Molekulare Alteration im E-Cadherin Gen bei malignen Melanomen
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Molekulare Alteration im E-Cadherin Gen bei malignen Melanomen und kolorektalen Karzinomen Von der Medizinischen Fakultät der Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen zur Erlangung des akademischen Grades einer Doktorin der Medizin genehmigte Dissertation vorgelegt von Alinda Dalma Varnai aus Pecs, Ungarn 2003 Molekulare Alteration im E-Cadherin Gen bei malignen Melanomen und kolorektalen Karzinomen Von der Medizinischen Fakultät der Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen zur Erlangung des akademischen Grades einer Doktorin der Medizin genehmigte Dissertation vorgelegt von Alinda Dalma Varnai aus Pecs, Ungarn Berichter: Herr Professor Dr.med. Reinhard Büttner Herr Universitätsprofessor Dr.med. Christian Mittermayer Tag der mündlichen Prüfung: 24. Juni 2003 Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar Meinen Eltern I. INHALTSVERZEICHNIS Abkürzungen II. 7 EINLEITUNG II.1. Tumorentwicklung und Tumorprogression 8 II.2. Zelladhäsionsmoleküle 11 II.3. E-Cadherin 12 II.4. Rolle des E-Cadherin in der Tumorinvasion 17 II.5. Das maligne Melanom 19 II.6. Das kolorektale Karzinom 24 III. AUFGABENSTELLUNG 30 IV. MATERIAL UND METHODEN IV.1. Puffer, Medien und Lösungen 31 IV.2. Materialien IV.2.1 Chemikalien und Lösungen 33 IV.2.2 Molekulargewichtsstandard 34 IV.2.3 Geräte und Materialien 35 IV.2.4 Primer 36 IV.2.5 Zelllinien 37 IV.3. Molekularbiologische Methoden V. IV.3.1 Kultivierung von eukaryontischen Zellen 38 IV.3.2 DNA- Isolierung 38 IV.3.3 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) 39 IV.3.4 Gelelektrophorese 40 IV.3.5 PEG-Fällung 40 IV.3.6 Sequenzierung (cycle sequencing) 41 ERGEBNISSE 42 5 VI. DISKUSSION 52 VII. ZUSAMMENFASSUNG 57 VIII. LITERATURVERZEICHNIS 59 IX. ANHANG 68 6 ABKÜRZUNGEN APC adenomatöse Polyposis coli cDNA CO2 copyDNA Kohlendioxid DCC DMSO DNA dNTP deleted in colorectal cancer Dimethylsulfoxid Desoxyribonukleinsäure Desoxynukleotidtriphosphat EtBr EtOH EDTA Ethidiumbromid Ethanol Ethylendiamintetraacetat FAP FKS familiäre adenomatöse Polyposis fötales Kälberserum HNPPC hereditäres non-polypöses kolorektales Karzinom MMR mismatch repair PBS PCR PEG p53 phosphat buffered saline Polymerase-Chain-Reaction Polyethylenglycol Protein 53 Taq TBE Tris TSR Termophilus aquaticus Tris-Borsäure-EDTA Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan Template Suppression Reagent 7 II. EINLEITUNG II.1 Tumorentwicklung und Tumorprogression In manchen populärwissenschaftlichen Veröffentlichungen wird der Begriff „Tumor“ fälschlicherweise stets als Oberbegriff für alle Formen obligat maligner Erkrankungen verwandt. Nach wissenschaftlicher Definition aber beinhaltet der Begriff „Tumor“ lediglich die abnorme Vergrößerung eines Gewebes, welche durch autonome, progressive und überschießende Proliferation von körpereigenen Zellen entsteht (Riede et al, 1989). Der Begriff „Tumor“ sagt allerdings nichts über das biologische Verhalten (=Dignität) dieser Geschwulst (=Neoplasie) aus, was sich am besten durch den klinischen Verlauf beurteilen lässt. Diesbezüglich unterscheidet man gutartige und bösartige Tumoren. Gutartige (=benigne) Tumoren sind dadurch gekennzeichnet, dass sie langsam, verdrängend und expansiv wachsen, in vielen Fällen kommt es kaum zur Beeinträchtigung des Gesamtorganismus und histologisch bestehen sie meistens aus ausgereiftem Gewebe, das sich kaum vom Ursprungsgewebe unterscheiden lässt. Bösartige (=maligne) Tumoren hingegen zeichnen sich durch infiltratives Wachstum und Destruktion des umgebenden Gewebes, durch die Fähigkeit zur Metastasenbildung aus und sie neigen zu Rezidivbildung. Klinische Symptome fehlen nie, treten aber meist erst im fortgeschrittenen Stadium auf. Histologisch bestehen bösartige Tumoren aus einem Gewebe, das je nach Differenzierungsgrad nur noch annähernd dem Ursprungsgewebe gleicht. 8 Die Zellen und ihre Zellkerne weisen dabei die für Malignome typische Veränderungen auf wie Zell- und Kernpolymorphie, Kernpolychromasie, Verschiebung der KernPlasma- Relation zugunsten des Zellkerns und Nukleolenvergrößerung (Riede et al., 1989). Die kausale Pathogenese menschlicher Tumoren ist bislang nur in ersten Ansätzen geklärt. Bei manchen Tumoren beobachtet man eine familiäre Häufung. Es gibt Tumoren, die nach den Mendelschen Regeln vererbt werden, wie z.B. die Familiäre Polyposis Coli (FAP). Anderseits gibt es Tumorerkrankungen mit familiärer Häufung, ohne dass ein den Mendelschen Regeln entsprechender Erbgang erkennbar ist, wie häufig bei kolorektalen Karzinomen; hier ist das Zusammenspiel von genetischer Disposition und Umweltfaktoren evident (Perera, 1997). Eine Fülle tierexperimenteller Untersuchungen und epidemiologischer Beobachtungen weisen darauf hin, dass chemische Verbindungen (wie z.B. polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe, Nitrosamine oder Aflatoxine), ionisierende Strahlen, Sauerstoffradikale und Viren krebserzeugend oder krebsfördernd sind. Solche Noxen werden als Karzinogene (=Kanzerogene) bezeichnet. Karzinogene können zu Mutationen in der DNA führen (Wagener, 1999). Der Gedanke, dass die maligne Entartung einer Zelle auf Veränderungen des Genoms, d.h. auf einer Mutation, beruht, wurde bereits von Boveri (1914) und Bauer (1928) formuliert. Strukturelle Veränderungen der DNA wie z.B. Punktmutationen, Deletionen oder Frameshift-Mutationen führen zu einer Beeinträchtigung der DNA-Synthese oder der Transkription, zur Änderung der DNA-Konformation, zur Genamplifikation wie auch zu genetischem Rearrangement (Riede et al., 1989). 9 Versagen die zellulären physiologischen Reparatur- und Tumorsupressormechanismen so ist mit einer genetisch induzierten Tumorentstehung zu rechnen. So weisen Patienten mit hereditären DNA-Reparaturstörungen ein stark erhöhtes Krebsrisiko auf (Wiestler et al., 1989). Maligne Tumoren wachsen in der Regel klonal, d.h. sie entstehen aus einer einzelnen maligne entarteten Zelle. Von einer malignen Progression spricht man bei Ausbreitung solcher transformierten Zellen im Organismus. Auf der Basis von histologischen, zytologischen und zellbiologischen Untersuchungen lassen sich verschiedene Schritte der malignen Progression abgrenzen. Der Übergang von normalem Gewebe zu invasiven Karzinomen ist durch eine zunehmende Entdifferenzierung gekennzeichnet, die sich u.a. in veränderter Zellform, gestörter Position der Zellen zueinander und zunehmendem Verlust der Gewebsstruktur äußert (Wagener et al., 1999). Invasiv wachsende Karzinome weisen Tumorzellnester oder einzelne Tumorzellen auf, die sich aus dem Zellverband gelöst haben. Voraussetzung dafür ist der Verlust der ZellZell-Adhäsion, die für den Zusammenhalt des normalen Epithels verantwortlich ist. Das invasive Wachstum bedingt eine Auseinandersetzung der Tumorzellen mit der extrazellulären Matrix und der vaskulären Basalmembran. Die Tumorzellen bedienen sich dabei extrazellulär wirksamer Proteasen und Hyaluronidasen. Darüber hinaus können Tumorzellen auch zytotoxische Substanzen bilden, mit denen sie normale, gesunde Zellen zerstören, und sich damit weiter aggressiv und invasiv verbreiten (Klein et al, 1989). Da offensichtlich einer der ersten Schritte im Rahmen der Ausbreitung von malignen Tumoren der Verlust des Zell-Zell-Zusammenhalts ist, stand Zelladhäsionsmoleküle bereits früh im Zentrum der Krebsforschung. 10 die Rolle der II.2 Zelladhäsionsmoleküle Der Kontakt von Zellen multizellulärer Organismen wird durch Zelladhäsionsmoleküle vermittelt. Zelladhäsionsmoleküle regulieren die dynamischen Prozesse in der Morphogenese während der Embryonalentwicklung und in der Regeneration von Geweben. Sie bestimmen ferner die Gewebs- und Organarchitektur. Sie vermitteln sowohl den Kontakt von Zellen untereinander als auch die Adhärenz von Zellen an Bestandteile der extrazellulären Matrix (Wagener et al., 1999). Mobile Zellen, wie z.B. Granulozyten, bewegen sich mittels Zelladhäsionsmolekülen an denjenigen Ort des Körpers, an dem die Zellen in physiologischen und pathologischen Situationen benötigt werden (Gumbiner, B.M., 1996). Zelladhäsionsmoleküle sind an allen Schritten der malignen Progression beteiligt. Durch Verlust und Dysregulation von Zelladhäsionsmolekülen geht die geordnete Gewebsstruktur verloren, wodurch sich Zellen aus dem Gewebsverband lösen können. Voraussetzung für die Infiltration bindegewebiger Strukturen ist die Expression von Adhäsionsmolekülen, die an die Bestandteile der extrazellulären Matrix binden können. Die Bindung von Zellmembranrezeptoren lymphogen metastasierender Tumorzellen an Liganden der Lymphgefäße von Lymphknoten ist eine wichtige Voraussetzung für die Ausbildung von Lymphknotenmetastasen. Hämatogen metastasierende Tumorzellen können über Zelladhäsionsmoleküle an Endothelzellen und die endotheliale Basalmembran binden und damit die Ausbildung von Fernmetastasen einleiten (Brodt, P., 1996; Hendrix et al., 2001). Die bisherigen Forschungsergebnisse zeigen, dass verschiedene Gruppen der Zelladhäsionsmoleküle, wie z.B. die Integrine (Ruiz et al., 1993), Mitglieder der Immunglobulin-Superfamilie wie MCAM (Xie et al., 1997), die CD44 ProteoglykanGruppe (Sy et al., 1992), die Selectine (Mannori et al., 1997), die MatrixMetalloproteinasen (Mignati et al., 1986) und auch die Cadherine (Bracke et al., 1996) in der malignen Transformation und Metastasierung beteiligt sind. 11 II.3 E-Cadherin E-Cadherin gehört zu einer Familie strukturell verwandter Proteine, die zu den wichtigsten Zelladhäsionsmolekülen zählen. Weitere Mitglieder der Familie sind die sogenannten klassischen Cadherine und Adhäsionsproteine von Desmosomen (Desmogleine, Desmocolline) (Suzuki et al., 1996). Zu den klassischen Cadherinen zählen E-Cadherin (Epitheliales-Cadherin, früher auch als Uvomorulin bezeichnet), P-Cadherin (Plazentares-Cadherin) und N-Cadherin (Neurales-Cadherin). Auf dem Aminosäurenniveau beträgt die Homologie zwischen E-, P- und N-Cadherin etwa 50%. Die Bindung die sie eingehen ist homophil, d.h. ECadherin bindet nur an E-Cadherin, nicht aber an P- oder N-Cadherin (Wagener et al., 1999). E-Cadherin wird im Verlauf der Embryonalentwicklung bereits im Blastomer-Stadium exprimiert und findet sich im weiteren Verlauf in allen Epithelien. Die Abwesenheit von E-Cadherin ist mit dem Leben nicht vereinbar, so sterben beispielsweise Embryonen von Knock-out-Mäusen im Stadium der Blastozyste ab (Marrs et al., 1996). 12 Strukturell besitzt E-Cadherin einen extrazellulären, einen transmembranösen und einen intrazellulären Anteil. Der extrazelluläre Anteil, der die Zelladhäsion vermittelt, ist in fünf Domänen unterteilt, die Bindungsfunktion liegt in der N-terminalen Domäne. Essentiell für die adhäsive Funktion ist eine Sequenz von drei Aminosäuren (His-Ala-Val) (Abb. II.3.1) Abb. II.3.1 Schematischer Aufbau von E-Cadherin. Das HAV (His-Ala-Val)-der N-terminalen Bindungsdomäne ist allen klassischen Cadherinen gemeinsam. Die Bindungsspezifität wird durch die flankierenden Aminosäuren bestimmt. (Wagener et al., 1999). 13 E-Cadherin vermittelt die Zelladhäsion nur in Anwesenheit von Calcium-Ionen. Diese Adhäsion ist temperaturabhängig und bei Körpertemperatur maximal. E-Cadherin-Domänen besitzen charakteristische Calcium-bindende Aminosäuremotive. Eine Bindung von Calcium-Ionen ermöglicht die Zusammenlagerung von E-CadherinMonomeren zu Dimeren, wodurch gegenüberliegende Cadherine multiple Bindungen eingehen können (Abb. II.3.2) (Takeichi, 1995). Abb. II.3.2 Die N-terminalen Domänen eines E-Cadherin-Dimers können zwei gegenüberliegende Dimere binden. Hierdurch werden multimere Bindungen ermöglicht. N, N-terminale Domäne; C, zytoplasmatische Domäne. (Wagener et al., 1999). 14 Der intrazelluläre Anteil ist über die Catenine (intrazelluläre Proteine) mit den Aktinfilamenten verbunden (Abb. II.3.3). Abb. II.3.3 Die zytoplasmatische Domäne von E-Cadherin geht eine direkte Bindung entweder mit βCatenin oder Plakoglobin (γ-Catenin) ein. α-Catenin bildet die Brücke zwischen β-Catenin bzw. Plakoglobin und Aktinfilamenten. (Wagener et al., 1999). α-Catenin ist ein Aktin-bindendes Protein, welches dadurch eine direkte Bindung mit dem Zytoskelett hat. β-Catenin bindet direkt an E-Cadherin. Da es auch mit α-Catenin assoziiert, bildet es eine Brücke zwischen E-Cadherin und α-Catenin. γ-Catenin ist identisch mit Plakoglobin und ist mit β-Catenin strukturell verwandt. Wie βCatenin bindet auch Plakoglobin sowohl an E-Cadherin als auch an α-Catenin. Man nimmt an, dass entweder β-Catenine oder Plakoglobin die Brücke zwischen E-Cadherin und dem Zytoskelett herstellen. Durch diese Bindung wird die Übertragung extrazellulärer Signale in die Zelle über die zytoplasmatische E-Cadherin-Domäne ermöglicht. E-Cadherin ist dadurch nicht nur ein Adhäsions- sondern auch ein wichtiges Signalmolekül (Aberle et al., 1996). 15 E-Cadherin ist durch die Verbindung mit dem β-Catenin Teil des Signalweges, in der βCatenin eine zentrale Rolle spielt. β-Catenin assoziiert mit einer als TCF/LEF bezeichneten Gruppe von Transkriptionsfaktoren (TCF „T-Cell Factor“; LEF „Lymphoid Enhancer Factor“). Im Komplex mit TCF induziert β-Catenin die Transkription entsprechender Zielgene (Wagener et al., 1999). Fehlregulierungen auf diesem Signalweg führen zu einer dauernden Aktivierung der β-Catenin/LEF/TCF Zielgene, zu denen auch unter anderem c-myc und cyclin D1 gehören. Solche Fehlregulierungen wurden bei verschiedenen malignen Tumoren beobachtet (Poser et al., 2001). 16 II.4 Rolle des E-Cadherin in der Tumorinvasion Untersuchungen zum divergent aggressiven Verhalten von Tumoren prinzipiell histologisch gleicher Entität weckten das wissenschaftliche Interesse an E-Cadherin. In Experimenten an epithelialen Zelllinien wurde nachgewiesen, dass E-Cadherin eine entscheidende Rolle für die epitheliale Differenzierung besitzt. Mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers, der gegen E-Cadherin gerichtet war, verloren die Zellen ihre differenzierte epitheliale Form und nahmen eine undifferenzierte, Fibroblasten-ähnliche Form an. Umgekehrt kann man in Fibroblasten durch Expression von E-Cadherin eine epitheloide Form induzieren. Dies zeigt, dass E-Cadherin für die Morphogenese von Epithelien von zentraler Bedeutung ist (Imhof et al., 1983; Hatta et al.,1988). Ein Verlust von E-Cadherin beeinflusst nicht nur die Morphogenese, sondern auch die maligne Progression und damit das invasive Wachstum (Birchmeier et al., 1994; Bracke et al., 1996). Bei Experimenten an Zelllinien konnte gezeigt werden, dass Zellen mit starker ECadherin-Expression kaum eine Tendenz zu invasivem Verhalten aufweisen, Zellen mit geringer oder keiner E-Cadherin-Expression sich hingegen hochmaligne verhalten (Behrens et al., 1989). Nach Transfektion von E-Cadherin-cDNA in derartig ursprünglich E-Cadherin negative Zellen verloren diese wiederum ihre vorherige Invasivität (Vleminckx et al., 1991). Dieses Verhalten konnte auch an Tumorzelllinien verschiedener menschlicher Tumorarten gezeigt werden (Frixen et al., 1991). All diese Befunde sprechen dafür, dass E-Cadherin zumindest funktionell als Tumorsupressor wirkt und somit für weitere Untersuchungen zur Entstehung und Biologie von malignen Tumoren von großem Interesse ist. Bis jetzt wurde eine verminderte E-Cadherin-Expression in Leber-, Pankreas-, Magen-, Dickdarm-, Blasen-, Prostata-, Pharynx-, Oesophagus-, Haut-, Schilddrüse- und Mamma-Karzinomen beschrieben (Bracke et al., 1990). 17 In den meisten Fällen ist die verminderte Expression von E-Cadherin auf eine verminderte Transkription des kodierenden Gens zurückzuführen. Im E-Cadherin Gen wurden jedoch auch somatische Mutationen nachgewiesen, die funktionelle Domänen des Proteins inaktivieren, wie z.B. bei Magenkarzinomen vom diffusen Typ (Becker et al., 1994). Bei lobulären Mammakarzinomen finden sich häufiger Frameshift- oder NonsenseMutationen, die für sezernierte statt Membran-insertierte E-Cadherin Formen kodieren (Berx et al., 1995; Berx et al., 1996). Der Mechanismus des in den meisten Fällen vorliegenden E-Cadherin Transkriptionsverlustes in vielen bösartigen Tumoren ist bislang weitgehend unbekannt. Eine Möglichkeit beinhaltet die Inaktivierung des Promotors durch Hypermethylierung, wie sie bei Mamma-, Magen- und Prostata-Karzinomen und auch bei Leukämien beobachtet werden konnte (Melki et al., 2000; Graff et al., 1995; Tamura et al., 2000). Weiterhin wurde der Verlust der Expression des AP-2 Transkriptionfaktors, der möglicherweise das E-Cadherin aktiviert, vermutet (Batsche et al., 1998; Bar-Eli 1999). Neuere Ergebnisse belegen zudem, dass der Transkriptionsfaktor Snail eine wesentliche Rolle bei der Repression der E-Cadherin Expression bei Blasen-, Pankreasund kolorektalen Karzinomen (Battle et al., 2000; Cano et al., 2000) und malignen Melanomen spielt (Poser,Varnai et al., 2001). In kolorektalen Karzinomen korreliert die Expression von E-Cadherin mit der Differenzierung und dem Tumorstadium (Dorudi et al., 1993). In Prostatakarzinomen nimmt sie ebenfalls mit fortschreitender Entdifferenzierung ab. Da entdifferenzierte Karzinome häufiger metastasieren, besteht damit auch ein Zusammenhang zwischen ECadherin Expression und Prognose (Umbas et al., 1994). Ein eindeutiger Zusammenhang zwischen dem Verlust von E-Cadherin und Tumorprogression besteht sowohl bei malignen Melanomen (Sanders et al., 1999) als auch bei kolorektalen Karzinomen (Efstathiou et al., 1999) und Plattenepithelkarzinomen (Birchmeier et al., 1994). II.5 Das maligne Melanom 18 Maligne Melanome bilden aufgrund ihrer frühzeitigen Metastasierungstendenz hochgradig maligne Tumoren, die von den melaninbildenden Zellen (Melanozyten) der Haut ausgehen. Sie metastasieren frühzeitig auf lymphogenem und hämatogenem Weg. Die Inzidenz der malignen Melanome hat in den letzten Jahrzehnten stetig zugenommen; sie liegt heute bei 10 bis 15 Fälle pro 100000 Einwohner und Jahr in Deutschland. In epidemiologischen Studien wird ein Süd-Nord-Gefälle innerhalb der Bevölkerung europäischer Herkunft deutlich. Je mehr man sich dem Äquator nähert, desto größer ist die Morbidität innerhalb der hellhäutigen Bevölkerung. In Neuseeland und Australien wird sogar von einer Inzidenz von 40-60 pro 100000 Einwohner und Jahr berichtet. Die asiatische und schwarze Bevölkerung desselben Breitengrades erkrankt nur in 15-25% der Fälle. Frauen sind fast doppelt so häufig betroffen wie Männer. Vor der Pubertät tritt ein malignes Melanom extrem selten auf. Nur 2% der Erkrankten sind unter 20 Jahre alt und ca. 10% unter 30. 80% der Erkrankten befinden sich zwischen dem 30. und 70. Lebensjahr (Jung et al., 1998) (Abb. II.5.1). 19 Abb. II.5.1 Relative Häufigkeit und Manifestation der verschiedenen Melanomtypen in der Abhängigkeit vom Lebensalter. (Jung et al., 1998). Die Ursachen für die Entstehung des malignen Melanoms sind trotz intensiver Forschung bis heute unklar. Lichtempfindliche Haut (Hauttyp I und II) ist ein genetisch determinierter, prädisponierender Faktor sowie eine hohe Anzahl von Pigmentmalen. Es besteht allerdings keine direkte Kausalität zwischen Sonnenlicht und Melanomentstehung (Weiß et al., 1990). Dennoch scheint ein indirekter Zusammenhang zwischen der Menge der UV-Exposition und der Genese maligner Pigmenttumoren zu bestehen. Dafür spricht die hohe Morbidität, insbesondere bei Patienten mit lichtempfindlicher Haut in Regionen mit starker Sonnenbelastung (Jung et al., 1998). Darüber hinaus kommen ca. 10% der Melanome familiär gehäuft vor (Syndrom der dysplastischen Nävi, DNS). Es handelt sich hierbei um eine autosomal dominante Vererbung mit polygenem Erbgang oder unvollständiger Penetranz. Für die Entstehung von Melanomen aus Melanozyten ist von Clark et al. (1984; 1991) ein Modell entwickelt worden, welches die Tumorprogression in fünf Stadien unterteilt und sie schrittweise vom Melanozyten zum metastasierenden Melanom beschreibt. Melanozytische Naevi werden als benigne Neoplasien von Melanozyten angesehen. 20 Melanozyten und Naevuszellen können in situ verbleiben oder spontan ausdifferenzieren (Schwannsche Differenzierung). In seltenen Fällen kommt es zu einer malignen Veränderung von Melanozyten in Naevi und so zur Entstehung von Melanomen. Zuerst breiten sich die Melanomzellen meist radial aus und durchdringen nicht die Basalmembran („radial growth phase“), anschließend kommt es zur „vertical growth phase“, wobei die Melanomzellen die Basalmembran überschreiten und bis in die Subkutis eindringen. Damit wird auch der Weg zur Metastasierung frei. Die terminale Differenzierung und damit Regression von Melanomzellen kommt nur sehr selten vor. Beschrieben wird auch die spontane Melanomentstehung ohne die Zwischenstufe der Naevusentwicklung (Abb. II.5.2). Abb. II.5.2 Modell der Tumorprogression bei Melanomen (nach Clark). RGP (radial growth phase); VGP (vertical growth phase). (Clark et al., 1984). 21 Maligne Melanome sind in der Regel in ihrer Farbintensität unterschiedliche, tiefbraune bis blauschwarze Tumoren. Durch verschieden schnelles horizontales und vertikales Wachstum sowie sekundäre Veränderungen wie Erosion, Ulzeration, Blutung und Verkrustung oder regressive Veränderungen entstehen klinisch in Farbe, Form und Größe sehr variable Tumoren. Mitunter finden sich im Tumor pigmentfreie Areale. Selten ist ein Tumor völlig pigmentfrei (amelanotisches malignes Melanom, AMM). Die meisten Melanome finden sich im Bereich des Rückens, der Brust und der Extremitäten; Lentigomaligna-Melanome (LMM, s.u.) finden sich bevorzugt im Gesicht, an Hals, Armen und Unterschenkeln. Man unterscheidet klinisch vier Arten von Melanomen: superfiziell spreitendes malignes Melanom (SSM, 60%), akrolentiginöses Melanom (ALM, 5%), noduläres malignes Melanom (NM, 20%) und Lentigo-maligna-Melanom (LMM, 10%). 5% der Malignen Melanome sind Sonderformen (Jung et al., 1998). Die Prognose für den Patienten richtet sich nach der Tumordicke und Eindringtiefe des Primärtumors. Dafür wird die Einteilung der Invasionstiefe nach Clark (Clark-Level I-V) benutzt (Abb. II.5.3). Abb. II.5.3 Tumoreindringtiefen der Melanome nach Clark I-V. Damit wird die Invasionstiefe des Melanoms in das Korium mit seinen verschiedenen Gefäßflechten und in das Unterhautfettgewebe bezeichnet. Die enormen Dickenunterschiede des Koriums an verschiedenen Körperstellen können auf diese Weise besser berücksichtigt werden als bei der Angabe der vertikalen Tumordicke in mm (Jung et al., 1998). 22 Bei einer Tumordicke von <0,75mm (pT1) beträgt die 10-Jahre-Überlebensrate (-JÜR) 97% und sinkt mit steigender Tumordicke stetig ab. Bei einem Tumor >4,0mm (pT4) beträgt die 10-JÜR 43%. Sind Lymphknoten- oder Fernmetastasen vorhanden, sinkt die 10-JÜR auf ca. 3% (Jung et al., 1998)(Abb. II.5.4). Abb. II.5.4 Stadieneinteilung bei malignen Melanomen. (Jung et al., 1998). Ein weiteres prognostisches Kriterium ist die Lokalisation des Primärtumors. Melanome an den Extremitäten haben eine bessere Prognose als Melanome im Bereich des Rumpfes oder des Kopfes. Prognostisch besonders ungünstig sind Melanome im Anogenitalbereich wegen der meist späten Diagnosestellung. Eine kurative Behandlung durch Resektion ist nur in frühen Tumorstadien möglich solange noch keine Metastasierung vorliegt. Melanome erweisen sich als resistent gegenüber konventionellen Chemo- oder Radiotherapien. Bereits bei kleinen Primärtumoren kommt es häufig zu Metastasierung, bevorzugt in Lymphknoten, Haut, Lunge, Leber, Gehirn und Knochen und in diesen Fällen ist eine kurative Therapie nach dem heutigen Stand des medizinischen Wissens nicht mehr möglich. 23 II.6 Das kolorektale Karzinom Das kolorektale Karzinom ist der häufigste maligne Tumor des Darmtraktes und die zweithäufigste Tumorerkrankung bei Männern (nach dem Bronchialkarzinom) und Frauen (nach dem Mammakarzinom). Diese Tumoren manifestieren sich meistens nach dem 45. Lebensjahr, mit einem Häufigkeitsgipfel um das 70. Lebensjahr. 90% der kolorektalen Karzinome gehen aus Adenomen hervor. 60% der Karzinome sind im Rektum, 20% im Colon sigmoideum, 10% im Coecum/Colon ascendens und 10% im übrigen Kolon lokalisiert (Herold et al., 1999). Während sich die Inzidenz des kolorektalen Karzinoms von 1960 bis 1980 verdoppelt hat (Schmiegel et al., 2000), verzeichnet die Arbeitsgemeinschaft Bevölkerungsbezogener Krebsregister in Deutschland seit Mitte der 80er Jahre keinen weiteren Anstieg. Die Inzidenz beträgt 15-25 Neuerkrankungen pro 100000 Einwohner und pro Jahr (Schumpelick et al.,1999). Den Angaben des Statistischen Bundesamtes 1998 zufolge stellt das Kolonkarzinom mit 30460 Todesfällen die zweithäufigste karzinombedigte Todesursache dar. Ernährungsfaktoren wie hoher Fett- und Eiweißkonsum, Übergewicht, niedriger Ballaststoffgehalt der Nahrung gelten als begünstigende Faktoren in der Entstehung des kolorektalen Karzinoms. Den Gallensäuren wird ein cokarzinogener Effekt zugeschrieben. Bei ca. 20% der Erkrankten besteht eine genetische Disposition. Zu den hereditären Karzinomen zählen z.B. die familiäre Adenomatosis coli oder das hereditäre, nichtpolypöse Kolonkarzinom-Syndrom (HNPCC) (Schumpelick et al., 1999). Kolorektale Karzinome entstehen aus Epitheldysplasien, wobei über 95% aller Dysplasien in Form von Adenomen auftreten. Manchmal können auch sog. „flache Adenome“ im Schleimhautniveau entstehen, wie bei langjähriger Colitis ulcerosa. Für die Entwicklung kolorektaler Karzinome sind zwei molekulargenetische Wege bekannt. Einerseits spielen proto-Onkogene und Tumorsuppressorgene eine wichtige Rolle, alternativ sind DNA-mismatch-repair-Gene (MMR-Gene) entscheidend in der Karzinogenese (Bruch et al., 1999). 24 Proto-Onkogene sind normale Bestandteile des Genoms und dabei besonders an der Regulation des Zellwachstums und der Zellteilung beteiligt (z.B. k-ras Onkogen). Die Mutation eines solchen Gens kann über spezielle Rezeptoren, veränderte Signalübertragung oder durch den Verlust wichtiger Regulationsmechanismen zum übermäßigen Wachstum eines Zellklons führen. Tumorsuppressorgene (z.B. APC-Gen oder p53) sind zellulär rezessiv wirksame Gene und spielen erst dann eine Rolle, wenn beide Allele von Mutation oder Verlust betroffen sind. Bei hereditären Karzinomen wird ein mutiertes Allel vererbt; das normale (wild-Typ) Allel verhindert jedoch zunächst noch eine maligne Entartung. Geht dieses Allel in einer einzelnen somatischen Zelle auch noch funktionell verloren, kann die Karzinomentwicklung beginnen. In den sogenannten sporadischen Fällen (Mehrzahl aller kolorektalen Karzinome, nicht familiär gehäuft) müssen hingegen beide Allele in einer einzelnen Zelle mutieren oder verloren gehen, um eine maligne Transformation und Karzinomwachstum zu induzieren. DNA-MMR-Gene (z.B. MSH2, MLH1) sind verantwortlich für die Identifikation bestimmter DNA Mutationen und deren Reparatur. Liegen hier Mutationen vor, führt dies zu charakteristischen Instabilitäten repetitiver DNA-Sequenzen als folge von Replikationsfehlern. Das Genom kann als „RER+“ (replication error positive) oder, falls repetitive Sequenzen in sog. Mikrosatelliten Regionen nachgewiesen werden, als „Mikrosatelliten instabil“ (MIN) klassifiziert werden. Von Vogelstein et al. (1988) wurde folgendes Tumorprogressions-Modell entwickelt, das als sog. Dysplasie-Karzinom-Sequenz bezeichnet wird: das normale Epithel geht durch die Mutation oder Verlust des APC-Gens in ein hyperproliferatives Epithel über. Durch eine Methylierungsstörung der DNA entwickelt sich ein frühes Adenom mit geringgradiger Dysplasie. Eine Mutation des k-ras-Onkogens führt dieses in ein intermediäres Adenom mit mittelgradiger Dysplasie über. Folgt darauf ein Verlust des DCC-Tumor-Supressor-Gens entsteht ein spätes Adenom mit hochgradiger Dysplasie. Die Deletion des p53-Gens führt schließlich zur Entstehung des Karzinoms. Weitere Alterationen wie nm23-Deletion führen dann zur Metastasierung. (Abb.II.6.1) 25 Abb. II.6.1 Genetisches Modell der kolorektalen Karzinogenese mit bekannten Mutationen oder Deletionen spezifischer Kolonkarzinom-assoziierter Gene. (Schumpelick et al., 1999). 26 Als Risikogruppen für ein kolorektales Karzinom gelten: familiäre Adenomatosis coli (100%), Colitis ulcerosa (20%), Morbus Crohn (3%), Zustand nach Ureterosigmoidostomie (10%), Patienten mit kolorektalem Adenom (10-50%), Patienten mit positiver Familienanamnese (10%), Normalbevölkerung (3-5%) (Baenkler et al., 1999). Aufgrund des histologischen Differenzierungsmusters lassen sich Dickdarmkarzinome einteilen in: Adenokarzinome (70%), muzinöse Karzinome (20%), anaplastischese Karzinome und in seltene Formen wie Adenoakanthome und Plattenepithelkarzinome. Sie wachsen meist langsam, meist exophytisch, polypös, häufig zentral zerfallend, an den Wandstrukturen orientiert zirkulär und zunächst gut begrenzt. Die lymphogene Ausbreitung erfolgt oft relativ spät entlang unipolaren Metastasenstraßen im Mesocolon und je nach Sitz des Primärtumors zusätzlich in paraaortale, iliakale oder inguinale Lymphknoten. Die hämatogene Metastasierung erfolgt zunächst meistens in die Leber, von dort in die Lunge, erst dann ist eine generalisierte Ausbreitung möglich. Bei tiefsitzenden Karzinomen ist eine primäre Lungenmetastase möglich (Abstrom über V. rectalis inf., V. iliaca, V. cava) (Herold et al., 1999). Die Therapie des kolorektalen Karzinoms besteht aus chirurgischer Resektion sowie adjuvanter Radio- und Chemotherapie. Insgesamt wird die Prognose von der lokalen Ausbreitung, Lymphknotenmetastasierung und Tumordifferenzierung bestimmt. Daran sind die gebräuchlichen Klassifikationen nach Dukes und TNM orientiert (Abb. II.6.2. und II.6.3.). 27 Abb.II.6.2 Aktuelle Klassifikation, Grading und Staging kolorektaler Karzinome. (Schumpelick et al., 1999) 28 Abb.II.6.3 Überlebenszeit beim Kolonkarzinom in Abhängigkeit von der Dukes-Klassifikation. (Schumpelick et al., 1999). Die 5-Jahre-Überlebensrate beim kolorektalen Karzinom beträgt ca. 50% und ist sehr stark vom Stadium abhängig: Stadium I 85%, Stadium II 50-60% (mit Radiotherapie 70%), Stadium III 25-35% (mit (Radio-)Chemotherapie >50%), Stadium IV <5% (Schumpelick et al., 1999). 29 III. AUFGABENSTELLUNG Die bisherigen Literatur- und Forschungsergebnisse zeigen, dass das epitheliale Adhäsionsmolekül E-Cadherin eine wichtige Rolle in der Tumorprogression spielt. Verschiedene maligne Tumoren zeigen im Rahmen der Invasion von umgebenden Strukturen und der weiteren Metastasierung einen Verlust oder eine reduzierte Expression des E-Cadherins. Ziel dieser Arbeit war es, das vollständige humane E-Cadherin Gen hinsichtlich von Mutationen zu analysieren, die dem Verlust bzw. der verminderten Expression des ECadherins zugrunde liegen, wie sie sowohl bei malignen Melanomen als auch bei kolorektalen Karzinomen beschrieben wurden. Dafür wurde aus fünf Melanom- und fünf kolorektalen Karzinom-Zellinien genomische DNA isoliert, die E-Cadherin Exone und Intron-Exon-Übergänge mittels PCR amplifiziert und in einer direkten Cycle-Sequenzierung-Reaktion mit kapillärer Elektrophorese analysiert. 30 IV. MATERIAL UND METHODEN Alle Arbeiten wurden mit sterilen Gefäßen und Pipettenspitzen durchgeführt, sämtliche Puffer und Medien sterilfiltriert oder autoklaviert. Zur Herstellung von Puffern und Medien wurde destilliertes Wasser verwendet. IV.1 PUFFER, MEDIEN UND LÖSUNGEN 2% Agarose-Gel 10 g Agarose 500 ml 1x TBE auf 500ml Agarose kommt 75 µl EtBr Ethidiumbromid 1 mg/ml (1 Tablette auf 10 ml Aqua dest.) Fällungslösung für die Sequenzierung 80 µl HPLC-Aqua dest. 10 µl NaOAc (3M, pH 4,6) 250 µl 100% EtOH 6x Loading Buffer 0,03 g Bromphenol blue 0,03 g Xylencycanol FF 1,8 g Ficoll 12 ml Aqua dest. 31 PBS 8 g NaCl 1,15 g Na2HPO4 0,2 g KH2PO4 0,2 g KCl mit Aqua bidest. auf 1000 ml auffüllen PEG- Mix 52,4 g PEG 8000 40 ml NaOAc (3M, pH 5,2) 1,32 ml MgCl2 bis 200 ml mit Aqua dest. Auffüllen PUC- Marker 5 µl 6x Loading Buffer 2 µl pUC 5 µl Aqua dest. TBE- Puffer 89 mM Tris / HCl 89 mM Borsäure 2 mM EDTA (pH 8,0) 32 IV.2. MATERIALIEN IV.2.1 Chemikalien und Enzyme ABI, Weiterstadt Biozym, Oldendorf Falcon,Heidelberg DNA Sequencing Kit, TSR Agarose Zellkulturartikel Life Technologies, Eggenstein 100bp DNA Ladder, PBS Tablets Merck, Darmstadt HPLC-Aqua dest., Ethanol abs., Borsäure, Natriumacetat, DMSO MBI Fermentas, St.Leon-Rot Qiagen, Hilden PAA, Linz Roche, Mannheim Serva, Bergneustadt Sigma, Steinheim PUC 19 DNA/MspI, 6xLoading Buffer QIAamp Mini Kit Zellkulturmedien dNTPs, MgCl2, 10xPCR Puffer, Taq-Polymerase Tris, EDTA PEG, EtBr, fötales Kälberserum 33 IV.2.2 Molekulargewichtsstandard Verwendet wurden die DNA Längenstandards READY-LOAD 100bp DNA Ladder von GIBCO BRL und der pUC19 DNA/MspI (HpaII) Marker von MBI Fermentas. 100 bp Ladder: 2072 bp pUC Marker: 501 bp 1500 489 1400 404 1300 331 1200 242 1100 190 1000 147 900 111 800 110 700 67 600 34 500 26 400 300 200 100 34 IV.2.3 Geräte und Materialien Autoklav -H+P Labortechnik, Oberschleißheim Brutschrank -Heraeus, Hannau Eppis -Biozym, Oldendorf Elektrophoreseapparaturen -Serva, Heidelberg Pipetten -Eppendorf, Hamburg Pipettenspitzen -Biozym, Oldendorf Thermocycler -Applied Biosystems, Weiterstadt -Hybaid, Heidelberg pH-Meter -WTW, Weilheim Photo-Geräte -MWG-Biotech, Ebersberg Sequenziergerät -Applied Biosystems, Weiterstadt Vortex -IKA Labortechnik, Staufen Zentrifugen -Eppendorf, Hamburg -Heraeus, Hannau IV.2.4 Primer 35 Die folgende Tabelle enthält die für die PCR und Cycle Sequencing benutzten Primer, ihre Annealing-Temperaturen, die für die PCR benötigte MgCl2 Konzentration und die Länge des jeweiligen E-Cadherin PCR- Produkts. Die Positionen des S (sense) und AS (antisense) Primers sind durch die Anzahl der Nukleotiden hinwärts (-y) oder rückwärts (+y) von dem nächsten Exon (bzw. StopCodon für der AS-Primer von Exon 16). Tabelle IV.2.4 Exon No. S Primer ( 5´ - 3´ ) AS Primer (5´- 3´ ) 1 2 3 4 und 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 (-53)tacggggggcggtgctccgg (-34)tcacccggttccatctac (-54)gctcttgtctttaatctgtc (-25)cttgttcctcatcttctttc (-18)ctcacttggttctttcag (-37)agcttgtctaaaccttcatc (-24)ttggttgtgtcgatctctc (-33)gtacttgtaatgacacatct (-24)acttcattgtttctgctctc (-47)gttgtttgctggtcctattc (-54)tggggattcattactgttgc (-44)tttcctcccctggtctcatc (-36)ctctcaacacttgctctgct (-67)catagccctgtgtgtatgac (-57)agatgacaggtgtgcccttc (+59)ctggggcgcggagcttgcgg (+229)caacctcctcttctttat (+75)gtaccaaggctgagaaacct (+151)cccatcacttctccttagca (+60)aacctttgggcttggaca (+116)gcttagaccatcactgtatt (+70)cagtggtacccttagttcat (+36)tgccagtttctgcatcttgc (+41)aaccagttgctgcaagtcag (+48)gaactagctaggaggtcgag (+27)gctaggcagttggagcaaag (+25)tgagtcacttgccagctgga (+22)agagatcaccactgagctac (+33)cggatgctttggctttccac (+51)atttctgcatttcccagcac 36 PCRProdukt(bp) Ann.Temp.(°C) MgCl2 (mM) 282 378 360 603 246 329 223 252 311 253 326 302 209 248 315 70 55 60 55 55 60 55 55 60 60 60 60 60 60 60 2 0 2 0 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 IV.2.5 Zelllinien Melanomzelllinien Mel Im Mel Im si Mel Wei Mel Ju Mel Ho (DSM ACC 109) Die Melanomzelllinien wurden von Jacob et al. (1995 und 1998) näher beschrieben und charakterisiert. Die Zelllinie Mel Ho stammt von der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig). Kolon-Karzinom Zelllinien HCT 116 (ATCC- CCL- 247) SW 48 (ATCC- CCL- 231) HT 29 (ATCC- HTB- 38) CaCo (ATCC- HTB- 37) LoVo (ATCC- CCL-229) Die Kolon-Karzinom Zelllinien stammen von der American Type Culture Collection (ATTC, Rockville, USA). 37 IV.3 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN IV.3.1 Kultivierung von eukaryontischen Zellen Alle verwendeten Zelllinien wurden in DMEM mit 10% FKS und 1% Penicillin/ Streptomycin bei 37°C und 8% CO2 in T75 Zellkulturflaschen kultiviert. Zur Passage der Zellen wurden diese nach Waschen mit PBS für 5 Minuten mit 0,05% Trypsin/ 0,2% EDTA bei 37°C inkubiert, in DMEM mit FKS aufgenommen und 1:5 bis 1:10 verdünnt in neue Zellkulturflaschen verteilt. Ein Mediumwechsel erfolgte jeden zweiten Tag. IV.3.2 DNA- Isolierung Das Zellkulturmedium wurde abpipettiert. Die Zellen wurden mit 5ml PBS gewaschen und in 1 ml PBS mit einem Zellschaber abgekratzt. Diese Zellsuspension wurde 5 Minuten bei 3000 rpm zentrifugiert, der Überstand entfernt und das Zellpellet für die DNA- Isolierung weiterbenutzt. Die DNA-Isolierung erfolgte entsprechend dem in QIAamp DNA Mini Kit (250), QIAGEN vorhandenen Protokoll für die DNA Fällung. Zum Zellpellet wurde 400µl AL Puffer, 50µl Protease K, 80µl Rnase A (10mg/ml) gegeben und vorsichtig gemischt. Diese Mischung wurde für 15 Minuten bei 70°C inkubiert, danach mit 100% Ethanol aufgefüllt und auf die QIAamp Säule aufgetragen. Nach 2 minütiger Zentrifugation bei 8000 U/ Min wurde der Überstand verworfen und 500µl AW1 Puffer dazugegeben. Dies wurde wieder bei 8000 U/ Min für 2 Minuten zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen und AW2 Puffer dazugefügt. Für 2 Minuten 38 wurde diese Mischung bei 14000 U/ Min zentrifugiert, der Überstand verworfen und die Säule getrocknet. Nach zweimaligem Waschen mit 200µl Tris (10mM, pH 7,6) und Inkubation bei 70°C für jeweils 5 Minuten wurde die Säule in ein sauberes Eppi überführt, mit 200µl Aqua dest. aufgefüllt, 1 Minute bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend für 1 Minute bei 8000 U/ Min zentrifugiert. Die so isolierte DNA Lösung wurde für die PCR weiterverwendet. IV.3.3 Polymerase- Ketten- Reaktion ( Polymerase- Chain- Reaction (PCR)) Zur spezifischen Amplifikation der E-Cadherin Exone wurde die Polymerase-ChainReaction (Mullis et al., 1986), angelehnt an die von Berx et al. (1995) beschriebene Modifikation, verwendet. Eingesetzt wurden jeweils 100 ng der aus den Zelllinien isolierten DNA, 50 pmol des jeweiligen Primers, 0.5 µl 5U Taq-Polymerase, 1 µl 10 mM dNTPs, 5µl 10xPCR Puffer, 2-3 mM MgCl2 (siehe Tabelle IV.2.4). Das Reaktionsgemisch wurde auf 50 µl mit destilliertem Wasser aufgefüllt. Nach der initialen Denaturierung bei 95°C für 2 min erfolgte die Amplifikation der DNA durch 35 repetitive Zyklen von Denaturierung (30 Sekunden 94°C), Annealen (30 Sekunden 55-70°C s. Tabelle IV.2.4) und Verlängerung (45 Sekunden 72°C). Bei Exon 1 wurde zusätzlich zu dem PCR- Reaktionsgemisch 2,5% DMSO zugefügt. Die Exone 2 und 4+5 wurden ohne MgCl2 amplifiziert. 39 IV.3.4 Gelelektrophorese Für die Elektrophorese wurden 2%ige Agarose-Gele mit Zusatz von 75µl/ 500ml Ethidiumbromid verwendet. 10 µl des PCR- Templates gemischt mit 3 µl 6x Loading Buffer pipettierte man in die Geltaschen. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte bei 100 Volt. Zum Nachweis der DNA wurden die Gele anschließend unter UVBeleuchtung photographiert. Als DNA-Längenstandard wurde die 100bp DNA Ladder benutzt. IV.3.5 PEG-Fällung Um die PCR-Produkte für die Sequenzierung vorzubereiten, wurden sie nach folgender Methode gefällt: gleiche Menge PCR-Produkt und PEG-Mix (je 40 µl) wurden zusammengegeben, gemischt und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde diese Mischung für 10 Minuten bei 13000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, in das Eppi wurden 100 µl 100% Ethanol dazugegeben und erneut bei 13000 rpm 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde erneut verworfen, der Rest bei Raumtemperatur ca. 20 Minuten getrocknet und in 40 µl destilliertem Wasser aufgenommen. Um die für die Sequenzierung benötigte Menge des PCR-Templates zu bestimmen, wurden 5 µl des Templates mit 5 µl 6x Loading Buffer gemischt und auf ein 2%iges Agarose-Gel aufgetragen. Als Referenzmarker wurde der pUC19/MspI (HpaII) Marker für die DNA-Mengen Bestimmung benutzt. 40 IV.3.6 Sequenzierung (cycle sequencing) Die Sequenzierungsreaktion basiert auf der von Sanger et al. (1977) beschriebenen Didesoxy-Methode, entsprechend dem von der Firma ABI PRISM 310 modifizierten Protokoll. In die Sequenzierunsreaktion wurden 30-90 ng (maximal in 8 µl Volumen) des aufgereinigten PCR- Produkts, 4 µl des DNA-Sequencing Kit (Big Dye Terminator, ABI PE Biosystems), 10 pmol des jeweiligen Primers eingesetzt und mit destilliertem Wasser auf 20 µl Reaktionsvolumen aufgefüllt. Die Cycle Sequencing Reaktion erfolgte in 25 repetitiven Zyklen von 96°C für 10 Sekunden, 55-70°C für 5 Sekunden (abhängig von dem jeweiligen Primer, s. Tabelle IV.2.4) und 60°C für 4 Minuten. Die fertigen Reaktionsprodukte wurden in die Fällungslösung, bestehend aus 80 µl HPLC-Aqua dest., 10 µl 3M Natriumacetatlösung ( pH 4,6 ) und 250 µl 100% Ethanol, überführt und bei Raumtemperatur 15 Minuten bei 15000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und durch 250 µl 75% Ethanol ersetzt. Nach 5 Minuten Zentrifugieren bei 15000 rpm wurde dieser Überstand auch abgenommen und verworfen und die Pellets wurden bei Raumtemperatur ca. 30 Minuten getrocknet. In 25 µl TSR ( Template Suppression Reagent, ABI ) gelöst, wurden die Produkte in Sequenzier-Gefässe überführt, zentrifugiert und 5 Minuten bei 95°C denaturiert. Die Auftrennung und Auswertung der Sequenzierreaktion erfolgte in dem 310-Gerät von ABI PE Biosystems. 41 V. ERGEBNISSE Das humane E-Cadherin Gen ist auf Chromosom 16q22.1 lokalisiert. Es wurde von Berx et al., 1995. isoliert und charakterisiert. Das Gen besteht aus 16 Exonen (Abb. V.1/ Tab. V.1). Die Abbildung V.1 zeigt einige der bisherig gefundenen relevanten Mutationen im E-Cadherin Gen. Abb. V.1 Schematische Darstellung einiger bekannten Mutationen im humanen E-Cadherin Gen. N, Amino-terminales Ende; C, Carboxy-terminales Ende; SIG, Signal-Peptide; PRE, Vorläufer-Sequenz; EC, extrazelluläre Domäne mit Calzium-bindenden Motiven; TM, transmembranäre Domäne; CP, zytoplasmatische Domäne. Die Zahlen unter dem Protein bezeichnen die zugehörige Exons, die Zahlen über dem Protein die Nummer der angrenzenden Codons. Die Reihe a beinhaltet die Mutationen für infiltrative lobuläre Mamma-Karzinome (Berx et al., 1995); die Reihe b für Magen-Karzinome (Becker et al., 1993,1994); die Reihe c für Magen-Karzinom Zelllinien (Oda et al., 1994); die Reihe d für Endometrium- und Ovarial-Karzinome (Risinger et al., 1994) und die Reihe e für lobuläre Mamma-Karzinome (Kania et al., 1994). (STOP, Stop-Codon; FR, frame-shift Mutation; AS, Aminosäure-Substitution; DL, Deletion; SK, ExonSkipping ). (Berx et al., 1995). 42 Für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurden die von Berx et al. (1995) entwickelten Primer, die die Intron-Exon-Übergänge beinhalten benutzt. Aus allen Zelllinien wurde die genomische DNA isoliert und für die PCR weiterverwendet. Bei allen Zelllinien konnten alle 16 Exone amplifiziert werden und auf dem Agarosegel nachgewiesen werden. Als Beispiel zeigt die Abbildung V.2 das Bild von den PCR-Produkten für Exon 1 für die Zelllinien HTC116, Mel Im si, SW48, CaCo, LoVo, Mel Im und HT29. In den Abbildungen V.3 und V.4 sind die PCR-Produkte für die Exone 3, 7,10-16 für die Zelllinien Mel Im und HT 29 dargestellt. Abb. V.2 Agarose-Gel von den PCR-Produkten für Exon 1 von den Zelllinen HTC 116, Mel Im Si, Sw 48, CaCo, LoVo, Mel Im und HT 29. 43 Abb. V.3 Agarose-Gel von den PCR-Produkten für die Exone 3, 7, 10-16 von der Zelllinie Mel Im und für Exon 16 von der Zelllinie CaCo. Abb. V.4 Agarose-Gel von den PCR-Produkten für die Exone 3, 7, 10-16 von der Zelllinie HT 29 und für die Exone 13 und 16 von der Zelllinie SW 48. Nachdem diese PCR-Produkte aufgereinigt wurden, konnten sie für die Sequenzierung verwendet werden. 44 Bei den Melanom-Zelllinien konnte keine Mutation im Exon-Bereich nachgewisen werden. Bei den kolorektal Karzinom-Zelllinien wurde bei der Zelllinie HTC 116 im Exon 3 die heterozygote Deletion der Base 196 (Guanin) gefunden (Abb.V.5). Weiterhin fand sich bei allen fünf kolorektal Karzinom-Zelllinien im Exon 13 die Punktmutation der Base 139 (Cytosin zu Thymin). Diese Punktmutation war homozygot bei den Zellinien CaCo und HT 29 (Abb. V.6) und heterozygot bei LoVo, SW 48 und HCT 116. Diese Punktmutation führt zu keiner Veränderung in der Aminosäuresequenz, denn sie kodiert weiterhin die Aminosäure Alanin. Abb. V.5 Sequenz von Exon 3 der Zelllinie HTC 116 mit der heterozygoten Deletion der Base 196 (Guanin). Im Bild ist das die Base 226. 45 Abb. V.6 Sequenz von Exon 13 im Beispiel von der Zelllinie HT 29 mit der homozygoten Punktmutation der Base 139 (Cytosin zu Thymin). Im Bild ist das die Base 165. In den Intron-Bereichen fanden sich zwei neue Punktmutationen und eine Insertion der Base G in allen Zelllinien, sowie eine zusätzliche Punktmutation bei der Zelllinie HT 29. Obwohl diese Veränderungen in der Nähe der Intron-Exon-Übergängen sind, haben sie keinen Einfluss auf die Transkription oder Translation des E-Cadherins. Die Ergebnisse sind in der Tabelle V.2 dargestellt. Diese Ergebnisse zeigen, dass mit Ausnahme der Zelllinie HTC 116 weder bei den Melanom- noch bei den kolorektal Karzinom-Zelllininen Mutationen zu finden sind, die zu einem Verlust des E-Cadherins führen. 46 Tabelle V.1: Die Exone des E-Cadherin Gens Kursiv dargestellt sind die Intron-Bereiche. Exon 1: gcttgcggaa gtcagttcag actccagccc gctccagccc ggcccgaccc gaccgcaccc ggcgcctgcc ctcgctcggc gtccccggcc agccatgggc ccttggagcc gcagcctctc ggcgctgctg ctgctgctgc aggtacctcg ga Exon 2: ttcccccacc ccaggtctcc tcttggctct gccaccacgg ggagccctgc caccctggct ttgacgccga gagctacacg ttcacggtgc cccggcgcca cctggagaga ggccgcgtcc tgggcagagg tgagggcgc Exon 3: atttctccct gcagtgaatt ttgaagattg caccggtcga caaaggacag cctatttttc cctcgacacc cgattcaaag tgggcacaga tggtgtgatt acagtcaaaa ggcctctacg gtttcataac ccacagatcc atttcttggt gtacgcctgg gactccacct acagaaagtt ttccaccaaagtcacgctga atacagtggg gcaccaccac cgccccccgc cccatcaggt atgttggc Exon 4: ttctttcctt ttaggcctcc gtttctggaa tccaagcaga attgctcaca tttcccaact cctctcctgg cctcagaaga cagaagagag actgggttat tcctcccatc agctgcccag aaaatgaaaa aggcccattt cctaaaaacc tggttcaggt agagaaac Exon 5: cattttgtct tcagatcaaa tccaacaaag acaaagaagg caaggttttc tacagcatca ctggccaagg agctgacaca ccccctgttg gtgtctttat tattgaaaga gaaacaggat ggctgaaggt gacagagcct ctggatagag aacgcattgc cacatacact gtaagtatct Exon 6: cttggttctt tcagctcttc tctcacgctg tgtcatcca cgggaatgca gttgaggatc caatggagat tttgatcacg gtaaccgatc agaatgacaa caagcccgaa ttcacccagg aggtctttaa ggggtctgtc atggaaggtg ctcttccagg tatatccac Exon 7: ttgaactctt ccaggaacct ctgtgatgga ggtcacagcc acagacggcgg acgatgatgt gaacacctac aatgccgcca tcgcttacac catcctcagc caagatcctg agctccctga caaaaatatg ttcaccatta acaggaacac aggagtcatc agtgtggtca ccactgggct ggaccgagag gtcaggggtc Exon 8: cgatctctct gcagagtttc cctacgtata ccctggtggt tcaagatgct gaccttcaag gtgaggggtt aagcacaaca gcaacagctg tgatcacagt cactgacacc aacgataatc ctccgatctt caatcccacc acggtaattc tat Exon 9: tctttgctct gcagtacaag ggtcaggtgc ctgagaacga ggctaacgtc gtaatcacca cactgaaagt gactgatgct gatgccccca ataccccagc gtgggaggct gtatacacca tattgaatga tgatggtgga caatttgtcg tcaccacaaa tccagtgaac aacgatggca ttttgaaaac agcaaaggtt tgtatgg Exon 10: tttctgctct ctagggcttg gattttgagg ccaagcagca gtacattcta cacgtagcag tgacgaatgt ggtacctttt gaggtctctc tcaccacctc cacagccacc gtcaccgtgg atgtgctgga tgtgaatgaa gcccccatct ttgtgcctcc tgaaaagaga gtggaagtgt ccgaggactt tggcgtgggc caggaaatca catcctacac tgcccaggag ccagacacat ttatggaaca gaaaataacg taagtgtga Exon 11: ttgtccccgt tcagatatcg gatttggaga gacactgcca actggctgga gattaatccg gacacaggtg ccatttccac tcgggctgag ctggagaccc aggattttga gcacgtgaag aacagcacgt acacagaaat aatcatagct acagacaatg gtaagggggc 47 Exon 12: gtattttctc ttaggttctc cagttgctac tggaacaggg acacttctgc tgatcctgtc tgatgtgaat gacaacgccc ccataccaga acctcgaact atattcttct gtgagaggaa tccaaagcca caggtcataa acatcattga tgcagacctt cctcccaata catctccctt cacagcagaa ctaacacacg gggcgactgc caactggacc attcagtaca acgacccaag tgggtacct Exon 13: attgctttct ccagcccaag aatctatcat tttgaagcca aagatggcct tagaggtggg tgactacaaa atcaatctca agctcatgga taaccagaat aaagaccaag tgaccacctt agaggtcagc gtgtgtgact gtgaaggggc cgccggcgtc tgtaggaagg cacagcctgt cgaagcagga ttgcaaattc ctgccattct ggggattctt ggaggaattc ttgctttgct aagtaagtcc ag Exon 14: ccccaccatc ccagttctga ttctgctgct cttgctgttt cttcggagga gagcggtggt caaagagccc ttactgcccc cagaggatga cacccgggac aacgtttatt actatgatga agaaggaggc ggagaagagg accaggtggg ttttg Exon 15: ttttttctcc aaaggacttt gacttgagcc agctgcacag gggcctggac gctcggcctg aagtgacacg taacgacgtt gcaccaaccc tcatgagtgt cccccggtat cttccccgcc ctgccaatcc cgatgaaatt ggaaatttta ttgatgaagt aagtaatc Exon 16: cccttcttct tgagaatctg aaagcggctg atgctgaccc cacagccccg ccttatgatt ctctgctcgt gtttgactac gaaggaagca gttccgaagc tgctagtctg agctccctga actcctcaga gtcagacaaa gaccaggact atgactactt gaacgaatgg ggcaatcgct tcaagaagct ggctgacatg tacggaggcg gcgaggacga ctaggggact cgagagaggc gggccccaga cccatgtgct gggaaatgca gaaat 48 Tabelle V. 2: Ergebnisse der Sequenzierung: Ergebnisse Melanom-Zellinien: Mel Im : Exon 3: Base7 (Intron) Insertion G Exon 4: Base 168 (Intron) Punktmutation C→G Exon 16: Base 12 (Intron) Punktmutation G→T Mel Im si : Exon 3: Base 7 (Intron) Insertion G Exon 4: Base 168 (Intron) Punktmutation C→G Exon 16: Base 12 (Intron) Punktmutation G→T Mel Ju : Exon 3: Base 7 (Intron) Insertion G Exon 4: Base 168 (Intron) Punktmutation G→T Exon 16: Base 12 (Intron) Punktmutation G→T Mel Wei : Exon 3: Base 7 (Intron) Insertion G Exon 4: Base 168 (Intron) Punktmutation C→G Exon 16: Base 12 (Intron) Punktmutation G→T Mel Ho : Exon 3: Base 7 (Intron) Insertion G Exon 4: Base 168 (Intron) Punktmutation C→G Exon 16: Base 12 (Intron) Punktmutation G→T 49 Ergebnisse kolorektal Karzinom-Zelllinien: CaCo : Exon 3: Base 7 (Intron) Insertion G Exon 4: Base 168 (Intron) Punktmutation C→G Exon 13: Base 139 Punktmutation C→T homozygot (Ala-Ala) Exon 16: Base 12 (Intron) Punktmutation G→T HCT 116 : Exon 3: Base 7 (Intron) Insertion G Base 196 Deletion G heterozygot (Frame-shift-Mutation) Exon 4: Base 168 (Intron) Punktmutation C→G Exon 10: Base 11 (Intron) Punktmutation C→A Exon 13: Base 139 Punktmutation C→T heterozygot (Ala-Ala) Exon 16: Base 12 (Intron) Punktmutation G→T SW 48 : Exon 3: Base 7 (Intron) Insertion G Exon 4: Base 168 (Intron) Punktmutation C→G Exon 13: Base 139 Punktmutation C→T heterozygot (Ala-Ala) Exon 16: Base 12 (Intron) Punktmutation G→T LoVo : Exon 3: Base 7 (Intron) Insertion G Exon 4: Base 168 (Intron) Punktmutation C→G Exon 13: Base 139 Punktmutation C→T heterozygot (Ala-Ala) Exon 16: Base 12 (Intron) Punktmutation G→T HT 29 : Exon 3: Base 7 (Intron) Insertion G Exon 4: Base 168 (Intron) Punktmutation C→G Exon 10: Base 11 (Intron) Punktmutation C→A Exon 13: Base 139 Punktmutation G→T homozygot (Ala-Ala) Exon 16: Base 12 (Intron) Punktmutation G→T 50 VI. DISKUSSION Adhäsionsmoleküle sind transmembranöse Glykoproteine, die auf der Zellmembran nahezu aller Körperzellen vorkommen. Sie besitzen zwei bindende Domänen: eine extrazelluläre und eine intrazytoplasmatische, funktionelle. Die Adhäsionsmoleküle treten typischerweise nur zeitlich begrenzt auf der Zellmembranoberfläche auf. Das Vorhandensein oder Fehlen von Adhäsionsmolekülen kann die Fähigkeit mancher maligner Tumoren, unkontrolliert zu wachsen, lokal zu invadieren und zu destruieren oder zu metastasieren, in ganz entscheidendem Ausmaße beeinflussen. Der durch Adhäsionsmoleküle vermittelte Kontakt zwischen zwei Zellen löst verschiedene Signale aus: die Aktivierung intrazellulärer Botenstoffe für die Expression verschiedener Gene, die Veränderungen von Proteinen des Zytoskeletts mit dem Ziel, Zellbewegungen auszulösen und ferner die Aggregation von Oberflächenproteinen zur Verstärkung von Zell-Zell-Kontakten und eine Exozytose. Es werden fünf Hauptfamilien von Adhäsionsmolekülen unterschieden: die Integrine, die Immunglobulinähnliche Superfamilie, die Selektine, die Cadherine und CD44. (Oberholzer, 2001). Das komplexe Zusammenspiel von Adhäsionsmolekülen bestimmt die Struktur und Dynamik von Geweben. In neoplastischen Geweben ist dieses Zusammenspiel gestört. Histopathologisch äußert sich dies in einer im Vergleich zum Normalgewebe verminderten Differenzierung. Mit zunehmender Entdifferenzierung lösen sich einzelne Zellen aus dem Gewebsverband. Vorausgesetzt, diese Zellen sind mobil und mit den erforderlichen Bindungsproteinen ausgestattet, invadieren sie Lymphspalten und/oder das interstitielle Bindegewebe. Der Verlust der Gewebsstruktur und invasives Wachstum sind daher oft miteinander gekoppelt. Da Zelladhäsionsmoleküle die Struktur eines Gewebes wesentlich bestimmen, kann der Verlust adhäsiver Eigenschaften ursächlich für eine verminderte Differenzierung und invasive Wachstumseigenschaften des Tumors verantwortlich sein. 51 Unter den verschiedenen Typen der Cadherine ist das E-Cadherin am besten charakterisiert. Das E-Cadherin kommt vor allem in der Zona adhärens von Epithelzellen vor und ist intrazellulär mit dem Zytoskelett über α-Actin verbunden. In verschiedenen Geweben wurde E-Cadherin als das entscheidende Zelladhäsionsmolekül identifiziert, welches für die Gewebsdifferenzierung zuständig ist und häufig bei metastasierenden und invasiv wachsenden Karzinomen eine fehlende oder verminderte Expression zeigt (Cowley et al., 1996, Sanders et al., 1999, Moll et al., 1993, Berx et al.,1995). In der Literatur wurden bis jetzt verschiedene Mutationen des E-Cadherin Gens beschrieben. So fand man sehr seltene Keimbahn-Mutationen im E-Cadherin Gen bei Familien mit erblicher Prädisposition für Magen- und Mammakarzinome (Guilford et al., 1998, Gayther et al., 1998, Keller et al., 1999). Somatische Mutationen, die zum Verlust der E-Cadherin Expression geführt haben, wurden weiterhin bei lobulären Mammakarzinomen und Magenkarzinomen vom diffusen Typ beobachtet (Becker et al., 1994, Berx et al., 1995). Für die verminderte Expression des E-Cadherins, wie sie häufig bei kolorektalen Karzinomen beschrieben wurde, fand man keine Mutation (Braungart et al., 1999, Schuhmacher et al., 1999). Andererseits, wenn Mutationen vorhanden waren, blieben sie entweder stumm oder befanden sich im Intron-Bereich (Efstathiou et al., 1999). Bei malignen Melanomen wurden bis jetzt keine Mutationen gefunden, vielmehr ergaben sich Hinweise, die darauf deuten, dass die Regulation des E-Cadherins über andere Mechanismen abläuft (Batsche et al., 1998, Poser et al., 2001). 52 Ziel dieser Arbeit war es daher, das vollständige E-Cadherin Gen hinsichtlich von Mutationen zu analysieren. Dafür wurde aus fünf Melanom- und fünf kolorektalen Karzinom-Zelllinien genomische DNA isoliert, die E-Cadherin Exone und Exon-IntronÜbergänge mittels PCR amplifiziert und in einer direkten Cycle-Sequencing-Reaktion mit kapillärer Elektrophorese analysiert. Bei den kolorektalen Karzinom-Zelllinien konnte eine heterozygote Frame-shift-Mutation in einer Zelllinie nachgewiesen werden. Darüber hinaus im Exon 13 eine Punktmutation, die einen Polymorphismus des Kodons der Aminosäure Alanin darstellt. Bei den Melanom-Zelllinien war keine Mutation zu finden. Drei neue Punktmutationen fanden sich im Intron-Bereich bei allen Zelllinien. Diese Ergebnisse unterstützen die These, dass die sehr häufig zu beobachtende verminderte oder fehlende E-Cadherin Expression, nur selten mit Mutationen im ECadherin Gen einhergeht, die zu einer strukturellen Inaktivierung des Proteins führen (Hirohashi S., 1998). Unter dem Gesichtspunkt der allgemeinen Tumorprogression, ist für die Ausbildung der Metastasen ein funktionell intaktes E-Cadherin Gen wahrscheinlich sogar günstig. Von Birchmeier (1994) wurde ein Modell entwickelt, das die epitheliale-mesenchymale Konversion beschreibt. Demnach ist in Primärtumoren die E-Cadherin Expression normal oder sogar gesteigert und die Tumorzellen haben ihre epitheliale Form. Wird die E-Cadherin Expression reprimiert, beginnen die Zellen invasiv zu wachsen und nehmen eine fibroblastenähnliche Form an. Diese Entdifferenzierung ist für die Tumorzellen essentiell, um sich im Bindegewebe, entlang der Lymphbahnen oder Richtung Blutgefässe zu wandern. Um allerdings solide Metastasen ausbilden zu können, brauchen die Tumorzellen einen festen Zusammenhalt und damit auch E-Cadherin. So beobachtet man in Metastasen eine erneute Re-Expression des E-Cadherins und eine epitheliale Redifferenzierung der Tumorzellen. 53 Die Heraufregulierung des intakten Genes hilft bei der Etablierung der Fernmetastase. Insofern sind komplett inaktivierende Mutationen beider Allele des E-Cadherin Gens in diesen Tumoren offenbar selten. Ähnliche Beobachtungen, die den Zusammenhang zwischen dem Verlust der ECadherin Expression bzw. funktionsfähigem E-Cadherin und gleichzeitiger Aktivierung anderer Proteine wie Fibronektin, Vimentin oder nuklearer β-Catenin und daraus resultierendem Verlust der epithelialen Differenzierung beschrieben, wurden auch von Brabletz et al., 2001 und Hirohashi, 1998 publiziert. Brabletz (2002) wies auf das onkogene Potetial von nuklearem β-Catenin bei kolorektalen Karzinomen hin. Eine große Gruppe von Genen, die die Umwandlung von differenzierten, epithelialen zu entdifferenzierten, mesenchymalen Tumorzellen bewirken, werden durch β-Catenin/TCF reguliert. Auch bei malignen Melanomen ist die Herabregulation von E-Cadherin im Rahmen von Invasion und Metastasierung ein transientes, transkriptionell über den Transkriptionsfaktor Snail reguliertes Phänomen (Poser et al., 2001). In der überwiegenden Mehrheit der Tumoren ist die Ursache für den Verlust von ECadherin daher sehr heterogen (Moll et al., 1993). Die Herabregulierung des E-Cadherin Gens wird auch von der „Mikro-Umgebung“ (microenvironment) der Tumorzellen bestimmt (Vanderbossche et al., 1994, Mareel et al., 1991, Brabletz et al., 2001). Das den Tumor umgebende Stroma und Stromazellen beeinflussen das Tumorwachstum und Angiogenese durch verschiedene Enzyme und Zytokine. Karzinome, bei denen inaktivierende Mutationen auftreten, sind vom histomorphologischen Typ Tumoren, bei denen die Zellen vereinzelt und diffus wachsen, wie das lobuläre Mammakarzinom und das diffuse Magenkarzinom. Diesen Tumoren müssen daher andere molekulare Mechanismen der Metastasierung zugrunde liegen. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass sowohl interzelluläre Kontakte, biochemische Prozesse oder interzelluläre Kommunikation die E-Cadherin Expression beeinflussen 54 können. Wie auch übereinstimmend in der hier vorliegenden Arbeit beobachtet wurde, liegen irreversible genetische Alterationen der verminderten Transkription des ECadherin Gens bzw. der verminderten E-Cadherin Expression und damit der Invasion und Metastasierung bei malignen Melanomen und kolorektalen Karzinomen somit nicht zugrunde. 55 VII. ZUSAMMENFASSUNG E-Cadherin gehört zu einer Familie strukturell verwandter Proteine, die zu den Zelladhäsionsmolekülen zählen. Es hat eine zentrale Bedeutung in der Embryonalentwicklung und vermittelt wichtige Signale für die Morphogenese epithelialer Gewebe. Darüber hinaus zeigen bisherige Forschungsergebnisse, dass E-Cadherin eine wichtige Rolle in der Tumorprogression spielt. Verschiedene maligne Tumoren zeigen bei Invasion der umgebenden Strukturen und auch bei Fernmetastasierung einen Verlust oder Verminderung der E-Cadherin-Expression. Der für diesen Verlust bzw. für die Regulation auf molekularer Ebene verantwortliche Mechanismus ist weitgehend unbekannt. Eine Möglichkeit beinhaltet inaktiverende Mutationen des E-Cadherin Gens. In der vorliegenden Arbeit wurde daher untersucht, ob im E-Cadherin Gen Mutationen zu finden sind, die den Verlust der Expression des E-Cadherins, die sowohl bei malignen Melanomen als auch bei kolorektalen Karzinomen beobachtet wurden, belegen würden und ob diese die bisherigen Erkenntnisse stützen. Für diesen Zweck wurde aus fünf Melanom- und fünf kolorektalen Karzinom-Zelllinien genomische DNA isoliert, die E-Cadherin Exone und Intron-Exon-Übergänge mittels der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) amplifiziert und in einer direkten Cycle- Sequenzierung-Reaktion mit kapillärer Elektrophorese analysiert. Bei den kolorektalen Karzinom-Zelllinien konnte eine heterozygote Frame-shift-Mutation in einer Zelllinie nachgewiesen werden. Darüber hinaus im Exon 13 eine Punktmutation, die einen Polymorphismus der Aminosäure Alanin darstellt. Bei den Melanom-Zelllinien war keine Mutation zu finden. Drei neue Punktmutationen fanden sich im Intron-Bereich bei allen Zelllinien, allerdings keine, die die Transkription oder die Translation des ECadherins beeinflusst. 56 Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass Mutationen im E-Cadherin-Gen für die verminderte E-Cadherin-Expression nicht verantwortlich sind, sondern die Fehlregulierung auf anderen molekularen oder zellulären Ebenen abläuft. Die Herabregulierung von E-Cadherin bei der Tumorinvasion ist ein transientes Phänomen und die Heraufregulierung des intakten Genes ist vielfach bei der Etablierung von Fernmetastasen zu beobachten. Insofern sind komplett inaktivierende Mutationen im E-Cadherin Gen offenbar selten und für den Ablauf der systemischen Metastasierung in den meisten Fällen nicht verantwortlich. 57 VIII. LITERATURVERZEICHNIS Aberle, H., H. Schwartz, R. Kemler: Cadherin-catenin complex: protein interactions and their implications for cadherin function. J Cell Biochem: 61 (1996) 514 Baenkler, H.W. et al., Unter Mitarbeit von Clement, U. et al. : Innere Medizin. Stuttgart: Hippokrates-Verlag im Thieme-Verlag, 1999 Bar-Eli, M. : Role of AP-2 in tumor growth and metastasis of human melanoma. Cancer Metastasi Rev: 18 (1999) 377 Batsche, E., C. Murhardt, J. Behrens, H.C. Hurst, C. 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Mein besonderer Dank gehört Prof. Dr. med. Reinhard Büttner für seine Unterstützung, Hilfe und Verständnis. Prof. Dr. rer.nat. Anja-Katrin Bosserhoff danke ich für ihre Hilfe, Anregungen und praktische Hilfeleistung. Allen Mitarbeitern der Abteilung möchte ich für die Hilfe und das gute Arbeitsklima danken, ganz besonders Inge Losen, Sandra Reuschenberg und Ellen Paggen. Mein Dank gehört noch allen Mitarbeitern des Instituts für Pathologie Bonn-Duisdorf, der IMoGen GmbH und Bollmann.com. Dr. Norbert Speich danke ich für die schnelle Hilfe bei der Sequenzierung einiger Proben. Oliver Hahn danke ich für die technische Hilfe am PC. Besonderer Dank auch meinen Eltern Dr. med. Reinhard Bollmann und Dr. med. Magdolna Bollmann für ihre Zuversicht und Unterstützung. Dr.med. Levente Varnai und Kai Händel danke ich für die moralische Unterstützung. 66 Lebenslauf Persönliche Daten Name, Vorname: Anschrift: Telefonnummer: Geburtsdatum: Geburtsort: Nationalität: Religion: Familienstand: Varnai, Alinda Dalma Moltkestr.32, 50674 Köln 0179-7072176 17.05.1976 Pecs, Ungarn Niederländisch katholisch ledig Schulbildung 1982 – 1990 1990 – 1991 1991 – 1995 1995 Besuch der Grundschulen in Knezevi Vinogradi, Osijek und Zagreb, Kroatien Besuch des Naurwissenschaftlichen Gymnasiums Zagreb Besuch des Mathematisch Naturwissenschaftlichen Gymnasiums Mönchengladbach Abitur Studium Seit 1995 September 1997 September 1998 März 2001 Bis März 2002 25.06.2002 Studium der Medizin an der RWTH Aachen Ärztliche Vorprüfung 1. Staatsexamen 2. Staatsexamen Praktisches Jahr im Klinikum der RWTH Aachen Ärztliche Prüfung (3. Staatsexamen) 01.08.2002 Ärztin im Praktikum in der Chirurgischen Abteilung Marienhospital, Euskirchen Publikation „Loss of E-cadherin expression in melanoma cells involves upregulation of the transcriptional repressor Snail“ (Poser, I. et al., J Biol Chem: 267(27), April 2001) Sprachkenntnisse Ungarisch (Muttersprache) Deutsch, fließend Englisch, fließend Kroatisch, fließend Serbisch, fließend Niederländisch, Grundkenntnisse 67
