Aus dem Zentrum für Pathologie der Universität zu Köln Allgemeine

Aus dem Zentrum für Pathologie der Universität zu Köln
Allgemeine Pathologie und Pathologische Anatomie
Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. H. P. Dienes
Immunreaktivität von MUC1 in kolorektalen Adenomen und Karzinomen unter
besonderer Berücksichtigung der Glykosylierungsabhängigkeit
Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde
der Hohen Medizinischen Fakultät
der Universität zu Köln
vorgelegt von
Sonja Christiane Zuber
aus Donaueschingen
promoviert am 13. Oktober 2010
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät
der Universität zu Köln
2010
Dekan:
Universitätsprofessor Dr. med. J. Klosterkötter
1. Berichterstatterin/Berichterstatter:
Universitätsprofessor Dr. med. S. E. Baldus
2. Berichterstatterin/Berichterstatter:
Professor Dr. med. S. P. Mönig
Erklärung
Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Dissertationsschrift ohne unzulässige Hilfe
Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus
fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich
gemacht.
Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des Manuskriptes
habe ich, außer von Herrn Universitätsprofessor Dr. med. S. E. Baldus, keine
Unterstützungsleistungen erhalten.
Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt.
Insbesondere habe ich nicht die Hilfe einer Promotionsberaterin/eines Promotionsberaters in
Anspruch genommen. Dritte haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte
Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten
Dissertationsschrift stehen.
Die Dissertationsschrift wurde von mir bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher
oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.
Köln, den 20.01.2010
Die dieser Arbeit zugrunde liegenden Daten wurden von mir persönlich im Archiv des
Zentrums für Pathologie der Universität zu Köln (Direktor: Herr Universitätsprofessor Dr.
med. H. P. Dienes) erhoben.
Die in dieser Arbeit angegebenen immunhistochemischen Färbungen wurden von mir selbst
im Labor von Herrn Universitätsprofessor Dr. med. S. E. Baldus durchgeführt.
Die Beurteilung und Auswertung der Präparate wurde nach entsprechender Anleitung durch
Herrn Universitätsprofessor Dr. med. S. E. Baldus von mir selbstständig durchgeführt.
Die Fotografien der immunhistochemischen Färbung wurden mir von Herrn Universitätsprofessor Dr. med. S. E. Baldus zur Verfügung gestellt.
Danksagung
Für die Möglichkeit, meine Dissertation am Zentrum für Pathologie der Universität zu Köln
erstellen zu können, danke ich Herrn Universitätsprofessor Dr. med. H. P. Dienes.
Weiterhin bedanke ich mich bei Herrn Universitätsprofessor Dr. med. S. E. Baldus für die
Überlassung des Themas und die freundliche und hilfsbereite Unterstützung bei der Durchführung dieser Arbeit.
Ebenso bedanke ich mich bei Herrn Prof. Dr. rer. nat. F.-G. Hanisch und Frau Dr. rer. nat. K.
Engelmann, Zentrum für Biochemie der Universität zu Köln, für die freundliche Bereitstellung der MUC1-spezifischen monoklonalen Antikörper, sowie die hilfsbereiten und fachkundigen Gespräche bei der Planung dieser Arbeit.
Insbesondere bedanke ich mich bei Frau S. Landsberg, biologisch-technische Assistentin, für
ihre freundliche und fachkundige Unterstützung bei der praktischen Umsetzung der immunhistochemischen Färbung.
Gewidmet meiner Familie
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
___________________________________________________________________________
1
Einleitung _____________________________________________________________ 1
1.1
Kolorektale Adenom-Karzinom-Sequenz _________________________________ 1
1.1.1 Definition _______________________________________________________ 1
1.1.2 Epidemiologie ____________________________________________________ 1
1.1.3 Ätiologie ________________________________________________________ 3
1.1.4 Histomorphologische Einteilung ______________________________________ 7
1.1.4.1
Kolorektale Adenome __________________________________________ 7
1.1.4.2
Kolorektale Karzinome _________________________________________ 9
1.1.5 Therapeutische Aspekte ___________________________________________ 13
1.1.5.1
Prognostische Parameter _______________________________________ 13
1.1.5.2
Therapieoptionen _____________________________________________ 15
1.1.6 Molekulare Kanzerogenese _________________________________________ 19
1.2
Muzine___________________________________________________________ 26
1.2.1 Grundstrukturen der Muzine ________________________________________ 26
1.2.1.1
Synthese der Oligosaccharidketten _______________________________ 32
1.2.2 MUC1: Struktur__________________________________________________ 33
1.2.3 MUC1: Biologische Relevanz _______________________________________ 36
1.2.4 Expression von Muzinantigenen im Kolon _____________________________ 39
1.2.4.1
Expression von Muzinantigenen in normalem Kolongewebe___________ 39
1.2.4.1.1 Peptid-Core-Antigene ______________________________________ 39
1.2.4.1.2 Kohlenhydratantigene ______________________________________ 40
1.2.4.2
Expression
von
Muzinantigenen
in
kolorektalen
Adenomen
und
Karzinomen _________________________________________________________ 41
1.2.4.2.1 Peptid-Core-Antigene ______________________________________ 42
1.2.4.2.2 Kohlenhydrat-Core-Antigene ________________________________ 43
1.2.4.2.3 Kohlenhydratantigene der Backbone- und peripheren Region _______ 44
1.3
2
Fragestellung der Arbeit _____________________________________________ 46
Material und Methoden ________________________________________________ 47
2.1
Patienten und Gewebe _______________________________________________ 47
2.2
MUC1-spezifische monoklonale Antikörper _____________________________ 47
2.2.1 HMFG2 ________________________________________________________ 47
2.2.2 BCP8 (#133) ____________________________________________________ 48
Inhaltsverzeichnis
2.2.3 115D8 (#148) ___________________________________________________ 48
2.2.4 MA695 (#154) ___________________________________________________ 48
2.3
Immunhistochemische Methode _______________________________________ 48
2.3.1 Ablauf der Färbung _______________________________________________ 48
2.3.1.1
Allgemeines über die Labeled-Streptavidin-Biotin-Methode ___________ 48
2.3.1.2
Coverplate-Methode __________________________________________ 49
2.3.1.3
Entparaffinierung ____________________________________________ 50
2.3.1.4
Partielle Deglykosylierung durch Vorbehandlung mit Neuraminidase ___ 50
2.3.1.5
Partielle Deglykosylierung durch Vorbehandlung mit Perjodat _________ 50
2.3.1.6
Ohne Vorbehandlung _________________________________________ 51
2.3.1.7
Hemmung der endogenen Peroxidase _____________________________ 51
2.3.1.8
Hemmung unspezifischer Proteinbindungen _______________________ 51
2.3.1.9
Die Immunmarkierung ________________________________________ 51
2.3.1.10
Markierung mit dem Sekundärantikörper ________________________ 52
2.3.1.11
Kopplung des Meerrettichperoxidase-konjugierten Streptavidins _____ 52
2.3.1.12
Entwicklung ______________________________________________ 52
2.3.2 Rezepte ________________________________________________________ 53
2.3.2.1
Zitratpuffer _________________________________________________ 53
2.3.2.2
Azetatpuffer _________________________________________________ 53
2.3.2.3
Peroxidase-Blocker ___________________________________________ 53
2.3.2.4
TBS-Puffer (tris buffer solution) _________________________________ 53
2.3.2.5
Entwicklerlösung _____________________________________________ 53
2.3.2.5.1 Lösung I _________________________________________________ 53
2.3.2.5.2 Lösung II ________________________________________________ 53
2.3.2.6
Hämalaun __________________________________________________ 54
2.3.3 Lichtmikroskopische Auswertung____________________________________ 54
3
Ergebnisse ___________________________________________________________ 55
3.1
Immunreaktivität MUC1-spezifischer monoklonaler Antikörper in kolorektalen
Adenomen vor und nach partieller Deglykosylierung ____________________________ 57
3.1.1 HMFG2 ________________________________________________________ 59
3.1.2 BCP8 __________________________________________________________ 61
3.1.3 115D8 _________________________________________________________ 63
3.1.4 MA695 ________________________________________________________ 65
3.2
Immunreaktivität MUC1-spezifischer monoklonaler Antikörper in kolorektalen
Karzinomen vor und nach partieller Deglykosylierung ___________________________ 67
3.2.1 HMFG2 ________________________________________________________ 68
3.2.2 BCP8 __________________________________________________________ 69
3.2.3 115D8 _________________________________________________________ 70
3.2.4 MA695 ________________________________________________________ 72
4
Diskussion ___________________________________________________________ 74
4.1
Relevanz von MUC1 in der kolorektalen Adenom-Karzinom-Sequenz _________ 74
4.2
Expression von MUC1 in der Adenom-Karzinom-Sequenz __________________ 76
4.3
Methoden der partiellen Deglykosylierung _______________________________ 80
4.3.1 Perjodat-Oxidation _______________________________________________ 80
4.3.2 Neuraminidase-Behandlung ________________________________________ 82
4.4
Fazit _____________________________________________________________ 85
5
Zusammenfassung _____________________________________________________ 86
6
Literaturverzeichnis ___________________________________________________ 88
7
Abbildungsverzeichnis ________________________________________________ 106
8
Tabellenverzeichnis ___________________________________________________ 107
9
Lebenslauf __________________________________________________________ 109
Einleitung
1
1 Einleitung
___________________________________________________________________________
1.1 Kolorektale Adenom-Karzinom-Sequenz
1.1.1
Definition
Die kolorektale Adenom-Karzinom-Sequenz beschreibt die morphologischen und genetischen
Ereignisse, die über ein Adenom zu einem kolorektalen Karzinom führen. Adenome sind
gutartige, polypös erhabene epitheliale Tumoren der Dickdarmschleimhaut mit drüsiger
Differenzierung. Sie können sich im Laufe der Zeit über eine Veränderung ihres Dysplasiegrades in ein kolorektales Karzinom umwandeln [210, 223, 270]. Das kolorektale Karzinom
ist ein Sammelbegriff für alle malignen epithelialen Primärtumoren des Kolons, einschließlich
des Rektums mit drüsiger Differenzierung. Dabei zählen international alle Tumoren, deren
aboraler Rand bei der Messung mit dem starren Rektoskop mehr als 16 cm von der
Anokutanlinie entfernt ist, zu den Kolonkarzinomen. Nach der UICC (Union Internationale
Contre le Cancer) von 2003 werden die Rektumkarzinome entsprechend ihrem Abstand von
der Anokutanlinie in Karzinome des oberen Rektumdrittels (12 bis 16 cm), des mittleren
Rektumdrittels (6 bis < 12 cm) und des unteren Rektumdrittels (< 6 cm) eingeteilt.
Demgegenüber gelten in den USA als Kolonkarzinome Tumoren, die mehr als 12 cm und als
Rektumkarzinome Tumoren, die 12 cm und weniger von der Linea anocutanea entfernt sind
[125, 197, 223, 263].
1.1.2
Epidemiologie
Zahlreiche Menschen in westlichen Ländern entwickeln im Laufe ihres Lebens ein oder
mehrere kolorektale Adenome. Vor allem bei Menschen mittleren und höheren Alters findet
man adenomatöse Polypen. Männer sind dabei häufiger betroffen als Frauen [104, 210, 223,
240].
Es bereitet Schwierigkeiten, genaue Angaben zur Epidemiologie kolorektaler Adenome zu
machen, da die meist asymptomatischen Adenome erst bei Autopsien oder bei
Früherkennungskoloskopien zufällig entdeckt werden. Die Angaben in Studien variieren
erheblich. In koloskopischen Studien unter asymptomatischen Patienten mit einem
Durchschnittsrisiko ergab sich eine Prävalenz von mehr als 25%. In sigmoidoskopischen
Studien von 10% [104]. Autopsiestudien zeigen eine altersabhängige Prävalenz mit 29%
zwischen dem 50. und 60., 33% zwischen dem 60. und 70. und 42% zwischen dem 70. und
2
Einleitung
80. Lebensjahr [44]. Die Prävalenz von kolorektalen Adenomen variiert stark von Land zu
Land und korreliert mit der Prävalenz und der Inzidenz von kolorektalen Karzinomen in
jedem Land [104, 210].
Das kolorektale Karzinom gehört weltweit zu den dritthäufigsten Tumorerkrankungen, wobei
Männer und Frauen etwa gleich häufig betroffen sind.
In den entwickelten westlichen Ländern ist es sogar die zweithäufigste Krebserkrankung [3,
20, 33, 207]. Es zeigen sich international erhebliche Unterschiede in der Inzidenz des
kolorektalen Karzinoms. Während die Neuerkrankungen in Ländern der 3. Welt sehr gering
sind, steigen die Zahlen mit der sozioökonomischen Entwicklung. Die niedrigsten
Erkrankungsraten findet man in Afrika und Indien mit etwa 3 bis 4 Neuerkrankungen pro
100.000 Einwohner pro Jahr, die Höchsten in den Wohlstandsländern Nordamerikas und
Westeuropas, sowie in Australien und Neuseeland mit über 30 Erkrankungen pro 100.000
Einwohner pro Jahr. In Ländern, die große Veränderungen in ihren Lebensstil- und
Ernährungsgewohnheiten erfahren, steigt die Inzidenz für kolorektale Karzinome. Dieser
Trend ist deutlicher unter den höheren Einkommensgruppen zu beobachten [2, 125, 127, 279].
Die jährlichen Neuerkrankungen in Deutschland werden auf etwas über 70.000 (etwa 37.000
bei Männern und 36.000 bei Frauen) geschätzt, das sind mehr als 16% aller Neuerkrankungen
an Krebs. Damit steht das kolorektale Karzinom an zweiter Stelle nach dem Prostatakarzinom
bei Männern und dem Mammakarzinom bei Frauen. Allerdings beruhen diese Zahlen bisher
vor allem auf dem Krebsregister Saarland [33]. Innerhalb der EU zeigen epidemiologische
Untersuchungen ein signifikant häufigeres Auftreten des kolorektalen Karzinoms in
nördlichen und westlichen als in südlichen Ländern. Die niedrigsten Inzidenzraten in Europa
findet man in Griechenland mit etwa 20.000 [33, 125].
Während die Inzidenzraten in den USA in der Zeit von 1998 bis 2002 um 1,8% jährlich
abnahmen, wird für Deutschland in den letzten 20 Jahren ein eher konstantes Niveau der
Inzidenz angegeben. Ein Grund hierfür sind verbesserte Früherkennungsprogramme, da zum
Beispiel durch die koloskopische Polypektomie die Progression von Adenomen zu
Karzinomen verhindert werden kann [3, 33, 153].
Das Risiko, im Laufe seines Lebens an einem kolorektalen Karzinom zu erkranken, liegt bei
etwa 5 bis 6%, daran zu sterben bei etwa 3%.
Einleitung
3
Ab einem Alter von 50 Jahren steigt das Erkrankungsrisiko deutlich an. Mehr als 90% der
Fälle werden bei Personen, die älter als 50 sind, diagnostiziert, wobei Männer im Mittel mit
69 und Frauen mit 75 Jahren erkranken [3, 33, 240, 270].
Darüber hinaus steht das kolorektale Karzinom sowohl bei Männern als auch bei Frauen an
dritter Stelle der Krebstodesursachen der westlichen Welt [114, 159].
In Deutschland ist das kolorektale Karzinom die zweithäufigste Krebstodesursache nach dem
Lungenkarzinom bei Männern und dem Mammakarzinom bei Frauen [33]. 2004 starben in
Deutschland 28.000 Menschen an einem kolorektalen Karzinom oder dessen Folgen. Etwa
50% der Patienten sterben innerhalb von 5 Jahren an der Erkrankung, meist aufgrund von
metastatischen Läsionen. Seit Mitte der 1970er Jahre nimmt die Mortalität für beide
Geschlechter stetig ab. In der EU ist die Sterberate bei Frauen in den Jahren von 1959 bis
1998 um 14,9% gesunken, bei Männern um 5,7% [158]. Dies kann auf verbesserte
Maßnahmen für Prävention, Screening, Therapie und Nachsorge zurückgeführt werden [3,
125, 158].
1.1.3
Ätiologie
Etwa 80 bis 85% der kolorektalen Karzinome entstehen sporadisch über die AdenomKarzinom-Sequenz. Von den sporadischen Adenomen, die etwa 98% der adenomatösen
Polypen ausmachen, ist nur bei etwa 1 bis 10% im Rahmen der Adenom-Karzinom-Sequenz
mit einer malignen Entartung zu rechnen. Das Entartungsrisiko ist insbesondere abhängig von
der Größe, vom histologischen Typ und dem Grad der Dysplasie bzw. der intraepithelialen
Neoplasie (IEN) der Adenome [7, 253].
Die Auslösungsmechanismen für die Entstehung von kolorektalen Adenomen und
Karzinomen sind bis heute noch nicht vollständig geklärt und Gegenstand vieler
wissenschaftlicher Studien. Viele Faktoren scheinen in der Ätiologie der kolorektalen
Adenome und Karzinome eine Rolle zu spielen. Als gesichert gilt, dass sowohl
umweltbedingte als auch konstitutionelle Faktoren zusammenspielen, die Entstehung und
Verlauf eines kolorektalen Karzinoms beeinflussen [7, 162, 256, 279]. So gibt es einige
genetische Alterationen, die im Laufe der Entwicklung von einem Adenom zu einem
kolorektalen Karzinom auftauchen. Dabei handelt es sich um Mutationen von ProtoOnkogenen, Tumorsuppressorgenen und DNA-Reparaturgenen.
Die großen geografischen Unterschiede in den Inzidenzraten und Ergebnisse von
Migrationsstudien deuten auf exogene Faktoren bei der Entstehung des kolorektalen
4
Einleitung
Karzinoms hin. Dabei spielen vor allem Ernährungsgewohnheiten, Lebensstilfaktoren, sowie
kulturelle und soziale Praktiken eine große Rolle. Migranten, die üblicherweise von ärmeren
Ländern in reichere Länder umziehen, haben nach einigen Jahren das gleiche Risiko, an
einem kolorektalen Karzinom zu erkranken, wie die einheimische Bevölkerung.
So zeigten schon frühe Migrationsstudien, dass das Risiko, an einem kolorektalen Karzinom
zu erkranken, für Japaner, die in die USA eingewandert sind, sich nach zehn Jahren dem
Erkrankungsrisiko eines Amerikaners angepasst hat. Einen ähnlichen Trend zeigte sich bei
polnischen und chinesischen Einwanderern in die USA. Geringer war das Risiko, wenn sich
die Migranten weiterhin mit ihrer ursprünglichen Kost ernährten [127, 279].
Epidemiologische Studien der letzten 40 Jahre haben geholfen, die Hauptrisikofaktoren, die
mit einem kolorektalen Karzinom assoziiert sind, aufzudecken und protektive Faktoren zu
identifizieren. Man schätzt, dass etwa 50 bis 80% der kolorektalen Karzinome mit der
Ernährung assoziiert sind. Es gibt jedoch zahlreiche kontroverse Studienergebnisse, so dass
eine genaue Risikoeinschätzung nicht möglich ist. Es ist anzunehmen, dass ein „westlicher
Ernährungsstil“ mit einem erhöhten Darmkrebsrisiko assoziiert ist. Darunter versteht man
eine ballaststoffarme Ernährung mit einem hohen Anteil an rotem Fleisch und Fett und wenig
Obst und Gemüse [99, 161, 270, 293].
Auch mangelnde körperliche Bewegung stellt einen Risikofaktor für die Entstehung eines
kolorektalen Karzinoms dar. So belegen Studien, dass regelmäßige körperliche Aktivität die
Häufigkeit von Adenomen und dass Risiko für das Auftreten eines kolorektalen Karzinoms
reduziert [98, 174, 253, 272]. Ebenso scheint Übergewicht bei der Karzinomentstehung eine
Rolle zu spielen. Bei Personen mit einem erhöhten BMI findet man häufiger Adenome, das
Risiko für ein kolorektales Karzinom ist bis zu zweifach erhöht. Unklar bleibt, ob das Risiko
auf die mangelnde Bewegung oder allein auf das Übergewicht zurückzuführen ist [106-107].
Bei postmenopausalen Frauen scheint eine Hormonersatztherapie das Karzinomrisiko zu
senken [253, 270].
Nikotinabusus ist ebenfalls mit einem erhöhten Adenom- und Karzinomrisiko im Kolorektum
assoziiert [67, 222, 253]. So haben starke Raucher ein etwa zwei- bis dreifach erhöhtes Risiko
kolorektale Adenome zu entwickeln. Tabakrauch ist eine bedeutende Quelle für verschiedene
Karzinogene, einschließlich Nitrosamine, heterozyklische Amine und polyzyklische Kohlenwasserstoffe.
Starker Alkoholkonsum ist vor allem bei unzureichender Folsäurezufuhr mit einem erhöhten
Risiko assoziiert. Entscheidend scheint dabei die Menge (≥ 30 g/d) und nicht die Art des
Alkohols zu sein [45, 208, 257]. Es konnte gezeigt werden, dass eine Langzeit-Aufnahme von
Einleitung
5
Alkohol die Wahrscheinlichkeit für das Auftreten eines Tumors mit Mikrosatelliteninstabilität
erhöht [127].
Ein weiterer Risikofaktor für das Auftreten eines kolorektalen Karzinoms ist eine
Familienanamnese. Für Verwandte ersten Grades von Patienten mit einem kolorektalen
Karzinom ist das mittlere Risiko, ebenfalls zu erkranken zwei- bis dreifach erhöht. Es ist
unklar, ob es sich dabei um genetische Faktoren oder um eine ähnliche Lebensweise als
Risikofaktor oder um beides handelt. Das Risiko erhöht sich weiterhin auf das drei- bis
vierfache, wenn das Karzinom bei dem Indexpatienten vor dem 60. Lebensjahr aufgetreten ist
und /oder mehr als ein Verwandter ersten Grades von einem kolorektalen Karzinom betroffen
ist. Ebenfalls ein erhöhtes Risiko an einem kolorektalen Karzinom zu erkranken, haben
Verwandte ersten Grades von Patienten mit kolorektalen Adenomen (ein- bis zweifach
erhöhtes Risiko) und Patienten, die selbst kolorektale Adenome (zwei- bis dreifach erhöhtes
Risiko) haben oder hatten. Patienten, die bereits ein kolorektales Karzinom hatten, haben nach
10 Jahren ein Risiko von 2% ein zweites kolorektales Karzinom zu entwickeln [14, 125, 154,
237].
Es gibt hereditäre Syndrome, die mit kolorektalen Adenomen und/oder Karzinomen
einhergehen und für die bestimmte Genmutationen gefunden wurden.
Man unterteilt sie in zwei Gruppen:
1. Familiäre adenomatöse Polyposis (FAP):
Die FAP ist für etwa 1% der kolorektalen Karzinome verantwortlich. Es handelt sich um
eine autosomal-dominant vererbte Erkrankung mit einer Mutation des APC-Gens, bei der
es zur Ausbildung von mehr als 100 adenomatösen Polypen im gesamten Kolon kommt.
Das Risiko für die Entstehung eines kolorektalen Karzinoms liegt nach 35 bis 40
Lebensjahren bei nahezu 100%.
Andere Polyposissyndrome mit einer ähnlich hohen Entartungstendenz sind das GardnerSyndrom und das Turcot-Syndrom. Eine niedrigere Karzinominzidenz haben das PeutzJeghers-Syndrom, die generelle juvenile Polyposis und das Cowden-Syndrom [93, 113,
125, 159].
2. Hereditäres Non-Polyposis-Cancer-Syndrom (HNPCC):
Etwa 5% der kolorektalen Karzinome entwickeln sich auf dem Boden eines HNPCCSyndroms. Hierbei kommt es aufgrund einer autosomal-dominant vererbter Mutation von
DNA-Reparaturgenen oft zur Ausbildung eines kolorektalen Karzinoms noch vor dem 50.
Lebensjahr ohne eine Adenomatose. Auch entstehen spezifische extrakolonische
6
Einleitung
Tumoren. Betroffen sind vor allem das Ovar, der Magen, der Dünndarm und der
Urogenitaltrakt. Das Lebenszeitrisiko von Genträgern, ein kolorektales Karzinom zu
entwickeln, wird auf 80 bis 90% geschätzt. Aufgrund eines fehlenden auffälligen
Phänotyps wurden die sogenannten Bethesda- und Amsterdamkriterien definiert, bei deren
Zutreffen die Diagnose gestellt werden kann und eine Mutationssuche erfolgen sollte [78,
113, 159].
Weitere 5% der kolorektalen Karzinome entwickeln sich auf dem Boden einer chronischentzündlichen Darmerkrankung.
Patienten mit einer Colitis ulcerosa weisen ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung eines
kolorektalen Karzinoms auf. Das Risiko ist abhängig von Beginn, Dauer und Ausdehnung der
Erkrankung, sowie von dem Vorhandensein einer primär sklerosierenden Cholangitis. Bei
Befall des gesamten Kolorektums mit schwerer Colitis ulcerosa ist nach 7 bis 10 Jahren mit
einem etwa 15% erhöhtem Karzinomrisiko zu rechnen. Die Angaben des kumulativen Risikos
variieren von 1,4 bis 34 % [71, 183].
Patienten mit einem Morbus Crohn und einem langwierigen Verlauf haben ebenfalls ein
erhöhtes Risiko für die Entstehung eines kolorektalen Karzinoms. Dieses ist im Vergleich zur
Colitis ulcerosa möglicherweise geringer. Die Angaben schwanken aufgrund uneinheitlicher
und spärlicher Datenlage zwischen keinem und einem 3,5- bis 7-fach erhöhten
Karzinomrisiko [35, 90].
Durch
primäre
Prävention
(Krankheitsverhütung)
und
sekundäre
Prävention
(Krankheitsfrüherkennung) kann aus epidemiologischer Sicht die Inzidenz, die Morbidität
und die Mortalität positiv beeinflusst werden. Da bei kolorektalen Karzinomen die
sogenannten „Lebensstilfaktoren“ eine wichtige Rolle spielen, sollte zur primären Prävention
die Bevölkerung über eine gesunde Lebensweise informiert werden.
Wichtig ist eine ausgewogene vitamin- und ballaststoffreiche Ernährung, die viel Obst und
Gemüse und wenig rotes Fleisch enthält. Für eine effiziente Prävention werden fünf Portionen
Obst oder Gemüse am Tag empfohlen. Zusammen mit geringem Alkoholkonsum und
Nikotinabstinenz, sowie täglicher körperlicher Bewegung kann das Risiko für das Auftreten
eines kolorektalen Karzinoms am besten reduziert werden [5, 38, 127, 254].
Für die wirksame Prävention des kolorektalen Karzinoms durch Mikronährstoffe und
Medikamente gibt es bisher keine gesicherten Daten. In einigen Studien konnte ein
Einleitung
7
präventiver Effekt durch die Einnahme von NSAR bestätigt werden [65, 243].
Wahrscheinlich wirken die NSAR über eine Hemmung der Cyclooxygenase, die bei
kolorektalen Karzinomen deutlich erhöht ist [166, 191]. Aufgrund der ungünstigen RisikoNutzen-Relation und widersprüchlicher Studiendaten kann eine protektive Gabe von NSAR
derzeit jedoch nicht empfohlen werden.
Die Einnahme von Mikronährstoffen, wie die Vitamine A, C, D und E, Kalzium, Karotinoide
und Folsäure zeigten in einigen Studien protektiven Charakter bezüglich des Darmkrebsrisikos.
Empfehlen kann man aktuell eine folsäurereiche, kalziumreiche Ernährung, da diese mit
einem erniedrigten kolorektalen Karzinomrisiko assoziiert ist [5, 167, 287].
Da bei kolorektalen Karzinomen die frühe Diagnosestellung für die Prognose entscheidend
ist, ist die sekundäre Prävention von großer Bedeutung.
Im
Rahmen
der
sekundären
Prävention
sollten
sich
Männer
und
Frauen
mit
durchschnittlichem Risiko ab einem Alter von 50 Jahren einem Screening in Form einer
Koloskopie unterziehen, die bei negativem Befund alle 10 Jahre wiederholt werden sollte. Die
Koloskopie ist das Standardverfahren mit der höchsten Sensitivität und Spezifität [3, 47, 280].
Bei Patienten, die eine Darmspiegelung ablehnen, sollte alle 5 Jahre eine Sigmoidoskopie
durchgeführt werden, sowie jährlich ein Guaiak-Test. Die alleinige jährliche Untersuchung
auf okkultes Blut im Stuhl (Guaiak-Test) sollte nur bei Patienten durchgeführt werden, die
jegliche endoskopische Untersuchung ablehnen [220, 232, 268]. Ein positives Testergebnis
macht die endoskopische Untersuchung des gesamten Dickdarms erforderlich.
Von Bedeutung für die Prävention ist auch das Erkennen von Risikopatienten, die dann je
nach Risikoprofil engmaschiger untersucht werden können.
Aufgrund der relativ geringen Teilnahme kann der Einfluss des Koloskopie-Screenings auf
die Inzidenz des kolorektalen Karzinoms bisher nicht bewertet werden [33].
1.1.4
1.1.4.1
Histomorphologische Einteilung
Kolorektale Adenome
a. Lokalisation
Etwa 60% der kolorektalen Adenome entwickeln sich im rektosigmoidalen Bereich. Das
Alter des Patienten scheint einen entscheidenden Einfluss auf die Lokalisation von
Adenomen zu haben. So entstehen bei jüngeren Patienten Adenome eher im linken Kolon,
8
Einleitung
bei älteren Patienten eher im rechten Kolon. Ebenso beobachtet man große Adenome mit
schwerer intraepithelialer Neoplasie eher im Rektum bzw. im distalen Kolon [210].
Kolorektale Adenome können solitär, aber auch multipel vorkommen, daher ist stets eine
komplette Koloskopie zum Ausschluss von Adenomen angezeigt.
b. Makroskopie
Nach der Wuchsform werden die Adenome eingeteilt in gestielte, schmalbasige (taillierte)
und breitbasige (sessile) Adenome [226].
c.
Histologie
Histologisch bestehen alle Adenome aus atypischen Drüsenformationen atypischer
Epithelzellen. Diese Epitheldysplasie wird je nach Ausdifferenzierung, Kerngröße und form, Chromatinverteilung, Nukleolengröße und Mitosezahl in gering-, mittel- und
hochgradige Dysplasie eingeteilt [223, 226].
Nach dem histologischen Feinbau unterscheidet man tubuläre, tubulovillöse und villöse
Adenome.
Tubuläre Adenome, die etwa 66% der Adenome ausmachen, haben meist eine sessile oder
gestielte Form und eine glatte Oberfläche. Typisch sind verzweigte drüsig-tubuläre
Wucherungen der Kryptenschläuche.
Villöse Adenome sind mit 8 bis 10% eher selten. Sie sind meist breitbasig und durch
ausgestülpte, fingerartige Schleimhautzotten mit manchmal exzessiver Schleimbildung
charakterisiert.
Tubulovillöse Adenome zeigen sowohl tubuläre als auch villöse Merkmale und machen
22% der Adenome aus [7, 226].
In den letzten Jahren wurde ein weiterer Adenomtyp beschrieben, das „serrated adenoma“
(Sägeblatt-Adenom), das Anteile eines hyperplastischen Polypen mit zellulären
Charakteristika eines kolorektalen Adenoms in sich kombiniert. Kleine Sägeblattadenome
ähneln eher hyperplastischen Polypen, während große den villösen Adenomen zugeordnet
werden können. Histomorphologisch findet man gezackte oder sägezahnartige Krypten,
eine zytoplasmatische Eosinophilie und ein geringes Kern-/Zytoplasma-Verhältnis. Es ist
bisher nicht klar, ob sich die „serrated adenomas“ aus hyperplastischen Polypen oder de
novo entwickeln [152, 179].
Einen weiteren histologischen Phänotyp stellt das mikrotubuläre Adenom dar, das
ebenfalls erst in den letzten Jahren beschrieben wurde. Es vereint villöse Anteile mit
mikrotubulären Strukturen [225].
Einleitung
9
Kolorektale Adenome können sich im Laufe der Zeit in ein Adenokarzinom umwandeln.
Dabei steigt das Karzinomrisiko mit der Anzahl, der Größe (Tabelle 1/1), dem histologischen
Typ und dem Grad der intraepithelialen Neoplasie der Adenome [152, 253]. Während das
Entartungsrisiko bei tubulären Adenomen je nach Größe zwischen 1 bis 10% liegt, steigt es
bei tubulovillösen Adenomen auf 20% und bei villösen Adenomen auf 20 bis 40% an. Bei
einer mäßigen intraepithelialen Neoplasie besteht ein Karzinomrisiko von 6%, bei einer
schweren intraepithelialen Neoplasie steigt es auf 35% an [41, 125, 223].
Es konnte gezeigt werden, dass 37% der Sägeblattadenome Anteile mit hochgradiger
intraepithelialer Neoplasie enthielten. Daher nimmt man an, dass diese Adenome einem sehr
schnellen Progress folgen [37].
Adenomgröße Karzinomrisiko
bis 1 cm
< 1%
bis 2 cm
6%
bis 3 cm
30%
bis 4 cm
40%
> 4 cm
70%
Tabelle 1/1: Entartungsrisiko in Abhängigkeit der Adenomgröße
1.1.4.2
Kolorektale Karzinome
a. Lokalisation
Die kolorektalen Karzinome entstehen zu 40% im Rektum und zu 60% im Kolon, wovon
etwa 20% im Sigma zu finden sind. Nach der UICC 2003 liegt ein Rektumkarzinom vor,
wenn der makroskopisch erkennbare aborale Tumorrand bei starrer Rektosigmoidoskopie
16 cm oder weniger von der Linea anocutanea entfernt ist. Die gleiche Lokalisation von
Polypen und Karzinomen im Kolon liefert einen weiteren Hinweis dafür, dass sich die
sporadischen Karzinome über die Adenom-Karzinom-Sequenz entwickeln [41, 223, 263].
b. Makroskopie
Kolorektale Karzinome zeigen unterschiedliche makroskopische Wachstumsformen. Man
unterscheidet ulzerierte, polypoide, flache und diffus infiltrierende Tumoren. Die
makroskopische Wuchsform erlaubt eine grobe Beurteilung des Tumors, da zum Beispiel
10
Einleitung
polypoide Karzinome später und seltener metastasieren als diffus infiltrierende Karzinome
[223].
c. Histologie
Histologisch werden die kolorektalen Karzinome nach der WHO-Klassifikation (2000) in
acht verschiedene Typen eingeteilt:
1. Adenokarzinom
2. Muzinöses Adenokarzinom (Gallertkarzinom)
3. Siegelringzellkarzinom
4. Kleinzelliges (neuroendokrines) Karzinom
5. Plattenepithelkarzinom
6. Adeno-squamöses Karzinom
7. Medulläres Karzinom
8. Undifferenziertes Karzinom
Bei über 80% der kolorektalen Karzinome handelt es sich um ein Adenokarzinom. Unter
den Adenokarzinomen gibt es tubuläre, papilläre und papillotubuläre Subtypen. Die
meisten Adenokarzinome sind mäßig differenziert (G2). Das muzinöse Adenokarzinom
macht etwa 10 bis 20% der Fälle aus. Es zeigt eine ausgedehnte extrazelluläre
Verschleimung, die mehr als 50% des Tumors einnimmt. Das seltene
Siegelringzellkarzinom ist zu mehr als 50% aus Siegelringzellen aufgebaut. Dabei kommt
es aufgrund einer Sekretionsstörung zu einer intrazellulären Anhäufung von Schleim. Es
hat eine schlechte Prognose mit einem hohen Malignitätsgrad. Die übrigen Karzinome
kommen sehr selten vor. Es können vor allem in größeren Tumorarealen oder in
Metastasen verschiedene Typen nebeneinander vorkommen.
Von grundlegender Bedeutung für die Prognose und Therapie des kolorektalen Karzinoms
bleibt die exakte makro- und mikroskopische Untersuchung und Beschreibung des Tumors
durch den Pathologen.
Die Tumorausbreitung wird international nach der TNM-Klassifizierung der UICC (Union
Internationale Contre le Cancer) eingeteilt [263]. Hierin werden die Infiltration des Tumors in
die Darmwand, seine Ausdehnung in benachbarte Strukturen, das Ausmaß des Lymphknotenbefalls und das Auftreten von Fernmetastasen erfasst (Tabelle 1/2). Für eine sichere
pathologische Stadieneinteilung müssen mindestens 12 Lymphknoten entnommen und
histologisch untersucht worden sein. Ein Carcinoma in situ liegt vor, wenn Tumorzellen
innerhalb der Basalmembran der Drüsen (intraepithelial) oder in der Lamina propria
Einleitung
11
(intramukös) nachweisbar sind, ohne dass eine Ausbreitung durch die Muscularis mucosae in
die Submukosa feststellbar ist.
Auch andere Klassifikationssysteme, zum Beispiel die Einteilung nach Dukes, werden in
einigen Ländern noch angewandt. Die Dukes-Klassifikation von 1932 (Tabelle 1/3)
berücksichtigt jedoch nicht die Tumorinfiltration in Nachbarorgane und das Vorliegen von
Fernmetastasen. Zahleiche Modifikationen dieser Einteilung erschweren den Vergleich von
Literaturdaten.
T
Primärtumor
TX
Primärtumor kann nicht beurteilt werden
T0
Kein Anhalt für Primärtumor
Tis
Carcinoma in situ
T1
Tumor infiltriert Submukosa
T2
Tumor infiltriert Muscularis propria
T3
Tumor infiltriert durch die Muscularis propria in Subserosa oder in nicht
peritonealisiertes, perikolisches oder perirektales Gewebe
T4
Tumor perforiert das viszerale Peritoneum oder infiltriert direkt in andere
Organe oder Strukturen
N
Regionäre Lymphknoten
NX
Regionäre Lymphknoten können nicht beurteilt werden
N0
Keine regionären Lymphknotenmetastasen nach regionärer Lymphadenektomie
N1
Metastasen in 1-3 perikolischen bzw. perirektalen Lymphknoten
N2
Metastasen in 4 oder mehr perikolischen Lymphknoten
M
Fernmetastasen
MX Das Vorliegen von Fernmetastasen kann nicht beurteilt werden
M0
Keine Fernmetastasen
M1
Fernmetastasen
Tabelle 1/2: pTNM-Klassifikation (UICC 2002)
12
Einleitung
Stadium A
Tumor reicht maximal in die Muscularis propria; keine
Lymphknotenmetastasen
Stadium B
Tumor breitet sich über die Muscularis propria hinaus aus; keine
Lymphknotenmetastasen
Stadium C1
Lymphknotenmetastasen liegen vor, aber nicht an der Grenze des
Resektates (Grenzlymphknoten negativ)
Stadium C2
Lymphknotenmetastasen liegen vor, Grenzlymphknoten positiv
Tabelle 1/3: Stadieneinteilung des kolorektalen Karzinoms nach Dukes (1932)
Tis
N0
M0
T1
N0
M0
T2
N0
M0
Stadium II A
T3
N0
M0
Stadium II B
T4
N0
M0
Stadium III A
T1,T2
N1
M0
Stadium III B
T3,T4
N1
M0
Stadium III C
Jedes T
N2
M0
Stadium IV
Jedes T
Jedes N
M1
Stadium 0
Dukes A
Stadium I
Dukes B
Dukes C
Tabelle 1/4: Stadieneinteilung des kolorektalen Karzinoms (UICC 2002)
Die Ausbreitung eines kolorektalen Karzinoms erfolgt kontinuierlich lymphogen oder
hämatogen in die Leber (Pfortader-Typ), erst sekundär in die Lunge. Bei etwa 15 bis 20% der
Tumoren finden sich bereits zum Zeitpunkt der Diagnosestellung sonografisch Lebermetastasen. Entsprechend der Metastasierungswege finden sich beim Kolonkarzinom eher
Lymphknoten-, Leber-, Lungen- und Skelettmetastasen, beim Rektumkarzinom vor allem
lokoregionäre Metastasen, gefolgt von Leber- und Lungenmetastasen.
In Abhängigkeit von der Lokalisation des Rektumkarzinoms verläuft die lymphogene
Ausbreitung über drei verschiedene Metastasierungswege. Hochsitzende Karzinome (8 bis 16
cm von der Anokutanlinie) metastasieren in paraaortale Lymphknoten, Tumoren der mittleren
Etage (4 bis 8 cm von der Anokutanlinie) betreffen zusätzlich die Beckenwand, tiefsitzende
Tumoren (0 bis 4 cm von der Anokutanlinie) befallen außerdem die inguinalen Lymphknoten.
Als Ausnahme metastasiert das tiefsitzende Rektumkarzinom primär in die Lunge (Cava-Typ
Einleitung
13
der Metastasierung). Daher ist die Lokalisation des Primärtumors ausschlaggebend für die Art
der operativen Therapie.
1.1.5
1.1.5.1
Therapeutische Aspekte
Prognostische Parameter
Um eine individuelle wirkungsvolle Tumortherapie zu erreichen, sind neben der TNMKlassifikation der UICC weitere Prognosefaktoren wichtig, die eine genauere Einteilung und
Risikoabschätzung erlauben.
Entscheidend für die Prognose und auch für weitere Therapieentscheidungen eines
kolorektalen Karzinoms ist die postoperative pathologische Untersuchung mit folgenden
Angaben [20, 70, 129, 173]:

Lokalisation des Tumors

Tumortyp nach WHO-Klassifikation

Tumorinvasionstiefe (pT-Stadium)

Status der regionären Lymphknoten (pN-Stadium)

Anzahl der untersuchten Lymphknoten

Anzahl der befallenen Lymphknoten

Tumor-Grading (Tabelle 1/7)

Abstand von den Resektionsrändern

R-Klassifikation (Tabelle 1/6)

Lymph-/Blutgefäßinvasion
Weitere histopathologische Prognoseparameter sind außerdem das Vorhandensein von
Fernmetastasen, eine perineurale Infiltration und eine Dedifferenzierung im Bereich der
Invasionsfront [20, 70].
Die 5-Jahres-Überlebensraten nach R0-Resektion des Tumors sind in Abhängigkeit vom
TNM-Stadium in Tabelle 1/5 angegeben. Im Falle von unresezierbarem residuellem oder
metastatischem Tumorgewebe liegt die mediane Überlebenszeit bei weniger als einem Jahr
[20].
Differenzierungsgrade geben Hinweise auf die biologische Qualität von Karzinomen. Dabei
zeigen wenig differenzierte Tumoren im Allgemeinen eine höhere Progressionsneigung als
gut differenzierte. Ein Nachteil des Tumor-Grading besteht in der Subjektivität der
Beurteilung, sowie in der beschränkten Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Trotzdem haben
Patienten mit hochdifferenzierten Karzinomen eine signifikant bessere Prognose [20].
14
Einleitung
TNM-Stadium
Ungefähres 5-Jahres Überleben
Stadium I
85-90%
Stadium II
70-75%
Stadium III
35-40%
Stadium IV
< 5%
Tabelle 1/5: TNM-Stadium und Überlebensrate bei R0-Resektion des Primärtumors
R0 Kein Residualtumor
R1 Histologisch Residualtumor
R2 Makroskopisch Residualtumor
Tabelle 1/6: R-Klassifikation (UICC 2002)
GX Differenzierungsgrad kann nicht bestimmt werden
G1
Gut differenziert
G2
Mäßig differenziert
G3
Schlecht differenziert
G4
Undifferenziert
Tabelle 1/7: Histopathologisches Grading (UICC 2002)
Neben den histopathologischen Faktoren, gibt es therapieassoziierte Parameter, die die
Prognose eines kolorektalen Karzinoms beeinflussen. So ist zum Beispiel die Erfahrung des
Chirurgen von großer Bedeutung, wie auch die Operationsmethode [130, 185]. Eine
erweiterte Resektion bewirkt eine höhere Überlebenszeit [42, 149]. Auch kann die Prognose
durch eine adjuvante Chemotherapie im Stadium III verbessert werden [188, 283].
Aufgrund der enormen prognostischen Unterschiede zwischen Früh- und Spätstadium lokaler
Tumoren, stellt die Suche nach nützlichen prognostischen Markern einen wichtigen Bereich
der klinischen Forschung dar. Die Identifikation von genetischen Risikofaktoren für die
Entwicklung von Adenomen und assoziierten Karzinomen des Kolon und Rektum ermöglicht
eine prädiktive molekulare Diagnose von malignen Erkrankungen.
Einleitung
15
Es gibt inzwischen zahlreiche immunhistochemische und molekularbiologische Methoden,
die als potenzielle Prognosemarker in Frage kommen. Etabliert hat sich bisher die
präoperative Bestimmung des CEA-Wertes (Carcinoembryonales Antigen) als unabhängiger
Prognoseparameter. Ein erhöhter Wert geht mit einer signifikant schlechteren Prognose einher
[68, 88].
1.1.5.2
Therapieoptionen
Da typischerweise 8 bis 15 Jahre vergehen, bis aus einem Adenom ein kolorektales Karzinom
entsteht, ergibt sich ein relativ großes Zeitfenster für Früherkennungsmaßnahmen,
insbesondere die Koloskopie. Koloskopisch entdeckte Adenome sollten immer vollständig
polypektomiert und histologisch untersucht werden, da dadurch die Entstehung von
Karzinomen im Sinne einer Unterbrechung der Adenom-Karzinom-Sequenz verhindert wird
[69, 165, 280]. Die Polypen müssen unter Angabe der Lokalisation entsprechend den WHOKriterien histologisch befundet werden.
Die Therapie kolorektaler Karzinome sollte grundsätzlich auf der Basis einer histologischen
Untersuchung geplant werden. Als Karzinome gelten Veränderungen, bei denen atypische
epitheliale Formationen in die Submukosa infiltrieren (pT1 oder mehr). Nicht einbezogen sind
sogenannte Mukosakarzinome oder intraepitheliale Karzinome (pTis), bei denen keine
Metastasierung erfolgt und die durch lokale Abtragung im Gesunden ausreichend behandelt
werden.
Prätherapeutisch wird die Stadieneinteilung aufgrund von klinischen, endoskopischen und
röntgenologischen Untersuchungsbefunden als Basis für die Therapieplanung vorgenommen.
Neben der Anamnese und klinischen Untersuchung mit digitaler rektaler Austastung zählen
hierzu eine vollständige Koloskopie mit Stufenbiopsien. Ist eine Koloskopie nicht möglich,
kann stattdessen ein Doppelkontrasteinlauf mit Rektoskopie und Biopsie durchgeführt
werden. Des Weiteren sind bildgebende Verfahren, wie die Endosonographie des Abdomens
und ein Röntgen-Thorax in zwei Ebenen indiziert. Bei Rektumkarzinomen ist zusätzlich eine
starre Rektoskopie obligat. Nach radikaler Tumorresektion sind für die weitere Therapieplanung das TNM-Stadium und der R-Status notwendig [68, 84, 88, 125, 232].
a. Operative Behandlung des kolorektalen Karzinoms
Die primäre Behandlung eines kolorektalen Karzinoms ist die komplette chirurgische
Entfernung des Tumors. Dies stellt bisher die einzige kurative Therapie für den Patienten
dar [3, 79].
16
Einleitung
Kolorektale Karzinome wachsen vorwiegend zirkulär und metastasieren weitgehend
konstant in die regionären Lymphknoten. Daher ist das Standardverfahren die radikale
Resektion des Primärtumors mit partieller oder totaler Entfernung des Mesorektums und
damit des Lymphabflussgebietes [42, 84]. Das Ausmaß der Darmresektion wird durch die
Resektion der versorgenden Gefäße und das hierdurch definierte Lymphabflussgebiet
bestimmt.
Ein Großteil aller Rektumkarzinome kann heute sphinktererhaltend reseziert werden.
Eine palliative Tumorentfernung beugt Komplikationen wie Blutungen, Perforation oder
Ileus vor.
Kolorektale Karzinome auf dem Boden einer familiären adenomatösen Polyposis (FAP)
sollten mit einer restaurativen Proktokolektomie mit Dünndarm-Pouch behandelt werden.
Bei HNPCC-Karzinomen werden zwei Vorgehensweisen diskutiert. Es kommen entweder
eine operative Therapie entsprechend dem sporadischen Karzinom in Frage oder die
regelhafte Kolektomie bei Kolonkarzinomen bzw. die restaurative Proktokolektomie bei
Rektumkarzinomen.
Bei Karzinomen auf dem Boden einer Colitis ulcerosa stellt die restaurative Proktokolektomie mit Dünndarm-Pouch die Regeloperation dar.
b. Adjuvante Therapie
Eine adjuvante Therapieform dient der Vorbeugung eines Tumorrezidivs. Nach der
chirurgischen Resektion erleiden etwa 1/3 der Patienten einen Rückfall der Erkrankung.
Um die Rezidivrate zu reduzieren, ist eine postoperative Chemotherapie sinnvoll, auf die
jedoch nur etwa 26% der Patienten ansprechen [79]. Voraussetzung für jede adjuvante
Therapie ist die R0-Resektion des Primärtumors, das heißt es können weder durch
klinische
noch
durch
pathologisch-histologische
Untersuchungen
Tumorreste
nachgewiesen werden. Es muss aber davon ausgegangen werden, dass zum Zeitpunkt der
Diagnose schon Lymphknoten- und Fernmetastasen vorhanden sein können. Vor allem
die Fernmetastasierung bestimmt die Prognose der Patienten erheblich. Durch eine
adjuvante Chemotherapie versucht man diese noch nicht nachweisbaren, okkulten
Streuherde und Mikrometastasen zu erreichen. Grundlage für die Indikation einer
adjuvanten Therapie ist die pathohistologische Stadienbestimmung, insbesondere die
Bestimmung des Lymphknotenstatus.
Für Patienten mit einem kurativ resezierten Kolonkarzinom im Stadium I ist eine
adjuvante Therapie nicht indiziert. Bei Patienten mit einem R0 resezierten Kolonkarzinom
im UICC-Stadium III ist eine adjuvante Chemotherapie indiziert. In zahlreichen Studien
Einleitung
17
konnte dadurch ein Überlebensvorteil nachgewiesen werden [230]. Die Letalitätsrate
konnte um 10 bis 15% reduziert werden [1, 230]. Bei Patienten mit einem kurativ
resezierten Kolonkarzinom im Stadium II kann eine adjuvante Therapie in Betracht
gezogen werden, da ein Nutzen nicht ausgeschlossen werden kann. In der britischen
Quasar-Studie fand sich ein absoluter Überlebensvorteil von 3 % [219]. In vielen Studien
fand sich jedoch bisher kein signifikanter Überlebensvorteil [1, 34, 94].
Für die adjuvante Chemotherapie des Kolonkarzinoms im Stadium III sollte eine
Oxiplatin-haltige Therapie, wie zum Beispiel das FOLFOX-Schema (5-FU plus
Folinsäure plus Oxaliplatin) eingesetzt werden. [1, 202].
In mehreren randomisierten Studien konnte durch eine Kombination von 5-FU und
Folinsäure eine signifikante Senkung der Rezidivrate und eine Verbesserung des Gesamtüberlebens gezeigt werden. Durch eine zusätzliche Gabe von Oxaliplatin konnte das
Gesamtüberleben weiter erhöht werden [1, 12, 84, 230, 233].
Bei Patienten mit einem Rektumkarzinom im Stadium II und III, bei denen keine
neoadjuvante Radiochemotherapie durchgeführt wurde, ist eine postoperative kombinierte
Radiochemotherapie indiziert. Es konnte sowohl die Rezidivrate gesenkt als auch das
Gesamtüberleben verbessert werden [262, 284]. Bei Patienten mit vorangegangener
neoadjuvanter Therapie ist im Stadium III eine adjuvante Therapie wie beim Kolonkarzinom indiziert. Eine Indikation für eine alleinige adjuvante Chemo- oder
Radiotherapie besteht beim Rektumkarzinom nicht.
c. Neoadjuvante Therapie
Eine neoadjuvante Therapie sollte, präoperativ verabreicht, zu einer deutlichen Tumorreduktion führen und den inoperablen Tumor in einen operablen Zustand führen.
Das Problem der Indikation zur neoadjuvanten Therapie ist die Selektion der geeigneten
Patienten, das heißt die Auswahl der Patienten mit einem hohem Lokalrezidivrisiko und
die Vermeidung einer Übertherapie der Patienten mit einem niedrigem Lokalrezidivrisiko
[124, 261]. Für das Kolonkarzinom liegen beweisende Untersuchungen für die
Wirksamkeit neoadjuvanter Maßnahmen nicht vor.
Bei Rektumkarzinomen im Stadium II und III hat sich eine präoperative Radiotherapie
bzw. Radiochemotherapie bewährt [157, 231]. Sie ist verglichen zur postoperativen
Bestrahlung wirksamer und bringt weniger akute und chronische Morbidität mit sich [56].
Die Rate der sphinktererhaltenden Operationen konnte durch eine neoadjuvante
Behandlung verdoppelt werden. Als ein Nachteil der präoperativen Radiochemotherapie
18
Einleitung
muss das potenzielle „Overstaging“ und die daraus resultierende Überbehandlung des
Patienten gewertet werden.
Als Strahlentherapie stehen die Kurzzeitbestrahlung und die konventionell fraktionierte
Bestrahlung zur Verfügung. Die Rolle der Chemotherapie im Rahmen der präoperativen
Radiochemotherapie ist bislang noch nicht gesichert und wird in Studien untersucht.
d. Immuntherapie bei kolorektalen Karzinomen
Es werden zahlreiche neue Behandlungsmethoden des kolorektalen Karzinoms in
klinischen Studien evaluiert, von denen die Immuntherapie einen großen Nutzen
verspricht, die Prognose dieser Erkrankung zu verbessern. Die passive Immunisierung
bezieht sich auf die Verwendung monoklonaler Antikörper gegen Tumor-assoziierte
Antigene, die auf der Oberfläche von Tumoren überexprimiert werden. Diese Antikörper
haben durch Komplementaktivierung oder durch zelluläre Zytotoxizität einen antitumorösen Effekt. Auch können die Antikörper Zelloberflächenrezeptoren hemmen, die
für das Überleben und die Proliferation der Tumorzellen wichtig sind. Die Vorteile so
einer Therapie liegen in der geringen Zytotoxizität und dem spezifischeren Angriff der
Tumorzellen ohne wesentliche Schädigung des gesunden Gewebes. Von großer
Bedeutung sind Bevacizumab [110, 229], ein Antikörper gegen den VEGF-Faktor
(vascular endothelial growth factor) und Cetuximab [97, 155], sowie Panitumumab [128,
265], Antikörper gegen den EGFR-Rezeptor (epidermal growth factor receptor). Durch
die Blockierung dieser Rezeptoren kommt es zu einer Hemmung angiogenetisch
wirksamer Faktoren bzw. Zellwachstums-fördernder Faktoren und dadurch zu einer
Beeinträchtigung von Tumorinvasion und Metastasierung [3]. In Phase III-Studien konnte
bereits in Kombination mit einer Chemotherapie eine signifikante Verbesserung des
progressionsfreien Überlebens erreicht werden. Bevacizumab ist für die Erstlinientherapie
zugelassen. Die aktive Immuntherapie basiert auf der Hypothese, dass neoplastische
Zellen keine effektive Immunantwort auslösen. Durch Vakzinierung können Zellen vom
Immunsystem als maligne erkannt werden und von zytotoxischen T-Lymphozyten
eliminiert werden. In diesem Fall kommt die Immunantwort vom Patienten selbst. Eine
Möglichkeit besteht darin, dem Patienten autologe Vakzine zu geben. Dabei entnimmt
man Zytokin-produzierende Zellen aus dem Tumor des Patienten und verändert diese
gentechnisch. Bei der allogenen Vakzinierung gewinnt man die Tumorzellen aus Tumoren
anderer Patienten. Eine weitere Strategie ist die Immunisierung mit dendritischen Zellen.
Diese Zellen sind die leistungsfähigsten Antigen-präsentierenden Zellen. Man isoliert die
dendritischen Zellen aus dem peripheren Blut des Patienten und bringt sie mit
Einleitung
19
synthetischen Peptid-Epitopen, wie zum Beispiel Her-2/neu, CEA, p53, MUC1 zusammen
oder man injiziert diese Peptide direkt dem Patienten. So kann der Tumor dem Immunsystem präsentiert werden [3, 79].
1.1.6
Molekulare Kanzerogenese
Während exogene Umwelteinflüsse eine wichtige Rolle in der Adenom-Karzinom-Sequenz
spielen, hat man in den letzten Jahrzehnten typische molekulare Alterationen entdeckt, die
während der malignen Transformation zu einem kolorektalen Karzinom auftreten. Kritische
genetische Faktoren in der Krebsentwicklung betreffen vor allem Gene der Zellregulation, der
Zellproliferation und der Zelldifferenzierung [127]. Das kolorektale Karzinom ist eines der
besten Modelle für die Erforschung genetischer Veränderungen, die zu maligner Transformation und Tumorprogression führen. Verschiedene chromosomale Mutationen und
Deletionen sind bekannt, die über verschiedene Stadien der Hyperplasie und malignen Transformation zu einem invasiven Karzinom führen. Betroffen sind unter anderem Tumorsuppressorgene, Onkogene und Mismatch-Repair-Gene (Tabellen 1/8 und 1/9).
Aktuell gibt es zwei bedeutende genetische „Pathways“, die zu einem kolorektalen Karzinom
führen [37, 40, 111, 162, 248, 258]. Etwa 80 bis 90% der kolorektalen Karzinome entstehen
über den sogenannten Tumorsuppressor-Pathway. Er ist durch die sequenzielle Inaktivierung
einer Reihe von Tumorsuppressorgenen und dem Verlust der Heterozygotie („loss of
heterozygosity“) charakterisiert [93, 109, 172]. Tumorsuppressorgene arbeiten in einer
rezessiven Weise und fördern die Krebsentwicklung nur, wenn sie in beiden Allelen
inaktiviert sind, entweder durch Allelverlust oder durch Mutation beider Allele [18, 113].
Dieses erste molekulare Modell der Kolorektalkarzinogenese wurde von Vogelstein und
Fearon für die familiäre adenomatöse Polyposis beschrieben und ist als das klassische Modell
der Entstehung eines kolorektalen Karzinoms generell akzeptiert [93, 100, 113, 127].
Entscheidend ist dabei offenbar nicht die Reihenfolge, sondern das Aufeinandertreffen
mehrerer dieser genetischen Alterationen (Abbildung 1/1). Für die autosomal dominant
vererbte familiäre adenomatöse Polyposis ist eine Keimbahnmutation des Tumorsuppressorgens APC (Adenomatöse-Polyposis-Coli-Gen) auf Chromosom 5q21 verantwortlich [125,
127, 200]. Auch bei 80% der Patienten mit einem sporadischen kolorektalen Karzinom wurde
dieser Gendefekt gefunden, wobei es sich in diesem Fall um eine somatische Mutation
handelt. Alterationen des APC-Gens werden als initiales Ereignis im Rahmen des Tumorsuppressor-Pathways angesehen. Die Funktionen des vom APC-Gen codierten Proteins
beinhalten unter anderem Signaltransduktion über den sogenannten wnt-Pathway,
20
Einleitung
Vermittlung interzellulärer Adhäsion und Stabilisierung des Zytoskeletts. Zusammen mit βCatenin reguliert APC über den wnt/β-Catenin-Pathway die Transkription verschiedener
Zielgene, wie c-myc und Zyklin D1, die durch ihren Einfluss auf Proliferation, Apoptose und
Zell-Zyklus-Progression wichtig in der Tumorentstehung sind. Durch den Funktionsverlust
des APC-Gens entsteht aus dem normalen Kolonepithel ein hyperproliferatives Epithel.
Durch die Inaktivierung des APC-Gens steigt die Wahrscheinlichkeit für weitere Mutationen
[96, 109, 113, 127, 217, 248]. Durch zusätzliche Störungen in der DNA, besonders bei
Methylierungsvorgängen, kommt es zur Ausbildung eines sogenannten frühen Adenoms. Die
DNA-Methylierung ist ein epigenetisches Ereignis, das eine wichtige Rolle in der
Regulierung von Genen spielt. Aus einer Hypomethylierung der DNA könnte eine
Überexpression von Onkogenen resultieren, die die Tumorentstehung vorantreibt. In kolorektalen Karzinomen konnte aber auch eine Hypermethylierung der DNA beobachtet werden,
die mit einigen Genen, wie APC und hMLH1 assoziiert war. Man vermutet, dass diese Hypermethylierung wichtige Tumorsuppressorgene inaktiviert [111].
5q
Verlust
APC
12p
Aktivierung
k-ras
H-ras(?)
18q
Verlust
DCC
DNA
HypoMethylierung
Normales
Epithel
Hyperproliferatives
Epithel
Frühes
Adenom
Chromosom
Änderung
Gen
17p
Verlust
p53
Weitere
Änderungen
Intermediäres
Adenom
spätes
Adenom
Karzinom
Metastase
Abbildung 1/1: Molekulargenetische Kolorektalkarzinogenese modifiziert nach Fearon und
Vogelstein [93]
Eine andere genetische Mutation, die relativ früh in der Adenom-Karzinom-Sequenz
erscheint, ist eine Aktivierung des Proto-Onkogens K-ras. Sie wird in 30 bis 50% der
Adenome und Karzinome gefunden. Es handelt sich dabei um eine Punktmutation im Kodon
12, 13 und 64 auf Chromosom 12. Das mutierte Onkogen aktiviert eine Reihe von
Einleitung
21
Effektorwegen, die eine Zunahme der Zellproliferation bewirken [127, 248]. Beim Übergang
eines Adenoms in ein invasives Karzinom wird zudem häufig eine Mutation des Tumorsuppressorgens p53 auf Chromosom 17p beobachtet. Das p53-Protein spielt eine wichtige
Rolle in vielen Zell-Prozessen, wie DNA-Reparatur, Apoptose und transkriptioneller
Aktivierung. Das p53-Protein induziert normalerweise die Apoptose von Zellen und den
Verbleib der Zelle in der G1-Phase. Mutationen dieses Gens findet man häufiger in Tumoren
des distalen Kolon und Rektum, als in Tumoren des proximalen Kolon [113, 115, 127, 210].
Mit dem Übergang zu Malignität findet man weitere Allelverluste auf dem langen Arm von
Chromosom 18. „Loss of heterozygosity“ findet man auf Chromosom 18q21 bei 13% der
kleinen Adenome, bei 47% der größeren Adenome und bei 73% der Karzinome. Das Tumorsuppressorgen DCC („deleted in colorectal cancer“), von dem man ursprünglich dachte, dass
es eines der wichtigen Zielgene dieser Region sei, codiert für ein großes Zelladhäsionsmolekül und scheint keinen hohen Stellenwert zu haben. Die Proteinprodukte des Smad2- und
Smad4-Gens sind in intrazellulären Signalwegen involviert, die mit dem TransformingGrowth-Factor (TGF-β) reagieren, ein Protein, dass viele Zellprozesse, einschließlich
Proliferation, Differenzierung, Adhäsion und Apoptose reguliert. Eine Mutation des SMAD4Gens scheint mit der Progression eines Karzinoms assoziiert zu sein [127, 248]. Ein weiteres
Gen, das in der Kanzerogenese eine Rolle zu spielen scheint, ist das MCC-Gen (mutated in
colorectal cancer). Es liegt nahe dem APC-Gen auf Chromosom 5p21, seine Funktion ist
bisher unklar [109].
Zusätzliche genetische Veränderungen ermöglichen es einzelnen Zellen, sich aus dem Tumor
zu lösen und in anderen Organen Metastasen zu entwickeln. Der Prozess der Entwicklung
eines invasiven Karzinoms aus einem adenomatösen Polypen nimmt etwa 8 bis 15 Jahre in
Anspruch.
22
Genetische
Läsion
Einleitung
Chromosom
Häufigkeit
Zellbiologische
Veränderung
Vermutetes
Stadium innerhalb
der AdenomKarzinom-Sequenz
Tumorsuppressorgene
APC
5q21
30-70%
Zellproliferation,
Adhäsionsverlust
Frühes Adenom
(Epitheliale
Hyperproliferation)
P53
17p12
40-50%
Verlust der DNAReparatur-Kontrolle,
Verlust der
Zellzykluskontrolle
Spätes
Adenom/Karzinom
DCC
18q21
6%
Adhäsionsverlust
Intermediäres/spätes
Adenom/Karzinom
MCC
5p21
selten
nicht bekannt
nicht bekannt
SMAD
18q21
16-25%
Zellproliferation
nicht bekannt
Onkogene
K-ras
12p12(M)
30-50%
Zellproliferation
Deregulierung eines
Abschaltmechanismus
in der Zellaktivierung
Intermediäres
Adenom
c-myc
nicht bekannt
< 5%
Zellproliferation
nicht bekannt
DNA-Hypomethylierung
Gesamtes
Genom
Überexpression von
Onkogenen, DNAFunktionsfehler
Frühes Adenom
Tabelle 1/8: Genetische Veränderungen in der Adenom-Karzinom-Sequenz
Ein zweiter genetischer Pathway, der sogenannte Mutator-Pathway, ist bei der Entwicklung
von kolorektalen Karzinomen bei Patienten mit dem „hereditary non-polyposis colorectal
cancer-Syndrom“ (HNPCC) involviert, das für etwa 2 bis 5% der kolorektalen Karzinome
verantwortlich ist [100, 113, 159]. Patienten mit dieser autosomal-dominant vererbten
Erkrankung tragen eine Mutation in den sogenannten Mismatch-Repair-Genen. Aktuell sind
fünf dieser DNA-Mismatch-Gene bekannt (Tabelle 1/9). Die durch die Punktmutation
inaktivierten MMR-Gene sind nicht mehr in der Lage, spontan auftretende Fehler bei der
DNA-Replikation zu korrigieren. Bei Patienten mit einem HNPCC-assoziierten Karzinom ist
in über 90% der Fälle das hMLH1- oder das hMSH2-Gen betroffen. In den restlichen 10% der
Einleitung
23
Fälle betrifft die Mutation das hPMS2- und das hMSH6-Gen. Defekte in den MismatchRepair-Genen werden auch in 10 bis 15% der sporadischen kolorektalen Karzinome gefunden
[100, 196, 255].
Die Mutation der „mismatch-repair-(MMR-)Gene“ führt zu einem weiteren genetischen
Phänomen des HNPCC-Syndroms, der Mikrosatelliteninstabilität (MSI). Es handelt sich
dabei um eine genetische Instabilität, die molekulargenetisch nachgewiesen werden kann.
Man findet Längenpolymorphismen im Bereich einfacher repetitiver DNA-Sequenzen, der
sogenannten Mikrosatelliten. Die Mikrosatellitenregionen sind besonders anfällig für
Mutationen während der DNA-Replikation, da Fehler nicht effizient repariert werden können.
Diese genetische Instabilität führt weiterhin zu Frameshift-Mutationen, die Gene betreffen,
die an die Mikrosatellitenregion gebunden sind. Dabei sind bevorzugt Onkogene und Tumorsuppressorgene betroffen, die kurze repetitive Gebiete in ihrer Sequenz besitzen, wie zum
Beispiel der TGF-β-TypII-Rezeptor und BAX, die in Zellwachstum und Apoptose involviert
sind. Der TGF-β-TypII-Rezeptor ist von besonderem Interesse, da in 90% der kolorektalen
Karzinome eine Mutation in diesem Gen über den Mikrosatelliteninstabilitäten-Pathway
gefunden wird.
Eine hochgradige Satelliteninstabilität (MSI-H, 2 oder mehr Loci betroffen) unterscheidet
man von einer niedriggradigen Satelliteninstabilität (MSI-L, ein Locus betroffen). Dabei
werden nach internationaler Übereinkunft fünf definierte Loci auf Mikrosatelliteninstabilität
untersucht. Man findet sie bei etwa 90% der HNPCC-Tumoren und bei 10 bis 20% der
sporadischen kolorektalen Karzinome. Bei den sporadischen Karzinomen wird meist eine
hochgradige Mikrosatelliteninstabilität beobachtet [20, 37, 100, 127, 159, 248].
Diese Karzinome weisen teilweise klinische, morphologische und molekulare Gemeinsamkeiten mit HNPCC-Tumoren auf. Histologisch sind MSI-H-Karzinome schlecht, medullär
oder muzinös differenziert und zeigen eine starke intratumorale lymphozytäre Infiltration.
Trotzdem haben diese Tumoren eine bessere Prognose als mikrosatellitenstabile kolorektale
Karzinome und Karzinome mit einer geringgradigen Mikrosatelliteninstabilität. Sie werden
häufig bei älteren Frauen im proximalen Kolon gefunden, während p53 und K-ras Mutationen
eher im linken Kolon erscheinen [8, 150, 159, 180].
24
Einleitung
hMLH1 Chromosom 3p 60% der Patienten
hMSH2
Chromosom 2p 35% der Patienten
hPMS1
Chromosom 2q 1% der Patienten
hPMS2
Chromosom 7p 1% der Patienten
hMSH6
Chromosom 2p 1% der Patienten
Tabelle 1/9: Mismatch-Repair-Gene
Es wurden noch weitere Wege der molekularen Karzinogenese beschrieben, zum Beispiel der
Serrated-Pathway. Sägeblatt-Adenome zeigen oft ein „loss of heterozygosity“ auf
Chromosom 18q. Daher vermutet man, dass Sägeblatt-Adenome über einen anderen
genetischen Pathway entstehen als andere Adenome im Kolon. Longacre und FenoglioPreiser zeigten, dass 37% dieser gezähnten Adenome Anteile mit hochgradiger intraepithelialer Neoplasie enthielten. Man vermutet, dass die Entwicklung eines „serrated
adenoma“ in ein Karzinom sehr schnell verläuft [37, 210, 248, 290].
Durch die genaue Kenntnis der molekularen Alterationen, die in die Entstehung eines kolorektalen Karzinoms involviert sind, eröffnen sich viele neue Anwendungsmöglichkeiten für
eine frühe Detektion, Diagnose und Prognose des kolorektalen Karzinoms (Tabelle 1/10).
Auch können spezifische molekulare Marker genutzt werden, um die Biologie einer
Erkrankung zu erforschen, um neue Therapiemöglichkeiten zu finden und um die Auswahl
der richtigen Therapie zu ermöglichen. So könnten Individuen, die endogenen (genetischen)
und exogenen (umweltbedingten) Risikofaktoren ausgesetzt sind, identifiziert werden, in ein
engmaschiges Überwachungsprogramm aufgenommen werden und/oder eine präventive
chirurgische Intervention erhalten. Patienten mit einem hohen Rezidivrisiko und einer
schlechten Prognose könnten von einer radikaleren Therapie profitieren, während Patienten
mit einem niedrigen Risiko und einer günstigen Prognose eine weniger aggressive Therapie
erhalten könnten.
Molekulare Marker könnten genutzt werden, um frühe, intermediäre Endpunkte in der
Entwicklung kolorektaler Karzinome zu charakterisieren. Da die K-ras-Onkogen-Mutation
gewöhnlich in einem frühen Stadium der Adenom-Karzinom-Sequenz auftritt, könnte sie vor
der Umwandlung eines kleinen Adenoms in ein Karzinom detektiert werden. So könnte die
Entstehung eines Karzinoms verhindert werden [113]. Eine Stuhluntersuchung auf DNAVeränderungen als Screening-Maßnahme des kolorektalen Karzinoms ist inzwischen
möglich, jedoch aufgrund unzureichender Daten bisher nur innerhalb von Studien empfohlen.
Einleitung
25
Dabei wird die DNA aus Kolonepithelzellen isoliert und auf Mutationen untersucht. Für die
APC-Mutation wurde in mehreren Studien eine hohe Sensitivität beobachtet [4, 86, 260].
Jedoch ist für die Mutation des APC-Gens als initiales Ereignis im Rahmen der AdenomKarzinom-Sequenz keine hohe prognostische Relevanz zu erwarten. Eine Mutation des p53Gens ist mit einer schlechteren Prognose assoziiert [20]. Weitere molekulare Marker, die mit
einer schlechteren Prognose einhergehen, sind Mutation des Onkogens k-ras und Verlust des
Tumorsuppressorgens DCC [139, 186]. Der Nachweis einer Mikrosatelliteninstabilität bei
kolorektalen Karzinomen korreliert mit einer besseren Prognose [52, 100].
Anwendung
Ziel
Detektion
Screening der asymptomatischen Bevölkerung
Diagnostik
Unterscheidung zwischen maligne und benigne
Monitoring
Einschätzung der Therapiewirksamkeit und prognostische Vorhersage des
Tumorverhaltens
Klassifikation Therapiewahl und Prognose
Staging
Definition der Krankheitsausbreitung
Lokalisation
Nukleäre Methoden mit injizierten radioaktiven Antikörpern
Therapie
Zytotoxische Agentien, Immuntherapie
Tabelle 1/10: Anwendungsmöglichkeiten molekularer Marker
Zusätzlich zu den schon beschriebenen Veränderungen von Onkogenen, Tumorsuppressorgenen und der Mikrosatelliteninstabilität stehen auch andere Veränderungen in der Expression
und der Aktivität von Genen und ihren Genprodukten im Interesse der Forschung. Dies
betrifft vor allem Faktoren, die in Vorgänge der Proteolyse, Adhäsion, Angiogenese und Zellproliferation involviert sind. Hierbei spielen verschiedene an der Zelloberfläche exprimierte
Moleküle, wie zum Beispiel β-Catenin und Muzine, sowie ihre assoziierten Antigene als
potenzielle prognostische Tumormarker eine große Rolle [20, 93, 248].
26
Einleitung
1.2 Muzine
1.2.1
Grundstrukturen der Muzine
Der Begriff „Muzin“ geht zurück auf De Saussure (1835) und bezog sich anfangs auf die
Hauptkomponente des Mukus, der die Oberflächen der glandulären Epithelien mit einem
viskoelastischen Gel überzieht. Typisch für die Muzine ist eine dichte O-Glykosylierung, die
größtenteils aus einfachen Glykanen mit einem hohen Anteil an sialylierten Bindungen
bestanden. Durch die Entwicklung neuer analytischer Methoden wurde offensichtlich, das die
Glykane, die an die Muzinpeptid-Cores gebunden sind, viel größer und strukturell komplexer
sind, als man erwartet hatte. Seit man entdeckt hat, dass einige blutgruppenverwandte Marker
in diese Gruppe fallen, spielen diese komplexen O-gebundenen Glykane eine wichtige Rolle
in der Tumordiagnostik.
Die Sequenzierung der DNA der Muzine gelang in den späten 1980igern. Als strukturelle
Charakterisierung eines „echten“ Muzins besitzen alle Muzine große Peptiddomänen von
Tandem-repeats und können so von den Muzin-like-Glykoproteinen klar unterschieden
werden [21, 118, 140, 194].
Muzine werden an der duktalen Zelloberfläche glandulärer Epithelien exprimiert und sind die
Hauptbestandteile der Glykokalix, die die Schleimhautepithelien bedeckt. Das gewebsspezifische Vorkommen der Muzine wird in Tabelle 1/11 dargestellt.
Ihr molekularer Aufbau und ihre Polymerisation gewährleisten die physikochemischen
Eigenschaften des Schleims, der ein viskös-elastisches, hochgradig hydriertes Gel darstellt
[23]. Dieser Mukus, der die epithelialen Oberflächen des Intestinal-, Bronchial- und Urogenitaltrakts überzieht, spielt eine wichtige Rolle in der Lubrikation und der Protektion der
Zellen vor Schäden durch Säuren, proteolytischen Enzymen, pathogenen Organismen und
anderen luminalen Noxen [77, 269]. Zu den weiteren Funktionen gehören die Modulation des
Wasser- und Elektrolythaushaltes und die Bindung von Proteinen. Zudem sind Muzine Träger
von Antigenen, insbesondere Kohlenhydraten, die im Rahmen der Entstehung und
Ausbreitung von Neoplasien typische Veränderungen erfahren [23, 259]. Im Kolon fungiert
der Mukus als Gleitmittel und sorgt für eine leichtere Darmpassage [9-10]. Sekretorische
luminale Muzine können unlösliche Bestandteile, auch Bakterien und Parasiten, ummanteln
und dadurch den Abtransport erleichtern. Die Zucker der Oligosaccharidketten sind
verantwortlich für Interaktionen mit Parasiten, Viren und Bakterien. Dadurch kann eine
Besiedelung und Schädigung der Schleimhaut durch Adhäsion verhindert werden [266].
Einleitung
Muzin
Hauptsächliches Vorkommen
MUC1
Membranassoziiert auf fast allen glandulären Epithelien,
vor allem Pankreas und Glandula mammaria
MUC2
Kolon (Becherzellen)
MUC3
Jejunum, Ileum, Kolon
MUC4
Respirationstrakt
27
MUC5AC Magen, Respirationstrakt, Konjunktiva
MUC5B
Gallenblase, Speicheldrüsen
MUC6
Magen
MUC7
Speicheldrüsen, Trachea
MUC8
Trachea
MUC9
Urogenitaltrakt
MUC11
Jejunum, Ileum, Kolon, Urogenitaltrakt, Respirationstrakt
MUC12
Jejunum, Ileum, Kolon
Tabelle 1/11: Gewebsspezifisches Vorkommen der Muzine
Muzine sind hochmolekulare Glykoproteine mit einem Molekulargewicht von 300-1000 kDa.
Diese Größenvariationen resultieren aus der unterschiedlichen Länge der Kohlenhydratseitenketten.
Charakteristisch für alle Muzine ist eine große zentrale Region, die aus Serin- und Threoninreichen (25 bis 70% der Aminosäuren) repetitiven Sequenzen besteht und die man aufgrund
ihrer allelabhängig schwankenden Anzahl „variable number of tandem repeats“ (VNTR)
nennt. Auch Alanin, Glyzin und Prolin werden in den Tandem-repeats gefunden. Jede dieser
Muzineinheiten hat eine spezifische Länge und Sequenz und weist einen genetischen
Polymorphismus auf. Diese Eigenschaften sind offenbar organcharakteristisch, jedoch nicht
organspezifisch [23, 151].
Jede Muzinuntereinheit besteht aus einer Kette von etwa 1000 Aminosäuren. Diese sind
teilweise glykosyliert („T-Domäne“, trypsinresistent) und zum Teil nicht glykosyliert („BDomäne“). Während die T-Domäne hohe Anteile der Hydroxyaminosäuren Serin und
Threonin enthält, ist die B-Domäne reich an Asparaginsäure und Cystein.
An das Proteingerüst werden in der Länge variierende neutrale, sialylierte oder sulfatierte
Oligosaccharidketten durch eine meist O-glykosidische Bindung an Serin bzw. Threonin
28
Einleitung
angeknüpft. Jede Muzinuntereinheit enthält etwa 200 Kohlenhydratseitenketten. Die Oligosaccharidketten machen 50 bis 80% der Masse eines Muzins aus. Die Regionen mit zahlreichen Oligosaccharidketten, die mit Regionen niedrigem Kohlenhydratgehaltes abwechseln,
bilden eine relativ starre für Proteasen wenig anfällige Struktur [24, 190, 242, 259].
Die Oligosaccharidketten kann man in drei strukturelle Regionen aufteilen (Abbildung 1/2
und Tabelle 1/12). Die innere Kernregion („core region“) ist durch die O-glykosidische
Bindung von N-Azetylgalaktosamin an Serin oder Threonin, sowie durch die Zuckerreste, die
direkt an N-Azetylgalaktosamin gebunden sind, charakterisiert. Bisher sind acht dieser CoreStrukturen aufgeklärt. Der inneren schließt sich die äußere Kernregion („backbone region“)
an. Sie besteht aus linearen oder verzweigten, teilweise repetitiven Galaktose-NAzetylglukosamin-Disacchariden (Gal-GlcNAc), die man aufgrund ihrer Bindung in die
Typen 1-Laktosamin (Galβ1-3GlcNAc) und 2-Laktosamin (Galβ1-4GlcNAc) unterscheidet.
Die periphere Region zeigt die größte Vielfalt von Kohlenhydratstrukturen und ist die
wichtigste Region für die Antigenität der muzinassoziierten Kohlenhydrate. Sie enthält unter
anderem ABH- und Lewis-Blutgruppenantigene, sowie eine Reihe anderer Blutgruppenverwandter Strukturen.
Einleitung
Peptid
Innere Kernregion
Äußere Kernregion
Periphere Region
Abbildung 1/2: Schematische Darstellung der Kohlenhydratseitenketten der Muzine
Innere Kernregion
Core 1
Galβ1-3GalNAc
Core 2
Galβ1-3(GlcNAcβ1-6)GalNAc
Core 3
GlcNAcβ1-3GalNAc
Core 4
GlcNAcβ1-3(GlcNAc1-6)GalNAc
Core 5
GalNAcα1-3GalNAc
Core 6
GlcNAcβ1-6GalNAc
Core 7
GalNAcα1-6GalNAc
Core 8
Galα1-3GalNAc
Tn-Antigen
GalNAcα
29
30
Sialyl-Tn-Antigen
Einleitung
NeuAcα2-6GalNAc
Äußere Kernregion
Typ1-Kette
Galβ1-3GlcNAc
Typ2-Kette
Galβ1-4GlcNAc
i-Antigen (unverzweigt) (Galβ1-4GlcNAcβ1-3)n
I-Antigen (verzweigt)
Galβ1-4GlcNAcβ1-3(Galβ1-4GlcNAcβ16)Galβ1
Periphere Region
H-Typ 1
Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-
Blutgruppe A-Typ 1
GalNAcα1-3(Fucα1-2)Galβ1-3GlcNAcβ1-
Blutgruppe B-Typ 1
Galα1-3(Fucα1-2)Galβ1-3GlcNAcβ1-
Lewisa
Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAcβ1-
Lewisb
Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAcβ1-
Lewisx
Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1-
Lewisy
Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1-
Sialyl-Lewisa
NeuAcα2-3Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAcβ1-
Sialyl-Lewisx
NeuAcα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1-
Tabelle 1/12: Glykanstrukturen in Oligosacchariden vom Muzin-Typ [21]
Bis heute sind 20 Gene identifiziert worden, die für jeweils unterschiedliche Muzin-Typen
codieren [49]. Die Muzine werden unterteilt in sekretorische und membrangebundene
Muzine, zwischen denen es große Unterschiede gibt (Tabelle 1/13). Die sekretorischen
Muzine besitzen in den nicht repetitiven Anteilen cysteinreiche Peptide („vonWillebrandtfactor-like D-Domains“), die über Bildung kovalenter Disulfidbrücken bei der
Oligomerisation von Muzin-Monomeren und an der Gestaltung der sekretorischen Vesikel
eine Rolle spielen. Im Gegensatz dazu enthalten die membrangebundenen Muzine weniger
Cystein und bilden keine oligomerischen Komplexe, besitzen aber hydrophobe Sequenzen
(„Transmembran-Domäne“),
die
für
die
Verankerung in
der
Lipid-Doppelschicht
verantwortlich sind und C-terminale Peptide, die in das Zytosol hineinreichen. Zu den
sekretorischen Muzinen zählen MUC2, MUC5AC, MUC5B, MUC6, MUC7, MUC8, MUC9,
und MUC19. Zu den Membrangebundenen gehören MUC1, MUC3A, MUC3B, MUC4,
Einleitung
31
MUC11-13, MUC15-18 und MUC20, wobei zumindest MUC1 auch in einer sekretorischen
Isoform existiert [55, 59, 118, 212].
MuzinSpezies
Sekretorisch
/ membrangebunden
ChromosomenLokalisation
Anzahl der
Tandem-repeats
Anzahl der
Aminosäuren
/ Tandemrepeat
DDo
mä
ne
MUC1
m, s
1q21
variabel (21-125)
20
-
MUC2
s
11p15.5
21/51-115
23/16
+
MUC3A
m, s
7q22
20/?
17/375
-
MUC3B
m, s
7q22
33*/?
17/375
-
MUC4
m, s
3q29
145-395
16
-
MUC5AC
s
11p15.5
124,17,34,66**
8/5
+
MUC5B
s
11p15.5
11,11,17,11,22**
29
+
MUC6
s
11p15.5
15-26
169
+
MUC7
s
4q13-21
5-6
23
-
MUC8
s
12q24.3
6*/3*
13/41
+
MUC9
s
1p13
6
15
+
MUC11
m
7q22
36*
28
-
MUC12
m, s
7q22
22*
28
+
MUC13
m
3q13.3
10
15
-
MUC15
m
11p14.3
Keine TR
0
-
MUC16
m
19p13.3
9
156
-
MUC17
m
7q22
5
59
-
MUC18
m
11q23.3
Keine TR
0
-
MUC19
s
12q12
6*/3/4/2/2/4/3
7/7/15/16/9/8/5 +
MUC20
m
3q29
2-6
19
Tabelle 1/13: Muzine [21, 224]
*Die vollständige DNA-Sequenz ist noch unbekannt
**Die Anzahl der TR ist in spezifischen Regionen von MUC5AC und MUC5B
unterschiedlich.
?
32
1.2.1.1
Einleitung
Synthese der Oligosaccharidketten
Typische post-translationelle Modifikationen von Glykoproteinen sind die N- oder OGlykosylierung. Muzine enthalten meist O-glykosidisch gebundene Oligosaccharide, die in
einem schrittweisen Prozess in den Golgikomplexen gebildet werden.
Die Synthese beginnt mit der Übertragung von N-Azetyl-D-Glalaktosamin (GalNAc) aus
UDP-GalNAc auf die Hydroxyaminosäuren Serin oder Threonin innerhalb der VNTRRegion. Es entsteht das sogenannte Tn-Antigen GalNAc-O-Ser/Thr. Dieser Schritt wird von
den Polypeptid-N-Azetylgalaktosaminyl-Transferasen katalysiert. Es liegen verschiedene Isoformen dieser Enzymgruppe vor, die in unterschiedlichen Kompartimenten des Golgiapparates verteilt sind und eine unterschiedliche, teilweise überlappende Spezifität beim
Erkennen der Peptid-Sequenz haben. Dadurch, dass die Enzyme in den Organen
unterschiedlich aktiv sind, ergeben sich regional unterschiedliche Muster der Kohlenhydratexpression. Bisher sind 30 verschiedene Glykosyltransferasen bekannt, von denen mindestens
12 an der Synthese der O-Glykane der Muzine beteiligt sind [49, 224, 271]. Außer von dem
Vorhandensein der Transferasen, hängt die initiale O-Glykosylierung auch von der Aminosäuresequenz ab, die die Aktivität der Transferasen negativ oder positiv beeinflussen kann.
Auch die post-translationalen Veränderungen der Peptidsubstrate und die Sekundär- und
Tertiärstruktur der Proteine, die potenzielle Glykosylierungspositionen maskieren können,
haben einen Einfluss auf die initiale O-Glykosylierung.
Als nächster Schritt folgt die Substitution von zwei bis drei weiteren Monosacchariden, meist
Galaktose (Gal) und/oder N-Azetylglukosamin (GlcNAc), aber auch Neuraminsäure (NeuAc,
NeuGc) oder Fukose (Fuc) mit N-Azetylgalaktosamin an den Positionen C3 und C6. Auf
diese Weise entstehen die bereits erwähnten Core-Strukturen, die alle weiter glykosyliert
werden können. Core 1 und Core 3 entstehen durch Addition von Gal bzw. GlcNAc an
Position C3. Wird zusätzlich an Position C6 GlcNAc addiert, entsteht Core 2 bzw. Core 4.
Core 5 entsteht durch Substitution von GalNAc in Position C3. Durch Bindung von GlcNAc
bzw. GalNAc in Position C6 entsteht Core 6 bzw. Core 7. Core 8 enthält Gal in Position C3
(Abbildung 1/2). Während Core 1 und Core 2 im menschlichen Organismus weit verbreitet
sind und Core 3 und Core 4 im Gastrointestinal- und Bronchialtrakt gefunden werden, kommt
Core 5 eher in fetalen Muzinen und in kolorektalen Karzinomen vor. Core 6 findet man in
Mekonium und in Magenkarzinomen, Core 7 und Core 8 im menschlichen Bronchialtrakt. Im
Kolon kommen vor allem die Core-Strukturen 1 bis 4 vor [49].
An die Core-Region schließt sich die Backbone-Region an durch Substitution des
Disaccharids Galβ1-4GlcNAc, entweder über eine β1-3-Bindung, so dass lineare Strukturen
entstehen, oder über eine β1-6-Bindung an Galaktose, wodurch verzweigte Ketten entstehen.
Einleitung
33
Die Position C6 wird hierbei meistens bevorzugt. Es entstehen Polylaktosaminstrukturen mit
über 20 Monosacchariden. Im menschlichen Magen und Kolon sind bis zu 21 verschiedene
Backbone-Strukturen bekannt. Diese linearen oder verzweigten Polylaktosamine von Typ1und Typ 2-Ketten repräsentieren die strukturelle Basis der i/I Blutgruppenantigene. Die
Ketten werden mit α-Galaktose, α-N-Azetylgalaktosamin oder mit terminierenden Monosacchariden wie α-Neuraminsäure, α-Fukose oder Sulfat substituiert [21, 252]. Die
strukturelle Variabilität erhöht sich ferner durch Veränderung der Neuraminsäure, die Nazetyliert, N-glykosyliert oder O-azetyliert sein kann. Die Addition von Neuraminsäure und
Sulfat verleihen den Muzinen seine negative Ladung, was den niedrigen pH-Wert erklärt,
während Fukose für die Hydrophobizität verantwortlich ist. Mit der negativen Ladung
und/oder der Hydrophobizität tragen die terminalen Zucker zu den physikalischen und
biologischen Eigenschaften der Muzine bei. Während im Magen hauptsächlich neutrale
Muzine und im Dünndarm neutrale und sialinierte Muzine enthalten sind, kommen im Kolon
neutrale, sialinierte und sulfatierte Muzine vor. Der hohe Anteil von O-azetylierter Neuraminsäure ist charakteristisch für das menschliche Kolon und wurde in keinem anderen
menschlichen Gewebe gefunden [7, 76]. Die poly-o-azetylierte Neuraminsäure führt zu einer
Hydrophobizität der Muzine, was im Kolon den Widerstand gegen bakterielle Enzyme erhöht
[23].
1.2.2
MUC1: Struktur
MUC1 wurde zuerst in menschlicher Milch als ein hochmolekulares Glykoprotein reich an
Serin, Threonin und Prolin mit einem hohen Prozentanteil von O-gebundenen Kohlenhydraten identifiziert [101, 251-252]. MUC1 ist auch bekannt unter den Namen HMFGAntigen, DF2-Antigen, EMA (epithelial membrane antigen), MAM-6, PEM (polymorphic
epithelial mucin), PAS-O, PUM und Episialin. Diese vielen Bezeichnungen unterstreichen die
polymorphe Struktur von MUC1 und seine verschiedenen Funktionen [59, 269]. Es wurde
1990 parallel von vier Arbeitsgruppen als erstes menschliches Muzin-Gen sequenziert [103,
169, 177, 251, 286]. MUC1 ist das bisher bekannteste Muzin, dessen Gen auf Chromosom
1q21 lokalisiert ist. Es besteht aus sieben Exons, wobei Exon 2 die multiplen Tandem-repeatSequenzen aus Einheiten mit 60 bp enthält. Abhängig von der Zahl der Tandem-repeats,
macht diese Region 50 bis 80% des ganzen Gens aus. Die VNTR-Domäne codiert für 20 bis
120 Repeats und weist einen hereditären Polymorphismus auf. Die meisten Menschen Nordeuropas haben zwischen 40 und 80 Repeats [21, 95, 101-102, 236, 244]. Die VNTR-Region
enthält einen hohen Anteil (82%) von G/C Basenpaaren. Die hoch konservierte VNTR-
34
Einleitung
Region wird flankiert von kurzen nicht repetitiven Peptid-Sequenzen. Die kleine N-terminaleDomäne enthält ein Signalpeptid. Der C-terminale Anteil enthält eine transmembranäre und
eine intrazelluläre Domäne, deren Sequenzen hoch konserviert sind (Abbildung 1/3) [24, 103,
169, 177]. Es werden einige MUC1 Isoformen beschrieben, die durch alternatives Splicen
generiert wurden. Das MUC1/TM, die vollständige Form von MUC1, bildet ein Heterodimer
mit einer extrazellulären, O-glykosylierten Untereinheit, die an eine transmembranäre Untereinheit gebunden ist. Das MUC1/Y ist ein verzweigtes Transmembran-Protein und enthält
keine Tandem Repeat-Domäne [102, 298]. Es dient als Bindungspartner für eine andere Isoform, das sekretorische MUC1/sec, ein lösliches Glykoprotein, das keine TransmembranDomäne enthält. Das MUC1/sec kann mit spezifischen Antikörpern in Sekreten von
Karzinomzellen und im Serum von Patienten mit einem Mammakarzinom detektiert werden
[21, 32, 55, 95, 102].
Sig
Tandem-repeat
Tandem-repeat
Domäne
Domäne
(VNTR)
(VNTR)
N
TM
CP
C
HGVTSAPDTRPAPGS
TAPPA
Immundominante Region
Abbildung 1/3: Primärstruktur von MUC1, abgeleitet aus der DNA-Sequenz von
Chromosom 1q21. Sig=Signalsequenz, TM=Transmembran-Sequenz, CP=cytoplasmatische
Domäne
MUC1 ist ein membrangebundenes Glykoprotein. Mit einem Molekulargewicht des Apomuzins von 120-300 kDa, in glykosylierter Form von 300-600 kDa, ist es im Vergleich zu
den anderen Muzinen ein relativ kleines Muzin. Das reife Glykoprotein bildet einen stabilen
heterodimeren Komplex. Es wird von den meisten glandulären Epithelzellen und epithelialen
Tumoren gebildet. MUC1 wird in Normalgeweben ausschließlich auf der apikalen Oberfläche
der Zellen exprimiert, wo es stabförmig 100 bis 500 nm über die Oberfläche hinausragt. Das
ist 100-mal weiter als die meisten anderen Oberflächenmoleküle [95, 163, 218, 252]. Es
kommt vor allem in der Mamma, in der Speicheldrüse, im Magen, im Pankreas, in der
Einleitung
35
Harnblase, im Uterus, im Dünndarm und im Kolon vor. Auch wurde MUC1 in hämatopoetischen Zellen, wie Granulozyten, Plasmazellen, erythropoetischen Zellen, aktivierten TZellen, Myelomzellen und
Lymphomzellen detektiert [269]. In Karzinomen der
entsprechenden Organe ist eine unterschiedlich deutliche Überexpression zu beobachten [6,
80, 87, 108, 136, 198]. Vom Aufbau her können die Untereinheiten des Muzins in drei
unterschiedliche Regionen aufgeteilt werden: Die zytoplasmatische Domäne mit 69 Aminosäuren, die hydrophobe Transmembran-Domäne mit 31 Aminosäuren und eine große hoch
glykosylierte extrazelluläre Domäne, die die große Anzahl an Tandem-repeats enthält. Diese
Tandem-repeat-Domäne enthält die bis zu 120-fach wiederholte aus 20 Aminosäuren
bestehende
Sequenz
(PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA)
mit
den
Varianten
(PD/ET/SRPAPGSTAPP/Q/A/TAHGVTSA). Jede Tandem-repeat-Einheit enthält fünf
potenzielle O-Glykosylierungsstellen. Zwei werden von Serin, drei von Threonin repräsentiert
Während in normalem Drüsengewebe der Mamma durchschnittlich nur 50% der potenziellen
Bindungsstellen besetzt sind, werden in malignen Zellen alle fünf Bindungsstellen zur OGlykosylierung genutzt [118, 192]. Die VNTR-Region ist reich an Serin, Threonin und
Prolin. Mit Alanin und Glyzin machen diese fünf Aminosäuren 50% der gesamten Aminosäuren in der VNTR-Region aus [24, 95, 218]. Cystein ist nur in der zytoplasmatischen
Domäne vorhanden, so dass eine Polymerisation zwischen einzelnen MUC1-Molekülen
unmöglich ist. Zwischen der VNTR-Region und der transmembranären Domäne liegen fünf
potenzielle N-Glykosylierungsstellen, die mit komplexen Glykanen substituiert sind. Die Ngebundenen Oligosaccharide machen quantitativ einen kleinen Teil aus, können aber
funktionell wichtig sein [55, 177]. Die an Serin, Threonin und Prolin O-glykosidisch
gebundenen Kohlenhydratketten machen einen hohen Prozentanteil des Moleküls aus und
erlauben dem Muzin, hochgradig hydratisiert zu sein. Die O-gebundenen Glykane in MUC1
variieren in Abhängigkeit des Organs und der Differenzierung des Gewebes. In Epithelien der
laktierenden Mamma werden hauptsächlich lange Polylaktosamin-Typ-Ketten exprimiert, die
durch Verlängerung des C6-Astes von Core2 gebildet werden [119, 121, 142]. Nur etwa 20%
der Glykane enthalten Neuraminsäure. Sie sind stark fukosyliert. In Zellen von Mammakarzinomen findet man demgegenüber kurze Ketten begrenzt auf die Core-Strukturen.
Sialylierte Glykane dominieren über Neutrale [120, 178]. Über die Glykosylierung von
MUC1 in kolorektalen Karzinomen gibt es weniger Informationen. In rektalen Adenokarzinomen konnte gezeigt werden, dass sich die Glykane auf kurze Core-Typ-Sequenzen
beschränken, die aus Core1, 3 und 5 bestehen. Sie enthalten als gemeinsame Struktureinheit
das Disaccharid NeuAcα2-6GalNAc (Sialyl-Tn-Antigen) [168]. Enzymatische Studien lassen
vermuten, dass es in kolorektalen Karzinomen zu einer generellen Verlagerung der Core-
36
Einleitung
Synthese von Core 3, das in normalen Kolongewebe dominiert, zu Core 2 kommt [50, 75,
215-216]. Die Typ 2-Polylaktosamine werden mit Neuraminsäure oder Fukose terminiert [95,
252].
1.2.3
MUC1: Biologische Relevanz
Als membrangebundenes Muzin wird MUC1 in normalen duktalen Epithelien auf der
apikalen Oberfläche der Zellen exprimiert. Die exakten Funktionen von MUC1 sind noch
nicht vollständig aufgeklärt. Die extrazelluläre Domäne, die stabförmig über die Zelloberfläche hinausragt, ist verantwortlich für die protektive Funktion von MUC1 und spielt eine
Rolle in der Immunregulation [170]. Der muköse Schleim bildet eine protektive Barriere
zwischen der Epitheloberfläche und dem das Epithel schädigende Milieu im Lumen des
gastrointestinalen, respiratorischen und reproduktiven Traktes. MUC1 ist für die Lubrikation
der Zelloberfläche und das Aufhalten von pathogenen Partikeln verantwortlich. Eine
protektive Funktion gegen bakterielle oder virale Pathogene konnte für MUC1 in
menschlicher Milch gezeigt werden [102, 234, 291]. Auch ist MUC1 in Zell-Zell- und ZellMatrix-Interaktionen involviert [189].
Im Rahmen der Kanzerogenese kommt es zu einer deutlichen Überexpression von MUC1, die
zum Beispiel in Adenokarzinomen bis auf das 10-fache gesteigert sein kann. MUC1 ist nicht
mehr auf die apikale Zellmembran beschränkt, sondern aufgrund des Polarisationsverlustes
der Tumorzellen auf der gesamten Zelloberfläche verteilt [189, 206]. Zusätzlich findet man
eine Veränderung der Muzin-Glykosylierung, im Sinne einer atypischen verminderten
Glykosylierung [49, 74, 95, 136]. Diese typischen Veränderungen in neoplastischen Geweben
könnten eine große Aussagekraft sowohl im Hinblick auf Differenzierung und Biologie als
auch in Bezug auf Diagnose, Progression und Prognose von Tumoren besitzen. So konnte in
Adenokarzinomen der Lunge gezeigt werden, dass eine Membranexpression von
glykosylierten MUC1 signifikant mit Lymphknotenmetastasen und fortgeschrittenen
pathologischen Stadien assoziiert ist [112]. Cao et al. hat eine Membranexpression von unterglykosyliertem MUC1 in kolorektalen Adenomen mit schwerer Dysplasie und in invasiven
kolorektalen Karzinomen nachgewiesen [62]. Hier könnte eine anormale Expression von
MUC1 in die Entwicklung von Metastasen und in den Übergang von normalen zu (prä-)
malignen Läsionen involviert sein.
Auch in der Entwicklung von neuen Therapieansätzen, wie zum Beispiel der Immuntherapie
könnte MUC1 wichtig sein [95, 137, 239, 252]. Die Überexpression von MUC1 in Tumoren
von Lunge, Magen, Mamma, Pankreas, Kolons, Prostata, Ovarien, Endometrium, Zervix und
Einleitung
in vielen Myelomen und einigen Lymphomen
37
machen MUC1 zu einem attraktiven
therapeutischen Ziel. Man geht inzwischen davon aus, dass MUC1 einen unabhängigen
negativen prognostischen Parameter für das kolorektale Karzinom darstellt und dass eine
Überexpression von MUC1 in Tumoren mit der Progression und der Metastasierung assoziiert
ist [27, 89, 102, 170, 195, 264]. Als Serumtumormarker CA 15.3 hat sich MUC1 bereits bei
Patientinnen mit einem Mammakarzinom etabliert [126, 227]. Der Nachweis dient
hauptsächlich der Verlaufskontrolle. Zum Nachweis von Primärtumoren ist die diagnostische
Empfindlichkeit der Methoden zu gering und der Nachweis zu unspezifisch [238]. Dennoch
ist die Aussagekraft und Bedeutung von MUC1, gerade in Bezug auf das Glykosylierungsprofil, trotz zahlreicher Studien noch nicht eindeutig geklärt und wird teilweise kontrovers
diskutiert.
Eine Theorie für den Zusammenhang einer gesteigerten MUC1-Expression und einer
erhöhten Metastasierungsbereitschaft eines Tumors bezieht sich auf die adhäsiven
Eigenschaften von MUC1.
Die gestörte anormale Glykosylierung von MUC1 im Rahmen der Kanzerogenese führt zu
kürzeren und weniger verzweigten Oligosaccharidketten, der Akkumulation von Vorläuferstukturen und der Demaskierung von Regionen des MUC1-Proteincores [214, 228]. Es
entstehen neue Kohlenhydrat-Epitope, wie zum Beispiel das T- und das Tn-Antigen, das
Sialyl- Le x - und das Sialyl- Le a -Antigen [49]. Diese strukturellen Veränderungen haben einen
Einfluss auf die Zellfunktion und somit auf das Potenzial eines Tumors, invasiv zu wachsen
und zu metastasieren. So geht ein starker Titeranstieg des muzinassoziierten Sialyl-TnAntigens bei kolorektalen Karzinom-Patienten mit einer schlechteren Prognose einher [145].
Sialyl- Le x und Sialyl- Le a tragen über die Liganden P- und E-Selektin und das intra-zelluläre
Adhäsionsmolekül ICAM-1 zur Adhäsion von malignen Zellen an vaskuläre Epithelien bei
und könnten so eine entscheidende Rolle in der hämatogenen Metastasierung einnehmen [6,
89, 181-182, 221, 246-247]. In Tumoren findet man eine Steigerung der Sialylierung von
MUC1. Die Neuraminsäure, ein terminierendes Monosaccharid der peripheren Region scheint
ebenfalls einen Einfluss auf die Metastasierung zu haben. So konnte gezeigt werden, dass ein
Entfernen der Neuraminsäure das Metastasierungspotenzial von Karzinomzellen reduzieren
kann [48-49].
Auch haben In-vitro-Ergebnisse gezeigt, dass Kolonkarzinomzelllinien mit einer starken
Muzinproduktion eine starke Adhärenz an Basalmembranproteine aufweisen. Dieser Effekt
konnte durch spezifische Hemmung der O-Glykosylierung aufgehoben werden [235].
38
Einleitung
Neben diesen adhäsiven Eigenschaften besitzt MUC1 aber auch anti-adhäsive Funktionen, die
eine entscheidende Rolle in der Progression und Metastasierung eines Tumors spielen.
Aufgrund der großen, stabähnlichen Konformation des MUC1-Proteins, das sich 200 bis 500
nm über die Zelloberfläche ausdehnt, können Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen
gehemmt werden. So könnten sich Tumorzellen aus dem Zellverband lösen und
metastasieren. Da MUC1 in Karzinomen durch den Polarisationsverlust der Zelle auf der
ganzen Zelloberfläche verteilt ist und aufgrund seiner Länge und Stabilität, kann MUC1
andere Adhäsionsmoleküle maskieren und so zu einer reduzierten Zell-Zell-Aggregation
beitragen [131, 176]. MUC1 kann auch die Interaktion zwischen Glykoproteinen gegenüberliegender Membranen hemmen, wodurch das Lumen der Drüsen und Venolen
aufrechterhalten wird [170]. MUC1 interagiert mit einer großen Anzahl an Proteinen, die
einen Einfluss auf Karzinogenese und Zell-Adhäsion haben. Vor allem für die über ECadherin vermittelte Zell-Zell-Adhäsion scheint MUC1 ein wichtiger adhäsionshemmender
Faktor zu sein [275]. Durch eine MUC1-Überexpression konnte auch die Integrin-vermittelte
Adhäsion von Karzinom-Zellen an Bestandteile der Extrazellulärmatrix, wie Laminin, Kalinin
und E-Cadherin, wie auch die Bindung zwischen E-Cadherin und β-Catenin gehemmt werden
[160, 252, 275-276, 288]. Die intrazelluläre Domäne von MUC1 interagiert außerdem direkt
mit β-Catenin, einem nukleären Transkriptionsfaktor, der zur Hemmung von E-Cadherin
vermittelter Zell-Zell-Adhäsion führt [144]. Eine Überexpression von MUC1 geht mit einem
erhöhtem Level an nukleären β-Catenin einher [274]. Ein Einfluss von β-Catenin auf die
Tumorprogression konnte gezeigt werden. So ist eine Koexpression von MUC1 und βCatenin in der Invasionsfront von kolorektalen Tumoren mit einer schlechteren Prognose
korreliert [46, 89]. β-Catenin bindet auch an APC. Dies ist ein essenzieller Partner im SignalPathway Wingless/wnt-1 [143, 193]. Eine APC-Überexpression reduziert den Anteil an
freiem zytoplasmatischen β-Catenin und somit auch die Komplexbildung von β-Catenin und
E-Cadherin. Dies reduziert die intrazelluläre Adhärenz [54, 209].
Die Blockierung der Zell-Zell-Interaktionen durch MUC1 zerstört die epitheliale Struktur und
Stabilität, was die Neigung zur Invasivität steigern kann. Dies konnte an Ovarialkarzinomen
gezeigt werden [87].
Einleitung
1.2.4
1.2.4.1
39
Expression von Muzinantigenen im Kolon
Expression von Muzinantigenen in normalem Kolongewebe
1.2.4.1.1 Peptid-Core-Antigene
In Normalgeweben sind die Muzinpeptidantigene infolge der regulär starken Glykosylierung
oft maskiert und ihr Nachweis durch Antikörper daher erschwert.
Im Gastrointestinaltrakt werden von der Mundhöhle bis zum Kolon Muzine exprimiert. Dabei
findet sich in den verschiedenen Geweben ein spezifisches Expressionsmuster der Muzingene. Im Kolon ist es häufig problematisch, die genaue Lokalisation der Muzin
produzierenden Zellen zu entdecken. Das liegt auf der einen Seite an der Schnittdicke beim
Lichtmikroskop, andererseits an der Schwierigkeit, die vollständig glykosylierten und
oligomerisierten Muzine zu detektieren [281]. Daher findet man in der Literatur einige
widersprüchliche Angaben in Bezug auf die Expression der Peptidantigene der Muzine. In
den vergangenen Jahren wurden in mehreren Workshops viele monoklonale und polyklonale
Antikörper entwickelt, die inzwischen gut charakterisierte Epitope auf den Muzin-Molekülen
erkennen und binden [64, 213, 218, 251]. Die meisten dieser Peptid-spezifischen Antikörper
sind gegen Epitope auf der Repeat-Domäne gerichtet und reagieren mit einem definierten
Cluster der Aminosäuren. Dabei stellt das PDTRP-Motiv des MUC1- Muzins eine sehr
immundominante Region dar [269].
Im Kolon werden hauptsächlich MUC2 und MUC3 exprimiert [77]. Für MUC2 gibt es
kontroverse Ergebnisse. Zum einen soll MUC2 vorwiegend in den Becherzellen und nicht in
den Enterozyten exprimiert werden, in denen anti-MUC2-VNTR-Antikörper eine intensive
zytoplasmatische Färbung hervorrufen, jedoch nicht das reife Muzin oder das anhängende
Mukusgel färben [11, 66, 136, 273]. Nach Entfernung von Oligosacchariden konnte
sekretorisches MUC2 nachgewiesen werden [281]. Zum anderen konnte MUC2 sowohl in
Becherzellen als auch in Zylinderepithelien nachgewiesen werden.
MUC3 wurde sowohl im supra- und perinukleären Zytoplasma der Becherzellen als auch in
den absorbierenden Enterozyten detektiert. MUC3 ist eher in den oberflächlichen Epithelien
als in der Kryptenbasis vorhanden [55, 66, 136, 273]. Mit Hilfe der In situ Hybridisierung
ließen sich im Kolon jedoch nicht nur Muzine vom intestinalen (MUC2 und MUC3), sondern
auch vom Mamma- (MUC1) und Tracheobronchialtyp (MUC4, MUC5) nachweisen [17]. In
einer Studie wurde neben einer MUC1-, MUC2- und MUC3-mRNA-Expression auch eine
MUC4-mRNA-Expression in normalem Kolongewebe gefunden [204]. MUC4 wird sehr stark
in den Krypten des normalen Kolons exprimiert, wo die Färbung der Becherzellen am
40
Einleitung
auffälligsten war [55, 281]. Obwohl in normalem Kolongewebe MUC1-mRNA detektierbar
ist, haben die meisten Studien herausgefunden, dass normale intestinale Epithelzellen eine nur
schwache oder gar keine Reaktion mit monoklonalen Antikörpern gegen MUC1-PeptidEpitope zeigen [55, 108, 136, 195, 297]. Das MUC1-Protein scheint in normalem Kolongewebe durch die starke Glykosylierung maskiert zu sein. Andererseits haben einige Autoren
berichtet, dass sie mit ihren monoklonalen Antikörpern MUC1 in normalem Kolon
detektieren konnten [59, 63]. Durch Perjodat-Oxidation, durch die teilweise Kohlenhydrate
entfernt werden, konnte die MUC1-Reaktivität verstärkt werden [6, 59]. Das MUC1-Protein
wurde im Zytoplasma von Becher- und Zylinderzellen gefunden. Am stärksten wurde das
MUC1-Apomuzin auf der apikalen Membranoberfläche vor allem in der Kryptenbasis
exprimiert [6, 37, 281]. Obwohl das MUC5B nur sehr gering in normalem Kolongewebe
exprimiert wird [55], konnte in einer Studie eine MUC5B- und MUC2-Koexpression in
Becherzellen nachgewiesen werden [267]. MUC5B zeigte eine Reaktivität vor allem in der
Kryptenbasis. MUC5AC und MUC6 wurden nur schwach oder überhaupt nicht in der
Mukosa des normalen Kolonepithels nachgewiesen [31, 55]. MUC11, MUC12, MUC13 und
MUC17 wurden ebenfalls in normalem Kolongewebe detektiert [55, 278].
1.2.4.1.2 Kohlenhydratantigene
Die Synthese der Oligosaccharidketten erfolgt durch die gewebe- und substratspezifischen
Glykosyltransferasen, die für ein organspezifisches Verteilungsmuster verantwortlich sind.
Sie haben teilweise überlappende Akzeptorspezifitäten. So kann zum Beispiel die α1-2Fukosylierung peripherer Antigene von H- oder von Sekretor (Se) gencodierten Transferasen
bewirkt werden. Die Sekretoreigenschaft beinhaltet die Fähigkeit zur Sekretion von ABHBlutgruppen mit dem Mukus. Diese Konstellation weisen etwa 75% der Europäer auf. Da die
Glykosyltransferasen jedoch nicht gleichermaßen in allen Anteilen gastrointestinaler Organe
aktiv sind, ergeben sich vom Gentyp abhängige, regional unterschiedliche Muster der Kohlenhydratexpression [23]. Es wurden viele spezifische Antikörper generiert, die gegen bestimmte
Kohlenhydratantigene gerichtet sind. Ein Problem des Nachweises der Kohlenhydratantigene
in normalem Kolongewebe ist die O-azetylierte Neuraminsäure, die viele Antigene maskiert.
Im Kolon steht der proximale Organabschnitt bis zur Flexura sinistra unter der Kontrolle des
Sekretor-Gens. Hier findet man daher eine starke Immunreaktivität von H-Typ-2 und Le y . Im
adulten distalen Kolon findet eine α1-2-Fukosylierung und somit eine Expression von ABHund Le b -/ Le y -Antigenen nicht mehr statt [30, 277, 292]. Das Le a -Antigen wird von
Individuen, die das Lewis-Gen nicht exprimieren, im Kolon nicht synthetisiert [91]. Le x ist
im gesamten Kolon schwach nachweisbar. Es wird vor allem im apikalen Zytoplasma von
Einleitung
Zylinderzellen an der Kryptenbasis exprimiert, während man
41
Le y in der Glykokalix
beobachten kann [6]. Während Sialyl- Le x und Sialyl- Le a im normalen Kolongewebe nicht
oder nur schwach nachweisbar sind, konnte nach De-O-Azetylierung eine starke Expression
beobachtet werden [203, 296]. Dies zeigt, dass sie in normalem Kolongewebe exprimiert
werden, aber durch O-azetylierte Neuraminsäurereste maskiert vorliegen.
Kohlenhydratantigene der inneren Kernregion, sogenannte Kryptantigene wie das Tn-, das
TF-Antigen und ihre sialylierten Formen, konnten bisher in normalen Kolongewebe nicht
oder nur gering mit Hilfe monoklonaler Antikörper nachgewiesen werden, da sie in der Regel
maskiert vorliegen [80]. Allerdings konnte nach Esterspaltung der O-azetylierten
Neuraminsäure Sialyl-Tn oder Tn in Becherzellen detektiert werden [205, 241]. Dagegen war
jedoch eine Bindung des Dolichos-biflorus-Agglutinins DBA an GalNAcα-Reste, die in Tnund A-Blutgruppenantigenen vorkommen und des Peanut-Agglutinins (PNA) zu beobachten
[148, 294].
Für die Expression des Thomsen-Friedenreich-Antigens (TF-Antigen) in normalem Kolongewebe findet man sehr widersprüchliche Daten. In einigen Studien konnte das TF-Antigen
mit PNA in Becherzellen und Zylinderepithelien nachgewiesen werden [58, 72, 294],
während in anderen Untersuchungen nur eine geringe oder gar keine Färbung zu beobachten
war [43, 164]. Mit spezifischen monoklonalen Antikörpern konnte das TF-Antigen nur
schwach oder gar nicht detektiert werden [61, 148, 205, 294]. Durch Entfernung der
Neuraminsäure- und Fukosereste gelang der Nachweis des TF-Antigens, was ein Hinweis
darauf ist, dass es in normalem Kolongewebe maskiert vorliegt [25, 57].
1.2.4.2
Expression von Muzinantigenen in kolorektalen Adenomen und Karzinomen
Im Rahmen der Karzinogenese konnte bisher in vielen Organen eine Reihe charakteristischer
Veränderungen der Antigeneigenschaften von Muzinen beschrieben werden.
So steigt bei einigen Muzinen die Expression stark an, während bei anderen Muzinen eine
verminderte Expression zu beobachten ist. Eine gestörte Glykosylierung führt zu kurzen
verzweigten Ketten und zur Synthese von neuen Zuckern. Beschrieben wurde dies für
Tumoren der Brust, des Endometriums, der Ovarien, des Pharynx und Larynx, der Lunge, des
Magens, der Leber, der Gallenblase, des Pankreas und des Dünn- und Dickdarms. Die
spezifische O-Glykosylierung macht Muzine zu sensitiven Indikatoren von differenzierungsabhängigen Veränderungen in der zellulären Glykosylierung [7, 281]. In den letzten Jahren
gewannen die Kohlenhydrate als prognostische Marker vieler menschlicher Karzinome an
klinischem Interesse. Neben den Kohlenhydrat-Core-Antigenen und den peripheren
42
Einleitung
Oligosaccharid-Antigenen könnten auch die Peptid-Core-Antigene prognostische Relevanz
besitzen.
1.2.4.2.1 Peptid-Core-Antigene
Antigene des Muzinpeptid-Cores sind infolge ihrer starken Glykosylierung in Normalgeweben oft maskiert und durch Antikörper nicht oder nur schwach nachweisbar. In kolorektalen Karzinomen wird der MUC1-Peptid-Core stark exprimiert [136]. In gastrointestinalen Karzinomen konnte man neben den intestinalen MUC2- und MUC3-Epitopen
auch das mammatypische MUC1 detektieren [13, 297]. Im Gegensatz zu normalem Kolongewebe ist MUC1 in Adenokarzinomen und Adenomen weniger glykosyliert und daher
immunhistochemisch besser zu detektieren [55]. Vor allem in fortgeschrittenen Tumorstadien
und in metastasierenden Karzinomen wurde eine starke Expression von MUC1 beobachtet
[184, 195]. In Adenokarzinomen kann die Überexpression von MUC1 bis auf das 10-fache
gesteigert sein. Eine starke Immunreaktivität zeigen vor allem tubuläre und papilläre
Tumoren. Muzinöse Karzinome exprimieren MUC1 demgegenüber gar nicht oder nur
schwach [25, 37]. MUC1 konnte auch in Adenomen, vor allem mit schwerer intraepithelialer
Neoplasie, detektiert werden. Es scheint, dass die MUC1-Expression mit zunehmenden Grad
der intraepithelialen Neoplasie ansteigt. Eine MUC1-Immunreaktivität korrelierte mit einer
p53-Expression und mit einem hohen Apoptoseindex in intramukosalen Karzinomen [250].
Demgegenüber zeigen das MUC2- und das MUC3-Peptid mit zunehmendem Grad der intraepithelialen Neoplasie in Adenomen eine Abnahme der Expression. In kolorektalen Adenokarzinomen findet man eine Abnahme der MUC2-Expression, obwohl muzinöse Karzinome
MUC2-positiv sind [6, 37, 55, 136, 184]. Für MUC3 wurde sowohl eine Abnahme als auch
eine Zunahme der Immunreaktivität in kolorektalen Karzinomen gefunden [136, 204].
Inzwischen weiß man, dass es ein MUC3A und ein MUC3B gibt, was in diesen Studien nicht
beachtet wurde [55]. Zusammenfassend ist MUC1 ein Marker der späten Stadien der
Adenom-Karzinom-Sequenz, während MUC2, MUC3 und MUC5A Marker der frühen
Stadien sind [21].
Es gibt einige Studien über die MUC4-Expression in kolorektalen Karzinomen. Einerseits
wurde für MUC4-mRNA in kolorektalen Karzinomen ein Anstieg im Vergleich zu Normalgewebe beobachtet, andererseits eine Abnahme [204]. Es ist dennoch ungewiss, ob eine
MUC4-Expression in Beziehung zur Progression des kolorektalen Karzinoms steht.
MUC5AC, das in normalem Kolon nicht detektierbar ist, wird in kolorektalen Adenomen und
Karzinomen oft de novo exprimiert. Kolorektale Karzinome mit einer hohen Mikrosatelliteninstabilität zeigten in einer Studie eine höhere Positivität für MUC2 und MUC5AC als Mikro-
Einleitung
43
satellitenstabile Tumoren [37]. Für MUC6 gibt es widersprüchliche Ergebnisse. In einer
Studie konnte MUC6 in kolorektale Karzinomen nicht detektiert werden [245], während eine
andere Studie MUC6 in Adenomen immunhistochemisch darstellen konnte [31]. Für die
Expression von MUC11 und MUC12 wurde in kolorektalen Karzinomen eine Downregulation im Vergleich zu Normalgewebe beobachtet [278].
1.2.4.2.2 Kohlenhydrat-Core-Antigene
Während in normalem Kolongewebe hauptsächlich Core 3-Srukturen vorhanden sind, findet
man in kolorektalen Karzinomen hauptsächlich die Kohlenhydratstrukturen Core 1, Core 2
und Core 4. Core 3 ist nicht mehr vorhanden. Dies ist auf eine veränderte Aktivität einiger
Glykosyltransferasen zurückzuführen [289].
Die sogenannten Kryptantigene sind Strukturen der inneren Kernregion, wie zum Beispiel das
TF- und das Tn-Antigen, die im Normalgewebe in der Regel maskiert sind.
Untersuchungen der Enzymaktivität der für die Synthese der Kryptantigene verantwortlichen
Glykosyltransferasen zeigten eine höhere Aktivität der α6-Sialyl-Transferase in muzinreichen,
der β3-Gal-Transferase in muzinärmeren Karzinomen. Dabei korrelierte die Höhe der Enzymaktivität nicht mit Tumorlokalisation, Stadium oder histologischem Typ. Daher scheint die
fehlende Expression von Sialyl-Tn, TF und Tn in Normalgeweben nicht auf mangelnde
Synthese, sondern auf Antigenmaskierung zu beruhen [23, 80].
In kolorektalen Karzinomen kommt es zu einem deutlichen Anstieg der Expression der drei
Core-Strukturen Tn-Antigen, TF-Antigen und Sialyl-Tn-Antigen.
Das TF-Antigen repräsentiert das am umfangreichsten erforschte Kohlenhydratantigen in
kolorektalen Neoplasien. Sowohl mit PNA, als auch mit spezifischen poly- und monoklonalen
Antikörpern konnte in kolorektalen Karzinomen eine starke Färbung erreicht werden [25, 43,
117, 148, 164, 294]. In kolorektalen Adenomen korrelierte die Reaktivität mit Zunahme der
Polypengröße, dem histologischen Typ und dem Grad der intraepithelialen Neoplasie [25, 62,
294]. Die TF-Positivität war in Lebermetastasen stärker als in primären kolorektalen
Karzinomen [61]. Für das Tn-Antigen konnte keine signifikante Veränderung in den
verschiedenen Dysplasiegraden von Adenomen beobachtet werden [62, 146]. In kolorektalen
Karzinomen zeigte sich jedoch eine starke Tn-Expression [148, 205]. Da Tn das obligate
Zwischenprodukt für die Synthese aller Muzin-Oligosaccharide ist, deutet seine Detektierbarkeit in kolorektalen Karzinomen eine Abnahme der weiteren Glykosylierung an, die Tn im
normalen Kolon maskiert.
Das Sialyl-Tn-Antigen war in kolorektalen Adenomen und Karzinomen sehr reaktiv. Seine
Expression korrelierte mit dem Grad der intraepithelialen Neoplasie, der Polypengröße und
44
Einleitung
dem histologischen Typ [62, 146, 241, 282]. Diese Core-Struktur wird vor allem in
metastasierten kolorektalen Karzinomen stark exprimiert und stellt einen unabhängigen Wert
für eine schlechte Prognose dar [48, 145].
1.2.4.2.3 Kohlenhydratantigene der Backbone- und peripheren Region
Die Typ2-Kette der Backbone-Region Galβ1-4GlcNAc zeigte, detektiert mit ErythrinaLektin, eine schwache Reaktivität in weniger als 50% der hyperplastischen Polypen und
Adenome. Hingegen waren Primärtumoren und Lebermetastasen stark positiv [24]. Das nichtfukosylierte Blutgruppen-i-Antigen wurde in etwa 65% der Karzinome beobachtet [187]. Die
Immunreaktivität von fukosylierten Antigenen, die Typ2-Ketten-abhängig sind, war in kolorektalen Adenokarzinomen generell erhöht. Ihre Bildung ist Folge einer verstärkten Synthese
von Typ 2-Ketten. Das Le x -Antigen wurde von etwa 85 bis 95% der Karzinome unabhängig
vom Sekretorstatus im proximalen und distalen Kolon exprimiert [147-148], während das
difukosylierte Le y -Antigen, normalerweise nur im rechten Darmabschnitt vorkommend, eine
stärkere Reaktivität in Karzinomen des distalen Kolon zeigte [30, 51]. Das Le y -Antigen
findet man in 91% der Karzinome des distalen Kolons, aber nur in 43% der Karzinome des
Zäkums [30]. Hierbei handelt es sich um eine ektope Antigenexpression, da das distale Kolon
auch beim Fetus kein Le y exprimiert. Die ABH-Blutgruppenantigene weisen eine Reihe von
möglichen Tumor-assoziierten Veränderungen auf. So sind in einigen Tumoren auftretende
ABH-Blutgruppenantigene inkompatibel zu der Blutgruppe des Patienten, die im Normalgewebe, zum Beispiel im proximalen Kolon exprimiert wird [73, 82-83, 295]. Dies könnte
eine Immunantwort auslösen. Eine andere typische Veränderung ist die Neoexpression von
Blutgruppenantigenen. Normalerweise weist das distale Kolon keine Aktivität der Fukosyltransferase auf. In Karzinomen des distalen Kolons kommt es jedoch oft zu einer onkofetalen
Synthese von ABH-Antigenen und der α1-2-fukosylierter Strukturen Le b und Le y [30, 91,
295]. Auch kann es zu einem Verlust der ABH-Blutgruppenantigene kommen. Selten kommt
es zu einem kompletten Verlust dieser Antigene, in 75% ist der Verlust fokal begrenzt [156,
295]. Dies wurde vor allem für Karzinome des proximalen Kolon beschrieben. In kolorektalen Adenomen nimmt die Expression der ABH-Antigene mit dem Grad der intraepithelialen Neoplasie zu.
Ein weiterer typischer Mechanismus der Modifikation Muzin-assoziierter Antigene ist die
angestiegene Expression von sialylierten Lewis-Antigenen. Sialyl- Le x zeigt eine Expression
in „low-grade“-Adenomen und in „high-grade“-Adenomen [123]. Mit Zunahme des Grades
der intraepithelialen Neoplasie nimmt auch die Expression zu [147]. Sialyl- Le a wird in kolo-
Einleitung
45
rektalen Karzinomen ebenfalls exprimiert, vor allem in Lymphknotenmetastasen [16, 196].
Der Anstieg der Immunreaktivität von Sialyl- Le x und Sialyl- Le a in Karzinomen und
Metastasen lässt sich durch eine reduzierte O-Azetylierung der Neuraminsäure erklären. Der
graduelle Verlust der O-Azetylierung wurde als ein frühes Ereignis in der AdenomKarzinom-Sequenz beobachtet [75].
46
Einleitung
1.3 Fragestellung der Arbeit
Das kolorektale Karzinom steht weltweit an dritter Stelle aller Tumorneuerkrankungen und ist
die dritthäufigste Krebstodesursache in den westlichen Ländern. Die meisten kolorektalen
Karzinome entwickeln sich über die Adenom-Karzinom-Sequenz. Daher ist es für die
onkologisch-pathologische Forschung von besonderer Bedeutung, objektive Parameter zu
finden, die eine Aussage über Diagnose, Tumorprogression, Prognose und Therapie
bestimmter
Patientengruppen
möglich
machen.
Neben
Tumorsuppressorgenen
und
Onkogenen stellen die Muzine dabei einen interessanten Bereich in der Tumorforschung dar.
Muzine sind wichtige Marker der gastrointestinalen Karzinogenese. Viele Studien haben sich
bereits mit der Bedeutung von MUC1 im Rahmen der malignen Transformation und der
Metastasierung beschäftigt. Die Ergebnisse von MUC1 als Prognoseparameter werden
teilweise widersprüchlich diskutiert.
Bisherige Ergebnisse belegen, dass MUC1 einen Marker für Progression und Prognose kolorektaler Karzinome darstellt. Unklar bleibt jedoch bisher, in welchem Maße eine Änderung
der Glykosylierung des MUC1-Peptids zu diesem Effekt beiträgt. In dieser Arbeit soll daher
die Immunreaktivität von nativen und deglykosylierten MUC1-Protein verglichen werden.
Dazu wurden Serienschnitte von kolorektalen Adenomen und Karzinomen mit MUC1spezifischen monoklonalen Antikörpern unterschiedlicher Epitop-Spezifität nach der
Streptavidin-Biotin-Peroxidase-Methode immunhistochemisch gefärbt. Die Antikörper waren
teils glykosylierungsabhängig, teils –unabhängig.
Als weitere Kontrollen zur Charakterisierung der Glykosylierungsabhängigkeit der Immunreaktivität von MUC1 wurden chemische und enzymatische Methoden der Deglykosylierung
durchgeführt. Hierzu wurde zum einen die Perjodat-Oxidation, zum anderen Neuraminidase
aus Clostridium perfringens verwendet. Des Weiteren wurde die Immunreaktivität von MUC1
in Adenomen mit leichtgradiger intraepithelialer Neoplasie, Adenomen mit hochgradiger
intraepithelialer Neoplasie und Karzinomen verglichen.
Material und Methoden
47
2 Material und Methoden
___________________________________________________________________________
2.1 Patienten und Gewebe
Das in dieser Arbeit verwendete Kollektiv setzt sich aus zwanzig Patientengeweben
zusammen. Es handelt sich dabei um zehn Resektate von Patienten mit einem kolorektalen
Karzinom und zehn Resektate von Patienten mit einem kolorektalen Adenom. Von den
Adenomen wiesen fünf eine leichte intraepitheliale Neoplasie und fünf eine schwere intraepitheliale Neoplasie auf. Die Gewebe wurden in den Jahren von 1987-2003 reseziert und
dem Zentrum für Pathologie der Universität zu Köln (Direktor: Universitätsprofessor H. P.
Dienes) zur histopathologischen Untersuchung zugesandt. Hier wurden die Resektate
zugeschnitten, zur Konservierung in 5%igem Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Zur
histologischen Untersuchung und Klassifizierung erfolgte an Schnitten dieser Paraffinblöcke
eine Hämatoxylin-Eosin-Färbung.
Von jedem Paraffinblock wurden mit dem Mikrotom mehrere 5 µm dicke Gewebeschnitte
angefertigt, die dann auf Superfrost Plus Objektträger aufgezogen und mit verschiedenen
monoklonalen Antikörpern gegen MUC 1 nach der Labeled-Streptavidin-Biotin-Methode
angefärbt wurden.
2.2 MUC1-spezifische monoklonale Antikörper
In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene MUC1-spezifische Antikörper verwendet,
die gegen unterschiedliche Epitope des MUC1-Muzins gerichtet sind.
2.2.1
HMFG2
HMFG2 ist ein monoklonaler Antikörper der Maus vom Isotyp IgG1-k. Er reagiert mit
Komponenten des Human Milk Fat Globulin und bindet an die Aminosäuresequenz DTR
innerhalb der VNTR des MUC1-Peptid-Cores. Das Epitop detektiert einen glykosylierungsabhängigen Teil des MUC1-Peptid-Cores (DTR) [26, 36, 251].
48
2.2.2
Material und Methoden
BCP8 (#133)
BCP8 ist ein monoklonaler Antikörper der Maus vom Isotyp IgG2b und definiert ebenfalls
das Epitop PDTRPA auf dem MUC1-Repeat-Peptid (Epitop-Cluster: VNTR (DTR).
2.2.3
115D8 (#148)
115D8 ist ein monoklonaler Antikörper der Maus vom Isotyp IgG2b-k. Er ist gegen ein
Glykopeptid-Epitop gerichtet und ist abhängig von Neuraminsäure (Epitop-Cluster: sialylVNTR/Non-VNTR) [189, 218].
2.2.4
MA695 (#154)
Ma695 ist ein monoklonaler Antikörper der Maus vom Isotyp IgG1 und reagiert ebenfalls mit
einem sialylierten Kohlenhydrat-Epitop auf MUC1-Repeat-Peptiden (Epitop-Cluster: sialylVNTR/Non-VNTR) [199, 218].
2.3 Immunhistochemische Methode
2.3.1
2.3.1.1
Ablauf der Färbung
Allgemeines über die Labeled-Streptavidin-Biotin-Methode (LSAB-Methode)
Das Grundprinzip der immunhistochemischen Methoden beruht auf dem Einsatz von Antikörpern zur Markierung der korrespondierenden Antigene in Geweben. Die Antigenbindungsstelle kann durch Enzym-Kopplung mit farbgebender Reaktion sichtbar gemacht werden
(Abbildung 2/1). Die LSAB-Methode macht sich die Affinität von Avidin/Streptavidin zu
Biotin zunutze. Avidin ist ein aus Hühnereiweiß gewonnenes Glykoprotein mit einem
Molekulargewicht von 68 kDa, das vier Bindungsstellen für Biotin enthält. Das aus dem
Bakterium Streptomyces avidinii gentechnisch gewonnene Streptavidin hat gegenüber Avidin
den Vorteil, dass es zu weniger unspezifischen Reaktionen kommt.
An einen Brückenantikörper wird Biotin gekoppelt. In dieser Studie wurde ein monoklonaler
Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper verwendet. Biotin ist ein wasserlösliches Vitamin, über das
das Streptavidin an den Brückenantikörper gebunden werden kann [141]. Das Streptavidin ist
mit einem Enzym (Peroxidase oder alkalische Phosphatase) direkt gekoppelt. Der
biotinylierte Brückenantikörper bindet an das Fc-Fragment des Primärantikörpers und
markiert so das gesuchte Antigen. Durch die Bindung zwischen Streptavidin und dem Biotin
des Brückenantikörpers wird die Peroxidase an den Brückenantikörper gekoppelt. Die
Material und Methoden
49
Peroxidase fördert die Freisetzung von Radikalen durch Oxidation von H 2 O 2 , die an farblose
Diazoniumsalze (Chromogene) binden und unlösliche Azofarbstoffe bilden. In dieser Studie
wurde 3-Amino-9-Ethylcarbazol als Chromogen verwendet, das ein rotes Reaktionsprodukt
liefert. Der immunologische Nachweis mit dieser Methode ist sehr sensitiv und derzeit eines
der spezifischsten Verfahren. Es erlaubt den Nachweis auch weniger Antigen-Epitope [105].
Streptavidin-Enzymkonjugat
Brückenantikörper, biotinyliert
Primärantikörper
Antigen
Abbildung 2/1: Schema der LSAB-Methode mit Darstellung von Primärantikörper,
biotinyliertem Brückenantikörper und Streptavidin-Enzym-Komplex
2.3.1.2
Coverplate-Methode
Zur Durchführung der Immunmarkierung und anschließender Färbung der Gewebeschnitte
bis zur Entwicklung wurde das Coverplate-System der Firma Shandon zu Hilfe genommen.
Ein Coverplate ist ein aus Kunststoff bestehender Rahmen, der eine mit Kunstharz
beschichtete Fläche trägt. Dieser Fläche wurden die Objektträger feucht angelegt.
Anschließend wurden jeweils zehn Coverplates in einen Schlitten verankert. Der Kopfteil des
Coverplates bildet eine trichterförmige Öffnung mit dem Objektträger, in die man die
Reaktionslösungen pipettieren kann. Bei sorgfältigem und luftblasenfreiem Aufziehen
entsteht ein Flüssigkeitsfilm zwischen Objektträger und Coverplate, durch den eine
Oberflächenspannung aufgebaut wird. Dies gewährleistet eine gleichmäßige Passage der
Flüssigkeiten über den Schnitt.
Das Coverplate-System macht eine Standardisierung des Verfahrens möglich. Weitere
Vorteile sind die Benötigung minimaler Reagenzvolumina, sowie der physikalische Schutz
während des mehrstündigen Färbevorgangs.
50
2.3.1.3
Material und Methoden
Entparaffinierung
Vor der immunhistochemischen Färbung müssen die Gewebeschnitte entparaffiniert werden.
Das Einbettmedium muss vollständig aus dem Gewebeschnitt entfernt werden, um eine Farbreaktion des Gewebes zu ermöglichen und um unspezifische Hintergrundreaktionen zu
vermeiden. Dazu wurden die Objektträger für 10 Minuten in einen 80°C heißen Ofen gestellt,
so dass das Paraffin ablaufen konnte. Zur Hydrierung wurden die abgekühlten Präparate für
12 Minuten in Xylol gebadet. Anschließend wurde eine absteigende Alkoholreihe durchlaufen. Dabei blieben die Objektträger für jeweils 30 Sekunden zweimal in 100% Ethanol,
dann für je 30 Sekunden in 96% und in 75% Ethanol. Abschließend wurden die Objektträger
zuerst mit Leitungswasser und dann mit Aqua dest. gewaschen. Die Objektträger mussten
vollständig frei von Paraffin- und Alkoholschlieren sein.
2.3.1.4
Partielle Deglykosylierung durch Vorbehandlung mit Neuraminidase
In einem Färbedurchgang wurde eine Vorbehandlung mit dem Enzym Neuraminidase (Fa.
New England Bio Labs) durchgeführt. Dadurch werden sialinierte Bindungsstellen
demaskiert. Die Neuraminidase wurde im Verhältnis 1:5000 mit Zitratpuffer verdünnt. Von
dieser Mischung wurde auf jeden Objektträger 100 µl aufgetragen, dies entsprach 1 Unit des
Enzyms je Schnitt. Anschließend wurden die Präparate bei 37° C für 30 Minuten inkubiert.
Dabei war es wichtig, dass die Präparate nicht austrocknen. Abschließend wurde mit TBS
(tris buffered solution) gespült.
2.3.1.5
Partielle Deglykosylierung durch Vorbehandlung mit Perjodat
In einem weiteren Färbedurchgang wurde von jedem Fall des Kollektivs je ein Schnitt mit
Perjodat (Fa. Merck) vorbehandelt. Perjodat demaskiert verschiedene Muzingen-Produkte und
Glykoproteine, die O-glykosidische Bindungen enthalten, ohne Peptid-Epitope zu zerstören.
Nach der Deparaffinierung wurden die Schnitte für 1 Stunde im Dunkeln bei Raumtemperatur
mit 100 µl einer 10 mM Perjodatlösung inkubiert, die im Verhältnis 1:348 mit 0,05 M
Azetatpuffer (pH 4,5) verdünnt wurde. Danach wurden die Präparate mit TBS gewaschen.
Anschließend wurden saure reaktive Gruppen mit 100 µl 1%igen Glyzerols (1g Glyzin (Fa.
Merck) in 100 ml Aqua dest. aufgelöst) für 30 Minuten neutralisiert.
Material und Methoden
2.3.1.6
51
Ohne Vorbehandlung
In einem letzten Durchgang wurden die Schnitte mit der Streptavidin-Biotin-Methode gefärbt,
ohne eine Vorbehandlung zu erhalten.
2.3.1.7
Hemmung der endogenen Peroxidase
Bei der Streptavidin-Biotin-Methode spielen peroxidasekatalysierte Reaktionen eine große
Rolle. Um die unerwünschte Reaktion des Chromogens mit der endogenen Peroxidase und
damit eine unspezifische Hintergrundfärbung zu verhindern, ist es notwendig, die endogene
Peroxidase zu hemmen. Dazu wurde ein Peroxidaseblock aus 30%igem H 2 O 2 und Methanol
angesetzt, worin die Objektträger 30 Minuten inkubiert wurden. Daraufhin wurden die
Objektträger mit TBS gespült.
2.3.1.8
Hemmung unspezifischer Proteinbindungen
Um die unspezifischen Bindungsstellen des Primärantikörpers zu blockieren, wurden die
Objektträger mit je 200 µl Schweineserum (X 0901, Fa. DAKO), das mit Antikörperverdünnungspuffer (Fa. Zymed) 1:20 verdünnt wurde, beschickt und für 30 Minuten bei 40°C
inkubiert.
2.3.1.9
Die Immunmarkierung
Die Schnitte wurden mit jeweils 100 µl des entsprechenden Primärantikörpers, der mit Antikörperverdünnungspuffer in dem angegebenen Verhältnis verdünnt wurde (Tabelle 2/1),
beschickt. Das optimale Verdünnungsverhältnis, bei dem es zu einer intensivroten Färbung
der Zellen kam und gleichzeitig die unspezifischen Hintergrundreaktionen möglichst gering
waren, wurde durch Vorversuche ermittelt. Die Schnitte wurden bei 4°C über Nacht inkubiert.
In jedem Färbedurchgang wurden Gewebeschnitte eines Mammakarzinoms als Positivkontrolle zugefügt. Die Negativkontrolle wurde mit 100 µl TBS ohne Primärantikörper
beschickt.
Vor der Bindung an den Sekundärantikörper wurden die Objektträger mit TBS gespült.
52
Material und Methoden
Primärantikörper
Verdünnung
HMFG 2
1:100
BCP 8
1:100
115 D 8
1:20
MA 695
1:100
Tabelle 2/1: Verdünnung der Primärantikörper
2.3.1.10
Markierung mit dem Sekundärantikörper
Als Sekundärantikörper, der an den Primärantikörper bindet, wurde ein biotinylierter, monoklonaler Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper verwendet (E 0354, Fa. DAKO). Auf jeden
Schnitt wurden 100 µl des Antikörpers aufgetragen, der im Verhältnis 1:400 mit Antikörperverdünnungspuffer gemischt war. Dann wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert.
Anschließend wurden die Schnitte mit TBS gespült.
2.3.1.11
Kopplung des Meerrettichperoxidase-konjugierten Streptavidins
In diesem Schritt wurde auf die Schnitte das mit Meerrettichperoxidase konjugierte
Streptavidin
aufgetragen
(P
0397,
Fa.
DAKO).
Auch
hier
erwies
sich
ein
Verdünnungsverhältnis von 1:400 als optimal. Für jeden Schnitt wurden 100µl verwendet.
Anschließend wurde wiederum bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert und danach mit
TBS gespült. Dabei wurden die Objektträger aus den Coverplates in Küvetten mit TBS
umgesetzt.
2.3.1.12
Entwicklung
Der Entwicklerlösung wurde H 2 O 2 als Substrat der Peroxidase und AEC (3-Amino-9-ethylcarbazol) als notwendiges Chromogen zugesetzt. AEC färbt sich bei entsprechender Bindung
rot. Die fertige Entwicklerlösung wurde in die Küvetten gegeben. Die optimale Entwicklungszeit, die unter mikroskopischer Kontrolle ermittelt wurde, war für alle verwendeten Antikörper 30 Minuten. Der Vorgang war abgeschlossen, wenn sich sie Zellen lichtmikroskopisch
in intensivroter Farbe präsentierten. Durch Einbringen der Objektträger in H 2 O wurde die
Farbreaktion gestoppt. Anschließend folgte eine Zellkerngegenfärbung mit Meyers Hämalaun
(Fa. Merck) und die Eindeckung der Präparate mit Kaisers
Glyceringelatine (Fa. Merck).
Material und Methoden
2.3.2
2.3.2.1

53
Rezepte
Zitratpuffer
0,52 g Zitronensäure-Monohydrat (Fa. Merck)
Diese Komponente wird mit 50 ml Aqua dest. gemischt und mit NAOH auf einen pH von 6
titriert.
2.3.2.2

Azetatpuffer
1 ml Essigsäure, 99,7% (Fa. Merck)
Diese mit 347 ml Aqua dest. mischen, dann mit NAOH auf einen pH von 4,5 titrieren.
2.3.2.3
Peroxidase-Blocker

50 ml Methanol, > 99% Methylalkohol (Fa. Roth)

1,5 ml H 2 O 2 , 30% (Fa. Roth)
Beide Komponenten werden zusammengegeben und abgedeckt gut gemischt.
2.3.2.4
TBS-Puffer (tris buffer solution)

84 g NaCl (Fa. Merck)

12 g Trishydroxymethylammoniummethan (Fa. Sigma)

10 l Aqua dest.
Einstellen des pH mit 25% HCL (Fa. Merck)auf 7,4
2.3.2.5
Entwicklerlösung
2.3.2.5.1 Lösung I

0,05 ml H 2 O 2 , 30% (Fa. Merck)

5 ml Dimethylformamid (Fa. Merck)

1 Tablette AEC (3-Amino-9-ethyl-carbazol) (Fa. Sigma)
2.3.2.5.2 Lösung II

7,4 ml Lösung A: 30 ml 96%-98%ige Essigsäure ad 1000 ml Aqua dest.

17,6 ml Lösung B: 16,4 g Natriumacetat-Trihydrat ad 1000 ml Aqua dest.
54
Material und Methoden
Lösung A und B mit Bidest auf 100 ml auffüllen und mit HCl/NaOH (beide 1 Mol/l) auf
einen pH von 5 einstellen. Lösung I und II erst kurz vor Gebrauch vermischen.
2.3.2.6
Hämalaun

5 g Hämatoxylin (Fa. Merck)

1 g Natriumtrijodid (Fa. Merck)

250 g Aluminiumkaliumsulfat (Fa. Merck)

250 g Chloralhydrat (Fa. Merck)

5 g Zitronensäure (Fa. Merck)
Lösung in 5 l Aqua dest. und Reifung für 3 Wochen
2.3.3
Lichtmikroskopische Auswertung
Für die Auswertung der Färbung wurden die Präparate lichtmikroskopisch untersucht und
semiquantitativ beurteilt. Zuerst wurden die Präparate in Lupenvergrößerung betrachtet, um
einen Eindruck über die Menge und die Verteilung der immun markierten Zellen zu erhalten.
Dann wurden sie mäanderförmig mit 250- bzw. 400-facher Vergrößerung durchstreift. Es
wurde der prozentuale Anteil der positiv markierten Adenom- bzw. Tumorzellen am
Gesamtanteil aller Adenom- bzw. Tumorzellen bestimmt. Außerdem wurden die Präparate
nach der Intensität der Färbung eingeteilt in die Stufen negativ (0), gering (1), mäßig (2) und
stark (3). Eine geringe Intensität war als eine schwach rosa Zellfärbung definiert, während
eine sehr rote Färbung der Stufe 3 (stark) zugeteilt wurde.
Ergebnisse
55
3 Ergebnisse
___________________________________________________________________________
In der vorliegenden Arbeit wurden Serienschnitte von fünf „low-grade“-Adenomen, fünf
„high-grade“-Adenomen und zehn kolorektalen Karzinomen mit vier verschiedenen monoklonalen MUC1-Antikörpern jeweils unterschiedlicher Epitop-Spezifität nach der LabeledStreptavidin-Biotin-Methode gefärbt. Die Antikörper HMFG2 und BCP8 binden an die
immundominante Aminosäuresequenz DTR innerhalb der VNTR-Region des MUC1-PeptidCores. Die Epitope von MA695 und 115D8 sind bisher nicht genau bekannt. Man weiß
jedoch, dass es sich um Glykopeptid-Epitope innerhalb der VNTR-Region handelt. 115D8
und MA695 sind gegen Sialidase-sensitive Epitope gerichtet.
Als weitere Kontrollen zur Charakterisierung der Glykosylierungsabhängigkeit der Immunreaktivität von MUC1 wurden an den gleichen Gewebeschnitten eine chemische und eine
enzymatische partielle Deglykosylierung durchgeführt. Für die chemische Deglykosylierung
wurde die Perjodat-Oxidation verwendet. Hierbei werden Verbindungen zwischen
Kohlenstoff- und Hydroxylgruppen gespalten, ohne dass die Peptid-Epitope zerstört werden.
Die enzymatische Deglykosylierung wurde mit Neuraminidase, einem Enzym, das aus dem
Bakterium Clostridium perfringens geklont wurde, durchgeführt. Dieses Enzym katalysiert
die Hydrolyse von N-Azetyl-Neuraminsäureresten von Glykoproteinen.
Die Farbkomplexablagerungen wurden lichtmikroskopisch semiquantitativ ausgewertet. Der
Anteil des Adenom- bzw. Tumorgewebes, der mit dem jeweiligen Antikörper eine positive
Reaktion aufwies, wurde in Prozent des Gesamtadenomgewebes bzw. Gesamttumorgewebes
angegeben. Die Intensität der Färbung wurde in die Stufen negativ (0), gering (1), mäßig (2)
und stark (3) eingeteilt. Eine Farbintensität wurde als gering eingestuft, wenn die Zellen leicht
rosa angefärbt waren. Eine starke Intensität wurde als intensiv roter Zellinhalt definiert.
Zum Vergleich der Daten wurden die Mittelwerte mit Standardabweichung, sowie die
Mediane mit dem Quartilsabstand berechnet. Zusätzlich wurden zur statistischen Auswertung
die nicht-parametrischen Testverfahren nach Wilcoxon (Rangtest für Paardifferenzen) und
Mann-Whitney-U angewendet. Sie setzen keine Normalverteilung der Daten voraus. Der
Grenzwert des Signifikanz-Niveaus wurde mit p<0,05 so gewählt, dass die Irrtumswahrscheinlichkeit unter 5% liegt.
56
Ergebnisse
Immunhistochemische Expressionsmuster
Abbildung 3/1: Adenokarzinom des
Dickdarms, Antikörper BCP8 ohne
Vorbehandlung, x200
Abbildung 3/2: Adenokarzinom des
Dickdarms, Antikörper BCP8 nach
Perjodatbehandlung, x200
Abbildung 3/3: Adenokarzinom des
Dickdarms, Antikörper 115D8 ohne
Vorbehandlung, x200
Abbildung 3/4: Adenokarzinom des
Dickdarms, Antikörper 115D8 nach
Neuraminidasebehandlung, x200
Ergebnisse
57
3.1 Immunreaktivität MUC1-spezifischer monoklonaler Antikörper in kolorektalen Adenomen vor und nach partieller
Deglykosylierung
Insgesamt ließ sich mit den vier verwendeten monoklonalen MUC1-Antikörpern bei den
untersuchten kolorektalen Adenomen, von denen fünf eine geringe intraepitheliale Neoplasie
und fünf eine hochgradige intraepitheliale Neoplasie aufwiesen, eine durchgehend positive
Immunreaktion erzielen. Lediglich der Antikörper MA695 reagierte gering bis gar nicht mit
den Geweben. Es waren durchschnittlich 7,7% der Adenomzellen angefärbt.
Mit dem Antikörper 115D8 zeigten die Adenomgewebe die stärkste Reaktion. Es wurden
durchschnittlich 71% der Adenomzellen angefärbt mit einer durchgehend starken Farbreaktion. Die Antikörper HMFG2 und BCP8, die das gleiche Epitop DTR innerhalb der
VNTR-Region von MUC1 erkennen, zeigten mit durchschnittlich 37% bzw. 36% positives
Adenomgewebe ein ähnliches Ergebnis bezüglich Quantität und Intensität der Farbreaktion.
Nach partieller Deglykosylierung der „low-grade“-Adenomgewebe mit dem Enzym
Neuraminidase nahm die Immunreaktivität von MUC1 bei den verwendeten Antikörpern ab.
MA695 zeigte als einziger Antikörper eine Zunahme der positiven Zellen. Bei den „highgrade“-Adenomen kam es mit den Antikörpern HMFG2, BCP8 und MA695 zu einem Anstieg
der MUC1-Immunreaktivität, bei dem Antikörper 115D8 zu einer Abnahme. Mit der
Perjodat-Oxidation konnte ein starker Einfluss auf die Immunreaktivität beobachtet werden.
Mit den Antikörpern HMFG2 und BCP8 kam es zu einer starken Zunahme der Immunreaktivität. Der Antikörper 115D8 detektierte weniger MUC1 nach der Vorbehandlung. Eine
Ausnahme bildete der Antikörper MA695. Bei den „low-grade“-Adenomen kam es zu einer
starken Abnahme der Reaktion mit dem Gewebe, bei den „high-grade“-Adenomen zu einer
Zunahme.
Statistisch konnte kein signifikanter Unterschied zwischen der Immunreaktivität von MUC1
mit den verwendeten Antikörper in den Adenomen mit leichter intraepithelialer Neoplasie
und in den Adenomen mit schwerer intraepithelialer Neoplasie beobachtet werden.
58
Ergebnisse
90
80
70
60
Ohne Vorbehandlung
50
Nach NeuraminidaseBehandlung
40
30
Nach PerjodatOxidation
20
10
0
HMFG2 BCP8
115D8 MA695
Abbildung 3/5: Häufigkeitsverteilung (Mittelwerte) der Antikörper bei den „low-grade“Adenomen
90
80
70
60
Ohne Vorbehandlung
50
Nach NeuraminidaseBehandlung
40
30
Nach PerjodatOxidation
20
10
0
HMFG2 BCP8
115D8 MA695
Abbildung 3/6: Häufigkeitsverteilung (Mittelwerte) der Antikörper bei den „high-grade“Adenomen
Ergebnisse
3.1.1
59
HMFG2
Die Ergebnisse der Immunreaktivität von HMFG2 in den Adenomgeweben sind in den
Tabellen 3/1 bis 3/3 zu sehen. Dieser Antikörper zeigte eine durchgehend positive Gewebsreaktion, sowohl in den „low-grade“-Adenomen, als auch in den „high-grade“-Adenomen.
Der Anteil des MUC1-markierten Gewebes variierte stark von 5% bis 90%. Bei den „lowgrade“-Adenomen konnten im Durchschnitt 39% (STABW 35,07%) des Gewebes angefärbt
werden, bei den „high-grade“-Adenomen 35% (STABW 29,15%). Die Intensität der Färbung
fiel - bis auf einen gering gefärbten Fall - mäßig aus.
Nach Vorbehandlung der Adenomgewebe mit Neuraminidase nahm der Anteil des MUC1markierten Gewebes der „low-grade“-Adenome in zwei Gewebeschnitten zu, in zwei anderen
gab es keinen Unterschied zu den unbehandelten Schnitte. Ein Fall zeigte nach partieller
Deglykosylierung mit Neuraminidase einen starken Abfall der Immunreaktivität von 90% auf
10%. Im Mittel wurden 26% (STABW 20,74%) des Adenomgewebes angefärbt. Bei den
„high-grade“-Adenomen kam es in drei Fällen zu einem Anstieg der immunmarkierten
Zellen. In zwei Fällen gab es keinen Unterschied. Im Mittel reagierten nach NeuraminidaseBehandlung 40% (STABW 28,88%) des Adenomgewebes mit dem Antikörper HMFG2. Die
Intensität der Färbung bei den Adenomgeweben war mäßig bis stark, dass heißt im Vergleich
zu den unbehandelten Fällen nahm die Intensität in vier Fällen um eine Stufe zu.
Nach Vorbehandlung der Adenomgewebe mit Perjodat-Oxidation kam es in den Adenomgeweben zu einer deutlichen Zunahme der MUC1-Immunreaktivität mit HMFG2. Lediglich
in einem Fall der „low-grade“-Adenome nahm der Anteil des reagierenden Gewebes von 90%
auf 70% ab. Im Mittel reagierten 62% (STABW 19,24%) der Adenomzellen mit leichter
intraepithelialer Neoplasie und 68% (STABW 21,68%) der Adenomzellen mit starker intraepithelialer Neoplasie mit HMFG2. In fünf Gewebeschnitten kam es zu einer Zunahme der
Farbintensität.
Nach dem nicht-parametrischen Testverfahren nach Wilcoxon gab es einen statistisch
signifikanten Unterschied zwischen dem Ergebnis der Adenome ohne Vorbehandlung und
dem nach Perjodat-Oxidation, während der Unterschied nach Neuraminidase-Behandlung
nicht signifikant war. Es gab nach dem Mann-Whitney-U-Test keinen signifikanten
Unterschied zwischen den Adenomen mit leichter und schwerer Dysplasie.
60
Ergebnisse
„low-grade“-Adenome „high-grade“-Adenome
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
Ohne Vorbehandlung
60
20
5
90
20
5
10
30
70
60
Farbintensität
2
2
1
2
2
2
2
2
2
2
Nach Neuraminidase-Behandlung 60
20
10
10
30
10
20
30
70
70
Farbintensität
2
3
2
3
2
2
2
2
2
3
Nach Perjodat-Oxidation
80
30
70
70
60
80
40
50
80
90
Farbintensität
2
3
2
2
3
3
2
2
2
3
Tabelle 3/1: MUC1-Immunreaktivität und Farbintensität mit dem Antikörper HMFG2 in den
Adenomgeweben
Ohne
Vorbehandlung
Nach NeuraminidaseBehandlung
Nach PerjodatOxidation
Mittelwert
39
26
62
STABW
35,07
20,74
19,24
Median
20
20
70
25%-Quantil
20
10
60
75%-Quantil
60
30
70
Quartilsabstand
40
20
10
Tabelle 3/2: Lage- und Streumaße von HMFG2 in den kolorektalen „low-grade“-Adenomen
Ohne
Vorbehandlung
Nach NeuraminidaseBehandlung
Nach PerjodatOxidation
Mittelwert
35
40
68
STABW
29,16
28,28
21,68
Median
30
30
80
25%-Quantil
10
20
50
75%-Quantil
60
70
80
Quartilsabstand
50
50
30
Tabelle 3/3: Lage- und Streumaße von HMFG2 in den kolorektalen „high-grade“-Adenomen
Ergebnisse
3.1.2
61
BCP8
Der Antikörper BCP8 zeigte ein ähnliches Reaktionsverhalten wie der Antikörper HMFG2. In
den Adenomgeweben ließ sich mit BCP8 eine durchgehend positive Reaktion erzielen. So
reagierten 42% (STABW 29,5%) der „low-grade“-Adenomzellen und 30% (STABW 20%)
der „high-grade“-Adenomzellen mit dem Antikörper (Tabellen 3/4 bis 3/6). Die Intensität der
Färbung war bei den Adenomen mit leichter intraepithelialer Neoplasie in einem Fall gering,
in drei Präparaten mäßig und in einem stark.
Bei den Adenomen mit schwerer intraepithelialer Neoplasie war die Intensität der Färbung bis
auf einen stark angefärbten Schnitt mäßig.
Nach Vorbehandlung der Gewebe mit Neuraminidase kam es in sechs Schnitten zu einer
Zunahme der mit dem Antikörper reagierenden Adenomzellen. Bei den „low-grade“Adenomen nahm in einem Fall der Anteil des angefärbten Gewebes von 90% auf 20% ab. In
den übrigen Schnitten blieb das Ergebnis unverändert. Nach Neuraminidase-Behandlung lag
die Menge des angefärbten Gewebes bei den „low-grade“-Adenomen bei 36% (STABW
18,17%) und bei den „high-grade“-Adenomen bei 40% (STABW 20%). Die Intensität der
Färbung war insgesamt mäßig bis stark ausgeprägt, dass heißt in drei Schnitten kam es zu
einer Zunahme.
Durch eine Vorbehandlung mit Perjodat konnte die Immunreaktivität von MUC1 mit dem
Antikörper BCP8 sowohl bei den „low-grade“-Adenomen, als auch bei den „high-grade“Adenomen deutlich verstärkt werden. Lediglich in einem Fall der „low-grade“-Adenome sah
man keine Veränderung der Quantität, aber eine um eine Reaktionsstufe höhere Intensität der
Färbung. Im Durchschnitt wurde bei den „low-grade“-Adenomen 78% (STABW 17,89%) des
Gewebes angefärbt. Bei den „high-grade“-Adenomen reagierten ebenfalls 78% (STABW
8,37%) der Adenomzellen mit dem Antikörper. Die Intensität der Färbung war in zwei der
Fälle mäßig, in drei Präparaten stark. Im Vergleich zu den Fällen ohne Vorbehandlung kam es
in drei Präparaten zu einer Zunahme der Intensität.
Die Farbintensität war bei den Adenomen mit leichter intraepithelialer Neoplasie in drei
Schnitten stark, bei den Adenomen mit schwerer intraepithelialer Neoplasie durchgehend
stark.
Statistisch zeigte sich, wie bei dem Antikörper HMFG2 für die partielle Deglykosylierung
mit Perjodat-Oxidation ein signifikanter Unterschied im Vergleich zum nativen Gewebe.
Demgegenüber konnte für die Vorbehandlung mit Neuraminidase kein signifikanter
Unterschied gezeigt werden. Auch konnte mit dem Mann-Withney-U-Test kein signifikanter
Unterschied zwischen den „low-grade“- und den „high-grade“-Adenomen gefunden werden.
62
Ergebnisse
„low-grade“-Adenome „high-grade“-Adenome
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
Ohne Vorbehandlung
20
50
30
90
20
10
50
10
30
50
Farbintensität
1
2
3
2
2
2
2
3
2
2
Nach Neuraminidase-Behandlung 50
60
30
20
20
10
60
30
50
50
Farbintensität
2
3
3
3
2
2
2
3
2
2
Nach Perjodat-Oxidation
90
70
90
90
50
80
70
90
80
70
Farbintensität
2
3
3
3
2
3
3
3
3
3
Tabelle 3/4: MUC1-Immunreaktivität und Farbintensität mit dem Antikörper BCP8 in den
Adenomgeweben
Ohne
Vorbehandlung
Nach NeuraminidaseBehandlung
Nach PerjodatOxidation
Mittelwert
42
36
78
STABW
29,5
18,17
17,89
Median
30
30
90
25%-Quantil
20
20
70
75%-Quantil
50
50
90
Quartilsabstand
30
30
20
Tabelle 3/5: Lage- und Streumaße von BCP8 in den kolorektalen „low-grade“-Adenomen
Ohne
Vorbehandlung
Nach NeuraminidaseBehandlung
Nach PerjodatOxidation
Mittelwert
30
40
78
STABW
20
20
8,37
Median
30
50
80
25%-Quantil
10
30
70
75%-Quantil
50
50
80
Quartilsabstand
40
20
10
Tabelle 3/6: Lage- und Streumaße von BCP8 in den kolorektalen „high-grade“-Adenomen
Ergebnisse
3.1.3
63
115D8
Der Antikörper 115D8, der gegen ein Glykopeptid-Epitop gerichtet ist und dessen genaues
Zielepitop noch nicht bekannt ist, zeigte mit den nativen Gewebeschnitten die stärkste
Reaktion im Vergleich zu den anderen Antikörpern (Tabellen 3/7 bis 3/9).
Bei den „low-grade“-Adenomen reagierten 70% (STABW 18,71%) der Zellen positiv mit
dem Antikörper, bei den „high-grade“-Adenomen sogar 72% (STABW 13,04%). Die Farbintensität war durchgehend stark.
Nach Vorbehandlung der Schnitte mit Neuraminidase nahm der Anteil der immunmarkierten
Adenomzellen in drei Fällen der Adenome mit leichter intraepithelialer Neoplasie und in vier
Fällen der Adenome mit schwerer intraepithelialer Neoplasie ab. Die übrigen Präparate
zeigten keine quantitative Veränderung. Der Mittelwert betrug 54% (STABW 26,08%)
angefärbter „low-grade“-Adenomzellen und 52%
(STABW 24,90%) angefärbter „high-
grade“-Adenomzellen. Die Intensität der Färbung war in allen Schnitten weiterhin sehr stark.
Durch die Vorbehandlung der Schnitte mit Perjodat kam es in allen Adenomgeweben zu einer
mehr oder weniger staken Abnahme der immunmarkierten Zellen. Nur in einem Fall der
„high-grade“-Adenome blieb es bei 70% positiven Gewebes. Durchschnittlich sank der Anteil
des positiv markierten Gewebes bei den Adenomen mit leichter intraepithelialer Neoplasie
von 70% auf 34% (STABW 19,49%) und bei den Adenomen mit schwerer intraepithelialer
Neoplasie von 72% auf 34% (STABW 20,74%). In der Hälfte der Fälle kam es zu einer
Abnahme der Farbintensität um eine Stufe.
Insgesamt zeigte sich für die partielle Deglykosylierung sowohl mit Neuraminidase, als auch
mit Perjodat-Oxidation ein signifikanter Unterschied im Vergleich zum nativen Gewebe.
Jedoch war auch diesmal kein signifikanter Unterschied zwischen den „low-grade“- und den
„high-grade“-Adenomen zu beobachten.
64
Ergebnisse
„low-grade“-Adenome „high-grade“-Adenome
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
Ohne Vorbehandlung
50
50
80
90
80
90
60
70
60
80
Farbintensität
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Nach Neuraminidase-Behandlung 40
50
80
80
20
70
20
70
30
70
Farbintensität
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Nach Perjodat-Oxidation
20
40
60
10
40
10
20
50
30
60
Farbintensität
2
3
2
3
2
2
2
3
3
3
Tabelle 3/7: MUC1-Immunreaktivität und Farbintensität mit dem Antikörper 115D8 in den
Adenomgeweben
Ohne
Vorbehandlung
Nach NeuraminidaseBehandlung
Nach PerjodatOxidation
Mittelwert
70
54
34
STABW
18,71
26,08
19,49
Median
80
50
40
25%-Quantil
50
40
20
75%-Quantil
80
80
40
Quartilsabstand
30
40
20
Tabelle 3/8: Lage- und Streumaße von 115D8 in den kolorektalen „low-grade“-Adenomen
Ohne
Vorbehandlung
Nach NeuraminidaseBehandlung
Nach PerjodatOxidation
Mittelwert
72
52
34
STABW
13,04
24,9
20,74
Median
70
70
30
25%-Quantil
60
30
20
75%-Quantil
80
70
50
Quartilsabstand
20
40
30
Tabelle 3/9: Lage- und Streumaße von 115D8 in den kolorektalen „high-grade“-Adenomen
Ergebnisse
3.1.4
65
MA695
Der monoklonale Antikörper MA695, der ähnlich 115D8, ein Glykopeptid-Epitop definiert,
zeigte insgesamt die schwächste Reaktion mit den Adenomgeweben (Tabellen 3/10 bis 3/12).
In zwei Fällen der „low-grade“-Adenome reagierte er gar nicht mit dem Gewebe. Im
Durchschnitt wurden nur 7,4% (STABW 12,8%) der Adenomzellen positiv angefärbt. Die
Intensität der Färbung war gering bis mäßig.
Bei den „high-grade“-Adenomen reagierten 5% bis 10% der Zellen mit dem Antikörper. Der
Mittelwert lag bei 8% (STABW 2,74). Die Farbintensität war mäßig bis stark.
Bei den „low-grade“-Adenomen zeigten nach Neuraminidase-Vorbehandlung alle Fälle eine
deutliche Reaktionszunahme des Gewebes. Alle Schnitte waren positiv (Mittelwert 26%,
STABW 20,74%). Die Intensität der Färbung fiel gering bis mäßig aus.
Die Adenome mit schwerer intraepithelialer Neoplasie zeigten nach Desialylierung in drei
Fällen eine Zunahme des angefärbten Gewebes, in zwei Fällen blieb der Anteil der positiven
Zellen gleich. Im Mittel reagierte der Antikörper mit 23% der schwer dysplastischen Zellen
(STABW 17,89%). Die Intensität der Färbung blieb in zwei Fällen im Vergleich zu den
Adenomen ohne Vorbehandlung mäßig, in einem Fall stark. In einem Präparat kam es zu
einer Abnahme der Intensität, in einem Anderen zu einer Zunahme.
Durch Perjodat-Oxidation kam es bei den „low-grade“-Adenomen durchschnittlich zu einer
Abnahme des Anteils positiv markierter Zellen (Mittelwert 2%, STABW 2,74%). Drei der
Gewebeschnitte waren nun negativ, die zwei anderen zeigten 5 % positiv gefärbtes Gewebe.
Die Färbung war negativ bis gering ausgeprägt. Bei den „high-grade“-Adenomen zeigten
zwei Präparate nach Perjodat-Behandlung keine Veränderung im Vergleich zu den
unbehandelten Schnitten. In zwei Fällen kam es zu einer Zunahme des angefärbten Gewebes.
Ein Schnitt, der vor Behandlung positiv war, zeigte nach Perjodat-Oxidation keine Reaktion
mit dem Antikörper. Im Mittel wurden 10% (STABW 7,07%) der Adenomzellen mit
schwerer Dysplasie angefärbt. Die Intensität der Färbung war gering bis mäßig.
Nach dem Testverfahren nach Mann-Whitney-U zeigte sich ein signifikanter Unterschied
zwischen den Ergebnissen der „low-grade“-Adenome und der „high-grade“-Adenome.
Zwischen den jeweiligen Methoden der partiellen Deglykosylierung und den nativen
Schnitten war kein signifikanter Unterschied zu sehen.
66
Ergebnisse
„low-grade“-Adenome „high-grade“-Adenome
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
Ohne Vorbehandlung
2
0
30
5
0
10
10
5
5
10
Farbintensität
1
0
2
1
0
2
3
2
3
2
Nach Neuraminidase-Behandlung 60
20
10
30
10
10
50
20
5
30
Farbintensität
2
1
2
1
2
2
1
3
3
2
Nach Perjodat-Oxidation
0
0
5
0
5
10
10
10
0
20
Farbintensität
0
0
1
0
1
2
1
2
0
1
Tabelle 3/10: MUC1-Immunreaktivität und Farbintensität mit dem Antikörper MA695 in den
Adenomgeweben
Ohne
Vorbehandlung
Nach NeuraminidaseBehandlung
Nach PerjodatOxidation
Mittelwert
7,4
26
2
STABW
12,8
20,74
2,74
Median
2
20
0
25%-Quantil
0
10
0
75%-Quantil
5
30
5
Quartilsabstand
5
20
5
Tabelle 3/11: Lage- und Streumaße von MA695 in den kolorektalen „low-grade“-Adenomen
Ohne
Vorbehandlung
Nach NeuraminidaseBehandlung
Nach PerjodatOxidation
Mittelwert
8
23
10
STABW
2,74
17,89
7,07
Median
10
20
10
25%-Quantil
5
10
10
75%-Quantil
10
30
10
Quartilsabstand
5
20
0
Tabelle 3/12: Lage- und Streumaße von MA695 in den kolorektalen „high-grade“-Adenomen
Ergebnisse
3.2 Immunreaktivität
MUC1-spezifischer
67
monoklonaler
Antikörper in kolorektalen Karzinomen vor und nach
partieller Deglykosylierung
Die Karzinomfälle zeigten ebenfalls eine durchgehend positive Farbreaktion mit den vier
MUC1-spezifischen monoklonalen Antikörpern. Die Intensität der Färbung war bis auf einen
gering angefärbten Schnitt durchgehend mäßig bis stark. Auffällig war, dass sowohl die
MUC1-Immunreaktivität als auch die Farbintensität bei den Antikörpern 115D8 und MA695
stärker ausfiel, als bei den Antikörpern HMFG2 und BCP8. Nach partieller Deglykosylierung
nahm die Immunreaktivität der Antikörper HMFG2 und BCP8 zu, während die der beiden
anderen Antikörper abnahm.
Im Vergleich zu den Adenomen zeigten die Antikörper 115D8 und MA695, die ein Glykopeptid-Epitop definieren, einen deutlichen Anstieg der Immunreaktivität von MUC1 in den
kolorektalen Karzinomen. Während mit MA695 in den „low-grade“-Adenomen 7,4% des
Adenomgewebes und in den „high-grade“-Adenomen 8% der Adenomzellen angefärbt waren,
reagierten in den kolorektalen Karzinomen 38,5% der Tumorzellen mit dem Antikörper. Ein
Anstieg der Immunreaktivität von 71% positiver Zellen in den Adenomen auf
79%
angefärbter Tumorzellen in den Karzinomen konnte bei dem Antikörper 115D8 beobachtet
werden. Demgegenüber reagierten die Antikörper HMFG2 und BCP8, die gegen die DTRSequenz innerhalb der VNTR-Region gerichtet sind, insgesamt schwächer mit dem
Karzinomgewebe als mit dem Adenomgewebe.
Nach dem nicht-parametrischen Testverfahren Mann-Whitney-U gab es jedoch keinen
statistisch signifikanten Unterschied zwischen den Ergebnissen der Adenome und der
Karzinome.
68
Ergebnisse
90
80
70
60
Ohne Vorbehandlung
50
Nach NeuraminidaseBehandlung
40
30
Nach PerjodatOxidation
20
10
0
HMFG2 BCP8
115D8 MA695
Abbildung 3/7: Häufigkeitsverteilung (Mittelwerte) der Antikörper bei den Karzinomen
3.2.1
HMFG2
Mit dem Antikörper HMFG2 ließen sich 17% (STABW 15,31%) des Tumorgewebes positiv
markieren. Die Farbintensität fiel in einem Fall gering, in acht Fällen mäßig und in einem Fall
stark aus (Tabellen 3/13 und 3/14).
Nach Vorbehandlung der Karzinomgewebe mit Neuraminidase kam es in allen Schnitten zu
einer Zunahme des positiv angefärbten Tumoranteils. Lediglich in einem Fall sah man keine
Veränderung. Der Mittelwert lag bei 28% positiver Karzinomzellen (STABW 16,87%). In
zwei Präparaten nahm die Intensität der Färbung um eine Stufe zu, ansonsten fiel sie mäßig
aus.
Mit einer Vorbehandlung der Gewebe mit Perjodat konnte die Reaktivität von HMFG2 in den
Karzinomen deutlich verstärkt werden. Es färbten sich 65% (STABW 21,21%) der Tumorzellen positiv an. Die Intensität der Färbung war durchgehend stark, dass heißt man sah eine
Zunahme der Farbintensität in allen zehn Präparaten.
Es gab statistisch einen signifikanten Unterschied zwischen den Ergebnissen der Gewebe
ohne Vorbehandlung und den Geweben nach Perjodat-Oxidation bzw. NeuraminidaseBehandlung.
Ergebnisse
69
1
2
3
4
5
6
7
8
Ohne Vorbehandlung
5
5
10
5
10
5
30 30 50 20
Farbintensität
2
2
2
2
2
2
3
2
9
2
10
1
Nach Neuraminidase-Behandlung 10 10 30 20 30 10 50 30 60 30
Farbintensität
2
2
Nach Perjodat-Oxidation
80 40 70 90 70 30 70 70 90 40
Farbintensität
3
3
2
3
2
3
2
3
3
3
3
3
2
3
2
3
2
3
Tabelle 3/13: MUC1-Immunreaktivität und Farbintensität mit dem Antikörper HMFG2 in
den kolorektalen Karzinomen
Ohne
Vorbehandlung
Nach NeuraminidaseBehandlung
Nach PerjodatOxidation
Mittelwert
17
28
65
STABW
15,31
16,87
21,21
Median
10
30
70
25%-Quantil
5
12,5
47,5
75%-Quantil
27,5
30
77,5
Quartilsabstand
22,5
17,5
30
Tabelle 3/14: Lage- und Streumaße von HMFG2 in den kolorektalen Karzinomen
3.2.2
BCP8
Mit dem Antikörper BCP8 konnten 29,5% (STABW 20,06%) des Karzinomgewebes positiv
angefärbt werden. Die Intensität der Färbung fiel bei allen Präparaten mäßig aus Tabellen
3/15 und 3/16).
Durch die Vorbehandlung der Präparate mit Neuraminidase konnte die Reaktion des Gewebes
mit dem Antikörper in sechs Fällen verstärkt werden. Die übrigen vier zeigten keinen
Unterschied zu den nativen Schnitten. Es reagierten durchschnittlich 37% (STABW 17,67%)
der Karzinomzellen positiv. Die Intensität der Färbung blieb auch mit der NeuraminidaseVorbehandlung durchgehend mäßig.
Nach Perjodat-Oxidation zeigte sich, ähnlich wie mit dem Antikörper HMFG2, eine deutliche
Zunahme der MUC1-Reaktivität des Karzinomgewebes mit dem Antikörper BCP8 in allen
70
Ergebnisse
zehn Präparaten. Es färbten sich 63% (STABW 21,11%) der Karzinomzellen an. Die
Intensität der Färbung war unverändert mäßig. In einem Präparat kam es zu einer starken
Färbung.
Statistisch zeigte sich sowohl für die partielle Deglykosylierung mit Neuraminidase, als auch
mit Perjodat-Oxidation ein signifikanter Unterschied im Vergleich zum nativen Gewebe.
1
2
3
4
Ohne Vorbehandlung
10
5
50 20 40 10 30 30 70 30
Farbintensität
2
2
2
2
5
2
6
2
7
2
8
2
9
2
10
2
Nach Neuraminidase-Behandlung 10 20 50 30 40 20 40 50 70 40
Farbintensität
2
2
Nach Perjodat-Oxidation
80 50 70 70 80 20 70 60 90 40
Farbintensität
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
2
2
Tabelle 3/15: MUC1-Immunreaktivität und Farbintensität mit dem Antikörper BCP8 in den
kolorektalen Karzinomen
Ohne
Vorbehandlung
Nach NeuraminidaseBehandlung
Nach PerjodatOxidation
Mittelwert
29,5
37
63
STABW
20,06
17,67
21,11
Median
30
40
70
25%-Quantil
12,5
22,5
52,5
75%-Quantil
37,5
47,5
77,5
Quartilsabstand
25
25
25
Tabelle 3/16: Lage- und Streumaße von BCP8 in den kolorektalen Karzinomen
3.2.3
115D8
Der Antikörper 115D8 zeigte die stärkste MUC1-Immunreaktivität mit den Karzinomgeweben. Es konnte ein Tumoranteil von 79% (STABW 13,7%) angefärbt werden. Die Werte
lagen zwischen 50% bis 90% positiv markierter Tumorzellen. Die Farbintensität war
durchgehend stark (Tabellen 3/17 und 3/18).
Ergebnisse
71
Nach partieller Deglykosylierung mit Neuraminidase nahm der Anteil gefärbter Karzinomzellen leicht ab. In zwei Präparaten sah man keine Veränderung. Es konnten nur noch 67%
(STABW 15,67%) der Karzinomzellen angefärbt werden. In zwei Schnitten sank auch die
Farbintensität um eine Stufe, ansonsten blieb die Intensität stark.
Mit der Perjodat-Vorbehandlung war die Abnahme der Immunreaktivität noch deutlich
stärker ausgeprägt. Durchschnittlich reagierte nur noch 45% (STABW 22,24%) des Tumorgewebes mit dem Antikörper. In einem Fall kam es nach Perjodat-Behandlung sogar zu einem
negativen Ergebnis. Die Intensität der Färbung nahm um ein bis zwei Stufen ab, in drei
Schnitten blieb sie unverändert. Auch mit dem Antikörper 115D8 zeigte sich ein statistisch
signifikanter Unterschied zwischen den Ergebnissen vor und nach partieller Deglykosylierung
von MUC1 in den Karzinomen.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Ohne Vorbehandlung
90 60 90 80 80 50 80 90 90 80
Farbintensität
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Nach Neuraminidase-Behandlung 90 40 80 50 70 50 70 80 70 70
Farbintensität
3
2
3
3
3
Nach Perjodat-Oxidation
70 40 40 30 70 30 70 50
0
50
Farbintensität
3
0
2
2
3
2
2
1
3
3
3
3
3
2
2
Tabelle 3/17: MUC1-Immunreaktivität und Farbintensität mit dem Antikörper 115D8 in den
kolorektalen Karzinomen
Ohne
Vorbehandlung
Nach NeuraminidaseBehandlung
Nach PerjodatOxidation
Mittelwert
79
67
45
STABW
13,7
15,67
22,24
Median
80
70
45
25%-Quantil
80
55
32,5
75%-Quantil
90
77,5
65
Quartilsabstand
10
22,5
32,5
Tabelle 3/18: Lage- und Streumaße von 115D8 in den kolorektalen Karzinomen
72
3.2.4
Ergebnisse
MA695
Der Antikörper MA695, der in den Adenomgeweben gar keine oder nur eine schwache
Reaktion zeigte, reagierte mit den Karzinomgeweben deutlich stärker. Während bei den „lowgrade“-Adenomen einige Fälle negativ blieben, färbten sich in den kolorektalen Karzinomen
38,5% (STABW 21,09%) der Tumorzellen an. Die Intensität der Färbung fiel mäßig bis stark
aus (Tabellen 3/19 und 3/20).
Ähnlich wie die Reaktion des Antikörpers 115D8 nahm die Immunreaktivität von MUC1 mit
MA695 nach partieller Deglykosylierung ab. Nach einer Vorbehandlung der kolorektalen
Karzinomgewebe mit dem Enzym Neuraminidase reagierten noch 29,5% (STABW 22.54%)
mit MA695. Während in sechs Schnitten der positiv gefärbte Tumoranteil abnahm,
beobachtete man in zwei Fällen eine Zunahme der Reaktivität, in einem Fall sah man keine
Veränderung. Die Intensität der Färbung war in vier Fällen stark, in vier Fällen mäßig und in
einem Fall gering ausgeprägt. Damit kam es bei vier der Gewebeschnitte zu einer Intensitätsabnahme mit der Neuraminidase-Vorbehandlung, während sie in den übrigen sechs Fällen
gleich blieb. Die Intensität der Färbung nahm in vier Fällen ab und blieb in den übrigen
Präparaten gleich.
Nach Perjodat-Oxidation sank die Immunreaktivität von MA695 stark ab. Es konnten nur
noch 6% (STABW 4,6%) der Karzinomzellen positiv markiert werden. Drei der Gewebeschnitte waren nach Perjodat-Behandlung negativ. Auch die Intensität der Färbung nahm in
allen Präparaten stark ab. In drei Fällen war sie mäßig, die übrigen Schnitte zeigten gar keine
bis eine geringe Färbung der Karzinomzellen.
Mit dem Wilcoxon-Test konnte ein statistisch signifikanter Unterschied für die Ergebnisse der
unbehandelten und die mit Perjodat behandelten Karzinome festgestellt werden. Die
Neuraminidase-Behandlung war im Vergleich zu den unbehandelten Karzinomen nicht
signifikant.
Ergebnisse
1
2
3
73
4
5
6
7
8
9
10
Ohne Vorbehandlung
80 40 30 50 40 5 60 30 20 20
Farbintensität
2
2
3
3
Nach Neuraminidase-Behandlung
5
30
5
40 40 5 40 70 10 50
Farbintensität
1
2
2
2
2
2
3
3
Nach Perjodat-Oxidation
0
10
5
10 10 0
0
5
10 10
Farbintensität
0
1
1
1
0
2
1
3
3
2
2
0
3
3
3
3
3
2
Tabelle 3/19: MUC1-Immunreaktivität und Farbintensität mit dem Antikörper MA695 in den
kolorektalen Karzinomen
Ohne
Vorbehandlung
Nach NeuraminidaseBehandlung
Nach PerjodatOxidation
Mittelwert
38,5
29,5
6
STABW
21,09
22,54
4,59
Median
35
35
7,5
25%-Quantil
30
6,25
1,25
75%-Quantil
47,5
40
10
Quartilsabstand
17,5
33,75
8,75
Tabelle 3/20: Lage- und Streumaße von MA695 in den kolorektalen Karzinomen
74
Diskussion
4 Diskussion
___________________________________________________________________________
4.1 Relevanz von MUC1 in der kolorektalen Adenom-KarzinomSequenz
Das kolorektale Karzinom stellt in den westlichen Industrieländern die zweithäufigste Tumorerkrankung sowohl bei Männern als auch bei Frauen dar. Etwa 80 bis 85 % der kolorektalen
Karzinome entstehen sporadisch über die Adenom-Karzinom-Sequenz. Kolorektale Adenome
gelten heute als fakultative Präkanzerosen. Das Risiko der malignen Entartung nimmt vor
allem mit der Größe und dem Grad der intraepithelialen Neoplasie zu.
Entscheidender Prädiktor für die Prognose des primären kolorektalen Karzinoms ist nach wie
vor das pathologische Tumorstadium. Dies gilt sowohl bei Verwendung der TNMKlassifikation der UICC als auch bei Anwendung anderer Klassifikationssysteme, zum
Beispiel nach Dukes oder Astler-Coller.
In den vergangenen Jahren wurden verschiedene Aspekte der Progression und Prognose des
kolorektalen Karzinoms erforscht, um neue unabhängige Parameter für dieses Krankheitsbild
zu definieren. Dabei rückten zunehmend genetische Veränderungen sowie die entsprechenden
Genprodukte in den Mittelpunkt des pathologisch-wissenschaftlichen Interesses. Durch
Anwendung neuer immunhistochemischer und molekularbiologischer Methoden konnten
verschiedene Faktoren der molekularen Pathogenese kolorektaler Karzinome beschrieben und
hinsichtlich ihrer Bedeutung für den Krankheitsverlauf und die Prognose evaluiert werden.
Als wichtiger Marker der gastrointestinalen Karzinogenese entwickelte sich ein besonderes
Interesse für die Gruppe der Muzine. Sie stellen eine heterogene Gruppe hochmolekularer,
ausgeprägt glykosylierter Proteine dar, deren Peptidcore durch das Auftreten von Tandemrepeat-Sequenzen charakterisiert ist. Die komplexen Oligosaccharid-Seitenketten sind durch
O-glykosidische Bindungen an das Apomuzin angeheftet. Muzine findet man in dem
mukösen Gel, das die epithelialen Oberflächen in den Hohlorganen des Körpers schützt.
Außerdem werden sie als transmembranäre Proteine an der apikalen Oberfläche glandulärer
und duktaler Epithelien verschiedener Organe exprimiert. In Normalgeweben zeigt die
Expression ein Organ- und Zell-spezifisches Muster. Während der Karzinogenese kommt es
zu typischen Veränderungen der Muzin-Expression. Durch die Einführung monoklonaler
Antikörper in die Immunhistochemie konnten die histologische Verteilung und die
Diskussion
75
Veränderungen der Muzine im Rahmen der Zelldifferenzierung und während der
Karzinogenese untersucht werden. Die O-glykosidisch gebundenen Kohlenhydratseitenketten
erfahren im Rahmen der neoplastischen Transformation Veränderungen, die für bestimmte
Zell- oder Tumorarten typisch sind. Einige dieser Veränderungen konnten in Zusammenhang
mit Zelladhäsion, Metastasierung und klinischer Prognose gebracht werden. Als Marker der
Zelldifferenzierung könnten muzinassoziierte Antigene eine Relevanz als funktionelle tumorbiologische Marker und Prognosemarker haben.
MUC1 repräsentiert als Produkt des MUC1-Gens das am besten charakterisierte membranassoziierte Muzin. Die Glykoproteinstruktur besteht aus einer extrazellulären Region, einer
transmembranären Domäne und einem zytoplasmatischen Teil. MUC1 wird an der apikalen
Oberfläche der meisten epithelialen Zellen, vor allem im Gastrointestinal-, respiratorischem
und genitourethralem Trakt, sowie im Mammagewebe, exprimiert. Es spielt eine wichtige
Rolle in der Modulation der Zell-Adhäsion, in der Erhaltung der Zellpolarität, in Signaltransduktionswegen und zellulärer Immunologie [37, 281].
In der Karzinomimmunologie und -therapie besitzt MUC1 inzwischen eine große klinische
Bedeutung, da es im Rahmen der Karzinogenese zu einer generellen Überexpression und zu
meist typischen, karzinom-bedingten Veränderungen der Kohlenhydratstrukturen kommt.
Bisherige Ergebnisse belegen, dass MUC1 ein Marker für Progression und Prognose kolorektaler Karzinome darstellt. Unklar ist jedoch, in welchem Maße eine Änderung der
Glykosylierung des MUC1-Peptids zu diesem Effekt beiträgt. Bisher sind die immunhistochemischen und biochemischen Daten über die Glykosylierung normaler oder neoplastischer
kolorektaler Muzine sehr dürftig.
In den letzten Jahren wurde eine große Anzahl monoklonaler Antikörper gegen MUC1
entwickelt. Ihre Zielepitope können entsprechend ihrer Position in der Tandem-repeat-Region
des Muzins und in Hinsicht auf Effekte, die durch die ortsspezifische Glykosylierung
ausgeübt werden, klassifiziert werden [22]. Die meisten dieser Antikörper binden an die
immundominante hydrophile Sequenz der VNTR-Region, die PDTRPAP-Sequenz. Die
Tandem-repeat-Region enthält fünf O-Glykosylierungsstellen, die die Spezifität der
monoklonalen Antikörper gegen MUC1 modulieren [189]. Eine Reihe von MUC1spezifischen monoklonalen Antikörpern erkennen oft Epitope, die aus Peptid- und Kohlenhydratanteilen bestehen. Von einigen Antikörpern weiß man, dass sie von dem
Glykosylierungsprofil des MUC1-Moleküls beeinflusst werden [116, 249]. Die Immun-
76
Diskussion
reaktivität des MUC1-Peptids wird stark von seiner O-Glykosylierung beeinflusst.
Veränderungen
der
MUC1-Glykosylierung
und
Mechanismen
einer
anormalen
Glykosylierung wurden gründlich in Mamma-Karzinomzellen erforscht. Die biosynthetischen
Wege werden von der Substratspezifität der verschiedenen Glykosyltransferasen bestimmt.
Daraus resultieren eine starke Reduktion der O-gebundenen Kohlenhydratseitenketten und der
O-azetylierten Neuraminsäure. Diese Aspekte haben direkte Auswirkungen auf die Antigenität von MUC1 und auf das Bindungsmuster spezifischer monoklonaler MUC1-Antikörper. In diesem Kontext spielt die Feinspezifität MUC1-spezifischer AK und ihre Epitopkonformation eine wichtige Rolle. Aus Ergebnissen einiger Studien wurde deutlich, dass dies
nicht nur von der unterschiedlichen Peptid-Epitopspezifität abhängen kann, sondern auch von
der MUC1-Glykosylierung und seiner Veränderung während der Karzinogenese. Daraus kann
eine Reduzierung der Länge der O-Glykane resultieren, was zu einem stärkeren
immunologischen Erkennen einiger Peptidsequenzen führt.
Mit mehreren solcher Antikörper könnte man zeigen, dass bestimmte Veränderungen der
Peptid- oder Kohlenhydrat-Epitope mit der Tumorentwicklung assoziiert sind und es wäre
möglich, Tumore früh zu detektieren, indem man diese Epitope als spezifische Tumormarker
nutzt.
In dieser Arbeit wurden vier monoklonale Antikörper verwendet. Zwei von ihnen, HMFG2
und BCP8 haben ihr Epitop innerhalb der VNTR-Region. Das exakte Zielepitop von 115D8
und MA695 ist bisher nicht bekannt.
Bei der Auswertung der Expressionsmuster der Antikörper zeigten sich in den kolorektalen
Geweben teilweise deutliche Quantitäts- und Intensitätsunterschiede.
4.2 Expression von MUC1 in der Adenom-Karzinom-Sequenz
Bisher konnte gezeigt werden, dass die Expression von MUC1 in einigen Karzinomen sehr
stark ansteigt [19, 85, 126]. Diese Überexpression von MUC1 wird in Verbindung mit
Tumorprogression und Metastasierung gebracht [37, 102, 184, 195, 201]. Mehrfach wurde
eine Assoziation zwischen der MUC1-Expression und dem Risiko der malignen Transformation bzw. einer schlechten Prognose kolorektaler Karzinome beschrieben. Dabei stellte
sich MUC1 als ein unabhängiger Prognosemarker für eine ungünstige Prognose bei Patienten
mit einem kolorektalen Karzinom dar [20, 27, 89, 133].
Diskussion
77
Auch die klinische Verwendung von MUC1 als Tumormarker bei Mamma-Karzinomen
wurde bereits in mehreren Studien demonstriert [92, 126, 227].
In kolorektalen Geweben wird das Vorkommen von MUC1 bis heute kontrovers diskutiert. In
den meisten Studien wurde angedeutet, dass normale intestinale Epithelzellen nicht oder nur
schwach mit monoklonalen Antikörpern gegen MUC1 reagieren [59, 108, 136, 151]. Andere
Autoren berichteten, dass normales adultes intestinales Gewebe mit ihren MUC1-spezifischen
monoklonalen Antikörpern angefärbt wurde [63, 132]. Auch MUC1-mRNA konnte mit Hilfe
der in-situ-Hybridisierung nachgewiesen werden [59]. Man nimmt an, dass MUC1 in
normaler kolorektaler Mukosa exprimiert wird, jedoch aufgrund der starken Glykosylierung
des MUC1-Proteins nicht durch anti-MUC1-Peptid erkennende monoklonale Antikörper
detektiert werden kann, da die Zielepitope maskiert sind [23, 136, 195, 204].
Im Rahmen der Entwicklung eines Kolonkarzinoms über die Adenom-Karzinom-Sequenz
wurde in vielen Studien demonstriert, dass im Vergleich zu normalem und hyperplastischem
Gewebe, die Immunreaktivität von MUC1 in kolorektalen Adenomen mit steigender villöser
Histologie, Größe und Dysplasie signifikant ansteigt [59, 135, 152].
So wurde in kolorektalen Adenomen mit leichter und moderater Dysplasie kein oder nur
wenig MUC1 detektiert [59]. In kolorektalen Adenomen mit schwerer Dysplasie und in
Karzinomen wurde eine MUC1-Überexpression beschrieben.
In einer Studie von Li et al. [175], in der 200 kolorektale Adenome und 58 Karzinome auf
MUC1 untersucht wurden, wurde MUC1 in kolorektalen Karzinomen in 24% der Zellen und
in den Adenomen mit schwerer Dysplasie in 4% der Zellen exprimiert, während die Adenome
mit leichter und mäßiger Dysplasie MUC1-negativ waren. In den Karzinomen neigten die
MUC1-positiven Fälle in den fortgeschrittenen Stadien signifikant anzusteigen.
Ein ähnliches Ergebnis erhielt Nakamori et al. [195], der eine Korrelation zwischen der
MUC1-Expression und der Progression kolorektaler Karzinome untersuchte. Es stellte sich
heraus, dass die MUC1-Expression in Karzinomgewebe merklich höher als in Normalgewebe
und in Primärtumoren von Patienten mit Metastasen oder metastasierten Tumoren höher als in
Primärtumoren von Patienten ohne Metastasen war. Dies könnte ein Hinweis sein, dass das
MUC1-Muzin in kolorektalen Karzinomen fortgeschrittener Metastasenstadien ektopisch
exprimiert wird und ein nützlicher Marker für das fortgeschrittene kolorektale Karzinom
darstellen könnte.
Auch Perçınel et al. [211] zeigten, dass die Expression von MUC1 in enger Korrelation mit
dem neoplastischen Prozess signifikant zunahm. MUC1, detektiert mit dem monoklonalen
Antikörper MA695, konnte in dieser Studie sowohl in normaler Mukosa, als auch in
78
Diskussion
hyperplastischen Polypen und tubulären Adenomen nicht nachgewiesen werden, während
24,4% der tubulo-villösen, 19,3% der villösen, 20% der „serrated adenomas“, 37,5% der
Adenome mit karzinomatösen Anteil und 89,3% der Adenokarzinome MUC1 positiv waren.
Zusammenfassend beweisen diese Daten, dass eine zunehmende MUC1-Expression mit der
malignen Transformation kolorektaler Neoplasien zusammenhängt.
In dieser Arbeit konnte ebenfalls eine Überexpression von MUC-1 in den untersuchten
Adenom- und Karzinomgeweben demonstriert werden. Mit den monoklonalen Antikörpern
HMFG2, BCP8 und 115D8 zeigten alle Präparate eine durchgehend positive Gewebereaktion.
Lediglich der Antikörper MA695 reagierte in drei Fällen der „low-grade“-Adenome negativ.
Insgesamt zeigte sich kein signifikanter Unterschied zwischen der MUC1-Positivität in den
„low-grade“- und den „high-grade“-Adenomen.
Viele Studien zeigten, dass der Antikörper HMFG2 der Beobachtung von Veränderungen des
Glykosylierungsstatus von MUC1 im Rahmen der Kanzerogenese dient, da die Bindungsaffinität durch lange, regulär glykosylierte Kohlenhydratseitenketten normaler Muzine
inhibiert wird. Die Überexpression in Karzinomen wurde mit dem Fehlen normal
glykosylierter MUC1-Seitenketten erklärt [28, 53].
Im Gegensatz zu diesen Beobachtungen, fiel die Immunreaktivität von MUC1 mit den Antikörpern HMFG2 und BCP8 in den Karzinomen schwächer aus als in den Adenomen. In den
„low-grade“-Adenomen waren mit dem Antikörper HMFG2 39%, in den „high-grade“Adenomen 35% der dysplastischen Zellen positiv markiert, während in den Karzinomgeweben nur 17% der Tumorzellen MUC1-positiv waren. Das spricht gegen die allgemeine
Annahme, dass das Zielepitop von HMFG2 vornehmlich von Tumorzellen exprimiert wird.
Demgegenüber reagierte der Antikörper MA695 gar nicht oder kaum mit den „low-grade“Adenomen (7,7%), während 38,5% des Karzinomgewebes stark positiv war. In den meisten
Untersuchungen konnte nachgewiesen werden, dass im Kolon nur Tumorgewebe und kein
Normalgewebe durch MA695 angefärbt wird. Dieses Ergebnis geht konform mit der
Annahme, dass der Antikörper MA695 eine erhöhte Bindungsaffinität zu Karzinomzellen mit
dichter, kurzer O-Glykosylierung hat.
Auch für den Antikörper 115D8 zeigte sich eine Zunahme der Immunreaktivität mit
steigendem Grad der intraepithelialen Neoplasie. Der Antikörper 115D8 reagierte mit 70 bis
80% immunmarkierter Zellen am stärksten mit den kolorektalen Geweben.
Diskussion
79
Diese Ergebnisse reflektieren deutlich die Unterschiede der Feinspezifität der monoklonalen
Antikörper und der damit zusammenhängenden Immunreaktivität. Das heißt, dass in Bezug
auf immunhistologische Studien, die die Korrelation zwischen Antigen-Expression und histopathologischen Subtyp, Tumorprogression und Prognose untersuchen, die Auswahl der
MUC1-spezifischen monoklonalen Antikörper das Ergebnis erheblich beeinflussen kann.
Jedoch scheinen diese Beobachtungen nicht nur durch eine unterschiedliche Peptid-Epitopspezifität, sondern auch durch die MUC1-Glykosylierung und ihre Veränderung während der
Karzinogenese beeinflusst zu sein.
Ein Grund für die zunehmende MUC1-Expression in kolorektalen Adenomen und
Karzinomen könnte sein, dass MUC1 in Karzinomen tatsächlich unkontrolliert überexprimiert
wird. In Tumorzellen wird das Glykoprotein nicht mehr nur an der apikalen Zelloberfläche
exprimiert, sondern ist durch Polaritätsverlust auf der gesamten Zelloberfläche vorhanden.
Andererseits wird die Immunreaktivität von MUC1-Peptid-Epitopen stark durch die OGlykosylierung beeinflusst. Die biosynthetischen Wege sind durch die Substratspezifität der
verschiedenen Glykosyltransferasen determiniert [22]. Die Glykosylierungsprozesse sind bei
krankhaften Prozessen, wie Karzinomen und Entzündungen häufig gestört im Sinne einer
abnormalen Glykosylierung und Sialylierung. Es dominieren statt langer Kohlenhydratseitenketten kürzere Core-Strukturen [81, 138, 204, 281, 289]. Studien haben einen Wechsel von
Core 3 (GalNAcβ1-3GalNAc) zu Core 2 (Galβ1-3[GlcNAcβ1-6]GalNAc) in kolorektalen
Karzinomen beschrieben [15, 21, 39, 122]. Diese Aspekte haben direkte Auswirkungen auf
die Antigenität von MUC1 und auf das Bindungsmuster MUC1-spezifischer monoklonaler
Antikörper und führen wohl zu einer Demaskierung von MUC1-Peptid-Antigenen, was die
immunhistochemische Detektion möglich macht [27, 55].
Außerdem wurde vermutet, dass die Bindung einiger monoklonaler AK an Karzinomassoziiertem MUC1 mit ihrer höheren Affinität für weniger glykosyliertes und sialyliertes
MUC1 zu tun hat. Andererseits brauchen einige Antikörper Neuraminsäurereste, um an
MUC1 binden zu können [81].
Insgesamt zeigte der Grad an MUC1-Positivität in den kolorektalen Adenomen und
Karzinomen erhebliche Unterschiede. Diese Beobachtungen reflektieren die Präsenz
80
Diskussion
verschiedener Epitope in oder außerhalb der VNTR-Region, die glykosylierungsabhängig
oder -unabhängig sein können.
4.3 Methoden der partiellen Deglykosylierung
Hochmolekulare Glykoproteine wie die Muzine enthalten zahlreiche Epitope, die mit
Kohlenhydrat- und Peptidketten verbunden sind. Die Kohlenhydrate machen bis zu 80% des
Gewichtes dieser Moleküle aus, der Peptid-Core die übrigen 20%. Einige Peptid-Epitope
können durch diese Kohlenhydratketten in Gewebeschnitten maskiert vorliegen und somit für
Antikörper schwer erreichbar sein [29, 138].
Bisher wurden verschiedene Methoden entwickelt, um solche maskierten Antigene in
paraffinierten Gewebeschnitten zu demaskieren, damit diese versteckten Epitope den Antikörpern zugänglich gemacht werden.
Da die Tandem-repeat-Einheiten aus verschiedenen Aminosäuresequenzen bestehen, die für
jedes Muzingenprodukt spezifisch sind, basieren immunhistochemische Studien des Apomuzins hauptsächlich auf Antikörpern, die mit der Peptid-Determinanten innerhalb der
Tandem-repeat-Domäne reagieren. Eine Schwierigkeit dieses Ansatzes ist, dass die starke
Glykosylierung das Erkennen des Peptid-Epitops durch die Antikörper verhindern kann und
dies falsch negative Ergebnisse liefert.
Der Glykosylierungsstatus von MUC1, der von Zellen exprimiert wird, ist ein interessantes
Thema der Tumorimmunologie, da die Glykosylierung von MUC1 seine Immunogenität
sowie seine biologische Funktion zu determinieren scheint. MUC1 spezifische monoklonale
Antikörper, die spezifische Glykosylierungsmuster erkennen, würden in Forschung und
klinischer Anwendung von großem Nutzen sein.
In dieser Arbeit wurden zur partiellen Deglykosylierung des MUC1-Glykoproteins eine
enzymatische Methode mit Neuraminidase, sowie eine chemische Methode mit PerjodatOxidation angewendet.
4.3.1
Perjodat-Oxidation
Die Perjodat-Oxidation von formalinfixierten Gewebeschnitten, die partiell Kohlenhydratreste
spaltet, um die Darstellung von Muzin-Antigenen zu verbessern, wurde erstmals von
Diskussion
81
Woodward et al. 1985 [285] beschrieben und wurde erfolgreich immunelektronenmikroskopisch angewendet ohne ernsthaft die Gewebemorphologie zu beeinträchtigen.
Eine milde Perjodat-Oxidation bei saurem pH spaltet die den Kohlenhydraten benachbarten
Hydroxylgruppen ohne die Struktur der Peptidketten zu verändern. Durch diese Prozedur wird
die rigide Ringstruktur der Saccharide zerstört.
So werden Kohlenhydrat-Epitope, die Galaktose, N-Azetylgalaktosamine oder Fukose
enthalten, fast vollständig zerstört. Dies könnte zu einer größeren Flexibilität des MuzinMoleküls führen. Maskierte Peptid-Epitope können dadurch enthüllt und für Antikörper
zugänglich gemacht werden [29, 59, 103].
Obwohl der Effekt der Perjodat-Oxidation noch nicht vollständig aufgeklärt ist, ist er deutlich
und spezifisch.
In der vorliegenden Arbeit nahm die MUC1-Immunreaktivität mit den monoklonalen
Antikörpern HMFG2 und BCP8 nach Vorbehandlung der Gewebe mit Perjodat signifikant zu.
Mit dem Antikörper HMFG2 vervierfachte sich das immunmarkierte Karzinomgewebe sogar.
Die starke Zunahme der Immunreaktivität dieser beiden Antikörper deutet darauf hin, dass
das Zielepitop bei nativen MUC1-Molekülen durch Glykane maskiert ist. Auch bestätigt
dieses Ergebnis die Annahme, dass die Antikörper HMFG2 und BCP8 eine Affinität für kurze
Kohlenhydratketten haben. Auf diese Weise eignen sich die Antikörper HMFG2 und BCP8
als Marker für Veränderungen der MUC1-Glykosylierung im Rahmen pathologischer
Prozesse während der Karzinogenese.
Ähnlich den Ergebnissen anderer Studien [29, 114, 116] zeigte sich in dieser Arbeit, dass die
Immunreaktivität von MUC1 mit dem Antikörper MA695 nach einer Perjodat-Oxidation der
Gewebeschnitte vor allem in den Kolon-Karzinomgeweben signifikant abnahm, nämlich von
38.5% auf 6% markierter Tumorzellen. Bei den „low-grade“-Adenomen kam es prozentual
ebenfalls zu einer Abnahme von 7,4% auf 2%, jedoch zeigte ein Fall eine Zunahme positiv
markierter Zellen, ein anderer zeigte keinen Unterschied. Bei den „high-grade“-Adenomen
kam es überraschenderweise zu einer prozentualen Zunahme von 8% auf 10% angefärbter
Zellen.
Mit dem Antikörper 115D8 kam es in allen Geweben zu einer deutlichen Abnahme der
MUC1-Immunreaktivität nach Perjodat-Behandlung.
Dies ist ein Hinweis dafür, dass diese Antikörper wahrscheinlich pure Kohlenhydratantigene
repräsentieren, die durch die partielle Deglykosylierung komplett zerstört werden.
82
Diskussion
Auch Bara et al. [29] unterstützt dieses Ergebnis. So nahm die Immunreaktivität von monoklonalen Antikörpern gegen Histoblutgruppen, die gegen Kohlenhydrat-Epitope gerichtet
sind, wie zum Beispiel A, Le a , Le x , Sialyl- Le a , H, I, T, TN und Sialyl-Tn nach PerjodatBehandlung drastisch ab. Im Gegensatz dazu blieb die Immunreaktivität von monoklonalen
Antikörpern gegen Peptid-Epitope meistens unbeeinflusst.
Nach einer Perjodat-Behandlung der Gewebeschnitte konnte MUC1 mit monoklonalen Antikörpern auch in Normalgewebe detektiert werden. In Adenomen und Karzinomen wurde die
Immunreaktivität nach Perjodat-Oxidation verstärkt. Dieser Effekt wurde auch in mehreren
anderen Studien bestätigt [6, 59, 138, 281].
Cao et al. [59] beschrieb einen schwächer verstärkenden Effekt durch Perjodat-Oxidation in
malignen Läsionen im Vergleich zu weniger dysplastischen Läsionen. Er deutete dies damit,
dass MUC1 in hoch dysplastischen Geweben und Karzinomen weniger glykosyliert vorliegt,
was dazu führt, dass die Epitope den monoklonalen Antikörpern auch ohne PerjodatBehandlung besser zugänglich sind.
Dieses Ergebnis konnte in dieser Arbeit nicht bestätigt werden.
In einer anderen Studie von Cao et al. [60] wurden 51 Antikörper gegen MUC1 an Warthin
Tumoren untersucht. Nach milder Kohlenhydrat-spezifischer Perjodat-Behandlung wurden
die Gewebe in den meisten Fällen mit einer stärkeren Intensität angefärbt als ohne Vorbehandlung. Cao erklärte diese scheinbare Heterogenität der Bindungsspezifität durch die
Glykosylierung und nicht durch Unterschiede in der Aminosäuresequenz der Epitope. Die
Abwesenheit oder Schwäche einer immunhistologischen Färbung eines Antikörpers ist oft
durch die Maskierung des Epitops durch die Glykosylierung bedingt, die je nach Gewebetyp
differiert.
Die Perjodat-Oxidation kann somit empfohlen werden als Methode, um die Kohlenhydratbedingte Epitop-Maskierung zu bewältigen und um die immunhistochemische Muzinfärbung
zu verbessern. Dabei sollte man sich nicht auf einen Antikörper verlassen.
4.3.2
Neuraminidase-Behandlung
Das MUC1-Glykoprotein enthält Neuraminsäurereste als terminierende Monosaccharide [81].
Die Neuraminsäure verleiht den Muzinen eine negative Ladung. Dadurch trägt sie zu den
physikalischen und biologischen Eigenschaften der Muzine bei. Der hohe Anteil von O-
Diskussion
83
azetylierter Neuraminsäure ist charakteristisch für das menschliche Kolon und wurde in
keinem anderen menschlichen Gewebe gefunden [7, 76]. Wahrscheinlich erhöht die poly-oazetylierte Neuraminsäure im Kolon den Widerstand gegen bakterielle Enzyme [21, 152].
In kolorektalen Adenomen und Karzinomen enthält MUC1 weniger Kohlenhydratseitenketten. Sie sind kürzer und enthalten weniger Neuraminsäurereste. Dieser Verlust der Seitenketten-O-Azetylierung erscheint als ein frühes Ereignis in der kolorektalen AdenomKarzinom-Sequenz und hat zwei Effekte: eine steigende Sensitivität der Neuraminsäure für
eine Neuraminidaseverdauung sowie eine veränderte Antigenität [55, 76, 152].
Es wird angenommen, dass die Neuraminsäure in MUC1 zur Maskierung der Peptid-Epitope
beiträgt, so dass ein Entfernen der Neuraminsäurereste durch eine Behandlung der Gewebe
mit dem Enzym Neuraminidase die Immunreaktivität positiv beeinflussen könnte.
Durch eine Vorbehandlung der Gewebeschnitte mit Neuraminidase werden endständige
Neuraminsäurereste entfernt, wodurch Kryptantigene, wie zum Beispiel T oder Le a enthüllt
werden können [29, 171].
Larena et al. [171] konnte zum Beispiel in papillären Karzinomen der Schilddrüse zeigen,
dass durch Demaskierung der sialinierten Bindungsstellen mit Neuraminidase die Färbeergebnisse des Le a - und Le x -Antikörper deutlich verstärkt wurden.
Es konnte in einigen Studien gezeigt werden, dass die Desialylierung von MUC1 durch
Neuraminidase die Bindung einiger monoklonaler Antikörper, wie 115D8 und MA695
vermindert, da diese Antikörper von Neuraminsäure abhängig sind. Die größte Abnahme der
Bindungskapazität wurde für den Antikörper 115D8 beobachtet [114, 249]. Demgegenüber
konnte für die Antikörper HMFG2 und BCP8 nach Desialylierung ein Anstieg der Antikörperbindung gefunden werden [81, 218].
Ho et al. [134] zeigte in einer Studie, dass die Reaktivität von HMFG2, spezifisch für das
Tripeptid DTR innerhalb der Tandem-repeat-Region von MUC1, durch eine Desialylierung
der Zelloberfläche mit dem Enzym Neuraminidase deutlich verstärkt wurde. Damit sah Ho
einen Beweis, dass Neuraminsäurereste an benachbarten Oligosaccharidenden den Zugang zu
Peptidregionen, die von HMFG2 erkannt werden, merklich beschränken.
In einer anderen Studie war eine Behandlung mit dem Enzym Neuraminidase ohne
wesentlichen Effekt bezüglich der Immunreaktivität von MUC1 [59]. Dies wurde als ein
84
Diskussion
Hinweis gedeutet, dass die Neuraminsäurereste allein nicht die Hauptrolle im Maskieren der
Peptid-Epitope in gastrointestinalen Geweben spielen kann.
In dieser Arbeit zeigte sich bei den kolorektalen Adenomen und Karzinomen nach
Neuraminidasebehandlung ein sehr unterschiedliches Ergebnis. Bei den „low-grade“Adenomen kam es mit den Antikörpern HMFG2 und BCP8 zu einer Zunahme, Abnahme oder
zu keiner Änderung der Immunreaktivität.
Bei den „high-grade“-Adenomen und Karzinomen verhielt es sich einheitlicher. Die Immunreaktivität nahm von 17% angefärbter Karzinomzellen auf 28% zu. Ein ähnliches Ergebnis
erhielt man mit dem Antikörper BCP8. In den Karzinomgeweben nahmen die positiv
gefärbten Tumorzellen von 29,5% auf 37% zu, wobei vier von den zehn Fällen keinen
Unterschied zeigten.
Nach Desialylierung nahm die Bindungsaffinität des Antikörpers 115D8 in allen Geweben
deutlich ab. Dieses Ergebnis geht konform mit dem anderer Studien [249] und beweist, dass
die Bindungsaffinität des Antikörpers 115D8 an das Zielepitop von Neuraminsäureresten
abhängig ist. Diese Beobachtungen indizieren, dass dieser Antikörper sehr nützlich sein
könnte, um MUC1 zu detektieren, das α2-3-gebundene Neuraminsäurereste enthält.
Mit dem Antikörper MA695 kam es bei den „low-grade“-Adenomen nach Neuraminidasebehandlung zu einer starken Zunahme des MUC1-markierten Gewebes von 7,4% auf 26%.
Ebenso stieg die Immunreaktivität bei den „high-grade“-Adenomen von 8% auf 23%. Dieses
Ergebnis spricht gegen die These, dass auch das Epitop von MA695 von Neuraminsäure
abhängig ist.
Bei den Karzinomen zeigte sich eine Abnahme des mit dem Antikörper MA695 markierten
Tumorgewebes von 38,5% auf 29,5%.
Daj et al. [81] untersuchte den Effekt einer Desialylierung bei 56 monoklonale Antikörper
gegen MUC1. Sein Ergebnis zeigte, dass eine Desialylierung verschiedene Effekte, wie einen
Anstieg, eine Abnahme oder keine Veränderung der Bindungsaffinität hatte. Alle monoklonalen Antikörper, die an Epitope innerhalb der Aminosäuresequenz VTSAPDTRPA von
MUC1 binden, wiesen nach Desialylierung einen Anstieg der Bindungskapazität auf.
Für die Antikörper, deren Bindung sich durch eine Desialylierung veränderte, könnten laut
Daj einige Mechanismen in Frage kommen. Terminale Neuraminsäurereste könnten die
Diskussion
85
Erreichbarkeit der Epitope durch elektrostatische Abstoßung positiv oder negativ
beeinflussen. Umgekehrt könnte das Entfernen der Neuraminsäure entweder zu sterischer
Behinderung oder zu einem besseren Zugang der Antikörper-Bindung zu den Peptid-Epitopen
führen.
Zusammenfassend wird die Bindung von monoklonalen Antikörpern an MUC1 stark von dem
Sialylierungsstatus beeinflusst. Der Vergleich von nativen und desialylierten MUC1 könnte
ein nützliches Instrument zur Selektion von Antikörpern sein, die weniger sialyliertes MUC1
favorisieren. Antikörper wie BCP8 oder HMFG2 könnten in der Entwicklung von neuen
Assays zur Detektion von Tumor-assoziiertem MUC1-Muzin genutzt werden.
4.4 Fazit
Die Ergebnisse in dieser Arbeit, wie auch in anderen Studien demonstrieren die Überexpression von MUC1 innerhalb der Adenom-Karzinom-Sequenz. Auch konnte der Einfluss
der Glykosylierung von MUC1 auf die Immunreaktivität bestätigt werden. Nach
Deglykosylierung der kolorektalen Gewebe konnte die Immunreaktivität der PeptidAntikörper HMFG2 und BCP8 verstärkt werden. Demgegenüber nahm die Immunreaktivität
der Antikörper 115D8 und MA695 nach Perjodat-Behandlung stark ab. Ein ähnliches
Ergebnis zeigte sich nach Entfernen der Neuraminsäurereste mit Neuraminidase. Dies
verdeutlicht, dass neben der unterschiedlichen Feinspezifität der monoklonalen Antikörper
auch das Glykosylierungsprofil von MUC1 einen großen Einfluss auf die Antigenität des
MUC1-Moleküls hat. In Bezug auf immunhistologische Studien, die ihren Fokus auf die
Korrelation zwischen Antigen-Expression und histopathologischen Subtypen, Tumorprogression und Prognose haben, kann die Auswahl der MUC1 spezifischen monoklonalen
Antikörper somit das Ergebnis entscheidend beeinflussen.
Die Ergebnisse verdeutlichen weiterhin die diagnostische Aussagekraft spezifischer MUC1Antikörper und weisen auf ihre mögliche Rolle bezüglich immuntherapeutischer
Überlegungen hin.
Um die mit der malignen Transformation von Zellen assoziierten Veränderungen des MuzinMoleküls für Prävention, Therapie und Nachsorge eines Karzinoms anwenden zu können,
sollte die Expression dieser Moleküle in unterschiedlichen Stadien der Kanzerogenese weiter
untersucht werden.
86
Zusammenfassung
5 Zusammenfassung
___________________________________________________________________________
Muzine stellen wichtige Marker der gastrointestinalen Karzinogenese dar. Von besonderer
Bedeutung für das kolorektale Karzinom ist vor allem das MUC1-Muzin.
Im Rahmen der Karzinogenese kommt es zu einer generellen Überexpression und zu meist
typischen, Karzinom-bedingten Veränderungen der O-glykosidisch gebundenen Kohlenhydratseitenketten des MUC1-Moleküls. Bisherige Ergebnisse belegen, dass MUC1 ein
Marker für Progression und Prognose kolorektaler Karzinome darstellt. Unklar ist jedoch, in
welchem Maße eine Änderung der Glykosylierung des MUC1-Peptids zu diesem Effekt
beiträgt.
In der vorliegenden vergleichenden Studie wurde an Paraffin-eingebetteten Serienschnitten
von zehn kolorektalen Adenomen (je fünf mit gering- und hochgradiger intraepithelialer
Neoplasie (IEN)) und zehn Karzinomen die Immunreaktivität von MUC1 in Hinblick auf das
Glykosylierungsprofil untersucht und bewertet. Dazu wurden die Gewebe mit vier MUC1spezifischen monoklonalen Antikörpern unterschiedlicher Epitop-Spezifität nach der
Streptavidin-Biotin-Peroxidase-Methode
immunhistochemisch
gefärbt.
Als
weitere
Kontrollen zur Charakterisierung der Glykosylierungsabhängigkeit wurden chemische und
enzymatische Methoden der partiellen Deglykosylierung durchgeführt. Bei der PerjodatOxidation werden Verbindungen zwischen Kohlenstoff- und Hydroxylgruppen gespalten,
ohne dass die Peptid-Epitope zerstört werden. Das Enzym Neuraminidase katalysiert die
Hydrolyse von N-Azetyl-Neuraminsäureresten von Glykoproteinen.
Bei der Auswertung der Expressionsmuster der Antikörper zeigten sich in den kolorektalen
Geweben deutliche Quantitäts- und Intensitätsunterschiede. Diese Beobachtungen reflektieren
die Präsenz verschiedener Epitope innerhalb des MUC1-Muzins, die glykosylierungsabhängig
oder –unabhängig sein können.
Eine Überexpression von MUC-1 konnte in den untersuchten kolorektalen Adenom- und
Karzinomgeweben bestätigt werden.
Die Immunreaktivität von MUC1 fiel mit den Antikörpern HMFG2 und BCP8 in den
Karzinomen schwächer aus als in den Adenomen. Das spricht gegen die allgemeine
Annahme, dass das Zielepitop von HMFG2 und BCP8 vornehmlich von Tumorzellen
exprimiert wird. Mit den Antikörpern Ma695 und 115D8 zeigte sich eine Zunahme der
Immunreaktivität von MUC1 mit zunehmender IEN. Der Antikörper MA695 reagierte
hauptsächlich mit dem Karzinomgewebe. Er scheint eine erhöhte Bindungsaffinität zu
Karzinomzellen mit dichter, kurzer O-Glykosylierung zu haben.
Zusammenfassung
87
Nach Vorbehandlung der kolorektalen Gewebe mit Perjodat konnte die Immunreaktivität von
MUC1 mit den Antikörpern HMFG2 und BCP8 deutlich verstärkt werden. Dies ist ein
Hinweis darauf, dass die Zielepitope durch die normale Glykosylierung des MUC1-Moleküls
maskiert sind.
Demgegenüber nahm die Immunreaktivität der Antikörper MA695 und 115D8 stark ab. Dies
beweist, dass ihr Zielepitop ein Glykopeptid darstellt, das durch die Deglykosylierung zerstört
wurde.
Insgesamt kann die Perjodat-Oxidation als Methode empfohlen werden, um die
Kohlenhydrat-bedingte Epitop-Maskierung zu bewältigen und die immunhistochemische
Muzinfärbung zu verbessern.
Nach Deglykosylierung der kolorektalen Gewebe mit Neuraminidase kam es mit den Antikörpern HMFG2, BCP8 und Ma695 zu einer Abnahme, einer Zunahme oder zu keinem
Unterschied der Immunaktivität.
Die Bindungsaffinität des Antikörpers 115D8 nahm nach Desialylierung in den kolorektalen
Geweben deutlich ab, ein Hinweis, dass das Epitop des Antikörpers 115D8 Neuraminsäureabhängig ist.
Mit dem Antikörper MA695 kam es bei den kolorektalen Adenomen nach Desialylierung zu
einer starken Zunahme des MUC1-markierten Gewebes. Dieses Ergebnis spricht gegen die
These, dass auch das Epitop von MA695 Neuraminsäure-abhängig ist.
Zusammenfassend verdeutlichen die Ergebnisse, dass neben der unterschiedlichen Feinspezifität der monoklonalen Antikörper auch das Glykosylierungsprofil von MUC1 einen
großen Einfluss auf die Antigenität des MUC1-Moleküls hat. In Bezug auf immunhistologische Studien, die ihren Fokus auf die Korrelation zwischen Antigen-Expression und
histopathologischen Subtypen, Tumorprogression und Prognose haben, kann die Auswahl der
MUC1 spezifischen monoklonalen Antikörper das Ergebnis entscheidend beeinflussen.
88
Literaturverzeichnis
6 Literaturverzeichnis
___________________________________________________________________________
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
Efficacy of adjuvant fluorouracil and folinic acid in colon cancer. International
Multicentre Pooled Analysis of Colon Cancer Trials (IMPACT) investigators. Lancet,
1995. 345: 939-944.
Cancer incidence in five continents. Volume IX. IARC Sci Publ, 2008: 1-837.
Cancer, Facts and Figures 2009. Herausgeber: American Cancer Society, 2009: 1213.
Ahlquist, D.A., Skoletsky, J.E., Boynton, K.A., Harrington, J.J., Mahoney, D.W.,
Pierceall, W.E., Thibodeau, S.N., Shuber, A.P., Colorectal cancer screening by
detection of altered human DNA in stool: feasibility of a multitarget assay panel.
Gastroenterology, 2000. 119: 1219-1227.
Ahmed, F.E., Effect of diet, life style, and other environmental/chemopreventive
factors on colorectal cancer development, and assessment of the risks. J Environ Sci
Health C Environ Carcinog Ecotoxicol Rev, 2004. 22: 91-147.
Ajioka, Y., Allison, L.J., Jass, J.R., Significance of MUC1 and MUC2 mucin
expression in colorectal cancer. J Clin Pathol, 1996. 49: 560-564.
Aksoy, N., Akinci, O.F., Mucin macromolecules in normal, adenomatous, and
carcinomatous colon: evidence for the neotransformation. Macromol Biosci, 2004. 4:
483-496.
Alexander, J., Watanabe, T., Wu, T.T., Rashid, A., Li, S., Hamilton, S.R.,
Histopathological identification of colon cancer with microsatellite instability. Am J
Pathol, 2001. 158: 527-535.
Allen, A., Flemstrom, G., Garner, A., Kivilaakso, E., Gastroduodenal mucosal
protection. Physiol Rev, 1993. 73: 823-857.
Allen, A., Hutton, D.A., Leonard, A.J., Pearson, J.P., Sellers, L.A., The role of mucus
in the protection of the gastroduodenal mucosa. Scand J Gastroenterol Suppl, 1986.
125: 71-78.
Allen, A., Hutton, D.A., Pearson, J.P., The MUC2 gene product: a human intestinal
mucin. Int J Biochem Cell Biol, 1998. 30: 797-801.
Andre, T., Boni, C., Mounedji-Boudiaf, L., Navarro, M., Tabernero, J., Hickish, T.,
Topham, C., Zaninelli, M., Clingan, P., Bridgewater, J., Tabah-Fisch, I., de Gramont,
A., Oxaliplatin, fluorouracil, and leucovorin as adjuvant treatment for colon cancer.
N Engl J Med, 2004. 350: 2343-2351.
Andrews, C.W., Jr., Jessup, J.M., Goldman, H., Hayes, D.F., Kufe, D.W., O'Hara,
C.J., Steele, G.D., Jr., Localization of tumor-associated glycoprotein DF3 in normal,
inflammatory, and neoplastic lesions of the colon. Cancer, 1993. 72: 3185-3190.
Andrieu, N., Launoy, G., Guillois, R., Ory-Paoletti, C., Gignoux, M., Familial relative
risk of colorectal cancer: a population-based study. Eur J Cancer, 2003. 39: 19041911.
Ashwell, G., Morell, A.G., The role of surface carbohydrates in the hepatic
recognition and transport of circulating glycoproteins. Adv Enzymol Relat Areas Mol
Biol, 1974. 41: 99-128.
Atkinson, B.F., Ernst, C.S., Herlyn, M., Steplewski, Z., Sears, H.F., Koprowski, H.,
Gastrointestinal cancer-associated antigen in immunoperoxidase assay. Cancer Res,
1982. 42: 4820-4823.
Audie, J.P., Janin, A., Porchet, N., Copin, M.C., Gosselin, B., Aubert, J.P., Expression
of human mucin genes in respiratory, digestive, and reproductive tracts ascertained
by in situ hybridization. J Histochem Cytochem, 1993. 41: 1479-1485.
Literaturverzeichnis
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
89
Baba, S., Recent advances in molecular genetics of colorectal cancer. World J Surg,
1997. 21: 678-687.
Baeckstrom, D., Nilsson, O., Price, M.R., Lindholm, L., Hansson, G.C.,
Discrimination of MUC1 mucins from other sialyl-Le(a)-carrying glycoproteins
produced by colon carcinoma cells using a novel monoclonal antibody. Cancer Res,
1993. 53: 755-761.
Baldus, S.E., Klinisch-pathologische und molekulare Prognosefaktoren kolorektaler
Karzinome. Pathologe, 2003. 24: 49-60.
Baldus, S.E., Engelmann, K., Hanisch, F.G., MUC1 and the MUCs: a family of human
mucins with impact in cancer biology. Crit Rev Clin Lab Sci, 2004. 41: 189-231.
Baldus, S.E., Goergen, D., Hanisch, F.G., Dienes, H.P., Epitope-dependent differential
immunoreactivities of anti-MUC1 monoclonal antibodies in human carcinomas. Int J
Oncol, 2001. 18: 507-512.
Baldus, S.E., Hanisch, F.G., Muzinassoziierte Antigene als Marker gastrointestinaler
Differenzierung und Karzinogenese. Pathologe, 1995. 16: 94-105.
Baldus, S.E., Hanisch, F.G., Biochemistry and pathological importance of mucinassociated antigens in gastrointestinal neoplasia. Adv Cancer Res, 2000. 79: 201-248.
Baldus, S.E., Hanisch, F.G., Kotlarek, G.M., Zirbes, T.K., Thiele, J., Isenberg, J.,
Karsten, U.R., Devine, P.L., Dienes, H.P., Coexpression of MUC1 mucin peptide core
and the Thomsen-Friedenreich antigen in colorectal neoplasms. Cancer, 1998. 82:
1019-1027.
Baldus, S.E., Hanisch, F.G., Putz, C., Flucke, U., Monig, S.P., Schneider, P.M.,
Thiele, J., Holscher, A.H., Dienes, H.P., Immunoreactivity of Lewis blood group and
mucin peptide core antigens: correlations with grade of dysplasia and malignant
transformation in the colorectal adenoma-carcinoma sequence. Histol Histopathol,
2002. 17: 191-198.
Baldus, S.E., Monig, S.P., Hanisch, F.G., Zirbes, T.K., Flucke, U., Oelert, S., Zilkens,
G., Madejczik, B., Thiele, J., Schneider, P.M., Holscher, A.H., Dienes, H.P.,
Comparative evaluation of the prognostic value of MUC1, MUC2, sialyl-Lewis(a) and
sialyl-Lewis(x) antigens in colorectal adenocarcinoma. Histopathology, 2002. 40:
440-449.
Baldus, S.E., Wienand, J.R., Werner, J.P., Landsberg, S., Drebber, U., Hanisch, F.G.,
Dienes, H.P., Expression of MUC1, MUC2 and oligosaccharide epitopes in breast
cancer: prognostic significance of a sialylated MUC1 epitope. Int J Oncol, 2005. 27:
1289-1297.
Bara, J., Decaens, C., Loridon-Rosa, B., Oriol, R., Immunohistological
characterization of mucin epitopes by pre-treatment of gastro-intestinal sections with
periodic acid. J Immunol Methods, 1992. 149: 105-113.
Bara, J., Mollicone, R., Herrero-Zabaleta, E., Gautier, R., Daher, N., Oriol, R., Ectopic
expression of the Y (Ley) antigen defined by monoclonal antibody 12-4LE in distal
colonic adenocarcinomas. Int J Cancer, 1988. 41: 683-689.
Bartman, A.E., Sanderson, S.J., Ewing, S.L., Niehans, G.A., Wiehr, C.L., Evans,
M.K., Ho, S.B., Aberrant expression of MUC5AC and MUC6 gastric mucin genes in
colorectal polyps. Int J Cancer, 1999. 80: 210-218.
Baruch, A., Hartmann, M., Yoeli, M., Adereth, Y., Greenstein, S., Stadler, Y.,
Skornik, Y., Zaretsky, J., Smorodinsky, N.I., Keydar, I., Wreschner, D.H., The breast
cancer-associated MUC1 gene generates both a receptor and its cognate binding
protein. Cancer Res, 1999. 59: 1552-1561.
Batzler, W.U., Giersiepen, K., Hentschel, S., Husmann, G., Kaatsch, P., Katalinic, A.,
Kieschke, J., Kraywinkel, K., Meyer, M., Stabenow, R., Stegmaier, C., Bertz, J.,
Haberland, J., Wolf, U., Krebs in Deutschland 2003-2004-Häufigkeiten und Trends.
90
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
Literaturverzeichnis
Herausgeber: Robert Koch-Institut in Zusammenarbeit mit der Gesellschaft der
epidemiologischen Krebsregister in Deutschland e. V., 2008. 6: 34-37.
Benson, A.B., 3rd, Schrag, D., Somerfield, M.R., Cohen, A.M., Figueredo, A.T.,
Flynn, P.J., Krzyzanowska, M.K., Maroun, J., McAllister, P., Van Cutsem, E.,
Brouwers, M., Charette, M., Haller, D.G., American Society of Clinical Oncology
recommendations on adjuvant chemotherapy for stage II colon cancer. J Clin Oncol,
2004. 22: 3408-3419.
Bernstein, C.N., Blanchard, J.F., Kliewer, E., Wajda, A., Cancer risk in patients with
inflammatory bowel disease: a population-based study. Cancer, 2001. 91: 854-862.
Berry, N., Jones, D.B., Smallwood, J., Taylor, I., Kirkham, N., Taylor-Papadimitriou,
J., The prognostic value of the monoclonal antibodies HMFG1 and HMFG2 in breast
cancer. Br J Cancer, 1985. 51: 179-186.
Biemer-Hüttmann, A.-E., Mucin Core Protein Expression in Colorectal Cancers with
High Levels of Microsatellite Instability Indicates a Novel Pathway of Morphogenesis.
Clinical Cancer Research, 2000. Vol. 6: 1909-1916.
Bingham, S.A., Day, N.E., Luben, R., Ferrari, P., Slimani, N., Norat, T., ClavelChapelon, F., Kesse, E., Nieters, A., Boeing, H., Tjonneland, A., Overvad, K.,
Martinez, C., Dorronsoro, M., Gonzalez, C.A., Key, T.J., Trichopoulou, A., Naska, A.,
Vineis, P., Tumino, R., Krogh, V., Bueno-de-Mesquita, H.B., Peeters, P.H., Berglund,
G., Hallmans, G., Lund, E., Skeie, G., Kaaks, R., Riboli, E., Dietary fibre in food and
protection against colorectal cancer in the European Prospective Investigation into
Cancer and Nutrition (EPIC): an observational study. Lancet, 2003. 361: 1496-1501.
Blank, M., Klussmann, E., Kruger-Krasagakes, S., Schmitt-Graff, A., Stolte, M.,
Bornhoeft, G., Stein, H., Xing, P.X., McKenzie, I.F., Verstijnen, C.P., Expression of
MUC2-mucin in colorectal adenomas and carcinomas of different histological types.
Int J Cancer, 1994. 59: 301-306.
Bodmer, W.F., Cancer genetics: colorectal cancer as a model. J Hum Genet, 2006.
51: 391-396.
Boese-Landgraf, J., Epidemiologie, Vorstufen und Pathogenese des kolorektalen
Karzinoms. Der Onkologe, 1998. 4: 2.
Bokey, E.L., Ojerskog, B., Chapuis, P.H., Dent, O.F., Newland, R.C., Sinclair, G.,
Local recurrence after curative excision of the rectum for cancer without adjuvant
therapy: role of total anatomical dissection. Br J Surg, 1999. 86: 1164-1170.
Boland, C.R., Montgomery, C.K., Kim, Y.S., Alterations in human colonic mucin
occurring with cellular differentiation and malignant transformation. Proc Natl Acad
Sci U S A, 1982. 79: 2051-2055.
Bombi, J.A., Polyps of the colon in Barcelona, Spain. An autopsy study. Cancer, 1988.
61: 1472-1476.
Bongaerts, B.W., de Goeij, A.F., de Vogel, S., van den Brandt, P.A., Goldbohm, R.A.,
Weijenberg, M.P., Alcohol consumption and distinct molecular pathways to colorectal
cancer. Br J Nutr, 2007. 97: 430-434.
Brabletz, T., Herrmann, K., Jung, A., Faller, G., Kirchner, T., Expression of nuclear
beta-catenin and c-myc is correlated with tumor size but not with proliferative activity
of colorectal adenomas. Am J Pathol, 2000. 156: 865-870.
Brenner, H., Arndt, V., Sturmer, T., Stegmaier, C., Ziegler, H., Dhom, G., Longlasting reduction of risk of colorectal cancer following screening endoscopy. Br J
Cancer, 2001. 85: 972-976.
Bresalier, R.S., Ho, S.B., Schoeppner, H.L., Kim, Y.S., Sleisenger, M.H., Brodt, P.,
Byrd, J.C., Enhanced sialylation of mucin-associated carbohydrate structures in
human colon cancer metastasis. Gastroenterology, 1996. 110: 1354-1367.
Literaturverzeichnis
49.
50.
51.
52.
53.
54.
55.
56.
57.
58.
59.
60.
61.
62.
63.
64.
91
Brockhausen, I., Mucin-type O-glycans in human colon and breast cancer:
glycodynamics and functions. EMBO Rep, 2006. 7: 599-604.
Brockhausen, I., Romero, P.A., Herscovics, A., Glycosyltransferase changes upon
differentiation of CaCo-2 human colonic adenocarcinoma cells. Cancer Res, 1991. 51:
3136-3142.
Brown, A., Ellis, I.O., Embleton, M.J., Baldwin, R.W., Turner, D.R., Hardcastle, J.D.,
Immunohistochemical localization of Y hapten and the structurally related H type-2
blood-group antigen on large-bowel tumours and normal adult tissues. Int J Cancer,
1984. 33: 727-736.
Bubb, V.J., Curtis, L.J., Cunningham, C., Dunlop, M.G., Carothers, A.D., Morris,
R.G., White, S., Bird, C.C., Wyllie, A.H., Microsatellite instability and the role of
hMSH2 in sporadic colorectalcancer. Oncogene, 1996. 12: 2641-2649.
Burchell, J., Taylor-Papadimitriou, J., Effect of modification of carbohydrate side
chains on the reactivity of antibodies with core-protein epitopes of the MUC1 gene
product. Epithelial Cell Biol, 1993. 2: 155-162.
Burchill, S.A., The tumour suppressor APC gene product is associated with cell
adhesion. Bioessays, 1994. 16: 225-227.
Byrd, J.C., Bresalier, R.S., Mucins and mucin binding proteins in colorectal cancer.
Cancer Metastasis Rev, 2004. 23: 77-99.
Camma, C., Giunta, M., Fiorica, F., Pagliaro, L., Craxi, A., Cottone, M., Preoperative
radiotherapy for resectable rectal cancer: A meta-analysis. Jama, 2000. 284: 10081015.
Campbell, B.J., Finnie, I.A., Hounsell, E.F., Rhodes, J.M., Direct demonstration of
increased expression of Thomsen-Friedenreich (TF) antigen in colonic
adenocarcinoma and ulcerative colitis mucin and its concealment in normal mucin. J
Clin Invest, 1995. 95: 571-576.
Campo, E., Condom, E., Palacin, A., Quesada, E., Cardesa, A., Lectin binding
patterns in normal and neoplastic colonic mucosa. A study of Dolichos biflorus
agglutinin, peanut agglutinin, and wheat germ agglutinin. Dis Colon Rectum, 1988.
31: 892-899.
Cao, Y., Blohm, D., Ghadimi, B.M., Stosiek, P., Xing, P.X., Karsten, U., Mucins
(MUC1 and MUC3) of gastrointestinal and breast epithelia reveal different and
heterogeneous tumor-associated aberrations in glycosylation. J Histochem Cytochem,
1997. 45: 1547-1557.
Cao, Y., Karsten, U., Binding patterns of 51 monoclonal antibodies to peptide and
carbohydrate epitopes of the epithelial mucin (MUC1) on tissue sections of
adenolymphomas of the parotid (Warthin's tumours): role of epitope masking by
glycans. Histochem Cell Biol, 2001. 115: 349-356.
Cao, Y., Karsten, U.R., Liebrich, W., Haensch, W., Springer, G.F., Schlag, P.M.,
Expression of Thomsen-Friedenreich-related antigens in primary and metastatic
colorectal carcinomas. A reevaluation. Cancer, 1995. 76: 1700-1708.
Cao, Y., Schlag, P.M., Karsten, U., Immunodetection of epithelial mucin (MUC1,
MUC3) and mucin-associated glycotopes (TF, Tn, and sialosyl-Tn) in benign and
malignant lesions of colonic epithelium: apolar localization corresponds to malignant
transformation. Virchows Arch, 1997. 431: 159-166.
Carrato, C., Balague, C., de Bolos, C., Gonzalez, E., Gambus, G., Planas, J., Perini,
J.M., Andreu, D., Real, F.X., Differential apomucin expression in normal and
neoplastic human gastrointestinal tissues. Gastroenterology, 1994. 107: 160-172.
Ceriani, R.L., Geradts, J., Peterson, J.A., Second international workshop on
monoclonal antibodies and breast cancer. San Francisco, November 20-21, 1986.
Breast Cancer Res Treat, 1987. 10: 55-63.
92
65.
66.
67.
68.
69.
70.
71.
72.
73.
74.
75.
76.
77.
78.
79.
80.
81.
82.
Literaturverzeichnis
Chan, A.T., Giovannucci, E.L., Schernhammer, E.S., Colditz, G.A., Hunter, D.J.,
Willett, W.C., Fuchs, C.S., A prospective study of aspirin use and the risk for
colorectal adenoma. Ann Intern Med, 2004. 140: 157-166.
Chang, S.K., Dohrman, A.F., Basbaum, C.B., Ho, S.B., Tsuda, T., Toribara, N.W.,
Gum, J.R., Kim, Y.S., Localization of mucin (MUC2 and MUC3) messenger RNA and
peptide expression in human normal intestine and colon cancer. Gastroenterology,
1994. 107: 28-36.
Chao, A., Thun, M.J., Jacobs, E.J., Henley, S.J., Rodriguez, C., Calle, E.E., Cigarette
smoking and colorectal cancer mortality in the cancer prevention study II. J Natl
Cancer Inst, 2000. 92: 1888-1896.
Chapman, M.A., Buckley, D., Henson, D.B., Armitage, N.C., Preoperative
carcinoembryonic antigen is related to tumour stage and long-term survival in
colorectal cancer. Br J Cancer, 1998. 78: 1346-1349.
Citarda, F., Tomaselli, G., Capocaccia, R., Barcherini, S., Crespi, M., Efficacy in
standard clinical practice of colonoscopic polypectomy in reducing colorectal cancer
incidence. Gut, 2001. 48: 812-815.
Compton, C.C., Pathology report in colon cancer: what is prognostically important?
Dig Dis, 1999. 17: 67-79.
Connell, W.R., Talbot, I.C., Harpaz, N., Britto, N., Wilkinson, K.H., Kamm, M.A.,
Lennard-Jones, J.E., Clinicopathological characteristics of colorectal carcinoma
complicating ulcerative colitis. Gut, 1994. 35: 1419-1423.
Cooper, H.S., Peanut lectin-binding sites in large bowel carcinoma. Lab Invest, 1982.
47: 383-390.
Cooper, H.S., Cox, J., Patchefsky, A.S., Immunohistologic study of blood group
substances in polyps of the distal colon. Expression of a fetal antigen. Am J Clin
Pathol, 1980. 73: 345-350.
Corfield, A.P., Carroll, D., Myerscough, N., Probert, C.S., Mucins in the
gastrointestinal tract in health and disease. Front Biosci, 2001. 6: 1321-1357.
Corfield, A.P., Myerscough, N., Gough, M., Brockhausen, I., Schauer, R., Paraskeva,
C., Glycosylation patterns of mucins in colonic disease. Biochem Soc Trans, 1995. 23:
840-845.
Corfield, A.P., Myerscough, N., Warren, B.F., Durdey, P., Paraskeva, C., Schauer, R.,
Reduction of sialic acid O-acetylation in human colonic mucins in the adenomacarcinoma sequence. Glycoconj J, 1999. 16: 307-317.
Cornberg, M., Differenzielle Muzinexpression im Gastrointestinaltrakt. 2000.
Cruz-Correra, M., Giradiello, FM., Diagnosis and management of hereditary colon
cancer. Gastroenterol Clin North Am, 2002. 31: 537-549.
Cubas, R., Li, M., Chen, C., Yao, Q., Colorectal cancer: new advances in
immunotherapy. Cancer Biol Ther, 2007. 6: 11-17.
Dahiya, R., Itzkowitz, S.H., Byrd, J.C., Kim, Y.S., Mucin oligosaccharide
biosynthesis in human colonic cancerous tissues and cell lines. Cancer, 1992. 70:
1467-1476.
Dai, J., Allard, W.J., Davis, G., Yeung, K.K., Effect of desialylation on binding,
affinity, and specificity of 56 monoclonal antibodies against MUC1 mucin. Tumour
Biol, 1998. 19 Suppl 1: 100-110.
David, L., Leitao, D., Sobrinho-Simoes, M., Bennett, E.P., White, T., Mandel, U.,
Dabelsteen, E., Clausen, H., Biosynthetic basis of incompatible histo-blood group A
antigen expression: anti-A transferase antibodies reactive with gastric cancer tissue of
type O individuals. Cancer Res, 1993. 53: 5494-5500.
Literaturverzeichnis
83.
84.
85.
86.
87.
88.
89.
90.
91.
92.
93.
94.
95.
96.
97.
98.
99.
100.
93
Denk, H., Tappeiner, G., Davidovits, A., Eckerstorfer, R., Holzner, J.H.,
Carcinoembryonic antigen and blood group substances in carcinomas of the stomach
and colon. J Natl Cancer Inst, 1974. 53: 933-942.
Deutsche-Krebsgesellschaft,
Kolonkarzinom-Interdisziplinäre
Leitlinien.
Coloproctology, 2000. 22: 145.
Devine, P.L., McGuckin, M.A., Ward, B.G., Circulating mucins as tumor markers in
ovarian cancer (review). Anticancer Res, 1992. 12: 709-717.
Dong, S.M., Traverso, G., Johnson, C., Geng, L., Favis, R., Boynton, K., Hibi, K.,
Goodman, S.N., D'Allessio, M., Paty, P., Hamilton, S.R., Sidransky, D., Barany, F.,
Levin, B., Shuber, A., Kinzler, K.W., Vogelstein, B., Jen, J., Detecting colorectal
cancer in stool with the use of multiple genetic targets. J Natl Cancer Inst, 2001. 93:
858-865.
Dong, Y., Walsh, M.D., Cummings, M.C., Wright, R.G., Khoo, S.K., Parsons, P.G.,
McGuckin, M.A., Expression of MUC1 and MUC2 mucins in epithelial ovarian
tumours. J Pathol, 1997. 183: 311-317.
Duffy, M.J., Carcinoembryonic antigen as a marker for colorectal cancer: is it
clinically useful? Clin Chem, 2001. 47: 624-630.
Duncan, T.J., Watson, N.F., Al-Attar, A.H., Scholefield, J.H., Durrant, L.G., The role
of MUC1 and MUC3 in the biology and prognosis of colorectal cancer. World J Surg
Oncol, 2007. 5: 31.
Ekbom, A., Helmick, C., Zack, M., Adami, H.O., Increased risk of large-bowel
cancer in Crohn's disease with colonic involvement. Lancet, 1990. 336: 357-359.
Ernst, C., Atkinson, B., Wysocka, M., Blaszczyk, M., Herlyn, M., Sears, H.,
Steplewski, Z., Koprowski, H., Monoclonal antibody localization of Lewis antigens in
fixed tissue. Lab Invest, 1984. 50: 394-400.
Eskelinen, M., Tikanoja, S., Valkamo, E., Loikkanen, M., Collan, Y., Cancerassociated antigen CA 15-3 in the diagnostics of breast tumours. Scand J Clin Lab
Invest, 1988. 48: 653-658.
Fearon, E.R., Vogelstein, B., A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell, 1990.
61: 759-767.
Figueredo, A., Germond, C., Maroun, J., Browman, G., Walker-Dilks, C., Wong, S.,
Adjuvant therapy for stage II colon cancer after complete resection. Provincial
Gastrointestinal Disease Site Group. Cancer Prev Control, 1997. 1: 379-392.
Finn, O.J., Jerome, K.R., Henderson, R.A., Pecher, G., Domenech, N., MagarianBlander, J., Barratt-Boyes, S.M., MUC-1 epithelial tumor mucin-based immunity and
cancer vaccines. Immunol Rev, 1995. 145: 61-89.
Fodde, R., The APC gene in colorectal cancer. Eur J Cancer, 2002. 38: 867-871.
Folprecht, G., Lutz, M.P., Schoffski, P., Seufferlein, T., Nolting, A., Pollert, P.,
Kohne, C.H., Cetuximab and irinotecan/5-fluorouracil/folinic acid is a safe
combination for the first-line treatment of patients with epidermal growth factor
receptor expressing metastatic colorectal carcinoma. Ann Oncol, 2006. 17: 450-6.
Friedenreich, C.M., Orenstein, M.R., Physical activity and cancer prevention:
etiologic evidence and biological mechanisms. J Nutr, 2002. 132: 3456-3464.
Fung, T., Hu, F.B., Fuchs, C., Giovannucci, E., Hunter, D.J., Stampfer, M.J., Colditz,
G.A., Willett, W.C., Major dietary patterns and the risk of colorectal cancer in
women. Arch Intern Med, 2003. 163: 309-314.
Gafa, R., Maestri, I., Matteuzzi, M., Santini, A., Ferretti, S., Cavazzini, L., Lanza, G.,
Sporadic colorectal adenocarcinomas with high-frequency microsatellite instability.
Cancer, 2000. 89: 2025-2037.
94
101.
102.
103.
104.
105.
106.
107.
108.
109.
110.
111.
112.
113.
114.
115.
116.
117.
118.
Literaturverzeichnis
Gendler, S., Taylor-Papadimitriou, J., Duhig, T., Rothbard, J., Burchell, J., A highly
immunogenic region of a human polymorphic epithelial mucin expressed by
carcinomas is made up of tandem repeats. J Biol Chem, 1988. 263: 12820-12823.
Gendler, S.J., MUC1, the renaissance molecule. J Mammary Gland Biol Neoplasia,
2001. 6: 339-353.
Gendler, S.J., Lancaster, C.A., Taylor-Papadimitriou, J., Duhig, T., Peat, N., Burchell,
J., Pemberton, L., Lalani, E.N., Wilson, D., Molecular cloning and expression of
human tumor-associated polymorphic epithelial mucin. J Biol Chem, 1990. 265:
15286-15293.
Giacosa, A., Frascio, F., Munizzi, F., Epidemiology of colorectal polyps. Tech
Coloproctol, 2004. 8: 243-247.
Giorno, R., A comparison of two immunoperoxidase staining methods based on the
avidin-biotin interaction. Diagn Immunol, 1984. 2: 161-166.
Giovannucci, E., Modifiable risk factors for colon cancer. Gastroenterol Clin North
Am, 2002. 31: 925-943.
Giovannucci, E., Diet, body weight, and colorectal cancer: a summary of the
epidemiologic evidence. J Womens Health (Larchmt), 2003. 12: 173-182.
Girling, A., Bartkova, J., Burchell, J., Gendler, S., Gillett, C., Taylor-Papadimitriou,
J., A core protein epitope of the polymorphic epithelial mucin detected by the
monoclonal antibody SM-3 is selectively exposed in a range of primary carcinomas.
Int J Cancer, 1989. 43: 1072-1076.
Grizzle, W.E., Manne, U., Jhala, N.C., Weiss, H.L., Molecular characterization of
colorectal neoplasia in translational research. Arch Pathol Lab Med, 2001. 125: 9198.
Gruenberger, B., Tamandl, D., Schueller, J., Scheithauer, W., Zielinski, C., Herbst, F.,
Gruenberger, T., Bevacizumab, capecitabine, and oxaliplatin as neoadjuvant therapy
for patients with potentially curable metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol, 2008.
26: 1830-5.
Gryfe, R., Swallow, C., Bapat, B., Redston, M., Gallinger, S., Couture, J., Molecular
biology of colorectal cancer. Curr Probl Cancer, 1997. 21: 233-300.
Guddo, F., Giatromanolaki, A., Patriarca, C., Hilkens, J., Reina, C., Alfano, R.M.,
Vignola, A.M., Koukourakis, M.I., Gambacorta, M., Pruneri, G., Coggi, G.,
Bonsignore, G., Depolarized expression of episialin (EMA, MUC1) in lung
adenocarcinoma is associated with tumor progression. Anticancer Res, 1998. 18:
1915-1920.
Hahn, M., Koufaki, O.N., Schackert, H.K., Molecular biology of colorectal cancer
and clinical consequences for colorectal cancer syndromes. Langenbecks Arch Surg,
1998. 383: 389-396.
Haier, J., Nasralla, M., Nicolson, G.L., Cell surface molecules and their prognostic
values in assessing colorectal carcinomas. Ann Surg, 2000. 231: 11-24.
Hamelin, R., Laurent-Puig, P., Olschwang, S., Jego, N., Asselain, B., Remvikos, Y.,
Girodet, J., Salmon, R.J., Thomas, G., Association of p53 mutations with short
survival in colorectal cancer. Gastroenterology, 1994. 106: 42-48.
Hanisch, F.G., Specificity clusters of MUC1-reactive mouse monoclonal antibodies.
Tumour Biol, 1998. 19 111-117.
Hanisch, F.G., Baldus, S.E., The Thomsen-Friedenreich (TF) antigen: a critical
review on the structural, biosynthetic and histochemical aspects of a pancarcinomaassociated antigen. Histol Histopathol, 1997. 12: 263-281.
Hanisch, F.G., Muller, S., MUC1: the polymorphic appearance of a human mucin.
Glycobiology, 2000. 10: 439-449.
Literaturverzeichnis
119.
120.
121.
122.
123.
124.
125.
126.
127.
128.
129.
130.
131.
132.
133.
134.
135.
136.
137.
95
Hanisch, F.G., Peter-Katalinic, J., Egge, H., Dabrowski, U., Uhlenbruck, G.,
Structures of acidic O-linked polylactosaminoglycans on human skim milk mucins.
Glycoconj J, 1990. 7: 525-543.
Hanisch, F.G., Stadie, T.R., Deutzmann, F., Peter-Katalinic, J., MUC1 glycoforms in
breast cancer-cell line T47D as a model for carcinoma-associated alterations of 0glycosylation. Eur J Biochem, 1996. 236: 318-327.
Hanisch, F.G., Uhlenbruck, G., Peter-Katalinic, J., Egge, H., Dabrowski, J.,
Dabrowski, U., Structures of neutral O-linked polylactosaminoglycans on human skim
milk mucins. A novel type of linearly extended poly-N-acetyllactosamine backbones
with Gal beta(1-4)GlcNAc beta(1-6) repeating units. J Biol Chem, 1989. 264: 872883.
Hanski, C., Is mucinous carcinoma of the colorectum a distinct genetic entity? Br J
Cancer, 1995. 72: 1350-1356.
Hanski, C., Bornhoeft, G., Topf, N., Hermann, U., Stein, H., Riecken, E.O., Detection
of a mucin marker for the adenoma-carcinoma sequence inhuman colonic mucosa by
monoclonal antibody AM-3. J Clin Pathol, 1990. 43: 379-384.
Hatfield, P., Sebag-Montefiore, D., The use of radiotherapy in rectal cancer. Scand J
Surg, 2003. 92: 65-73.
Hauser, H., Das kolorektale Karzinom-Epidemiologie, Präkanzerosen, Primär- und
Sekundärprävention. J Gastroenterol 2004. 2: 6.
Hayes, D.F., Zurawski, V.R., Jr., Kufe, D.W., Comparison of circulating CA15-3 and
carcinoembryonic antigen levels in patients with breast cancer. J Clin Oncol, 1986. 4:
1542-1550.
Heavey, P.M., McKenna, D., Rowland, I.R., Colorectal cancer and the relationship
between genes and the environment. Nutr Cancer, 2004. 48: 124-141.
Hecht, J.R., Patnaik, A., Berlin, J., Venook, A., Malik, I., Tchekmedyian, S., Navale,
L., Amado, R.G., Meropol, N.J., Panitumumab monotherapy in patients with
previously treated metastatic colorectal cancer. Cancer, 2007. 110: 980-8.
Hermanek, P., Methodik der histopathologischen Untersuchung von Resektionen
kolorektaler Karzinome. Chir Gastroenterol, 2000. 16: 255-259.
Hermanek, P., Mansmann, U., Staimmer, D.S., Riedl, S., Hermanek, P., The German
experience: the surgeon as a prognostic factor in colon and rectal cancer surgery.
Surg Oncol Clin N Am, 2000. 9: 33-49.
Hilkens, J., Ligtenberg, M.J., Vos, H.L., Litvinov, S.V., Cell membrane-associated
mucins and their adhesion-modulating property. Trends Biochem Sci, 1992. 17: 359363.
Hilkens, J., Wesseling, J., Vos, H.L., Storm, J., Boer, B., van der Valk, S.W., Maas,
M.C., Involvement of the cell surface-bound mucin, episialin/MUC1, in progression of
human carcinomas. Biochem Soc Trans, 1995. 23: 822-826.
Hiraga, Y., Tanaka, S., Haruma, K., Yoshihara, M., Sumii, K., Kajiyama, G.,
Shimamoto, F., Kohno, N., Immunoreactive MUC1 expression at the deepest invasive
portion correlates with prognosis of colorectal cancer. Oncology, 1998. 55: 307-319.
Ho, J.J., Cheng, S., Kim, Y.S., Access to peptide regions of a surface mucin (MUC1)
is reduced by sialic acids. Biochem Biophys Res Commun, 1995. 210: 866-873.
Ho, S.B., Ewing, S.L., Montgomery, C.K., Kim, Y.S., Altered mucin core peptide
immunoreactivity in the colon polyp-carcinoma sequence. Oncol Res, 1996. 8: 53-61.
Ho, S.B., Niehans, G.A., Lyftogt, C., Yan, P.S., Cherwitz, D.L., Gum, E.T., Dahiya,
R., Kim, Y.S., Heterogeneity of mucin gene expression in normal and neoplastic
tissues. Cancer Res, 1993. 53: 641-651.
Hollingsworth, M.A., Swanson, B.J., Mucins in cancer: protection and control of the
cell surface. Nat Rev Cancer, 2004. 4: 45-60.
96
138.
139.
140.
141.
142.
143.
144.
145.
146.
147.
148.
149.
150.
151.
152.
153.
154.
155.
Literaturverzeichnis
Hong, J.C., Kim, Y.S., Alkali-catalyzed beta-elimination of periodate-oxidized
glycans: a novel method of chemical deglycosylation of mucin gene products in
paraffin embedded sections. Glycoconj J, 2000. 17: 691-703.
Houlston, R.S., What we could do now: molecular pathology of colorectal cancer.
Mol Pathol, 2001. 54: 206-214.
Hounsell, E.F., Lawson, A.M., Stoll, M.S., Kane, D.P., Cashmore, G.C., Carruthers,
R.A., Feeney, J., Feizi, T., Characterisation by mass spectrometry and 500-MHz
proton nuclear magnetic resonance spectroscopy of penta- and hexasaccharide chains
of human foetal gastrointestinal mucins (meconium glycoproteins). Eur J Biochem,
1989. 186: 597-610.
Hsu, S.M., Raine, L., Fanger, H., A comparative study of the peroxidaseantiperoxidase method and an avidin-biotin complex method for studying polypeptide
hormones with radioimmunoassay antibodies. Am J Clin Pathol, 1981. 75: 734-738.
Hull, S.R., Bright, A., Carraway, K.L., Abe, M., Hayes, D.F., Kufe, D.W.,
Oligosaccharide differences in the DF3 sialomucin antigen from normal human milk
and the BT-20 human breast carcinoma cell line. Cancer Commun, 1989. 1: 261-267.
Hulsken, J., Behrens, J., Birchmeier, W., Tumor-suppressor gene products in cell
contacts: the cadherin-APC-armadillo connection. Curr Opin Cell Biol, 1994. 6: 711716.
Hulsken, J., Birchmeier, W., Behrens, J., E-cadherin and APC compete for the
interaction with beta-catenin and the cytoskeleton. J Cell Biol, 1994. 127: 2061-2069.
Itzkowitz, S.H., Bloom, E.J., Kokal, W.A., Modin, G., Hakomori, S., Kim, Y.S.,
Sialosyl-Tn. A novel mucin antigen associated with prognosis in colorectal cancer
patients. Cancer, 1990. 66: 1960-1966.
Itzkowitz, S.H., Bloom, E.J., Lau, T.S., Kim, Y.S., Mucin associated Tn and sialosylTn antigen expression in colorectal polyps. Gut, 1992. 33: 518-523.
Itzkowitz, S.H., Yuan, M., Fukushi, Y., Palekar, A., Phelps, P.C., Shamsuddin, A.M.,
Trump, B.F., Hakomori, S., Kim, Y.S., Lewisx- and sialylated Lewisx-related antigen
expression in human malignant and nonmalignant colonic tissues. Cancer Res, 1986.
46: 2627-2632.
Itzkowitz, S.H., Yuan, M., Montgomery, C.K., Kjeldsen, T., Takahashi, H.K., Bigbee,
W.L., Kim, Y.S., Expression of Tn, sialosyl-Tn, and T antigens in human colon
cancer. Cancer Res, 1989. 49: 197-204.
Izbicki, J.R., Hosch, S.B., Knoefel, W.T., Passlick, B., Bloechle, C., Broelsch, C.E.,
Extended resections are beneficial for patients with locally advanced colorectal
cancer. Dis Colon Rectum, 1995. 38: 1251-1256.
Jass, J.R., Do, K.A., Simms, L.A., Iino, H., Wynter, C., Pillay, S.P., Searle, J.,
Radford-Smith, G., Young, J., Leggett, B., Morphology of sporadic colorectal cancer
with DNA replication errors. Gut, 1998. 42: 673-679.
Jass, J.R., Roberton, A.M., Colorectal mucin histochemistry in health and disease: a
critical review. Pathol Int, 1994. 44: 487-504.
Jass, J.R., Walsh, M.D., Altered mucin expression in the gastrointestinal tract: a
review. J Cell Mol Med, 2001. 5: 327-351.
Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Murray, T., Xu, J., Thun, M.J., Cancer statistics,
2007. CA Cancer J Clin, 2007. 57: 43-66.
Johns, L.E., Houlston, R.S., A systematic review and meta-analysis of familial
colorectal cancer risk. Am J Gastroenterol, 2001. 96: 2992-3003.
Jonker, D.J., O'Callaghan, C.J., Karapetis, C.S., Zalcberg, J.R., Tu, D., Au, H.J.,
Berry, S.R., Krahn, M., Price, T., Simes, R.J., Tebbutt, N.C., van Hazel, G.,
Wierzbicki, R., Langer, C., Moore, M.J., Cetuximab for the treatment of colorectal
cancer. N Engl J Med, 2007. 357: 2040-8.
Literaturverzeichnis
156.
157.
158.
159.
160.
161.
162.
163.
164.
165.
166.
167.
168.
169.
170.
171.
97
Kapadia, A., Feizi, T., Jewell, D., Keeling, J., Slavin, G., Immunocytochemical studies
of blood group A, H, I, and i antigens in gastric mucosae of infants with normal
gastric histology and of patients with gastric carcinoma and chronic benign peptic
ulceration. J Clin Pathol, 1981. 34: 320-337.
Kapiteijn, E., Marijnen, C.A., Nagtegaal, I.D., Putter, H., Steup, W.H., Wiggers, T.,
Rutten, H.J., Pahlman, L., Glimelius, B., van Krieken, J.H., Leer, J.W., van de Velde,
C.J., Preoperative radiotherapy combined with total mesorectal excision for
resectable rectal cancer. N Engl J Med, 2001. 345: 638-646.
Karner-Hanusch, J., Marian, B., Genderspezifische Aspekte bei kolorektalen Tumoren.
Wien Med Wochenschr, 2006. 156: 541-544.
Kemp, Z., Thirlwell, C., Sieber, O., Silver, A., Tomlinson, I., An update on the
genetics of colorectal cancer. Hum Mol Genet, 2004. 13: 177-185.
Kemperman, H., Wijnands, Y., Wesseling, J., Niessen, C.M., Sonnenberg, A., Roos,
E., The mucin epiglycanin on TA3/Ha carcinoma cells prevents alpha 6 beta 4mediated adhesion to laminin and kalinin and E-cadherin-mediated cell-cell
interaction. J Cell Biol, 1994. 127: 2071-2080.
Kesse, E., Clavel-Chapelon, F., Boutron-Ruault, M.C., Dietary patterns and risk of
colorectal tumors: a cohort of French women of the National Education System
(E3N). Am J Epidemiol, 2006. 164: 1085-1093.
Kinzler, K.W., Vogelstein, B., Lessons from hereditary colorectal cancer. Cell, 1996.
87: 159-170.
Kitamura, H., Yonezawa, S., Tanaka, S., Kim, Y.S., Sato, E., Expression of mucin
carbohydrates and core proteins in carcinomas of the ampulla of Vater: their
relationship to prognosis. Jpn J Cancer Res, 1996. 87: 631-640.
Klein, P.J., Osmers, R., Vierbuchen, M., Ortmann, M., Kania, J., Uhlenbruck, G., The
importance of lectin binding sites and carcinoembryonic antigen with regard to
normal, hyperplastic, adenomatous, and carcinomatous colonic mucosa. Recent
Results Cancer Res, 1981. 79: 1-9.
Klimpfinger, M., Hauser, H., Hermanek, P., Pathologie kolorektaler Präkanzerosen.
Chirurgische Gastroenterologie, 1992. 8: 16-19.
Kokawa, A., Kondo, H., Gotoda, T., Ono, H., Saito, D., Nakadaira, S., Kosuge, T.,
Yoshida, S., Increased expression of cyclooxygenase-2 in human pancreatic
neoplasms and potential for chemoprevention by cyclooxygenase inhibitors. Cancer,
2001. 91: 333-338.
Konings, E.J., Goldbohm, R.A., Brants, H.A., Saris, W.H., van den Brandt, P.A.,
Intake of dietary folate vitamers and risk of colorectal carcinoma: results from The
Netherlands Cohort Study. Cancer, 2002. 95: 1421-1433.
Kurosaka, A., Nakajima, H., Funakoshi, I., Matsuyama, M., Nagayo, T., Yamashina,
I., Structures of the major oligosaccharides from a human rectal adenocarcinoma
glycoprotein. J Biol Chem, 1983. 258: 11594-11598.
Lan, M.S., Batra, S.K., Qi, W.N., Metzgar, R.S., Hollingsworth, M.A., Cloning and
sequencing of a human pancreatic tumor mucin cDNA. J Biol Chem, 1990. 265:
15294-15299.
Langner, C., Ratschek, M., Rehak, P., Schips, L., Zigeuner, R., Expression of MUC1
(EMA) and E-cadherin in renal cell carcinoma: a systematic immunohistochemical
analysis of 188 cases. Mod Pathol, 2004. 17: 180-188.
Larena, A., Vierbuchen, M., Schroder, S., Larena-Avellaneda, A., Hadshiew, I.,
Fischer, R., Blutgruppenantigenexpression in papillaren Karzinomen der Schilddruse.
Eine immunhistochemische und klinische Studie uber das Vorkommen von Lewis-,
ABO- und verwandten Antigenen. Langenbecks Arch Chir, 1996. 381: 102-113.
98
172.
173.
174.
175.
176.
177.
178.
179.
180.
181.
182.
183.
184.
185.
186.
187.
188.
Literaturverzeichnis
Laurent-Puig, P., Blons, H., Cugnenc, P.H., Sequence of molecular genetic events in
colorectal tumorigenesis. Eur J Cancer Prev, 1999. 8: 39-47.
Le Voyer, T.E., Sigurdson, E.R., Hanlon, A.L., Mayer, R.J., Macdonald, J.S.,
Catalano, P.J., Haller, D.G., Colon cancer survival is associated with increasing
number of lymph nodes analyzed: a secondary survey of intergroup trial INT-0089. J
Clin Oncol, 2003. 21: 2912-2919.
Lee, I.M., Physical activity and cancer prevention-data from epidemiologic studies.
Med Sci Sports Exerc, 2003. 35: 1823-1827.
Li, A., Goto, M., Horinouchi, M., Tanaka, S., Imai, K., Kim, Y.S., Sato, E.,
Yonezawa, S., Expression of MUC1 and MUC2 mucins and relationship with cell
proliferative activity in human colorectal neoplasia. Pathol Int, 2001. 51: 853-860.
Ligtenberg, M.J., Buijs, F., Vos, H.L., Hilkens, J., Suppression of cellular aggregation
by high levels of episialin. Cancer Res, 1992. 52: 2318-2324.
Ligtenberg, M.J., Vos, H.L., Gennissen, A.M., Hilkens, J., Episialin, a carcinomaassociated mucin, is generated by a polymorphic gene encoding splice variants with
alternative amino termini. J Biol Chem, 1990. 265: 5573-5578.
Lloyd, K.O., Burchell, J., Kudryashov, V., Yin, B.W., Taylor-Papadimitriou, J.,
Comparison of O-linked carbohydrate chains in MUC-1 mucin from normal breast
epithelial cell lines and breast carcinoma cell lines. Demonstration of simpler and
fewer glycan chains in tumor cells. J Biol Chem, 1996. 271: 33325-33334.
Longacre, T.A., Fenoglio-Preiser, C.M., Mixed hyperplastic adenomatous
polyps/serrated adenomas. A distinct form of colorectal neoplasia. Am J Surg Pathol,
1990. 14: 524-537.
Lothe, R.A., Peltomaki, P., Meling, G.I., Aaltonen, L.A., Nystrom-Lahti, M.,
Pylkkanen, L., Heimdal, K., Andersen, T.I., Moller, P., Rognum, T.O., Genomic
instability in colorectal cancer: relationship to clinicopathological variables and
family history. Cancer Res, 1993. 53: 5849-5852.
Lowe, J.B., Stoolman, L.M., Nair, R.P., Larsen, R.D., Berhend, T.L., Marks, R.M.,
ELAM-1-dependent cell adhesion to vascular endothelium determined by a transfected
human fucosyltransferase cDNA. Cell, 1990. 63: 475-484.
Majuri, M.L., Mattila, P., Renkonen, R., Recombinant E-selectin-protein mediates
tumor cell adhesion via sialyl-Le(a) and sialyl-Le(x). Biochem Biophys Res Commun,
1992. 182: 1376-1382.
Marchesa, P., Lashner, B.A., Lavery, I.C., Milsom, J., Hull, T.L., Strong, S.A.,
Church, J.M., Navarro, G., Fazio, V.W., The risk of cancer and dysplasia among
ulcerative colitis patients with primary sclerosing cholangitis. Am J Gastroenterol,
1997. 92: 1285-1288.
Matsuda, K., Masaki, T., Watanabe, T., Kitayama, J., Nagawa, H., Muto, T., Ajioka,
Y., Clinical significance of MUC1 and MUC2 mucin and p53 protein expression in
colorectal carcinoma. Jpn J Clin Oncol, 2000. 30: 89-94.
McArdle, C.S., Hole, D., Impact of variability among surgeons on postoperative
morbidity and mortality and ultimate survival. Bmj, 1991. 302: 1501-1505.
McLeod, H.L., Murray, G.I., Tumour markers of prognosis in colorectal cancer. Br J
Cancer, 1999. 79: 191-203.
Miyake, M., Kohno, N., Nudelman, E.D., Hakomori, S., Human IgG3 monoclonal
antibody directed to an unbranched repeating type 2 chain (Gal beta 1-4GlcNAc beta
1-3Gal beta 1-4GlcNAc beta 1-3Gal beta 1-R) which is highly expressed in colonic
and hepatocellular carcinoma. Cancer Res, 1989. 49: 5689-5695.
Moertel, C.G., Fleming, T.R., Macdonald, J.S., Haller, D.G., Laurie, J.A., Tangen,
C.M., Ungerleider, J.S., Emerson, W.A., Tormey, D.C., Glick, J.H., Veeder, M.H.,
Mailliard, J.A., Fluorouracil plus levamisole as effective adjuvant therapy after
Literaturverzeichnis
189.
190.
191.
192.
193.
194.
195.
196.
197.
198.
199.
200.
201.
202.
203.
99
resection of stage III colon carcinoma: a final report. Ann Intern Med, 1995. 122:
321-326.
Mommers, E.C., Leonhart, A.M., von Mensdorff-Pouilly, S., Schol, D.J., Hilgers, J.,
Meijer, C.J., Baak, J.P., van Diest, P.J., Aberrant expression of MUC1 mucin in ductal
hyperplasia and ductal carcinoma In situ of the breast. Int J Cancer, 1999. 84: 466469.
Moniaux, N., Escande, F., Porchet, N., Aubert, J.P., Batra, S.K., Structural
organization and classification of the human mucin genes. Front Biosci, 2001. 6:
1192-1206.
Morris, C.D., Armstrong, G.R., Bigley, G., Green, H., Attwood, S.E.,
Cyclooxygenase-2 expression in the Barrett's metaplasia-dysplasia-adenocarcinoma
sequence. Am J Gastroenterol, 2001. 96: 990-996.
Muller, S., Goletz, S., Packer, N., Gooley, A., Lawson, A.M., Hanisch, F.G.,
Localization of O-glycosylation sites on glycopeptide fragments from lactationassociated MUC1. All putative sites within the tandem repeat are glycosylation targets
in vivo. J Biol Chem, 1997. 272: 24780-24793.
Munemitsu, S., Albert, I., Souza, B., Rubinfeld, B., Polakis, P., Regulation of
intracellular beta-catenin levels by the adenomatous polyposis coli (APC) tumorsuppressor protein. Proc Natl Acad Sci U S A, 1995. 92: 3046-3050.
Mutsaers, J.H., van Halbeek, H., Vliegenthart, J.F., Wu, A.M., Kabat, E.A., Typing of
core and backbone domains of mucin-type oligosaccharides from human ovarian-cyst
glycoproteins by 500-MHz 1H-NMR spectroscopy. Eur J Biochem, 1986. 157: 139146.
Nakamori, S., Ota, D.M., Cleary, K.R., Shirotani, K., Irimura, T., MUC1 mucin
expression as a marker of progression and metastasis of human colorectal carcinoma.
Gastroenterology, 1994. 106: 353-361.
Nakayama, T., Watanabe, M., Katsumata, T., Teramoto, T., Kitajima, M., Expression
of sialyl Lewis(a) as a new prognostic factor for patients with advanced colorectal
carcinoma. Cancer, 1995. 75: 2051-2056.
Nelson, H., Petrelli, N., Carlin, A., Couture, J., Fleshman, J., Guillem, J., Miedema,
B., Ota, D., Sargent, D., Guidelines 2000 for colon and rectal cancer surgery. J Natl
Cancer Inst, 2001. 93: 583-596.
Nguyen, P.L., Niehans, G.A., Cherwitz, D.L., Kim, Y.S., Ho, S.B., Membrane-bound
(MUC1) and secretory (MUC2, MUC3, and MUC4) mucin gene expression in human
lung cancer. Tumour Biol, 1996. 17: 176-192.
Nilsson, O.B., Karlsson, A., Petterson, L., Lindholm, L., Development of a new
serological assay for determination of the MUC1 breast cancer associated antigen.
Current tumor diagnosis: applications, clinical relevance, research trends, ed. Klapdor,
R. 1994: W. Zuckerschwerdt Verlag, München, Bern, Wien, New York.
Nishisho, I., Nakamura, Y., Miyoshi, Y., Miki, Y., Ando, H., Horii, A., Koyama, K.,
Utsunomiya, J., Baba, S., Hedge, P., Mutations of chromosome 5q21 genes in FAP
and colorectal cancer patients. Science, 1991. 253: 665-669.
Niv, Y., MUC1 and colorectal cancer pathophysiology considerations. World J
Gastroenterol, 2008. 14: 2139-2141.
O'Connell, M.J., Mailliard, J.A., Kahn, M.J., Macdonald, J.S., Haller, D.G., Mayer,
R.J., Wieand, H.S., Controlled trial of fluorouracil and low-dose leucovorin given for
6 months as postoperative adjuvant therapy for colon cancer. J Clin Oncol, 1997. 15:
246-250.
Ogata, S., Ho, I., Chen, A., Dubois, D., Maklansky, J., Singhal, A., Hakomori, S.,
Itzkowitz, S.H., Tumor-associated sialylated antigens are constitutively expressed in
normal human colonic mucosa. Cancer Res, 1995. 55: 1869-1874.
100
204.
205.
206.
207.
208.
209.
210.
211.
212.
213.
214.
215.
216.
217.
218.
219.
220.
221.
Literaturverzeichnis
Ogata, S., Uehara, H., Chen, A., Itzkowitz, S.H., Mucin gene expression in colonic
tissues and cell lines. Cancer Res, 1992. 52: 5971-5978.
Orntoft, T.F., Harving, N., Langkilde, N.C., O-linked mucin-type glycoproteins in
normal and malignant colon mucosa: lack of T-antigen expression and accumulation
of Tn and sialosyl-Tn antigens in carcinomas. Int J Cancer, 1990. 45: 666-672.
Park, S.Y., Lee, H.S., Choe, G., Chung, J.H., Kim, W.H., Clinicopathological
characteristics, microsatellite instability, and expression of mucin core proteins and
p53 in colorectal mucinous adenocarcinomas in relation to location. Virchows Arch,
2006. 449: 40-47.
Parkin, D.M., Global cancer statistics in the year 2000. Lancet Oncol, 2001. 2: 533543.
Pedersen, A., Johansen, C., Gronbaek, M., Relations between amount and type of
alcohol and colon and rectal cancer in a Danish population based cohort study. Gut,
2003. 52: 861-867.
Peifer, M., Cancer, catenins, and cuticle pattern: a complex connection. Science,
1993. 262: 1667-1668.
Peipins, L.A., Sandler, R.S., Epidemiology of colorectal adenomas. Epidemiol Rev,
1994. 16: 273-297.
Perçınel S, S.B., Ensarı A, Kuzu I, Kuzu MA, Bektaş M, Cetınkaya H, Kurşun N. ,
Mucins in the colorectal neoplastic spectrum with reference to conventional and
serrated adenomas. Turk J Gastroenterol., 2007. 18: 230-238.
Perez-Vilar, J., Hill, R.L., The structure and assembly of secreted mucins. J Biol
Chem, 1999. 274: 31751-31754.
Peterson, J.A., Ceriani, R.L., International workshop on monoclonal antibodies and
breast cancer. San Francisco, California; November 8 and 9, 1984. Breast Cancer Res
Treat, 1985. 5: 207-214.
Petrakou, E., Murray, A., Price, M.R., Epitope mapping of anti-MUC1 mucin protein
core monoclonal antibodies. Tumour Biol, 1998. 19: 21-29.
Podolsky, D.K., Oligosaccharide structures of human colonic mucin. J Biol Chem,
1985. 260: 8262-8271.
Podolsky, D.K., Oligosaccharide structures of isolated human colonic mucin species.
J Biol Chem, 1985. 260: 15510-15515.
Powell, S.M., Zilz, N., Beazer-Barclay, Y., Bryan, T.M., Hamilton, S.R., Thibodeau,
S.N., Vogelstein, B., Kinzler, K.W., APC mutations occur early during colorectal
tumorigenesis. Nature, 1992. 359: 235-237.
Price, M.R., Rye, P.D., Petrakou, E., Murray, A., Brady, K., Imai, S., Haga, S.,
Kiyozuka, Y., Schol, D., Meulenbroek, M.F., Snijdewint, F.G., von MensdorffPouilly, S., Verstraeten, R.A., Kenemans, P., Blockzjil, A., Nilsson, K., Nilsson, O.,
Reddish, M., Suresh, M.R., Koganty, R.R., Fortier, S., Baronic, L., Berg, A.,
Longenecker, M.B., Hilgers, J., Summary report on the ISOBM TD-4 Workshop:
analysis of 56 monoclonal antibodies against the MUC1 mucin. San Diego, Calif.,
November 17-23, 1996. Tumour Biol, 1998. 19: 1-20.
Quasar Collaborative, G., Gray, R., Barnwell, J., McConkey, C., Hills, R.K.,
Williams, N.S., Kerr, D.J., Adjuvant chemotherapy versus observation in patients with
colorectal cancer: a randomised study. Lancet, 2007. 370: 2020-2029.
Rasmussen, M., Kronborg, O., Fenger, C., Jorgensen, O.D., Possible advantages and
drawbacks of adding flexible sigmoidoscopy to hemoccult-II in screening for
colorectal cancer. A randomized study. Scand J Gastroenterol, 1999. 34: 73-78.
Regimbald, L.H., Pilarski, L.M., Longenecker, B.M., Reddish, M.A., Zimmermann,
G., Hugh, J.C., The breast mucin MUCI as a novel adhesion ligand for endothelial
intercellular adhesion molecule 1 in breast cancer. Cancer Res, 1996. 56: 4244-4249.
Literaturverzeichnis
222.
223.
224.
225.
226.
227.
228.
229.
230.
231.
232.
233.
234.
235.
236.
237.
101
Reid, M.E., Marshall, J.R., Roe, D., Lebowitz, M., Alberts, D., Battacharyya, A.K.,
Martinez, M.E., Smoking exposure as a risk factor for prevalent and recurrent
colorectal adenomas. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2003. 12: 1006-1011.
Riede, U.N., Werner, M., Schäfer H.E., Allgemeine und spezielle Pathologie. Thieme,
2004. 5: 719.
Rose, M.C., Voynow, J.A., Respiratory tract mucin genes and mucin glycoproteins in
health and disease. Physiol Rev, 2006. 86: 245-278.
Rubio, C.A., Colorectal adenomas: time for reappraisal. Pathol Res Pract, 2002. 198:
615-620.
Rubio, C.A., Jaramillo, E., Lindblom, A., Fogt, F., Classification of colorectal polyps:
guidelines for the endoscopist. Endoscopy, 2002. 34: 226-236.
Safi, F., Kohler, I., Rottinger, E., Beger, H., The value of the tumor marker CA 15-3 in
diagnosing and monitoring breast cancer. A comparative study with
carcinoembryonic antigen. Cancer, 1991. 68: 574-582.
Sagara, M., Yonezawa, S., Nagata, K., Tezuka, Y., Natsugoe, S., Xing, P.X.,
McKenzie, I.F., Aikou, T., Sato, E., Expression of mucin 1 (MUC1) in esophageal
squamous-cell carcinoma: its relationship with prognosis. Int J Cancer, 1999. 84: 251257.
Saltz, L.B., Clarke, S., Diaz-Rubio, E., Scheithauer, W., Figer, A., Wong, R., Koski,
S., Lichinitser, M., Yang, T.S., Rivera, F., Couture, F., Sirzen, F., Cassidy, J.,
Bevacizumab in combination with oxaliplatin-based chemotherapy as first-line
therapy in metastatic colorectal cancer: a randomized phase III study. J Clin Oncol,
2008. 26: 2013-9.
Sargent, D.J., Goldberg, R.M., Jacobson, S.D., Macdonald, J.S., Labianca, R., Haller,
D.G., Shepherd, L.E., Seitz, J.F., Francini, G., A pooled analysis of adjuvant
chemotherapy for resected colon cancer in elderly patients. N Engl J Med, 2001. 345:
1091-1097.
Sauer, R., Fietkau, R., Wittekind, C., Rodel, C., Martus, P., Hohenberger, W.,
Tschmelitsch, J., Sabitzer, H., Karstens, J.H., Becker, H., Hess, C., Raab, R., Adjuvant
vs. neoadjuvant radiochemotherapy for locally advanced rectal cancer: the German
trial CAO/ARO/AIO-94. Colorectal Dis, 2003. 5: 406-415.
Schmiegel, W., Pox, C., Adler, G., Fleig, W., Folsch, U.R., Fruhmorgen, P., Graeven,
U., Hohenberger, W., Holstege, A., Junginger, T., Kuhlbacher, T., Porschen, R.,
Propping, P., Riemann, J.F., Sauer, R., Sauerbruch, T., Schmoll, H.J., Zeitz, M.,
Selbmann, H.K., S3-Leitlinienkonferenz "Kolorektales Karzinom" 2004. Z
Gastroenterol, 2004. 42: 1129-1177.
Schmoll,
H.J.,
Neoadjuvante
und
adjuvante
Therapiekonzepte
beim
Kolorektalkarzinom. Onkologie, 2000. 23: 35.
Schroten, H., Hanisch, F.G., Plogmann, R., Hacker, J., Uhlenbruck, G., Nobis-Bosch,
R., Wahn, V., Inhibition of adhesion of S-fimbriated Escherichia coli to buccal
epithelial cells by human milk fat globule membrane components: a novel aspect of
the protective function of mucins in the nonimmunoglobulin fraction. Infect Immun,
1992. 60: 2893-2899.
Schwartz, B., Bresalier, R.S., Kim, Y.S., The role of mucin in colon-cancer
metastasis. Int J Cancer, 1992. 52: 60-65.
Siddiqui, J., Abe, M., Hayes, D., Shani, E., Yunis, E., Kufe, D., Isolation and
sequencing of a cDNA coding for the human DF3 breast carcinoma-associated
antigen. Proc Natl Acad Sci U S A, 1988. 85: 2320-2323.
Slattery, M.L., Levin, T.R., Ma, K., Goldgar, D., Holubkov, R., Edwards, S., Family
history and colorectal cancer: predictors of risk. Cancer Causes Control, 2003. 14:
879-887.
102
238.
239.
240.
241.
242.
243.
244.
245.
246.
247.
248.
249.
250.
251.
252.
253.
254.
255.
Literaturverzeichnis
Stenman, U.H., Heikkinen, R., Serum markers for breast cancer. Scand J Clin Lab
Invest Suppl, 1991. 206: 52-59.
Stepensky, D., Tzehoval, E., Vadai, E., Eisenbach, L., O-glycosylated versus nonglycosylated MUC1-derived peptides as potential targets for cytotoxic immunotherapy
of carcinoma. Clin Exp Immunol, 2006. 143: 139-149.
Stevens, T., Burke, C.A., Colonoscopy screening in the elderly: when to stop? Am J
Gastroenterol, 2003. 98: 1881-1885.
Stramignoni, D., Bowen, R., Atkinson, B.F., Schlom, J., Differential reactivity of
monoclonal antibodies with human colon adenocarcinomas and adenomas. Int J
Cancer, 1983. 31: 543-552.
Strous, G.J., Dekker, J., Mucin-type glycoproteins. Crit Rev Biochem Mol Biol, 1992.
27: 57-92.
Sturmer, T., Glynn, R.J., Lee, I.M., Manson, J.E., Buring, J.E., Hennekens, C.H.,
Aspirin use and colorectal cancer: post-trial follow-up data from the Physicians'
Health Study. Ann Intern Med, 1998. 128: 713-720.
Swallow, D.M., Gendler, S., Griffiths, B., Corney, G., Taylor-Papadimitriou, J.,
Bramwell, M.E., The human tumour-associated epithelial mucins are coded by an
expressed hypervariable gene locus PUM. Nature, 1987. 328: 82-84.
Sylvester, P.A., Myerscough, N., Warren, B.F., Carlstedt, I., Corfield, A.P., Durdey,
P., Thomas, M.G., Differential expression of the chromosome 11 mucin genes in
colorectal cancer. J Pathol, 2001. 195: 327-335.
Takada, A., Ohmori, K., Takahashi, N., Tsuyuoka, K., Yago, A., Zenita, K.,
Hasegawa, A., Kannagi, R., Adhesion of human cancer cells to vascular endothelium
mediated by a carbohydrate antigen, sialyl Lewis A. Biochem Biophys Res Commun,
1991. 179: 713-719.
Takada, A., Ohmori, K., Yoneda, T., Tsuyuoka, K., Hasegawa, A., Kiso, M., Kannagi,
R., Contribution of carbohydrate antigens sialyl Lewis A and sialyl Lewis X to
adhesion of human cancer cells to vascular endothelium. Cancer Res, 1993. 53: 354361.
Takayama, T., Miyanishi, K., Hayashi, T., Sato, Y., Niitsu, Y., Colorectal cancer:
genetics of development and metastasis. J Gastroenterol, 2006. 41: 185-192.
Takeuchi, H., Kato, K., Denda-Nagai, K., Hanisch, F.G., Clausen, H., Irimura, T., The
epitope recognized by the unique anti-MUC1 monoclonal antibody MY.1E12 involves
sialyl alpha 2-3galactosyl beta 1-3N-acetylgalactosaminide linked to a distinct
threonine residue in the MUC1 tandem repeat. J Immunol Methods, 2002. 270: 199209.
Tanimoto, T., Tanaka, S., Haruma, K., Yoshihara, M., Sumii, K., Kajiyama, G.,
Shimamoto, F., Kohno, N., MUC1 expression in intramucosal colorectal neoplasms.
Possible involvement in histogenesis and progression. Oncology, 1999. 56: 223-231.
Taylor-Papadimitriou, J., Report on the first international workshop on carcinomaassociated mucins. Int J Cancer, 1991. 49: 1-5.
Taylor-Papadimitriou, J., Burchell, J., Miles, D.W., Dalziel, M., MUC1 and cancer.
Biochim Biophys Acta, 1999. 1455: 301-313.
Terry, M.B., Neugut, A.I., Bostick, R.M., Sandler, R.S., Haile, R.W., Jacobson, J.S.,
Fenoglio-Preiser, C.M., Potter, J.D., Risk factors for advanced colorectal adenomas: a
pooled analysis. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2002. 11: 622-629.
Terry, P., Giovannucci, E., Michels, K.B., Bergkvist, L., Hansen, H., Holmberg, L.,
Wolk, A., Fruit, vegetables, dietary fiber, and risk of colorectal cancer. J Natl Cancer
Inst, 2001. 93: 525-533.
Thibodeau, S.N., Bren, G., Schaid, D., Microsatellite instability in cancer of the
proximal colon. Science, 1993. 260: 816-819.
Literaturverzeichnis
256.
257.
258.
259.
260.
261.
262.
263.
264.
265.
266.
267.
268.
269.
270.
271.
103
Thomas, D.B., Karagas, M.R., Cancer in first and second generation Americans.
Cancer Res, 1987. 47: 5771-5776.
Tiemersma, E.W., Wark, P.A., Ocke, M.C., Bunschoten, A., Otten, M.H., Kok, F.J.,
Kampman, E., Alcohol consumption, alcohol dehydrogenase 3 polymorphism, and
colorectal adenomas. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2003. 12: 419-45.
Toft, N.J., Arends, M.J., DNA mismatch repair and colorectal cancer. J Pathol, 1998.
185: 123-129.
Toribara, N.W., Roberton, A.M., Ho, S.B., Kuo, W.L., Gum, E., Hicks, J.W., Gum,
J.R., Jr., Byrd, J.C., Siddiki, B., Kim, Y.S., Human gastric mucin. Identification of a
unique species by expression cloning. J Biol Chem, 1993. 268: 5879-5885.
Traverso, G., Shuber, A., Levin, B., Johnson, C., Olsson, L., Schoetz, D.J., Jr.,
Hamilton, S.R., Boynton, K., Kinzler, K.W., Vogelstein, B., Detection of APC
mutations in fecal DNA from patients with colorectal tumors. N Engl J Med, 2002.
346: 311-320.
Tveit, K.M., Radiotherapy in rectal cancer. Acta Oncol, 1999. 38: 5-6.
Tveit, K.M., Guldvog, I., Hagen, S., Trondsen, E., Harbitz, T., Nygaard, K., Nilsen,
J.B., Wist, E., Hannisdal, E., Randomized controlled trial of postoperative
radiotherapy and short-term time-scheduled 5-fluorouracil against surgery alone in
the treatment of Dukes B and C rectal cancer. Norwegian Adjuvant Rectal Cancer
Project Group. Br J Surg, 1997. 84: 1130-1135.
UICC, TNM Classification of malignant tumours. New York: John Wiley & Sons,
2002.
Utsunomiya, T., Yonezawa, S., Sakamoto, H., Kitamura, H., Hokita, S., Aiko, T.,
Tanaka, S., Irimura, T., Kim, Y.S., Sato, E., Expression of MUC1 and MUC2 mucins
in gastric carcinomas: its relationship with the prognosis of the patients. Clin Cancer
Res, 1998. 4: 2605-2614.
Van Cutsem, E., Peeters, M., Siena, S., Humblet, Y., Hendlisz, A., Neyns, B., Canon,
J.L., Van Laethem, J.L., Maurel, J., Richardson, G., Wolf, M., Amado, R.G., Openlabel phase III trial of panitumumab plus best supportive care compared with best
supportive care alone in patients with chemotherapy-refractory metastatic colorectal
cancer. J Clin Oncol, 2007. 25: 1658-64.
Van Klinken, B.J., Dekker, J., Buller, H.A., Einerhand, A.W., Mucin gene structure
and expression: protection vs. adhesion. Am J Physiol, 1995. 269: 613-627.
van Klinken, B.J., Dekker, J., van Gool, S.A., van Marle, J., Buller, H.A., Einerhand,
A.W., MUC5B is the prominent mucin in human gallbladder and is also expressed in
a subset of colonic goblet cells. Am J Physiol, 1998. 274: 871-878.
Verne, J.E., Aubrey, R., Love, S.B., Talbot, I.C., Northover, J.M., Population based
randomized study of uptake and yield of screening by flexible sigmoidoscopy
compared with screening by faecal occult blood testing. Bmj, 1998. 317: 182-185.
von Mensdorff-Pouilly, S., Snijdewint, F.G., Verstraeten, A.A., Verheijen, R.H.,
Kenemans, P., Human MUC1 mucin: a multifaceted glycoprotein. Int J Biol Markers,
2000. 15: 343-356.
Wagner, M., Adler, G., Seufferlein, T., Kolorektale Karzinome: Neue Entwicklungen
in der Tumorprävention und in der Diagnostik der Tumorausbreitung. Chir
Gastroenterol, 2005. 21: 109.
Wandall, H.H., Hassan, H., Mirgorodskaya, E., Kristensen, A.K., Roepstorff, P.,
Bennett, E.P., Nielsen, P.A., Hollingsworth, M.A., Burchell, J., Taylor-Papadimitriou,
J., Clausen, H., Substrate specificities of three members of the human UDP-N-acetylalpha-D-galactosamine:Polypeptide
N-acetylgalactosaminyltransferase
family,
GalNAc-T1, -T2, and -T3. J Biol Chem, 1997. 272: 23503-23514.
104
272.
273.
274.
275.
276.
277.
278.
279.
280.
281.
282.
283.
284.
285.
286.
Literaturverzeichnis
Wei, E.K., Giovannucci, E., Wu, K., Rosner, B., Fuchs, C.S., Willett, W.C., Colditz,
G.A., Comparison of risk factors for colon and rectal cancer. Int J Cancer, 2004. 108:
433-442.
Weiss, A.A., Babyatsky, M.W., Ogata, S., Chen, A., Itzkowitz, S.H., Expression of
MUC2 and MUC3 mRNA in human normal, malignant, and inflammatory intestinal
tissues. J Histochem Cytochem, 1996. 44: 1161-1166.
Wen, Y., Caffrey, T.C., Wheelock, M.J., Johnson, K.R., Hollingsworth, M.A.,
Nuclear association of the cytoplasmic tail of MUC1 and beta-catenin. J Biol Chem,
2003. 278: 38029-38039.
Wesseling, J., van der Valk, S.W., Hilkens, J., A mechanism for inhibition of Ecadherin-mediated cell-cell adhesion by the membrane-associated mucin
episialin/MUC1. Mol Biol Cell, 1996. 7: 565-577.
Wesseling, J., van der Valk, S.W., Vos, H.L., Sonnenberg, A., Hilkens, J., Episialin
(MUC1) overexpression inhibits integrin-mediated cell adhesion to extracellular
matrix components. J Cell Biol, 1995. 129: 255-265.
Wiley, E.L., Murphy, P., Mendelsohn, G., Eggleston, J.C., Distribution of blood group
substances in normal human colon. Use of the unlabeled antibody (PAP)
immunoperoxidase technic to identify A and B blood group substances. Am J Clin
Pathol, 1981. 76: 806-809.
Williams, S.J., McGuckin, M.A., Gotley, D.C., Eyre, H.J., Sutherland, G.R., Antalis,
T.M., Two novel mucin genes down-regulated in colorectal cancer identified by
differential display. Cancer Res, 1999. 59: 4083-4089.
Wilmink, A.B., Overview of the epidemiology of colorectal cancer. Dis Colon
Rectum, 1997. 40: 483-493.
Winawer, S.J., Zauber, A.G., Ho, M.N., O'Brien, M.J., Gottlieb, L.S., Sternberg, S.S.,
Waye, J.D., Schapiro, M., Bond, J.H., Panish, J.F., et al., Prevention of colorectal
cancer by colonoscopic polypectomy. The National Polyp Study Workgroup. N Engl J
Med, 1993. 329: 1977-1981.
Winterford, C.M., Walsh, M.D., Leggett, B.A., Jass, J.R., Ultrastructural localization
of epithelial mucin core proteins in colorectal tissues. J Histochem Cytochem, 1999.
47: 1063-1074.
Wolf, B.C., D'Emilia, J.C., Salem, R.R., DeCoste, D., Sears, H.F., Gottlieb, L.S.,
Steele, G.D., Jr., Detection of the tumor-associated glycoprotein antigen (TAG-72) in
premalignant lesions of the colon. J Natl Cancer Inst, 1989. 81: 1913-1917.
Wolmark, N., Rockette, H., Fisher, B., Wickerham, D.L., Redmond, C., Fisher, E.R.,
Jones, J., Mamounas, E.P., Ore, L., Petrelli, N.J., et al., The benefit of leucovorinmodulated fluorouracil as postoperative adjuvant therapy for primary colon cancer:
results from National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project protocol C-03. J
Clin Oncol, 1993. 11: 1879-1887.
Wolmark, N., Wieand, H.S., Hyams, D.M., Colangelo, L., Dimitrov, N.V., Romond,
E.H., Wexler, M., Prager, D., Cruz, A.B., Jr., Gordon, P.H., Petrelli, N.J., Deutsch,
M., Mamounas, E., Wickerham, D.L., Fisher, E.R., Rockette, H., Fisher, B.,
Randomized trial of postoperative adjuvant chemotherapy with or without
radiotherapy for carcinoma of the rectum: National Surgical Adjuvant Breast and
Bowel Project Protocol R-02. J Natl Cancer Inst, 2000. 92: 388-396.
Woodward, M.P., Young, W.W., Jr., Bloodgood, R.A., Detection of monoclonal
antibodies specific for carbohydrate epitopes using periodate oxidation. J Immunol
Methods, 1985. 78: 143-153.
Wreschner, D.H., Hareuveni, M., Tsarfaty, I., Smorodinsky, N., Horev, J., Zaretsky,
J., Kotkes, P., Weiss, M., Lathe, R., Dion, A., et al., Human epithelial tumor antigen
Literaturverzeichnis
287.
288.
289.
290.
291.
292.
293.
294.
295.
296.
297.
298.
105
cDNA sequences. Differential splicing may generate multiple protein forms. Eur J
Biochem, 1990. 189: 463-473.
Wu, K., Willett, W.C., Fuchs, C.S., Colditz, G.A., Giovannucci, E.L., Calcium intake
and risk of colon cancer in women and men. J Natl Cancer Inst, 2002. 94: 437-446.
Yamamoto, M., Bharti, A., Li, Y., Kufe, D., Interaction of the DF3/MUC1 breast
carcinoma-associated antigen and beta-catenin in cell adhesion. J Biol Chem, 1997.
272: 12492-12494.
Yang, J.M., Byrd, J.C., Siddiki, B.B., Chung, Y.S., Okuno, M., Sowa, M., Kim, Y.S.,
Matta, K.L., Brockhausen, I., Alterations of O-glycan biosynthesis in human colon
cancer tissues. Glycobiology, 1994. 4: 873-884.
Yashiro, M., Carethers, J.M., Laghi, L., Saito, K., Slezak, P., Jaramillo, E., Rubio, C.,
Koizumi, K., Hirakawa, K., Boland, C.R., Genetic pathways in the evolution of
morphologically distinct colorectal neoplasms. Cancer Res, 2001. 61: 2676-2683.
Yolken, R.H., Peterson, J.A., Vonderfecht, S.L., Fouts, E.T., Midthun, K., Newburg,
D.S., Human milk mucin inhibits rotavirus replication and prevents experimental
gastroenteritis. J Clin Invest, 1992. 90: 1984-1991.
Yonezawa, S., Nakamura, T., Tanaka, S., Sato, E., Glycoconjugate with Ulex
europaeus agglutinin-I-binding sites in normal mucosa, adenoma, and carcinoma of
the human large bowel. J Natl Cancer Inst, 1982. 69: 777-785.
Yoon, H., Benamouzig, R., Little, J., Francois-Collange, M., Tome, D., Systematic
review of epidemiological studies on meat, dairy products and egg consumption and
risk of colorectal adenomas. Eur J Cancer Prev, 2000. 9: 151-164.
Yuan, M., Itzkowitz, S.H., Boland, C.R., Kim, Y.D., Tomita, J.T., Palekar, A.,
Bennington, J.L., Trump, B.F., Kim, Y.S., Comparison of T-antigen expression in
normal, premalignant, and malignant human colonic tissue using lectin and antibody
immunohistochemistry. Cancer Res, 1986. 46: 4841-4847.
Yuan, M., Itzkowitz, S.H., Palekar, A., Shamsuddin, A.M., Phelps, P.C., Trump, B.F.,
Kim, Y.S., Distribution of blood group antigens A, B, H, Lewisa, and Lewisb in
human normal, fetal, and malignant colonic tissue. Cancer Res, 1985. 45: 4499-4511.
Zhang, K., Baeckstrom, D., Brevinge, H., Hansson, G.C., Secreted MUC1 mucins
lacking their cytoplasmic part and carrying sialyl-Lewis a and x epitopes from a
tumor cell line and sera of colon carcinoma patients can inhibit HL-60 leukocyte
adhesion to E-selectin-expressing endothelial cells. J Cell Biochem, 1996. 60: 538549.
Zotter, S., Lossnitzer, A., Hageman, P.C., Delemarre, J.F., Hilkens, J., Hilgers, J.,
Immunohistochemical localization of the epithelial marker MAM-6 in invasive
malignancies and highly dysplastic adenomas of the large intestine. Lab Invest, 1987.
57: 193-199.
Zrihan-Licht, S., Vos, H.L., Baruch, A., Elroy-Stein, O., Sagiv, D., Keydar, I.,
Hilkens, J., Wreschner, D.H., Characterization and molecular cloning of a novel
MUC1 protein, devoid of tandem repeats, expressed in human breast cancer tissue.
Eur J Biochem, 1994. 224: 787-795.
106
Abbildungsverzeichnis
7 Abbildungsverzeichnis
___________________________________________________________________________
Abbildung 1/1: Molekulargenetische Kolorektalkarzinogenese ______________________ 20
Abbildung 1/2: Schematische Darstellung der Kohlenhydratseitenketten der Muzine _____ 29
Abbildung 1/3: Primärstruktur von MUC1 ______________________________________ 34
Abbildung 2/1: Schema der LSAB-Methode _____________________________________ 49
Abbildung 3/1: Adenokarzinom des Dickdarms, Antikörper BCP8 ohne Vorbehandlung,
x200 _____________________________________________________________________ 56
Abbildung 3/2: Adenokarzinom des Dickdarms, Antikörper BCP8 nach Perjodatbehandlung,
x200 _____________________________________________________________________ 56
Abbildung 3/3: Adenokarzinom des Dickdarms, Antikörper 115D8 ohne Vorbehandlung,
x200 _____________________________________________________________________ 56
Abbildung 3/4: Adenokarzinom des Dickdarms, Antikörper 115D8 nach Neuraminidasebehandlung, x200 __________________________________________________________ 56
Abbildung 3/5: Häufigkeitsverteilung (Mittelwerte) der Antikörper bei den „low-grade“Adenomen ________________________________________________________________ 58
Abbildung 3/6: Häufigkeitsverteilung (Mittelwerte) der Antikörper bei den „high-grade“Adenomen ________________________________________________________________ 58
Abbildung 3/7: Häufigkeitsverteilung (Mittelwerte) der Antikörper bei den Karzinomen _ 68
Tabellenverzeichnis
107
8 Tabellenverzeichnis
___________________________________________________________________________
Tabelle 1/1: Entartungsrisiko in Abhängigkeit der Adenomgröße _____________________ 9
Tabelle 1/2: pTNM-Klassifikation (UICC 2002) __________________________________ 11
Tabelle 1/3: Stadieneinteilung des kolorektalen Karzinoms nach Dukes (1932) _________ 12
Tabelle 1/4: Stadieneinteilung des kolorektalen Karzinoms (UICC 2002) ______________ 12
Tabelle 1/5: TNM-Stadium und Überlebensrate bei R0-Resektion des Primärtumors _____ 14
Tabelle 1/6: R-Klassifikation (UICC 2002) ______________________________________ 14
Tabelle 1/7: Histopathologisches Grading (UICC 2002) ____________________________ 14
Tabelle 1/8: Genetische Veränderungen in der Adenom-Karzinom-Sequenz ____________ 22
Tabelle 1/9: Mismatch-Repair-Gene ___________________________________________ 24
Tabelle 1/10: Anwendungsmöglichkeiten molekularer Marker _______________________ 25
Tabelle 1/11: Gewebsspezifisches Vorkommen der Muzine _________________________ 27
Tabelle 1/12: Glykanstrukturen in Oligosacchariden vom Muzin-Typ _________________ 30
Tabelle 1/13: Muzine _______________________________________________________ 31
Tabelle 2/1: Verdünnung der Primärantikörper ___________________________________ 52
Tabelle 3/1: MUC1-Immunreaktivität und Farbintensität mit dem Antikörper HMFG2 in den
Adenomgeweben ___________________________________________________________ 60
Tabelle 3/2: Lage- und Streumaße von HMFG2 in den kolorektalen „low-grade“-Adenomen
_________________________________________________________________________ 60
Tabelle 3/3: Lage- und Streumaße von HMFG2 in den kolorektalen „high-grade“-Adenomen
_________________________________________________________________________ 60
Tabelle 3/4: MUC1-Immunreaktivität und Farbintensität mit dem Antikörper BCP8 in den
Adenomgeweben ___________________________________________________________ 62
Tabelle 3/5: Lage- und Streumaße von BCP8 in den kolorektalen „low-grade“-Adenomen
_________________________________________________________________________ 62
Tabelle 3/6: Lage- und Streumaße von BCP8 in den kolorektalen „high-grade“-Adenomen
_________________________________________________________________________ 62
Tabelle 3/7: MUC1-Immunreaktivität und Farbintensität mit dem Antikörper 115D8 in den
Adenomgeweben ___________________________________________________________ 64
Tabelle 3/8: Lage- und Streumaße von 115D8 in den kolorektalen „low-grade“-Adenomen
_________________________________________________________________________ 64
Tabelle 3/9: Lage- und Streumaße von 115D8 in den kolorektalen „high-grade“-Adenomen
_________________________________________________________________________ 64
108
Tabellenverzeichnis
Tabelle 3/10: MUC1-Immunreaktivität und Farbintensität mit dem Antikörper MA695 in den
Adenomgeweben ___________________________________________________________ 66
Tabelle 3/11: Lage- und Streumaße von MA695 in den kolorektalen „low-grade“-Adenomen
_________________________________________________________________________ 66
Tabelle 3/12: Lage- und Streumaße von MA695 in den kolorektalen „high-grade“-Adenomen
_________________________________________________________________________ 66
Tabelle 3/13: MUC1-Immunreaktivität und Farbintensität mit dem Antikörper HMFG2 in
den kolorektalen Karzinomen _________________________________________________ 69
Tabelle 3/14: Lage- und Streumaße von HMFG2 in den kolorektalen Karzinomen _______ 69
Tabelle 3/15: MUC1-Immunreaktivität und Farbintensität mit dem Antikörper BCP8 in den
kolorektalen Karzinomen ____________________________________________________ 70
Tabelle 3/16: Lage- und Streumaße von BCP8 in den kolorektalen Karzinomen _________ 70
Tabelle 3/17: MUC1-Immunreaktivität und Farbintensität mit dem Antikörper 115D8 in den
kolorektalen Karzinomen ____________________________________________________ 71
Tabelle 3/18: Lage- und Streumaße von 115D8 in den kolorektalen Karzinomen ________ 71
Tabelle 3/19: MUC1-Immunreaktivität und Farbintensität mit dem Antikörper MA695 in den
kolorektalen Karzinomen ____________________________________________________ 73
Tabelle 3/20: Lage- und Streumaße von MA695 in den kolorektalen Karzinomen _______ 73
Lebenslauf
109
9 Lebenslauf
___________________________________________________________________________
Mein Lebenslauf wird aus Gründen des Datenschutzes in der elektronischen Fassung meiner
Arbeit nicht veröffentlicht.