Objektive, nicht-invasive bildgebende Diagnostik der
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Tierärztliche Hochschule Hannover Objektive, nicht-invasive bildgebende Diagnostik der Neurodegeneration in transgenen Huntington-Ratten – eine Follow-up-Studie mit Kleintier-PET und - MRT INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae Vorgelegt von Veronika Lippross Münster Hannover 2015 Wissenschaftliche Betreuung: 1. Univ.-Prof. Dr. med. vet. O. Distl, Institut für Tierzucht und Vererbungsforschung, Tierärztliche Hochschule Hannover 2. Univ.-Prof. Dr. med. Dr. h.c. E. Bernd Ringelstein Klinik für Neurologie, Universitätsklinikum Münster 1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med.vet. O. Distl, Institut für Tierzucht- und Vererbungsforschung, Tierärztliche Hochschule Hannover 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. phil.nat. Hassan Y. Naim Institut für Physiologische Chemie Tierärztliche Hochschule Hannover Tag der mündlichen Prüfung: 12.5.2016 Inhaltsverzeichnis VERZEICHNIS DER IN TEXT UND ABBILDUNGEN VERWENDETEN ABKÜRZUNGEN 5 1 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG 7 2 LITERATURÜBERSICHT 9 2.1 CHOREA HUNTINGTON 9 2.1.1 HISTORISCHER ÜBERBLICK 9 2.1.2 EPIDEMIOLOGIE 10 2.1.3 PATHOGENESE 10 2.1.4 EXZITOTOXITÄTSTHERORIE 15 2.1.5 SYMPTOMATIK UND VERLAUF 17 2.1.6 DIAGNOSTIK 18 2.1.7 PATHOLOGIE 18 2.1.8 THERAPIE 19 2.2 TIERMODELLE 19 2.2.1 AVERTEBRATEN 19 2.2.2 VERTEBRATEN 19 2.2.2.1 2.2.2.2 2.2.2.3 2.2.2.3.1 2.2.2.3.2 Quinolinsäure-Modelle Stoffwechsel-Toxin-Modelle (indirekte Exzitotoxitäts-Modelle) Transgene Tiermodelle Maus-Modelle Die transgene Huntington-Ratte 19 20 22 22 23 2.2.3 PET-BILDGEBUNG 28 2.2.4 VORVERSUCHE AN HD-RATTEN 29 2.2.5 MRT-BILDGEBUNG 29 2.2.6 VORVERSUCHE AN HD-RATTEN 30 2.3 VERHALTENSTEST /ACCELEROD 2.3.1 30 BISHERIGE ERGEBNISSE VON ACCELEROD-UNTERSUCHUNGEN TRANSGENER HDRATTEN 31 MATERIAL UND METHODEN 32 3.1 CHEMIKALIEN UND VERBRAUCHSMATERIAL 32 3 3.2 GERÄTE UND LABORGEGENSTÄNDE 32 3.3 TIERE UND TIERHALTUNG 33 3.4 POSITRONEN-EMISSIONSTOMOGRAPHIE 34 3.4.1 PET-SCANNER 39 3.4.2 TRACER 39 3.4.3 UNTERSUCHUNGSABLAUF 40 3.5 MAGNET-RESONANZ-TOMOGRAPHIE 41 3.5.1 GERÄT 44 3.5.2 UNTERSUCHUNGSABLAUF 44 3.5.3 BILDBEARBEITUNG 44 3.6 ACCELEROD-TEST 47 ERGEBNISSE 49 4 4.1 ÜBERLEBENSRATE 49 4.2 PET-UNTERSUCHUNG 50 4.2.1 MITTLERE STRIATALE AKTIVITÄT MIT BEZUG AUF DIE MITTLERE KLEINHIRNAKTIVITÄT 4.2.2 50 MAXIMALE STRIATALE AKTIVITÄT MIT BEZUG AUF DIE MITTLERE KLEINHIRNAKTIVITÄT 51 4.3 MRT-UNTERSUCHUNG: BESTIMMUNG DER STRIATALEN VOLUMINA 55 4.4 ACCELEROD-TEST 57 5 DISKUSSION 60 5.1 ZUR F18-FDG-PET-UNTERSUCHUNG 60 5.2 ZUR MRT-UNTERSUCHUNG 68 5.3 ZUR ACCELEROD-UNTERSUCHUNG 69 6 ZUSAMMENFASSUNG 71 7 SUMMARY 74 8 LITERATURVERZEICHNIS 77 9 ANHANG 87 Verzeichnis der in Text und Abbildungen verwendeten Abkürzungen Abb. al. AMPA ATP bp Bq c CAG ccm cm D DH d.h. DNA/DNS Dopa F FDG FOV FID GABA HD htt i.d.R kBq kDa keV LOR m mBq Mg min ml µl MPI Mpp mRNA MRT Ms MSN n NMDA 3-NP O o.g. P Abbildung alii α-Amino-3-Hydroxy-5-Methyl-4-Isoxazolpropionat Adenosin-Triphosphat Basenpaare Bequerel complementary Cytosin Adenin Guanin Kubikzentimeter Zentimeter Dopa Dehydrogenase das heißt Deoxyribonukleinsäure Dopamin Fluor FluordesoxyGlucose Field Of View Free Induction Decay Gammaaminobuttersäure Huntington’s Disease Huntingtin in der Regel Kilo-Bequerel Kilo-Dalton Kilo-Elektronenvolt Line Of Response magnetischer Moment Milli-Bequerel Magnesium Minute Milliliter Mikroliter Multipurpose Imaging Methyl-4-Phenylpyridinium messenger Ribonukleinsäure Magnet-Resonanz-Tomographie Millisekunden Medium Sized Spiny Neurons amino N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor 3-Nitropropionsäure Sauerstoff oben genannt Phosphor PCR PET RNA ROI RPM s. s Stabw. Tab. tg u.a. v. v.a. vergl. wt YAC z.B. ZNS ZTE Polymerase Chain Reaction Positronen-Emissions-Tomographie Ribonukleinsäure Region of interest Rounds per minute siehe Sekunde Standardabweichung Tabelle transgen unter anderem von vor allem vergleiche wildtyp Yeast Artificial Chromosome zum Beispiel Zentrales Nervensystem Zentrale Tierexperimentelle Einrichtung 7 1 Einleitung und Zielsetzung Die Chorea Huntington (Syn. Huntington’sche Krankheit, Huntington’s Disease, HD) ist die häufigste autosomal-dominant vererbte neurodegenerative Erkrankung des Menschen. Die Krankheit bricht i.d.R. zwischen dem 35. und 45. Lebensjahr aus, verläuft langsam progredient und resultiert im vollständigen Verlust der motorischen Kontrolle, psychiatrischen Symptomen und einer Demenz, beruhend ausgeprägten neurodegenerativen Veränderungen (Walker et al., 2007). auf Der Ausgang ist immer tödlich. Bis heute gibt es keine wirksame kausale die Krankheit bremsende oder verzögernde Therapie (Venuto et al., 2012). Die Patienten entwickeln im Laufe der Erkrankung eine Atrophie des Nervengewebes im Bereich bestimmter Hirnareale, die mit den bildgebenden Verfahren PositronenEmissions-Tomographie (PET) (Feigin et al., 2007) und Magnet-ResonanzTomographie (MRT) in-vivo messbar und auch im Verlauf quantifizierbar ist (Tabrizi et al., 2012). Diese Neurodegeneration findet sich auch bei einigen der bisher vorhandenen Tiermodellen der HD. Das in dieser Studie untersuchte tgHD Ratten-Modell (von Horsten et al., 2003) hat im Gegensatz zu im Vorfeld häufiger eingesetzten Mausmedellen, wie z.B. der R6/2Maus (Mangiarini et al., 1996), den Vorteil eines chronischen Phänotyps. Während die R6/2 Mäuse nur wenige Monate überleben, haben die tgHD Ratten eine Lebenserwartung von bis über 2 Jahren. Damit entsprechen sie, bezogen auf die Lebenserwartung von Ratten, phänotypisch eher der chronischen Verlaufsform der Erkrankung im Menschen. Signifikante Veränderungen sowohl in FDG-PET als auch in MRT Untersuchungen der tgHD Ratten wurden in Vorstudien dokumentiert (von Horsten et al., 2003). In dieser Arbeit wurden daher die Hypothesen untersucht, daß mittels zerebraler PET und MRT Bildgebung „in vivo“ (1.) der Phänotyp der tgHD Ratten im Vergleich zu wilde-type Tieren detektierbar ist und (2.) sich dieser Phänotyp in den tgHD Ratten meßbar progredient verschlechtert. Mit diesen Untersuchungen sollten somit Erkenntnisse über Einsetzbarkeit von PET und MRT Untersuchungen in zukünftigen Therapiestudien mit tgHD Ratten gewonnen werden. Ein besonderer Aspekt war hierbei der Wunsch in zukünftigen Therapiestudien in diesem chronischen Tiermodell möglichst frühzeitig Anhaltspunkte für die 8 Wirksamkeit einer Therapie zu erlangen und somit die Entwicklung neuer Therapien zu fazilitieren. Über den Zeitraum von zwei Jahren wurden daher in Abständen von drei bis vier Monaten wiederholt PET und MRT Untersuchungen durchgeführt, um den Verlauf der zu erwartenden Neurodegeneration zu bestimmen. Durch die parallele Durchführung eines Motorik-Tests, dessen Sensitivität in Bezug auf die Neurodegeneration der Huntington-Ratten bereits wissenschaftlich nachgewiesen werden konnte, konnten die Veränderungen in der Bildgebung in Bezug zu der "klinischen" Manifestation eines Phänotyps bewertet werden. 9 2 Literaturübersicht 2.1 Chorea Huntington 2.1.1 Historischer Überblick Die für die Chorea Huntington typischen choreatischen Hyperkinesen wurden bereits vor mehr als 2000 Jahren von den Ägyptern als eigenständiges Symptom beschrieben (Hayden et al., 1981). Doch erst PARACELSUS (1493-1541) erkannte, dass den unwillkürlichen, unregelmäßigen, abrupt auftretenden, nicht repetitiven Muskelkontraktionen organische Schädigungen des Zentralen Nervensystems zugrunde liegen. Er unterschied damit die Erkrankung von dem vermutlich durch Massenhysterie oder rheumatische Erkrankungen verursachten „Veitstanz“ des Mittelalters. Diese Vorstellung wurde allerdings zu seiner Zeit nicht akzeptiert. Vielmehr ging man davon aus, dass solche unwillkürlichen und bizarr wirkenden Bewegungen durch „teuflische Besessenheit“ zu erklären seien. Möglicherweise litten die von Paracelsus beschriebenen Patienten bereits an dem genetischen Defekt, der erst Ende des 20. Jahrhunderts als Ursache der hereditären Chorea erkannt wurde (Hayden et al., 1981). Drei Jahrhunderte später, im Jahre 1832, erkannte ein englischer Arzt namens Elliotson erstmals die erbliche Komponente der „Erwachsenen Chorea“ (Stevens et al., 1972). Im Jahre 1842 beschrieb der New Yorker Arzt Dr. C.O. Waters die Chorea Huntington bereits als erbliche, unheilbare Erkrankung, die zu Demenz führt und selten vor Erreichen des Erwachsenenalters ausbricht (Waters et al., 1942). Es folgten weitere Veröffentlichungen durch Lund in Norwegen (Lund, 1860) und Lyon in New York (Lyon, 1863), die allerdings aufgrund ihres Erscheinens in regionalen, wenig verbreiteten Werken kaum Beachtung fanden. Weltweite Akzeptanz als eigenständiges Krankheitsbild sowie ihren Namen brachte der Chorea Huntington erst 1872 die Veröffentlichung von George Huntington im „Medical and Surgical Reporter“ in Philadelphia (Huntington, 1872). Huntington hatte bei seinen Studien von Familien auf Long Island das klassische Muster einer autosomal dominant vererbten Erkrankung beobachtet und die wesentlichen Charakteristika der motorischen, psychischen und sozialen Aspekte der Erkrankung beschrieben (Hayden et al. , 1981, Harper, Morris, and Tyler, 1990). 10 2.1.2 Epidemiologie Die Huntington’sche Krankheit betrifft alle Rassen und hat in Europa und Nordamerika mit vier bis acht Fällen pro 100.000 Einwohner die höchste Prävalenz. Mit etwa 35.000 Betroffenen allein in Europa und ca. dreimal so vielen Risikopersonen handelt es sich um eine der häufigsten genetisch bedingten neurologischen Erkrankungen (Reilmann et al., 2012). Männer und Frauen sind gleich häufig betroffen (Meierkord et al., 1994). 2.1.3 Pathogenese Die Huntington’sche Krankheit gehört zur wachsenden Gruppe der heriditären, neurodegenerativen CAG-Triplet-Erkrankungen, denen eine pathologisch Verlängerung der meiotisch instabilen Cytosin-Adenosin-Guanin-Sequenz zugrunde liegt. Zu diesen Erkrankungen zählen unter anderem die Spinale und Bulbäre Muskelatrophie (La Spada et al., 1991) und verschiedene Formen der Spinocerebellären Atrophien (Orr et al., 1993). Alle diese Erkrankungen haben eine in etwa vergleichbare Anzahl an CAG-Triplet-Wiederholungen sowohl in der normalen als auch in der pathologisch verlängerten Gensequenz gemeinsam. Die zugrunde liegenden Gene und die von ihnen abgeleiteten Proteine sind jedoch alle unterschiedlich und stehen nicht miteinander in funktioneller Verbindung. Es wird trotzdem vermutet, dass dieser Erkrankungsgruppe mit neurologisch progredient verlaufender Symptomatik gemeinsame Pathomechanismen zugrunde liegen könnten (Mac Donald, 1996, Burright et al., 1997). Die Lokalisation des der Chorea Huntington zugrunde liegenden Gendefekts konnte im Jahre 1983 auf eine Region des kurzen Arms des Chromosoms 4 eingegrenzt werden (Gusella et al., 1983). Die Entschlüsselung des Huntington-Gens erfolgte 1993 nach Sequenzierung dieser Region durch die Huntington’s Disease Collaborative Research Group. Der Unterschied zu dem normalen Gen besteht in einer verlängerten Anzahl der CAG-Triplet-Wiederholungen im Exon 1 des HD-Gens, die für eine Kette von Glutamin-Aminosäuren innerhalb eines 350 kDA großen Proteins namens Huntingtin codiert (Aronin et al., 1995). Das gesunde HD-Gen 11 enthält 9 bis 26 CAG-Triplet-Wiederholungen, wohingegen das pathologisch veränderte HD-Gen 36 bis 121 dieser Wiederholungen beinhalten kann (HUNTINGTON`S DISEASE COLLABORATIVE RESEARCH GROUP 1993). Der Bereich zwischen 27 und 35 Wiederholungen gilt als Indifferenzzone, in der eine genaue Aussage über einen eventuellen Ausbruch nicht gemacht werden kann. Ab einer Anzahl von 40 Basen-Tripletts manifestiert sich die Hungtington’sche Krankheit fast zu 100 Prozent innerhalb einer normalen Lebensspanne (Rubinsztein et al., 1996) (McNeil et al. 1997). Zwischen der Anzahl der CAG-Wiederholungen und dem Alter des ersten Auftretens von Symptomen besteht eine reziproke Korrelation. Je höher die Anzahl der TripletWiederholungen, umso größer ist die Wahrscheinlichkeit, in jungen Jahren zu erkranken (Brandt et al., 1996). Bei Patienten mit juveniler HD (Westphal-Variante) wurden die längsten Ketten von CAG-Wiederholungen mit bis zu ca. 120 Repeats beobachtet; vereinzelt werden auch längere Repeats gefunden (Nance et al., 1999). Ab ca. einer Anzahl von 55-60 Repeats muss mit dem Auftreten eines juvenilen Phänotyps gerechnet werden (Gusella et al., 1997). Aufgrund der meiotischen Instabilität kann sich die Länge des CAG-Repeats bei der Ei- bzw. Samenzellbildung ändern. Während der Meiose, der Reifeteilung, wird der im Zellkern vorliegende diploide, also doppelte Chromosomensatz auf den haploiden (einfachen) Satz reduziert. Die Längenveränderung des CAG-Repeats durch die meiotische Instabilität umfasst in der Regel nur eine kleine Anzahl von Triplets (<6). Bei der Spermatogenese werden jedoch teilweise auch erheblich größere Expansionen beobachtet. So lässt sich auch die Tatsache erklären, dass juvenile HD-Fälle praktisch immer von väterlichen Allelen verursacht werden (paternale Transmission) (Zuhlke et al., 1993). Auch das sporadische Auftreten von HD-Erkrankungen beruht auf der meiotischen Instabilität. Hier sind gewöhnlich intermediäre Allele mit Repeatlängen von weniger als 36 Wiederholungen, die während der Zellkernteilung in den pathologischen Bereich hineinexpandieren für den Ausbruch der HD verantwortlich (Epplen et al., 2000). 12 Patienten mit homozygoter Anlage, d.h. mit zwei pathologischen Allelen, sind klinisch nicht von heterozygoten Trägern, die nur ein HD-Allel tragen, zu unterscheiden; dies spricht dafür, dass das verbleibende normale Allel den Krankheitsprozess nicht verzögern oder verändern kann (Myers et al., 1989, Wexler et al., 1987). Außerdem scheint ein Defekt in beiden Allelen keinen signifikant schwereren Krankheitsverlauf zu verursachen als eine heterozygote Anlage. Der mutierte Genabschnitt des HD-Gens befindet sich innerhalb einer Sequenz, die für das Protein Huntingtin (htt) kodiert. Auf der Proteinebene wird die CAG-Sequenz in eine entsprechend verlängerte Poly-Glutaminkette am stickstoffseitigen Ende, dem N-terminalen Ende des Huntingtins, translatiert (HUNTINGTON`S COLLABORATIVE RESEARCH GROUP 1993). Huntingtin wird nicht nur im gesamten Gehirn, sondern auch in zahlreichen anderen Organen, beispielsweise in Muskel-, Leber-, Lymphoblasten-, Lungen-, Herz- und Pankreasgewebe in unterschiedlicher Menge exprimiert (Landwehrmeyer et al., 1995) (Strong et al. 1993). Auch innerhalb des Gehirns wird eine unterschiedliche Expression beobachtet. So wird das Huntingtin relativ stark in Nervenzellen, aber kaum in den Gliazellen, den das Stützgerüst bildenden Zellen, exprimiert (Strong et al., 1993). Trotz dieser Beobachtungen lässt sich bisher kein eindeutiger Zusammenhang zwischen Intensität der Genexpression und den Regionen, die besonders von der Neurodegeneration betroffen sind (s. 2.1.7), herstellen. So wurden bei Patienten und Normalprobanden innerhalb des Striatums lediglich mittlere htt-Niveaus gemessen (Li et al., 1993) (Landwehrmeyer et al., 1995), während im von der Degeneration relativ verschont bleibenden Kleinhirn eine vergleichsweise hohe htt-Expression gefunden wurde (Strong et al., 1993). Auch auf zellulärer Ebene findet sich eine unterschiedlich starke Genexpression, wobei auch hier keine eindeutige Aussage bezüglich der Empfindlichkeit der verschiedenen Zelltypen und der resultierenden Degeneration zu machen ist. Die Ergebnisse verschiedener Studien divergieren stark. Beobachtungen, dass in den anfälligen „medium spiny neurons“ (s. 2.1.7) des Striatums eine besonders ausgeprägte httExpression stattfindet (Ferrante et al.,1997), widersprechen anderen, die von exakt 13 entgegengesetzten Befunden berichten (Gutekunst et al., 1995). In anderen Studien wurden weder bei Gesunden noch bei HD-Patienten signifikante Unterschiede hinsichtlich des Huntingtin-Gehalts in unterschiedlichen Nervenzelltypen gefunden (Landwehrmeyer et al. 1995). Huntingtin ist beim Gesunden ein rein zytoplasmatisches Protein, dessen Funktion noch nicht vollständig geklärt werden konnte. Es ist innerhalb der Zelle mit dem Cytoskelett und den Endosomen assoziiert, weshalb eine Beteiligung an Transportvorgängen angenommen wird (DiFiglia et al., 1997). Die Entfernung des Gens bei „knock-out“-Mäusen führt schon in der Embryonalphase zum Tod (Nasir et al., 1995). Eine protektive Wirkung des normalen Huntingtins bei exzitotoxischen Reizen wird diskutiert (Sun et al., 2001). Die normale Funktion des Huntingtins bleibt auch mit dem Gendefekt bestehen. Allerdings entwickelt das Huntingtin wahrscheinlich durch die pathologische CAGVerlängerung eine zusätzliche, bislang nicht geklärte toxische Wirkung, die die Pathologie der Chorea Huntington induziert. Dieses Prinzip bezeichnet man als „Gain of function“ (Sharp et al, 1996), (Sisodia et al., 1998), (Ambrose et al., 1994). Während bei Gesunden Huntingtin nur im Zytoplasma vorhanden ist, wird das pathologisch verlängerte Polyglutamin vom Restprotein abgespalten und bei Huntington-Patienten nicht nur im Zytoplasma, sondern auch im Zellkern gefunden. Die Polyglutaminketten haben die Fähigkeit sich aneinanderzulagern und große Proteinaggregate zu bilden. Diese Aggregate können intrazelluläre Vorgänge stören (Cha et al., 2000). Die Proteinaggregate sind signifikant größer als Nukleoli und liegen frei, ohne eine sie begrenzende Membran, innerhalb der Zellen (DiFiglia et al., 1997). Versuche mit Antikörpern gegen innere Epitope, d.h. bestimmte Proteinsequenzen, des Huntingtins und entsprechende Westernblot-Untersuchungen wiesen darauf hin, dass die Aggregate lediglich N-terminale Fragmente von htt enthalten und sich kein normales htt bzw. htt voller Länge im Zellkern befindet. Dies erklärt möglicherweise auch die nukleäre Lokalisation, da normales Htt zu groß ist, um in den Zellkern zu diffundieren. Wird das htt durch Enzyme in kleinere Bruchstücke gespalten, so 14 können diese anschließend passiv in den Zellkern gelangen und dort wie im Rest der Zelle akkumulieren (Ross et al., 1997). In-vitro-Experimente unterstützten, dass die Transfektion von Zellen mit N-terminalen htt-Fragmenten mit verlängerten Polyglutaminketten sowohl im Zytoplasma als auch im Zellkern zu Aggregatbildung führen kann. Je kürzer die Länge des Fragmentes war, umso häufiger fanden sich die Aggregate im Zellkern. Es gab zudem Hinweise darauf, dass von den Einschlüssen toxische Wirkungen ausgehen, die mit der Länge der Polyglutaminkette zunehmen (Martindale et al.,1998) (Cooper et al., 1998) (Hackam et al., 1998). Trotz allem ist es bis heute nicht gelungen, die toxische Funktion der Aggregate als Ursache für die Entstehung der HD zu beweisen. Einige Autoren wiesen auf die Möglichkeit hin, dass die Eiweißaggregate möglicherweise nur ein Nebenprodukt anderer toxischer Vorgänge darstellen und somit selbst nicht für den Zelluntergang verantwortlich sind (Ordway et al., 1997). Mittlerweile gibt es allerdings auch Theorien über eine mögliche protektive Funktion der Proteinaggregate (Arrasate et al., 2004) Während die Einschlusskörperchen anfangs noch als Schlüssel zur Pathogenese gesehen wurden, mehren sich in letzter Zeit Hinweise, dass sie lediglich ein Epiphänomen sind oder sogar neuroprotektiv wirken.Neurone, die Huntingtin(htt)-Aggregate aufweisen, sind nicht notwendigerweise von einer Neurodegeneration betroffen (Gutekunst et al., 1999). Vielmehr enthalten gerade die von der Neurodegeneration ausgesparten Interneurone die meisten Aggregate (Kuemmerle et al., 1999). Auch konnte mit Hilfe von kultivierten Neuronen, in die mutiertes htt transfiziert wurde, demonstriert werden, dass die Aggregate nicht die Ursache der Neurodegeneration in diesen Zellen darstellen (Saudouet al., 1998). Arrasate et al. berichteten zudem 2004, dass die Überlebensrate der Zellen mit htt-Aggregaten in einem Zellmodell höher war als die ohne (Arrasate et al., 2004). Jedoch konzentrierten sich die meisten dieser Studien auf die nukleären Einschlusskörperchen, so dass die Zytotoxizität der zytoplasmatischen, v.a. der in den Nervenfortsetzungen vorgefundenen Aggregate („neuropil aggregates“), durchaus eine andere Qualität haben können. So konnte in einem transgenen HD-Mausmodell nachgewiesen werden, dass die Formierung von „neuropil aggregates“ enger mit der Entwicklung der neurologischen Symptome in 15 diesen Tieren korreliert als die nukleären Einschlusskörperchen (Li et al., 1999). Ein aktiver neuroprotektiver Effekt der nukleären Einschlusskörperchen konnte jedoch in vivo noch nicht nachgewiesen werden. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass ein Verständnins der Rolle der Aggregate in der Pathogenese der HD weiterer Forschung bedarf. Eine weitere Theorie zur pathogenetischen Entwicklung der Huntington’schen Krankheit legt der Entstehung der Neurodegeneration eine Entzündung des Nervengewebes als Ursache zugrunde. Durch Bjorkqvist et al. wurden bei präsymptomatischen Huntington-Patienten erhöhte Zytokinspiegel im Hirngewebe festgestellt. Bei anschließenden Untersuchungen im R6/2-Mausmodell, wurden die zytokinproduzierenden Zellen des Gehirns, die Mikrogliazellen, mit einem Molekül behandelt wurden, das die Zytokinproduktion triggert. Die Zellen produzierten signifikant größere Zytokin-Mengen als die Zellen von Kontrolltieren. Bjorkqvist et al. vermuten, dass das pathologische Huntingtin zu einer Übererregbarkeit der Immunzellen und damit zu einer Entzündung führt, die eine Degeneration der Nervenzellen verursacht (Bjorkqvist et al., 2008). 2.1.4 Exzitotoxitätstherorie Unter Exzitotoxität versteht man den möglichen toxischen Effekt exzitatorischer Neurotransmitter im Zentralen Nervensystem. Durch eine unphysiologisch hohe Konzentration endogener exzitatorischer Neurotransmitter, z.B. Glutamat, im synaptischen Spalt werden postsynaptische Glutamatrezeptoren übermäßig erregt. Es kommt zum Öffnen von Ionenkanälen und einer Überladung der Zelle mit Calciumionen, was zu einer vermehrten Aktivierung calciumabhängiger Proteasen führt. Dadurch kommt es zu einer Kaskade von Stoffwechselvorgängen, an deren Ende der neurotoxische Zelltod steht (Pavon et al., 1998). Eine pathogenetische Rolle der Exzitotoxität wird bei verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen wie z.B. Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson und vor allem Chorea Huntington diskutiert. Exzitatorische Neurotransmitter wie Glutamat vermitteln ihre exzitatorische Wirkung in erster Linie über Glutamat-Rezeptoren. Im Säugetiergehirn werden nach pharmakologischen Gesichtspunkten vier verschiedene Rezeptoren für 16 exzitatorische Aminosäuren unterschieden: (1) α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionat-Rezeptor (AMPA) (2) Kainat-Rezeptor (3) N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor (NMDA) (4) Metabotroper, Quisqualat-sensitiver Rezeptor (fünf Untergruppen). Die ersten drei Rezeptoren sind an Ionenkanäle gekoppelt, während der letzte GProtein-assoziiert ist. Alle vier Rezeptoren gehören zu den Glutamat-Rezeptoren. Glutamat ist der wichtigste exzitatorische Neurotransmitter im ZNS. Zum ersten Mal wurde das Phänomen der Exzitotoxizität mit der Huntington’schen Erkrankung im Jahre 1976 in Verbindung gebracht. Nach einer Injektion von KainatRezeptor-Agonisten in Rattengehirne konnten neurochemische und neuropathologische Veränderungen beobachtet werden, die denen der Chorea Huntington ähnlich waren (Coyle et al., 1976). Allerdings waren alle Zelltypen von der neurotoxischen Wirkung betroffen, so dass auf diese Weise der typische selektive Zellschaden (s. 2.1.7) nur in eingeschränktem Maße reproduziert werden konnte. Zehn Jahre später wurden Ratten verschiedene Dosen Quinolinsäure (QA) injiziert. Hierbei handelt es sich um einen endogenen Tryptophan-Metaboliten, der im Gehirn hauptsächlich zu Serotonin abgebaut wird. Quinolinsäure wirkt agonistisch am NMethyl-D-Aspartat-Rezeptortyp der Glutamatrezeptoren (NMDA-R). Bei der immunhistochemischen Auswertung konnte festgestellt werden, dass nur SubstanzP-haltige und GABAerge Projektionsneurone vom Zellschaden betroffen waren. Somatostatin und Neuropeptid Y enthaltende Interneurone blieben ausgespart. Damit imitierte dieses Modell deutlich mehr den bei Chorea Huntington beobachteten differenzierten Zellschaden (Beal et al., 1996). Durch intrastriatale Injektionen von Quinolinsäure konnten im Tierversuch einige der bei HD auftretenden Verhaltensauffälligkeiten reproduziert werden (Block et al., 1993). Aufgrund exzitotoxischem der Ähnlichkeit Zellschaden im neuropathologischer Striatum mit den Veränderungen nach neuropatholgischen Beobachtungen bei HD wird angenommen, dass Exzitotoxizität bei der Pathogenese der HD eine ursächliche Rolle spielen könnte. 17 2.1.5 Symptomatik und Verlauf HD ist durch den zunehmenden Verlust der motorischen Kontrolle und der intellektuellen Fähigkeiten gekennzeichnet, sowie durch psychiatrische Veränderungen. Typische Symptome sind tänzelnde oder torkelnde Bewegungen (Chorea, Hyperkinese), Persönlichkeitsveränderungen, Gewaltbereitschaft, Depressionen, Wahnvorstellungen und Demenz (Nakamura et al., 2007). Der Verlauf der HD ist langsam progredient und führt innerhalb eines Zeitraums von meist 15 bis 20 Jahren zum Tod der Patienten. Die Krankheit manifestiert sich typischerweise im Erwachsenenalter, wohingegen 5-10 % der Erkrankungen vor dem 20. Lebensjahr beginnen. Hierbei handelt es sich um die als Westphal-Variante bezeichnete juvenile Verlaufsform der Chorea Huntington, die sich sowohl in den Symptomen als auch im Schweregrad vom normalen Krankheitsverlauf unterscheidet (Topper et al., 1998). Adulte Form Frühstadium Persönlichkeitsveränderungen Juvenile Form Persönlichkeitsveränderungen Evtl. Depressives Syndrom Hypokinese Kognitive Beeinträchtigungen Hypomimie Choreatische Hyperkinesen Ruhetremor Dysdiadochokinese Dysarthophonie Bicksakkadenverlangsamung Spätstadium Demenz Demenz Chronische organische Psychose Dysarthrie Dystonie Rigor Rigor Ruhetremor Mutismus Epileptische Anfälle Tabelle 1: Symptomatik der HD: Symptome der adulten und juvenilen Verlaufsform im Früh- und Spätstadium 18 2.1.6 Diagnostik Die Diagnose der Chorea Huntington erfolgt klinisch durch den Nachweis spezifischer für die Erkrankung charakteristischer motorischer Symptome mit einer für den diagnostizierenden Arzt sehr hohen Sicherheit – in der Regel handelt es sich dabei um die choreatischen Hyperkinesen. Die klinische Diagnose kann durch einen Gentest bestätigt werden, bei dem die Anzahl der CAG-Triplets des Huntington-Gens bestimmt wird. 2.1.7 Pathologie Charakteristische pathologische Befunde bei HD-Patienten finden sich in Form von Atrophien im Bereich der Hirnrinde (des cerebralen Kortex) und der Basalganglien. Der Verlust der Neuronen beginnt im Schwanz des Nucleus caudatus und schreitet von anterior nach lateroventral in Richtung Putamen fort. Die Reduktion der Neurone im Striatum kann bis zu 60% betragen (Vonsattel et al.,1985). Auch im Neocortex findet sich ein Verlust an Neuronen, so dass das gesamte Gehirn im Verlauf der Erkrankung bis zu 30% an Gewicht verlieren kann. Sowohl im Striatum als auch im Cortex sind nicht alle Neuronen gleichmäßig betroffen. Im Striatum, einem Teil der Basalganglien, lässt sich insbesondere die Degeneration mittelgroßer, bedornter enkephaliner bzw. GABAerger Neuronen (medium spiny neurons) nachweisen. Durch den Verlust dieser in erster Linie inhibitorisch auf die Substantia nigra und den Globus pallidus pars medialis wirkenden Neuronen wird der motorische Kortex verstärkt erregt. Dadurch entstehen bei den Patienten die typischen unkoordinierten choreatischen Bewegungen. In den betroffenen Gehirnen findet man außerdem später eine Atrophie im Hypothalamus, im Corpus amygdaloideum und im Thalamus (Schmitz et al., 1999). Immunhistochemisch lassen sich bei HD-Patienten sogenannte intranukleäre Einschlusskörper in vielen Bereichen des Gehirns nachweisen (Qin et al., 2004). Sie sind immunhistochemisch positiv für Ubiquitin und können außerdem mit Antikörpern gegen Polyglutamine nachgewiesen werden. Im Verlauf der Erkrankung nimmt ihre Anzahl zu. 19 2.1.8 Therapie Bisher ist es ausschließlich möglich die Chorea Huntington symptomatisch zu behandeln, nicht aber kausal den Verlauf der Erkrakung zu beeinflussen oder sie gar zum Stillstand zu bringen. Neben physiotherapeutischen Maßnahmen, psychologischer Betreuung und einer möglichst gesunden Ernährung kann durch den Einsatz von Neuroleptika und Antidepressiva versucht werden, die Beschwerden der Patienten zu lindern (Bonelli et al., 2007) (Venuto et al., 2012). Mit Tetrabenazin ist ein Medikament zur Behandlung der choreatischen Hyperkinesen zugelassen. Der Einsatz der antihyperkinetischen Medikamente sollte jedoch afgrund von möglichen Nebenwirkungen zurückhaltend erfolgen (Reilmann et al., 2013). 2.2 Tiermodelle 2.2.1 Avertebraten Zu den bisher in der Huntington-Forschung eingesetzten Tiermodellen zählen auch einige Avertebraten. Neben bestimmten Wurmarten (v.a. Caenorhabditis elegans ) (Voisine et al., 2007) (Parker, et al. 2001) und der Meerschneckenart Aplysia (Lee, et al., 2003), wurden bisher vor allem Drosophila melanogaster-Fliegen (Fruchtfliegen) verwendet (Marshet al., 2003). Das relativ primitive Nervensystem, das bereits über spezialisierte Funktionen wie Visus, Geruchssinn, Lernen und Gedächtnis verfügt, eignet sich gut für die Erforschung neurodegenerativer Erkrankungen. Drosophila-Fliegen wurden und werden u.a. auch in der Parkinson-, Alzheimer- und ALS-Forschung eingesetzt. Phylogenetisch sind die Fruchtfliegen wie auch die anderen Avertebraten jedoch so weit vom Menschen entfernt, dass es nur bis zu einem gewissen Grad möglich ist, Forschungsergebnisse – insbesondere in Bezug auf Therapiestudien – auf den Menschen zu übertragen. 2.2.2 Vertebraten 2.2.2.1 Quinolinsäure-Modelle Die unter 2.1.4 beschriebene Exzitotoxizitätstheorie führte zur Entwicklung einer neuen Gruppe von Huntington-Tiermodellen. 1976 konnte an Ratten erstmalig 20 gezeigt werden, dass die direkte striatale Injektion von Kainat, einem GlutamatAgonisten, die bei Huntington-Patienten beobachteten striatalen Läsionen hervorruft (Coyle et al., 1976). Es folgte eine große Zahl von Veröffentlichungen, die sich mit dem Gebrauch des Glutamat-Analogons als neurotoxische Substanz beschäftigten. Trotzdem ist es mittels striataler Injektion von Kainat nicht hinreichend möglich, die histopathologischen Ereignisse der Chorea Huntigton zu reproduzieren, da sowohl die Projektionsneurone als auch die NADPH-positiven Interneuronen durch das Exzitotoxin vernichtet werden. Letztere bleiben bei Huntington-Patienten größtenteils erhalten. Injiziert man aber Quinolinsäure, einen NMDA-selektiven Glutamat-Agonisten und endogenen Tryptophan-Metaboliten, so degenerieren in erster Linie GABAerge Neuronen, während die NADPH-positive und cholinerge Interneuronen überleben. Dies führte zu der Annahme, dass die selektive Aktivierung von NMDA-Rezeptoren zum histopathologischen Krankheitsbild der Huntington’schen Krankheit führt (Bruyn et al.,). Die exzitotoxischen striatalen Läsionen lösen in den Ratten einige der beim Menschen beobachteten Symptome aus, beispielsweise Hyperkinesen, Gleichgewichtsstörungen und schlechteres räumliches Lernen. Dyskinesien oder choreatische Bewegungsabläufe sind in diesem Modell aber nicht zu beobachten. Die Entwicklung der Quinolinsäure-Modelle führte u.a. zum Versuch der therapeutischen Anwendung von Glutamat-Antagonisten wie Riluzol bei HuntingtonPatienten (Qin et al., 2005), die aber negativ verlief (Landwehrmeyer et al., 2007). 2.2.2.2 Stoffwechsel-Toxin-Modelle (indirekte Exzitotoxitäts-Modelle) Es konnte gezeigt werden, dass die Injektion verschiedener mitochondrialer Toxine (Aminooxyacetat, Rotenon, Malonat, Mpp+, Mg²+, 3-Acetylpyridin) in das Striatum von Ratten zu einem erhöhten Lactatspiegel, ATP-(Adenosin-Triphosphat)- Verarmung sowie zu einer verzögerten neuronalen Degeneration führt und damit eine gravierende Störung des mitochondrialen Energiestoffwechsels verursacht. In den USA wurde 1991 3-Nitropropionsäure (3-NP) als neurotoxisches Agens entdeckt, das für die Vergiftung von Vieh durch die Aufnahme 3-NP-haltiger Pflanzen 21 verantwortlich war (Ludolph et al., 1991). Die Tiere zeigten verschiedene motorische Störungen, generelle Schwäche und Hinterhand-Inkoordination bis hin zu Paralysen. Daraufhin initiierte Studien bewiesen, dass 3-NP Hypoxie-ähnliche cerebrale Läsionen vorwiegend im Bereich der Basalganglien hervorruft. In vitro-Versuche ergaben, dass 3-NP als potenter Hemmstoff der SuccinatDehydrogenase wirkt. Bei der Succinat-DH handelt es sich um ein Enzym, das in der inneren Mitochondrien-Membran lokalisiert ist und die Reduktion von Succinat zu Fumarat katalysiert. Aufgrund der histochemischen Ähnlichkeit zwischen der Huntington’schen Krankheit und dem 3-NP-Modell wurde dieses als weiteres Modell für die Erkrankung vorgeschlagen. Diverse Studien mit Ratten ergaben, dass eine einmalige Gabe selbst hoher Dosen von 3-NP keinen Huntington-ähnlichen Phänotyp hervorrufen kann (Borlongan et al. 1997). Die chronische 3-NP-Intoxikation dagegen führte bei 30% bis 40% der behandelten Tiere zu motorischen Störungen und selektivem striatalem Zellverlust. Verhaltenstests ergaben eine hohe Vergleichbarkeit zwischen der Symptomatik bei den injizierten Tieren und dem Verlauf der Erkrankung bei Patienten. Beispielsweise zeigten sich bei den behandelten Tieren Spontanbewegungen, wobei die Tiere in der Frühphase der Behandlung eine Hyperkinese, in der Spätphase dagegen eine Hypokinese aufwiesen (Borlongan et al., 1997). Damit unterscheidet sich das 3-NP-Modell von den anderen Injektionsmodellen, bei denen es zu keiner progressiven motorischen Veränderung kommt, die für die Huntington’sche Krankheit aber von großer Bedeutung ist. 1990 entwickelten HANTRAYE et al. ein Primatenmodell, indem sie heranwachsende Paviane über 16 Wochen mit 3-NP behandelten (Hantraye et al., 1990). Die Tiere zeigten zunächst eine symptomfreie Phase. Anschließend wurde ihnen der GlutamatAntagonist Apomorphin injiziert, und die Tiere zeigten abnormale Spontanbewegungen. Nach drei Monaten entwickelten die Affen spontane Dyskinesen und Dystonien der Extremitäten. Die postmortale Untersuchung ergab das Vorhandensein von bilateralen striatalen Läsionen ohne messbare extrastriatale Beteiligung. 22 2.2.2.3 Transgene Tiermodelle Diese Tiermodelle tragen in ihrem Genom Teile eines menschlichen Gens. Man unterscheidet transgene, knock-in, knock-out und vektor-induzierte Modelle. Transgen bedeutet, dass das mutierte Gen bzw. der mutierte Genabschnitt zufällig positioniert in das Genom des Tieres eingebracht wird und somit das pathologische Protein zusätzlich zum endogenen, normalen Huntingtin produziert wird. Im Unterschied dazu, wird bei knock-in-Modellen das Gen gezielt in den entsprechenden Genort des Tieres eingebracht. Knock-out-Modelle sind Tiermodelle, in denen ein gesamtes Gen oder Genabschnitte ausgeschaltet werden. Bei vektorinduzierten Modellen wird das Gen mittels viraler Vektoren in das Genom des Tieres eingebracht. Hierbei kann der Ort der Genexpression präzise lokalisiert werden. Nachteil ist jedoch der im Vergleich zu anderen knock-in-Modellen hohe technische Anspruch (Wang et al., 2006). 2.2.2.3.1 Maus-Modelle Das erste und mittlerweile weit verbreitete transgene Tiermodell mit Ausprägung eines HD-Phänotyps, die R6-Maus, wurde 1996 unter der Regie von Gillian Bates entwickelt (Mangiarini et al., 1996). Insgesamt entstanden sechs Linien, von denen vier Linien sehr lange CAG-Repeats exprimieren (R6/1 mit ca. 115 Reapeats, R6/2 mit ca.145 Repeats, R6/5 mit ca. 135 Repeats und R6/0 mit ca. 142 Repeats). Die R6/2-Maus ist kommerziell erhältlich, am weitesten verbreitet und am besten untersucht. Diese Linie exprimiert das erste Exon des humanen Huntington-Gens mit ca. 141 bis 157 CAG-Repeats (Wang et al., 2006). Sie entwickelt einen sehr frühzeitig manifesten und schnell progredienten Phänotyp mit progressiven motorischen Defiziten, Lernstörungen und Verhaltensauffälligkeiten (Carter et al.,1999) (File et al., 1998). Histologisch finden sich intranukleäre neuronale Ablagerungen und eine striatale Neurodegeneration (Davies et al., 1997), (Davies et al., 1999). Im Vergleich zu der ausgeprägten Symptomatik ist der nachweisbare neuronale Zelltod jedoch auffallend gering (Wang et al., 2006). Die Mäuse sterben im Alter von ca. 8 bis 16 Wochen. Die 23 Übertragbarkeit der Ergebnisse von Therapiestudien auf den Menschen scheint problematisch, da die Patienten wesentlich niedrigere Repeatzahlen aufweisen (meist 40 bis 50) und die Krankheit schleichend über Jahrzehnte verläuft. Das R6/2Modell entspricht eher der seltenen juvenilen Variante der Huntington’schen Krankheit (Westphal-Variante), die ebenfalls mit langen CAG-Repeats einhergeht und frühzeitig letal endet (Harper et al., 1996). Im Gegensatz zu den R6-Mäusen, die lediglich ein Fragment des htt-Gens exprimieren, wurden auch zahlreiche "full-length"-Mausmodelle entwickelt, die das gesamte Gen exprimieren und ab Repeatlängen von etwa 50 einen Phänotyp entwickeln (Wang et al., 2006). 1999 entwickelten Hayden et al. die YAC-Maus, bei der es durch den Einsatz künstlicher Hefe-Gene (Yeast artificial genes) als Vektoren gelang, das gesamte Huntington-Gen in das Erbgut der Tiere einzubringen (Hodgson et al., 1999). Trotz der vergleichsweise langen Repeatzahl von 128 Repeats entwickelt die YAC-Maus eine langsam progrediente Neurodegeneration. Obwohl im Striatum insgesamt keine erhöhte Htt-Expression zu finden ist, treten nukleäre lokalisierte Htt-Aggregate zeitlich früher und in größerem Ausmaß auf als in anderen Geweben. Das Auftreten des mutierten Huntingtins im Zellkern korreliert überdies zeitlich mit dem Beginn der Verhaltensauffälligkeiten und motorischen Defizite der Mäuse (Wang et al., 2006). 2.2.2.3.2 Die transgene Huntington-Ratte Im Jahr 2003 gelang die Entwicklung einer transgenen Huntington-Ratte, die ebenfalls einen gut reporduzierbaren Phänotyp entwickelt (von Horsten et al., 2003). Die transgene Ratte exprimiert ein cDNA-Fragment mit 51 CAG-Repeats unter der Kontrolle des nativen Huntington-Promoters der Ratte (Holzmann et al., 1998). Zwei Linien konnten erfolgreich etabliert werden. Die Linie 2762 wurde über mehr als zwei Jahre im Detail charakterisiert (Nguyen et al., 2006). Es existieren sowohl homozygote als auch heterozygote Tiere. Die homozygoten Ratten tragen zwei identische Kopien des mutierten HD-Gens, während die heterozygoten jeweils ein „krankes“ und ein „gesundes“ Gen exprimieren. Mittels PCR konnte die Expression 24 des N-terminalen Fragments des mutierten Hungtingtin-Proteins im Gehirn nachgewiesen werden, insbesondere im frontalen und temporalen Cortex, dem Hippocampus, den Basalganglien und dem Mesencephalon. Eine deutlich geringere Expression fand im Kleinhirn und Rückenmark statt (Von Horsten et al., 2003). Abb. 1 Genom-Veränderungen der transgenen Huntington-Ratte (tgHD-Ratte) Die ersten 154 Basenpaare einer partiellen Huntingtin-cDNA, die 1962 Basenpaare des N-terminalen Fragments der Rattensequenz umfasst, wurde durch ein PCR-Produkt des betroffenen Allels eines HD-Patienten ersetzt. Die cDNA wird gesteuert durch ein 885Bp-Fragment des nativen RattenPromotors (Position 900 bis15 Bp). Schließlich wurde ein 200Bp-Fragment, das das SV40Polyadenylation-Signal enthält, an die cDNA angefügt, so dass der RHD/Prom51A-Promotor entstand (von Horsten et al., 2003). 25 Abb. 2 : Westernblotanalyse von Hirngewebe der transgenen Ratten-Linien 2771 und 2762 mit Hilfe des polyklonalen Anti-Huntingtin-Antikörpers 675 Es ist ein 75 kDa-Produkt erkennbar, das die Expression des Transgens repräsentiert, wenn auch auf einem niedrigeren Level als das endogene Protein. Homozygote Ratten (+/+) exprimieren etwa doppelt so viel transgenes Protein wie heterozygote Tiere (+/-) und Kontrollen (-/-) (von Horsten et al., 2003). Abb. 3: Westernblot-Analyse verschiedener Hirngewebe-Anteile der Rattenlinie 2762 in einem Alter von 6 Monaten: Die Expression des transgenen Huntingtins konnte im frontalen und temporalen Cortex, dem Hippocampus, den Basalganglien und dem Mesencephalon, nicht aber im Kleinhirn und dem Rückenmark nachgewiesen werden. Eine Wiederholung desselben Westernblots zeigte eine Expression des trangenen Huntingtins auch in Kleinhirn und Rückenmark, allerdings auf einem wesentlich niedrigeren Level (Daten nicht in der Abb. gezeigt) (von Horsten et al., 2003). 26 Der Phänotyp entwickelte sich bei den von v. Hörsten et al. entwickelten HuntingtonRatten im adulten Tier. Typische Symptome sind reduzierte Angst, kognitive Defizite und langsam progrediente motorische Defizite (s. Abb. 1). Der Phänotyp und Verlauf kommt dem von Huntington-Patienten mit ungefähr gleicher CAG-Repeatlänge sehr nahe. Die Manifestation der einzelnen Defizite erfolgt in einer relativ stabilen zeitlichen Abfolge (von Horsten et al. 2003). Dies ist sehr hilfreich für die Evaluation des Erkrankungsstadiums der Ratten und möglicher Therapieeffekte. Abb. 4: Ungefähre Zeitachse (in Monaten) der Manifestation der Symptome der transgenen Ratten Mit ca. zwei Monaten entwickeln die Tiere eine reduzierte Angst-Wahrnehmung, mit ca. 6 Monaten motorische Defizite in motorischen Tests, mit etwa 10 Monaten Defizite im Lernen. HuntingtinAggregate sind ab einem Alter von 10 Monaten histopathologisch nachweisbar. Ab dem 12. Lebensmonat ist ein Verlust von Neuronen erkennbar (von Horsten et al., 2003). (pn=perinatal) Nach der Geburt sind sowohl die homozygoten als auch die heterozygoten transgenen Ratten von den wildtyp-Ratten phänotypisch nicht zu unterscheiden. Etwa ab dem zweiten Lebensmonat zeigen transgene Ratten eine reduzierte Angst in psychophysischen Tests. Bereits ab dem fünften Lebensmonat sind signifikante motorische Defizite im Accelerod-Versuch nachweisbar (Nguyen et al., 2006). Ungefähr ab dem fünfzehnten Monat finden sich ferner Reduktionen der kognitiven Leistungen, z.B. im räumlichen Lernen und im Kurzzeitgedächtnis (Kantor et al., 2006), (Cao et al., 2006). Ab dem 20. Lebensmonat zeigen homozygot transgene Tiere ausgeprägte choreiforme Bewegungen in Form von Drehungen um die eigene Achse und abrupten, schnellen, kurzen und unwillkürlichen Bewegungen des Kopfes 27 (Cao et al., 2006). Die Manifestation von psychosozialen und Verhaltensauffälligkeiten vor dem ersten Auftreten motorischer Defizite ist bei Huntington-Patienten ein häufig beobachtetes Phänomen (Harper et al., 1996), (Jason et al., 1997). Histopathologisch finden sich in den transgenen Ratten nukleäre Ablagerungen in den striatalen Nervenzellen (von Horsten et al., 2003) wie auch bei den HuntingtonPatienten (Scherzinger et al., 1997), (Martindale et al., 1998). Der Nachweis gelang mit EM48, einem selektiven Antikörper für Huntingtin (Gutekunst et al., 1999), (Li, et al., 2000). Die nukleären Aggregate in den Ratten finden sich in erster Linie im Striatum, aber auch im Kortex. Sie bilden sich erstmals zwischen dem sechsten und zwölften Lebensmonat und nehmen im Verlauf der Erkrankung zu – s. Abb. 4 (von Horsten et al., 2003). Die Aggregate können daher ebenfalls als Marker für VerlaufsStudien zur Progredienz der Erkrankung in den Ratten genutzt werden. Histopathologische Untersuchungen an 19 und 23 Monate alten Tieren zeigten eine ausgeprägte Verbreiterung der lateralen Ventrikel sowie eine deutliche Atrophie des Striatums (Petrasch-Parwez et al., 2007). V. Hörsten et al. untersuchten 2003 einige acht Monate alte transgene HD-Ratten mittels Magnet-Resonanz-Tomographie (MRT) und konnten verbreiterte laterale Ventrikel sowie fokale Läsionen im Striatum nachweisen. Die FDG-Positronen-Emissions-Tomographie (PET)-Untersuchung 24 Monate alter homozygoter Tiere ergab einen herabgesetzten Glucose-Stoffwechsel im gesamten Gehirn der transgenen Tiere im Vergleich zu den Kontrolltieren gleichen Alters und Geschlechts (von Horsten et al., 2003). Bode et al. analysierten 2008 erstmals geschlechtsspezifische Unterschiede bei den Huntington-Ratten. Tiere im Alter zwischen 4 und 14 Monaten wurden mit verschiedenen Verhaltenstests sowieso histopathologisch untersucht. Das Ergebnis zeigte bei allen transgenen Tieren eine signifikante Änderung im Sozialverhalten, aber nur bei den männlichen 14 Monate alten Tieren eine Verschlechterung der motorischen Funktion im Accelerod-Test, einem Test, bei dem sich die Tiere möglichst lange auf einer rotierenden Stange halten müssen (Bode et al., 2008). 28 Bei keinem Geschlecht gelang der histopathologische Nachweis einer generellen Atrophie des Striatums oder des Neocortex. Man fand jedoch eine deutliche Abnahme der MSN (medium sized spiny neurons) sowie der D1-DopaminRezeptordichte bei den männlichen Tieren, während die weiblichen Tiere von den Kontrolltieren nicht zu unterscheiden waren. Als Ursache nahmen BODE et al. einen niedrigeren 17-beta-Östradiolspiegel bei den männlichen Tieren an, da bereits einige Studien auf den neuroprotektiven Effekt des weiblichen Sexualhormons hindeuteten (Gillies et al.,, 2004) (Heron et al., 2000) (Dubal et al., 2006). 2.2.3 PET-Bildgebung Ein vielfach in der HD-Diagnostik angewandtes Verfahren ist die PositronenEmissions-Tomographie (PET). In den Patienten injizierte radioaktive MarkerSubstanzen werden mittels bestimmter Detektorsysteme sichtbar gemacht und können so die Verstoffwechselung der betreffenden Substanz und damit den Funktionszustand der zu untersuchenden Gewebe und Zellen darstellen. Bei der FDG-PET wird als Tracer radioaktive Glucose (F18-Fluordesoxy-Glucose, FDG) verwendet und der Glucosestoffwechsel im Gehirn des Patienten gemessen. Untersuchungen an prä- und frühsymptomatischen Huntington-Patienten mittels FDG-PET ergaben bereits bei der präsymptomatischen Gruppe einen deutlich herabgesetzten Glucosestoffwechsel im Striatum und mediotemporalen Kortex (Feigin et al., 2001). Mit zunehmender Symptomatik nahm der Glucosemetabolismus in den o.g. Hirnbereichen weiter ab. Der Glucose-Hypometablismus im Bereich der Hirnrinde stand im Zusammenhang mit Gedächtnisverlust, Sprach- und Wahrnehmungsstörungen (Montoya et al., 2006 ), (Wolf et al.,2008). Keine Unterschiede von HD-Patienten zu Normalprobanden konnten im Bereich des Thalamus und des Kleinhirns gefunden werden (Kuwert et al., 1990). 29 2.2.4 Vorversuche an HD-Ratten Von Hörsten et al. untersuchten 2003 homozygot transgene Tiere im Alter von 24 Monaten mittels F18-FDG-PET. Die Tiere zeigten einen im Vergleich zu den KontrollTieren signifikant herabgesetzten Glukose-Metabolismus im Gesamthirn. Einzelne Hirnregionen wurden nicht gesondert untersucht (von Horsten et al., 2003). Abb. 5: PET-Untersuchung des Gehirns transgener HD-Ratten und ihrer Kontrolltiere Horizontale (B-D) und coronale (F-G) F18-FDG-PET-Bilder im Zusammenhang mit individuellen MRTBildern (A, E) und ex vivo-Autoradiographien von tgHD-Ratten (C,D, G, H, ) und Kontrolltieren ( B, F). Die transgenen Tiere zeigten signifikant höhere FDG-Aktivitäts-Level als die Kontrolltiere (von Horsten et al., 2003) 2.2.5 MRT-Bildgebung Zahlreiche Studien mit präsymptomatischen und symptomatischen HuntingtonPatienten ergaben eine deutliche Korrelation zwischen dem Stadium der Erkrankung, dem Ausmaß der psychischen und motorischen Defizite und den morphologischen Veränderungen im Gehirn (Tabrizi et al., 2012) (Bechtel et al., 2010) (Scahill et al., 2011). Die Patienten weisen bereits Jahre bis Jahrzehnte vor dem erwarteten Ausbruch der Erkrankung bzw. dem ersten Auftreten von Symptomen eine im MRT 30 messbare striatale und kortikale Atrophie auf (Montoya et al., 2006), (Paulsen et al., 2004), (Gavazzi et al., 2007), (Kassubek et al., 2004), (Aylward et al., 1997), (Wolf et al., 2008), (Harris et al., 1992). 2.2.6 Vorversuche an HD-Ratten Von Hörsten et al. untersuchten 2003 acht Monate alte homozygot transgene Tiere MR-tomographisch und konnten verbreiterte laterale Ventrikel und fokale Läsionen im Striatum nachweisen (s. Abb. 6) (von Horsten et al., 2003). Abb. 6: MRT-Aufnahmen des Gehirns einer transgenen HD-Ratte und eines Kontrolltieres A, E coronale Projektion Kontrolltier; B horizontale Projektion Kontrolltier; C, F coronale Projektion transgenes Tier; D horizontale Projektion transgenes Tier. Die Pfeile bezeichnen die erweiterten lateralen Ventrikel (C) sowie fokale Läsionen im Striatum bei dem transgenen Tier (F) (mod. nach von Horsten et al., 2003). 2.3 Verhaltenstest /Accelerod Beim Accelerod handelt es sich um ein speziell für Mäuse und Ratten entwickeltes Laufrad, mit dem die motorische Leistung der Tiere, insbesondere die Koordination der Vorder- und Hinterläufe und die Gleichgewichtsfunktion, erfasst werden kann 31 (Carter et al. 1999) (Crawley et al. 1999) (Karl et al., 2003). Die Tiere werden auf sich drehende Rollen gesetzt, deren Geschwindigkeit gesteuert werden kann. Gemessen werden die Zeit, die die Tiere auf der Rolle verbleiben, sowie die Anzahl der erfolgreich überstandenen Umdrehungen. 2.3.1 Bisherige Ergebnisse von Accelerod-Untersuchungen transgener HDRatten 2003 untersuchten v. Hörsten et al. erstmals eine Gruppe homozygot und heterozygot transgener HD-Ratten mittels Accelerod und kamen zu dem Ergebnis, dass bei Tieren im Alter von fünf Monaten noch keine motorischen Defizite im Vergleich zu den Kontrolltieren festzustellen waren. Mit Beginn des zehnten Lebensmonates verschlechterte sich die Vorder- und Hinterhandkoordination der transgenen Tiere zusehends, wobei die homozygoten Tiere deutlich kürzere Laufzeiten erreichten als die heterozygoten (von Horsten et al., 2003). 2006 konnten Nguyen et al. in einer weiteren Studie mit homo- und heterozygoten HD-Ratten bereits ab dem fünften Lebensmonat eine signifikante Verschlechterung der motorischen Fähigkeiten der Tiere erkennen, wobei wiederum die homozygoten Vertreter eine schnellere und stärkere Degeneration zeigten als die heterozygoten. Bemerkenswert war eine zunächst sichtbare Steigerung der motorischen Leistungsfähigkeit der homozygot transgenen Tiere im Vergleich zu ihren Kontrolltieren im zweiten und dritten Lebensmonat (Nguyen et al., 2006). Den o.g. Ergebnissen widersprach eine 2008 von Bode et al. veröffentlichte Studie, in der zum ersten Mal auch geschlechtsspezifische Unterschiede untersucht wurden (Bode et al., 2008). Hier wurden bis zum 14. Lebensmonat keine signifikanten Unterschiede zwischen transgenen Tieren und Kontrollen deutlich. Lediglich die homozygot transgenen männlichen Ratten wiesen ab dem 14. Lebensmonat ein Defizit in der Motorfunktion auf, während die weiblichen Artgenossen sich nicht von ihren Kontrollen unterschieden. 32 3 Material und Methoden 3.1 Chemikalien und Verbrauchsmaterial Bezeichnung Hersteller Größe/Menge Butterfly Venenkatheter BD 23G Einmal-Untersuchungshandschuhe Maimed L Einstreu Weichholzgranulat Altromin 20 kg Einwegspritzen BD 1 ml Einwegspritzen BD 10 ml F18-Fluordesoxy-Glucose Universitätsklinik Münster Braun Isofluran (1-Chloro-2,2,2trifluoroethyldifluoromethylether), Forene®Isofluran Kanülen Abbot 25.000 Einheiten/50 ml 250 ml BD 23G Klebeband Leukosilk 0,5 cm Natriumchlorid-Lösung 0,9% Braun 50ml PVC-Schlauch BD 23 G Tierfutter Zucht und Haltung 131 für Mäuse und Ratten Altromin 25kg Heparin-Natrium-Lösung Tabelle 2: Chemikalien und Verbrauchsmaterial 3.2 Geräte und Laborgegenstände Accelerod Feinmechanik, Universitätsklinikum Münster 4-Element-Oberflächenspule, 7cm Philips Medical Systems, Hamburg Isofluran-Inhalationsnarkose-Gerät Dräger, Lübeck Sulla 800V Isofluran-Vapor Dräger, Lübeck Magnetresonanz-Tomograph 3 Philips Entera, Best, NL Tesla Metallrestrainer für Ratten Narkose-Box PET-Scanner Quad-HIDAC-PET Tabelle 3: Geräte und Laborgegenstände Feinmechanik der Orthopädie, Universitätsklinikklinik Münster Feinmechanik der Orthopädie, Universitätsklinikklinik Münster Philips Medical Systems, Hamburg, D 33 Multi-Purpose-Imaging-Tool Advanced Tomo Vision, Gesellschaft für medizinische Bildverarbeitung mbH, Kerpen SPSS-Statistik-Programm SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA Tabelle 4: Computersoftware 3.3 Tiere und Tierhaltung Für die Untersuchungen wurden transgene Huntington-Ratten der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Stefan von Hörsten, Universitätsklinik Erlangen, verwendet. Es handelte sich um 35 Sprague Dawley Ratten der Linie 2762 (von Horsten et al., 2003), geboren im Juni 2006. Für die nicht transgenen Vergleichsgruppen wurden die als nicht transgen getesteten Geschwistertiere verwendet. Bei den transgenen Tieren handelt es sich um für Chorea Huntington homozygot transgene Tiere. Die Gruppengröße betrug zu Beginn der Studie bei den weiblichen transgenen Tieren 9, bei den weiblichen Kontrolltieren (wildtyp) 8, bei den männlichen transgenen Tieren 8 und bei den männlichen Kontrolltieren (wildtyp) 10. Genotyp / Tierzahl weiblich männlich wildtyp 8 10 transgen 9 8 Tabelle 5: Genotyp, Geschlecht und Anzahl der im Versuch verwendeten Ratten Die Tiere wurden in einem vollklimatisierten Raum mit einer relativen Luftfeuchte von ca. 50% +/- 10% und einer durchschnittlichen Raumtemperatur von 24° C gehalten, in dem sie einem zwölfstündigen Hell-Dunkelrhythmus ausgesetzt waren. Die transgenen und nicht transgenen Tiere lebten gemischt in Makrolon-TypIV-Käfigen auf entstaubtem Weichholzgranulat und hatten freien Zugang zu Trinkwasser (Makrolon-Trinkflaschen) und Standardfutter (Altromin 131 Haltungsfutter für Ratten 34 und Mäuse). Die Räumlichkeiten befanden sich im S-1-Bereich des Tierstalls des Instituts für Pharmakologie der Uniklinik Münster unter der Leitung der Zentralen Tierexperimentellen Einrichtung (ZTE). Die Tierversuchsgenehmigungsnummer der Bezirksregierung Münster lautete G54/2006. 3.4 Positronen-Emissionstomographie Die funktionelle Bildgebung des Gehirns mit der Positronen-Emissions-Tomografie (PET) beruht auf der Messung radioaktiver Strahlung (Gammastrahlung) durch ringförmig um den Schädel angeordnete Detektoren. Die Strahlung wird von einem vorher injizierten Radionuklid emittiert, einem sog. β+-Strahler. Dieser emittiert Positronen. Trifft ein durch den Zerfall des Radionuklids entstandenes Positron auf ein Elektron, so werden beide vernichtet (Annihilation). Es entstehen dabei zwei hochenergetische Photonen (Gammastrahlen) mit einer Energie von exakt 511 keV, die sich in einem Winkel von 180° voneinander entfernen. Abb. 7: Funktionsprinzip eine Animal-PET-Scanners (mod. nach Beer, 2007): Der injizierte β-Strahler emmittiert im Körper Positronen, die beim Aufprall auf ein Elektron vernichtet werden. Bei der Vernichtung entstehen hochenergetische Photonen, die sich in einem Winkel von 180° von einander entfernen. Die Messung dieser Photonen mittels gegenüberliegender Detektoren ermöglicht den Rückschluss auf die Lokalisation ihrer Entstehung. Die Aufzeichnung einer großen Zahl dieser Ereignisse führt zur Entstehung eines zweidimensionalen Bildes (Beer et al. 2007). 35 Aufgrund des gleichzeitigen Eintreffens dieser beiden Gammaquanten (Vernichtungsstrahlung) auf gegenüberliegenden Detektoren kann auf den Ort ihres Entstehens geschlossen werden. Werden zwei Gammaquanten mit einer Energie von 511 keV innerhalb eines Zeitfensters von 4,5 bis 15 Nanosekunden nachgewiesen, so wird dies als Positron-Elektron-Vernichtung auf der gedachten Linie zwischen den signalgebenden Detektoren interpretiert (Line of Response (LOR) bzw. Koinzidenzlinie) (Yamamoto et al., 1984). Werden ausreichend viele Strahlen emittiert, so lässt sich ein zweidimensionales Schnittbild des Gehirns erstellen. Da der Ort der Bildung der Gammastrahlen aus Positron und Elektron einige Millimeter vom Ort der Emission des Positrons entfernt liegen kann, ist die räumliche Auflösung der PET technischen Beschränkungen unterworfen (Jamieson et al., 1989). Bei dem am häufigsten und auch in diesem Versuch verwendeten Radionuklid handelt es sich um das radioaktive Isotop des Fluors (F18). Es wird in einem Zyklotron hergestellt und besitzt eine Halbwertszeit von 110 Minuten (Heiss et al., 1984). Zur Herstellung des Radiopharmakons, des Tracers, wird das F18 wird in Glucose eingebaut, indem eine Hydroxylgruppe der Glucose durch ein F18-Molekül ersetzt wird. Die so entstandene F18-Fluordesoxyglucose (FDG) wird von den Körperzellen wie normale Glucose aufgenommen. Nach der Phosphorylierung wird FDG nicht weiter verstoffwechselt, so dass es zu einer Anreicherung im Gewebe kommt. Die Verteilung von FDG im Körper erlaubt somit Rückschlüsse auf den Glucosestoffwechsel in den verschiedenen Geweben bzw. den verschiedenen Hirnstrukturen (Graham et al. 2001). Auf dem Weg zu den Detektoren kann die Koinzidenzstrahlung gestreut und absorbiert werden. Ziel der PET-Messung ist es natürlich, ausschließlich wahre Koinzidenzen („Trues“) zu messen. Wahre Koinzidenzen liegen vor, wenn zwei entstandene Photonen die Ratte ohne Wechselwirkung (Streuung) durchqueren konnten, anschließend ihre volle Energie an zwei in Koinzidenz geschalteten Detektoren abgegeben haben, die im Anschluss von der Messelektronik auch als solche erkannt wurden. Dafür muss die Flugrichtung beider Photonen im Sichtbereich der Detektoren liegen, und keines der Photonen darf durch Streuung an Energie verlieren oder durch Absorption komplett verschwinden (Yamamoto et al., 1984), (Jamieson et al., 1989). 36 Abb. 8: Prinzip der wahren Koinzidenz: zwei entstehende Photonen durchqueren den Körper ohne Wechselwirkung Nicht erwünscht ist die Entstehung sogenannter „Singles“ - d.h. nur eines der entstandenen Photonen kann nachgewiesen werden. Dieses passiert u.a. wie oben beschrieben durch Streuung, Absorption, Durchdringen des Detektorringes oder durch das Auftreffen eines Photons auf einen bereits „beschäftigten“ Detektor. Wird ein Single als solches erkannt, wird es verworfen und trägt nicht zur Bildentstehung bei. Es kann allerdings passieren, dass zwei Singles zufällig zur gleichen Zeit (bzw. im bestimmten Zeitfenster) auf zwei in Koinzidenz geschaltete Detektoren auftreffen und so fälschlicherweise als Vernichtungsstrahlung interpretiert werden und in die Bildrekonstruktion eingehen. Diese sog. „Randoms“ lassen sich verringern durch eine niedrige Radionukliddosis, ein kleines Koinzidenzfenster, eine große Zahl an Detektoren sowie die Verringerung der Zahl der gemessenen Singles. 37 Abb. 9: Prinzip der Entstehung von „Randoms“: zwei Singles treffen zufällig zur gleichen Zeit auf zwei in Koinzidenz geschaltete Detektoren Ein weiteres unerwünschtes Ereignis, die gestreuten Koinzidenzen oder „Scatter“, entsteht durch die Streuung eines Photons auf dem Weg zum Detektor. Abb. 10: Prinzip der Entstehung gestreuter Koinzidenzen (Scatter) durch die Streuung von Photonen auf dem Weg zum Detektor. Daraus resultiert eine Fehllokalisation, da der Ortsbestimmung im PET immer eine gerade Strecke zugrunde liegt. Da der Ortsbestimmung im PET jedoch immer eine gerade Strecke zwischen zwei gleichzeitig auftreffenden Ereignissen zugrunde liegt, führt dies zu einer Fehllokalisation. Da Photonen durch die Streuung aber an Energie verlieren, können solche gestreuten Koinzidenzen durch die Verwendung einer angemessenen unteren Energieschwelle weitestgehend vermieden werden. Eine andere Möglichkeit der Vermeidung von Scatter ist die Verwendung von Septen bzw. Endshields. Diese 38 verhindern, dass die gestreuten Photonen überhaupt zu den Detektoren gelangen (Townsend et al., 2004). Um die gemessenen Daten aufzunehmen, gibt es verschiedene Verfahren, die statische, die dynamische und die getriggerte Datenaufnahme. Die einfachste und auch in diesem Versuch angewandte Methode ist die statische Aufnahme. Hierbei werden alle Ereignisse, die während einer bestimmten Zeitspanne an derselben Aufnahmeposition ablaufen, für die Bildrekonstruktion verwendet. Typischerweise werden bei der FDG-PET Koinzidenzen über eine Zeitspanne von zwei bis vier Minuten aquiriert. Je länger die Aufnahme läuft, umso größer wird die Zahl der für die Bildrekonstruktion verwendbaren Koinzidenzereignisse, was die Bildqualität im Hinblick auf das Signal-Rauschverhältnis verbessert. Eine Verlängerung der Aufnahmedauer vergrößert jedoch andererseits die Wahrscheinlichkeit von Bewegungsartefakten durch willkürliche und physiologische Bewegungen des untersuchten Tieres. Die statische Aufnahme gibt ausschließlich Aufschluss über die zum Aufnahmezeitpunkt im Untersuchungsvolumen angereicherte Tracermenge, nicht aber über die Geschwindigkeit der Anreicherung (Townsend et al., 2004). Kleintier-PETs stellen aufgrund der geringen Größe der darzustellenden Strukturen höhere Anforderungen an die räumliche Auflösung als die gängigen humanmedizinischen Scanner. Bei dem in diesem Versuch verwendeten Scanner handelt es sich um den quadHIDAQ-PET-Scanner. Mit diesem System ist es möglich, Bilder mit einer räumlichen Auflösung von unter einem Millimeter zu akquirieren (Schafers et al., 2003). Es wurden zwei verschiedene Arten von Tier-PET-Scannern entwickelt. Die erste Art benutzt Photonen-sensible Kristalle als Detektoren (bspw. MicroPET4, MADPET, Hammersmith rat PET, YAP-PET, Sherbrooke APD PET, SHR-7700, ANIPET, Clear PET, TierPET). Bei der anderen Art werden multi-wire chambers (d.h. aus mehreren Drähten bestehende Kammern) verwendet, die die ankommenden Photonen in Elektronen umwandeln, die dann wiederum in einem starken elektrischen Feld vervielfältigt („Avalanche- oder Lawinen-Effekt“) und mit Hilfe von Anoden-Drähten detektiert werden. Hierzu zählt der QuadHIDAC-PET-Scanner, hergestellt von der 39 Firma Oxford Positron Systems Ltd, UK. Er basiert auf „High Density Avalange Chambers“ (HIDAC), welche aus beschichteten Kathoden bestehen, die sich überlappende, isolierte Bleischilder enthalten, in die kleine Löcher mit einem Durchmesser von 0,4 mm gebohrt sind. Jedes dieser Löcher funktioniert als kleiner Detektor, der ein ankommendes Photon einfängt und durch den Avalanche-Effekt in einem starken elektrischen Feld amplifiziert. Hier wird es von Anoden detektiert. Das Resultat ist eine präzise zweidimensionale Lokalisation der einfallenden Gammastrahlung. Insgesamt beinhaltet der Scanner 32 Module, die zu vier Detektorbänken zusammengefasst sind. Das Field-of-View des Scanners besitzt einen Durchmesser von 17 cm und eine Länge von 28 cm. Die räumliche Auflösung beträgt über das gesamte FOV nahezu konstant 1,09 mm³. Die absolute Sensitivität im Zentrum des FOV liegt bei 18 kBq. Damit ist es den sonstigen zu Zeit verfügbaren Animal-PET-Scannern eindeutig überlegen (Schafers et al., 2003). 3.4.1 PET-Scanner In der Klinik für Nuklearmedizin der Universitätsklinik Münster stand ein hochmodernes Tier-Quad-HIDAC-PET (High Density Avalange Chambers) von der Firma Oxford Positron Systems Ltd. aus Oxford in England zur Verfügung. Es ermöglichte die Anfertigung von Bildern mit sehr hoher dreidimensionaler Auflösung (Schafers et al., 2003). Technisch konnte eine Auflösung von weniger als 1mm in allen Richtungen erreicht werden. Eine Darstellung des Hirnstoffwechsels der tgHDRatten mit FDG war in baugleichem PET in vorangegangenen Studien sehr gut möglich (Magata et al., 1995), (Chatziioannou et al., 2002). 3.4.2 Tracer Als Tracer wurde F18-Fluoro-Desoxy-Glucose, das radioaktive Isotop der 2-Fluor-2deoxy-D-Glucose (FDG) verwendet. Zur Herstellung wird das natürliche Fluoratom der FDG mit der Nukleonenzahl 19 durch das radioaktive Fluor-18-Isotop ersetzt. So entsteht ein Positronen-Emitter mit einer Halbwertszeit von 109,8 Minuten. Die Herstellung erfolgt in einem Zyklotron, in dem mit dem Sauerstoffisotop O18 40 angereichertes Wasser mit hochenergetischen Protonen bombardiert wird. Dabei wird in einer Kernreaktion ein kleiner Teil des O18-Sauerstoffs unter Aufnahme je eines Protons und der Abgabe eines Neutrons in das radioaktive Fluorisotop F18 umgewandelt. Über einen Ionenaustauscher wird das gebildete Fluorid vom Wasser abgetrennt und anschließend über verschiedene Zwischenschritte in das FGD eingebaut (Graham et al., 2001). F18-FDG wird von den Zellen des menschlichen oder tierischen Körpers wie Glucose aufgenommen, aber nach der Phosphorylierung zu FDG-6-Phosphat nicht weiter verstoffwechselt. Deshalb findet eine Anreicherung von FDG-6-Phosphat in den Zellen statt. Anhand des Zerfalls von F18 kann FDG detektiert werden. F18 zerfällt in O18 und Glucose, die auf normalem Wege weiter verstoffwechselt und abgebaut wird. Es überwindet auf Grund seiner geringen Größe problemlos die Blut-HirnSchranke und kann so zu Untersuchung des Glucosestoffwechsels im Gehirn verwendet werden (Goto et al., 1993). 3.4.3 Untersuchungsablauf Am Vorabend der Untersuchung wurden die Ratten durch Futterentzug nüchtern gesetzt, Wasser stand ihnen weiterhin ad libitum zur Verfügung. Zur PETUntersuchung wurden die Tiere nacheinander mit einer Isofluran-Inhalationsnarkose (Einleitung mit 4 % Isofluran, Erhaltung mit 2 % Isofluran, Sauerstoff-Flow 0,8 l/min) narkotisiert. In die Vena coccygea lateralis wurde ein Schwanzvenenkatheter gelegt. Anschließend wurden die Tiere in einen Metall-Restrainer verbracht, und die Narkosegaszufuhr wurde eingestellt. Nach einer halben Stunde erfolgte die Injektion von ca. 40 mBq F18-FDG in die Schwanzvene. Der Inhalt der hierfür verwendeten Spritze wurde jeweils vor und nach der Injektion gemessen, so dass die ins Tier gelangte Menge an Aktivität exakt berechnet werden konnte. Die Tiere mussten eine weitere Stunde wach im Restrainer verbringen (Uptake-Phase), um dann erneut mit Isofluran in Narkose gelegt und in den PET-Scanner verbracht zu werden. Die Messzeit betrug 15 Minuten. Die Messungen fanden für alle Tiere im Alter von 5, 10, 15 und 20 Monaten statt. 41 3.5 Magnet-Resonanz-Tomographie Das Prinzip der Kernspin-Resonanz wurde im Jahre 1946 gleichzeitig von zwei Arbeitsgruppen beschrieben (Arbeitsgruppen von PURCELL und BLOCH). Auf diesem Prinzip beruht das bildgebende Verfahren der Magnet-Resonanz- Tomographie (Andrews et al., 1986). Die Verwendung in der Medizin begann aber erst in der 70er Jahren nach der Entwicklung der ortsauflösenden Kernresonanz (Brownell et al., 1982). Atomkerne mit ungerader Ordnungszahl (z.B. H, Na, Cl, Cu), d.h. einer ungeraden Anzahl an Protonen und/oder Neutronen, besitzen eine Eigenrotation um die eigene Achse (Spin), die ein magnetisches Feld erzeugt. In der Medizin macht man sich vor allem die magnetische Eigenschaft von Wasserstoffatomen (H+) zunutze, da diese aufgrund des hohen Wassergehalts in biologischen Geweben am häufigsten vorkommen (Marincek et al.,1988). Normalerweise sind die magnetischen Felder vieler benachbarter Atome hinsichtlich ihrer Ausrichtung zufällig verteilt, legt man allerdings von außen ein Magnetfeld an, so richten sich die Magnetfelder dieser Atomkerne parallel nach dem von außen angelegten Feld aus und führen eine Kreiselbewegung um die Feldlinien dieses Feldes aus (Präzessionsbewegung) (Seiderer et al.,1989). Die Präzessionsbewegung tritt jedes Mal auf, wenn der Kern aus seiner Ruhelage gebracht wird. Wird das aussen angelegte magnetische Feld wieder abgeschaltet, so fällt der Kern in seine ursprüngliche Lage, das thermische Feld, zurück. Durch das Anlegen des äußeren Magnetfeldes entsteht eine Längsmagnetisierung in Richtung des externen Magnetfeldes. Ihre Stärke ist abhängig von der Differenz der parallelen und antiparallelen Spins. Die Protonen präzedieren asynchron mit der Frequenz ω (Resonanzfrequenz, Larmorfrequenz), die proportional zur Feldstärke des konstanten Magnetfeldes ist. Wird nun ein zweites Magnetfeld (Transversalfeld) Bt angelegt, welches rechtwinklig zum ersten steht, beginnt der Kern wieder zu präzedieren, bis sich ein Gleichgewichtszustand einstellt. Die Protonen werden so aus dem energetisch günstigeren (Parallelen) in den energetisch höheren (antiparallelen) Zustand gebracht und ihre Präzessionsbewegungen werden synchronisiert (Phasenkohärenz) 42 (Andrew et al., 1989) (Andrew et al., 1990). Der eingestrahlte Impuls muss dabei in seiner Energie der Gleichgewichtsenergie des Protonensystems entsprechen. Dies ist nur dann der Fall, wenn die Frequenz des Impulses mit der Lamorfrequenz ω des Systems übereinstimmt (Resonanzbedingung). Dabei werden nur die freien Spins zur Messung genutzt, da diese eine genau definierte Lamorfrequenz besitzen. Nach Beendigung des Impulses kehren die Protonen wieder in ihren Ausgangszustand zurück. Um die Kerne dauerhaft zur Präzession anzuregen, handelt es sich bei dem zweiten Feld um ein hochfrequentes Wechselfeld (HF-Feld), das in der xy-Achse rotiert. Das Magnetfeld B0 hat für diagnostische Zwecke üblicherweise eine Stärke von 1 bis 3 Tesla. Der Magnetresonanz-Tomograph der Universitätsklinik Münster verfügt über ein Magnetfeld der Stärke 3 Tesla. Nach Anregung durch einen hochfrequenten Energieimpuls induzieren die phasenkohärent präzidierenden Spins einen messbaren Strom in der Empfangsspule. Die Signalintensität nimmt mit zunehmender Dephasierung der Spins bzw. deren Übergang in den ursprünglich parallelen Energiezustand ab. Dieses wird auch als freier Induktionszerfall (Free induction decay, FID) bezeichnet. Die gewebespezifischen ursprünglichen Zeitkonstanten Gleichgewichtszustandes bis zur werden Wiederherstellung Relaxationszeiten des genannt (Semmler et al., 1984). Da die Messspulen normalerweise in Richtung der xy-Achse angebracht werden, ist die gemessene Spannung proportional zur Quermagnetisierung des magnetischen Moments m. Mit einer Folge von Hochfrequenzimpulsen des Transversalfeldes in einem Körper, der in einem starken Magnetfeld liegt, kann eine rotierende Quermagnetisierung erzeugt werden, welche sich aus den Quermagnetisierungen der einzelnen Kerne zusammensetzt. Diese Quermagnetisierung ist abhängig vom Ort und vom Gewebetyp. Das Ziel der MRT ist die Erzeugung von Schnittbildern der Quermagnetisierung. Die Zeit, die die Protonen benötigen, um wieder in ihren ursprünglichen Zustand zurückzukehren, nennt man T1-Relaxationszeit (Spin-Gitter-Relaxationszeit). Dabei geben sie Energie an ihre Umgebung, das sog. Gitter, ab. Die T1-Relaxationszeit wird auch Längsrelaxationszeit genannt, da in dieser Zeitspanne die 43 Längsmagnetisierung wieder ihren ursprünglichen Wert erreicht. Der anschließende Prozess der Dephasierung, durch den die Protonen wieder asynchron präzedieren, findet während der T2-Relaxationszeit (Querrelaxationszeit) statt. Dabei treten die Spins miteinander in Wechselwirkung (Spin-Spin-Relaxationszeit). Die Spins funktionieren als kleine Magneten und verändern die Stärke des Magnetfeldes ihrer Nachbarn. Da die Präzessionsfrequenz abhängig von der Magnetfeldstärke ist, werden sie Spins mal schneller und mal langsamer sobald ihr Magnetfeld durch einen benachbarten Spin beeinflusst wird (Marincek et al., 1988). Im Gegensatz zur T1-Relaxationszeit findet während der T2-Relaxationszeit keine Energieübertragung statt, und die T2-Zeit an sich ist relativ unabhängig von der Magnetfeldstärke. Durch die Abhängigkeit der T2-Relaxation von der Anwesenheit angeregter Spins ergibt sich, dass die T2-Zeit immer kürzer als die T1-Zeit ist. Sie liegt durchschnittlich zwischen 10 und 1000ms. Unter realen Bedingungen jedoch ist das Magnetfeld nicht homogen. Technisch bedingte, zeitlich konstante Inhomogenitäten z. B durch den Tomographen oder den untersuchten Körper, reduzieren die substanzspezifische Relaxationszeit T2 zur effektiven Relaxationszeit T2*. Ein Magnet-Resonanztomograph besteht aus einem Magneten, einer Sendespule und einer Empfängerspule, wobei letztere beide senkrecht zum Magnetfeld stehen. Drei kleine Widerstandsspulen erzeugen zusätzlich sog. Zusatzfelder (magnetische Gradientenfelder) entlang der drei Raumrichtungen. Diese ermöglichen die Bildrekonstruktion. Dabei wird der untersuchte Körper in Volumenelemente (Voxel) aufgeteilt. Um die Signale den einzelnen Voxeln zuordnen zu können, wird mit abgestuften Magnetfeldern, den Gradientenfeldern, eine Ortskodierung erzeugt. Ein Gradient liegt bei der Anregung an und stellt sicher, dass nur eine einzelne Schicht des Körpers die passenden Lamorfrequenz besitzt und somit nur die Spins dieser Schicht ausgelenkt werden (Schichtselektionsgradient). Ein zweiter Gradient quer zum ersten wird nach der Anregung kurz eingeschaltet und bewirkt eine kontrollierte Dephasierung der Spins, so dass in jeder Bildzeile die Präzession der Spins eine andere Phasenlage hat (Phasenkodiergradient). Der dritte Gradient wird während der Messung rechtwinklig zu den beiden anderen geschaltet. Er sorgt dafür, dass die Spins jeder Bildspalte eine andere Präzessionsgeschwindigkeit haben – also eine andere Larmorfrequenz senden (Auslesegradient, Frequenzkodiergradient). Alle drei Gradienten zusammen bewirken eine Kodierung des Signals in drei Raumebenen. Das empfangene Signal gehört zu einer bestimmten Schicht des 44 Körpers und enthält eine Kombination aus Frequenz- und Phasenkodierung, die der Computer mit einer Fourier-Transformation auflösen kann. Für jedes Volumenelement werden dann die Intensitäten der gemessenen Signale rechnerisch durch die zweidimensionale Fourier-Analyse den verschiedenen Pixeln in der Bildverarbeitung zugeordnet (Ortskodierung). Dazu sind extrem leistungsfähige Computer die Voraussetzung. Auf dem Bildschirm erscheinen dann Gewebe mit einer hohen Signalgebung in einer hellen Graustufe, während Gewebe mit einer niedrigen Signalgebung dunkel dargestellt werden (Andrew et al., 1989)}. . 3.5.1 Gerät Die MRT-Untersuchungen wurden im Institut für Klinische Radiologie des Universitätsklinikums Münster durchgeführt. Dem Institut für Klinische Radiologie steht ein Ganzkörper-MR-Scanner mit 3 Tesla (Philips Intera, Best, Niederlande) zur Verfügung. Für das 3 Tesla-MRT-Gerät sind als Sonderanfertigungen zwei hochauflösende Vier-Element Oberflächenspulen mit parallelen Bildgebungseigenschaften verfügbar (Spulendurchmesser 7 cm / Firma Philips Medical Systems, Hamburg). Diese Spulen sind speziell für die Untersuchung von Kleintieren konzipiert und liefern eine sehr hohe räumliche Auflösung. Für die Ratten wurde die 7 cm Spule verwendet. 3.5.2 Untersuchungsablauf Die Tiere wurden im Alter von 5, 10, 15 und 20 Monaten untersucht. Für die Untersuchung wurden die Tiere mit einer Isofluran-Inhalationsnarkose (0,8 L/min Sauerstoff und 2% Isofluran, Einleitung mit 4% Isofluran) anästhesiert und mit dem Kopf mittig in die 7 cm Oberflächenspule gelegt. Die Messung dauerte etwa 35 Minuten, wobei sowohl eine T1 als auch eine T2 gewichtete Messung durchgeführt wurde. Zur Auswertung diente die T1-gewichtete Aufnahme. 3.5.3 Bildbearbeitung Die entstandenen PET-Datensätze wurden zunächst in V-files umgewandelt. Dabei erfolgt ein Rechts-Links-Flip, um die Bilder in der gleichen Richtung wie die MRTBilder auszurichten. Die MR-Datensätze standen als Analyze-Files zur Verfügung. Die Fusion der Bilder sowie das Zeichnen und Auswerten der erforderlichen Masken 45 erfolgt mit Hilfe des Programms MPI-Tool (Version 2.58) der Firma Advanced Tomo Vision, Gesellschaft für medizinische Bildverarbeitung mbH. Zunächst wurde durch das Übereinanderlegen sämtlicher MR-Datensätze aller Tiere gleichen Geschlechts ein Standard-MR-Bild erstellt. Jedes MR-Bild wurde anschließend auf dieses Standard-MR gelegt, um eine gleiche räumliche Ausrichtung zu gewährleisten und die folgende manuelle MR-PET-Fusion zu vereinfachen. Als Orientierungshilfen dienten hierbei definierte Hirnstrukturen wie der Thalamus, das Kleinhirn und bestimmte Ventrikelbereiche, die sowohl im PET- als auch im MR-Bild gut zu erkennen sind. Zusätzlich ist das Programm in der Lage, eine frei wählbare Anzahl an Konturen zu zeichnen, die die exakte Fusion der Bilder in den drei verschiedenen Raumrichtungen möglich macht. Nach erfolgter Fusion wurden auf dem MR-Bild manuell die ROIs (Regions Of Interest) festgelegt. Striata und Kleinhirn wurden jeweils auf drei Schichten, das gesamte Gehirn auf neun Schichten mit markiert. Die so entstandenen ROIs wurden nun auf das entsprechende PET-Bild übertragen und ausgewertet. Berechnete Werte waren: Volumen Striatum rechts bzw. links (in mm³) mittlere Aktivität Striatum rechts bzw. links (in mBq/ccm) mittlere Aktivität Kleinhirn (in mBq/ccm) maximale Aktivität Striatum rechts bzw. links (in mBq/ccm) Die mittlere Aktivität bezeichnet das arithmetische Mittel der aufgezeichneten Werte über die Zeit der Messung, die maximale Aktivität ist der größte Wert, der während dieser Zeit gemessen wurde. Durch die Definition der ROIs waren die gemessenen PET-Aktivitäts-Werte bereits auf das Volumen der entsprechenden Bereiche bezogen. Aus diesen Werten wurden weiter berechnet: Mittelwert der mittleren rechten und linken striatalen Aktivität = mittlere PETAktivität im Striatum 46 Mittelwert der maximalen rechten und linken striatalen Aktivität = maximale PET-Aktivität im Striatum Mittelwert der Volumina der rechten und linken Striata mittlere PET-Aktivität im Striatum bezogen auf die mittlere PET-Aktivität im Kleinhirn maximale PET-Aktivität im Striatum bezogen auf die mittlere PET-Aktivität im Kleinhirn Die PET-Aktivität in den Striata als eigentliche Zielgröße wurde auf die KleinhirnAktivität normiert, um mögliche Fehler durch Umverteilung der Aktivität im Tier auszuschließen. Das Kleinhirn wurde gewählt, da in diesem Hirnbereich ausgeprägte Veränderungen durch die Huntington’sche Krankheit nicht zu erwarten sind (Strong et al., 1993) (Kuwert et al.,1990). Abb. 11: PET- und MRT-Aufnahme einer 20 Monate alten transgenen Huntington-Ratte 47 (A) MRT-Aufnahme mit den manuell eingezeichneten Regions of Interest (ROI) Kleinhirn und Striatum rechts und links, (B) PET-Bild derselben Ratte, (C) PET-Bild mit den vom MRT übertragenen ROIs, (D) Fusion der MRT- und PET-Bilder. 3.6 Accelerod-Test Es wurde ein akzelerierendes Rotarod (Accelerod) der Feinmechanikwerkstatt der Orthopädie des Universitätsklinikums Münster verwendet (s. Abb. 12). Die Messapparatur besteht aus einer profilierten Stange mit 7 bzw. 10 cm Durchmesser (je nach Größe der Tiere), die in 35 cm Höhe befestigt ist und durch einen Elektromotor angetrieben wird. Diese Stange wird durch fünf undurchsichtige Plastikscheiben mit jeweils 50 cm Durchmesser in vier Abschnitte aufgeteilt, wobei jeder dieser Abschnitte eine Breite von 12,5 cm besitzt. So können vier Tiere gleichzeitig getestet werden. Unter jedem der Stangenabschnitte befindet sich eine Kontaktplatte, die mit einem digitalen Sekundenzählwerk verbunden ist. Sobald die Ratten das Gleichgewicht verlieren und sich nicht mehr auf der Laufstange halten können, fallen sie auf die Kontaktplatte, und die Zählung der Laufzeit wird unterbrochen. Da es sich um ein akzelerierendes Laufrad handelt, wird die Umdrehungsgeschwindigkeit der Laufstange während der Messung kontinuierlich gesteigert. Zu Beginn dreht sich die Stange viermal pro Minute, danach wird alle 30 Sekunden die Umdrehungsgeschwindigkeit gesteigert, bis nach 300 Sekunden die Maximalgeschwindigkeit von 40 Umdrehungen pro Minute erreicht ist. Dies entspricht etwa einer Geschwindigkeit von 38 cm/min bzw. 380 mm/min. Falls die Ratten eine Laufleistung von 450 Sekunden erreichen, wird die Messung beendet. Die Erfassung der motorischen Leistung mittels der durchschnittlichen Laufzeit auf dem Accelerod erfolgte für jedes Versuchstier im Alter von 15 und 21 Monaten. Im Vorfeld der eigentlichen Messung wurden die Tiere fünf Tage lang trainiert, wobei jedes Tier dreimal pro Tag für fünf Minuten auf das Rad gesetzt wurde. Konnte es sich die volle Zeit auf der Rolle halten, wurde der Durchgang abgebrochen. Die eigentliche Messung bestand aus zwei Durchgängen. Notiert wurde die Zeit in Sekunden sowie die Umdrehungen pro Minute (rounds per minute, rpm). 48 Abb. 12: Ratte auf Accelerod Es wird die Zeit gemessen, die sich das Tier auf der sich zunehmend schneller drehenden Rolle halten kann. 3.7 Statistische Auswertung der Daten Die Erhebung und Auswertung der Daten erfolgte über einen Zeitraum von etwa zwei Jahren. Es handelte sich um eine explorative Studie. Von allen erhobenen Messdaten wurden Mittelwerte und Standardabweichungen berechnet. Zur Signifikanzprüfung innerhalb der Gruppen (transgen/wildtyp und männlich/weiblich) wurde zur Übersichtsanalyse der Friedmann-Test verwendet. Zur genaueren Überprüfung wurde der Wilcoxon-Test angewandt. Zum Vergleich der Gruppen wildtyp gegen transgen wurde die Signifikanzprüfung mittels Mann-Whitney-Test vorgenommen, wobei die beiden Gruppen für jedes Geschlecht (männlich/weiblich) einzeln geprüft wurden. Alle im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Tests wurden auf einem Signifikanzniveau von 5% durchgeführt. Somit liegt ein signifikantes Testergebnis bei einem p-Wert von p<*0,05 vor. Aufgrund der geringen Tierzahlen pro Gruppe wurde die exakte zweiseitige Signifikanz bestimmt. 49 4 Ergebnisse 4.1 Überlebensrate Zum zweiten Messzeitpunkt war ein männliches transgenes Tier bereits verstorben. Ein weiteres Tier derselben Gruppe verstarb vor dem dritten Messzeitpunkt. Zwischen dem dritten und vierten Messzeitpunkt verendeten noch einmal fünf der ursprünglich acht Ratten, so dass am vierten und letzten Messzeitpunkt nur noch ein transgenes Männchen am Leben war. Bei den männlichen Kontrolltieren waren bereits zum zweiten Messzeitpunkt drei Tiere gestorben. Den letzten erreichten lediglich zwei der zehn Ratten. Von den anfangs neun weiblichen tgHD-Ratten starb bis zum Ende der Versuchsreihe nur ein Tier im Alter von 13 Monaten und fiel somit für die dritte und vierte Messung aus. Die acht weiblichen Kontrolltiere überlebten bis auf ein vor dem letzten Messzeitpunkt verendetes Tier alle die gesamte Messreihe. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die weiblichen Tiere ein wesentlich höheres Lebensalter erreichten als die männlichen, und dass der letzte Messzeitpunkt bei den Männchen aufgrund der sehr geringen Gruppengrößen von einem (transgen) bzw. zwei Tieren (Kontrolltiere) statistisch nicht mehr auswertbar war. Messzeitpunkt 5 Monate (1) 10 Monate (2) 15 Monate (3) 20 Monate (4) männlich transgen 7 7 6 1 männlich Wildytp 10 7 7 2 weiblich transgen 9 9 8 8 weiblich Wildtyp 8 8 8 7 Tabelle 6: Überlebende Tiere zu den Messzeitpunkten 1 bis 4 Messzeitpunkt 1 im Alter von 5 Monaten, Messzeitpunkt 2 im Alter von 10 Monaten, Messzeitpunkt 3 im Alter von 15 Monaten, Messzeitpunkt 4 im Alter von 20 Monaten 50 4.2 PET-Untersuchung Die Tiere wurden, soweit sie das entsprechende Alter erreichten (s. 4.1), vier Mal im Alter von 5 (Messzeitpunkt 1), 10 (Messzeitpunkt 2), 15 (Messzeitpunkt 3) und 20 Monaten (Messzeitpunkt 4) im PET untersucht. Während des Aufenthaltes im Restrainer (s. 3.4.3) zwischen der FDG-Applikation und der eigentlichen Messung verhielten die Tiere sich überwiegend ruhig. Einige Ratten zeigten erhöhte Unruhe, nagten an den Gitterstäben und versuchten, sich innerhalb des Restrainers umzudrehen. Eine Zuordnung dieser vermehrten Unruhe zu den verschiedenen Genotypen oder Geschlechtern war nicht möglich. Gemessen wurde die FDG-Aktivität im Striatum. Als individuelle Referenz wurde die FDG-Aktivität im Kleinhirn herangezogen (s.u.). Ausgewertet wurden die mittlere und maximale Aktivität in den Striata bezogen auf die mittlere Kleinhirnaktivität. 4.2.1 Mittlere striatale Aktivität mit Bezug auf die mittleren Kleinhirn-Aktivität Um auszuschließen, dass die Unterschiede der im Striatum gemessenen Werte auf einer Änderung der Aktivität des gesamten Gehirns bzw. verschiedener Bereiche des Gehirns beruhten, wurde die im Striatum gemessene mittlere Aktivität auf die mittlere Aktivität im Kleinhirn normiert (mittlere FDG-PET-Aktivität im Striatum/mittlere FDGPET-Aktivität Kleinhirn). Bei den weiblichen Tieren war zu keinem Zeitpunkt ein signifikanter Unterschied zwischen den transgenen und den Kontrolltieren zu erkennen. Die Betrachtung des zeitlichen Verlaufs innerhalb der beiden Gruppen über die Messzeitpunkte F1 bis F4 ergab bei den Kontrolltieren einen signifikanten Anstieg der FDG-PET-Aktivität vom Zeitpunkt F1 zu F2 mit p*0.008. Parallel dazu kam es bei den transgenen Tieren zu einer signifikanten Zunahme mit p*0.004 (s. Abb.13). Vom zweiten zum dritten Messzeitpunkt fand sich bei den Kontrolltieren ein signifikanter Abfall der Aktivität mit p*0.012, während bei den transgenen Tieren ein solcher Abfall vom dritten zum vierten Messzeitpunkt hin zu beobachten war (p*0.031) (s. Abb 13). 51 Der Gruppenvergleich der männlichen Tiere ergab ebenfalls keine signifikanten Unterschiede der FDG-PET-Aktivität zwischen transgenen und Kontrolltieren. Die Auswertung des Verlaufs der Aktivitätslevel über den gesamten Messzeitraum zeigte bei den transgenen Tieren eine signifikante Zunahme von F2 nach F3 (p*0,008), während bei den Kontrolltieren keine signifikanten Schwankungen erkennbar waren (s. Abb. 14). Nach Zusammenfassung der männlichen und weiblichen Tiere war am ersten Messzeitpunkt bei den transgenen Tieren ein signifikant höherer Glucosestoffwechsel (p*0.027) als bei den Kontrolltieren festzustellen. In beiden Gruppen stieg die Aktivität vom ersten zum zweiten Messzeitpunkt signifikant an (tg =p*0.015, wt= p*0.004) und fiel anschliessend vom dritten zum vierten Zeitpunkt wieder signifikant ab (tg = p*0.016, wt = p*0.039) (s. Abb. 15). 4.2.2 Maximale striatale Aktivität mit Bezug auf die mittlere Kleinhirn-Aktivität Die Auswertung der maximalen in Striatum gemessenen Aktivität bezogen auf den mittleren Kleinhirn-Uptake ergab ein ähnliches Bild wie die der mittleren Aktivität. Bei den Weibchen war auch hier kein signifikanter Unterschied zwischen transgenen und Kontrolltieren erkennbar. Bei den Wildtypen stieg die gemessene Aktivität vom ersten zum zweiten Messzeitpunkt mit p*0.008 signifikant an und fiel dann vom 2. zum 3. Messzeitpunkt wieder signifikant an (p*0.004). Der Verlauf bei den transgenen Tieren zeigte eine signifikante Zunahme von F1 nach F2 (p*0.004). Anschließend fiel die Aktivität bei den tgHD-Ratten vom dritten zum vierten Zeitpunkt hin signifikant ab (p*0.031) (s. Abb. 16). Auch bei den männlichen Ratten ergab die Auswertung der maximalen Aktivität keine wesentlichen Unterschiede zu der der mittleren Aktivität. Zwischen transgenen und Kontrolltieren war kein signifikanter Unterschied erkennbar. Im zeitlichen Verlauf war ausschliesslich bei den transgenen Tieren vom zweiten zum dritten Messzeitpunkt ein signifikanter Anstieg mit p* 0.031 zu verzeichnen (s. Abb. 17). Auch bei der geschlechterübergreifenden Auswertung konnten keine signifikanten Differenzen zwischen transgenen und Kontrolltieren gefunden werden. 52 Bei den Wildtypen stieg die Aktivität vom ersten zum zweiten und vom zweiten zum dritten Messzeitpunkt hin signifikant an mit p*0.002 bzw. p*0.049, während sich bei den tgHD-Ratten die Aktivität vom ersten zum zweiten Messzeitpunkt signifikant erhöhte (p*0.012) und anschließend vom dritten zum vierten Messzeitpunkt signifikant abfiel (p*0.016) (s. Abb. 18). Abb. 13: Mittlere FDG-PET-Aktivität in den Striata der weiblichen Ratten zum Zeitpunkt 1-4 mit Bezug auf die Kleinhirn-Aktivität: Vergleich zwischen transgenen (tg) und Kontrolltieren (wildtyp – wt) Transgene Tiere :Zeitpunkt 1: n=9 Tiere, Zeitpunkt 2: n=9 Tiere, Zeitpunkt 3: n=8 Tiere, Zeitpunkt 4: n=8 Tiere; Kontrolltiere: Zeitpunkt 1: n=8 Tiere, Zeitpunkt 2: n=8 Tiere, Zeitpunkt 3: n=8 Tiere, Zeitpunkt 4: n=7 Tiere. Die Zeitpunkte 1 bis 4 entsprechen den Messzeitpunkten bei 5, 10, 15, 20 Monaten. Dargestellt sind die Mittelwerte +/- Standardabweichung 53 n.s n.s n.s n.s * 0.008 n.s n.s n.s Abb. 14: Mittlere FDG-PET-Aktivität in den Striata der männlichen Ratten zum Zeitpunkt 1-4 mit Bezug auf die mittlere Kleinhirn-Aktivität: Vergleich zwischen transgenen (tg) und Kontrolltieren (wildtyp – wt) Transgene Tiere: Zeitpunkt 1: n=7 Tiere, Zeitpunkt 2: n=7 Tiere, Zeitpunkt 3: n=6 Tiere Kontrolltiere: Zeitpunkt 1: n=10 Tiere, Zeitpunkt 2: n=7 Tiere, Zeitpunkt 3: n=7 Tiere, Zeitpunkt 4: n=2. Die Zeitpunkte 1 bis 4 entsprechen den Messzeitpunkten bei 5, 10, 15 und 20 Monaten. Dargestellt sind die Mittelwerte +/- Standardabweichung * 0.004 n.s. * 0.015 * 0.027 F1 * 0.039 n.s. * 0.016 n.s. n.s. F2 F3 n.s. F4 Abb. 15: Mittlere FDG-PET-Aktivität in den Striata der männlichen und weiblichen Ratten zum Zeitpunkt 1-4 mit Bezug auf die mittlere Kleinhirn-Aktivität: Vergleich zwischen transgenen (tg) und Kontrolltieren (wildtyp – wt) 54 Transgene Tiere: Zeitpunkt 1: n=16 Tiere, Zeitpunkt 2: n=16 Tiere, Zeitpunkt 3: n=14 Tiere, Zeitpunkt 4: n= 9 Tiere; Kontrolltiere: Zeitpunkt 1: n=18 Tiere, Zeitpunkt 2: n= 15 Tiere, Zeitpunkt 3: n=15 Tiere, Zeitpunkt 4: n = 9. Die Zeitpunkte 1 bis 4 entsprechen den Messzeitpunkten bei 5, 10, 15 und 20 Monaten. Dargestellt sind die Mittelwerte +/- Standardabweichung 55 * 0.0080.004 * 0.004n.s. * n.s. n.s. * 0.031 n.s. n.s. n.s. Abb. 16: Maximale FDG-PET-Aktivität in den Striata der weiblichen Ratten zum Zeitpunkt 1-4 mit Bezug auf die Kleinhirn-Aktivität: Vergleich zwischen transgenen (tg) und Kontrolltieren (wildtyp – wt) Transgene Tiere :Zeitpunkt 1: n=9 Tiere, Zeitpunkt 2: n=9 Tiere, Zeitpunkt 3: n=8 Tiere, Zeitpunkt 4: n=8 Tiere Kontrolltiere: Zeitpunkt 1: n=8 Tiere, Zeitpunkt 2: n=8 Tiere, Zeitpunkt 3: n=8 Tiere, Zeitpunkt 4: n=7 Tiere. Die Zeitpunkte 1 bis 4 entsprechen den Messzeitpunkten bei 5, 10, 15, 20 Monaten. Dargestellt sind die Mittelwerte +/- Standardabweichung n.s. n.s n.s * 0.031n.s. n.s. 56 n.s. n.s. Abb. 17: Maximale FDG-PET-Aktivität in den Striata der männlichen Ratten zum Zeitpunkt 1-4 mit Bezug auf die mittlere Kleinhirn-Aktivität: Vergleich zwischen transgenen (tg) und Kontrolltieren (wildtyp – wt) Transgene Tiere: Zeitpunkt 1: n=7 Tiere, Zeitpunkt 2: n=7 Tiere, Zeitpunkt 3: n=6 Tiere Kontrolltiere: Zeitpunkt 1: n=10 Tiere, Zeitpunkt 2: n=7 Tiere, Zeitpunkt 3: n=7 Tiere, Zeitpunkt 4: n=2. Die Zeitpunkte 1 bis 4 entsprechen den Messzeitpunkten bei 5, 10, 15 und 20 Monaten. Dargestellt sind die Mittelwerte +/- Standardabweichung 57 * * 0.049 0.002 * 0.012 n.s. n.s. n.s. n.s. * 0.016 n.s. n.s. Abb. 18: Maximale FDG-PET-Aktivität in den Striata der männlichen und weiblichen Ratten zum Zeitpunkt 1-4 mit Bezug auf die mittlere Kleinhirn-Aktivität: Vergleich zwischen transgenen (tg) und Kontrolltieren (wildtyp – wt) Transgene Tiere: Zeitpunkt 1: n=16 Tiere, Zeitpunkt 2: n=16 Tiere, Zeitpunkt 3: n=14 Tiere, Zeitpunkt 4: n= 9 Tiere; Kontrolltiere: Zeitpunkt 1: n=18 Tiere, Zeitpunkt 2: n= 15 Tiere, Zeitpunkt 3: n=15 Tiere, Zeitpunkt 4: n = 9. Die Zeitpunkte 1 bis 4 entsprechen den Messzeitpunkten bei 5, 10, 15 und 20 Monaten. Dargestellt sind die Mittelwerte +/- Standardabweichung 4.3 MRT-Untersuchung: Bestimmung der striatalen Volumina Die transgenen Ratten und die Kontroll-Tiere wurden im Alter von 5 (Messzeitpunkt 1), 10 (Messzeitpunkt 2), 15 (Messzeitpunkt 3) und 20 (Messzeitpunkt 4) Monaten im MRT untersucht. Es wurden auf dem entstandenen Bild auf je drei Schichten das rechte und linke Striatum markiert und als ROIs (regions of interest ) festgelegt (s. 3.5.3). Mit Hilfe der so definierten ROIs wurden die Volumina der Striata in Kubikmillimetern (mm³)) berechnet. Die Bestimmung der Volumina der Striata ergab keine signifikanten Unterschiede zwischen den transgenen Tieren und den Wildtypen (s. Abb. 19; Abb. 20; Abb. 21). Auch intraindividuell ließen sich keine signifikanten Volumenab- oder zunahmen nachweisen. Lediglich bei den transgenen Tieren stieg das Volumen mit p*0.023 bei den Weibchen bzw. p* 0.012 bei der gemischtgeschlechtlichen Gruppe zum vierten Messzeitpunkt hin signifikant an 58 n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. * 0.023 n.s. Abb. 19: Volumina der Striata weiblicher transgener (tg) HD-Ratten im Vergleich zu den weiblichen Kontrolltieren (wildtyp - wt) Transgene Tiere :Zeitpunkt 1: n=9 Tiere, Zeitpunkt 2: n=9 Tiere, Zeitpunkt 3: n=8 Tiere, Zeitpunkt 4: n=8 Tiere; Kontrolltiere: Zeitpunkt 1: n=8 Tiere, Zeitpunkt 2: n=8 Tiere, Zeitpunkt 3: n=8 Tiere, Zeitpunkt 4: n=7 Tiere. Die Zeitpunkte 1 bis 4 entsprechen den Messzeitpunkten bei 5, 10, 15, 20 Monaten. Dargestellt sind die Mittelwerte +/- Standardabweichung n.s . . . n.s . n.s . n.s n.s . n.s n.s . . n.s . n.s Abb. 20: Volumina der Striata männlicher tgHD-Ratten (tg) im Vergleich zu den männlichen Kontrolltieren (wildtyp - wt) Transgene Tiere: Zeitpunkt 1: n=7 Tiere, Zeitpunkt 2: n=7 Tiere, Zeitpunkt 3: n=6 Tiere Kontrolltiere: Zeitpunkt 1: n=10 Tiere, Zeitpunkt 2: n=7 Tiere, Zeitpunkt 3: n=7 Tiere, Zeitpunkt 4: n=2. Die Zeitpunkte 1 bis 4 entsprechen den Messzeitpunkten bei 5, 10, 15 und 20 Monaten. Dargestellt sind die Mittelwerte +/- Standardabweichung 59 n.s . n.s n.s n.s . . . n.s n.s . . n.s . n.s . * 0.012 n.s . Abb. 21: Volumina der Striata der männlichen und weiblichen Ratten: Vergleich zwischen transgenen (tg) und Kontrolltieren (wildtyp – wt) Transgene Tiere: Zeitpunkt 1: n=16 Tiere, Zeitpunkt 2: n=16 Tiere, Zeitpunkt 3: n=14 Tiere, Zeitpunkt 4: n= 9 Tiere; Kontrolltiere: Zeitpunkt 1: n=18 Tiere, Zeitpunkt 2: n= 15 Tiere, Zeitpunkt 3: n=15 Tiere, Zeitpunkt 4: n = 9. Die Zeitpunkte 1 bis 4 entsprechen den Messzeitpunkten bei 5, 10, 15 und 20 Monaten. Dargestellt sind die Mittelwerte +/- Standardabweichung 4.4 Accelerod-Test Die Ratten wurden im Alter von 15 (Messzeitpunkt 1) und 21 Monaten (Messzeitpunkt 2) auf dem Accelerod getestet, um die motorischen Fähigkeiten der Tiere zu untersuchen. Das Accelerod ist ein Laufrad, bestehend aus einer sich drehenden Stange auf der sich die Tiere halten müssen (s.2.3.). Die Laufgeschwindigkeit erhöht sich in regelmäßigen Abständen bis sie mit 40 Umdrehungen pro Minute ihr Maximum erreicht. Die Zeit, die sich die Tiere auf dem Rad halten können, wird gemessen. 60 Die Auswertung ergab keine signifikanten Unterschiede zwischen den transgenen Ratten und ihren Kontrolltieren. Auch vom ersten zum zweiten Messzeitpunkt hin veränderte sich die Laufleistung der Tiere nicht signifikant. n.s. n.s. n.s. n.s. Abb. 22: Accelerod-Ergebnisse der weiblichen transgenen (tg) und Kontrolltiere (wt-wildtyp) an den Zeitpunkten 1 (im Alter von 15 Monaten) und 2 (im Alter von 21 Monaten): Laufleistung der Tiere auf dem Rad in Sekunden. Transgene Tiere : Zeitpunkt 1 n=8, Zeitpunkt 2 n=8; Kontrolltiere : Zeitpunkt 1 n=8, Zeitpunkt 2 n=7 Dargestellt sind die Mittelwerte +/Standardabweichung n.s. n.s. n.s. 61 Abb. 23: Accelerod-Ergebnisse der männlichen transgenen (tg) und Kontrolltiere (wt-wildtyp) am Zeitpunkt 1 (im Alter von 15 Monaten) und 2 (im Alter von 20 Monaten): Laufleistung der Tiere auf dem Rad in Sekunden Transgene Tiere : Zeitpunkt 1 n=6; Zeitpunkt 2 n= 1; Kontrolltiere : Zeitpunkt 1 n=7, Zeitpunkt 2 n=2 Dargestellt sind die Mittelwerte +/- Standardabweichung 62 n.s. n.s. n.s. n.s. Abb. 24: Accelerod-Ergebnisse der männlichen und weiblichen Ratten zum Zeitpunkt 1 und 2: Vergleich zwischen transgenen (tg) und Kontrolltieren (wildtyp – wt): Laufleistung in Sekunden Transgene Tiere: Zeitpunkt 1: n=14 Tiere, Zeitpunkt 2: n=9 Tiere; Kontrolltiere: Zeitpunkt 1: n=15 Tiere, Zeitpunkt 2: n= 9 Tiere. Die Zeitpunkte 1 und 2 entsprechen den Messzeitpunkten 15 und 20 Monaten. Dargestellt sind die Mittelwerte +/- Standardabweichung 63 5 Diskussion Im Rahmen der genetisch bedingten Huntington’schen Krankheit kommt es zu einer selektiven Neurodegeneration im Gehirn der Patienten, die mit den bildgebenden Verfahren PET und MRT schon frühzeitig im Verlauf der Erkrankung nachgewiesen werden kann. Eine entsprechende Degeneration des vorwiegend betroffenen Hirnareals, des Striatums, konnte auch in dem in dieser Arbeit eingesetzten transgenen Rattenmodell der HD histopathologisch nachgewiesen werden (s. 2.2.2.3.2). Nach den zu Beginn dieses Projektes verfügbaren Publikationen zu diesem Thema war zu erwarten, dass die Tiere bereits im 8. Lebensmonat Auffälligkeiten in der Magnetresonanz-Tomographie in Form von atrophierten Striata zeigen (von Horsten et al., 2003). Weiterhin zeigten 24 Monate alte Tiere bei in vivo F18-FDG-PETUntersuchungen und post mortem Autoradiographien eine signifikante Reduktion im Glucosestoffwechsel des Gesamthirns (von Horsten et al., 2003). Histopathologische Untersuchungen bei 19 bzw. 23 Monate alten Tieren demonstrierten eine deutliche Verbreiterung der lateralen Ventrikel sowie eine makroskopisch erkennbare Atrophie der Striata (Petrasch-Parwez et al., 2007). Ziel dieses Projektes war es daher die Hypothese zu untersuchen, dasss das transgene Huntington-Rattenmodell eine im PET und MRT messbare Neurodegeneration entwickelt, die sich über den Verlauf der Erkrankung bzw. die Lebensspanne der Tiere darstellt. 5.1 Zur F18-FDG-PET-Untersuchung Von Hörsten et al. untersuchten 2003 24 Monate alte transgene Huntington-Ratten mittels F18-FDG-PET. Es zeigte sich in den transgenen Tieren eine signifikant niedrigere Aktivität im Gesamthirn (v. Horsten et al., 2003). Dieses Ergebnis widerspricht den Resultaten unserer Studie. In unserer Studie kam es zunächst bei allen Tieren zu einer signifikanten Zunahme der Aktivität und anschließend vom zweiten zum dritten bzw. vom dritten zum vierten Zeitpunkt zu einer signifikanten Abnahme. Unterschiede zwischen transgenen und Kontrolltieren waren lediglich beim Gruppenvergleich transgen gegen wildtyp ohne Auftrennung nach Geschlechtern am ersten Messzeitpunkt feststellbar, wobei wider Erwarten die transgenen Tiere einen 64 signifikant höheren Glucose-Uptake aufwiesen als die Kontrolltiere. Ein grundsätzlicher Unterschied in der Bewertung der Hirnaktivität zwischen der durchgeführten Studie und den Ergebnissen von v. Hörsten besteht in der Analyse spezifischer Hirnregionen. Die Vergleichsuntersuchung legte die Gesamtaktivität des Rattenhirns zugrunde, während in unserer Studie weiter differenziert wurde. Eine Aussage, z.B., zur ausschließlich striatalen Aktivität wurde daher in der von von Hörsten durchgeführten Studie nicht getroffen. Gerade die Striatum-Aktivität ist jedoch der bei menschlichen Huntington-Patienten sensitivste Endpunkt (Kuwert et al., 1990, Young et al. 1986). Es ist zudem methodisch sinnvoll, spezifische nicht vom Krankheitsprozess betroffene Hirnareale als Referenzbereiche zu bestimmen, um selektive Aktivitätsunterschiede reliabel messbar zu machen. In diesem Fall wurde auf die Kleinhirnaktivität zurückgegriffen, da keine durch Chorea Huntington verursachten Veränderungen im diesem Hirnbereich zu erwarten waren (Petrasch-Parwez et al. 2007) und die Expression des mutierten HuntingtonGens im Kleinhirn auf einem sehr geringen Level stattfindet (Von Horsten et al. 2003). Problematisch an der von v. Hörsten et al. angewandten Methode der Bewertung der Gesamthirnaktivität ist unter anderem, dass es durch unterschiedliche motorische Aktivität der Tiere zu einem erhöhten oder erniedrigten Muskel-Uptake, d.h. zu einem erhöhten oder erniedrigten Glucoseumsatz in der Muskulatur kommen kann. Somit können durch Umverteilung der verfügbaren Aktivitäten Unterschiede in der gemessenen Aktivität im Gehirn entstehen, die nicht mit dem Funktionszustand der Nervenzellen korrelieren. Der erhöhte Umsatz von Glucose in der Skelettmuskulatur bewirkt also durch die vermehrte FDG-Aufnahme der Muskelzellen eine verminderte FDG-Verfügbarkeit und Verstoffwechselung im Gehirn. Auch Veränderungen der Umgebungsbedingungen wie Geräuschpegel, Belichtung oder anwesende Personen können über eine Beeinflussung des Erregungszustandes der Tiere solche Unterschiede in der motorischen Aktivität und damit im Glucosestoffwechsel verursachen. Die durch das HD-Gen hervorgerufene Symptomatik der transgenen Tier führt zu 65 einer Zunahme von Spontanbewegungen und zu einer insgesamt erhöhten Nervosität der Tiere (von Horsten et al., 2003) (Cao et al., 2006). Es ist denkbar, dass insbesondere bei den symptomatischen Tieren mit einem erhöhten Muskeluptake und damit einer verminderten FDG-Konzentration im Gehirn zu rechnen ist. Durch die Normierung der gemessenen Aktivität im Striatum auf die Kleinhirnaktivität konnten in unserer Studie derartige Fehlinterpretationen mit großer Sicherheit ausgeschlossen werden. Bei der Betrachtung des Aktivitätsverlaufes über den gesamten Versuchszeitraum fällt auf, dass bei allen Tieren die Aktivität zunächst anstieg – bei den weiblichen Tieren vom ersten zum zweiten Messzeitpunkt hin, bei den Männchen vom 2. zum 3. Messzeitpunkt hin. Bei den tgHD-Ratten käme für den Anstieg der Aktivität eine inflammatorische Reaktion infolge der HD-Erkrankung in Frage. Entzündungszellen haben einen erhöhten Glucosestoffwechsel und können deshalb u.a. zu Fehlinterpretationen im Rahmen der PET-Diagnostik führen (Aigner et al., 2002). Eine Entzündung wird im Verlauf vieler neurodegenerativer Erkrankungen beobachtet und auch für die Huntington’sche Krankheit diskutiert (Bjorkqvist et al., 2008). Durch Bjorkqvist et al. wurden bei präsymptomatischen Huntington-Patienten erhöhte Zytokinspiegel im Hirngewebe festgestellt (s. 2.1.3). Versuche im R6/2-Mausmodell, bei denen die zytokinproduzierenden Zellen des Gehirns, die Mikrogliazellen, mit einem Molekül behandelt wurden, das die Zytokinproduktion triggert, produzierten die Zellen der HD-Mäuse signifikant größere Zytokin-Mengen als die Zellen von Kontrolltieren. Möglicherweise führt das im Rahmen der Huntington’schen Krankheit entstehende Huntingtin zu einer Übererregbarkeit der Immunzellen und damit zu einer Entzündung, die die Degeneration der Nervenzellen verursacht (Bjorkqvist et al., 2008). Damit könnte es zu dem in unserem Versuch gemessenen Anstieg zum 2. bzw. 3. Messzeitpunkt kommen. Ebenso erklärbar wäre damit die höhere FDG-Aktivität der transgenen Tiere am ersten Messzeitpunkt (s. Abb. 16). Bei den weiblichen Tieren erfolgte der Aktivitäts-Anstieg bereits im Alter von 10 Monaten, während es bei den Männchen erst im Alter von 15 Monaten zu einer Aktivitätssteigerung kam. Läge dem Anstieg der FDG-Aktivität ein entzündlicher Vorgang zugrunde, so träte dieser bei den Weibchen deutlich früher auf als bei den Männchen. Dies scheint jedoch unwahrscheinlich, da die männlichen Tiere insgesamt einen stärker ausgeprägten Phänotyp entwickeln und früher versterben 66 als die weiblichen Tiere (Bode et al., 2008). Die Tatsache, dass es parallel zum Verlauf bei den transgenen Tieren auch bei den Kontrolltieren zu einem zeitweisen Anstieg der FDG-Aktivität kommt und lediglich am ersten Messzeitpunkt – also vor dem Aktivitätsanstieg beider Gruppen - signifikante Unterschiede zwischen beiden Genotypen auftreten, spricht ebenfalls gegen eine durch Entzündungsvorgänge im Rahmen der HD ausgelöste Veränderung. Zudem wäre selbst bei einem ausschliesslichen Anstieg bei den transgenen Tieren dann auch zum vierten Messzeitpunkt hin eine weitere inflammatorische Erhöhung des Metabolismus oder aber eine deutliche Degeneration infolge der entzündlichen Vorgänge und damit ein erneuter Hypometabolismus zu erwarten. Das Absinken des FDG-Niveaus zum letzten Messzeitpunkt hin könnte bei den transgenen Tieren als degenerativer Prozess im Rahmen der Huntington’schen Krankheit gedeutet werden. Das Fehlen signifikanter Unterschiede gegenüber den Kontrolltieren spricht insgesamt aber für eine wenig bis gar nicht im PET messbare Veränderung durch die Huntington’sche Krankheit bei den transgenen Tieren. Vielmehr scheint es sich um altersbedingte degenerative Veränderungen zu handeln, die alle Tiere gleichermaßen betreffen. Im Unterschied zu der Untersuchung von v. Hörsten, dessen Ratten bei der Messung 24 Monate alt waren, wurden in dieser Studie Tiere im Alter von 5 bis 20 Monaten untersucht. Es ist daher möglich, dass eine Abnahme der striatalen FDG-PETAktivität erst in einem späteren Erkrankungsstadium, d.h. ab einem Alter von 20 Monaten, auftritt und somit in unserem Versuch nicht mehr messbar war. Andererseits ist das frühe Versterben der transgenen Tiere höchstwahrscheinlich auf eine schnelle und früh einsetzende Entwicklung der pathologischen Prozesse der HD zurückzuführen. Damit hätten im PET messbare neuronale Zellverluste ebenfalls frühzeitig auftreten und erkennbar sein müssen. Es ist davon auszugehen, dass die durch die HD bedingten pathologischen Prozesse kurz vor dem Zeitpunkt des Todes der Tiere ihre maximale Ausprägung erreicht haben. Somit hätten sie spätestens am vierten Messzeitpunkt erfassbar sein sollen. Bis auf drei männliche Tiere, zwei Kontrolltiere und ein tgHD-Tier, erreichten das Alter von 20 Monaten in dieser Studie ausschließlich weibliche Tiere. Die Haltungsbedingungen und das Handling der Männchen und Weibchen waren identisch und scheiden somit als Ursache für das vorzeitige Versterben der 67 männlichen Tiere aus. Diese Beobachtung entspricht der Publikation von Bode et al. (2008), die besagt, dass die männlichen Tiere aufgrund ihres im Vergleich zu den Weibchen niedrigeren 17--Östradiolspiegels einen ausgeprägten Phänotyp und damit eine ausgeprägtere Pathologie entwickeln (Bode et al., 2008) (s. 2.2.2.3.2). In zahlreichen Human-Untersuchungen wurde ein neuroprotektiver Effekt des weiblichen Sexualhormons bestätigt (Gillies et al., 2004), (Heron et al.,2000), (Dubal et al., 2006). Aufgrund dieser Tatsache sind an sich die männlichen Tiere die für Verlaufsstudien interessanteren Tiere, da bei ihnen mit einer deutlicher ausgeprägten Neurodegeneration zu rechnen ist. Es ist unwahrscheinlich, wenn auch nicht auszuschliessen, dass auch in diesem Versuch Hinweise auf Neurodegeneration hätten gefunden werden können, wenn die Tiere das bei v. Hörsten untersuchte Alter von 24 Monaten erreicht hätten. Jedoch stellt sich die Frage, ob größere Studien mit PET-Untersuchungen Sinn machen würden, wenn lediglich einzelne, i.d.R. weibliche Tiere, das notwendige Alter erreichen. Plausibler scheint jedoch zu sein, dass die stattfindenden pathologischen Prozesse zwar zu einem frühzeitigen Versterben der transgenen Tiere, nicht jedoch zu einer mittels PET-Bildgebung nachweisbaren Degeneration von Neuronen führen. Eine weitere Erklärung für die negativen Ergebnisse unserer Studie könnte darin bestehen, dass eine eventuell vorhandene Neurodegeneration mit dem hier verwendeten Tracer F18-FDG nicht messbar ist. FDG ist ein relativ unspezifischer Tracer, der nach der Phosphorylierung nicht weiter verstoffwechselt wird und sich dort anreichert, wo sonst Glucose verstoffwechselt wird (siehe 3.4.2). Er findet große Anwendung in der Tumordiagnostik, der Nephrologie und der Neurologie (Graham et al., 2001) (Goto et al., 1993), ist aber möglicherweise für die Untersuchung der transgenen Huntington-Ratten zu unspezifisch, da die Glucoseutilisation im Organismus und speziell im Gehirn von verschiedenen Faktoren abhängig ist (Otsuka et al., 1993). In diesem Versuch wurde F18-FDG benutzt, da die Ergebnisse der Vergleichuntersuchungen durch von Hörsten für eine Verwendbarkeit sprachen und die FDG vielfach in der Neurologie und auch bei Huntington Patienten erfolgreich angewendet wurde (Kumar et al., 2005) (Boecker et al., 1994) (Kuwert et al., 1993) (Feigin et al., 2001). Statt FDG wird in der Diagnostik neurologischer Erkrankungen häufig F18-Fluordopa 68 als Tracer eingesetzt. F18-Dopa ist eine Blut-Hirn-Schranken-gängige Vorstufe des Botenstoffs Dopamin. Es wird von der Dopa-Carboxylase, einem Enzym der Dopamin-Synthese, zu Dopamin metabolisiert. Mit F18-Dopa wird das der dopaminergen Funktion in verschiedenen cerebralen Zustandsbild Schaltkreisen, insbesondere der Basalganglien, beschrieben (Otsuka et al., 1993). Die PETUntersuchung ermöglicht die quantitative Beurteilung der Aktivität der DopaCarboxylase und stellt somit einen Indikator für den Dopa-Transport in die dopaminergen Terminalen und die Dopa-Speicherkapazität dar (Brown et al., 1998). Im Rahmen der Chorea Huntington-Erkrankung kommt es zu einer Atrophie und einem Neuronenverlust im Bereich der Basalganglien, in denen sehr hohe Konzentrationen dopaminerger Neurone angetroffen werden. Innerhalb der Schaltkreise der Basalganglien kann mit F18-Dopa-PET die Funktion der dopaminergen Neuronen der nigrostriatalen Bahn bestimmt werden. Diese ist ein Nervenbündel, das aus dopaminergen Neuronen im Kerngebiet der Substantia nigra und neuronalen Verbindungen mit dopaminergen Nervenendigungen im Kerngebiet des Striatums besteht (Brown et al., 1998). In den striatalen Nervenendigungen der nigrostriatalen Bahn erfolgt der o.g. durch die Dopa-decarboxylase katalysierte Syntheseschritt zum Dopamin. Folglich lässt das im Striatum gemessene F18-DopaPET-Signal auf den Dopaminmetabolsimus der striatalen dopaminergen Neurone schließen. Die bei Chorea Hungtington auftretende massive Degenration striataler Neurone lässt sich so bestimmen (Otsuka et al., 1993). F18-Fluordopa sowie bestimmte Kokain-Analoga und die Radiotracer C11Nomifensin, C11-WIN und C11-DTBZ sind Marker präsynaptisch lokalisierter Komponenten des dopaminergen Sytems (Bartenstein et al., 2000) (Heiss et al., 1999). C11-Raclopride, ein Benzamidanalogon, das als reversibler D2-RezeptorAntagonist wirkt und vorwiegend zur Darstellung der postsynaptischen D2Rezeptordichte eingesetzt wird, wir ebenfalls für neurologische PET-Studien eingesetzt. Sowohl bei symptomatischen als auch bei präsymptomatischen Huntington-Patienten wurden Korrelationen zwischen der CAG-Repeat-Zahl und der Racloprid-Anreicherung und damit der Neurodegeneration im Striatum nachgewiesen (Antonini et al.1998), (Pavese et al., 2003). Es existieren einige neuere F18markierte Radiopharmaka mit ähnlicher Affinität wie Racloprid (z.B. F18-desmethoxyFallyprid) sowie höher affine Pharmaka wie F18-Fallyprid (Bartenstein et al., 2004). Außerdem werden teilweise Butyrophenonderivate zur Quantifizierung der D2Rezeptorbindung eingesetzt, die aber reversibel und weniger spezifisch binden, da 69 sie auch eine Affinität zu serotonergen Rezeptoren aufweisen (Coenen et al., 1987). Möglich, wenn auch klinisch weniger gebräuchlich, ist auch eine Bestimmung der D1Rezeptordichte durch den Gebrauch des Radioliganden C11-SCH23390. Auch anhand dieser Untersuchung kann bereits bei präsymptomatischen Patienten eine striatale Neurodegeneration nachgewiesen werden (Thomasin et al., 1999). Zusammenfassend sprechen die Befunde dafür, dass die im HD-Rattenmodell auftretenden Pathologie nicht mittels FDG-PET messbar ist. Die bei von Hörsten gefundenen Unterschiede könnten durch andere, nicht mit der HD zusammenhängenden Veränderungen, erklärbar sein, wie z.B. der o.g. Umverteilung von Glukose in die Muskulatur mit konsekutiver Fehlinterpretationen als durch eine HD verursachte Neurodegeneration. Grundsätzlich muss zur Bewertung der durchgeführten Untersuchungen diskutiert werden, inwieweit das Rattenmodell an sich für die Untersuchung der Chorea Huntington mittels bildgebender Verfahren geeignet ist. Möglicherweise liegt die Limitation des verwendeten Modells in der ausschließlichen Exprimierung des nterminalen Fragments des HD-Gens, die zu einem veränderten Ablauf der pathogenetischen Kaskade der HD führen könnte. Es existieren bereits verschiedene Mausmodelle mit verkürzten Htt-Genabschnitten. Das bekannteste und am weitesten verbreitete Modell ist die R6/2-Maus. Allen diesen Modellen mit verkürztem Gen-Abschnitt sind ein relativ frühzeitig einsetzender Phänotyp und ein rascher Verlauf der Erkrankung gemeinsam. Dies ist unter zeitlichen Aspekten ein für die Untersuchungen günstiger Umstand, da ein pathologischer Phänotyp frühzeitig messbar ist. Problematisch scheint jedoch, dass bei den transgenen Mausmodellen mit fragmentiertem Gen histologischen Untersuchungen zufolge ein deutlich geringerer Zelluntergang im Striatum stattfindet als beim Menschen, der zudem lediglich in sehr späten Erkrankungsstadien nachweisbar ist (Wang et al., 2006). Die Tiere zeigen zwar eine ausgeprägt neurologische Symptomatik und eine generelle Atrophie des Gehirns, nicht jedoch die für die menschliche Chorea Huntington pathognomische frühzeitige Neurodegeneration im Striatum (Tabrizi et al., 2012). 70 Eine Alternative zu den Tiermodellen mit fragmentiertem Genabschnitt stellen die sog. "full-length"-Modelle dar. Bei Mausmodellen, die das gesamte Transgen tragen, entwickelt sich eine wesentlich langsamer fortschreitende Symptomatik, die im zeitlichen Verlauf eher der menschlichen Erkrankung entspricht. Unter Umständen nachteilig ist jedoch, dass sichtbare Veränderungen wie motorische Störungen und Neurodegeneration erst spät auftreten und in der Regel schwach ausgeprägt sind (Van Raamsdonk et al., 2007). Histologische Untersuchungen zeigten bisher nur die Anwesenheit zellulärer Einschlüsse, jedoch keine signifikante Neurodegeneration (Wang et al., 2005). Eine mit bildgebenden Verfahren messbare Neurodegeneration im präsymptomatischen Erkrankungsstadium scheint damit auch in einem potentiellen "full-length"-Rattenmodell unwahrscheinlich. Bei den transgenen Tiermodellen besteht generell das Problem, dass neben dem in das Genom eingebrachten menschlichen Gen(-abschnitt) zwei weitere endogene (normale) Kopien vorliegen. Diese Konstellation wird von einigen Wissenschaftlern als nicht repräsentativ für die menschliche Chorea Hungtington angesehen (Ramaswamy et al., 2007). Zudem können die fremden, in das Genom eingebrachten Genabschnitte zu pathologischen Veränderungen führen, die mit der eigentlichen Erkrankung nicht im Zusammenhang stehen, aber dennoch eine eigene Symptomatik hervorrufen können. Die zufällige Einbringung des Transgens in das Tiergenom könnte mit den normalen Funktionen anderer, benachbarter Gene interferieren und so zu Funktionsstörungen führen. So wäre auch erklärbar, warum bei den Ratten im Gegensatz zu den Menschen eine frühzeitige Neurodegeneration im Striatum nicht stattzufinden scheint, es aber dennoch zu Veränderungen der motorischen und kognitiven Fähigkeiten kommt. Ein systematischer oder technischer Fehler in der Erhebnug oder Auswertung der Daten scheint als Ursache für die Abweichungen unserer Ergebnisse von den erwarteten Resultaten aufgrund der ausgeprägten Homogenität der Ergebnisse unwahrscheinlich. Zudem wurden die Ergebnisse verblindet von zwei unabhängigen Untersuchern ausgewertet, d.h. dass während der Auswertung die Identität der Tiere nicht bekannt war. Die ROIs wurden für jedes Tier durch das entsprechende MRT separat festgelegt, wodurch Schwankungen durch Hirnanatomie einzelner Individuen ausgeschlossen wurden. Abweichungen in der 71 Lediglich eine voxelbasierte computerisierte Auswertemethode könnte möglicherweise durch noch größere, manuell nicht erreichbare Genauigkeit evtl. vorhandene, aber mit unserer Methode nicht erkennbare Unterschiede sichtbar machen. Ein derartiges System war zum Zeitpunkt der Durchführung der Studie noch nicht verfügbar. 5.2 Zur MRT-Untersuchung Auch die MRT-Messungen in diesem Versuch konnten keine signifikanten Veränderungen der striatalen Volumina nachweisen. Die letzte Messung der Tiere fand zu einem Zeitpunkt statt, an dem die Tiere 20 Monate alt waren. Die im Versuch von von Hörsten et al. 2003 nachgewiesene Reduktion des Volumens bereits bei 8 Monate alten transgenen HD-Ratten konnte damit nicht bestätigt werden. Es wäre denkbar, dass sich eine im MRT erkennbare Atrophie bei den HD-Ratten erst in einem Alter von mehr als 20 Monaten manifestiert und somit in unserer Studie nicht erfasst werden konnte. Dagegen spricht jedoch – neben den o.g. Ergebnissen der Arbeitsgruppe von v.Hörsten, dass ein Großteil der Tiere bereits vor Erreichen diesen Alters verstorben war und eine maximale Ausprägung der pathologischen Veränderungen vor dem Versterben und damit am vierten Messzeitpunkt mit großer Wahrscheinlichkeit angenommen werden kann. Möglicherweise können zukünftige Untersuchungen mit speziellen Kleintier- Tomographen mit höherer räumlicher und zeitlicher Auflösung (9 bis zu 21 Tesla) zu einer Verbesserung der Qualität der Messungen und damit möglicherweise zu einem genaueren Ergebnis im Sinne einer Erfassung minimaler Volumenänderungen führen. Zudem könnte eine voxelbasierte Auswertung erwogen werden, um kleinste Veränderungen zu detektieren. 69 5.3 Zur Accelerod-Untersuchung Die Untersuchung der Ratten mit dem Accelerod ließ keine signifikant schlechtere Laufleistung der transgenen Tiere im Vergleich zu den Kontrolltieren erkennen. In keiner der Gruppen konnte eine signifikante Veränderung der Laufzeiten vom ersten zum zweiten Messzeitpunkt nachgewiesen werden, wobei die Männchen aufgrund der zu geringen Tierzahl nicht mehr in die Auswertung eingingen. Bode et al. untersuchten 2008 Tiere im Alter von 14 Monaten und konnten eine verminderte Laufleistung ausschließlich bei den männlichen transgenen Tieren, nicht aber bei den Weibchen feststellen. Durch v. Hörsten et al. wurden 2003 Ergebnisse von Accelerod-Versuchen mit hetero- und homozygoten HD-Ratten veröffentlicht, die eine progressive Verschlechterung der Motorik der Tiere ab einem Alter von 10 Monaten feststellten (von Horsten et al., 2003). Nugyen et. al. fanden signifikante motorische Defizite schon bei 5 Monate alten transgenen HD-Ratten beider Geschlechter erkennen konnten (Nguyen et al., 2006). In diesem Versuch waren keine signifikanten Unterschiede in der Laufleistung der transgenen und der Kontrolltiere zu erkennen. Aufgrund des progredienten Verlaufs der HD und den damit einhergehenden progressiven Einbußen der motorischen Fähigkeiten bei menschlichen Patienten wäre eine deutliche Verschlechterung der Laufleistung der transgenen Tiere im zeitlichen Verlauf zu erwarten gewesen (Beste et al., 2007). Untersuchungen verschiedener transgener Mausmodelle der HD zeigten dem Rotarod bzw. Accelerod ebenfalls eine progressiv verlaufende Verschlechterung der Laufleistung (Carter et al., 1999) (Slow et al., 2003). Das hier gefundene Ergebnis deckt sich allerdings mit den MRT- und PETUntersuchungen, bei denen sich ebenfalls keine deutlichen pathologischen und pathognomischen Veränderungen erkennen lassen. 70 Zusammenfassende Beurteilung Aufgrund der in unserer Studie erhobenen Befunde steht die generelle Eignung des hier untersuchten transgenen Ratten-Modells für die HD zur Disposition. In unserer mit einer großen Tierzahl unter standardisierten Bedingungen durchgeführten Studie konnten wir weder im Querschnitt noch im Verlauf mittels PET- und MRT-Messungen und Accelerod-Untersuchungen einen pathologischen Phänotyp detektieren. Es waren keine Hinweise auf neurodegenerative Veränderungen im Striatum transgener HD-Ratten in-vivo nachweisbar. Zukünftige Untersuchungen müssen zeigen, in wieweit sich die hier gefundenen Ergebnisse reproduzieren lassen und transgene Ratten mit einem anderen molekularen Aufbau einen mit dem Menschen vergleichbareren Phänotyp aufweisen. 71 6 Zusammenfassung Veronika Lippross Objektive, nicht-invasive bildgebende Diagnostik der Neurodegeneration in transgenen Huntington-Ratten – eine Follow-up-Studie mit Kleintier-PET und MRT Ziel der Arbeit war, die Hypothese zu untersuchen, dass transgene Huntington-Ratten im Verlauf der Erkrankung bzw. ihrer Lebensspanne eine im PET und MRT messbare Neurodegeneration entwickeln. Sollte sich diese Hypothese bestätigen, würde sich das Ratten-Modell für weitere Therapie- und Verlaufsstudien eignen. Die Huntington‘sche Erkrankung gehört zu der wachsenden Gruppe der herediteren neurodegenerativen CAG-Triplet-Repeat-Erkrankungen, denen eine pathologische Verlängerung der Cytosin-Adenosin-Guanin-Sequenzen zugrunde liegt. Der mutierte Genabschnitt des HD-Gens befindet sich innerhalb einer Sequenz, die für das cytoplasmatische Protein Huntingtin (htt) kodiert. Wahrscheinlich durch die pathologische CAG-Verlängerung entwickelt das Huntingtin eine bislang nicht geklärte toxische Wirkung, die die Krankheitserscheinungen der Chorea Huntington induziert, ein als „Game of Function“ bezeichnetes Prinzip. Die Chorea Huntington ist eine der häufigsten genetisch bedingten Erkrankungen beim Menschen. Sie ist gekennzeichnet durch den zunehmenden Verlust der motorischen Kontrolle und führt u.a. zu unkontrollierbaren Hyperkinesien, Dysdiadochokinese sowie zum Nachlassen der intellektuellen Fähigkeiten und psychiatrischen Symptomen wie Persönlichkeitsveränderungen, Gewaltbereitschaft, Wahnvorstellungen und Depressionen. Die Erkrankung, die sich typischerweise im Erwachsenenalter manifestiert, verläuft langsam progredient und führt innerhalb eines Zeitraums von meist 15 – 20 Jahren zum Tod des Betroffenen. Charakteristische pathologische Befunde sind Atrophien im Bereich der Hirnrinde und der Basalganglien, vor allem des Striatums. Im Verlauf der Erkrankung verliert das gesamte Hirn bis zu 30% an Gewicht. Bei den Versuchstieren handelte es sich um 35 Sprague-Dawley-Ratten aus der 72 Arbeitsgruppe um Professor Dr. Stephan von Hörsten, Erlangen. Die 17 homozygot transgenen Tiere der Linie 2762 wurden mit 18 als nicht transgen getesteten Geschwistertieren verglichen. In das Genom der transgenen Ratten wurde das Huntington-Gen zufällig positioniert eingebracht. Die Tiere produzieren zusätzlich zum endogenen normalen Protein Huntingtin das krankheitsauslösende pathologische Protein. Das tgHD-Rattenmodell hat im Vergleich zu den bisher hauptsächlich verwendeten Maus-Modellen den Vorteil eines chronischen Phänotyps. Die tgHDRatten haben im Gegensatz zu den früher eingesetzten Mäusen eine Lebenserwartung von etwa 2 Jahren und entwickeln einen langsam progredienten Phänotyp, der am ehesten der chronischen Verlaufsform der Erkrankung des Menschen entspricht. Die Expression des mutierten Proteins erfolgt vor allem im frontalen und temporalen Cortex, dem Hypocampus, den Basalganglien, insbesondere dem Striatum und dem Mesencephalon. Deutlich geringere Expression findet im Kleinhirn und im Rückenmark statt. Die Tiere wurden unter standardisierten Bedingungen im Tierstall des Instituts für Pharmakologie der Universitätsklinik Münster gehalten, unter der Leitung der zentralen tierexperimentellen Einrichtung (ZTE). Die Tierversuchsgenehmigungsnummer der Bezirksregierung Münster lautete G 54/2006. Die Tiere wurden im Alter von jeweils 5, 10, 15 und 20 Monaten mit bildgebenden Verfahren untersucht. Dazu wurden die Tiere mit einer Isofluran-Inhalationsnarkose betäubt. Zum Einsatz kamen die Magnetresonanztomographie sowie die PositronenEmissionstomographie, um sowohl anatomisch substanzielle als auch Stoffwechselveränderungen im Verlauf der Erkrankung festzustellen. Genutzt wurden der Philips-Ganzkörper-MR-Scanner mit drei Tesla im Institut für klinische Radiologie des Universitätsklinikums Münster, ausgerüstet mit zwei hochauflösenden Vierelementoberflächenspulen, die speziell für die Untersuchung von Kleintieren konzipiert worden sind. Es wurden sowohl T1 als auch T2 gewichtete Messungen durchgeführt. Die Darstellung des Hirnstoffwechsels der tgHD-Ratten und der Kontrolltiere erfolgte nach Injektion von jeweils ca. 40 mBq F18-FDG über eine Schwanzvene im Tierquad-HIDAC-PET der Firma Oxford Positron Systems Ltd. in der Klinik für Nuklearmedizin in der Universität Münster. Die Datensätze von MRT und PET wurden fusioniert. Die ROIs (Regions of Interest), Striata und Kleinhirn sowie das gesamte Gehirn, wurden markiert und ausgewertet. Im Unterschied zu den F18-FDGPET-Voruntersuchungen durch von Hörsten et al. 2003, die nur am Gesamthirn 73 vorgenommen worden waren, wurden jetzt spezifische Hirnregionen wie das Striatum untersucht und das Kleinhirn als nicht vom Krankheitsprozess betroffenes Areal als Referenzbereich bestimmt. Dadurch konnten in der vorliegenden Arbeit Störeinflüsse wie Muskelaktivität oder Veränderungen der Umgebungsbedingungen weitestgehend ausgeschlossen werden. Die motorische Leistung der Tiere wurde jeweils im Alter von 15 und 21 Monaten in einem akzelerierten Rotarod, dem Accelerod der Feinmechanik-Werkstatt der Orthopädie des Universitätsklinikums Münster gemessen. Die Erhebung und Auswertung der Daten erfolgte über einen Zeitraum von etwa zwei Jahren. Es handelte sich um eine explorative Studie. Von allen erhobenen Messwerten wurden Mittelwerte und Standardabweichungen berechnet. Alle durchgeführten Tests wurden auf einem Signifikanzniveau von 5% durchgeführt. Obwohl eine maximale Ausprägung der pathologischen Veränderungen vor dem Versterben und damit zum vierten Messzeitpunkt angenommen werden konnte, ergaben die MRT-Messungen keine signifikante Abnahme der striatalen Volumina. Auch mittels FDG-PET-Bildgebung war die erwartete Neurodegeneration nicht darzustellen. Die Messung der mittleren und der maximalen striatalen Aktivität mit Bezug auf die Kleinhirnaktivität ergab keinen signifikanten Unterschied zwischen transgenen Tieren und Kontrolltieren. Möglicherweise ist F18-FDG für die Untersuchung der transgenen Huntington-Ratten zu unspezifisch. In der Accelerod-Untersuchung ließ sich in dieser Studie ebenfalls keine signifikant schlechtere Laufleistung der transgenen Tiere im Vergleich zu den Kontrolltieren erkennen. Aufgrund der erhobenen Befunde steht die generelle Eignung des hier untersuchten transgenen Ratten-Modells für die Huntingtonsche Krankheit zur Disposition. In der mit einer großen Tierzahl unter standardisierten Bedingungen durchgeführten Studie konnte weder im Querschnitt noch im Verlauf mittels PET- und MRT-Messungen und Accelerod-Untersuchungen ein pathologischer Phänotyp detektiert werden. Es waren keine Hinweise auf neurodegenerative Veränderungen im Striatum transgener HDRatten in vivo nachweisbar. Zukünftige Untersuchungen müssen zeigen, inwieweit sich die hier gefundenen Ergebnisse reproduzieren lassen und transgene Ratten mit einem anderen molekularen Aufbau einen mit dem Menschen vergleichbareren Phänotyp aufweisen. 74 7. Summary Veronika Lippross Objective non-invasive diagnostic imaging for neurodegeneration in transgenic Huntington rats - a follow-up study using small animal PET and MRI. The hypothesis of the work presented was that transgenic Huntington rats develop neurodegeneration measurable in PET and MRI during the course of the disease or their life span. Should this hypothesis be confirmed, the rat model could be used for further treatment or follow-up studies. Huntington’s disease (HD) belongs to the growing group of inherited neurodegenerative CAG triplet-repeat disorders, which are based on a pathological extension of guanine cytosine-adenosine sequences. The mutant gene section of the HD gene is located within a sequence that encodes for the cytoplasmic protein huntingtin (htt). Probably caused by the pathological CAG extension htt develops unclarified toxic effects, which induce the symptoms of Huntington's disease, a principle known as "Game-of-function". Huntington's disease is one of the most common genetic human disorders. It is characterized by the increasing loss of motor control and leads to uncontrollable hyperkinesia, dysdiadochokinesia as well as by decreasing intellectual skills and psychiatric symptoms such as personality changes, violence, delusions and depression. The disease, which typically manifests itself in adulthood, leads slowly progressive over a period of usually 15-20 years to the death of the patient. Characteristic pathological findings include atrophy in the area of the cerebral cortex and the basal ganglia, especially of the striatum. During the course of the disease, the entire brain loses up to 30% of weight. The test animals were 35 Sprague-Dawley rats from the group of Professor Dr. Stephan von Hörsten, Erlangen. 17 homozygous transgenic animals were compared with 18 control animals tested as not transgene. The Huntington's disease gene was randomly inserted into the genome of the transgenic rats. The animals produce the disease-inducing pathological protein in addition to normal endogenous protein huntingtin. The tgHD rat model has the advantage of a chronic phenotype. TgHD rats have a life expectancy of more than 2 years as opposed to the previously used mice. 75 Hence this rodent model is phenotypically most closely comparable to the human chronic form of the disease, with respect to the life expectancy of rats. The expression of the mutated protein is in the frontal and temporal cortex, the hippocampus, the basal ganglia, particularly the striatum, and the midbrain. Significantly lower expression are found in the cerebellum and spinal cord. The animals were kept under standardized conditions in the Institute of Pharmacology of the University Hospital of Münster, under the direction of the Central animal facility (ZTE). Ethical approval was obtained from the local authorities (Regierungsbezirk Münster, 54/2006 G) All animals were examined at the age of 5, 10, 15 and 20 months with imaging techniques. Prior to imaging, all animals recieved isoflurane inhalation anesthesia. Magnetic Resonance Imaging (3 Tesla MRI Scanner) and Positron Emission Tomography were used to determine substantial anatomic as well as metabolic changes. Imaging of brain metabolism of tgHD rats and control animals was carried out after injection of approximately 40 mBq F18-FDG through the tail vein in the animal-Quad-HIDAC PET of Oxford Positron Systems Ltd. at the Department for Nuclear Medicine at the University of Münster. The data sets of MRI and PET were merged. ROIs (regions of interest) encompassing striata, the entire brain and cerebellum were manually placed on the MRI and transferred to the co-registered μPET. Mean and maximal FDG-PET activities within ROIs were calculated and normalized to cerebellar FDG uptake. Activity and spatially normalized FDG-μPET were compared between groups on a hypothesis-free voxel-by-voxel basis using SPM. In contrast to the preliminary F18-FDG-PET investigations by Hörsten et al. 2003, which only examined the entire brain, now specific brain regions were investigated and the cerebellum as a non-affected area was determined as reference area. By this, interfering factors like muscle activity or changes in ambient conditions could be almost excluded in the present work. Motor performance of the animals was measured at the age of 15 and 21 months in an accelerated Rotarod, the Accelerod of the precision mechanics workshop of Orthopedics of the University Hospital of Münster. The collection and analysis of data was carried out over a period of about two years. 76 Averages and standard deviations of the collected measures were calculated. All tests were conducted at a significance level of 5%. The exact two-sided significance was determined. However MRI measurements showed no significant decrease of striatal volumes, although a maximum expression of pathological changes before the death and thus the fourth time of the measurement can be assumed. Further, Neurodegeneration was not represent by means of FDG-PET imaging. Measurement of the middle and the maximum striatal activity with relation to the cerebellum activity showed no significant difference between transgenic and control animals. F18-FDG may be too unspecific for the investigation of the Huntington transgenic rats. Also the Accelerod investigation revealed no significantly worse mileage of transgenic animals as compared to the control animals. Based on findings presented here the general suitability of the tested transgenic rat model for Huntington disease is debatable. In the study carried out with a large number of animals under standardized conditions, no pathological phenotype could be detected in the cross section, nor in the course of using PET and MRI measurements and Accelerod studies. Future studies must show to what extent the results found here may be reproduced and if transgenic rats with a different molecular structure exhibit a phenotype comparable with the humans. 77 8 Literaturverzeichnis 1. Ambrose, C. M., et al. "Structure and expression of the Huntington's disease gene: evidence against simple inactivation due to an expanded CAG repeat." Somat.Cell Mol.Genet. 20.1 (1994): 27-38. 2. Andrew, E. R. and E. Szczesniak. "Magnetic shielding of magnetic resonance systems." Magn Reson.Med. 10.3 (1989): 373-87. 3. Andrew, E. R. "An introduction to nuclear magnetic resonance in biomedicine." 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Hum.Mol.Genet 87 9 Anhang weiblích wildtyp weiblich transgen Mes Mess szeit zeitp pun Mittelwert Vol unkt Volumen Sre Volumen Sli Mittelwert Vol kt Volumen Sre Volumen Sli 1 7.264 7.304 7.284 1 7.144 7.144 7.144 1 7.128 7.032 7.08 1 7.12 7.176 7.148 1 8.016 8.04 8.028 1 7.048 7.144 7.096 1 7.176 7.208 7.192 1 7.216 7.144 7.18 1 1 7.856 8.072 7.964 1 7.832 7.824 7.828 1 8.112 8.352 8.232 1 1 7.84 7.856 7.848 1 8.296 8.288 8.292 1 8.08 8.08 8.08 1 7.584 7.648 7.616 1 7.36 7.456 7.408 1 7.664 7.736 7.7 1 2 7.656 7.608 7.632 2 7.912 7.944 7.928 2 7.936 7.936 7.936 2 7.736 7.648 7.692 2 8.032 7.96 7.996 2 7.6 7.712 7.656 2 8.016 8.144 8.08 2 7.16 7.176 7.168 2 8.768 8.744 8.756 2 7.904 7.992 7.948 2 7.96 8.12 8.04 2 8.456 8.48 8.468 2 2 6.888 6.896 6.892 2 7.904 7.848 7.876 2 8.112 8.144 8.128 2 7.536 7.592 7.564 2 8.568 8.52 8.544 2 7.328 7.352 7.34 2 8.176 8.16 8.168 3 7.872 7.976 7.924 3 3 9.48 9.408 9.444 3 7.984 7.944 7.964 3 8.856 8.824 8.84 3 8.424 8.48 8.452 3 8.144 8.16 8.152 3 7.288 7.384 7.336 3 9.536 9.584 9.56 3 7.288 7.384 7.336 3 8.432 8.568 8.5 3 6.992 6.968 6.98 3 8.712 8.712 8.712 3 7.728 7.712 7.72 3 7.136 7.208 7.172 3 8.736 8.728 8.732 3 7.456 7.528 7.492 3 8.656 8.584 8.62 3 7.408 7.424 7.416 3 8.328 8.296 8.312 4 9.16 9.096 9.128 4 4 8.008 7.936 7.972 4 8.328 8.296 8.312 4 8.432 8.48 8.456 4 8.664 8.64 8.652 4 8.992 8.952 8.972 4 7.56 7.552 7.556 4 8.504 8.456 8.48 4 4 8.176 8.216 8.196 4 4 9.704 9.712 9.708 4 8.448 8.432 8.44 4 8.88 8.976 8.928 4 8.6 8.568 8.584 4 8.528 8.536 8.532 4 8.704 8.656 8.68 4 Tabelle 7: Volumina der rechten und linken Striata der weiblichen Tiere an den Messzeitpunkten 1-4 Dargestellt sind die Werte von rechtem und linkem Striatum der einzelnen Tiere sowie deren Mittelwert. Die Messzeitpunkte 1, 2, 3 und 4 entsprechen einem Alter der Tiere von 5, 10, 15 und 20 Monaten. 88 männlich wildtyp männlich transgen Mes Mess szeit zeitp punk Volumen Sre Volumen Sli Mittelwert Vol unkt Volumen Sre Volumen Sli Mittelwert Vol t 1 6.88 7.128 7.004 1 7.704 7.736 7.72 1 4.552 7.744 6.148 1 1 7.64 7.704 7.672 1 8.288 8.256 8.272 1 8.456 8.304 8.38 1 7.488 7.44 7.464 1 8.056 8.192 8.124 1 7.928 7.936 7.932 1 7.576 7.448 7.512 1 1 8.224 8.288 8.256 1 7.072 7.112 7.092 1 7.272 7.296 7.284 1 7.696 7.68 7.688 1 7.128 7.088 7.108 1 7.28 7.264 7.272 1 3.232 5.864 4.548 2 8.08 8.064 8.072 2 8.264 8.272 8.268 2 7.552 7.544 7.548 2 8.328 8.376 8.352 2 7.728 7.728 7.728 2 7.48 7.56 7.52 2 7.48 7.432 7.456 2 2 8.704 8.72 8.712 2 2 8.872 8.92 8.896 2 8.648 8.632 8.64 2 2 7.928 7.944 7.936 2 7.88 7.904 7.892 2 7.768 7.784 7.776 2 7.448 7.424 7.436 2 3 8.232 8.248 8.24 2 7.96 8.12 8.04 3 8.024 8.152 8.088 3 8.848 8.832 8.84 3 7.32 7.312 7.316 3 8.616 8.544 8.58 3 8.8 8.752 8.776 3 8.848 8.768 8.808 3 3 8.848 8.768 8.808 3 8.112 8.064 8.088 3 8.56 8.504 8.532 3 3 9.36 9.432 9.396 3 9.368 9.344 9.356 3 9.928 9.952 9.94 3 8.056 8.008 8.032 3 8.536 8.496 8.516 4 3 8.68 8.6 8.64 4 3 6.16 6.088 6.124 4 7.448 7.424 7.436 3 4 3 4 4 4 4 9.392 9.36 9.376 4 4 8.864 8.864 8.864 4 4 4 4 4 4 4 Tabelle 8: Volumina der rechten und linken Striata der männlichen Tiere an den Messzeitpunkten 1-4 Dargestellt sind die Werte von rechtem und linkem Striatum der einzelnen Tiere sowie deren Mittelwert. Die Messzeitpunkte 1, 2, 3 und 4 entsprechen einem Alter der Tiere von 5, 10, 15 und 20 Monaten. 89 Messzeitpunkt weiblich wildtyp weiblich transgen Volumen Volumen 7.6275 7.56666667 0.42341435 0.46007391 1 Mw Stabw 2 Mw Stabw 7.91333333 0.40195522 7.8592 0.52728841 3 Mw Stabw 8.3212 0.83421084 7.8925 0.58363198 4 Mw Stabw 8.43028571 0.51582352 8.698 0.58363198 Tabelle 9: Mittelwerte und Standardabweichung der Volumina der rechten und linken Striata der weiblichen Ratten an den Messzeitpunkten 1-4 Dargestellt sind die Mittelwerte aus rechtem und linkem Striatum der gesamten Gruppe und die dazugehörige Standardabweichung. Die Messzeitpunkte 1, 2, 3 und 4 entsprechen einem Alter der Tiere von 5, 10, 15 und 20 Monaten Messzeitpunkt männlich wildtyp Volumen männlich transgen Volumen 1 Mw Stabw 7.2036 1.14867336 7.63428571 0.39997238 2 Mw Stabw 8.076 0.40203482 7.9675 0.56194535 3 Mw Stabw 8.6184 0.37664484 8.27085714 0.56194535 4 Mw Stabw 9.12 0.41663029 7.436 0.63356768 Tabelle 10: Mittelwerte und Standardabweichung der Volumina der rechten und linken Striata der männlichen Ratten an den Messzeitpunkten 1-4 : Dargestellt sind die Mittelwerte aus rechtem und linkem Striatum der gesamten Gruppe und die dazugehörige Standardabweichung . Die Messzeitpunkte 1, 2, 3 und 4 entsprechen einem Alter der Tiere von 5, 10, 15 und 20 Monaten 90 weiblich´wildtyp kh sre sli Messzeitpunkt ROI Avg ROI Max. ROI Avg ROI Max. ROI Avg ROI Max. 1 1151.3 1894.4 1575 1825 1686.9 1964.9 1 1244.7 2026.1 1717.8 2110.1 1694.7 2106.4 1 851.85 1272.8 1377.4 1766.8 1285.7 1578.2 1 851.59 1369.5 1266.8 1657.4 1321.9 1659.7 1 1 1298.3 2053.5 1830.8 2151.8 1840.1 2194.2 1 1 829.96 1310 1290.6 1676.2 1241.6 1703 1 845.72 1417.4 1183.8 1437.7 1251.6 1517.4 1 1012.4 1546.5 1407.4 1704.6 1434.8 1825 2 407.85 722.72 911.66 1209 909.46 1200 2 628.42 1354.8 1289.2 1618.9 1266.2 1606.2 2 481.8 834.76 1007.1 1318.5 922.53 1204.3 2 508.28 810.31 839.11 1098.8 935.25 1168.7 2 637.21 1051.9 1145.6 1390.8 1104.1 1400.9 2 784.13 1325.7 1528.3 1914.2 1568.3 1938 2 2 738.93 1106.2 1197.3 1462.7 1213.1 1535.8 2 631.7 1025.8 1162 1454.5 1183.8 1386 2 642.82 1130 1407.7 1774.4 1480.8 1838.7 3 769.82 1413.8 1193.5 1605.8 1239.7 1701.8 3 754.46 1202 1100.5 1486.2 1172.5 1407.7 3 588.72 984.46 1001.2 1236.3 999.82 1253.3 3 736.09 1093.4 1131.2 1401.2 1065.3 1369.1 3 627.74 1120.9 1034 1283.8 1097.6 1335 3 859.98 1427.4 1552.7 1909.2 1529.7 2052.4 3 871.93 1288.1 1492 1868.6 1485.6 1862.8 3 813.43 1328.7 1378.5 1671.3 1394.9 1668.3 3 765.3 1185.5 1192.1 1445.2 1235.1 1549.8 3 745.87 1226.2 1226.2 1514.2 1261.7 1571.3 4 575.59 994.38 814.23 1065.4 788.56 1003.3 4 576.86 876.18 873.3 1068.4 815.69 1022.4 4 470.35 641.18 602.32 749.67 624.92 736.21 4 572.73 841.31 844.72 1129.4 838.43 1136.2 4 4 4 450.89 757.52 873.85 1101 816.57 1132.2 4 460.88 687.59 602.24 743.32 573.66 720.55 4 466.39 840.98 883.29 1159.4 823.12 1073.3 Tabelle 11: Mittlere und maximale PET-Aktivität des Kleinhirns (kh) und der rechten (sre) und linken (sli) Striata der weiblichen Kontrolltiere an den Messzeitpunkten 1-4. Die Messzeitpunkte 1, 2, 3 und 4 entsprechen einem Alter der Tiere von 5, 10, 15 und 20 Monaten. Zum Zeitpunkt 4 waren die Gruppen der männlichen Tiere nicht mehr auswertbar. 91 weiblich transgen kh sre sli Messzeitpunkt ROI Avg ROI Max. ROI Avg ROI Max. ROI Avg ROI Max. 1 680.1 941.38 949.75 1125 935.28 1129.1 1 677.72 914.39 950.36 1140.2 922.21 1185.9 1 643.51 885.48 872.36 1048.9 886.12 1073.7 1 810.22 1340.6 1299.6 1598.4 1319.3 1698 1 630.14 1002.2 956.59 1144.8 990.85 1183 1 450.37 677.95 671.79 784.14 671.61 837.61 1 669.44 928.99 979.77 1236.3 994.6 1198.9 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 623.58 543.62 531.38 543.62 510.71 396.92 546.91 610.36 488.47 584.35 557.91 531.66 963.45 901.88 784.71 803.79 847.75 640.47 844.04 878.54 872.56 969.66 778.15 809.34 927.56 931.5 942.76 869.37 1031.9 790.09 1081.2 1126 863.5 1050.2 1076.2 1119 1143.1 1149.3 1143.8 1089.7 1261.5 950.98 1368.9 1506.7 1082.1 1335.3 1423 1417 925.97 932.64 956.57 873.24 1049.3 733.67 1047.9 1095.3 839.25 1085.2 1058.8 1088.7 1100 1157.6 1162.4 1060.4 1286.6 915.03 1339.7 1415 1082.2 1368 1339.1 1448.9 538.34 627.14 882.55 1010.6 969.21 1207.5 1203.7 1594.3 1039.6 1281.1 1246.9 1703.9 504.66 602.64 848.51 568.04 606.87 678.45 1011.3 1471 1045.4 875.91 829.65 941.09 1633.1 1035.5 994.87 1015.8 1110.3 2115.1 1371.8 1326.2 836.68 843.59 1672.5 1070.6 1040.8 1092.4 1077.7 2201.1 1335.4 1263.6 384.92 495.36 374.1 458.9 692.08 237.7 309.53 286.73 656.23 833.67 661 667.01 1040.5 355.18 586.96 424.99 594.82 740.29 448.13 674.19 916.31 399.42 461.9 525.59 740.45 920.04 567.66 855.8 1206.6 522.02 571.25 647.23 555.25 777.64 515.97 671.39 960.96 422.21 472.7 507.18 788.48 979.65 651.9 894.81 1152.7 581.15 589.74 630.41 Tabelle 12: Mittlere und maximale PET-Aktivität des Kleinhirns (kh) und der rechten (sre) und linken (sli) Striata der weiblichen tgHD-Ratten an den Messzeitpunkten 1-4. Die Messzeitpunkte 1, 2, 3 und 4 entsprechen einem Alter der Tiere von 5, 10, 15 und 20 Monaten. Zum Zeitpunkt 4 waren die Gruppen der männlichen Tiere nicht mehr auswertbar. 92 männlich wildtyp kh sre sli Messzeitpunkt ROI Avg ROI Max. ROI Avg ROI Max. ROI Avg ROI Max. 1 939.14 1357.7 1413.9 1935.9 1520 1953.5 1 1053.8 1578.9 1576.6 1912.2 1626.6 2036.4 1 740.58 1218.8 1264.7 1733.6 1215 1581.2 1 703.8 1044.1 1084.9 1460 1135.2 1462.3 1 809.11 1512.8 1250 1553 1285.4 1520 1 1082.5 1764.6 1501.2 1866.2 1518.7 1857 1 1059.3 1643.6 1389.8 1819.1 1453.2 1800.2 1 870.96 1341 1221.9 1579.9 1235.9 1532.9 1 1086.9 1548.2 1518.7 1987.6 1453.7 1845 1 814.65 1233 1220.6 1431.1 1179.2 1559.4 2 810.39 1303.9 1156 1577 1191.2 1686.6 2 740.48 1333 1190.1 1539.1 1205.5 1485.6 2 806.08 1350.8 1245.2 1580.3 1279.4 1525.5 2 2 2 779.4 1097.2 1141.7 1571.9 1188.9 1520 2 693.09 1174.8 1282.7 1588.5 1269.2 1571.6 2 863.89 1395.6 1329.4 1661.4 1319 1697.2 2 2 3 724.92 1069.1 1083.7 1353.8 1104.8 1356.3 3 870.43 1437.5 1527.9 2004 1478.8 1914.7 3 439.55 671.74 997.91 1246.6 1078.1 1382 3 420.69 779.99 994.01 1257.4 970.3 1154 3 505.62 823.38 718.45 959.38 754.22 915.75 3 623.7 987.87 1000.5 1410.7 1022.9 1343 3 749.47 1303.1 1575.9 2054.5 1673.1 2005.3 3 405.58 739.6 1065.2 1416.8 1064.1 1472.7 3 540.93 998.63 1081.4 1391 1191.5 1552.6 4 435.44 711.76 795.57 1001.5 744.7 909.22 4 507.54 791.43 827.38 1037.5 798.14 1005.4 4 4 4 4 4 4 4 Tabelle 13: Mittlere und maximale PET-Aktivität des Kleinhirns (kh) und der rechten (sre) und linken (sli) Striata männlichen Kontrolltiere an den Messzeitpunkten 1-4. Die Messzeitpunkte 1, 2, 3 und 4 entsprechen einem Alter der Tiere von 5, 10, 15 und 20 Monaten. Zum Zeitpunkt 4 waren die Gruppen der männlichen Tiere nicht mehr auswertbar. 93 männlich transgen kh sre sli Messzeitpunkt ROI Avg ROI Max. ROI Avg ROI Max. ROI Avg ROI Max. 1 944.98 1398.7 1649.5 2040.2 1649.3 2012 1 1 1222.6 2060.9 2395.6 3188.9 2455.6 3196.9 1 1098.9 1618.8 1829.1 2133.7 1843.1 2164.3 1 445.45 768.01 838.24 1028.9 837.64 1051.2 1 1 906.98 1562.5 1640.9 2047.8 1593 1962.4 1 382.39 653.92 615.29 836.18 644.5 833.43 1 647.26 1053.5 1044 1403.1 1058.4 1249.6 2 568.29 1143.7 904.76 1136.5 919.36 1128.4 2 566.03 804.26 832.1 1057.3 872.79 1055.4 2 428.96 726.5 815.15 1116.1 873.84 1152.1 2 671.07 928.55 1020.6 1304.3 990.01 1202.6 2 612.97 872.09 921.53 1142 945.4 1137.4 2 896.1 1477.6 1569.9 1938.7 1597.8 1912.4 2 2 588.28 920.49 1009 1255.9 1031.3 1268.9 2 371.48 593.44 765.73 943.89 709.74 848.31 3 756.92 1312.1 1496.1 1820.5 1485.8 1935.1 3 478.15 698.69 918.17 1201.6 1040 1313.3 3 716.91 1071.2 1366.9 1784.8 1385.1 1809.9 3 675.59 1305.6 1435.3 1773.8 1407.3 1740.7 3 3 630.53 1115.7 1464.1 1836 1461 1774.7 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 564.46 469 958.69 839.22 1193.9 1037.8 1573.4 1402 1221.7 1036.2 1603.7 1322.4 648.54 1267.3 913.36 1198.9 870.95 1110.8 Tabelle 14: Mittlere und maximale PET-Aktivität des Kleinhirns (kh) und der rechten (sre) und linken (sli) Striata männlichen tgHD Ratten an den Messzeitpunkten 1-4. Die Messzeitpunkte 1, 2, 3 und 4 entsprechen einem Alter der Tiere von 5, 10, 15 und 20 Monaten. Zum Zeitpunkt 4 waren die Gruppen der männlichen Tiere nicht mehr auswertbar. 94 Weiblich wildtyp Messzeitpunkt 1 mw stabw kh striatum(max) striatum(mean) striatum max/kh mean striatum mean/kh mean 1010.7275 1842.6375 1462.93125 1.84547304 1.45665476 195.548922 231.42018 230.687161 0.15857422 0.06967271 2 mw stabw 606.793333 120.999071 1498.11111 264.863745 1170.63944 229.837629 2.49863518 0.30739928 1.9431177 0.21336087 3 mw stabw 753.334 89.8707959 1589.09 244.338078 1239.191 180.709638 2.10556539 0.1336166 1.64339881 0.09757192 4 mw stabw 510.527143 195.548922 1007.79857 231.42018 769.635714 230.687161 1.98435962 0.15857422 1.51569936 0.06967271 Tabelle 15: Mittelwerte und Standardabweichung der mittleren Kleinhirnaktivität und der mittleren und maximalen PET-Aktivität der Striata der weiblichen Kontrolltiere an den Messzeitpunkten 1-4 :. Die Messzeitpunkte 1, 2, 3 und 4 entsprechen einem Alter der Tiere von 5, 10, 15 und 20 Monaten. Messzeitpunkt 1 mw stabw weiblich transgen kh striatum(max) striatum(mean) striatum max/kh mean striatum mean/kh mean 636.522222 1182.70111 950.992222 1.85786392 1.49577157 98.9894649 224.84901 163.823132 0.16509235 0.11579206 2 mw stabw 530.101111 61.7169625 1280.55333 193.536238 993.267778 128.903001 2.41372849 0.20922921 1.87618759 0.1467823 3 mw stabw mw 4 stabw 613.742857 111.906967 404.915 144.387687 1436.08571 394.382705 792.445 221.56572 1099.69929 276.53423 602.746875 177.324856 2.31921565 0.29214636 2.00868089 0.24199468 1.78005661 0.18231631 1.52198822 0.17175671 Tabelle 16: Mittelwerte und Standardabweichung der mittleren Kleinhirnaktivität und der mittleren und maximalen PET-Aktivität der Striata der weiblichen tgHD Ratten an den Messzeitpunkten 1-4 :. Die Messzeitpunkte 1, 2, 3 und 4 entsprechen einem Alter der Tiere von 5, 10, 15 und 20 Monaten. 95 Messzeitpunkt 1 mw stabw männlich wildtyp kh striatum(max) striatum(mean) striatum max/kh mean striatum mean/kh mean 916.074 1755.1 1353.26 1.93486085 1.48880611 147.766748 206.833196 163.230517 0.18994835 0.10854131 2 mw stabw 782.221667 59.5435543 1610.6 65.2564173 1233.19167 63.8296202 2.06558868 0.12268624 1.58344695 0.1388816 3 mw stabw 586.765556 165.134896 1494.39778 346.119336 1132.37722 271.281253 2.6342406 0.5938207 1.9894011 0.42190552 4 Mw stabw 471.49 50.9823989 1019.5 25.4558441 791.4475 30.1404265 2.17207315 0.18087691 1.68500382 0.11827422 Tabelle 17: Mittelwerte und Standardabweichung der mittleren Kleinhirnaktivität und der mittleren und maximalen PET-Aktivität der Striata der männlichen Kontrolltiere an den Messzeitpunkten 1-4 :. Die Messzeitpunkte 1, 2, 3 und 4 entsprechen einem Alter der Tiere von 5, 10, 15 und 20 Monaten. . männlich transgen kh striatum mean/kh striatum(max) striatum(mean) striatum max/kh mean mean Messzeitpunkt 1 mw stabw 806.937143 322.359102 1819.95429 800.784803 1435.29786 628.91696 2.24507098 0.20115943 1.76221194 0.13207288 2 mw stabw 587.8975 158.337581 1242.96125 302.887136 986.188125 258.204351 2.15269938 0.30870412 1.6985124 0.19946152 3 Mw stabw 613.08 113.292889 1667.68571 235.087767 1282.09786 208.880734 2.74223025 0.18031879 2.10156267 0.13811854 4 nicht auswertbar Tabelle 18: Mittelwerte und Standardabweichung der mittleren Kleinhirnaktivität und der mittleren und maximalen PET-Aktivität der Striata der männlichen tgHD-Ratten an den Messzeitpunkten 1-4 :. Die Messzeitpunkte 1, 2, 3 und 4 entsprechen einem Alter der Tiere von 5, 10, 15 und 20 Monaten. 96 weiblích weiblich männlich männlich wildtyp transgen wildtyp transgen Messzeitpunkt Accelerod Accelerod Accelerod Accelerod 3 190 190 120 3 300 110 250 150 3 280 250 250 180 3 220 280 160 200 3 165 120 210 3 245 200 120 130 3 300 195 160 3 210 300 240 100 3 270 200 100 240 3 275 130 180 4 200 4 270 130 100 4 300 4 300 140 150 4 125 200 220 4 200 4 290 4 220 125 4 290 160 4 220 Tabelle 19: Accelerod-Laufzeiten an den Messzeitpunkten 3-4: Die Messzeitpunkte 3 und 4 entsprechen einem Alter der Tiere von 15 und 21 Monaten. weiblich wildtyp Messzeitpunkt 3 mw stabw 4 mw stabw weiblich transgen männlich wildtyp männlich transgen 245.5 206.875 186 160 47.2258169 68.7094036 52.5357021 49.3288286 232.142857 193.125 185 60.8178389 69.1239828 49.4974747 Tabelle 20: Mittelwerte und Standardabweichung der Accelerod-Laufzeiten an den Messzeitpunkten 1-4 : Die Messzeitpunkte 1, 2, 3 und 4 entsprechen einem Alter der Tiere von 5, 10, 15 und 20 Monaten. Zum Zeitpunkt 4 war die Gruppe der männlichen tgHD-Ratten nicht mehr auswertbar.
