslich ist. Die Entwässerung fand durch eine aufsteigende Alkoholreihe statt, bei der der Phosphatpuffer durch das Ethanol ersetzt wurde (siehe Tab. 7). Nach der Überführung des Embryos in Propylenoxid (als Intermedium) für 30 Minuten und anschließend weiteren 30 Minuten in Propylenoxid und Epon im Verhältnis 1 : 1, wurde der Embryo in reines Material und Methoden 73 Epon überführt und über Nacht (12 h) inkubiert. Am nächsten Tag wurde der Embryo in eine Einbettungsform gegeben und orientiert (vgl. Abb 16). Die Aushärtung des Epon 812 erfolgte bei 60 °C für 48 Stunden. Tab. 7: Tabellarische Auflistung der Lösungen und Einwirkzeiten zur Überführung der Präparate in Epon bei Raumtemperatur Lösung Einwirkdauer 50 %iges Ethanol für 45 min auf dem Schüttler (50 U/min) 75 %iges Ethanol für 1 h auf dem Schüttler (50 U/min) 96 %iges Ethanol für 45 min auf dem Schüttler (50 U/min) 100 %iges Ethanol für 45 min auf dem Schüttler (50 U/min) 100 %iges Ethanol für 15 min auf dem Schüttler (50 U/min) Propylenoxid für 30 min auf dem Schüttler (50 U/min) Propylenoxid-Epon im Verhältnis 1 : 1 für 30 min auf dem Schüttler (50 U/min) 100 % Epon für 12 h auf dem Schüttler (50 U/min) A L R P A A P B Abb. 16: Beispielhafte Darstellung eines eingebetteten Embryos unter Angabe seiner Orientierung im Block. In der Aufsicht (A) und in der Seitenansicht (B) mit rot angedeutetem Primitivknoten und der Anzeige der Schnittrichtung (siehe Pfeile) für das Ultramikrotom. A: Anterior; L: Links; P: Posterior; R: Rechts. 74 Material und Methoden 3.3.3 Schneiden Das Präparat wurde mit Hilfe eines Ultramikrotoms (Ultracut E) und einer Diamantklinge in 1 µm dünne Schnitte geschnitten, mit einem feinen Pinsel von der Klinge genommen und in ein Streckbad bei Raumtemperatur überführt. Die gestreckten Schnitte wurden vorsichtig in der exakten Reihenfolge auf einen Objektträger überführt und bei 80 °C ca. 10 Sekunden getrocknet. 3.3.4 Färben Im Falle der Semidünnschnitte wurde eine Schnellfärbung mit Methylenblau-Azur II vorgenommen. Hier fand das Verfahren von RICHARDSON et al. (1960) durch die angegebene Färbung mit einer Mischung von 1 % Methylenblau in 1 %iger wässriger Boraxlösung und 1 % Azur II in Aqua dest. Anwendung. Diese beiden Stammlösungen wurden im Verhältnis 1 : 1 gemischt. Die Schnitte färbten auf der Heizplatte bei 70 °C für 30 Sekunden, wurden in Aqua dest. gespült und anschließend getrocknet. 75 Material und Methoden Tab. 8: Verschiedene Lösungen für die Einbettung Lösung Glutaraldehyd Cacodylatpuffer 0,1 M, pH 7,2 OsO4 Fixation nach Palade (1952) pH 7,2; 0,35 mol Stammlösung A (Michaelispuffer) für OsO4 Fixation nach PALADE (1952) Stammlösung B für OsO4 Fixation nach PALADE (1952) Stammlösung C für OsO4 Fixation nach PALADE (1952) 2 %ige OsO4 Lösung für OsO4 Fixation nach PALADE (1952) Eponzusammensetzung: Lösung A+ B im Verhältnis 1 : 1+ DMP 30 Zusammensetzung Glutaraldehyd, 25 % (SIGMA® G 5882) Aqua dest. Cacodylatpuffer 0,2 M Cacodylsäure Natriumsalz Trihydrat (Merck®820670) lösen, pH einstellen Aqua dest. auffüllen auf Stammlösung A + Stammlösung B + Stammlösung C = 2 %ige OsO4 Lösung Volumen- und Mengenangaben 8 ml 34 ml 50 ml 21,4 g 1000 10 4 11 25 ml ml ml ml ml Natriumacetat Barbital-Natrium Aqua dest. auffüllen auf 9,714 g 14,714 g 500 ml Natriumchlorid Aqua dest. auffüllen auf 42,5 g 500 ml 0,1 n Salzsäure 11 ml 2 %ige OsO4 Lösung 25 ml Lösung A: Epon 812 (Gycidether) + 2 Dodecenylbernsteinsäureanhydrid (DBA Härter) Lösung B: Epon 812+ 1–Methyl-5-Norbornen-2,3Dicarbonsäureanhydrid (MNA Härter) 2,4,6-Tridimethylaminomethylphenol (DMP 30 Beschleuniger) 50 ml Phosphatpuffer KH2PO4 nach Sörensen (pH 7,4) Aqua dest. auffüllen auf 8 ml KH2PO4 + 42 ml Na2HPO4 Na2HPO4 + 3,76 ml Aqua dest. auffüllen auf Saccharose (Molgewicht 0,22) 5,15 ml 8,35 ml 8,35 ml 7,40 ml 0,375 ml 1,3609 100 1,78 100 g ml g ml 76 Material und Methoden 3.4 Rasterelektronenmikroskopische Analysen 3.4.1 Präparation der Embryonen für die Rasterelektronenmikroskopaufnahmen Die Mausembryonen wurden wie in 3.1.3 beschrieben präpariert und für die REMAufnahmen für zwei Stunden in 4 % Glutaraldehyd in 0,1 M Cacodylatpuffer (4 °C) fixiert (siehe Tab. 9). Anschließend wurden die Embryonen 3-mal für je 15 min in 0,1 M Cacodylatpuffer (4 °C) gewaschen und in einer aufsteigenden Alkoholreihe entwässert (30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 96 %,100 %, 100 % Ethanol). Tab. 9: Zusammensetzung der Pufferlösungen für die Präparation der Embryonen für die REM-Aufnahmen Lösung Cacodylatpuffer 0,2 M, pH 7,2 Cacodylatpuffer 0,1 M, pH 7,2 4 % Glutaraldehyd Zusammensetzung Cacodylsäure Natriumsalz Trihydrat (Merck®820670) lösen, pH einstellen Aqua dest. auffüllen auf Cacodylsäure Natriumsalz Trihydrat (Merck®820670) lösen, pH einstellen Aqua dest. aufüllen auf Glutaraldehyd, 25 %(SIGMA® G 5882) Aqua dest. Cacodylatpuffer 0,2 M Volumen- und Mengenangaben 21,4 g 500 ml 21,4 g 1000 ml 16 ml 34 ml 50 ml 3.4.2 Kritische-Punkt-Trocknung (KPT) Die Kritische-Punkt-Trocknung erfolgte mit der Kritisch-Punkt-Trocknungsapparatur CPD 020. Die Proben-Druckkammer des Kritische-Punkt-Trockners wurde mit Ethanol befüllt, der Probenhalter mit den in 100 % Ethanol befindlichen Präparaten hineingegeben und die Druckkammer geschlossen. Anschließend wurde die Kammer auf 9 °C gekühlt und das Medium (Ethanol) mit dem f lüssigen CO2 solange ausgetauscht, bis kein Ethanol mehr vorhanden war (ca. 7 - 10 Waschvorgänge, bis kein 77 Material und Methoden Alkoholgeruch mehr festzustellen war). Anschließend wurde die Temperatur der Kammer auf 37 °C erhöht. Nach 1 - 2 Minuten sollte die wahre Temperatur in der Kammer mit der Temperaturanzeige übereinstimmen und die Probenkammer weiter auf 40 °C erhitzt werden. Bei einer Temperatur von 31 °C und einem Druck von 73,8 bar ist der kritische Punkt für CO2 erreicht, schlägt schlagartig von flüssig zu gasförmig um und die Präparate sind somit getrocknet. Allerdings sollte beachtet werden, dass sich die Temperatur und der Druck weiterhin erhöhen, damit Feuchtigkeitseffekte beim Gasablassen verhindert werden. Zum Schluss wurde das Gas kontrolliert und langsam (ca. 35 Minuten) abgelassen und die Probe entnommen, sobald kein Druck mehr vorhanden war. 3.4.3 Sputtern Die Präparate wuden mit einem dünnen leitfähigen Film überzogen (Besputtern), durch Aufbringung einer sehr dünnen (2 - 20 nm) Metallschicht (z.B. Gold) mittels Kathodenzerstäubung in einer Glimmentladung. Dabei ist darauf zu achten, dass die Schicht nicht zu dick aufgedampft wird, da sonst die feinen Strukturen des Objekts abgedeckt werden. Hierzu wurden die getrockneten Präparate mit Tempfix auf dem Probenhalter befestigt und anschließend in die Metallbeschichtungskammer (Sputter Coater, Fa Leitz) eingesetzt. Die Kammer wurde dicht verschlossen und die in der Kammer befindliche Luft mit Argon-Gas ausgetauscht. Dadurch wird erreicht, dass der Elektronenfluss nicht durch andere Moleküle beeinflusst wird. Durch das Spülen mit Argon entstand ein Unterdruck von bis zu 0,08 mmHg. Nun wurde das Präparat mehrfach kurz mit Gold besputtert, wobei die Sputterzeit (2-3 Minuten) abhängig vom Präparat war. Anschließend wurde der Unterdruck wieder langsam abgelassen und das mit Gold beschichtete und jetzt leitfähige Präparat entnommen. Bis zur weiteren Verwendung lagerten die Präparate in einem Exsikkator bei Raumptemperatur. 78 Material und Methoden 3.4.4 Rasterelektronenaufnahmen, Filme, Filmentwicklung und Einscannen Die Rasterelektronenaufnahmen mit dem REM Hitachi S-530 wurden durch Dr. Petra Pennekamp erstellt. Die Photodokumentation erfolgte mit einer Mamiya Rollfilmkamera (6x7) unter Verwendung von Rollfilmen (Agfa APX 100 S/W-Film, ISO 100/21 °C, 120er Rollfilm). Die Entwicklung der Filme fand im Fotolabor des Universitätsklinikums Münster statt. 3.4.5 Rasterelektronenaufnahmen des Knotens und der Zilien Den Rasterelektronenmikroskopaufnahmen folgten die Messungen der Zilienlängen im Primitivknoten verschiedener Altersstufen der Maus (Neuralplatte bis 7 Somiten) sowohl von Wildtypembryonen als auch von Pkd2 mutanten Embryonen. Die Pkd2 -/- und Pkd2 +/ Embryonen wurden freundlicherweise von Frau Dr. Petra Pennekamp zur Verfügung gestellt. Die Zilienlängenmessung von insgesamt 32 Embryonen erfolgte mit Hilfe des ImageJ Programmes (Funktion: Analyze-Measure) bei einer 1000-fachen Vergrößerung (Abramoff, M.D, Magelhaes, P.J, Ram, S.J. "Image Processing with ImageJ". Biophotonics International, Volume 11, Issue 7, pp. 36-42, 2004). Dabei wurden alle sichtbaren Zilien innerhalb des Primitivknotens von der Basis bis zur Spitze vermessen und deren durchschnittliche Zilienlänge berechnet. Es wurden pro Knoten bei den Wildtypemembryonen mindestens 57 und maximal 212 Zilien und bei den Pkd2 mutanten Embryonen mindestens 96 und maximal 297 Zilien ausgemessen. In der folgenden Tabelle 10 ist die Anzahl der Embryonen angegeben, die pro Entwicklungsstadium untersucht wurden. Material und Methoden 79 Tab. 10: Anzahl der mit dem Rasterelektronenmikroskop untersuchten Mausembryonen Alter der Embryonen Wildtypembryonen Pkd2 mutante Embryonen Neuralplatte 1 1 Kopffalte 2 1 0 Somiten 6 1 1 Somiten 1 nicht nachweisbar 2 Somiten 3 1 3 Somiten 1 2 4 Somiten 1 5 5 Somiten 1 1 6 Somiten 1 2 7 Somiten nicht vorhanden 1 3.5 Darstellung der Primitivknotenzilienbewegung Um die Primitivknotenzilienbewegung darzustellen, wurden zwischen 21 - 3 Uhr ca. 8 Tage alte Wildtypembryonen (n=8) und Pkd2 mutante Embryonen (n=6) in DMEM/F12 + 10 % FCS + Hepes (1M, pH 7,2) präpariert. Anschließend wurden die Embryonen in 75 % Rattenserum in DMEM/F12 überführt und in diesem Medium bis zur eigentlichen Untersuchung bei 37 °C und 5 % CO 2 bei einer relativen Luftfeuchtigkeit nahe des Sättigungsbereiches (96-98 %) im Brutschrank belassen. Die Präparation erfolgte je nach gewünschtem Alter der Embryonen wie folgt: Bei einem frühen Stadium, wie z.B. dem Kopffaltenstadium, wurde der Embryo in Vertiefungen in einer Silikongummimatte so positioniert, dass der Primitivknoten oben liegt. Die per Hand durch Kanülen hergestellten Vertiefungen besaßen einen durchschnittlichen Durchmesser von 0,5-1,5 mm und die Silikonmatte eine Größe von 20 x 32 x 1 mm (LxHxB). Anschließend wurden die Embryonen mit einer Lösung aus DMEM/F12 + 75 % Rattenserum + Kügelchen (FluoSpheres Size Kit 2, Molecular Probes) mit einem Durchmesser von 0,2 µm überschichtet, um den Flüssigkeitsstrom über den Primitivknoten (nodal flow) zu visualisieren. Die Kügelchen besitzen mit 0,2 µm 80 Material und Methoden Durchmesser eine ideale Größe. Sie sind klein genug, um vom Fluss tranportiert werden zu können und trotzdem groß genug, um mit dem Lichtmikroskop erkannt zu werden. Bei älteren Stadien (2 - 6 Somiten) wurde der Embryo zunächst in einer Lösung aus DMEM/F12 + 75 % Rattenserum + fluoreszenten Kügelchen mit einem Durchmesser von 0,2 µm gespült. Anschließend wurde der Embryo mit der dorsalen Seite auf einem Objektträger so positioniert, dass der ventrale Primitivknoten mit den Monozilien oben, d.h. zum Deckgläschen hin, lag. Die so positionierten Embryonen wurden vorsichtig mit einem mit Knetgummifüßen besetztem Deckglas eingedeckelt. Die Knetgummifüße (herkömmliches Knetgummi aus der Spielwarenabteilung) sollten verhindern, dass der Embryo unter dem Deckglas eingedrückt wird. Der Primitivknoten wurde für 10 bis 15 Minuten unter der 40er Vergrößerung mit Differentialinterferenzkontrastoptik beobachtet und die Bewegung der Kügelchen am Primitivknoten in mehreren Filmen (je ca. 3 min) mit einer digitalen Videokamera (DVC 710 Monochrom) mit 25 Bildern pro Sekunde dokumentiert. Hierbei wurden alle Kügelchen analysiert, die eine gerichtete Bewegung zeigen, in einer Ebene sichtbar und damit auswertbar sind. In einzelnen Fällen wurde im Anschluss eine Detailaufnahme mit der 63-fachen bzw. der 100-fachen ObjektivVergrößerung mit Öl vorgenommen. Die Auswertung der Filme bezüglich der Richtung und der Geschwindigkeit der Kügelchen erfolgte mit dem Programm ImageJ (Abramoff, M.D, Magelhaes, P.J, Ram, S.J. "Image Processing with ImageJ". Biophotonics International, volume 11, issue 7, pp. 36-42, 2004). Um die Geschwindigkeit der Kügelchen zu messen werden diese durch einzelne Bilder verfolgt, die zurückgelegte Strecke gemessen und mit der Anzahl der Bilder verrechnet. Die Primitivknotenzilienbewegung wird durch den Fluss der Kügelchen visualisiert. 81 Material und Methoden 3.6 In-situ-Hybridisierung 3.6.1 Gesamt-Embryonen In-situ-Hybridisierung In Tab. 11a und 11b sind die Arbeitsschritte für die Vorbehandlung und die Hybridisierung der Embryonen in einem Protokoll aufgelistet. Die für die Hybridisierung verwendeten Lösungen sind in Tabelle 12 aufgezeigt. 3.6.1.1 Präparation der Mausembryonen Um eine In-situ-Hybridisierung eines vollständigen Mausembryos durchführen zu können, wurden die Embryonen wie im Kapitel 3.1.3 nach der Anleitung aus „Manipulating the Mouse Embryo, a Laboratory Manual“ (HOGAN 1994) präpariert und anschließend in einer 4 %igen PFA-Lösung bei 4 °C ü ber Nacht (12 h) fixiert. Im weiteren Verlauf wurden die Embryonen über eine Methanol (MeOH)-Reihe (25 %, 50 % und 75 % MeOH in Phosphatgepufferte Salzlösung + 0,1 % Tween [PBT]) in 100 %iges Methanol für jeweils 5 - 10 Minuten bei einer Temperatur von 4 °C überführt und bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert . 3.6.1.2 Bleichen und Permeabilisierung der Embryonen Die in 100 %igem Methanol gelagerten Embryonen wurden für die In-situHybridisierung über eine Methanol-Reihe (75 %, 50 % und 25 % MeOH in PBT) für jeweils 5 Minuten bei einer Temperatur von 4 °C reh ydriert. Anschließend wurden die rehydrierten Embryonen in 100 %iges PBT überführt und nachfolgend 2-mal für jeweils 5 Minuten bei 4 °C in PBT gewaschen. Das Bl eichen der Präparate erfolgte durch die Überführung in 6 %iges Wasserstoffperoxid in PBT für eine Stunde bei Raumtemperatur auf dem Schüttler mit anschließendem zweimaligem Waschen in PBT für jeweils 5 Minuten bei Raumtemperatur. Hiernach wurden die Embryonen mit der Proteinase K angedaut. Je nach Größe und Alter des Embryos sollte der Vorgang 7 - 30 Minuten dauern, wobei für die optimale Verdauung eine empirische 82 Material und Methoden Ermittlung erfolgen muss. In den hier beschriebenen Experimenten erfolgte der Proteinase K-Verdau bei 22-24 °C Raumtemperatur für 10 Minuten. Durch die Inkubation in Glycin für 10 Minuten bei Raumtemperatur stoppte der Proteinase K-Verdau. Danach wurden die Embryonen erneut 2-mal für jeweils 5 Minuten bei Raumtemperatur gewaschen und in einer PFA-Lösung für 20 Minuten bei Raumtemperatur nachfixiert. Zum Schluss wurden die Embryonen 2-mal für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur in PBT gewaschen und dadurch die bestehenden Lösungsreste entfernt. 3.6.1.3 Prähybridisierung und Hybridisierung Nach Bleichen und Permeabilisierung wurden die Embryonen zunächst für 5 Minuten in ein Hybridisierungslösungs-PBT-Gemisch (1/1) überführt, äquilibriert und nachfolgend für weitere 5 Minuten in 1 ml Hybridisierungslösung gegeben und für 2 - 3 Stunden bei 65 °C in 0,5 ml Hybridisierungslösung p rähybridisiert. Die Hybridisierung erfolgte in 0,5 ml Hybridisierungslösung und Digoxigenin (DIG)-markierten RNASonden (1 µg/ml) bei einer Temperatur von 65 °C übe r Nacht (12 h). Am Folgetag (Tag 2) wurden die nicht gebundenen RNA-Sonden 1 Minute lang mit auf 65 °C vorgewärmter Hybridisierungslösung gespült und 2-mal für 30 Minuten bei 65 °C im Hybridisierungsofen (Unitherm Hybridisierungsofen 6/12, UniEquip) mit integriertem Schüttler gewaschen. Danach erfolgte die Überführung für 10 Minuten in 1x MABT (Maleinsäurepuffer + Tween 20)- Hybridisierungslösung (1/1) mit anschließendem 2-fachem Spülen für jeweils 10 Minuten in MABT bei Raumtemperatur. Nachfolgend wurden die Embryonen 2-mal in 1x MABT für 15 Minuten bei Raumtemperatur auf dem Schüttler gewaschen. Durch den Hybridisierungsblockpuffer I für 1 Stunde bei 4 °C auf dem Schüttler wurden unspezifische Antikör perbindungsstellen abgeblockt. Hiernach erfolgte ein zweites Blocken in Hybridisierungsblockpuffer II für 2 - 3 Stunden bei 4 °C auf dem Schüttler. Die nachfolgende An tikörper-Inkubation mit alkalischer Phosphatase gekoppelten anti-DIG Antikörpern bei einer Verdünnungskonzentration von 1 : 2000 im Hybridisierungsblockpuffer II fand bei 4 °C über Nacht (12 h) auf dem Schüttler statt. Am Tag 3 wurde 3-mal für 10 Minuten bei Raumtem- 83 Material und Methoden peratur gespült und 3-mal mit 1x MABT für jeweils 1 Stunde bei Raumtemperatur auf dem Schüttler gewaschen. Dadurch wurden nicht gebundene und unspezifisch gebundene Antikörper entfernt. Mit 2-fachem Waschen der Embryonen für 10 Minuten bei Raumtemperatur auf dem Schüttler in NTMT wurden diese auf die Färbelösungs-Konditionen äquilibriert. Zur Detektion der spezifisch gebundenen Antikörper folgte eine Inkubation in der NBT/BCIP-Färbelösung bei 37 °C im Dunkeln. Die Farbreaktion wurde beobachtet, bei ausreichender Färbung mit PBT gestoppt und Farblösungsreste durch 5-maliges Spülen mit PBT bei Raumtemperatur entfernt. Die anschließende Fixierung über Nacht (12 h) erfolgte in einer 4 %igen PFA-Lösung bei 4 °C. Für eine mehrjährige Lagerung und Orientierun g zur Photodokumentation wurden die Embryonen nach erneutem dreimaligen Waschen für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur in PBT nochmals über eine aufsteigende Glycerol-Reihe (20 %, 40 %, 60 % Glycerol in PBT) in 80 % Glycerol für jeweils 30 Minuten bei Raumtemperatur in PBT überführt. Nun konnten die Präparate bei 4 °C im Dunkeln gelagert und mikroskopisch ausgewertet werden. Material und Methoden 84 Tab. 11a: In-situ-Hybridisierungsprotokoll (Vorbehandlung) Vorbehandlung der Embryonen Präparation der Embryonen wie im Kapitel 3.6.1.1 Fixierung Dauer/Häufigkeit Lösung ü.N. bei 4 °C jeweils 5 - 10 min bei 4 °C, bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert Rehydrierung jeweils 5 min bei 4 °C Waschen 2x, jeweils 5 min bei 4 °C 4 %ige PFA-Lösung in MeOH-Reihe (25 %, 50 %, 75 % MeOH in PBT) in 100 %iges Methanol über MeOH-Reihe (75 %, 50 %, 25 % MeOH in PBT); 100 % PBT in PBT Bleichen 1 Std. bei RT, Schüttler in 6 % H2O2 in PBT Waschen in PBT mit Proteinase K (10 µg/ml PBT) Verdauungsstopp 2x, jeweils 5 min bei RT ca. 10 min bei 22 – 24 °C, je nach Größe und Alter des Embryos 10 min bei RT Waschen 2x, jeweils 5 min bei RT Nachfixierung 20 min bei RT Waschen 2x, jeweils 10 min bei RT in PBT in 4 % PFA-Lösung mit 0,2 % Glutaraldehyd in PBT in PBT Überführung Verdauen in Glycin (2mg/ml PBT) Material und Methoden 85 Tab. 11b: In-situ-Hybridisierungsprotokoll (Hybridisierung) Prähybridisierung und Hybridisierung Dauer/Häufigkeit Überführung: 5 min Überführung: 5 min Überführung: 2 - 3 h bei 65 °C Hybridisierung ü.N. bei 65 °C Spülen 1 min Waschen 2x 30 min bei 65 °C, Schüttler, Hybridisierungsofen Spülen 10 min bei 65 °C Spülen 2x 10 min bei RT 2x 15 min bei RT, Schüttler 1 h bei 4 °C, Schüttler 2 - 3 h bei 4 °C, Schüttler Waschen Blocken Blocken AntikörperInkubation ü.N. bei 4 °C, Schüttler Spülen 3x 10 min bei RT 3x 1 Std. bei RT, Schüttler 2x 10 min bei RT, Schüttler bei 37 °C im Dunkeln Waschen Äquilibrierung Detektion Bei ausreichender Färbung stoppen Waschen Fixierung Waschen Überführung Lösung in 1 ml HybridisierungslösungPBT-Gemisch (1/1) in 1 ml Hybridisierungslösung in 0,5 ml Hybridisi erungslösung DIG-markierte Sonden (1 µg/ml) zur Lösung hinzufügen mit auf 65 °C vorgewärmter Hybridisierungslösung 1 2 mit auf 65 °C vorgewärmter Hybridisierungslösung in 1x MABT-Hybridisierungslösung (1/1) In 1x MABT in 1x MABT in Hybridisierungsblockpuffer I in Hybridisierungsblockpuffer II in mit alkalische Phosphatase gekoppelte anti-DIG Antikörper (1 : 2000) in Hybridisierungsblockpuffer II in 1x MABT in 1x MABT (> 10 ml/ Probe) in NTMT (> 10 ml/ Probe) NTMT + NBT/BCIP mit PBT 5x 5 min bei RT in PBT ü.N. bei 4 °C 3x jeweils 10 min bei RT in 4 % PFA in PBT jeweils ca. 30 min bei RT Tag In PBT über Glycerol-Reihe (20 %, 40 %, 60 % Glycerol in PBT) in 80 % Glycerol in PBT 3 86 Material und Methoden Tab. 12: Verwendete Lösungen für die In-situ-Hybridisierung Lösung Anti-Dig-AP, 1 ml/Probe Glycin in PBT H2O2 in PBT Hybridisierungsblockpuffer I Hybridisierungsblockpuffer II Hybridisierungslösung MABT Zusammensetzung Konzentration in Hybridisierungsblockpuffer II Verdünnung von 1 : 2000 Glycin in PBT 2,0 mg/ml H2O2 in PBT 6,0 % MABT 1x Boehringer Block (10 %) 2,0 % mit Aqua dest. auf Endvolumen auffüllen MABT 1x Boehringer Block 2,0 % Lammserum 20,0 % mit Aqua dest. auf Endvolumen auffüllen Formamid 50,0 % CHAPS 0,5 % SSC (mit Zitronensäure auf pH 1,3x 5,2) EDTA (pH 8,0) 5,0 mM Hefe tRNA 50,0 µg/ml Heparin 700,0 U/ml Tween 20 0,2 % mit Aqua dest. auf Endvolumen auffüllen Maleinsäure 500,0 mM NaCl 750,0 mM NaOH (kristallines) 1M mit Aqua dest.auffüllen und autoklavieren Tween 20 zum Schluss 0,5 % hinzufügen NBT/BCIP-Färbelösung, 1ml/Probe NTMT, 25 - 30 ml/Probe NTMT NBT BCIP NaCl Tris, pH 9,5 MgCl2 Tween 20 mit Aqua dest. auf Endvolumen auffüllen 1x 1x 1x 100,0 mM 100,0 mM 50,0 mM 1,0 % 87 PBT Material und Methoden PBS Tween 20 PFA Glutaraldehyd Tween 20 in 1x PBS Proteinase K in PBT PFA-Lösung (Embryonen-Fixierung) Proteinase K in PBT 1x 0,1 % 4,0 % 0,2 % 0,1 % 10,0 µg/ml 3.7 Fotodokumentation Embryonen und Schnittpräparate wurden mit Hilfe der folgenden Stereolupen, Mikroskope und Kameras präpariert, analysiert und dokumentiert: Tab. 13: Übersicht der verwendeten Stereolupen, Mikroskope und Kameras Stereolupen Leica MZ 12 Nikon SMZ800 Zeiss Stemi SV6 Mikroskope Zeiss Axioskop aufrechtes Mikroskop Zeiss Axiovert 25 Zeiss LSM 510 inverses Mikroskop Konfokales Laser Scanning Mikroskop Nikon Confocal Microscope A1 Konfokales Laser Scanning Mikroskop REM Mikroskop REM Hitachi S-530 Kameras Scion Corporation CFW-1310C Scion Corporation CFW-1310M DVC 710 Monochrom (Videokamera) Mamiya Rollfilm-Kamera (REM Mikroskop) 88 Material und Methoden 3.7.1 Programme zur Auswertung und Darstellung Konfokales Laser Scanning Mikroskop: LSM Image Browser Software (Carl Zeiss, Jena) NIS-Elements Advanced Research, Version 3.06 (Nikon, Düsseldorf) Videokamera: Scion VisiCapture, Scion 1394 Twain (http://www.scioncorp.com/downloads/user_manuals/Cameras/VisiCaptureTWAINWi n.pdf) Zilienmessung: ImageJ Programmes (Abramoff, M.D, Magelhaes, P.J, Ram, S.J. "Image Processing with ImageJ". Biophotonics International, volume 11, issue 7, pp. 36-42, 2004) Software: Microsoft Powerpoint CorelDraw12 Microsoft Excel Datenbank-Analysen und -Recherchen: http://www.genecards.org http://www.informatics.jax.org/ [Mouse Genome Informatics] https://www.refworks.com/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ http://apps.isiknowledge.com/ http://www.ihop-net.org/UniPub/iHOP/ Material und Methoden 89 3.8 Verwendete Chemikalien, Materialien, Geräte und Bezugsadressen Tab. 14: Aufstellung der verwendeten Chemikalien 10x PBS (pH 7,4) Ambion Katalognummer 9625 1x PBS (pH 7,2) Invitrogen® GIBCOTM 14040-091 Aceton J.T. Baker 3403 Anti-Dig-AP Roche 1207733 Azur II Fluka 11670 Barbital-Natrium MERCK 106318 Beschleuniger DMP-30 ROTH® 8621.1 BM Purple Roche 11442074001 Boehringer Block Roche 11096176001 Borax Anhydrous Fluka 71997 Cacodylsäure Natriumsalz Trihydrat MERCK 820670 CHAPS Fluka 75621-03-3 Dimethylsulfoxid (DMSO) SIGMA® D-8418 DMEM-F12 Invitrogen® GIBCOTM 21331-020 Dako S3023 T.J. Baker 8006 GIBCOTM 26010-041 Glutaraldehyd 0,2 % für die Fixierung Fluka 111-3-08 Glutaraldehyd 25 % SIGMA® G 5882 Glycidether 100 (Epon 812) ROTH® 8619.1 Glycin ROTH® HN07.1 Hepes GIBCOTM 15630 Chemikalien Eindeckelmedium (fluorescence mounting medium) Ethanol Fötales Kälberserum (fetal calf serum, FCS) Hersteller Material und Methoden 90 Härter DBA ROTH® 8623.1 Härter MNA ROTH® 8639.1 Hefe tRNA Boehringer Mannheim 109525 KH2PO4 Kaliumdihydrogenphosphat MERCK 4873 Lammserum GIBCOTM 16070096 Heparin-Natrium (Liquemin N 25000) Roche 19101121 Magnesiumchlorid MERCK Biosciences 247232 Maleinsäure ROTH® 3538.1 Methanol ROTH® 7342 Methylenblau SIGMA® M9140 Na2HPO4 Dinatriumhydrogenphosphat MERCK 1.06580 Natriumacetat ROTH® 6773.2 Natriumchlorid AppliChem A3597,5000 Natriumhydroxid MERCK 106462 NBT/BCIP Roche 11681451001 Osmiumtetroxidlösung 2 % ROTH® 7436.1 Paraformaldehyd MERCK 1040005 Propylenoxid ROTH® 8617.3 Proteinase K Roche 03155844001 SIGMA® 072K1561 Saccharose Riedel-de Haën 16104 Salzsäure Bernd Kraft GmbH® 01041.3000 20x SSC Ambion AM 9764 Tris (hydroxymethyl)-Aminomethan (Tris) MERCK 108387 Triton X MERCK 648462 Trypsin GIBCOTM 15090-046 TweenR20 ROTH® 9127.1 Wasserstoffperoxid SIGMA® H1009 Rinderserumalbumin (BSA, bovine serum albumin) 91 Material und Methoden Tab. 15: Aufstellung der verwendeten Geräte und Materialien Geräte und Materialien 4 Well Multischalen Hersteller NUNC™ Katalognummer 0176740 6 Well Multischalen NUNC™ 140675 24 Well Multischalen NUNC™ 142475 Cell-Saver-Pipettenspitzen G. Kisker CSP100B G. Kisker CSP250B Deckgläser, 18x18 mm Menzel-Gläser BB018018A1 Einbettungsform EMS; Electron Microscopy 70907 100-1000 µl Cell-Saver-Pipettenspitzen 1-200 µl Sciences Hybridisierungsofen UniEquip (Unitherm Hybridization Oven 6/12) Instrumentenkasten aus Edel- Neolab® 2-1322 stahl mit Deckel, 220 x 150 x 50 mm Kanüle 27G 3/4ІІ-Nr.20 BD Microlance™ 3 302200 Konische Röhrchen 15 ml BD Falcon™ (Becton Di- 352095 ckinson) Konische Röhrchen 50 ml BD Falcon™ (Becton Di- 352070 ckinson) Kügelchen Molecular Probes F8888 (yellow-green FluoSpheres) Kritisch-Punkt- CPD 020 von Balzers- Trocknungsapparatur Union Mikroskop NIKON SMZ800 Mikrozentrifugengefäße G.Kisker „perfekt klar“, 1,5 ml G052BP 92 Mikrozentrifugengefäße Material und Methoden G.Kisker G053BP Superfrost-Objektträger R. Langenbrinck 8037/1 Petrischale mit Nocken, greiner bio-one 627102 Pinzette 0,05mm x 0,01 mm FST (Fine Science Tools) 11295-20 Pinzette 0,05mm x 0,02 mm FST (Fine Science Tools) 11295-51 Pipetboy comfort IBS (Integra Biosciences) 156404 Pipette 0,5 - 10 µl Eppendorf Reference 4900000.010 Pipette 200 - 1000 µl Pipetman P 1000 von Gil- 7-4305 „perfekt klar“, 2,0 ml 35, 0/10 mm son Pipette 50 - 200 µl Pipetman P 200 von Gil- 7-4304 son Pipettenspitzen 0,2 - 20 µl Sarstedt 70.1116 Schere FST (Fine Science Tools) 14088-10 Silikonmatte transparent 1 mm THS (Technischer Handel 240000010 Straub) Spatel (zur Plug-Detektion) FST 10091-12 13 cm x 2 mm Standardkäfig (Slimline, IL2- Tecniplast long, aus Makrolon) Stripetten (serologische Pipet- Costar® 4488 te), 10 ml Stripetten (serologische Pipet- Costar® 4489 te), 25 ml Tischschüttler GFL 3006 10207904A Tempfix EMS; Electron Microscopy 12668 Sciences Ultramikrotom Ultracut E Reichert-Jung Zentrifuge Heraeus 75003235 93 Material und Methoden Tab. 16: Bezugsadressen Hersteller Altromin Adresse Lage, Deutschland AppliChem Darmstadt, Deutschland Applied Biosystems/Ambion Austin, Texas, USA Balzers-Union Wiesbaden, Deutschland BD (Becton, Dickinson and Company) Franklin Lakes, New Jersey, USA Bernd Kraft GmbH Duisburg, Deutschland Boehringer Mannheim Mannheim, Deutschland Carl Zeiss Göttingen, Deutschland Dako Hamburg, Deutschland Electron Microskopy Science Hatfiled, Pennsylvania, USA Eppendorf Wesseling/Berzdorf, Deutschland Fine Science Tools Heidelberg, Deutschland Fluka Neu-Ulm, Deutschland Fröbel Lindau, Deutschland GIBCOTM Eggenstein, Deutschland Gilson Middleton, Wisconsin, USA Greiner bio-one Frickenhausen, Deutschland Heraeus Düsseldorf, Deutschland IBS Integra Biosciences Fernwald, Deutschland Invitrogen® Krefeld, Deutschland J.T. Baker Deventer, Niederlande Kisker Steinfurt, Deutschland Langenbrinck Teningen, Deutschland Menzel Braunschweig, Deutschland Merck Darmstadt, Deutschland Neolab® Heidelberg, Deutschland Nikon Düsseldorf, Deutschland Nunc Langenselbold, Deutschland Roche Grenzach-Wyhlen, Deutschland Material und Methoden 94 ROTH® Karlsruhe, Deutschland Sarstedt Nümbrecht, Deutschland Sigma-Aldrich Heidelberg, Deutschland Technischer Handel Straub Mühlacker, Deutschland UniEquip Planegg, Deutschland Präparierte Embryonen Methode Immunfluoreszenz 1. Antilkörperinkubation Zeit 24 h Videomikroskopie Präparation und Videoaufnahmen (mit anschließender Genotypisierung) Rasterelektronenmikroskopie Semidünnschnitte In-SituHybiridsierung Fixieren Fixieren Fixieren 2h 12 h Kritische-PunktTrocknung Waschen, Entwässerung und Einbetten ca. 2 h 16 h 2. Antilkörperinkubation 24 h Aushärtung 1-2 h pro Wurf. 3,5 h Prähybridisierung, Hybridisierung und Farbdetektion Sputtern 48 h pro Probe 2-3 min Lokalisation verschiedener Polaritätsmarker Bleichen und Permeabilisieren Aufkleben 1h Ziel 12 h Darstellung der Primitivknotenzilienbewegung Darstellung des Primitivknotens und der Zilien Darstellung des Querschnitts im Primitivknotenbereich Abb. 17: Grafische Übersicht des Material- und Methodenteils. 72 h Darstellung von RNA im Gewebe Ergebnisse 95 4. Ergebnisse 4.1. Negativkontrollen Bei der immunhistochemischen Färbung des Mausembryos mit dem sekundären Antiköper Alexa Fluor 488 Huhn-Anti-Maus zeigt sich eine homogene, aber sehr schwache Grünfärbung des Präpapates. Spezifische Signale waren dabei nicht zu erkennen. Die durchgeführten Negativkontrollen mit den sekundären Antikörpern Anti-Maus-Cy3, Anti-Kaninchen-Cy3, Anti-Ratte-Cy3 und Anti-Ziege-Cy3 wiesen eine schwache Rotfärbung auf, wobei auch hier weder Zellmembranen oder Zellkerne markiert waren. Alle durchgeführten Negativkontrollen zeigten sich frei von spezifischen Signalen (Bilder nicht angezeigt). 4.2 Entwicklung des Primitivknotens Um einen Überblick über die Primitivknotenentwicklung im Mausembryo zu erhalten, wurden Aufnahmen mit dem LSM von verschiedenen Altersstufen (E7.5-8.5) durchgeführt. Die Altersbestimmung der Embryonen erfolgte nach den von DOWNS und DAVIES (1993) beschriebenen morphologischen Merkmalen. Die Lokalisation des sich entwickelnden Primitivknotens ist bei einem Embryo im Primitivstreifenstadium nur zu erahnen (Abb. 18.1a-b, blauer Pfeil). Im späten Neuralplattenstadium beginnen sich allerdings am distalen Ende des Embryos entodermale Zellen an verschiedenen, aber eng zusammenliegenden Stellen (Abb. 18.2a-b, gelbe Pfeile) zu verjüngen (Abb. 18.2b, gelbe Sternchen) und somit die Bildung des Primitivknotens der Maus zu intiieren. Die die Primitivknotenregion umgebenden entodermalen Zellen sind dagegen regelmäßig angeordnet (Abb. 18.2c, grüne Sternchen). Wenige Stunden später, im frühen und späten Kopffaltenstadium, sind bereits deutlich die Grubenzellen (G in Abb. 18.3-4, runde Klammer) zu erkennen. Auch die Kronzellen (K in Abb. 18.5) heben sich durch ihre langgestreckte Form von den kleineren Grubenzellen (G) im 4-Somitenstadium 96 Ergebnisse ab, so dass man die Kronzellen deutlich von den Grubenzellen unterscheiden kann. In dem 8-Somitenstadium beginnt der Primitivknoten mit seiner Regression (Abb. 18.6). 97 Ergebnisse 98 Ergebnisse Abb. 18: Aufnahmen von Mausembryonen (E7.5-8.5) mit dem LSM zur Darstellung der Zellform in der Primitivknotenregion und Primitivknotenentwicklung verschiedener Entwicklungsstadien. (1a) Seitliche Aufnahme eines Embryos im frühen Primitivstreifenstadium unter Angabe der Primitivknotenlokalisation (blauer Pfeil). (1b) Der blaue Pfeil zeigt die vergrößerte Stelle der Primitivknotenentwicklung an. (2a) 3D-Übersichtsaufnahme eines Embryos im späten Primitivstreifenstadium (mit angezeigten Bereichen, der sich apikal verjüngenden Zellkörper (gelbe Pfeile). (2b) Seitliche scan-Aufnahme durch die angezeigten sich verjüngenden Zellen (gelbe Pfeile, gelbe Sternchen). (2c) Regelmäßige Anordnung der Zellen im sich entwickelnden Primitivknotenbereich (grüne Sternchen). 2c und 2b wurden im Abstand von 22 µm gemacht. (3-4) Seitliche Aufnahme des Primitivknotenbereichs mit angezeigtem Bereich der Grubenzellen (G, runde Klammer) und Kronzellen (K, eckige Klammer) im frühen (3) und späten Kopffaltenstadium (4). (5) Aufsicht auf den Primitivknoten eines Embryos im 4-Somitenstadium mit eingezeichneten Bereichen (gepunktete Linien) in Grubenzellen (G) und Kronzellen (K). (6) Aufsicht auf den sich zurückbildenden Primitivknoten (gestrichelte Linie) eines Embryos im 8-Somitenstadiums. A: Anterior; G: Grubenzellen; K: Kronzellen; L: Links; P: Posterior; R: Rechts. 1-5: JAM-A Expression; 6: β-Catenin Expression. 1a: 10-fache Objektiv-Vergrößerung; 1b, 2a: 20-fache Objektiv-Vergrößerung; 2b, 2c, 3-6: 40-fache Objektiv-Vergrößerung. 99 Ergebnisse 4.3 Darstellung des Primitivknotens und der Zilien 4.3.1 Rasterelektronenaufnahmen des Primitivknotens und der Zilien Rasterelektronenmikroskopaufnahmen wurden von 17 Wildtyp-Embryonen und 15 Pkd2-mutanten Embryonen durchgeführt, um dem Sachverhalt nachzugehen, wie sich die Zilien in den verschiedenen Altersstufen entwickeln. In diesem Kontext stellte sich auch die Frage, ob sich die Zilienlängen zwischen Wildtypembryo und der Pkd2 (polycystic-kidney-disease-2) Mutante unterscheiden. Eindeutig zu erkennen ist, dass sich die durchschnittliche Länge der Zilien im Primitivknotenbereich mit Zunahme der Altersstufe beim Wildtyp (Abb. 19 und 21) stetig von der Neuralplatte bis zum 4-Somitenstadium verlängert (von 1,31 µm auf 2,73 µm), um danach bis zum 6-Somitenstadium wieder leicht abzunehmen (Abnahme von 2,73 µm auf 2,49 µm). Bei den Pkd2 Mutanten (Abb. 20 und 21) ist eine ähnliche Tendenz zu erkennen. Von der Neuralplatte bis zum 5-Somitenstadium zeigt sich ein deutlicher Anstieg der Zilienlänge (von 1,61 µm auf 3,58 µm), die anschließend wiederum abnimmt (von 3,58 µm auf 2,88 µm). Vergleicht man die Primitivknotenzilienlänge der Wildtypen mit den Pkd2 Mutanten untereinander, so sind keine wesentlichen Unterschiede zu vermerken: Der maximal gemessene Wert der Zilienlänge bei der Pkd2 Mutante beträgt im 5-Somitenstadium 3,58 µm während beim Wildtyp im 5-Somitenstadium 2,65 µm gemessen wurde (siehe Tab. 17). Außerdem verläuft das Wachstum der Zilienlänge bei Wildtypembryonen annähernd linear (zumindest bis zum 4-Somitenstadium), während das Zilienwachstum der Pkd2 Mutante keinen linearen Verlauf, sondern im Vergleich zur Zilienlänge der Wildtypembryonen geringe Abweichungen nach oben und unten zeigt. Eine Ausnahme bezüglich der Zilienlängendiskrepanz zwischen dem Wildtypembryo und der Pkd2 Mutanten ist im Alter von 5 Somiten zu erkennen. Hier sind Zilien der Pkd2 Mutanten fast 1 µm länger als die der Wildtypembryonen (Abb. 21). Ergebnisse 100 Zilienlängen bei Wildtypembryonen 0 Somiten Knotenzilie: 1,613 µm 2 Somiten Knotenzilie: 2,109 µm 3 Somiten Knotenzilie: 2,51 µm 4 Somiten Knotenzilie: 2,732 µm Abb. 19: Rasterelektronenmikroskopaufnahmen von Wildtypembryonen der Maus mit aufsteigenden Altersstufen. Die mittlere Spalte zeigt die Ventralaufsicht auf den Primitivknoten (siehe Pfeil), wobei die Embryonen alle mit ihrer Kopfregion nach rechts orientiert sind. Die rechte Spalte zeigt eine Vergrößerung der Primitivknotengrube mit den sich darin befindlichen Zilien. Ergebnisse 101 Zilienlängen bei Pkd2 mutanten Embryonen Kopffaltenstadium Knotenzilie: 1,096 µm 3 Somiten Knotenzilie: 2,533 µm 5 Somiten Knotenzilie: 3,582 µm 6 Somiten Knotenzilie: 2,360 µm Abb. 20: Rasterelektronenmikroskopaufnahmen von Pkd2 Mutanten der Mausembryonen mit aufsteigenden Altersstufen. Die linke Spalte zeigt die Übersichtsaufnahmen der Pkd2 Mutanten, die alle mit dem Primitivknoten (siehe Pfeil) nach unten orientiert sind und mit der Kopfregion nach links zeigen. Die mittlere Spalte zeigt die Ventralaufsicht auf den Primitivknoten (siehe Pfeil) wobei die Embryonen alle mit ihrer Kopffalte nach rechts orientiert sind. Die rechte Spalte zeigt eine Vergrößerung der Primitivknotengrube mit den sich darin befindlichen mit Zilien besetzen Zellen. Linke Spalte: 3,2-fache Objektiv-Vergrößerung mit der Stereolupe. Ergebnisse 102 4 3,5 Knotenzilienlänge [µm] 3 2,5 Wildtypembryonen 2 Pkd2-/- Embryonen 1,5 1 0,5 n ite om 7S m ite n n So 6 So 5 4 So m ite m ite n n n m ite So 3 So 2 So m ite m ite n n m ite 1 lte So pf fa 0 Ko N eu r al pl at te 0 Abb. 21: Grafische Darstellung der Primitivknotenzilienlänge von 15 Pkd2 mutanten (Pkd2-/) Embryonen und 17 Wildtypembryonen. Y-Achse: Alter der Mausembryonenen; X- Achse: Primitivknotenzilienlänge in µm. Tab. 17: Tabellarische Aufstellung der durchschnittlich gemessenen Zilienwerte mit ihren Standardabweichungen der auswertbaren Wildtypembryonen und Pkd2 Mutanten (n= 32). Alter der Embryonen Neuralplatte (n=2) Kopffalte (n=3) 0 Somiten (n=7) 1 Somiten (n=1) 2 Somiten (n=4) 3 Somiten (n=3) 4 Somiten (n=6) 5 Somiten (n=2) 6 Somiten (n=3) 7 Somiten (n=1) Wildtyp Primitivknotenzilienlänge in µm 1,31 1,515 ± 0,021 1,718 ± 0,165 1,79 2,167 ± 0,072 2,51 2,73 2,65 2,49 nicht vorhanden Pkd2-/Knotenzilienlänge in µm 1,61 1,1 1,87 nicht nachweisbar 1,79 2,135 ± 0,559 2,744 ± 0,282 3,58 2,7 ± 0,481 2,88 103 Ergebnisse 4.3.2 Darstellung der Bewegung der Primitivknotenzilien Anhand der Darstellung der Bewegung der Primitivknotenzilien mittels kleiner definierter Kügelchen (beads) mit einem Durchmesser von 0,2 µm konnte ein gerichteter Fluss von rechts nach links bestätigt werden. Dabei zeigte dieser Fluss mit einer Geschwindigkeit von 4,7 - 4,8 µm/s im posterioren Bereich des Primitivknotens eine stärker gerichtete Bewegung als im anterioren Primitivknotenabschnitt. Bei der Analyse der Zilienbewegung am Primitivknoten der Wildtypembryonen und Pkd2 mutanten Embryonen (4,7 - 4,8 µm/s, Daten von P.Pennekamp übernomen) konnten keine signifikanten Unterschiede bezüglich der Geschwindigkeit oder der Richtung des Flüssigkeitsstroms festgestellt werden (vgl. beigelegte Videoaufnahmen auf der CD). Abbildung 22 zeigt den linksgerichteten Bewegungsverlauf einzelner Kügelchen im Primitivknoten des frühen Mausembryos. Zur Auswertung wurden Embryonen um den Embryonaltag 8 herangezogen (Wildtypembryonen n= 8, Pkd2 Mutante n= 6). Abb. 22: Einzelbilder einer Videoaufnahme der Bewegung der Zilien im Primitivknoten des Mausembryos, die im Abstand von 3,23 s (Bild 1-2), 1,59 s (Bild 2-3) und 3,43 s (Bild 3-4) bei einer 40-fachen Objektiv-Vergrößerung entstanden sind. A: Anterior; L: Links; P: Posterior; R: Rechts. Die unterschiedlichen Linienfarben entsprechen dem Verlauf einzeln ausgesuchter Kügelchen. Jede Farbe steht für ein Kügelchen. 40-fache Objektiv-Vergrößerung. 104 Ergebnisse 4.4 Immunhistochemische Analysen des Primitivknotens Unter Einsatz von immunhistochemischen Färbungen wurden einige bedeutende Polaritätsproteine am Primitivknoten der Maus analysiert (vgl. Tab. 18). Zu diesem Zweck wurden Polaritätsproteine ausgewählt, die den Tight Junctions (Zonula occludens), den Adherens Junctions (Zonula adhaerens) und den Focal Adhesions (Fokale Adhäsionskomplexe) zuzuordnen sind (Abb. 12), zu den Annexinen, in den Bereich der Zilien oder zu den Signalmolekülen gehören. Diese Proteine sind insofern von großer Bedeutung, da sie Zell-Zell-Kontakte und Zell-Matrix-Interaktionen bilden und an vielen verschiedenen Zellprozessen, wie der Zellmigration und der Genexpression (LIU 2000) oder der Epithelproliferation beteiligt sind (BALDA et al. 2003). Um die Bedeutung von strukturellen Proteinen der Zell-Zell-Kontakte oder Transkriptions beeinflussenden Proteine am Primitivknoten bei Pkd2 homozygot mutanten Mäusen zu klären, sollten im Rahmen dieser Arbeit Embryonen in den entsprechenden Altersstadien mittels ausgewählter Proteine und immunhistochemischer Färbungen vergleichende Untersuchungen zwischen Pkd2 Mutanten und Wildtypembryonen durchgeführt werden. Alle ausgesuchten Polaritätsproteine durchlaufen eine immunhistochemische Analyse, wie sie im Material- und Methodenteil beschrieben worden ist. Mit Hilfe der konfokalen Laser Scanning Mikroskopie (ZEISS LSM 510 und Nikon Confocal Microscope A1) wurden die Präparate Schicht für Schicht „durchgescannt“. Die Fotos wurden mit der LSM Image Browser Software (Carl Zeiss, Jena) und dem NIS-Elements Advanced Research, Version 3.06 (Nikon, Düsseldorf) ausgewertet. Angaben zu den Anzahlen der immunhistochemisch gefärbten Embryonen sind in der Tabelle 19 aufgelistet. Pro ausgewähltem Protein wurde zunächst eine große Bandbreite an Stadien (E7.5-8.5) analysiert. Bei interessanten vorläufigen Ergebnissen wurde die Immunfärbung im entsprechenden Stadium mit mindestens 5 Embryonen wiederholt. Ergebnisse 105 Tab. 18: Anzahl der immunhistochemisch analysierten Embryonen (n) Acetyliertes Tubulin (180) Annexin 2 (15) Annexin 4 (23) Annexin 6 (29) β-Catenin (88) Claudin 1 (7) Claudin 2 (11) Claudin 3 (6) Claudin 4 (37) Claudin 5 (12) E-Cadherin (64) γ-Tubulin (63) JAM (144) N-Cadherin (76) PAR-3 (6) PAR-6 (5) p-Fak (12) Phospho-β-Catenin (11) p-Pax (16) p-Smad 1 (4) p-Tyr (16) Smad 1 (11) Smad 2 (5) Smad 3 (5) Smad 4 (9) Zo-1 (76) 4.4.1 Immunhistochemische Färbungen ziliärer Proteine 4.4.1.1 Lokalisation von acetyliertem Tubulin und γ-Tubulin im frühen Mausembryo Acetyliertes Tubulin ist vor allem in den Primärzilien und Monozilien des Primitivknotens nachweisbar, wie auch in mitotischen Spindeln, während γ-Tubulin im Basalkörper der Zilien vorhanden ist. Anhand der Lokalisation des acetylierten Tubulins und γ-Tubulins in den Zilien des Primitivknotens dient acetyliertes Tubulin als excellenter Marker für die Ausbildung und Differenzierung der Zilien des Primitivknotens (PIPERNO 1987; ZHENG u. WIESE 2006; HAMMOND 2008). Daher wurden immunhistochemische Färbungen mit Antikörpern gegen acetyliertes Tubulin zur Darstellung der Zilien und immunhistochemische Färbungen mit Antikörpern gegen γ-Tubulin zur Darstellung der Basalkörper durchgeführt. Abbildung 23 stellt eine Übersicht dar, in der die Lokalisation der Zilien mit zunehmendem Alter der Embryonen angegeben ist. Abbildung 24.1 zeigt hier deutlich die Tubulin markierten Zilien (grün), die posterior in der Zelle angeordnet sind (siehe weiße Pfeile). Die Zilienposition ändert sich im Laufe der Entwicklung. Während im frühen Knospungsstadiums der Allantois (early allantoic bud) des Mausembryos der Basalkörper noch relativ Ergebnisse 106 zentral in den Grubenzellen des Primitivknotens angeordnet ist, verlagert sich diese Position bereits nach 5 Stunden mit fortschreitender Entwicklung nach posterior (HASHIMOTO et al. 2010) (vgl. Abb. 24.1). In Abb. 24.2 wurde eine Doppelimmunfärbung mit Anti-acetylierten-Tubulin-Antikörpern (grün, weißer Pfeil) und Anti-γ-Tubulin-Antikörpern (rot, blauer Pfeil) durchgeführt. Hier wird die enge Kolokalisation von acetyliertem Tubulin und γ-Tubulin veranschaulicht. In den Abbildungen 24.3 und 24.4a sind deutlich die monozilienbesetzten Zellen (siehe weiße Pfeile) zu erkennen, die den Primitivknoten umgeben und nicht nur in diesem selbst vorhanden sind (hier erhöhte Dichte der Zilien). Rasterelektronenmikroskopisch wird dies wiederum bestätigt (vgl. Abb. 24.5a-c). In Abb. 25 ist als interessanter Nebenbefund die Lokalisation von acetyliertem Tubulin in den mitotischen Spindeln (weiße Pfeile) eines Embryos im 0 - 1 Somitenstadium detektiert worden. Ergebnisse 107 Überlagerung Tubulin β-Catenin Neuralplatte/ No allantoic bud stage Neuralplatte / Late bud stage A P A P A P 2 Somiten R L R L R L 5-6 Somiten Abb. 23: Übersichtsaufnahmen der Expression von Tubulin (grün) mit β-Catenin (rot) beim Mausembryo gestaffelt nach Alter. Acetyliertes Tubulin wird in den Zilien exprimiert und ist deutlich im Mausknoten des 2-Somitenstadiums zu erkennen. Die Pfeile markieren die Lokalisation des Primitivknotens. Die Embryonen der oberen beiden Reihen sind so angeordnet, dass die Ventralseite nach unten zeigt und die Kopfseite nach links orientiert ist. Die Kopfseite der unteren beiden Reihen ist hier nach oben gerichtet und die Ventralseite ist dem Betrachter zugewandt. A: Anterior; L: Links; P: Posterior; R: Rechts. Alle Embryonen: 10-fache Objektiv-Vergrößerung. 108 Ergebnisse 109 Ergebnisse Abb. 24: Konfokale Aufnahme des Primitivknotenbereiches mit Tubulin-Expression und Rasterelektronenmikroskopaufnahmen eines Mausembryos mit Vergrößerung der Zilienbereiche. (1) Acetyliertes Tubulin (grün) im Primitivknoten eines Embryos im 8-Somitenstadium. Die weißen Pfeile deuten auf die posteriore Lokalisation der Zilien hin. (2) Acetyliertes Tubulin (grün, weißer Pfeil) und γ-Tubulin (rot, blauer Pfeil) eines Embryos im 2-Somitenstadium. (3) Acetyliertes Tubulin (grün) im und um den Primitivknoten eines sich im späten Kopffaltenstadium befindlichen Mausembryos. (4) Übersichtsaufnahme eines Embryos im Kopffaltenstadium mit acetyliertem Tubulin (grün) und E-Cadherin (rot) mit angezeigtem Bereich der Vergrößerung des Primitivknotens. (4a) Vergrößerter Ausschnitt aus (4) mit angezeigten Zilien außerhalb des Primitivknotens (weiße Pfeile). (5a) Rasterlektronenmikroskopaufnahme eines Mausembryos im frühen Neuralplattenstadium mit den jeweiligen Vergrößerungsausschnitten des Primitivknotens selbst (5b) und einer Vergrößerung posterior zum Primitivknoten (5c). Die weißen Pfeile weisen auf die Lokalisation der Zilien hin. Grüne Kästen: Vergrößerung des jeweiligen Ausschnitts. A: Anterior; P: Posterior. 1: 2 x 40-fache ObjektivVergrößerung; 2, 3, 4a: 40-fache Objektiv-Vergrößerung; 4: 10-fache Objektiv-Vergrößerung. Abb. 25: Doppelimmunfärbung mit acetyliertem Tubulin (grün) und β-Catenin (rot) im Embryo eines 1-Somitenstadiums. Tubulin-Lokalisation in den mitotischen Spindeln (s. Pfeile). 40-fache ObjektivVergrößerung. 110 Ergebnisse 4.4.2 Tight Junction 4.4.2.1 Claudin 1-5 Lokalisation im frühen Mausembryo Als Hauptbestandteil der TJs dienen die Claudine 1-5 als Abdichtung in den Zwischenräumen der Epithelzellen. Immunhistochemische Untersuchungen mit AntiClaudin 1-5-Antikörpern haben unterschiedliche Ergebnisse aufgezeigt. Trotz vielfältiger Optimierungsversuche konnten mit Anti-Claudin 1-3-Antikörpern beim Mausembryo keine eindeutigen Ergebnisse generiert werden (Daten nicht angezeigt). Dagegen ist Claudin 4 im Primitivknoten selbst in den Zellen internalisiert (Abb. 26.1a). Die Querschnittsaufnahme von Claudin 4 demonstriert hier, dass es vorwiegend apikal in der Primitivknotengrube nur im Entoderm exprimiert ist (Abb. 26.1b). Des Weiteren ist als interessanter Nebenbefund Claudin 4 auch deutlich im Herzfeld zu erkennen (Abb. 26.1c). Claudin 5 ist verstärkt im Primitivknoten lokalisiert und hier wurde zur besseren Darstellung der Grenzen des Embryos die Eigenfluoreszenz in das Bild integriert (Abb. 26.2). 111 Ergebnisse Abb. 26: Immunhistochemische Untersuchungen mit Anti-Claudin-Antikörpern: (1a-b): Doppelfärbung mit Claudin 4 (rot) und γ-Tubulin (grün) in der 3D-Übersichtsaufnahme (1a) und in der Querschnittsaufname des Primitivknotens eines Embryos im 3 – 4 Somitenstadium (1b). (1c) Claudin 4 im Herzfeld (siehe Pfeil) eines Embryos im 5-Somitenstadium. (2) Lokalisation von Claudin 5 im Primitivknoten eines Embryos im 3 – 4 Somitenstadium. 1c: 1,5 x 40-fache Objektiv-Vergrößerung. 112 Ergebnisse 4.4.2.2 JAM-A Lokalisation im frühen Mausembryo JAM-A ist im frühen Mausembryo in entodermalen Zellen lokalisiert. Um punktuelle, einzelne Signale im Primitivknotenbereich, die außerhalb der Zellmembran dedektiert werden konnten, zu lokalisieren, wurde eine Doppelfärbung von JAM-A mit acetyliertem Tubulin durchgeführt. Diese Doppelfärbung zeigt, dass JAM-A mit acetyliertem Tubulin kolokalisiert und daher auch in den Zilien des Primitivknotens vorkommt. Abbildung 27 zeigt das Ergebnis einer immunhistochemischen Doppelfärbung mit einem Anti-JAM-A-Antikörper (rot) und einem Antikörper gegen acetyliertes Tubulin (grün). In Abb. 27.1a-c liegt eine Übersicht des Primitivknotens vor. Die Abbildungen 27.2a-c stellen die jeweilige vergrößerte Aufnahme des Primitivknotens dar, in der man zusammen mit den Abb. 27.3a-c (vergrößerte Querschnittsaufnahme aus Abb. 27.2a-c) und allen Überlagerungsaufnahmen (Abb. 27.1c, 2c, 3c) die offensichtliche Kolokalisation von JAM-A mit dem acetylierten Tubulin erkennen kann. Abbildung 27.4 zeigt eine enge Lokalisation von acetylierten Tubulin (grüner Pfeil) und JAM-A (roter Pfeil). In der nachfolgenden Abb. 28 sieht man eine einfache Immunfärbung mit dem AntiJAM-A-Antikörper. In dieser Abbildung ist die Gegenüberstellung eines Dottersacks von einem Wildtypembryo (Abb. 28.1a) und eines Pkd2 mutanten Embryos (Abb. 28.1b) dargestellt. Hier ist deutlich zu sehen, dass beim Wildtyp die JAM-AExpression eher apikal und punktuell zwischen den Zellen lokalisiert ist, während sich die JAM-A-Expression bei der Pkd2 Mutanten tendenziell über die ganze apikale Fläche ausbreitet. Ein ähnliches Bild sieht man im Querschnitt des Primitivknotens des Wildtypembryonen (Abb. 28.3a) und des Pkd2 mutanten Embryos (Abb. 28.3b). Auch hier ist JAM-A beim Wildtyp relativ scharf abgegrenzt zwischen den Zellen und überwiegend apikal lokalisiert, während bei der Mutante JAM-A vergleichsweise diffus über die apikale Fläche verteilt ist und sogar basal bis in das Mesoderm reicht. 113 Ergebnisse Abb. 27: Doppelfärbung des Mausembryos mit Anti-Tubilin-Antikörper (grün) und Anti-JAMAntikörper (rot). (1a-c) Übersicht des Primitivknotens. (2a-c) Vergrößerter Ausschnitt aus 1ac. 3a-c: Vergrößerte Querschnittsaufnahme des Primitivknotens. In allen Überlagerungsaufnahmen (1c, 2c, 3c) sind deutlich die Kolokalisationen von JAM mit Tubulin zu erkennen. (4) Enge Lokalisation von acetyliertem Tubulin (grüner Pfeil) und JAM (roter Pfeil) im Primtiviknoten. Alle hier abgebildeten Embryonen befinden sich im 5-Somitenstadium. 1: 40-fache Objektiv-Vergrößerung; 2-3: 3x40-fache Objektiv-Vergrößerung; 2 x 40-fache ObjektivVergrößerung. 114 Ergebnisse Abb. 28: Immunhistochemischer Nachweis der JAM-A Lokalisation bei Wildtyp- (4 Somiten) und Pkd2 mutanten Embryonen mit dem Anti-JAM-A-Antikörper. (1a, 1b) Lokalisation von JAM-A im Dottersack eines Wildtypembryos (1a) und einer Pkd2 Mutanten (1b). Beim Wildtyp ist die apikale und punktuelle Expression zwischen den Zellen deutlich erkennbar, während bei der Pkd2 Mutante die Expression eher diffus über die ganze apikale Fläche ausläuft. (2) Lokalisation von Jam-A im Primitivknoten eines Wildtyp-(2a) und eines Pkd2 mutanten Embryos (2b). (3) Querschnitt des Primitivknotens des Wildtyps (3a) und des Pkd2 mutanten Embryos (3b). Bei Pkd2 mutanten Embryonen lässt sich JAM-A nicht nur im Entoderm, sondern auch im Mesoderm nachweisen. 1-3: 40-fache Objektiv-Vergrößerung. 115 Ergebnisse 4.4.2.3 PAR-3 und PAR-6 Lokalisation im frühen Mausembryo Mittels der immunhistochemischen Färbung mit dem Anti-PAR-3- und Anti-PAR-6Antikörper konnten keine genauen Lokalisationen festgestellt werden, da die unspezifische Hintergrundfluoreszens zu stark ausgeprägt war. Es konnten keine aussagekräftigen Daten generiert werden. 4.4.2.4 Zo-1 Lokalisation im frühen Mausembryo Zo-1 ist ein TJ-assoziiertes Protein, das eine Verbindung zu Nachbarzellen bildet. Die Abbildungen 29.1-2 zeigen ein kortikales Färbemuster von Zo-1 an den Zell-ZellKontakten des Primitivknotens (Abb. 29.1 mit eingezeichnetem Primitivknotenbereich) und des Dottersacks (Abb. 29.2). Hier wird besonders die starke Expression von Zo-1 an den Schnittstellen der Zell-Zell-Kontakte deutlich (siehe weiße Pfeile). Die Querschnittsaufnahme des Primitivknotens zeigt eine durchgehende Lokalisation von Zo-1 im Ento-, Meso- und Ektoderm auf (Abb. 29.3). Bei der Fluoreszenzdetektion von Zo-1 wurden zu der Pkd2 Mutante (nicht angezeigt) keine Unterschiede festgestellt. 116 Ergebnisse Abb. 29: Immunhistochemischer Nachweis von Zo-1 beim Embryo (Kopffaltenstadium) mit eingezeichnetem Primitivknotenbereich (gepunktete Linie) (1) und im Dottersack mit starker Expression an den Schnittestellen der Zell-Zell-Kontakte (s. Pfeile) (2). (3) Querschnittsaufnahme des Primitivknotens. 1 u. 3: 40-fache Objektiv-Vergrößerung. 2: 60-fache Vergrößerung. 4.4.3 Adherens Junctions 4.4.3.1 β-Catenin Lokalisation im frühen Mausembryo Als Verbindungsprotein ist β-Catenin zwischen den Zelladhäsionsmolekülen und dem Zytoskelett an den Zell-Zell-Kontakten vorhanden und gehört zu den AJs. Die Untersuchungsergebnisse haben aufgezeigt, dass ein kortikales Färbemuster an den ZellZell-Kontakten im Dottersack des Wildtypembryos zu detektieren ist (Abb. 30.1a). Die Querschnittsaufnahme des Dottersacks weist eine überwiegend apikale Lokalisation von β-Catenin auf (Abb. 30.2a). Die Abbildungen 30.3a, 4a, 5a zeigen die Expressionen von β-Catenin im Primitivknoten des Wildtyps. Hier ist wieder das ringförmige Expressionsmuster im Primitivknoten zu erkennen (Abb. 30.3a). Aufgrund des Eindrucks einer asymmetrischen β-Catenin-Verteilung, wurden Querschnittsaufnahmen in normaler Aufnahme (Abb. 30.4.a) und Querschnittsaufnahmen in „rainbow“-Form (Abb. 30.5a) angefertigt. Durch diese rainbow-Aufnahme ist eine deutlich Ergebnisse 117 stärker ausgebildete Expression auf der linken Seite des Wildtypembryos zu erkennen, wobei die Signale im Primitivknoten selbst schwächer ausgeprägt sind als in der Peripherie. Im Gegensatz dazu ist die Expression von β-Catenin mit einem ebenfalls kortikalen Färbemuster bei den Pkd2 mutanten Embryonen insgesamt stärker ausgeprägt (Abb. 30.1b, 2b, 3b, 4b, 5b). Die Querschnittsaufnahme des Dottersacks zeigt im Unterschied zum Wildtyp eine nicht auf die apikalen Bereiche begrenzte Lokalisation von β-Catenin, sondern zieht bis nach basal weiter (Abb. 30.2b). Auch mit Hilfe der Untersuchungsergebnisse des Primitivknotens des Pkd2 mutanten Embryos konnten kortikale Expressionsmuster detektiert werden, die im Kontrast zum Wildtypembryonen allerdings stärker aber diffuser ausgebildet sind (Abb. 30.3b). In der Querschnittsaufnahme des Pkd2 mutanten Embryos ist die wie oben schon erwähnte stärkere und diffusere Expression zu entdecken, die allerdings keine asymmetrische Verteilung von β-Catenin aufweist. Dennoch sind im Gegensatz zum Wildtypembryo die β-Catenin-Signale über die ganze Entodermfläche, d.h. auch im Primitivknoten gleichmäßig verteilt. Da wie bereits beschrieben bei Wildtypembryonen eine asymmetrische Expression von β-Catenin zugunsten der linken Seite beobachtet wurde, wurden weitere Mausembryonen mit Expression von β-Catenin in der Primitivknotenregion verschiedener Entwicklungsstadien untersucht (Abb. 31). Für diesen Versuch wurden insgesamt 45 Embryonen ausgewertet. In Abb. 32 ist der prozentuale Anteil der β-Catenin-Verteilung in den verschiedenen Embryonalstadien dargestellt. Im 0 - 2 Somitenstadium liegt eine überwiegend asymmetrische Expression zugunsten der linken Seite und eine bilaterale Expression von β-Catenin vor. Dagegen ändert sich die Expressionsverteilung von β-Catenin ab dem 3-Somitenstadium. Ab diesem Stadium treten auch β-Catenin-Expressionen auf, die auf der rechten Seite stärker ausgebildet sind, wobei dieser Anteil im 4-Somitenstadium erheblich ansteigt. Der prozentuale Anteil der überwiegend linkseitigen β-Catenin-Expression sinkt ab dem 2-Somitenstadium kontinuierlich ab, während der Anteil der bilateralen β-CateninExpression stetig steigt. In Abb. 31 ist die Expression von β-Catenin mit ansteigender Somitenzahl angezeigt. In der linken Spalte sind Übersichtsaufnahmen des Embryos dargestellt, während die mittlere Spalte die Vergrößerung des Primitivknotens präsentiert. Die rechte Spalte beleuchtet die β-catenin-Intensität (rainbow- 118 Ergebnisse Aufnahmen). Hier liegen Querschnittsaufnahmen des Primitivknotens vor und man kann deutlich eine asymmetrische Expression zugunsten der linken Hälfte des Primitivknotens erkennen. Auffällig dabei ist, dass die asymmetrische Expression von β-Catenin mit zunehmendem Alter (ab ca. 3 Somiten) abnimmt und insgesamt schwächer wird. 119 Ergebnisse Abb. 30: Lokalisation von β-Catenin beim Mausembryo. (1) Teil des Dottersacks beim Wildtyp (2-3 Somiten) (1a) und bei der Pkd2 Mutante (1b). (2) Querschnitt des Dottersacks mit überwiegend apikaler Lokalisation beim Wildtyp (2a). Beim Pkd2 mutanten Embryo deutlich stärkere Expression, die auch weiter nach basal zieht (2b). (3) Übersicht des Primitivknotens beim Wildtyp (3a) und bei der Pkd2 Mutante (3b). (4, 5) Querschnitt des Primtiviknotens beim Wildtyp (4a, 5a) und bei der Pkd2 Mutante (4b; 5b). 5a zeigt in der rainbow-Aufnahme die markante asymmetrische Expression auf der linken Seite des Primitivknotens eines Wildtypembryos. L: Links; R: Rechts. 1-5: 40-fache Objektiv-Vergrößerung. 120 Ergebnisse Abb. 31: Asymmetrische Lokalisation von β-Catenin beim Mausembryo. Die linke Spalte zeigt die Übersichtsaufnahme mit dem konfokalen laserscanning Mikroskop. Dabei sind alle Em-bryonen mit dem Kopf nach oben orientiert. Die weiße gestrichelte Linie bei dem 2 Somiten Embryo zeigt exemplarisch den Bereich des Primitivknotens an. Die mittlere Spalte zeigt die Vergrößerung des Knotenbereichs an, der in der rechten Spalte mit der rainbowAufnahme als Querschnittsaufnahme aufgezeigt wird. Durch die rainbow-Aufnahmen sind deutlich die asymmetrischen Expressionen von β-Catenin zugunsten der linken Seite zu erkennen (die gestrichelte Linie deutet die Mittellinie an). Dabei schwächt die asymmetrische β-Catenin-Expression im Bereich des Primitivknotens mit zunehmendem Somitenalter ab. L: Links; R: Rechts. Linke Spalte: 10-fache Vergößerung; Mittlere und rechte Spalte: 40-fache Objektiv-Vergrößerung. Ergebnisse 121 100% 90% 1 1 2 3 80% 3 4 70% 60% 2 5 50% 2 40% rechts bilateral links 5 5 30% 3 20% 2 2 10% 1 0% 0 Somiten 1 Somit 2 Somiten 3 Somiten 4 Somiten 5 Somiten Abb. 32: Grafische Auswertung des prozentualen Anteils der β-Catenin Verteilung in den verschiedenen Embryonalstadien. n= 41 auswertbare Embryonen (jeweilige Anzahl der Embryonen mit der entsprechenden β-Catenin Verteilung in den Säulen). 4.4.3.2 Phospho-β-Catenin Lokalisation im frühen Mausembryo Die Immunfluoreszenzfärbungen mit einem Anti-Phospho-β-Catenin-Antikörper zeigten auch trotz vielfacher Optimierungsversuche keine aussagekräftigen Ergebnisse (nicht angezeigt). 122 Ergebnisse 4.4.3.3 E-Cadherin Lokalisation im frühen Mausembryo E-Cadherin wird zu den AJs gerechnet und befindet sich an den Zell-Zell-Kontakten. Abb. 33.1a-b zeigen laterale Aufnahmen eines nicht aufgeklappten Embryos im Neuralplattenstadium eines Wildtyps und einer Pkd2 Mutante mit markiertem Primitivknotenbereich. Hier liegt beim Wildtypembryo eine gleichmäßige Verteilung von E-Cadherin in den Zell-Zell-Kontakten vor. Das Expressionsmuster des Pkd2 mutanten Embryos zeigt dagegen keine Unterschiede auf. Die Abbildungen 33.2a-b stellen den Querschnitt des Primitivknotens eines Embryos im 2-Somitenstadium dar. Der Wildtypembryo weist in der Querschnittsaufnahme Lokalisationen von E-Cadherin im Entoderm und schwächer ausgeprägt auch im Ektoderm auf, während im Mesoderm kaum Signale vorhanden sind. Die entodermale Lokalisation von E-Cadherin beim Wildtypembryo scheint außerhalb des Primitivknotens schwächer zu sein als im Primitivknoten selbst (Abb. 33.2a). Im Gegensatz dazu ist E-Cadherin bei den Pkd2 mutanten Embryonen gleichmäßiger im Entoderm verteilt, wobei die Expression im Ektoderm hier auch schwächer ausgeprägt ist als im Entoderm und ebenfalls keine Signale im Mesoderm zu detektieren sind (Abb. 33.2b). Abbildung 33.3 zeigt eine weitere Querschnittsaufnahme eines Embryos mit deutlicher Fluoreszenzdetektion von E-Cadherin im Ento- und Ektoderm. Die Signalstärke des Ektodermbereichs, der zum Lumen hin zeigt, ist ausgeprägter als die dem Mesoderm zugewandte Seite. Ergebnisse 123 1a R 2a 1b L R L 2b 3 Abb. 33: (1) Laterale Aufnahme der Expressionsverteilung von E-Cadherin eines Wildtypembryos (1a) und eines Pkd2 mutanten Embryos (1b) im Neuralplattenstadium. (2) Querschnitt des Primitivknotens eines Wildtypembryos im 1-Somitenstadium (2a) und eines Pkd2 mutanten Embryos im 2-Somitenstadium (2b). Die Expression von E-Cadherin ist hier im Wildtypembryo deutlich auf die Primitivknotengrube begrenzt (s. rote Pfeile), während sich die Expression bei der Pkd2 Mutante auch peripher ausbreitet (s. weiße Pfeile). (3) Querschnittsaufnahme des Wildtypembryos durch den Primitivknoten. L: Links; R: Rechts. 1: 20-fache Objektiv-Vergrößerung. 2-3: 40-fache Objektiv-Vergrößerung. 124 Ergebnisse 4.4.3.4 N-Cadherin Lokalisation im frühen Mausembryo N-Cadherin, das zu den kalziumabhängigen Cadherinen gehört, ist an den AJs lokalisiert. Immunhistochemische Färbungen mit einem Anti-N-Cadherin-Antikörper haben gezeigt, dass in der Übersichtsaufnahme des Primitivknotens (Abb. 34.1) ein ringförmiges Färbemuster zu erkennen ist. Einzelne Zellen weisen im Primitivknoten Signale innerhalb der Zelle auf. Die Querschnittsaufnahmen des Primitivknotens verdeutlichen hier die Lokalisation von N-Cadherin im Ento- und Ektoderm, wobei die Expression im Ektoderm stärker ausgeprägt ist (Abb. 34.2-3). Einige wenige Signale sind auch im Mesoderm zu sehen (Abb. 34.2). Auffallend ist besonders die ausgeprägte Expression der Ektodermschicht, die dem Mesoderm zugewandt ist. Im Vergleich dazu sieht man, dass E-Cadherin eine stärkere Expression im Bereich des Ektoderms besitzt, das dem Mesoderm abgewandt ist (Abb. 34.4). 125 Ergebnisse Abb. 34: Immunhistochemische Färbung mit einem Anti-N-Cadherin-Antikörper. (1) Übersichtsaufnahme des Primitivknotens. (2-3) Querschnittsaufnahmen des Primitivknotens eines Embryos im 3-Somitenstadium. (4) Querschnittsaufnahme des Primitivknotens mit einem Anti-E-Cadherin-Antikörper zum Vergleich. 1-4: 40-fache Objektiv-Vergrößerung. 126 Ergebnisse 4.4.4 Fokale Adhäsionen 4.4.4.1 p-Fak Lokalisation im frühen Mausembryo Untersuchungen mit dem Anti-p-Fak-Antikörper haben ergeben, dass ein punktförmiges, schwaches Färbemuster zu detektieren ist (Abb.35), welches sich zwischen den Zelltypen und Geweben nicht unterscheiden lässt. Abb. 35: Immunhistochemische Färbung mit einem Anti-p-Fak-Antiköper. Übersichtsaufnahme des Primitivknotens eines Embryos im 5-Somitenstadium mit punktförmigem Detektionsmuster. 40-fache Objektiv-Vergrößerung. 4.4.4.2 p-Pax Lokalisation im frühen Mausembryo Paxillin ist an den fokalen Adhäsionskomplexen lokalisiert, deren Funktion es ist, Aktinstressfasern an die fokalen Adhäsionskomplexe zu verankern. Die Untersuchungsergebnisse mit dem Anti-p-Pax-Antikörper haben gezeigt, dass hier ein kortikales Färbemuster zu erkennen ist, welches auf der linken Seite des Primitivknotens stärker ausgeprägt ist, als auf der rechten Seite. Dahingegen ist auf der rechten Seite des Primitivknotens eher ein punktförmiges Muster zu detektieren (Abb. 36.1). Des Weiteren ist die Expression im Bereich des Primitivstreifens verstärkt, während die Signale im Primitivknoten und in der Neuralrinne wiederum punktuell erscheinen. 127 Ergebnisse Die allgemein stärkere Expression von p-Pax auf der linken Seite wird nochmals verdeutlicht durch die Übersichtsaufnahme des Primitivknotens in rainbow-Form (Abb. 36.2). Abbildung 36.3 zeigt eine Querschnittsaufnahme desselben Primitivknotens mit überwiegender Lokalisation im Entoderm. Die Signale von p-Pax reichen allerdings auch bis in das Mesoderm. Im Ektoderm sind hingegen keine Signale zu detektieren. Abb. 36: Immunhistochemische Färbung eines Embryos im 3-Somitenstadium mit einem Anti-p-Pax-Antikörper. (1) Übersichtsaufnahme des Primitivknotens. (2) Gleiche Übersichtsaufnahme des Primitivknotens in rainbow-Darstellung. (3) Querschnittsaufnahme des Primitivknotens. L: Links; R: Rechts. 1-3: 40-fache Objektiv-Vergrößerung. 128 Ergebnisse 4.4.5 Annexine 4.4.5.1 Annexin 2, 4, 6 Lokalisation im frühen Mausembryo Annexine sind Kalzium-abhängige Phospholipid-bindende Proteine, die an vielen intrazellulären und membranassoziierten Prozessen beteiligt sind. In Abb. 37 ist die immunhistochemische Färbung mit den Annexinen 2 und 6 (rot) im Mausknoten dargestellt. Abbildung 37.1a (am Rand) und Abb. 37.1b (in der Grube) zeigen deutliche Expressionen von Annexin 2 (rot) im Primitivknoten, die vermutlich intrazellulär vorliegen. Die punktuellen Annexin 2 Expressionen im Primitivknoten ließen eine mögliche Kolokalisation mit den Primitivknotenzilien vermuten. Daher erfolgte eine Doppelfärbung mit Annexin 2 (rot) und γ-Tubulin (grün), das Bestandteil der Basalkörper der Zilien ist, so dass bei Überlagerung eine Kolokalisation von Annexin 2 und γ-Tubulin detektiert würde. Hier konnte festgestellt werden, dass eindeutig keine Kolokalisation von Annexin 2 (siehe rote Pfeile) mit γ-Tubulin (siehe grüne Pfeile) vorliegt (Abb. 37.2). Annexin 6 zeigt im Primitivknoten ähnliche Ergebnisse wie Annexin 2 (vgl. Abb. 37.3a-d). Abbildung 37.3a zeigt eine 3D-Übersichtsaufnahme des Primitivknotens. Hier erkennt man die ausgeprägte Expression von Annexin 6 sowohl in der entodermalen Epithelschicht als auch im Primitivknoten selbst. Abbildung 37.3b zeigt nochmals die Aufsicht des Primitivknotens mit den Annexin 6 Expressionen durch den vollständigen Primitivknoten, wobei deutlich wird, das nur einige Grubenzellen Annexin 6 beinhalten (siehe weiße Pfeile). Außerdem sind im Entoderm verschiedene Färbemuster zu erkennen. Zum einen zeigt das Entoderm kortikale Expressionen an den Zell-Zell-Kontakten (Kasten), aber auch Lokalisationen von Annexin 6 in der gesamten Zelle (Kreis) (Abb. 37.3b). Die Abbildungen 37.3c-d stellen die einzelnen Annexin 6 Lokalisationen jeweils in der Epithelschicht (Abb. 37.3c) und in den Grubenzellen des Primitivknotens dar (Abb. 37.3d) dar. In der Epithelschicht ist Annexin 6 unübersehbar an den Zell-Zell-Kontakten vorhanden (Abb. 37.3c). Ein interessanter Nebenbefund ist allerdings die sehr stark ausgeprägte Expression im Herzfeld des Embryos (Abb. 38, siehe weiße Pfeile), die bei beiden, bei Annexin 2 (Abb. 38.1) und Annexin 6 (Abb. 38.2) deutlich zu erkennen ist. In Abb. 39 ist die Expression von Annexin 4 dargestellt. Anhand dieser Abbildung kann man die deutliche Expression 129 Ergebnisse von Annexin 4 im Entoderm sehen. Abbildung 39.1a zeigt eine Querschnittsaufnahme eines E8.0 Embryos im 5-Somitenstadium in Höhe des Primitivknotens mit eindeutiger Expression im Entoderm (hier ventral, gestrichelte Linie) und schwacher Expression im Ektoderm (hier dorsal, gepunktete Linie). Abbildung 39.1b zeigt die Aufsicht von ventral auf den Primitivknoten. Hier ist anzumerken, dass im Primitivknoten (gepunkteter Bereich) Annexin 4 in den Grubenzellen nicht mehr in den Zell-ZellKontakten lokalisiert ,sondern auch wie Annexin 6 internalisiert ist, während im Entoderm Annexin 4 deutlich an den Zell-Zell-Kontakten zu erkennen ist. Abbildung 39.2a stellt wiederum eine Querschnittsaufnahme desselben Embryos dar, allerdings in Höhe des 3. Somiten mit Blick auf die Neuralrinne (gepunkteter Bereich). Hier ist wieder die deutliche Expression von Annexin 4 im Entoderm zu sehen, während im Ektoderm kaum Annexin 4 Expression vorliegt. In beiden Querschnittsaufnahmen (39.1a und 39.2a) ist deutlich zu beobachten, dass das Mesoderm kaum Annexin 4 Lokalisation aufweist. In Abb. 39.2b ist die Aufsicht von ventral auf die Neuralrinne (gepunkteter Bereich) zu erkennen. Im Unterschied zur Aufsicht auf den Primitivknoten (Abb. 39.1b) ist hier auch im Bereich der Neuralrinne die Expression von Annexin 4 an den Zell-Zell-Kontakten vorhanden, wie auch gleichermaßen im entodermalen Bereich. 130 Ergebnisse Abb. 37: Immunhistochemische Färbung von Annexin 2 und Annexin 6 zum Zeitpunkt 8.0 dpc im Primitivknotenbereich des frühen Mausembryos. (1a, 1b) Annexin 2 Expression im Knoten (rot) im 2-Somitenstadium (1a) und im 3-Somitenstadium (1b). (2) Doppelfärbung mit Annexin 2 (rot) und γ-Tubulin (grün) im 3-Somitenstadium. Es ist keine Kolokalisation von γ-Tubulin nachweisbar (vgl. rote und grüne Pfeile). (3) Annexin 6 Expression beim Embryo eines 4-Somitenstadiums. (3a) 3D-Übersichtsaufnahme des Knotens. (3b) Aufsicht des Knotens. Nur einige Grubenzellen beinhalten Annexin 6 (siehe weiße Pfeile). Kortikale Expressionen an den Zell-Zell-Kontakten (Kasten) und Annexin 6 Lokalisation in der gesamten Zelle (Kreis). (3c) eindeutige Expression in der Epithelschicht an den Zell-Zell-Kontakten des Knotens. (3d) In den Grubenzellen des Knotens ist Annexin 6 nicht an den Zell-Zell-Kontakten nachweisbar, sondern internalisiert. 1-2, 3b: 40-fache Objektiv-Vergrößerung; 3c, 3d: 1,5 x 40-fache Objektiv-Vergrößerung. 131 Ergebnisse Abb. 38: Immunhistochemische Färbung zum Zeitpunkt 8.0 dpc von Annexin 2 (1) und Annexin 6 (2) im 5-Somitenstadium. Eindeutige Expression von Annexin im Herzfeldbereich (siehe weiße Pfeile). 1-2: 2 x 10-fache Objektiv-Vergrößerung. 132 Ergebnisse Abb. 39: Immunhistochemische Färbung im Primitivknotenbereich des Mausembryos zum Zeitpunkt 8.0 dpc im Alter von 5 Somiten mit dem Anti-Annexin 4-Antikörper. (1a) Querschnittsaufnahme in Höhe des Knotens. (1b) Aufsicht von ventral auf den Knoten. (2a) Querschnittsaufnahme in Höhe der Somiten. (2b) Aufsicht von ventral auf die Neuralrinne. Gestrichelte und gepunktete Linien in 1a markieren das Ekto und Entoderm ein. Gepunktete Linie in 1b grenzt den Knoten ein. Gepunktete Linien in 2a und 2b grenzen den Bereich der Neuralrinne ein. D: Dorsal; V: Ventral. 1-4: 40-fache Objektiv-Vergrößerung. 133 Ergebnisse 4.4.6 Signalmoleküle 4.4.6.1 Smad 1-4 Lokalisation im frühen Mausembryo Smad-Proteine gehören zur Familie von Rezeptor-aktivierten Proteinen, die Signale von Tgf-β Superfamilie Liganden vermitteln. Abbildung 40.1 und 40.3 zeigen Übersichtsaufnahmen des Primitivknotenbereichs (Abb. 40.1) in Höhe der Somiten und Übersichtsaufnahmen des Primitivknotens (Abb. 40.3) mit deutlich stärkerem kortikalen Färbemuster von Smad 1 auf der linken Seite. Diese asymmetrischen Expressionen werden durch die Querschnittsaufnahmen in Höhe der Somiten (Abb. 40.2) und in Höhe des Primitivknotens (Abb. 40.4) bestätigt. Hier zeigt sich die überwiegend entodermale Lokalisation von Smad 1 mit leichtem Übergang ins Mesoderm und geringen Signalen im Ektoderm. In Abb. 41.1 ist die Lokalisation von Smad 2 mit einem klaren, gleichmäßigen, kortikalen Färbemuster angegeben, wobei der Primitivknoten keine Smad 2 Expression enthält. In der Querschnittsaufnahme ist Smad 2 fast ausschließlich im Entoderm exprimiert (Abb. 41.2). Dahingegen ist Smad 3 stark in der Neuralrinne und dem Primitivknoten akkumuliert (Abb. 41.3). Die Querschnittsaufnahme von Smad 3 zeigt dagegen deutliche Signale sowohl im Entoderm als auch im Mesoderm und schwächere im Ektoderm (Abb. 41.4). Immunhistochemische Färbungen mit dem Anti-Smad-4-Antikörper haben keine auswertbaren Ergebnisse gegeben (nicht angezeigt). Ergebnisse 134 R L R L 1 2 3 4 Abb. 40: Immunhistochemische Färbung mit einem Anti-Smad-1-Antikörper eines Embryos im 5-Somitenstadium. (1) Übersichtsaufnahme des Primitivknotenbereichs in Höhe der Somiten. (2) Querschnittsaufnahme in Höhe der Somiten. (3) Übersichtsaufnahme des Primitivknotens. (4) Querschnittsaufnahme des Knotens. L: Links; R: Rechts. 1-4: 40-fache ObjektivVergrößerung. 135 Ergebnisse 1 2 3 4 Abb. 41: Immunhistochemische Färbung mit einem Anti-Smad-2-Antikörper (1-2) und mit einem Anti-Smad-3-Antikörper (3-4) eines Embryos im 6-Somitenstadium. (1) Übersichtsaufnahme des Primitivknotens. (2) Querschnittsaufnahme des Primitivknotens. (3) Übersichtsaufnahme des Primitivknotens. (4) Querschnittsaufnahme des Primitivknotens. 1-4: 40-fache Objektiv-Vergrößerung. Ergebnisse 136 4.4.6.2 Nkd1 Lokalisation im frühen Mausembryo Folgende Abbildung 42 zeigt eine In-situ-Hybridisierung eines E8.0 Embryos mit einer deutlichen, asymmetrischen Expression von Nkd1 im Primitivknotenbereich zugunsten der linken Seite. Die immunhistochemische Färbung mit Anti-Nkd1Antikörpern konnte kein eindeutiges Ergebnis liefern. R 1 L 2 Abb. 42: In-situ-Hybridisierung mit asymmetrischer Expression von Nkd1 zum Zeitpunkt 8.0 dpc. (1) Übersichtsaufnahme eines Embryos mit deutlicher, asymmetrischer Expression von Nkd1 auf der linken Seite des Primitivknotens. (2) Vergrößerte Aufnahme des Primitivknotenbereiches. Gestrichelte Linie: Andeutung der Mittellinie; L: Links; R: Rechts. 1: 5-fache Objektiv-Vergrößerung; 2: 10-fache Objektiv-Vergrößerung. 137 Ergebnisse 4.4.7 p-Tyr Lokalisation im frühen Mausembryo Abbildung 43 zeigt die Fluoreszenzdetektierung von p-Tyr. Die Übersichtsaufnahme des Primitivknotens lässt ein kortikales Färbemuster erkennen, wobei die Signale auf der linken Seite des Primitivknotens erheblich stärker ausgeprägt sind als auf der rechten Seite. Im hinteren Bereich der Grubenzellen ist die Expression ebenfalls deutlicher zu sehen als im vorderen Bereich (Abb. 43.1), während in der Primitivknotengrube und in der Neuralrinne keine Signale zu detektieren sind. Abbildung 43.2 verdeutlicht hier in der Querschnittsaufnahme die alleinige Lokalisation von p-Tyr im Entoderm. 138 Ergebnisse Abb. 43: Immunhistochemische Färbung eines Embryos mit dem Anti-p-Tyr-Antikörper im 4-Somitenstadium. (1) Übersichtsaufnahme des Primitivknotens mit stärkerer Expression auf der linken Seite. (2) Querschnittsaufnahme desselben Primitivknotens mit ausschließlicher Lokalisation von p-Tyr im Entoderm. L: Links; R: Rechts. 1-2: 40-fache ObjektivVergrößerung. 139 Diskussion 5. Diskussion 5.1. Entwicklung des Primitivknotens und Differenzierung der Primitivknotenzellen Die Etablierung der Links-Rechts-Körperachse ist ein komplizierter Prozess, der im Falle einer Störung schwerwiegende Folgen für die Betroffenen haben kann. Von zentraler Bedeutung für die Etablierung der Links-Rechts-Körperachse ist eine embryonale Struktur, die bei der Maus als Primitivknoten bezeichnet wird. Die Besonderheit dieses Primitivknotens besteht darin, dass seine Zellen motile Monozilien besitzen, die aufgrund ihrer nach posterior verlagerten Struktur und ihrer Fähigkeit koordiniert zu schlagen, einen nach links gerichteten Fluss über den Primitivknoten generieren. Dieser gerichtete Flüssigkeitsstrom ist notwendig, um die hochkonservierte Nodal-Signalkaskade auf der linken Seite des Embryos zu aktivieren und so die korrekte Ausbildung der LR-Körperachse zu ermöglichen. Während über die Signaltransduktion am Primitivknoten, hierbei ist insbesondere der ventrale Anteil des Primitivknotens gemeint, und im Seitenplattenmesodern das Wissen stetig ansteigt und zunehmend Moleküle identifiziert werden, die für den Aufbau und die Motilität der Monozilien notwendig sind (BASU u. BRUECKNER 2008; LEE u. ANDERSON 2008), ist über die Entwicklung des Primitivknotens, den Aufbau der Zellen des Primitivknotens und ihre Polarität nach wie vor wenig bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass der ventrale Primitivknoten nicht an einer Stelle entsteht, sondern aus verschiedenen Zellklustern (Abb. 18.2b), die am distalen Ende des Embryos sichtbar werden. Diese Zellen besitzen eine kleine apikale Oberfläche und sind deutlich von den sie umgebenden entodermalen Zellen zu unterscheiden. Mit ihrer basalen Seite stehen sie im direkten Kontakt zu den Zellen des dorsalen Bereichs des Primitivknotens. Diese sind morphologisch nicht von den sie umgebenden ektodermalen Zellen zu unterscheiden. 140 Diskussion Die Zellkluster auf der ventralen Seite des Embryos aggregieren miteinander und der Primitivknoten bildet seine typische hufeisenförmige Form aus. Zu diesem Zeitpunkt besteht der ventrale Anteil des Primitivknotens, der einen Durchmesser von ca. 5070 µm besitzt, aus ca. 200 - 250 Grubenzellen, die von den Kronenzellen (ca. 20-30) umgeben werden (Daten übernommen von P. Pennekamp) (Abb.18, 19, 20). Diese Daten stehen im Einklang mit bereits publizierten Daten (SULIK et al. 1994; LEE u. ANDERSON 2008). Elektronenmikroskopische Untersuchungen und „Cell fate“Studien haben gezeigt, dass die Bildung des Primitivknotens, der nur für wenige Stunden beim Embryo existiert, ein mehrstufiger Prozess ist. Dieser beinhaltet die Differenzierung von Primitivknotenzellen noch unterhalb der entodermalen Schicht, die Epithelialisierung dieser Zellen und Bildung der typischen Form des Primitivknotens (LEE u. ANDERSON 2008). Völlig unklar ist jedoch der Mechanismus, der zu dieser Differenzierung und Verdrängung der entodermalen Zellen führt und welche strukturellen Änderungen (Zell-Zell-Kontakte, Zell-Matrix-Kontakte, Zytoskelett) notwendig sind. 5.2 Zilien Zilien sind hochspezialisierte Strukturen, die an der apikalen Oberfläche von Zellen vorkommen und u.a. eine wichtige Rolle in der Etablierung der LR-Asymmetrie spielen. Zilien und Flagellen wachsen durch eine Verlängerung an der Spitze (ROSENBAUM u. CHILD 1967; JOHNSON u. ROSENBAUM 1992). Da sie unfähig sind, die verschiedenen ziliären Proteine in der Zilie selbst zu synthetisieren, müssen alle Proteine, die für eine Verlängerung der Zilie notwendig sind, zur Zilienspitze transportiert werden. Dieser Transport wird durch den so genannten intraflagellaren Transport (IFT) sichergestellt. Das IFT-System wurde zuerst in den grünen Algen der Chlamydomonas durch KOZMINSKI et al. (1993) entdeckt. Durch Elektronenmikroskopie wurde das Transportsystem als makromolekulare „Flöße“ zwischen der Membran und den äußeren Mikrotubulidupletts beschrieben (KOZMINSKI et al. 1995; PAZOUR et al. 1998). Die Flöße bestehen aus verschiedenen Komponenten, die IFT-Partikel genannt werden, von denen über 15-20 Polypeptide bereits identifiziert wurden und 141 Diskussion alle für den intraflagellaren Transport notwendig sind. Alle IFT-Partikel sammeln sich um den Basalkörper herum, um zu jeder Zeit für den IFT verfügbar zu sein (ROSENBAUM u. WITMAN 2002). Alle Mikrotubuli in den Zilien sind so angeordnet, dass das Plusende an der Spitze der Organelle lokalisiert ist. Weil die Mikrotubulimotoren Teilchen nur in eine Richtung bewegen, werden zwei Typen benötigt, um einen geregelten ziliären Transport zu bewerkstelligen. Für den anterograden Transport ist Kinesin II zuständig. Kinesin II, besteht aus den zwei Motoruntereinheiten KIF3A und KIF3B und bildet zusammen mit einer Nicht-Motor-Untereinheit, dem Kinesinassoziierten Protein KAP3, das am Schwanzende von KIF3A und KIF3B bindet, ein Heterotrimer, das als KIF3 Komplex bezeichnet wird (HIROKAWA et al. 2006). Für den retrograden Transport dagegen ist der zytoplasmatische Dynein 2 Komplex zuständig. Defekte in dem Gen, das für das zytoplasmatische Dynein der leichten Kette in Chlamydomonas LC8 kodiert, resultieren in der deutlichen Verkürzung der Flagelle von 50 - 70 % der Wildtyplänge. Auch eine Mutation in IFT88, das an der Flagellen- und Zilienzusammensetzung beteiligt ist, resultiert in verkürzten Flagellen (PAZOUR et al. 2000). Mutation von murinem Tg737, einem Ortholog von IFT88, führt zur Unfähigkeit Primärzilien zu bilden (PAZOUR et al. 2000; HIROKAWA et al. 2006). Untersuchungen der Zilienlängen mit dem Rasterelektronenmikroskop (Abb. 19, 20) haben gezeigt, dass das Wachstum mit steigendem Alter bei den Wildtypembryonen annähernd linear verläuft, während das Zilienwachstum der Pkd2 Mutanten geringe Abweichungen nach oben und unten zeigt (Abb. 21). Eine Diskrepanz zwischen dem Wildtypembryo und der Pkd2 Mutanten ist im Alter von 5 Somiten zu verzeichnen. Hier sind Zilien der Pkd2 Mutanten fast 1 µm länger als die der Wildtypembryonen (Abb. 21). Allerdings kann über die Signifikanz der Diskrepanz bezüglich der Zilienlänge derzeit keine gesicherte Aussage getroffen werden, da es nicht möglich war, ausreichend homozygot Pkd2 mutante Embryonen des gleichen Entwicklungsstadiums zu erhalten und erfolgreich zu präparieren. Störungen des IFT während des Zilienaufbaus könnten den anterograden und retrograden Transport betreffen und somit zu verkürzten oder verlängerten Zilien bei den Pkd2 Mutanten im Vergleich zu den Wildtypembryonen führen. Auf der anderen Seite 142 Diskussion sieht man bei näherer Betrachtung einzelner Zilien bei Pkd2 mutanten Embryonen weder Verdickungen am apikalen noch am basalen Ende der Zilie (HUANGFU u. ANDERSON 2005; OCBINA u. ANDERSON 2008), was sicher für eine Störung des anterograden oder retrogaden Transports von Molekülen sprechen würde. Im Falle von Polycystin-1, welches bei den meisten bisher untersuchten Zelltypen mit Polycystin-2 interagiert, wurde gezeigt, dass Mutationen im PKD1-Gen, welches für Polycystin-1 codiert, die Länge primärer Zilien in Nierenepithelzellen und Cholangiozyten und damit auch die Zellpolarität negativ beeinflussen (BONNET et al. 2009). Im Falle von Pkd1 ist es jedoch zelltypspezifisch, ob die primären Zilien länger (präzystische Nierenepithelzellen des Sammeltubulus) oder kürzer (präzystische Cholangiozyten) sind, so dass eher ein subtiler Signalmechanismus, der die terminale Differenzierung der Epithelzelle anzeigt, gestört sein wird, als ein Transportprozess von Molekülen. Welcher Mechanismus dahinter verborgen ist oder wie die Auswirkungen auf die Zellfunktion exakt aussehen, ist weiterhin völlig unbekannt. Störungen der terminalen Differenzierung der Epithelzellen sind für Pkd2 ebenfalls sehr wahrscheinlich, und gute Kandidaten für weitere funktionale Analysen könnten SHH-Signaltransduktion (ASHIQUE et al. 2009) und Wnt-Signaltransduktion (HE 2008) sein, auch wenn im Falle einiger Mausmutanten gezeigt worden ist, dass primäre Zilien nicht zwingend für den kanonischen Wnt-Signaltransduktionsweg notwendig sind (OCBINA et al. 2009). Pkd2 kodiert für den Ca2+-Ionenkanal Polyzystin 2 (PC2), das bei einer Mutation beim Menschen die autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung (ADPKD) verursacht (GABOW 1993; HANAOKA et al. 2000). Mit Hilfe von Pkd2 knockout Mäusen konnte man eine Beteiligung von PC2 an der LR-Achsenentwicklung erkennen (PENNEKAMP et al. 2002). Dabei zeigen Pkd2 knockout Mäuse unter anderem rechte Lungenisomerie, zufällige Anordnung der embryonalen Drehung und Herzdrehung sowie abdominale Situs-Defekte. Es ist noch unklar, ob der Verlust des Ionenkanals PC2 (Genprodukt von Pkd2) Auswirkungen auf die Zilienbildung hat. Zumindest liegen hier keine signifikanten Unterschiede bezüglich der Zilienlänge von Wildtyp- 143 Diskussion embryonen und Pkd2 mutanten Embryonen vor, die den Phänotyp der Pkd2 knockout Mäuse erklären könnten. Die in der vorliegenden Arbeit nachgewiesene Zilienmotilität und Richtung des Flüssigkeitsstroms über den Primitivknoten bei Wildtyp- und Pkd2 mutanten Embryonen entspricht den bisher publizierten Werten (NONAKA et al. 2002), und die regelgerechte Positionierung der Zilien bei Pkd2 Mutanten Embryonen macht einen Einfluss von Pkd2 auf die planare Zellpolarität am Primitivknoten (HASHIMOTO et al. 2010) derzeit unwahrscheinlich. Detaillierte Untersuchungen haben gezeigt, dass Monozilien nicht nur im Primitivknoten, sondern auch außerhalb des Primitivknotens vorhanden sind (Abb.: 24.3, 24.4 und 24.5c) (LEE u. ANDERSON 2008). Ob diese mit Monozilien besetzten Zellen zur Bildung des Primitivknotens beitragen oder diese Zilien als Sensoren (chemosensorisch, mechanosensorisch) für extraembryonale Signale fungieren, ist derzeit noch ungeklärt. 144 Diskussion 5.3 Immunhistochemische Nachweise Da bis dato noch keine umfassende Analyse über die Entwicklung und Struktur des Primitivknotens der Maus sowie den Aufbau der hoch polarisierten Primitivknotenzellen bestehen, sollten die durchgeführten immunhistochemischen Untersuchungen des Primitivknotens der Mäuse im Alter von 7.5 - 8.5 dpc (frühes Primitivstreifenstadium bis 8 Somitenstadium) einen Einblick in das Expressionsprofil und die Lokalisation verschiedener Zellpolaritätsmarker bringen. Die im Rahmen dieser Studie erhobenen Befunde werden im Folgenden mit bisherigen Erkenntnissen verglichen und deren mögliche Bedeutung im Hinblick auf Mechanismen, die zu einer fehlerhaften Körperachsenentwicklung und zu nachfolgend massiven kongenitalen Herzdefekten führen, diskutiert. 145 Diskussion 5.3.1 Tight Junction 5.3.1.1 Claudine 1-5 Studien über die Expression und Lokalisation der Claudine 1 bis 5 haben gezeigt, dass Expressionsmuster der Claudine zwischen den Geweben beträchtlich variieren, und einige Claudine ubiquitär aktiv sind, während andere zeitlich begrenzt nur bei der Embryogenese exprimiert werden (vgl. Tab.1) (FURUSE et al. 1998; MORITA et al. 1999; TSUKITA et al. 2001). Im Alter von E7.5 bis E9.0 existieren meines Wissens nach nur Expressionsdaten von Claudin 4, die mittels In-situ-Hybridisierungen an Gesamtembryonen generiert worden sind (TAMPLIN et al. 2008). In dieser Arbeit von TAMPLIN et al. (2008) wurde gezeigt, dass Claudin 4 zum Zeitpunkt E7.25 zunächst im vorderen definitiven Entoderm und in den extraembryonalen Regionen exprimiert wird, anschließend (E7.75) in den Vorderdarmtaschen, im lateralen definitiven Entoderm und in den extraembryonalen Regionen und zum Zeitpunkt E8.5 bis E9.0 im Darmentoderm und den Ohrbläschen. Die in der vorliegenden Arbeit auf Proteinebene durchgeführten Analysen zur Claudin-Expression und Lokalisation mit den Anti-Claudin 1-5-Antikörpern haben gezeigt, dass trotz vielfältiger Optimierungsversuche keine Claudine 1, 2 und 3 im frühen Mausembryo nachgewiesen werden können, wie es auch die fehlenden Expressionsdaten zu Claudin 1-3 in der Literatur vermuten lassen. Die Ursachen für den nicht möglichen Nachweis von Claudin 1-3 könnten jedoch auch in der Verwendung ungeeigneter Antikörper und Färbeverfahren liegen. Wahrscheinlicher ist jedoch, dass diese Claudine in diesem Entwicklungsstadium keine Rolle spielen. Im Gegensatz dazu konnten nicht nur Claudin 4, sondern auch erstmalig Claudin 5 im Primitivknoten in diesem frühen Embryonalstadium und in einigen, dem Primitivknoten direkt benachbart liegenden entodermalen Zellen nachgewiesen werden (vgl. Abb. 26.1a-b, 2). Claudin 4 lag dabei im Primitivknoten internalisiert vor und nicht an den Tight junctions. Auffallend war als interessanter Nebenbefund die Lokalisation 146 Diskussion von Claudin 4 im Herzfeld des Embryos am E8.0 (vgl. Abb. 26.1c) die im internationalem Schriftum bislang nicht beschrieben wurde. Im Hinblick auf Claudin 4 konnten die Expressionsdaten von TAMPLIN et al. (2008) durch die vorliegenden Ergebnisse bestätigt und durch die subzelluläre Lokalisation von Claudin 4 im Knoten erweitert werden. Welche Funktion Claudin 4 jedoch während der Embryogenese ausübt, bleibt derzeit weiterhin unklar. Analysen insbesondere zur Bedeutung von Claudin 4 im Herzfeld sollten durch weitere Versuche ausgeweitet werden. Bezüglich Claudin 5 konnte in dieser Arbeit erstmals eine Lokalisation im frühen Embryonalstadium (E7.5) nachgewiesen werden. Ein Funktionsverlust von Claudin-5 während der Embryogenese resultiert in einer Störung der Größenselektion bei der Passage der Blut-Hirnschranke, so dass diese für Moleküle mit einer molekularen Masse von bis zu 800 Dalton durchlässig wird. Zugrunde liegt daher ein endothelialer Defekt und neugeborene Mäuse versterben innerhalb von 10 Stunden nach der Geburt (NITTA et al. 2003). Welche Funktion Claudin 5 jedoch am Knoten ausüben könnte, ist derzeit noch unklar. Allerdings zeigt die Arbeitsgruppe von YAMAGISHI et al. (2010), dass Claudin 5 in der frühen Entwicklung des Herzens im Xenopus exprimiert wird. Es wird vermutet, dass Claudin 5 dort für die Herzbildung mittels Epithelialisierung des präkardialen Mesoderm eine Rolle spielt. Auch SANFORD et al. (2005) haben gezeigt, dass Claudin 5 in den Herzmuskeln und an den lateralen Membranen der Kardiomyozyten in Mäusen lokalisiert ist. Da zumindest 24 verschiedene Claudine indentifiziert wurden (FURUSE u. TSUKITA 2006), könnte es zu Redundanzen unter den funktionalen Rollen der Claudinproteine kommen, wodurch womöglich auch die Lokalisation von Claudin 4 erklärt werden könnte. 5.3.1.2 JAM-A JAM-A bildet zusammen mit den Claudinen und Occludin die TJs (FURUSE et al. 1998; TSUKITA et al. 2001). Man vermutet, dass JAM-A über seine zytoplasmatische Domäne direkt mit den TJ-assoziierten Proteinen wie Zo-1 in Kontakt tritt (BAZZONI et al. 2000) und über seine extrazelluläre Domäne mit Leukozyten assoziiert (EBNET et al. 2004). Somit besitzt JAM-A eine duale Funktion, zum einen als Adhäsionsgrundlage zwischen den Zell-Zell-Kontakten, zum anderen in der Entzün- 147 Diskussion dung während der Leukozytenmigration (MARTIN-PADURA et al. 1998; BAZZONI 2003). Die hier durchgeführten immunhistochemischen Untersuchungen geben einen Einblick in die Lokalisation von JAM-A im Mausembryo. Dabei stimmen die JAM-AExpressionen im Entoderm (vgl. 28.3a) mit den Ergebnissen von PARRIS et al. überein (PARRIS et al. 2005). In diesem Fall wurden ebenfalls schwächere Lokalisationen von JAM-A im Ektoderm beobachtet (Daten nicht angezeigt), während im Mesoderm von Wildtypembryonen kein JAM-A nachweisbar ist (Abb 28a). Im Gegensatz dazu zeigt JAM-A bei Pkd2 mutanten Embryonen ein deutlich diffuseres Verteilungsmuster innerhalb der Zellen wie auch eine Lokalisation im Mesoderm (Abb. 28.3b). Welche Ursache die allgemein diffusere Expression von JAM-A bei Pkd2 mutanten Embryonen sowohl im Dottersack (Abb. 28.1b) als auch im Knoten (Abb. 28.2b und 3b) und die Expression von JAM-A im Mesoderm hat, bleibt noch offen. Das Resultat sollte jedoch eine veränderte Eigenschaft der TJs, nämlich entweder eine verminderte oder erhöhte Durchlässigkeit für Moleküle sein, und möglicherweise ist JAM-A an der fehlerhaften und durchlässigen Gefäßwandbildung bei Pkd2-knockout Mäusen beteiligt, was sich in fokalen Blutungen und Austritt von Erythrozyten in benachbartes Gewebe bei homozygot mutanten Mäusen äußert. 5.3.1.3 PAR-3 und PAR-6 PAR-3 und PAR-6 bilden zusammen mit der aPKC einen dreigliedrigen PAR-3aPKC-PAR-6 Komplex der die Entwicklung der TJs unterstützt und zur Bildung und Erhaltung der Zellpolarität beiträgt (SHIN et al. 2006; SUZUKI u. OHNO 2006; EBNET et al. 2008). In der hier vorliegenden Arbeit konnten weder für PAR-3 noch für PAR-6 eindeutige und aussagekräftige Ergebnisse erzielt werden. Die Ursache liegt in beiden Fällen wahrscheinlich darin, dass die hier verwendeten Antikörper nicht geeignet waren. Mindestens im Fall von PAR-3 wäre ein spezifischer und wiederholbarer Nachweis zu erwarten gewesen, da PAR-3 bereits in Prä-Implantationsstadien exprimiert wird, an TJs lokalisiert ist und mittels Northern-Blot-Analysen bereits in Post- 148 Diskussion Implantationsstadien ab E7.0 nachgewiesen werden konnte (MANABE et al. 2002; PLUSA et al. 2005). Dass PAR-3 eine bedeutende Rolle während der Embryogenese spielt, wird auch am Phänotyp homozygot PAR-3-mutanter Mäuse deutlich: Sie versterben pränatal ca. um E12.5 und zeigen Wachstumsretardierung, eine abnormale Herzentwicklung und ungewöhnliche epikardiale Zellentwicklung (HIROSE et al. 2006). Für PAR-6 sind bisher keine vergleichbaren Daten bei Mausembryonen publiziert worden. 5.3.1.4 Zo-1 Zo-1 stellt über intramembranäre TJ Proteine (Occludin, Claudin, JAM) eine Verbindung zu den Nachbarzellen her (FURUSE et al. 1993; ANDERSON u. VAN ITALLIE 1999) und kommt auf der zytoplasmatischen Seite der TJs vor (STEVENSON et al. 1986; 1988). Es ist erstmalig im 8-Zellstadium exprimiert und dort zusammen mit β-Catenin und α-Catenin kolokalisiert. Insgesamt verschiebt sich die Expression von Zo-1 bis zur frühen Blastozyste immer weiter nach apikal an die sich bildenden TJs. Im 32-Zellstadium (frühe Blastozyste) ist Zo-1 vorwiegend mit Cingulin und Occludin kolokalisiert (SHETH et al. 2000). Eindeutig festzuhalten ist, dass das deutliche Ringmuster von Zo-1 auch im Blastozystenstadium auftritt (SHETH et al. 2000; STRUMPF et al. 2005). In der vorliegenden Arbeit konnte ZO-1 sowohl in den TJs des Entoderms, des Ektoderms als auch des Dottersacks gezeigt werden (Abb. 29.1. und 29.2.) was den bisher publizierten Daten entspricht. Zusätzlich war ZO-1 auch punktuell innerhalb der Zellen zu sehen und durchgängig auch punktförmig im Mesoderm (Abb. 29.3). ZO-1 wurde zusammen mit β-Catenin als „shuttle“-Moleküle beschrieben, welche eine Rolle während der mit TumorInvasion assoziierten EMT spielen. Man geht derzeit davon aus, dass die Lokalisation von ZO-1 abhängig vom Differenzierungs- und Migrationsstatus epithelialer Zellen ist (POLETTE et al. 2007). Welche Rolle ZO-1 jedoch bei der Bildung und Differenzierung des embryonalen Mesoderms spielt, ist derzeit noch unklar. Homozygot ZO-1-mutante Embryonen versterben vor E11.5 und zeigen ab E8.5 eine verzögerte 149 Diskussion Entwicklung. Auffällig sind eine massive Apoptose im Notochord, dem Neuralrohr und der Allantois und Gefäßentwicklungsstörungen im Dottersack (KATSUNO et al. 2008). 5.3.1.5 β-Catenin Das zu den AJs gerechnete β-Catenin fungiert in der Zelle nicht nur als Ankermolekül für Kalzium-abhängige Cadherine (GUMBINER 1995; ABERLE et al. 1996; ABERLE et al. 1997; MULLER et al. 2002), sondern spielt zusammen mit seiner phosphorilierten Form eine wichtige Rolle im Wnt/Signaltransduktionsweg (GUMBINER 1995; MULLER et al. 2002; POLETTE et al. 2007). β-Catenin wird bereits im frühen Mausembryo im Ekto- und Entoderm exprimiert und β-Catenin-Knockout-Mäuse versterben pränatal (ca. E7.5), bilden kein Mesoderm aus und zeigen anterior-posteriore Entwicklungsdefekte (HUELSKEN et al. 2000; MORKEL et al. 2003). Die in dieser Arbeit vorgestellten immunhistochemischen Analysen von β-Catenin zeigen, dass β-Catenin in diesen Entwicklungsstadien bei Wildtypembryonen vor allem an den Zell-Zell-Kontakten lokalisiert ist (Abb. 30.1a, 2a, 3a) und sich vor allem in der apikalen Hälfte der Zellen befindet (Abb. 30.2a). Immunfluoreszenzfärbungen mit einem Anti-Phospho-β-Catenin-Antikörper zeigten keine aussagekräftigen Ergebnisse, was wahrscheinlich auf die Verwendung eines ungeeigneten Antikörpers zurückzuführen ist. Bei Pkd2 mutanten Embryonen erscheint das β-Catenin-Muster deutlich diffuser (Abb. 30.1b, 2b, 3b). Zusätzlich ist β-Catenin gleichmäßig über den gesamten lateralen Zell-Zell-Kontakt verteilt und es erscheint auch quantitativ mehr β-Catenin in den Zellen vorhanden zu sein als beim Wildtyp. Die stärkere β-Catenin Expression beim Pkd2 mutanten Embryo deckt sich mit der stärkeren Expression bei Pkd2 mutanten Nierenepithelzellen und höheren Transkriptionsleveln sowohl in der TranskriptAnalyse als auch im Western Blot, was im Rahmen der Diplomarbeit von 150 Diskussion WINTERSTETTER (2006) im Institut für Humangenetik Münster nachgewiesen werden konnte. Daher liegt die Vermutung nahe, dass β-Catenin zum einen im Rahmen der Achsenentwicklung und zum anderen auch im Rahmen der Zystenentwicklung in den Nieren von Pkd2 mutanten Embryonen stromabwärts von Pkd2 eine Rolle spielt. Auffallend war in der weiteren Analyse, dass β-Catenin eine asymmetrische Verteilung zugunsten der linken Seite zeigt. Die Ursache und auch die Folge dieser stärkeren Expression auf der linken Seite, die im 0-Somitenstadium am stärksten ausgeprägt ist und mit zunehmendem Alter insgesamt schwächer wird (Abb. 32), ist noch unklar. 5.3.2.2 E-Cadherin E-Cadherin wird zu den AJs gerechnet (TANEYHILL 2008; HULPIAU u. VAN ROY 2009) und wird vorwiegend in den Epithelien an den AJs der aneinander grenzenden Zellen exprimiert, wo es für die epitheliale Zell-Zell-Adhäsion und für die Aufrechterhaltung des Zytoskeletts von großer Bedeutung ist (NOSE et al. 1988; TAKEICHI 1991; YAP et al. 1997; TANEYHILL 2008). E-Cadherin spielt auch bei der EMT eine Rolle, bei der Epithelzellen während der Embryonalentwicklung mesenchymale Eigenschaften erlangen, indem E-Cadherin herunterreguliert wird (PLA et al. 2001). E-Cadherin wird bereits im 2-Zellstadium an den Zell-Zell-Kontakten lokalisiert (HARROUK et al. 2000) und E-Cadherin Knockout-Embryonen versterben bereits im Präimplantationsstadium (RIETHMACHER et al. 1995). Der Nachweis von E-Cadherin beim Mausembryo ergab das bekannte kortikale Expressionsmuster, das sowohl beim Wildtypembryo (Abb. 33.1a), als auch beim Pkd2 mutanten Embryo (Abb. 33.1b) detektiert wurde. Schwache bis keine Signale konnten sowohl im Mesoderm von Wildtypembryonen als auch von Pkd2 mutanten Embryonen detektiert werden (Abb. 33.2a, 33.2b, 31.3). Auffallenderweise differierte die Topographie des E-Cadherin Signals in der Querschnittsaufnahme des Primitivknotens beim Wildtypembryo zu den Befunden bei der Pkd2 Mutante. Während beim Embryo des Wildtyps E-Cadherin in der Primitivkno- 151 Diskussion tengrube stärker nachzuweisen ist als im benachbarten Entoderm (Abb. 33.2a), erscheint E-cadherin beim Pkd2 mutanten Embryo gleichmäßig über die ventrale Seite des Embryos verteilt. (Abb. 33.2b). Für Pkd1, den Interaktionspartner von Pkd2, wurde gezeigt, dass das Genprodukt Polycystin-1 mit E-Cadherin interagiert (HUAN u. VAN ADELSBERG 1999; ROITBAK et al. 2004) und dass der Funktionsverlust von Pkd1 zu einer Depletion von E-Cadherin an den Zell-Zell-Kontakten führt. Vergleichbare Ergebnisse für Pkd2 mutante Nierenepithelzellen wurden in der Diplomarbeit von WINTERSTETTER (2006) ebenfalls gezeigt, so dass E-Cadherin wie β-Catenin offensichtlich ein von Pkd2 direkt oder indirekt reguliertes Protein darstellt. 5.3.2.3 N-Cadherin N-Cadherin gehört wie E-Cadherin zu den AJs (TANEYHILL 2008) und trägt zum einen zur extrazellulären Adhäsion bei, zum Anderen hat N-Cadherin auch eine entscheidende Funktion im cadherin-switch bei der EMT, bei der E-Cadherin herunterreguliert und durch N-Cadherin ersetzt wird (MAEDA et al. 2005). N-Cadherin zeigt ein kortikales Expressionsmuster mit entodermaler und ektodermaler Lokalisation, jedoch keinerlei Expression im Mesoderm (Abb. 34.1-3). Im Unterschied zu E-Cadherin ist N-Cadherin sowohl im Primitivknoten als auch im Entoderm schwächer ausgeprägt (Abb. 34.2-3), jedoch konnten vereinzelt N-Cadherin Signale in der Primitivknotengrube nachgewiesen werden. Im Ektoderm zeigt N-Cadherin eine eher basale Verteilung innerhalb der Zellen, was im Gegensatz zu der ektodermalen Verteilung von E-Cadherin steht (Abb. 34.3). Dieses umgekehrte Expressionsverhalten von E-Cadherin (Abb. 34.4) und N-Cadherin (Abb. 34.3) in der Ektodermschicht könnte mit dem cadherin-switch bei der EMT während der Embryonalentwicklung zusammenhängen. Bei diesem Vorgang findet eine Reorganisation des Zytoskeletts statt, bei der die Zell-Zell-Kontakte unterbrochen werden und eine erhöhte Motilität der Zellen erfolgt, die sich ehemals im Zellverband befanden. E-Cadherin wird dabei normalerweise herunterreguliert und durch N-Cadherin ersetzt 152 Diskussion (MAEDA et al. 2005). Da die Embryonalentwicklung in diesem Entwicklungsstadium jedoch ein sehr zügiger Prozess ist, könnte man durchaus annehmen, dass die „Aufgaben“ von E-Cadherin und N-Cadherin in diesem Fall durch Lokalisation und nicht durch Expression reguliert und gesteuert werden. Expressionsanalysen haben gezeigt, dass N-Cadherin im Neuroepithel und in der apikalen Neuralplatte von E8.5 Wildtypembryonen angereichert ist (RADICE et al. 1997; LEE et al. 2007). Der komplette Funktionsversust von N-Cadherin resultiert in Letalität am E10. Mutante Embryonen besitzen einige Entwicklungsstörungen wie Wachstumsretardierung, vergrößertes Herz, aufgetriebene Perikardbeutel, fehlerhafte Herzschläuche, wellenförmige Neuralrohre, unregelmäßige Somitenform und eine abnormale Embryonaldrehung (RADICE et al. 1997), so dass der Einfluss von N-Cadherin auf die Embryonalentwicklung weitreichend ist. Interessanterweise konnte beim Hühnchen gezeigt werden, dass N-Cadherin für die korrekte Ausbildung der Links-Rechts-Körperachse notwendig ist (GARCIA-CASTRO et al. 2000), so dass im Falle von N-Cadherin weitere Lokalisationsanalysen als auch funktionale Analysen oder auch eine erneute Charakterisierung der N-Cadherin-Mausmutanten erforderlich sein könnten. 153 Diskussion 5.3.3 Fokale Adäsionen 5.3.3.2 p-Pax Paxillin ist an den fokalen Adhäsionskomplexen lokalisiert, fungiert als Ankerprotein für die Bindung der Aktinstressfasern und wird nach Wachstumsfaktor-Stimulation oder Integrin vermittelter Aktivierung phosphoriliert (TURNER et al. 1990; BROWN u. TURNER 2004). Die Arbeitsgruppe von HAGEL et al. (2002) hat mit Hilfe von X-Gal-Färbungen verschiedener Embryonalstadien die Expression von Paxillin untersucht. Auf diese Weise wurde Paxillin bei E7.5-Embryonen vor allem in der extraembryonalen Region nachgewiesen. Eine Schnittdarstellung eines gefärbten E7.5 zeigte Färbungen im ektoplazentaren Kegel, im Chorion, in der Allantois und im Amnion. Expressionen im E8.5 sind in vielen Strukturen, inklusive der vom Mesoderm abstammenden Komponenten wie der der Kopffalte, der Chorda dorsalis und dem Herzen detektiert. X-Gal gefärbte Embryonen im E8.5 zeigen an, dass die Expression in dem darunterliegenden Kopfmesenchym, aber nicht im Neuralrohr zu beobachten ist. Homozygote mutante Mäuse sterben am E9.5 mit Defekten, die Amnion, Allantois und Kopfstrukturen betreffen, sowie beeinträchtigtes Wachstum und abnormale Herz- und Somitenentwicklung. Mutante Fibroblasten zeigen abweichende Fibronectin-regulierte fokale Adhäsionsbewegungen und fehlorganisierte Membranzytoskelettstrukturen (HAGEL et al. 2002). Die hier vorliegenden Untersuchungsergebnisse mit einem Anti-p-Pax-Antikörper haben ergeben, dass p-Pax auf der linken Seite des Primitivknotens ein kortikales Expressionsverhalten aufweist, während auf der rechten Seite eher ein punktförmiges Muster zu erkennen ist (Abb. 36.1). Dieses Muster spricht für eine asymmetrische Aktivierung von Paxillin und eine seitenspezifische Lokalisation von p-Pax. P-Pax ist im Bereich des Primitivstreifens verstärkt nachweisbar, während p-Pax im Primitivknoten und in der Neuralrinne nur punktuell zu sehen ist (Abb.36.1). Die stärkere Expression auf der linken Seite wird durch die rainbow-Aufnahme und die Querschnittsaufnahme des Primitivknotens mit überwiegender entodermaler und schwacher mesodermaler Lokalisation bestätigt (Abb. 36.2-3). Weitere Analysen sollten 154 Diskussion erfolgen, um die Rolle von Paxillin und dessen Phosphorilierung während der Embryonalentwicklung weiter zu definieren. 5.3.4.1 Annexin 2, 4 und 6 Annexine sind Kalzium-abhängige und Phospholipid-bindende Proteine, die ubiquitär an intrazellulären und membranassoziierten Prozessen, wie z.B. der Endo- und Exozytose beteiligt sind (aus Mouse Genome Informatics; GERKE u. MOSS 2002; MOSS u. MORGAN 2004; GERKE et al. 2005). Annexin 2 wurde in dieser Arbeit sowohl am Primitivknotenrand (Abb. 37.1a) als auch in der Primitivknotengrube (Abb. 37.1b) internalisiert vorgefunden. Expressionsanalysen bezüglich Annexin 2 tauchen in der Literatur erst ab E13.0 auf, die mit Hilfe von In-situ-Hybridisierungen generiert wurden (EASTERDAY et al. 2003). Annexin 6 wurde wie auch Annexin 2 im Primitivknoten internalisiert vorgefunden und zeigt zusätzlich eine ausgeprägte Expression in der entodermalen Epithelschicht. Dabei sind im Entoderm zum einen kortikale Muster mit Lokalisation von Annexin 6 an den Zell-Zell-Kontakten und zum anderen Lokalisationen von Annexin 6 innerhalb einiger Zellen zu sehen (Abb. 37.3b). Dagegen zeigte eine Western Blot-Studie über Annexin 6 auf, dass Annexin 6 erst ab E 12.5 im Gaumen der Maus auftritt (CHEPENIK et al. 1995). Zusätzlich treten sowohl Annexin 2 als auch Annexin 6 spezifisch im Herzfeld auf (Abb. 38.1 und 38.2). Die Verteilung des Annexin 4 Signals im eigenen Untersuchungsmaterial ähnelt zum Teil den Ergebnissen der Arbeitsgruppe von HEMRE et al. (1996). HEMRE et al. stellten keine Expression im ZNS oder der Chorda dorsalis eines E7.5 oder E8.0 Embryos fest. Erst ab E8.5 wurde eine schwache Färbung von Annexin 6 in der Chorda dorsalis (Entoderm) bzw. der notochordalen Platte (Ektoderm) entdeckt, die sich im älter werdenden Embryo verstärkt. Im E9.5 steigt die Intensität von Annexin 4 in den Zellen der Chorda dorsalis drastisch an, welche noch in Kontakt mit der sich entwickelnden Bodenplatte stehen (HEMRE et al. 1996). Annexin 4 ist in den vorliegenden Ergebnissen ebenfalls verstärkt im Entoderm lokalisiert, während im Ektoderm die Annexin 4 Signale deutlich schwächer sind (Abb. 39.1a, 39.2a) und im Mesoderm keine Lokali- Diskussion 155 sation von Annexin 4 zu vermerken ist. Insgesamt zeigt Annexin 4 wie auch Annexin 6 im Entoderm ein kortikales Expressionsmuster, wobei das Expressionsprofil im Primitivknoten eher punktuell erscheint. Warum gerade im Primitivknoten dieses kortikale Expressionsmuster fehlt, ist derzeit unklar. Homozygote Mäuse, die Unterbrechungen in dem Annexin 2 Gen zeigen, sind lebensfähig und fruchtbar, aber leiden unter Wachstumsdefiziten, beeinträchtigter Angiogenese und gesteigerter Anfälligkeit für Thrombose (LING et al. 2004). Annexin 6 Knockout-Mäuse zeigen keinen pathologischen Phänotyp, sowohl die immunologische, als auch die kardiovaskuläre Funktion sind normal entwickelt (HAWKINS et al. 1999). Über einen Funktionsverlust von Annexin 4 ist nichts bekannt. Da Annexin 6 jedoch im frühen Mausembryo spezifisch exprimiert wird, wäre es denkbar, dass seine Funktion von einem anderen Annexin kompensiert wird. Es wäre interessant, dieses durch entsprechende Expressionsanalysen in Annexin 6-Knockout Mäusen und durch Kreuzungsexperimente zu analysieren. 5.3.5 Signalmoleküle 5.3.5.1 Immunhistochemischer Nachweis von Smad 1-4 Die Smad Proteine gehören zu einer Familie von Rezeptor-aktivierten Proteinen, die Signale von TGF-β Superfamilie Liganden vermitteln (HUANG et al. 2000; WEINSTEIN et al. 2000). Immunhistochemische Färbungen mit dem Anti-Smad 1Antikörper haben eine deutlich asymmetrische Expression zugunsten der linken Seite des Primitivknotens gezeigt (Abb. 40.1 und 40.3), die durch die Querschnittsaufnahmen in Höhe der Somiten und des Primitivknotens bestätigt wurden (Abb. 40.2 und 40.4). Mittels der Querschnittsaufnahmen (Abb. 40.2 und 40.4) konnte eine eindeutige entodermale Lokalisation von Smad 1 mit schwachem Übergang ins Mesoderm und geringen Signalen im Ektoderm detektiert werden. Eine andere In-situ-Hybridisierungsstudie zu Smad 1 zeigt dagegen, dass Smad 1 mRNA im frühen Kopffaltenstadium stark im Primitivstreifen, lateralen Mesoderm und vordersten präkardialen Mesoderm exprimiert ist (WALDRIP et al. 1998). Homozygote Smad 1 156 Diskussion mutante Embryonen besitzen eine beeinträchtigte Bildung der Allantois, da die Verbindung zur Plazenta nicht möglich ist. Die betroffenen Mausembryonen sterben um den E10.5 (TREMBLAY et al. 2001). Die topographische Verteilung des Smad 2 Signales zeigt ein klares kortikales Expressionsmuster, wobei der Primitivknoten frei von Smad 2 ist (Abb. 41.1). Smad 2 ist überwiegend nur im Entoderm des Embryos nachweisbar (Abb. 41.2). Die Arbeitsgruppe von WALDRIP et al. (1998) zeigt eine ubiquitäre Expression von Smad 2 mRNA sowohl im embryonalen als auch im extraembryonalen Gewebe früher Postimplantationsstadien. Homozygote Smad 2 Mutanten sterben bereits am E6.5 - 8.5 mit mehrfachen Defekten: Mangelhafte Gastrulation, Fehlen des Mesoderms, Fehlbildung des viszeralen Entoderms und Ausfall der Bildung der anteriorposterioren Achse. Heterozygot mutante Embryonen zeigen Gastrulationsdefekte und Fehlen der Mandibeln oder der Augen (WEINSTEIN et al. 1998). Das Expressionsmuster von Smad 3 zeichnet sich durch ein eher punktförmiges Färbemuster aus, wobei die akkumulierte Expression im Primitivknoten und in der Neuralrinne hier besonders auffallend ist (Abb. 41.3). Die Querschnittsaufnahme beweist eine überwiegend entodermale und mesodermale Expression mit geringeren Signalen im Ektoderm. Smad 3 homozygot mutante Embryonen besitzen eine verringerte Schleimhautimmunität, chronische intestinale Entzündungen (gelegentlich mit Adenokarzinom im Kolon), Missbildungen der Vordergliedmaßen, reduzierte Mineralisierung des Zahnschmelzes, beeinträchtigtes Wachstum der Eierstocksfollikel und Entwicklung von Osteoarthritis. TREMBLAY et al. (2000) hat durch whole mount insitu-Hybridisierungsversuche gezeigt, dass Smad 3 mRNA räumlich begrenzt exprimiert wird. Die Smad 3 Expression ist zum Zeitpunkt E5.5 auf das extraembryonale Ektoderm begrenzt. Im späten Primitvstreifenstadium ist Smad 3 im embryonalen und extraembryonalen Mesoderm nachweisbar sowie im definitiven Entoderm und in der extraembryonalen Ektodermkomponente des Chorions. In der hier vorliegenden Arbeit konnten für Smad 4 keine eindeutigen und aussagekräftigen Ergebnisse erhalten werden. Die Ursache liegt vermutlich darin, dass der hier verwendete Antikörper nicht geeignet war. Im Fall von Smad 4 wäre ein spezifischer und wiederholbarer Nachweis von Smad 4 zu erwarten gewesen, da bereits im 157 Diskussion E7.5 Embryo mittels Northern Blot (SIRARD et al. 1998) und RT-PCR (KO et al. 1998) Smad 4 detektiert wurde. Smad 4 homozygote Mutanten sterben bereits um den E7.0. Heterozygote Mausmutanten zeichnen sich dagegen durch Polypenbildung des Magens und des Duodenums aus (TAKAKU et al. 1998). 5.3.5.2 Nachweis von Nkd1 Nkd1 gehört zur Nkd Familie und besitzt wichtige Funktionen sowohl im WntSignalweg (KATOH 2001; WHARTON et al. 2001; YAN et al. 2001; ZHANG et al. 2007) als auch im JNK-Weg (YAN et al. 2001) und in der Spermatogenese (WHARTON et al. 2001; YAN et al. 2001; LI et al. 2005). Da mit dem Anti-Nkd1Antikörper keine auswertbaren Ergebnisse generiert werden konnten, wurde eine Insitu-Hybridisierung durchgeführt, bei der festgestellt wurde, dass Nkd1 asymmetrisch zugunsten der linken Seite beim Mausembryo im E8.0 exprimiert wird (Abb. 42.1. und 42.2). Dieses Expressionsmuster könnte auf eine Funktion von Nkd1 in der frühen Embryonalentwicklung hinweisen. Eine andere Studie zeigt zudem, dass eine Nkd1 Transkription zuerst im zentralen Nervensystem und im präsomitischen Mesoderm von 8.5 dpc Embryonen gefunden wurde (ISHIKAWA et al. 2004). Homozgote Mutanten weisen nur eine reduzierte männliche Fertilität mit Oligospermie, kleinen Hoden und kleinen Samenleitern auf und mutante Mausembryonen, die sowohl Nkd1, als auch Nkd2 betreffen, zeigen keine wesentlichen Beeinträchtigungen (LI et al. 2005; ZHANG et al. 2007). 5.3.6 Immunhistochemischer Nachweis von p-Tyr Phosphoriliertes Tyrosin spielt eine entscheidende Rolle in der Signaltransduktion, indem es viele biologische Prozesse inklusive der Zellproliferation, Differenzierung und Beweglichkeit reguliert (NANDI u. BANERJEE 1995; GEIGER u. BERSHADSKY 2001; NOLLAU u. MAYER 2001). Mit Hilfe von immunhistochemischen Analysen wurde ein kortikales Färbemuster mit stärkeren Signalen auf der linken Seite des Primitivknotens festgestellt (Abb. 43.1). Primitivknoten und Neuralrinne sind dagegen 158 Diskussion frei von phosphorylierten Tyrosin-Resten. Die Querschnittsaufnahme lokalisiert p-Tyr ausschließlich im Entoderm. Diese Analysen zeigen, dass auf der linken Seite des Embryos offensichtlich eine erhöhte Tyrosin-Kinase-Aktivität zu verzeichnen ist. Weitere Studien zur p-Tyr Expression sind derzeit nicht bekannt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Analyseergebnisse dieser Arbeit sowohl bereits bekannte als auch neue Erkenntnisse in Bezug auf die Darstellung der Entwicklung des Primitivknotens der Maus inklusive der Zell-Zell- und Zell-MatrixKontakte aufzeigt. Mit diesen Daten kann dazu beigetragen werden, die Funktion des Primitivknotens weiter zu definieren und somit eine solide Grundlage für funktionale Untersuchungen zu bilden, um pathologische Prozesse zu erkennen und die Mechanismen zu verstehen, die zu einer fehlerhaften Körperachsenentwicklung führen. 159 Zusammenfassung 6. Zusammenfassung Entwicklung und Struktur des Primitivknotens der Maus Nadia Koo (2012) Ziel dieser Arbeit ist es zum einen die strukturelle Entwicklung des Primitivknotens nachzuvollziehen und zum anderen den Aufbau der hoch polarisierten Primitivknotenzellen zu beschreiben. Nach derzeitigem Wissensstand ist die Struktur und Funktion des Primitivknotens bei der Maus ausschlaggebend für den Bruch der bilateralen Symmetrie während der Links-Rechts-Achsenentwicklung, der zu einem der wichtigsten Schritte in der Körperachsenentwicklung zählt. Über die Entwicklung und den exakten Aufbau des Primitivknotens ist bislang jedoch noch sehr wenig bekannt. Zur Darstellung der frühembryonalen Entwicklung des Primitivknotens erfolgten die Analysen mittels verschiedener Methoden. Hierzu wurden immunhistochemische und elektronenmikroskopische Analysen sowie In-situ-Hybridisierungen durchgeführt, Semidünnschnitte hergestellt und Videoaufnahmen von Primitivknotenzilien erstellt. Das Untersuchungsmaterial hierfür bestand aus E7.5 bis E8.0 Embryonen von CD1Wildtyp Mäusen. Für die immunhistochemischen Untersuchungen wurden charakteristische Zellpolaritätsmarker verwendet. Bezüglich der Entwicklung des Primitivknotens konnte bestätigt werden, dass der Primitivknoten nicht aus einem Ursprung entsteht, sondern aus verschiedenen Zellklustern hervorgeht, die danach miteinander „verschmelzen“ und den typischen hufeisenförmigen Primitivknoten bilden. Mittels elektronenmikroskopischer Untersuchungen der Zilienlängen wurde ein mit steigendem Alter bei den Wildtypembryonen annähernd linear verlaufendes Zilienwachstum festgestellt. Die mittels Videomikroskopie erstellten Ergebnisse über die von mir nachgewiesene Zilienmotilität und Richtung des Flüssigkeitsstroms über den Primitivknoten bei Wildtypembryonen entsprechen der bekannten Literatur. 160 Zusammenfassung Immunhistochemische Ergebnisse: 1. Dass Monozilien außerhalb des Primitivknotens vorhanden sind, deren Funktion derzeit völlig unbekannt ist, ist bestätigt worden. 2. Die Expression von Claudin 4 ist ebenfalls verifiziert, während Claudin 5 im frühen Embryo und im Primitivknoten erstmalig detektiert ist. 3. Ebenfalls ist die JAM-A-Expression in epithelialen Zellen des Embryos bestätigt. Neue Erkenntnisse der Assoziierung der JAM-A-Epression im Primitivknoten mit Zilien konnten aufgezeigt werden. 4. Die Detektion von ZO-1 sowohl in Entoderm, Ektoderm als auch im Mesoderm stimmt mit der Literatur überein. 5. β-Catenin ist nicht nur in den Zell-Zell-Kontakten und hier in der apikalen Hälfte der Zellen lokalisiert worden, sondern zusätzlich zeigte sich erstmalig, dass β-Catenin ein asymmetrisches Verteilungsmuster zugunsten der linken Seite des Embryos aufweist, das im 0-Somitenstadium am stärksten ausgeprägt ist und mit zunehmendem Alter des Embryos relativiert wird. 6. E-Cadherin ist in epithelialen Zellen lokalisiert und zum ersten Mal konnte E-Cadherin jedoch verstärkt im Primitivknoten lokalisiert werden. 7. N-Cadherin, das bislang nur im Neuroepithel und der Neuralplatte entdeckt worden ist, ist nun in der Primitivknotengrube, im Ento- und verstärkt im Ektoderm lokalisiert worden. 8. Mit Hilfe von immunhistochemischen Analysen ist erstmalig Annexin 2 im Primitivknoten und Annexin 6 im Primitivknoten und Entoderm nachgewiesen worden. 9. Smad 1 und 2 im Primitivknoten ist selbst nur gering exprimiert, während Smad 3 im Primitivknoten akkumuliert zu finden ist. Bislang wurde Smad 1-3 nur in In-situ-Hybridisierungsstudien nachgewiesen. 10. Die asymmetrischen Verteilung zugunsten der linken Seite von p-Pax, Smad 1, Nkd1 (Nkd1 mittels In-situ-Hybridisierung nachgewiesen) und p-Tyr konnte erstmalig aufgezeigt werden. Bei Pkd2 mutanten Embryonen konnten im Vergleich zu Wildtypembryonen folgende Unterschiede festgestellt werden: 161 Zusammenfassung 1. Die Monozilien bei Pkd2 mutanten Embryonen sind geringfügig länger und zeigen ein unregelmäßiges Längenwachstum. Die Motilität und die Richtung des Flüssigkeitsstroms über den Primitivknoten sind jedoch vergleichbar und konnten mit den Literaturergebnissen bestätigt werden. Die Unterschiede im Längenwachstum der Zilien könnten durch Störungen des anterograden oder retrograden Transports von Molekülen innerhalb der Zilie oder durch Störung von Signalmechanismen, die die terminale Differenzierung der Epithelzellen anzeigen, verursacht werden. 2. Neu entdeckt ist die Lokalisation von JAM-A, die diffuser und auch im Mesoderm auftritt, was auf eine pathologische Veränderung der Tight Junctions und der beteiligten Proteine schließen lässt. 3. β-Catenin zeigt ein stärkeres und schwammigeres Verteilungsmuster und die Lokalisation von β-Catenin ist nicht auf die apikale Hälfte der Zellen beschränkt, so dass zumindest der Aufbau der Adherens Junctions bei Pkd2 mutanten Embryonen gestört ist. Die Tatsache, dass β-Catenin eine stärkere Expression aufzeigt, unterschreibt die ebenfalls stärkere Expression bei Pkd2 mutanten Nierenepithelzellen. 4. Erstmals konnte aufgezeigt werden, dass E-Cadherin Unterschiede in der Verteilung aufzeigt, was zusätzlich auf eine Störung des Aufbaus der Adherens Junctions hinweist. Mit den in dieser Arbeit generierten Daten zur Darstellung der Entwicklung des Primitivknotens der Maus inklusive der Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kontakte konnte eine solide Grundlage für weiterführende Studien zur normalen und pathologischen Entwicklung, der strukturellen Beschaffenheit und Funktion des Primitivknotens geschaffen werden. Nur in Kenntnis des Normalzustands können die molekularbiologischen Mechanismen normaler und fehlerhafter Körperachsenentwicklung frühzeitig erkannt und verstanden werden. Am Beispiel von Pkd2 mutanten Embryonen wurde schließlich gezeigt, dass Unterschiede zu detektieren sind und Hinweise auf pathologische Prozesse und dysregulierte Signaltransduktionswege geben können. 162 Summary 7. Summary Development and structure of the primitive node of the mouse Nadia Koo (2012) The aim of this study was to understand the structural development of the primitive node of the mouse, as well as to describe the molecular formation of the highly polarized primitive node cells in detail. According to current knowledge, the structure and function of the primitive node in the mouse are important for the breaking event of the bilateral symmetry during the left-right axis development, which accounts for one of the main steps in the establishment of the left-right body axis. Contemporary literature provides only few insights into development and exact structure of the primitive node. Since different methods have been used for the analyses, it has been possible to demonstrate the development of the early primitive node. Samples have been analysed by immunohistochemical and electron microscopy. In-situ-hybridization has been performed, semi thin sections were investigated and videos of the node cilia’s motility have been shot. As samples, routinely E7.5 to 8.0 embryos from CD1Wildtype mice where utilized. With regard to immunohistochemical studies, characteristic marker proteins of cell polarity have been used. Concerning the development of the node, this study confirms that the primitive node does not only have one single origin, but developed from different clusters of cells, which thereafter fuse and form the final characteristic horseshoe structure. With the help of electron microscopic analysis of the cilia an increase in cilia length of the node has been demonstrated. This is almost linear to the increasing age of the wildtype-embryo. The motility of the cilia and the direction of the fluid flow over the node have been analysed by video microscopy. These results correspond to data which have already been published. 163 Summary Immunohistochemical results: 1. Additional monocilia exist outside the primitive node in surrounding tissues, the function of which remains elusive is confirmed. 2. The expression of Claudin 4 is verified, while Claudin 5 is expressed for the first time in early embryonic development and in the primitive node. 3. The JAM-A - expression is confirmed in epithelial cells of the embryo. It could be shown that it is associated with node cilia. 4. Zo-1 is detected in the endoderm, ectoderm, as well as in the mesoderm, which was expected from literature. 5. β-Catenin is not only localized within the cell-cell-contact and in the apical cell junctions, but is also found to be asymmetrically distributed to the left side of the embryo with a peak expression in somite stage 0, followed by a progressive decrease in asymmetrical expression with increasing age of the embryo. 6. E-Cadherin is localized in epithelial cells, but for the first time a higher concentration is noticed in the primitive node. 7. N-Cadherin, so far only known to be located in the neural epithelium and the neural plate, is also identified in the nodal pit, in endodermal tissue and especially in ectodermal tissue. 8. By means of immunohistochemical analyses it could be asserted that Annexin 2 is expressed in the node and Annexin 6 is expressed in the node and the endoderm. 9. Despite only minimal expression of Smad 1 and 2 in the node, a high accumulation of Smad 3 in the node could be observed. So far, Smad 1-3 could only be detected by In-situ-hybridization studies. 10. An asymmetric distribution of p-Pax, Smad 1, Nkd1 (by In-situ-hybridization) and p-Tyr in favour of the left side of the embryo is found and has not been presented in the literature so far. 164 Summary Concerning the Pkd2 mutant embryos the following differences compared to wildtype-embryos have been observed: 1. Monocilia in Pkd2 mutant embryos are slightly longer and show an abnormal growth in length. However, a comparable motility and directional fluid flow by node cilia over the node in Pkd2 mutants and wildtype-embryos has been found, which confirms the literature. The difference in length either results from a disturbance in the anterograde or retrograde transport of molecules, which is essential for cilia growth and maintenance, or an abnormal signal transduction mechanism, which is related to terminal differentiation and polarization of epithelial cell layers. 2. Contrary to literature, the localization of JAM-A turns out more diffuse than expected and additionally presents itself in the mesoderm. This may indicate a pathological disturbance of the TJ complex and related proteins. 3. β-Catenin shows a generally stronger and more diffuse distribution and is not limited to the apical portion of the cell body, which accounts at least for an abnormal assembly of Adherens Junctions in Pkd2 mutant embryos. The fact that β-Catenin is expressed stronger points out the likewise stronger expression of Pkd-2-mutant renal epithelial cells. 4. Furthermore we could show for the first time that the distribution of E-Cadherin is different as well, which additionally supports evidence for a disturbed Adherens Junction assembly. With the data generated in this study regarding the development of the primitive node, including cell-cell-contacts and cell-matrix-contacts, it has been managed to establish a solid basis for further studies of the normal and pathological development of structural features of the node. Knowledge on the default state of embryonic development, molecular mechanisms of abnormal or disturbed axial development can be assessed and understood at an early stage. Using the example of Pkd2 mutant embryos, this study demonstrates that it is possible to detect abnormal node development, and hence provide hints for pathological processes and dysregulated signal transductions. 165 Literaturverzeichnis Literaturverzeichnis ABERCROMBIE, M. u. G. 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Meeting abstract of the 16th International Society of Developmental Biologists Congress, Edinburgh, England (Posterbeitrag) PENNEKAMP, P., N. KOO, S. FELDNER, G. RANDAU, B. DWORNICZAK (2010): Cell Polarity and gene expression at the embryonic mouse node. Keystone Symposium Cilia, Signaling and Human Disease, Monteray, USA (Posterbeitrag) Danksagung Ich bedanke mich herzlich bei Bernd für die Vergabe des Themas. Mein größter Dank gilt Petra für ihre unermüdliche Betreuung bei Tag und Nacht, ihre Geduld und tatkräftige Hilfestellung bei großen und bei kleinen Problemen während der gesamten Zeit. Besonderer Dank gilt vor allem Gerrit und Stefan, die mich während meiner Arbeit in der Humangenetik begleitet haben und mit ihren Ratschlägen und ihren tatkräftigen Unterstützungen, sowie bei EDV-Problemen in allen Lebenslagen unter die Arme gegriffen haben. Vielen Dank auch an Franz-Josef für die Betreuung der Mäuse und ein großes Dankeschön an Kostas für die gute Einführung und Hilfestellung bei EDV-Problemen. Des Weiteren möchte ich mich auch bei Herrn Prof. Dr. Horst, Herrn Univ.-Prof. Dr. med. P. Wieacker und den Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Instituts für Humangenetik für die Bereitstellung der Räumlichkeiten und Geräte, für die Hilfsbereitschaft und das nette Arbeitsklima bedanken. Prof. Dr. Meinecke-Tillmann danke ich herzlich für die Übernahme meiner Dissertation und Ihre Geduld und Zeit, die sie für die Erstellung meiner Arbeit auf sich genommen hat. Bedanken möchte ich mich auch sehr herzlich bei Edita für Ihre Hilfe und lieben Ratschläge. Vielen Dank auch an Prof. Dr. Meyer für die ursprüngliche Betreuung als Doktorvater. Für das Korrekturlesen und die Übersetzunshilfen möchte ich mich insbesondere bei meinen Freunden Stefan, Gerrit, Sandra, Steffen, Nicole, Leo, meinem Bruder und meiner Schwiegermutter Monika bedanken. Vielen Dank auch an meine Familie, insbesondere meine Eltern, für die jahrelange Unterstützung, ohne die meine Ausbildung und die Durchführung dieser Arbeit nicht möglich gewesen wäre. Meine tiefste Dankbarkeit gilt meinem Mann. Für seine ausdauernde, finanzielle und seelische Unterstützung danke ich Sebastian, der in allen Lebenslagen für mich da ist und immer hinter mir steht, wie in guten sowie in schlechten Zeiten. Bei meinen Freundinnen und Freunden Anna-Sophie, Nicole, Reinhard, Steffen, Katja, Dewy, Sandra, Steven, Ammanouil und Sinje danke ich vor allem für Ihre seelische Unterstützung. Zuletzt danke ich allen Mäusen und Mausembryonen, mit denen ich so manche Nacht verbracht habe, die ihr Leben für meine Dissertation gelassen haben und ohne die meine Arbeit nicht zustande gekommen wäre.
