Immunphänotypisierung von Neutrophilen Granulozyten und NK

Universitätsklinikum Ulm, Klinik für Anästhesiologie
Prof. Dr. med. Dr. med. h.c. Michael Georgieff
Sektion Experimentelle Anästhesie
Prof. Dr. rer. nat. Marion Schneider
Immunphänotypisierung von
Neutrophilen Granulozyten und NK-Zellen
bei Sepsis-, HLH- und Tumorpatienten
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Zahnmedizin
der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm
eingereicht von
Stephanie Möhrle
aus
Bad Saulgau
2010
Amtierender Dekan:
Prof. Dr. rer. nat. Thomas Wirth
Erster Berichterstatter:
Prof. Dr. rer. nat. Marion Schneider
Zweiter Berichterstatter:
Prof. Dr. med. Jürgen Steinacker
Tag der Promotion:
13.01.2011
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis.......................................................................................III
1 EINLEITUNG....................................................................................................1 1.1 Die angeborene ≡ unspezifische Immunabwehr................................................................................. 1 1.2 Zellen der angeborenen Immunabwehr ................................................................................................ 1 1.2.1 Neutrophile Granulozyten (Polymorphonuclear leukocytes; PMN)........................................................................... 1 1.2.2 Natürliche Killerzellen (NK-Zellen).......................................................................................................................... 2 1.2.3 NK-T-Zellen .................................................................................................................................................................... 3 1.3 Zelloberflächenmerkmale und Immunphänotypisierung ............................................................... 4 1.3.1 Vα24 .................................................................................................................................................................................. 5 1.3.2 CD161 (NKR-P1)........................................................................................................................................................... 5 1.3.3 CD56 (NCAM)................................................................................................................................................................ 6 1.3.4 CD69 (AIM)..................................................................................................................................................................... 6 1.3.5 CD16 (FCGR3)............................................................................................................................................................... 7 1.3.6 CD57 (NK-1)................................................................................................................................................................... 7 1.3.7 TLR..................................................................................................................................................................................... 8 1.3.8 CD39 (NTPDase-1) ....................................................................................................................................................... 9 1.3.9 CD64 (IGFR1) ................................................................................................................................................................ 9 1.3.10 IL-7R............................................................................................................................................................................. 10 1.3.11 IL-17R .......................................................................................................................................................................... 10 1.3.12 CD3............................................................................................................................................................................... 11 1.3.13 HLA-DR ...................................................................................................................................................................... 12 1.3.14 CD244 (Cytotox/NK-Rezeptor 2B4).................................................................................................................. 12 1.4 Unkontrollierte systemische Inflammation: SIRS/Sepsis/septischer Schock/MODS ..........12 1.4.1 Aktuelle Kriterien ........................................................................................................................................................ 14 1.5 HLH -­ Folgen überschießender Aktivierung des Immunsystems................................................14 1.6 Tumoren .........................................................................................................................................................16 1.7 Fragestellung.................................................................................................................................................18 2 MATERIAL UND METHODEN .....................................................................19 2.1 Patientenkollektiv .......................................................................................................................................19 2.1.1 Gruppeneinteilung....................................................................................................................................................... 19 2.2 Materialien und Geräte ..............................................................................................................................21 2.3 Typisierung: Vorbereitung und Arbeitsablauf ..................................................................................22 2.4 Messung im FACS-­Gerät .............................................................................................................................22 2.4.1 Methodische Grundlagen / Prinzip........................................................................................................................ 22 2.5 Analyse und Darstellung ...........................................................................................................................24 2.6 Statistik ...........................................................................................................................................................24 2.6.1 Ausreißerbewertung: Grubb’s Ausreißertest .......................................................................................................... 24 2.6.2 Kruskal-Wallis-Test..................................................................................................................................................... 25 2.6.3 Dunn’s post test ................................................................................................................................................................ 26 I 2.7 Software ..........................................................................................................................................................27 3 ERGEBNISSE ..................................................................................................28 3.1 Grubb’s Ausreißerbewertung ..................................................................................................................28 3.2 Kruskal-­Wallis-­Analyse mit Dunn’s Multiple Comparison-­Test ..................................................28 3.2.1 Ergebnisse für Granulozyten................................................................................................................................... 29 3.2.2 Ergebnisse für NK-Zellen......................................................................................................................................... 51 3.3 Zusammenfassung der Ergebnisse ........................................................................................................71 4 DISKUSSION ...................................................................................................73 4.1 Methodische Aspekte..................................................................................................................................73 4.1.1 Statistik............................................................................................................................................................................ 73 4.1.2 Überlegungen zur experimentellen Methodik...................................................................................................... 74 4.2 Inhaltliche Aspekte/Diskussion der Ergebnisse...............................................................................75 4.2.1 Beeinflussung der Immunantwort durch Oberflächenmarker ........................................................................ 75 4.2.2 Zusätzliche Fragestellung .......................................................................................................................................... 93 4.3 Schlussfolgerung und Ausblick ...............................................................................................................94 5 ZUSAMMENFASSUNG ...................................................................................96 6 LITERATURVERZEICHNIS ..........................................................................98 Anhang......................................................................................................................................106 Danksagung.............................................................................................................................107 II Abkürzungsverzeichnis
ADCC
Ab-dependent Cellular Cytotoxicity
ADP
Adenosindiphosphat
AIM
Activation Inducer Molecule
AMP
Adenosinmonophosphat
APC
Antigen-präsentierende Zelle
ATP
Adenosintriphosphat
CA
Karzinom
CARS
Compensatory Anti-inflammatory Response Syndrome
CD
Cluster of Differentiation
CMV
Cytomegalievirus
DC
Dendritische Zelle
EBV
Epstein-Barr-Virus
EDTA
Äthylendiamintetraessigsäure
FACS
Fluorescence Activated Cell Sorting
FCS
Fetales Kälberserum
FGFR
Fibroblast Growth Factor Receptor
FITC
Fluoresceinisothiocyanat
FSC
Vorwärtsstreuung
G-CSF
Granulocyte-Colony Stimulating Factor
GM-CSF
Granulocyte-Makrophage-Colony Stimulating Factor
HLA
Human Leukocyte Antigen
HLDA
Human-Leukocyte-Differentiation-Antigen
HLH
Hämophagozytische Lymphohistiozytose
IFN
Interferon
Ig
Immunglobulin
IL
Interleukin
IRAK
Interleukin-1 Receptor Associated Kinase
ITAM
Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif
JAK
Janus-Kinasen
KIR
Killer cell Immunoglobulin-like Receptors
LPS
Lipopolysaccharide
M-CSF
Makrophage Colony-Stimulating-Factor
MAPK
Mitogen Activated Protein Kinase
MAS
Macrophage Activation Syndrome
III MDSC
Myeloid-Derived Suppressor Cells
MHC
Haupthistokompatibilitätskomplex
MODS
Multiple Organ Dysfunction Syndrome
mRNA
Boten-Ribonukleinsäure
MyD88
Myeloid Differentiation factor 88
NCAM
Neural Cell Adhesion Molecule
NF-κB
Nuclear Factor of kappa light chain gene enhancer in B-cells
NK-T-Zellen
Natürliche Killer T-Zellen
NK-Zellen
Natürliche Killerzellen
NTDPase-1
ecto-Nucleoside Triphosphate Diphosphohydrolase
P(2X/Y)-Rezeptoren
purinergische Rezeptoren
p53
ein Tumorsuppressorgen
PAMP
Pathogen Associated Molecular Patterns
PE
Phycoerythrin
PMN
Polymorphkernige neutrophile Granulozyten
pNK
periphere NK-Zellen
PRR
Pattern Recognition Receptor
Ras
ein Proto-Onkogen
SEF
Similar Expression to FGF-Receptor
SIRS
Systemic Inflammatory Response Syndrome
SSC
Seitwärtsstreuung
STAT
Signal Transducers and Activators of Transcription
TCR
T-Zell-Antigenrezeptor
TH1
T-Helfer 1 Zelle
TH2
T-Helfer 2 Zelle
TIR
Toll/Interleukin-1-Receptor
TLR
Toll-like-Rezeptor
TNF
Tumornekrosefaktor
Tollip
Toll-interacting-protein
TRIF
Toll/IL-1 Receptor (TIR)-domain-containing adaptor Inducing IFN-b
TSLP
Thymic Stromal-Derived Lymphopoietin
IV Einleitung
1
1
Einleitung
1.1
Die angeborene ≡ unspezifische Immunabwehr
Als biologisches Abwehrsystem dient die Immunabwehr zum Schutz vor diversen
externen
schädlichen
Einflüssen
sowie
auch
vor
internen
pathologischen
Veränderungen.
Die komplexe Immunreaktion des menschlichen Körpers setzt sich dabei aus zwei
Hauptkomponenten zusammen: Der angeborenen oder unspezifischen Immunabwehr
und der adaptiven oder spezifischen Abwehr.
Gelingt es nun Pathogenen, die mechanischen bzw. physiologischen Barrieren
(Epithelien,
pH-Wert
etc.)
zu
durchdringen,
so
greift
zunächst
das
angeborene/unspezifische Abwehrsystem: Makrophagen, Natürliche Killerzellen und
Neutrophile Granulozyten u.a. können dabei mittels spezieller Rezeptoren zwischen
körpereigenen Substanzen (“Selbst”) und Fremdkörpern (“Nicht-Selbst”, z.B. Zellen
ohne MHC = Haupthistokompatibilitätskomplex, Bakterien, Viren etc.) unterscheiden
und im Fremdkörper-Fall eine Abwehrreaktion beginnen bzw. einleiten. Überdies weiß
man mittlerweile, dass nicht nur Fremdkörper dazu in der Lage sind, eine
Immunantwort auszulösen, sondern auch körpereigene Proteine und Strukturen wie
z.B. intrazelluläre Antigene aus verletzten oder nekrotischen Zellen und Geweben:
Wird Gewebeverletzung im Sinne von Gefahr für den Organismus erkannt, kommt es
zur Immunantwort (Matzinger, 2002).
1.2
Zellen der angeborenen Immunabwehr
In dieser Arbeit gilt der Fokus den Zellen des angeborenen/unspezifischen
Immunsystems, speziell den Neutrophilen Granulozyten und NK-Zellen mit ihren
spezifischen Oberflächenrezeptoren.
1.2.1
Neutrophile Granulozyten (Polymorphonuclear leukocytes; PMN)
Neutrophile Granulozyten entwickeln sich über die Myelopoese und machen ca. 90%
der Granulozyten aus (mit ca. 60%igem Anteil an den Leykozyten).
Nach der „Fremdkörper“-Phagozytose schütten Makrophagen Zytokine (wie IL-1 und
TNF) aus, welche für die Produktion von Chemokinen und so im weiteren Verlauf
Einleitung
2
zum Einen für die Modulation der Granulopoiese (Greulich, 2004) und zum Anderen
auch für die verstärkte Selectin- und die nachfolgend stabile Integrin-vermittelte
Adhäsion von PMN an die Gefäß-Endothel-Oberfläche verantwortlich sind. PMN
durchdringen
dann
das
Endothelium
und
wandern
entlang
dem
Konzentrationsgradienten der lokalen Chemokine zum Infektionsort, wo es zur
Akkumulation kommt. Nach der Identifizierung der Fremdkörper z.B. über Toll-likeRezeptoren (TLR) erfolgt deren Phagozytose oder Bindung, um eine weitere
Ausbreitung der Fremdkörper zu verhindern. PMN machen somit eine der
Hauptkomponenten einer Entzündung aus: Die Stimulation über TLR führt im
weiteren Verlauf zur Aktivierung von T-Helfer-1-Zellen (TH1), welche wiederum
weitere pro-inflammatorische Zytokine wie TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8 etc. freisetzen (=
pro-inflammatorische „TH1-Antwort“). Normalerweise überleben PMN ca. 1-2 Tage.
Apoptosevorgänge der PMN können dabei via Fas-Bindung oder TNF-α eingeleitet
werden. Interessanterweise reagieren PMN im peripheren Blut mit verzögerter
Apoptose (im Zusammenhang mit NF-κB-Aktivierung und verminderter Caspase-3/9Akivität), ganz im Gegensatz zu erhöhten Apoptoseraten bei Lymphozyten (Wesche u.
a., 2005).
1.2.2
Natürliche Killerzellen (NK-Zellen)
Als Angehörige der Lymphozyten entwickeln sich die NK-Zellen aus lymphatischen
Vorläuferzellen im Knochenmark, um später im Blutkreislauf zu zirkulieren und die
Verteidigung des Körpers gegen virusinfizierte oder auch maligne körpereigene Zellen
aufzunehmen. Ihr Anteil beläuft sich dabei auf ca. 15% der zirkulierenden
Lymphozyten (Robertson und Ritz, 1990). Mittels spezieller Rezeptoren (u.a. „killer cell
immunoglobulin-like receptors“ – kurz: KIR; erkennen HLA-A, -B, -C) erfolgt die
Differenzierung zwischen normalen, körpereigenen Zellen (exprimieren MHC-IMoleküle auf ihrer Zelloberfläche) und Fremdkörperbefallenen Zellen bzw.
Tumorzellen: NK-Zellen werden dabei durch bei infizierten Zellen fehlende MHC-IKomplexe aktiviert. Nach enger Bindung an die Zielzelle, welche mittels eines CLectin-artigen
Rezeptorproteins
der
Killerzelle
und
bestimmter
Kohlenhydratstrukturen auf Seiten der schadhaften Zelle erfolgt, leiten sie die
Apoptose der Zielzellen ein. Aufgrund ihrer schnell einsetzenden Zytokinproduktion
Einleitung
3
und der Fähigkeit, Zielzellen ohne vorhergehende Sensibilisierung zu lysieren, werden
somit auch Zellen eliminiert, die den zytotoxischen T-Lymphozyten, welche infizierte
Zellen und Tumorzellen, die Antigene im Komplex mit MHC-I-Molekülen
präsentieren, entgehen (Bryceson und Long, 2008a).
Humane NK-Zellen wurden bislang entsprechend ihrer CD56-Oberflächenexpression
(der T-Zell-Marker CD3 fehlt typischerweise) in zwei Gruppen mit unterschiedlichen
phänotypischen Eigenschaften unterteilt: CD56bright und CD56dim (Cooper u. a., 2001).
Die in der Regel quantitativ am meisten vertretene CD56dim-Untergruppe (kaum
CD56-Oberflächenexpression; ∼90% der humanen NK-Zellen) exprimiert im
Vergleich zur CD56bright-Untergruppe große Mengen an Ig-ähnlichen NK-Rezeptoren
und FCγ-III-Rezeptoren (CD16) und macht primär den zytotoxischen NK-Zell-Anteil
aus.
Die CD56bright-Untergruppe hingegen, welche natürlicherweise weniger Zytotoxizität
aufweist (kaum bzw. keine KIR) und in der Regel CD16dim/- ist, produziert auf
Monozytenaktivierung hin massenhaft Zytokine wie IFN-γ, TNF-β, IL-10, IL-13
sowie GM-CSF (granulocyte–macrophage colony-stimulating factor) und wirkt damit eher
immunmodulatorisch.
Die NK-Zell-Aktivität kann dabei durch Zytokine (IL-12, IL-15, IL-18) oder
Interferone (IFN-α/β; von Makrophagen sezerniert) gesteigert werden: Daraus
resultiert wiederum eine erhöhte Produktion von IFN-γ (abermals Makrophagenaktivierend) (Cooper u. a., 2001; Chini und Leibson, 2001; Bryceson und Long, 2008b).
1.2.3
NK-T-Zellen
NK-T-Zellen (eine T-Zell-Untergruppe) exprimieren neben einem T-Zell-Rezeptor
auch einen für NK-Zellen typischen Oberflächenmarker und vereinen somit Merkmale
des adaptiven und des angeborenen Immunsystems: Sie werden nicht durch klassische
MHC-Komplexe aktiviert, sondern erkennen MHC-I-ähnliche CD1d-Moleküle und
müssen nicht zwangsläufig CD8 oder CD4 tragen; die Ausbildung von
Gedächtniszellen im Verlauf der ausgelösten Immunreaktion bleibt aus, und sie
schütten nach Aktivierung große Mengen an TH1-/TH2-Zytokinen wie IFN-γ, IL-4
(anti-inflammatorisch; stimuliert B-Zell-Aktivierung und Antikörper-Produktion) und
IL-10 (anti-inflammatorisch; hemmt Makrophagen-Funktion) aus.
Einleitung
4
Der Hauptteil der NK-T-Zellen exprimiert eine gleichbleibende T-Zell-Rezeptor
(TCR)-α-Kettenanordnung (Vα24Jα18) und gehört zu den Typ-I-NK-T-Zellen. Alle
übrigen NK-T-Zellen gehören dem auf CD1d-beschränkten Typ-II an (ohne TCR-αKetten). Eine funktionelle Differenzierung von NK-T-Zellen kann im weiteren Sinne
auch über CD4 vorgenommen werden: CD4+ NK-T-Zellen produzieren sowohl TH1als auch TH2-Zytokine (IFN-γ, TNF, IL-4, IL-10, IL-13...etc.), wohingegen CD4- NKT-Zellen
vorwiegend
nur
TH1-Zytokine
(IFN-γ,
TNF)
produzieren.
Interessanterweise konnte man darüber hinaus auch eine verstärkte rasche IL-17Produktion (pro-inflammatorisch) bei CD4- NK-T-Zellen beobachten.
Hinsichtlich der Anti-Tumor-Antwort konnte bislang herausgefunden werden, dass
Typ-I-NK-T-Zellen eine protektive Rolle spielen, während Typ-II-NK-T-Zellen eine
unterdrückende Rolle in der tumorspezifischen Immunantwort innehaben.
Des Weiteren wurde bereits berichtet, dass NK-T-Zell-vermittelte Anti-TumorImmunantwort verstärkt werden könnte, indem MDSC in Tumormodellen inhibiert
werden (Eger u. a., 2006; Coquet u. a., 2008; Renukaradhya u. a., 2008).
1.3
Zelloberflächenmerkmale und Immunphänotypisierung
Wie bereits erläutert, exprimieren die verschiedenen Zellen des Immunsystems diverse
Oberflächenantigene, welche sich via Immunphänotypisierung (Methode zur Analyse
der verschiedenen Expressionsmuster von CD-Molekülen) nachweisen und je nach
Biochemie
oder
Funktion
in
Gruppen
unterscheiden
lassen:
"Unterscheidungsgruppen" = „Cluster of Differentiation“, abgekürzt CD.
Es handelt sich bei diesen CD-Oberflächenmolekülen vorwiegend um TransmembranGlykoproteine, welche zum Teil zelltypabhängig bzw. entwicklungsspezifisch
exprimiert werden und dabei unterschiedliche Funktionen aufweisen, wie z.B.
Rezeptor- oder Signalfunktionen.
Die Entwicklung monoklonaler Antikörper (von einer auf einen einzigen BLymphozyten zurückgehenden Zelllinie produziert) – konzeptioniert von Georges
Köhler, César Milstein und Niels Jerne - machte es schließlich erst möglich, die
Vielzahl von Zelloberflächenantigene menschlicher Zellen zu erkennen bzw. zu
bestimmen und zu klassifizieren: Markierte monoklonale Antikörper binden dabei an
Einleitung
5
ein entsprechendes Antigen der Zelloberfläche und identifizieren auf diese Weise
unterschiedliche zelltypische Oberflächenstrukturen. Die entstandenen Gruppen
werden in der CD-Nomenklatur erfasst, welche durch die Human-LeukocyteDifferentiation-Antigens-(HLDA)-Konferenz ständig aktualisiert und erweitert wird. Bis
zum Jahr 2005 konnten über 300 nachgewiesene Cluster bestimmt und aufgenommen
werden, welche teilweise noch weiter unterteilt werden (wie z.B. CD8a, CD8b) (Zola u.
a., 2005).
Nachfolgend werden die in der vorliegenden Arbeit angewandten und analysierten
Oberflächenmarker kurz vorgestellt:
1.3.1
Vα24
Vα24 wird von NK-T-Zellen mit monomorphem T-Zellrezeptor exprimiert. Dabei
können humane Vα24+-NK-T-Zellen Studien zufolge als Homologe der Vα14+-NKT-Zellen von Mäusen angesehen werden (Takahashi u. a., 2000).
Vα24+-NK-T-Zellen gelten als eine Subpopulation der NKR-P1A-exprimierenden TZellen mit einem unveränderlichen T-Zell-Rezeptor (TCR; Vα24-JαQ) (Nicol u. a.,
2000). Es konnte dabei eine spezifische Aktivierung durch von DC präsentierte
synthetische Glykolipide festgestellt werden (CD1d-abhängig oder CD1d-unabhängig).
Derzeit können drei verschiedene Subpopulationstypen differenziert werden:
Vα24+ doppeltnegative NK-T-Zellen (CD4-CD8-) exprimieren NK-Rezeptoren (wie
z.B. CD16, CD94), CD161 sowie den TCR mit der Vα24-JαQ unveränderlichen TCRα-Kette. Darüber hinaus sind neben Vα24+CD161+CD4+ NK-T-Zellen, welche bis
auf CD161 keine anderen NK-Oberflächenmarker exprimieren, noch Vα24+CD161CD4+ bekannt (Takahashi u. a., 2000).
1.3.2
CD161 (NKR-P1)
CD161 bzw. NK-Rezeptor-Protein1-Moleküle repräsentieren eine Familie von
homodimeren Typ-2-Transmembran-C-Typ-Lectin-like-Rezeptoren (Washington State
University). CD161 wird hauptsächlich von NK-Zellen exprimiert, aber auch von TLymphozyten und Gedächtniszellen. Ihnen gemeinsam ist die Assoziation mit der
Einleitung
6
Tyrosinkinase p56lck: Die zytoplasmatische Domäne des NKR-P1–Rezeptors
interagiert mit p56lck. Dadurch wird die NK-Zytotoxizität induziert.
Nach enger Bindung dieses C-Lectin-artigen NK-Rezeptorproteins an bestimmte
Kohlenhydratstrukturen auf Seiten der schadhaften Zielzelle verursachen NK-Zellen
deren Lyse. Jedoch können nicht alle „fremdartigen“ Zellen so beseitigt werden: Einige
Tumorzellen erweisen sich als resistent gegenüber NK-Zellen, was darauf
zurückgeführt werden kann, dass sie auf ihrer Oberfläche keine Strukturen
präsentieren, die als Liganden für das die Anbindung vermittelnde Rezeptorprotein
NKR-P1 fungieren (Ljutic u. a., 2005).
1.3.3
CD56 (NCAM)
CD56 wurde immunhistologisch bei Thyreozyten entdeckt und wird gemäß der
Washington State University in vergleichsweise hohen Zahlen auf humanen NK-Zellen
exprimiert. Des Weiteren sind sie auch auf einer Untergruppe von CD4+ und CD8+ TZellen im peripheren Blut, auf Nervenzellen im Cerebellum und Kortex sowie an
neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen, aber auch in typischerweise (sehr)
niedriger Anzahl auf Tumorzellen zu finden (Washington State University).
CD56 gehört als ein Typ-I-Transmembran-Glykoprotein der Ig-Supergen-Familie an.
Die extrazelluläre Domäne enthält unter anderem das NCAM-Glykoprotein =
Adhäsionsmolekül, welches im ZNS für die homo- und heterophile Adhäsion
verantwortlich ist. Somit hat es eine signifikante Bedeutung bei der Kontrolle der
neuronalen Entwicklung: Es scheint über Signale einen Neuritenauswuchs via FGFR
(fibroblast growth factor receptor) einzuleiten und sich auf den p59Fyn-Signalweg
auszuwirken (Vargas u. a., 1994).
1.3.4
CD69 (AIM)
Als Mitglied der NK-Zell-Gen-Komplex-Familie der Zelloberfächenrezeptoren
(Marzio u. a., 1999) gehört CD69, unter anderem auch bekannt als AIM (activation
inducer molecule), zu den Typ-2-Transmembran-Glycoproteinen mit einer extrazellulären
C-Typ-Lectin-bindenden Domäne (Arase u. a., 1997). Die Anwesenheit von NF-κBMotiven innerhalb der proximalen Promotor-Region des CD69-Gens trägt wohl zur
durch TNF-α (v.a. von Makrophagen ausgeschüttet) induzierbaren Promotor-Aktivität
Einleitung
7
bei (López-Cabrera u. a., 1995). CD69 wird auf Stimulation durch Zytokine hin
innerhalb von 1 Stunde auf aktivierten Leukozyten exprimiert und stellt somit den
ersten Vertreter der Zelloberflächenrezeptoren nach Aktivierung dar. Bei NK-Zellen
wird die Expression u.a. durch IL-2 (von TH-Zellen gebildet) und IFN-α (von
Leukozyten gebildet; immunstimulierende, vor allem antivirale und antitumorale
Wirkung; JAK-STAT-Signalweg) induziert. Die Stimulation der aktivierten NK-Zellen
mit
anti-CD69-Antikörpern
bewirkt
dabei
zytolytische
Aktivität.
Neben
Thrombozyten, reifen Thymozyten, myeloiden Knochenmarks- und lymphoiden
Vorläuferzellen wird CD69 auch konstitutiv auf einer kleinen Subpopulation von Tund B-Zellen im peripheren Lymphgewebe, auf neutrophilen und auch eosinophilen
Granulozyten exprimiert (Marzio u. a., 1999; Esplugues u. a., 2003).
1.3.5
CD16 (FCGR3)
CD16 wird auf allen FcR-Typ-III+ Zellen exprimiert und ist somit nebst anderen
natürlich auf Granulozyten, aber auch auf NK-Zellen (in der Regel CD56dim) zu
finden. CD16 bindet an Antikörpertragende Zielzellen und induziert Signale über
assoziierte Untereinheiten, welche ein ITAM enthalten, das für die Antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) verantwortlich ist (Cooper u. a., 2001).
Der Hauptteil der CD16+ peripheren NK-Zellen (pNK) exprimiert dabei Mitglieder
der KIR-Familie, wohingegen die meisten CD16- pNK diese nicht exprimieren und
auch wenig Zytotoxizität aufweisen (Keskin u. a., 2007).
Durch CD16 kommt es somit zur Stimulation der T-Zellen und damit zur Phagozytose
opsonierter Bakterien. Darüber hinaus hat CD16 auch Bedeutung für die Einleitung
des Zelltodes.
1.3.6
CD57 (NK-1)
Eine CD57 (= NK-Zellmarker)-Expression findet man bei NK-Zellen, bei T-Zellen
sowie im Nervensystem. Sie erfolgt aber auch bei einigen soliden Tumoren wie z.B. bei
ausdifferenzierten Prostata-Tumoren und Melanomen.
Strukturell handelt es sich bei CD57 um ein Typ-II-Transmembran-Glykoprotein,
welches zur Glycosyltransferase-Gen-Familie gehört. CD57 kann an verschiedene
Einleitung
8
Glykoproteine binden (einschließlich CD56) und hat seine Funktion in der Zell-ZellAdhäsion via Laminin und L-/P-Selectin (Washington State University).
Bekanntermaßen wächst die humane CD57+-T-Zell-Anzahl mit steigendem Alter. Bei
CD57+T-Zellen handelt es sich meistens auch um CD8+ Zellen, welche im Zuge des
Alterungsprozesses immer größere Mengen an IFN-γ produzieren und somit eine
wichtige Rolle beim immunologischen Wandel im Alter spielen: Sie beeinflussen dabei
vor allem das Th1/Th2- Gleichgewicht (Shinomiya u. a., 2005).
1.3.7
TLR
Toll-like-Rezeptoren (TLR) gehören zum angeborenen Immunsystem, genauer gesagt
zur Toll/Interleukin-1-Receptor (TIR)-Familie. Strukturell handelt es sich um
Transmembranproteine mit extrazellulären Leucin-reichen Repeats sowie einer
typischen unabdingbaren intrazellulären TIR-Domäne für die Signaltransduktion
(Martin und Wesche, 2002). TLR sind in der Lage, über die PRR (Pattern Recognition
Receptors) sogenannte PAMP (Pathogen Associated Molecular Patterns = Strukturen, welche
auf oder in Mikroorganismen = Viren, Bakterien und Pilzen vorkommen) zu erkennen.
Im menschlichen Organismus konnten bislang 10 verschiedene TLR identifiziert
werden, wobei einige davon spezifische mikrobielle Produkte wie Lipopolysaccharide
(LPS), bakterielle Lipoproteine, Peptidoglykane und bakterielle DNA erkennen (Lien
und Ingalls, 2002).
Der TLR4-Rezeptor-Komplex im Speziellen benötigt allerdings zusätzliche Moleküle:
Über die intrazelluläre TIR-Domäne kommt es zu Protein-Protein-Interaktionen,
welche wiederum für eine einzigartige Signalkaskade verantwortlich sind. Eine Rolle
spielt im weiteren Verlauf neben MyD88 und der IRAK (interleukin-1 receptor associated
kinase) das für die TIR-Familie spezifische Adaptermolekül Tollip (Toll-interactingprotein), welches an TLR bindet. Im Endeffekt wird so die Genexpression und damit
der Aktivitätszustand der Leukozyten geregelt (Martin u. a., 2002).
Einleitung
9
Tabelle 1: Toll-like-Rezeptoren TLR-2/-4 und die entsprechenden Mikroorganismen, die sie erkennen (Kawai und Akira, 2006, 2)
Toll-likeRezeptor
TLR-2
TLR-4
1.3.8
Mikroorganismus
Strukturelle Komponente
Gram-positive Bakterien
Lipoteichinsäure, Lipopeptide
Cytomegalovirus
Glycoprotein gB und gHL
Leptospirosis interrogans
Atypische Lipopolysaccharide
Porphyromonas gingivalis
Atypische Lipopolysaccharide
Herpes simplex Virus
unbekannt
Varicella zoster Virus
unbekannt
Gram-negative Bakterien
Lipopolysaccharide
Respiratory Syncytial Virus
Fusionprotein
CD39 (NTPDase-1)
Bei CD39 (NTDPase-1 = ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase) handelt es sich um
ein integrales Membranprotein, welches man sowohl auf Endothelzellen als auch bei >
90% der Monozyten, PMN und B-Lymphozyten sowie auf einigen wenigen (∼ 6%) TLymphozyten und NK-Zellen findet (Pulte u. a., 2007).
CD39 hydrolysiert extrazellulär Nukleotide, v.a. ATP und ADP zu AMP und
verhindert so inflammatorische Prozesse sowie (v.a. als „soluble CD39“) die ADPinduzierte Thrombozytenaggregation: Auf Gefäß-Schädigung hin oder z.B. durch LPS
ausgelöst setzen Endothelzellen nämlich ATP und ADP frei, welche P2X- sowie P2YRezeptoren aktivieren, was schließlich zu pro-inflammatorischen, apoptotischen sowie
thrombotischen Veränderungen führt (Atkinson u. a., 2006).
1.3.9
CD64 (IGFR1)
CD64 (der Ig-Supergen-Familie zugehörig) wird konstitutiv exprimiert von
Monozyten, Makrophagen, DC (im Blut und im Follikelzentrum) sowie von frühen
myeloischen Zelllinien. Die Expression auf PMN hängt dabei von IFN-γ ab, welches
zusammen mit G-CSF via STAT1 und STAT3 für eine stark erhöhte Expression von
CD64 bei PMN wie auch bei Monozyten sorgt.
Strukturell handelt es sich um ein Typ-I-Glycoprotein mit einer extrazellulären
Domäne, welche wiederum 3 Ig-like C2-Typ-Domänen aufweist. Es handelt sich bei
Einleitung
10
CD64 also um einen Fc-Rezeptor, der mit hoher Affinität IgG bindet und somit
Rezeptor-vermittelte Phagozytose von IgG-Antigen-Komplexen induziert. Außerdem
dient CD64 der Antigenpräsentation für T-Zellen und löst zudem die Freisetzung von
weiteren Zytokinen und reaktiven O2-Mediatoren einschließlich IL-1, IL-6 und TNFα
aus (Qureshi u. a., 2001).
1.3.10
IL-7R
Der Interleukin-7-Rezeptor gehört zur Hematopoietin-Familie und kommt sowohl als
Membranprotein als auch als löslicher (soluble) IL7-R vor. Expression konnte auf
humanen T-Zelllinien und Makrophagen beobachtet werden, wobei sie während der TZell-Differenzierung und -Aktivierung reguliert wird: Bindet der Ligand an den
Rezeptor, wird die Oberflächen-Expression herunterreguliert. Der heterodimere IL-7R
besitzt eine α-Kette, gekennzeichnet durch CD127-Spezifität, sowie eine γc (common)
-Kette, welche zudem verschiedenen anderen Zytokinen wie IL-2, IL-4, IL-9, IL-15
und IL-21 dient. Die IL-7Rα-Kette stellt auch eine Komponente des hochaffinen
Rezeptors für TSLP (Thymic stromal-derived lymphopoietin) dar und kann neben der
membranständigen Form auch in löslicher Form vorkommen. IL-7 benötigt zur
Signaltransduktion sowohl den α-Anteil als auch den γc-Teil, wobei intrazellulär u.a.
zusätzlich Janus-Kinasen (JAK1, JAK3) sowie STAT-Transkriptionsaktivatoren eine
Rolle spielen (Palmer u. a., 2008). Die Bindung von IL-7 an den IL-7R führt schließlich
zu B-Zell-Differenzierung im Prä-B-Zell-Stadium (Wahn, 2005), T-Zell-Proliferation
sowie Aktivierung und hat anti-apoptotische Wirkung (Beq u. a., 2004): IL-7 ist
entscheidend für das Überleben naiver T-Zellen und trägt so zum selbstregulierten
Zirkulieren von naiven und Gedächtnis-T-Zellen bei (Fry und Mackall, 2005).
1.3.11
IL-17R
Der ursprünglich beschriebene IL-17-Rezeptor (IL-17RA) stellt ein Typ-1Transmembran-Glycoprotein dar. Seine humane mRNA konnte in Epithelzellen,
Fibroblasten, B- und T-Lymphozyten sowie Myelomonozyten gefunden werden. Das
IL-17R-Protein selber kann in T-Lymphozyten im peripheren Blut und in
Gefäßendothelzellen beobachtet werden (Kolls und Lindén, 2004). IL-17RA ist
allgegenwärtig hinsichtlich des mRNA-Levels, wobei die Oberflächenexpression
Einleitung
11
hingegen sehr variiert. Es wurden bislang noch fünf weitere IL-17-Rezeptoren (IL17RB-D und SEF) beschrieben, welche sich von IL-17RA insofern unterscheiden, als
dass sie ein signifikantes alternatives Splicing aufweisen (Kolls u. a., 2004). IL-17Rezeptoren unterscheiden sich hinsichtlich der Aminosäurensequenz von anderen
Zytokin-Rezeptoren. Allerdings wurde eine Ähnlichkeit zur gut erforschten TIRDomäne (Toll/Interleukin1-like) prognostiziert: Die sogenannte „SEFIR“-Domäne (SEF
= “similar expression to FGF receptor”. Dieser Domäne fehlen jedoch wichtige strukturelle
Elemente der TIR-Domäne. Maitra et al. konnten zeigen, dass diese SEFIR-Domäne
IL-17R-Signale vermittelt, unabhängig von den klassischen TIR-Adaptoren, wie z.B.
MyD88 und TRIF (Toll/IL-1 receptor (TIR)-domain-containing adaptor inducing IFN-β).
Bekanntermaßen bewirkt IL-23 eine IL-17-Expression bei einer einzigartigen CD4+TZell-Population, den sogenannten „TH17-Zellen“ (bei Mäusen wird die Entwicklung
von TH17-Zellen durch TGF-β und IL-6 gelenkt): TH17-Zellen produzieren neben
IL-17 auch IL-17F, TNF-α, Il-6, IL-22 und regulieren diverse Aspekte der
Inflammation und Autoimmunität (Maitra u. a., 2007).
1.3.12
CD3
Der CD3-Rezeptor wird als Erkennungsmolekül auf der Oberfläche aller TLymphozyten exprimiert und ist somit auch bei NK-T-Zellen vertreten. An den CD3Proteinkomplex (CD3γ, -δ, -ε und -ζ) ist der heterodimere T-Zell-Antigenrezeptor
(TCR-α/β/γ/δ- Ketten) gebunden, wobei CD3 für die Signaltransduktion, nicht aber
für die Antigen/MHC-Erkennung zuständig ist. Fehlt der CD3-Komplex, so werden
auch keine TCR-Ketten exprimiert.
Der zytoplasmatische Anteil von CD3γ, -δ, und -ε enthält jeweils ein ITAM als
Andockstelle
für
verschiedene
Tyrosinkinasen,
welche
an
der
weiteren
Signaltransduktion durch Phosphorylierung der ITAM direkt mitbeteiligt sind. Die
heterodimeren CD3ζ-Ketten besitzen intrazellulär sogar drei ITAM und können u.a.
mit FcγR-III (CD16) vollständige Ig-Rezeptoren bilden. Schließlich ist CD3ζ auch für
den Transport des T-Zell-Antigenrezeptors an die Zelloberfläche von Bedeutung,
wobei die ζ-Kette erst am Schluss der Komplexbildung mit anderen CD3-Ketten
assoziiert (Arnett u. a., 2004).
Einleitung
12
Nicht zuletzt ist ein Zusammenhang zwischen steigender CD3-Rate und erhöhter
Apoptoserate CD57+-Zellen bekannt (vgl. CD57).
1.3.13
HLA-DR
HLA-DR ist ein glykosyliertes Zelloberflächen-Membranprotein auf APC, welches
konstitutiv von Monozyten exprimiert wird. Die HLA-DR-Expression durch
Monozyten ist essenziell für die Aufbereitung und Präsentation von Peptiden, welche
von phagozytierten Mikroben stammen: Die HLA-DR-Funktion besteht somit darin,
CD4+ Zellen aufbereitete Antigene zu präsentieren. So wird schließlich die spezifische
Immunantwort durch CD4+ T-Zellen initiiert, um die Pathogene zu eliminieren (Perry
u. a., 2004).
1.3.14
CD244 (Cytotox/NK-Rezeptor 2B4)
CD244 wird auf der Oberfläche von ruhenden sowie aktivierten NK-Zellen, auf TZellen (~50% der CD8+), auf einigen CD8+ Thymozyten und auf einem geringen
Anteil CD4+ Zellen, Monozyten und basophilen Granulozyten exprimiert. Der
extrazelluläre Anteil dieses (der Ig-Superfamilie angehörigen) transmembranären IgDomänen-besitzenden Glycoproteins weist einige strukturelle Merkmale auf, aufgrund
derer man es der Ig-CD2-Familie zuordnen kann und welche wahrscheinlich aus einer
Serie von Gen-Duplikationen entstanden sind. CD244 spielt eine Rolle in der nichtMHC-gebundenen zytotoxischen Aktivität von NK-Zellen und agiert als ein
costimulatorischer Ligand sowohl für NK-Zellen als auch für T-Zellen in vitro (Boles
u. a., 1999).
1.4
Unkontrollierte
systemische
Inflammation:
SIRS/Sepsis/septischer
Schock/MODS
Im septischen Formenkreis spielt das Zusammenspiel von Infektion und
Immunantwort die entscheidende Rolle. Das Auftreten einer (egal ob bakteriell, viral,
fungal oder parasitär getriggerten) systemischen Entzündungsantwort wird nach
Aktivierung immunkompetenter Zellen mit einer außergewöhnlichen Anzahl primärer
proinflammatorischer Mediatoren in Zusammenhang gebracht: Bakterien etc. und ihre
Toxine z.B. sind verantwortlich für erhöhte Zytokinlevel (wie TNF, IL-1/6 etc.). Diese
Einleitung
13
primäre Immunantwort wird durch das Freisetzen weiterer sekundärer Mediatoren
zusätzlich intensiviert.
Neben dieser Hyperinflammation treten aber auch anti-inflammatorische Reaktionen
in Erscheinung: Es kommt zu einer veränderten Expression entsprechender
Immunzelloberflächenmarker/Rezeptoren (Marshall, 2001) wie z.B. lösliche TNFRezeptoren, IL-1-Rezeptorantagonisten, IL-4, IL-10; zudem können nun auch eine
gestörte lymphatische Apoptose bzw. Apoptose-Verzögerung bei PMN beobachtet
werden (Fialkow u. a., 2006).
Resultat: Hin- und hergerissen zwischen Hyper- und Hypoinflammation gerät die
Immunabwehr außer Kontrolle.
Früher war man der Annahme, bei der Sepsis handle es sich nur mehr um eine
überschießende, hyperinflammatorische Immunantwort, welche eine oft tödliche
Organschädigung verursachen kann. Heute weiß man, dass die Immunantwort
septischer Patienten in entgegengesetzte Richtungen gehen kann: Während bei dem
einen Patientenanteil hyperinflammatorische Prozesse überwiegen, erscheinen andere
Patienten immunsupprimiert. Es kristallisiert sich also immer mehr heraus, dass eine
Sepsis kein gleichförmiges einheitliches Krankheitsbild darstellt, sondern vielmehr
einen Entwicklungsprozess, in dem ein systemisch-entzündliches Reaktionssyndrom
(systemic
inflammatory
response
syndrome,
SIRS)
auftritt,
gefolgt
von
einer
kompensatorischen anti-inflammatorischen Antwort (compensatory anti-inflammatory
response syndrome, CARS) (Perry u. a., 2003; Muller Kobold u. a., 2000).
Einleitung
1.4.1
Aktuelle Kriterien
SIRS (systemic inflammatory response syndrome)
14
Mortalität 7-17%
Hypo- (<36°C) oder Hyperthermie (>38°C)
Tachykardie (>90 Schläge/min)
Tachypnoe (>20/min) und/oder arterieller CO2-Partialdruck <32mmHg und/oder maschinelle Beatmung
Leukozytose >12.000/µl oder Leukopenie <4.000/µl und/oder Linksverschiebung >10% im Differentialblutbild (unreife).
Sepsis
Mortalität 16%
SIRS plus dokumentierte Infektion und Infektionsort
Schwere Sepsis
Mortalität 20%
Sepsis assoziiert mit infektionsbezogener Organdysfunktion
Septischer Schock
Mortalität 46%
Sepsis assoziiert mit Kreislaufversagen
MODS = Multiple Organ Dysfunction Syndrome
Mortalität >60%
Abbildung 1: Kurzübersicht über die aktuellen Kriterien zur Diagnosestellung beim septischen Formenkreis
1.5
HLH - Folgen überschießender Aktivierung des Immunsystems
Bei der Hämophagozytischen Lymphohistiozytose - abgekürzt HLH (englische
Synonyme: hemophagocytic syndrome (HPS), reactive hemophagocytic sydrome (RHS), macrophage
activation syndrome (MAS) oder lymphohistiocytic syndrome (LHS)) - handelt es sich um eine
seltene, außerordentlich schwer verlaufende Erkrankung des Immunsystems.
Sie kann zum Einen genetischen Ursprungs sein (autosomal rezessive Vererbung,
durch Infektionen getriggert). Man unterscheidet hierbei zwei Untergruppen:
1) FHLH = familiäre HLH, Manifestation bereits im frühen Säuglingsalter;
2) HLH in Verbindung mit Immundefizienz, z.B. beim Chédiak-HigashiSyndrom.
Zum Anderen kann es sich aber auch um eine erworbene Form handeln:
Im Zusammenhang mit Viren (v.a. Viren der Herpes-Gruppe wie EBV, CMV),
Bakterien, Pilzen, Parasiten, malignen Erkrankungen oder Autoimmunerkrankungen
erfolgt eine verstärkte Aktivierung und Vermehrung von Makrophagen und T-Zellen,
Einleitung
15
was wiederum zu dem sog. „Zytokinsturm“ (hohe Mengen an IFN-γ, TNF-α, sCD25,
IL-1, IL-6 sowie IL-18) und somit zu einer überschießenden Immunreaktion führt.
Pathophysiologisch ist die Phagozytose von Blutzellen und deren Vorläufer dabei das
Markenzeichen des Hämophagozytotischen Syndroms. Sie erfolgt laut D.N. Fisman
meist durch Makrophagen und Monozyten, wobei speziell Milzmakrophagen von
HLH-Patienten einen aktivierten Phänotyp aufzeigen mit erhöhter Expression von
MHC-I/II-Molekülen und M-CSF-Rezeptoren (Janka, 2007; Fisman; Créput u. a.,
2008).
HLH repräsentiert einen hyperinflammatorischen Zustand mit einer verstärkten
Lymphohistiozyten-Aktivierung und deren Organinfiltration – verbunden mit
folgenden klinischen Kardinalsymptomen: Anhaltendes Fieber (>38°C oder <36°C),
Hepatosplenomegalie,
Panzytopenie
(Schwäche
und
Blässe,
erhöhte
Infektionsanfälligkeit und Blutungsneigung), Lymphadenopathie, Hautausschläge und
neurologische Symptome wie Lähmungserscheinungen und Anfälle. Eine wichtige
Untersuchung betrifft die Funktion der NK-Zellen, die bei den Patienten vermindert
ist bzw. im Laufe der Erkrankung fehlt (hauptsächlich bei der erworbenen Form)
(Allen u. a., 2008; Janka, 2007; Fisman; Créput u. a., 2008).
Einleitung
16
Abbildung 2: Immunpathologische Mechanismen bei HLH (Hämophagozytischen Lymphohistiozytose): klinische Effekte der
TH1-Aktivierungsschleife und der Zytokinproduktion. Die Aktivierung von CD-8-T-Lymphozyten resultiert in einer klonalen
Proliferation und Aktivierung von NK-Zellen, verbunden mit erhöhter Produktion aktivierender Zytokine: TNF-α sowie andere
Zytokine verursachen Fieber und systemische Krankheitserscheinungen. TNF-α- und INF-γ-Produktion tragen zur
Makrophagen-Aktivierung mit daraus resultierender Hämophagozytose bei. „TNF-α = tumor necrosis factor alpha; IFN-γ =
interferon-gamma; IL1-β = interleukin-1 beta; IL-2 = interleukin-2; IL-6 = interleukin-6; IL-8 = interleukin-8; IL-12 =
interleukin-12; sCD-8 = soluble cluster of differentiation 8; NK cell = natural killer cell“; Quelle: (Créput u. a., 2008) (mit
freundlicher Genehmigung durch Prof. Elie Azoulay)
1.6
Tumoren
Laut dem Deutschen Krebsforschungszentrum ist Krebs mit über 450.000
Neuerkrankungen und 270.000 Todesfällen pro Jahr eine der meist gefürchteten
Krankheiten und die zweithäufigste Todesursache in Deutschland. Jedes Organ kann
befallen sein, wobei die zugrunde liegenden Veränderungen in den betroffenen Zellen
höchst komplex sind. In Deutschland treten Krebserkrankungen gehäuft in Organen
wie Brustdrüse (Frauen), Prostata (Männer), Lunge und Dickdarm auf.
Bei Krebszellen sind im Vergleich zu gesunden Zellen Vorgänge in den Bereichen
Wachstum, Teilung, Differenzierung und Apoptose im Zellverband gestört. Aufgrund
von Gendeletionen bzw. Mutationen entstehen durch die Inaktivierung von
Tumorsupressorgenen (z.B. p53: Spielt eine zentrale Rolle bei der Expression von
Einleitung
17
Genen, die an der Regulierung der Apoptose und der DNA-Reparatur beteiligt sind)
und die Aktivierung sog. Onkogene (entwickeln sich aus normalen Genen =
Protoonkogenen wie z.B. Ras oder Cyclin D welche normale Zellvorgänge
kontrollieren und steuern) Tumorzellen. Onkogene als Teile des normalen Erbgutes
einer Zelle triggern dabei den Übergang vom normalen Zellwachstumsverhalten zum
ungebremsten infiltrierenden Tumorwachstum - regulierende Signale werden nicht
mehr erkannt oder nicht ausgeführt.
Eine wichtige negative Eigenschaft von Tumorzellen ist dabei die fehlende Apoptose,
was häufig auf Störungen im Bereich des Fas-Rezeptors (keine Auslösung der
Signalkaskade für die Apoptose) beziehungsweise des Fas-Proteins (intrazelluläre
Signalübertragung, die zur Aktivierung der Caspase führt, bleibt aus) zurückzuführen
ist. Außerdem kommt es im Laufe der Zellteilung zur Entdifferenzierung bei
Tumorzellen (Strukturveränderungen, Funktionsverlust).
Tumorzellen sind oft durch verschiedene schwerwiegende Phänotypen charakterisiert,
welche
dem
Antigenprozess
Immunsystem
durch
Veränderungen
(MHC-I-Antigenpräsentation
im
reguliert
MHC-I-abhängigen
neben
der
T-
Lymphozytenantwort auch die NK-Zell-Funktion) entkommen können (Fishman u. a.,
2004; Garcia-Lora u. a., 2003).
Einleitung
1.7
18
Fragestellung
Aus der vorangegangenen Beleuchtung bzw. Thematisierung des Immunsystems haben
sich folgende zu bearbeitende Fragestellungen für die vorliegende Arbeit ergeben:
1. Gibt es Hinweise auf Immunsuppression durch spezifische Oberflächenrezeptoren
bei HLH-, Sepsis- sowie Tumor-Patienten (im Endstadium)?
2. Welche Rolle spielen NK-(T-)Zellen sowie PMN?
Zur Bearbeitung dieser Fragen wurden der Experimentellen Anästhesiologie
eingesandte Blutproben von 51 Patienten, welche Diagnose-entsprechend einer der
vier Testgruppen („Panel“, „HLH“, „Sepsis“, „Tumor“) zugeordnet werden konnten,
einer Immunphänotypisierung unterzogen und analysiert.
19 Material und Methoden
2
Material und Methoden
2.1
Patientenkollektiv
Für die vorliegende Arbeit wurden Blutproben von 51 Patienten bearbeitet und
untersucht, die der Abteilung der Experimentellen Anästhesie Ulm von verschiedenen
Kliniken/Behandlern zugesandt wurden.
2.1.1
Gruppeneinteilung
Die Einteilung der Daten der 51 untersuchten Patienten erfolgte anhand der uns
zusammen mit den Blutproben übermittelten Diagnosen:
Die Patienten wurden entsprechend ihrer Diagnose einer der vier Gruppen „Panel“
(=gesund), „HLH“, „Sepsis“ und „Tumor“ zugeteilt:
Tabelle 2 : Gruppeneinteilung der gemessenen Blutproben entsprechend der Haupt-Diagnosen: Patientengruppe mit Angabe der
Probenanzahl - Panel (= gesund), Sepsis (= septischer Formenkreis), HLH (=Hämophagozytische Lymphohistiozytose), Tumor
- unter Angabe der Patientennummern (Pat.nr.), des Geschlechts (m = männlich, w = weiblich), des Patientenalters (Alter in
Jahren) und der Diagnose. (SIRS = systemic inflammatory response syndrom, MAS = Macrophage Activation Syndrome)
Patientengruppe
(Anzahl)
Pat.nr.
Geschlecht
Alter
Diagnose
9686
9687
9782
10083
10084
10119
10120
10121
10213
10341
10342
m
w
w
m
w
w
m
w
m
m
w
28
29
26
61
58
29
28
26
28
26
55
gesund
gesund
gesund
gesund
gesund
gesund
gesund
gesund
gesund
gesund
gesund
9691
9696
9699
9719
9720
9734
9751
9785
9793
9794
9795
9867
9867
m
m
w
w
m
m
w
m
m
w
m
m
m
63
63
53
78
46
19
95
46
47
74
67
38
38
Sepsis
Sepsis
Sepsis
septischer Schock
septischer Schock
SIRS-Schock
SIRS-Schock
Sepsis
Sepsis
Sepsis
Sepsis
Sepsis
Sepsis
Panel (11)
Sepsis (15)
Material und Methoden
20
9877
9877
m
m
38
38
Sepsis
Sepsis
9569
9612
9643
9646
9688
9690
9728
9738
9893
w
w
w
w
m
w
w
w
w
45
4
2
58
60
44
1
44
44
HLH-MAS
HLH
HLH
HLH-MAS
HLH-MAS
MAS
HLH-MAS
MAS
MAS
9506
9507
9508
9509
9520
9521
9539
9556
9559
9560
9589
9616
9629
9630
9645
9647
w
m
w
m
w
m
w
m
m
w
w
w
w
w
w
m
37
57
57
58
50
45
60
50
74
60
66
63
42
1
42
60
Glioblastom
Prostata-Karzinom
Malignes Melanom
Mamma-Karzinom
Mamma-Karzinom
Metastasierendes Melanom
MAS bei Gallengang-Karzinom
MAS Glioblastom
MAS bei Prostata-Karzinom
MAS bei Gallengang-Karzinom
MAS bei Mamma-Karzinom
HLH/MAS bei Thymus-Karzinom
Lungen-Karzinom
HLH/MAS bei Thymus-Karzinom
Lungen-Karzinom
Nieren-Karzinom
HLH (9)
CA (16)
Material und Methoden
2.2
21
Materialien und Geräte
Für die Untersuchungen wurden folgende Geräte und Substanzen verwendet:
-
EDTA-Röhrchen: S-Monovetten (66x11mm, 2,7ml; Firma Sarstedt, Nümbrecht),
Inhalt: 1,6mg EDTA/ml Blut
-
Polystyrene-Round-Bottom-Tubes (12x75mm, 5ml; Firma BD Biosciences)
-
Antikörper:
Tabelle 3: Getestete Antikörper mit Anbieter (Ig = Immunglobulin, CD = Cluster of Differentiation, TLR = Toll-like-Rezeptoren,
FITC = Fluoresceinisothiocyanat , PE = Phycoerythrin)
Antikörper
Anbieter
1.
Mouse IgG1 FITC/
Mouse IgG2a PE
BD
2.
CD57 FITC (IgM)
BD
3.
CD69 PE
BD
4.
CD3 FITC (IgG1)
Beckman Coulter
5.
CD 244 PE (IgG1 K–mouse)
Beckman Coulter
6.
CD16 FITC
Invitrogen
7.
CD39 FITC (1:10)
Serotech
8.
CD64 FITC (IgG1)
Beckman Coulter
9.
CD56 FITC
BD
10. CD161 PE
BDPharMingen
11. Anti-HLA-DR FITC (IgG2a
BD
12. Vα24 PE
Beckman Coulter
13. TLR 2 FITC
eBioscience
14. TLR 4 PE (CD284)
AbD Serotec
15. IL 17R FITC
R&D Systems
16. IL 7R PE
R&D Systems
- Vortex-Genie 2 (Scientific Industries)
- GS-6R Centrifuge (Beckman Coulter)
- FACS Lysing Solution (1:10; Firma BD Biosciences)
- Isotonische Phosphat-gepufferte Salzlösung: DPBS (ohne CaCl2/MgCl2; Firma
GIBCO/invitrogen)
- CellFIX (1:10 mit dest. H2O; Firma BD Biosciences)
- FACS-Calibur (Firma BD Biosciences)
Material und Methoden
- Software: Cellquest pro®
2.3
22
Typisierung: Vorbereitung und Arbeitsablauf
Das abgenommene Patientenblut wurde in EDTA-Röhrchen (EDTA als Calciumpuffer dient
der Antikoagulation von Blutproben) bei Kühlschranktemperaturen aufbewahrt.
Nach der Plasmaabnahme wurden die zu messenden EDTA-Blutproben mit FCS aufgefüllt
und zunächst gut durchmischt.
Zur eigentlichen Typisierung wurden jeweils 50µl Patientenblut in beschriftete PolystyreneRöhrchen (auf Eis gestellt) pipettiert und anschließend mit jeweils 3µl der verschiedenen mit
FITC oder PE markierten monoklonalen Antikörper versetzt (die Markierung mit FITC ist
insofern vorteilhaft, da FITC ein definiertes schmales Fluoreszenzspektrum aufweist, was eine
Mehrfarben-Fluoreszenzanalyse durch gleichzeitige Markierung mit z.B. Phycoerythrinmarkierten (PE) Antikörpern zulässt).
Nach einer 25-minütigen Inkubationszeit auf Eis und unter Ausschluss von Licht wurden
durch Zugabe von 2,5 ml FACS Lysing Solution über die Dauer von 12 Minuten die Zellen
fixiert und gleichzeitig die Erythrozyten lysiert.
Im Folgeschritt wurden die Proben 5 Minuten bei 980 RPM und 10°C zentrifugiert.
Anschließend erfolgte eine 2-malige Resuspendierung mit PBS (isotonische Phosphatgepufferte Salzlösung).
Im letzten Schritt wurde den Proben Cell Fix®, welches zur Fixierung von Leukozyten nach
Anfärbung dient, hinzupipettiert.
2.4
Messung im FACS-Gerät
2.4.1
Methodische Grundlagen / Prinzip
Die Durchflusszytometrie (Akronym: FACS = fluorescence activated cell sorting) dient zur
fluoreszenzaktivierten Zellanalyse von mit Antikörpern "angefärbten" Zellen in Suspension,
basierend auf einer Antigen-Antikörper-Reaktion.
Mithilfe dieses optischen Messverfahrens ist es möglich, 10000 Zellen in nur wenigen
Sekunden bis Minuten zu analysieren, indem die Zellen aus der Zellsuspension aufgesaugt und
anschließend durch die Flusskammer in einer Hüllflüssigkeit einzeln an einer Lichtquelle (=
Laserstrahlen) vorbeigeleitet werden.
Zum Einsatz kam ein FACSCalibur von BD, welches mit einem Argonlaser (488 nm) und
einem roten Diodenlaser (635 nm) ausgestattet ist. Die Laserstrahlen treffen dabei im 90°Winkel auf die vorbeiströmenden Zellen bzw. Partikel und unterliegen somit einer Streuung,
Material und Methoden
23
welche mittels Sammellinsen gebündelt und weiter zu Foto-Detektoren und -Multipliern
gelenkt wird.
Je nach Größe ( Vorwärtsstreuung/FSC), Binnenstruktur (Granularität, Zellkern-Größe 
Seitwärtsstreuung/SSC) und Fluoreszenz-Markierung (FITC/PE) erfolgt nun nach Detektion
und
Digitalisierung
die
Identifizierung
bzw.
Charakterisierung
der
verschiedenen
Zellpopulationen.
Die Möglichkeit der zeitgleichen Verwendung mehrerer Fluoreszenzfarbstoffe bei der
Mehrfarbendurchflusszytometrie
Absorptionsspektren.
basiert
Fluorescein
auf
bzw.
unterschiedlichen
der
verwandte
Emissions-
und
Reaktivfarbstoff
Fluoresceinisothiocyanat (FITC) hat sein Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von
496 nm. Im Vergleich zu diesem schmalen Spektrum hat Phycoerythrin (PE) das
Absorptionsmaxima bei 496 nm, 529–534 nm und bei 555 nm Wellenlänge.
SSC
FITC
Bandpass-Filter
PE
Halbspiegel
Fluoreszenz-Sammellinse
Fokussierungslinse
blauer Laser
408nm
FSC (Diode)
Flusskammer
roter Diodenlaser
633nm
Abbildung 3: Schematische Darstellung des Strahlenganges eines FACS (fluorescence activated cell sorting)-Gerätes. (FITC =
Fluoresceinisothiocyanat , PE = Phycoerythrin , SSC = Seitwärtsstreuung, FSC = Vorwärtsstreuung)
Material und Methoden
2.5
Analyse und Darstellung
24
Das Computerprogramm Cellquest pro® ermöglicht statistische Auswertungen.
Durch Gaten = Setzen von sogenannten „Regions of interest“ kann der Anteil positiver
Zellen gegenüber der Gesamtzahl eingegrenzt und somit genauer ausgewertet werden. Die
Darstellung der Ergebnisse erfolgt in Form von Streudiagrammen (= zweidimensionale
Erweiterung eines Histogramms).
2.6
Statistik
Im Folgenden werden die in dieser Arbeit angewandten statistischen Verfahren
beschrieben (zur Begründung bzw. Diskussion dieser Methoden mit den vorliegenden
Daten vergleiche Kapitel 4).
Die gesammelten Daten wurden nach dem Prinzip einer explorativen Datenanalyse
untersucht. Dabei wurden die erstellten Diagramme (vgl. Kapitel 3) sowohl deskriptiv
beurteilt, als auch statistische Testverfahren auf die Daten der Patientengruppen
angewandt. Es wurde stets ein Signifikanzniveau von α = 5 % (p < 0,05) zugrunde
gelegt. Da bei der explorativen Datenanalyse jedoch nicht nur signifikante
Unterschiede sondern auch Tendenzen erkannt werden sollen, wurden p-Werte
zwischen 0,05 und 0,15 als zwar nicht signifikant, aber auf einen Unterschied
hindeutend gewertet, und damit ebenfalls in der Auswertung berücksichtigt.
2.6.1
Ausreißerbewertung: Grubb’s Ausreißertest
Basierend auf Messfehlern, Dokumentationsfehlern oder aber pathologischen
Besonderheiten können extrem hohe oder niedrige Werte entstehen, welche als
Ausreißer bezeichnet werden. Auffällige Messwerte in den gesammelten Daten wurden
dabei einzeln betrachtet und in Frage gestellt: Möglicherweise entstand der fragliche
Messwert aufgrund eines Mess- oder Dokumentationsfehlers (wenn er z.B. signifikant
höher lag als andere Messwerte desselben Patienten), oder die Ursache liegt in einem
klinischen Hintergrund (wenn mehrere Werte desselben Patienten signifikant erhöht
waren). Zusätzlich kam zur Ausreißerbewertung Grubb's Ausreißertest zur Anwendung,
welcher überprüft, ob die Wahrscheinlichkeit besteht, dass ein auffälliger Wert unter
Annahme einer Normalverteilung zu den restlichen Werten passt oder tatsächlich
herausfällt.
Material und Methoden
Nachdem die Prüfgröße Z mittels folgender Formel
25
(mean =
Mittelwert, value = Messwert, SD = Standardabweichung der Werte) bestimmt wurde,
kann - der Anzahl der geprüften Messwerte entsprechend - ein sog. kritischer Wert
(aus standardisierten Tabellen) als Bezugswert angenommen werden: Wird dieser
kritische Wert überstiegen, so wird der Messwert als signifikant betrachtet. Damit ist es
wahrscheinlich, dass es sich bei dem Messwert um einen Ausreißer handelt.
Konnte nach Betrachtung der auffälligen Messwerte nach obigem Vorgehen also ein
Mess- oder Dokumentationsfehler bzw. ein besonderer pathologischer Hintergrund
des Patienten nicht ausgeschlossen werden und war der Wert zusätzlich nach Grubb's
Ausreißertest signifikant, so wurde er aus dem Datensatz ausgeschlossen.
2.6.2
Kruskal-Wallis-Test
Der Kruskal-Wallis-Test (auch: H-Test) ist ein nichtparametrischer statistischer Test
(d.h. Art und Anzahl der Parameter sind flexibel und nicht von vornherein festgelegt).
Er vergleicht die Mediane von ≥ 3 unabhängigen Stichproben im Rahmen einer
Varianzanalyse (Varianz = Maß dafür, wie weit die einzelnen Werte im Durchschnitt
vom Mittelwert entfernt liegen; ein Streuungsmaß) dahingehend, ob sich verschiedene
unabhängige Stichproben (Gruppen) hinsichtlich einer ordinalskalierten Variable (d.h.
Zahlen drücken Rangfolgen aus) bei stetiger Verteilung unterscheiden:
Dieser Test vergleicht hierbei anstelle der Original-Messwerte die entsprechenden
Rangplätze der Daten, die sich bei der Ordnung der Datenwerte der Größe nach (von
niedrig nach hoch) über die Gruppen hinweg ergeben. Der größte Wert bekommt den
Rang n, wobei n für die Gesamtzahl der Werte aller Gruppen steht.
Als Prüfgröße des Kruskal-Wallis-Tests wird der sogenannte H-Wert („Kruskal-Wallis
statistic“) folgendermaßen berechnet:
Die Daten der Stichproben werden zusammengeworfen und jeder der n
Beobachtungen wird ein Rang zugeordnet. Für jede der Gruppen berechnet man nun
die Summe der Ränge, die den Messwerten der betreffenden Gruppe zugeordnet sind.
Hieraus wird wiederum die Teststatistik errechnet: Sofern die Stichproben groß genug
sind (bei vier Gruppen: wenn n ≥ 4 gilt), wird die berechnete Prüfgröße H mit einer
Material und Methoden
theoretischen
Größe
26
aus
der
Chi-Quadrat-Verteilung
für
eine
gewählte
Irrtumswahrscheinlichkeit verglichen.
Ist der errechnete H-Wert größer als der H-Wert aus der Chi-Quadrat-Tabelle, so wird
H0 ( = Nullhypothese: d.h. es besteht kein Unterschied zwischen den Gruppen)
verworfen – je höher nun dieser H-Wert also ist, umso signifikanter ist der Unterschied
zwischen den Gruppen.
Der p-Wert (auch sog. Überschreitungswahrscheinlichkeit) beantwortet schließlich die
Fragestellung der Signifikanz: Unterschieden sich die Rangsummen deutlich, so fällt
der p-Wert klein aus. Haben die Gruppen nun tatsächlich die gleichen Mediane bzw.
ist
die
Nullhypothese
anzunehmen,
stellt
sich
die
Frage,
mit
welcher
Wahrscheinlichkeit ein so hoher H-Wert (oder höherer), wie er in diesem Experiment
herausgekommen ist, beobachtet werden kann.
Sind die Stichproben klein und gibt es keine identischen Werte, so berechnet Prism
einen exakten p-Wert - andernfalls wird der p-Wert entsprechend der Chi-QuadratTabelle angenähert. Die Approximation ist dabei ausreichend, sobald k ≥ 4
unabhängige Zufallsstichproben mit jeweils einem Stichprobenumfang von mindestens
5 Beobachtungen vorliegen (Eckstein, 2008).
2.6.3
Dunn’s post test
Dunn’s post test vergleicht die Differenz der Rangsummen zweier Spalten (= Gruppen)
mit der anzunehmenden Durchschnittsdifferenz (basierend auf Gruppenanzahl und größe). Für jedes Vergleichsgruppenpaar wird der p-Wert angezeigt: p>0,05, <0,05*,
<0,01**, oder <0,001***. Bei der Kalkulation des p-Wertes wird die Anzahl der
Vergleiche, die gemacht werden, berücksichtigt. Kann die Nullhypothese angenommen
werden (das bedeutet: Alle Werte entstammen Gruppen mit identischer Verteilung,
d.h. alle Gruppenunterschiede basieren auf zufälliger Stichprobenerhebung), so besteht
eine 5%ige Wahrscheinlichkeit, dass zumindest einer der nachfolgenden Tests p < 0,05
ergibt. Diese Wahrscheinlichkeit gilt nicht für jeden einzelnen Vergleich, sondern
vielmehr für die Gesamtheit der Vergleiche.
Material und Methoden
2.7
Software
27
Folgende Software wurde für die statistischen Berechnungen und Erstellung der
Diagramme verwendet:
-
Grubb's Ausreißertest: Onlinerechner QuickCalcs, Online Calculators for
Scientists der Fa. GraphPad Software, San Diego, California, USA Inc.
http://www.graphpad.com/quickcalcs/Grubbs1.cfm
-
Kruskal-Wallis-Test + Dunn’s post test: nonparametrischer statistischer
Test für den Vergleich von mehr als zwei Gruppen und für die graphische Darstellung
der Diagramme im Ergebnisteil: Graph Pad Prism, Version 5.0b, GraphPad Prism
Inc., San Diego, California, USA
28 Ergebnisse
3
3.1
Ergebnisse
Grubb’s Ausreißerbewertung
Zunächst wurden in allen Gruppen auffällige hohe oder niedrige Messwerte betrachtet:
konnten Messfehler oder Dokumentationsfehler bzw. besondere pathologische
Hintergründe des entsprechenden Patienten nicht ausgeschlossen werden, so kam
Grubb's Ausreißertest zum Einsatz. Dafür wurden jeweils alle Messwerte aus den
einzelnen Gruppen für die einzelnen Marker-Werte zusammengefasst und auf
Ausreißer getestet. Bei Signifikanz des fraglichen, extremsten Messwertes wurde dieser
Wert nach Prüfung der Fraglichkeit schließlich aus dem Kollektiv entfernt. Sofern
weitere Messwerte auffällig erschienen, wurde der Testvorgang wiederholt.
3.2
Kruskal-Wallis-Analyse mit Dunn’s Multiple Comparison-Test
Anschließend wurde unter Zuhilfenahme des Kruskal-Wallis-Tests in Verbindung mit
Dunn’s post test überprüft, ob zwischen den verschiedenen Gruppen ein statistischer
Unterschied mit Bezug auf die gemessenen „Gate“- bzw. „Mean“-Werte nachgewiesen
werden kann:
„Gated“-Werte: Betrachtet wird der prozentuale Anteil der jeweils markerspezifisch
(z.B. CD16) positiven Zellen in dem jeweiligen Zell-Fenster (Granulozyten-Fenster
oder Lymphozyten-Fenster) bezogen auf die Gesamtzellzahl in diesem Fenster.
„Mean-Werte“: Die Betrachtung des Mean-Wertes gibt Aufschlüsse über die
Expressionsdichte.
Ergebnisse
3.2.1
Ergebnisse für Granulozyten
CD64
Prozentwert der gegateten =
CD64-exprimierenden Zellen
3.2.1.1
29
Abbildung 4: CD64 (CD = Cluster of Differentiation): Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten aus der Blutprobenanalyse: xAchse:
Patienten-Gruppeneinteilung
nach
Haupt-Diagnose
(Panel
[=gesund],
HLH
[=Hämophagozytische
Lymphohistiozytose], Sepsis, Tumor); horizontale Balken: oberer Balken = 75% Percentile, mittlerer Balken = Median, unterer
Balken = 25% Percentile; y-Achse: Prozentwert der gegateten [= CD64-exprimierenden] Zellen
Tabelle 4: Ergebnisse nach Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests sowie des Dunn’s Multiple Comparison-Tests für CD64 (CD
= Cluster of Differentiation) unter Angabe des analysierten p-Wertes inkl. Eruierung des Signifikanzniveaus unter Angabe des HWertes dargestellt. Abschließend erfolgt die Auflistung deutlicher Unterschiede (wenn p < 0,05) beim Gruppenvergleich nach
Dunn’s Multiple Comparison-Test.
Kruskal-Wallis-Test
p-Wert
p < 0,05?
H-Wert (Kruskal-Wallis statistic)
Dunn’s Multiple Comparison-Test
p < 0,05?
Panel vs Sepsis
Sepsis vs Tumor
< 0,0001
Ja
21,91
***Ja
***Ja
30
Mean-Werte = Expressionsdichte für CD64
Ergebnisse
Abbildung 5 CD64 (CD = Cluster of Differentiation): Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten aus der Blutprobenanalyse: xAchse:
Patienten-Gruppeneinteilung
nach
Haupt-Diagnose
(Panel
[=gesund],
HLH
[=,Hämophagozytische
Lymphohistiozytose], Sepsis, Tumor); horizontale Balken: oberer Balken = 75% Percentile, mittlerer Balken = Median, unterer
Balken = 25% Percentile; y-Achse: Mean-Werte = Expressionsdichte für CD64
Tabelle 5: Ergebnisse nach Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests sowie des Dunn’s Multiple Comparison-Tests für CD64 (CD
= Cluster of Differentiation) unter Angabe des analysierten p-Wertes inkl. Eruierung des Signifikanzniveaus unter Angabe des HWertes dargestellt. Abschließend erfolgt die Auflistung deutlicher Unterschiede (wenn p < 0,05) beim Gruppenvergleich nach
Dunn's Multiple Comparison-Test.
Kruskal-Wallis-Test
p-Wert
p < 0,05?
H-Wert (Kruskal-Wallis statistic)
Dunn's Multiple Comparison-Test
p < 0,05?
Panel vs Sepsis
Panel vs Tumor
0,0005
Ja
17,61
** Ja
*** Ja
Ergebnisse
31
Als Fc-Rezeptor bindet CD64 mit hoher Affinität IgG und induziert somit Rezeptorvermittelte Phagozytose von IgG-Antigen-Komplexen. Außerdem dient CD64 der
Antigenpräsentation für T-Zellen und löst darüber hinaus die Freisetzung weiterer
Zytokine und reaktiver O2-Mediatoren einschließlich IL-1, IL-6 und TNFα aus.
Beim kerngesunden Menschen gehen die CD64-Werte in der Regel gegen 0.
Wie man dem Scatterdiagramm „Gated“ entnehmen kann, liegen die Mediane der
Panel- (Werte zwischen 2,72 und 61,5) und Tumor-Gruppe (Messwerte – im Vergleich
zu den anderen Gruppen am stärksten gestreut - zwischen 0,01 und 99,51)
vergleichsweise eher im unteren Bereich und dabei näher beieinander, während die
HLH-Gruppe bei insgesamt auch sehr starker Streuung im Vergleich zu den vorigen
zwei Gruppen einen 3-fach erhöhten Median-Wert aufzeigt. Bei der Tumor-Gruppe
fallen jedoch zwei Werte-Akkumulationen auf: Während sich 5 Werte im oberen
Messbereich befinden, liegen die restlichen Werte im niedrigen Messwertbereich. Die
Sepsis-Gruppe weist von allen Gruppen den höchsten Median-Wert auf, wobei bis auf
einen Einzelwert alle Werte dieser Gruppe eng beieinander im obersten Bereich liegen.
Sie unterscheidet sich hierbei am deutlichsten von der Panel- und Tumor-Gruppe (p =
***< 0,0001).
Das Scatterdiagramm „Mean“ zeigt deutlich erhöhte Medianwerte und damit deutlich
erhöhte Expressionsdichten in den Gruppen HLH, Sepsis und Tumor im Vergleich
zur Panel-Gruppe. Bedeutende Unterschiede hinsichtlich der Expressionsdichte in
Form von vergleichsweise stark erhöhten Messwerten ergaben sich dabei vor allem bei
der Sepsis- und Tumor-Gruppe (p = ***0,0003).
Ergebnisse
CD16
Mean-Werte =
Expressionsdichte für CD16
3.2.1.2
32
Abbildung 6 CD16 (CD = Cluster of Differentiation): Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten aus der Blutprobenanalyse: xAchse:
Patienten-Gruppeneinteilung
nach
Haupt-Diagnose
(Panel
[=gesund],
HLH
[=,Hämophagozytische
Lymphohistiozytose], Sepsis, Tumor); horizontale Balken: oberer Balken = 75% Percentile, mittlerer Balken = Median, unterer
Balken = 25% Percentile; y-Achse: Mean-Werte = Expressionsdichte für CD16
Tabelle 6: Ergebnisse nach Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests sowie des Dunn’s Multiple Comparison-Tests für CD16 (CD
= Cluster of Differentiation) unter Angabe des analysierten p-Wertes inkl. Eruierung des Signifikanzniveaus unter Angabe des HWertes dargestellt. Abschließend erfolgt die Auflistung deutlicher Unterschiede (wenn p < 0,05) beim Gruppenvergleich nach
Dunn's Multiple Comparison-Test.
Kruskal-Wallis-Test
p-Wert
p < 0,05?
H-Wert (Kruskal-Wallis statistic)
0,7131
1,368
Dunn's Multiple Comparison-Test
p < 0,05?
CD16 wird auf allen FcR-Typ-III+ - Zellen exprimiert und ist immer auf Granulozyten
zu finden. Es bindet an Antikörper-tragende Zielzellen und induziert so die
Stimulation der T-Zellen: Es kommt zur Phagozytose opsonierter Bakterien etc..
Darüber hinaus hat CD16 auch Bedeutung für die Einleitung des Zelltodes.
Die Betrachtung der Mean-Werte gibt Aufschluss über die Expressionsdichte. Wie
man erkennen kann, liegt hier in allen vier Gruppen eine breite Streuung der Werte
vor. Während sich die Messwerte der Panel-Gruppe bei einem Median von 1439 im
Ergebnisse
33
Bereich zwischen 773,5 – 3045 bewegen, liegen die Mediane der restlichen Gruppe
niedriger. Sowohl in der Panel- als auch in der HLH-Gruppe fällt jeweils eine WerteGruppierung in zwei Akkumulationen auf. Jedoch haben sich nach der statistischen
Analyse keine bedeutenden Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen
herauskristallisiert (p = 0,7131).
34
Mean-Werte =
Expressionsdichte für CD39
Ergebnisse
3.2.1.3
CD39
Abbildung 7: CD39 (CD = Cluster of Differentiation): Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten aus der Blutprobenanalyse: xAchse: Patienten-Gruppeneinteilung nach Haupt-Diagnose (Panel [=gesund], HLH [=Hämophagozytische
Lymphohistiozytose], Sepsis, Tumor); horizontale Balken: oberer Balken = 75% Percentile, mittlerer Balken = Median, unterer
Balken = 25% Percentile; y-Achse: Prozentwert der gegateten [= CD39-exprimierenden] Zellen
Tabelle 7: Ergebnisse nach Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests sowie des Dunn’s Multiple Comparison-Tests für CD39 (CD
= Cluster of Differentiation) unter Angabe des analysierten p-Wertes inkl. Eruierung des Signifikanzniveaus unter Angabe des HWertes dargestellt. Abschließend erfolgt die Auflistung deutlicher Unterschiede (wenn p < 0,05) beim Gruppenvergleich nach
Dunn's Multiple Comparison-Test.
Kruskal-Wallis-Test
p-Wert
p < 0,05?
H-Wert (Kruskal-Wallis statistic)
Dunn's Multiple Comparison-Test
p < 0,05?
Panel vs Sepsis
0,0201
Ja
9,828
*Ja
CD39 hydrolysiert extrazellulär Nukleotide, v.a. ATP und ADP zu AMP und
verhindert so Inflammatorische Prozesse sowie (v.a. als „soluble CD39“) die ADPinduzierte Thrombozytenaggregation.
Wie man dem Scatterdiagramm „Gated“ entnehmen kann, liegen die Einzelwerte der
Panel-Gruppe vergleichsweise im unteren Bereich zwischen 0,9 – 23,65% und dabei
Ergebnisse
35
relativ nahe beieinander. Während die anderen drei Gruppen bei insgesamt starker
Streuung im Vergleich zur Panel-Gruppe erhöhte Median-Werte (die Mediane aller drei
Krankheits-Gruppen übersteigen den Maximalwert der Panel-Gruppe) sowie deutlich
höhere Maximal-Werte aufzeigen, hebt sich vor allem die Sepsis-Gruppe mit dem
höchsten Median-Wert (bei zwei Werte-Akkumulationen) deutlich von der PanelGruppe ab, was auch der p-Wert verdeutlicht (p = *0,0201). In dieser PatientenGruppe fällt darüber hinaus auf, dass es zwei Messwerte-Ansammlungen gibt (eine
größere Ansammlung im oberen Messwertebereich sowie eine kleinere im unteren).
Ergebnisse
HLA-DR
Prozentwert der gegateten =
HLA-DR-exprimierenden Zellen
3.2.1.4
36
Abbildung 8 HLA-DR (Human Leukocyte Antigen-D-Rezeptor): Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten aus der
Blutprobenanalyse:
x-Achse:
Patienten-Gruppeneinteilung
nach
Haupt-Diagnose
(Panel
[=gesund],
HLH
[=Hämophagozytische Lymphohistiozytose], Sepsis, Tumor); horizontale Balken: oberer Balken = 75% Percentile, mittlerer
Balken = Median, unterer Balken = 25% Percentile; y-Achse: Prozentwert der gegateten [= HLA-DR-exprimierenden] Zellen
Tabelle 8: Ergebnisse nach Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests sowie des Dunn’s Multiple Comparison-Tests für HLA-DR
(Human Leukocyte Antigen-D-Rezeptor) unter Angabe des analysierten p-Wertes inkl. Eruierung des Signifikanzniveaus unter
Angabe des H-Wertes dargestellt. Abschließend erfolgt die Auflistung deutlicher Unterschiede (wenn p < 0,05) beim
Gruppenvergleich nach Dunn's Multiple Comparison-Test.
Kruskal-Wallis-Test
p-Wert
p < 0,05?
H-Wert (Kruskal-Wallis statistic)
Dunn's Multiple Comparison-Test
p < 0,05?
0,2099
4,527
37
Mean-Werte =
Expressionsdichte für HLA-DR
Ergebnisse
Abbildung 9 HLA-DR (Human Leukocyte Antigen-D-Rezeptor): Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten aus der
Blutprobenanalyse:
x-Achse: Patienten-Gruppeneinteilung nach Haupt-Diagnose (Panel [=gesund], HLH
[=,Hämophagozytische Lymphohistiozytose], Sepsis, Tumor); horizontale Balken: oberer Balken = 75% Percentile, mittlerer
Balken = Median, unterer Balken = 25% Percentile; y-Achse: Mean-Werte = Expressionsdichte für HLA-DR
Tabelle 9: Ergebnisse nach Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests sowie des Dunn’s Multiple Comparison-Tests für HLA-DR
(Human Leukocyte Antigen-D-Rezeptor) unter Angabe des analysierten p-Wertes inkl. Eruierung des Signifikanzniveaus unter
Angabe des H-Wertes dargestellt. Abschließend erfolgt die Auflistung deutlicher Unterschiede (wenn p < 0,05) beim
Gruppenvergleich nach Dunn's Multiple Comparison-Test.
Kruskal-Wallis-Test
p-Wert
p < 0,05?
H-Wert (Kruskal-Wallis statistic)
0,1694
5,033
Dunn's Multiple Comparison-Test
p < 0,05?
Für die vorliegende Untersuchung spielt die Betrachtung von HLA-DR insofern eine
Rolle, als dass es durch seinen Zusammenhang mit GM-CSF gegebenenfalls
Aufschluss im Sinne einer Linksverschiebung (↓ GM-CSF) im Granulozyten-Fenster
geben kann.
Bei der Betrachtung sowohl der „Gated“- als auch der „Mean“-Werte fällt hier jedoch
keine bedeutsame Linksverschiebung der Sepsis-Gruppe im Vergleich zu den anderen
Patientengruppen auf.
Ergebnisse
38
Während die Mediane aller Gruppen im „Gated“-Fenster relativ nah beieinander
liegen, zeigt die HLH-Gruppe die breiteste Streuung mit dem höchsten Maximal-Wert
auf. Die Messwerte der Panel-Gruppe bewegen sich dabei in einem Bereich zwischen
0,1 – 2,09%. In diesen Bereich fallen auch die Werte der Sepsis- sowie der TumorGruppe (bis auf lediglich 3 Ausnahme), wohingegen die HLH-Gruppe eine breitere
Messwert-Spanne im Bereich von 0,01 – 5,38% mit einem 6fach höheren Median-Wert
im Vergleich zur Panel-Gruppe aufweist. Der p-Wert von 0,2102 besagt jedoch, dass
die Unterschiede zwischen den vier Gruppen nicht bedeutsam sind.
Auch die Betrachtung der Mean-Scatterdiagramm-Werte lässt bei einem p-Wert von
0,1694 keine deutlichen Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen erkennen.
Vielmehr liegen anstelle der vermuteten Sepsis-Gruppe die Mediane der HLH- und
Tumor-Gruppe im Vergleich zur Panel-Gruppe höher.
Ergebnisse
IL-7R
Prozentwert der gegateten =
IL-7R-exprimierenden Zellen
3.2.1.5
39
Abbildung 10 IL-7R (Interleukin-7-Rezeptor): Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten aus der Blutprobenanalyse: x-Achse:
Patienten-Gruppeneinteilung nach Haupt-Diagnose (Panel [=gesund], HLH [=Hämophagozytische Lymphohistiozytose],
Sepsis, Tumor); horizontale Balken: oberer Balken = 75% Percentile, mittlerer Balken = Median, unterer Balken = 25%
Percentile; y-Achse: Prozentwert der gegateten [= IL-7R-exprimierenden] Zellen
Tabelle 10: Ergebnisse nach Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests sowie des Dunn’s Multiple Comparison-Tests für IL-7R
(Interleukin-7-Rezeptor): unter Angabe des analysierten p-Wertes inkl. Eruierung des Signifikanzniveaus unter Angabe des HWertes dargestellt. Abschließend erfolgt die Auflistung deutlicher Unterschiede (wenn p < 0,05) beim Gruppenvergleich nach
Dunn's Multiple Comparison-Test.
Kruskal-Wallis-Test
p-Wert
p < 0,05?
H-Wert (Kruskal-Wallis statistic)
Dunn's Multiple Comparison-Test
p < 0,05?
0,0784
6,805
40
Mean-Werte =
Expressionsdichte für IL-7R
Ergebnisse
Abbildung 11 IL-7R (Interleukin-7-Rezeptor): Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten aus der Blutprobenanalyse: x-Achse:
Patienten-Gruppeneinteilung nach Haupt-Diagnose (Panel [=gesund], HLH [=,Hämophagozytische Lymphohistiozytose],
Sepsis, Tumor); horizontale Balken: oberer Balken = 75% Percentile, mittlerer Balken = Median, unterer Balken = 25%
Percentile; y-Achse: Mean-Werte = Expressionsdichte für IL-7R
Tabelle 11: Ergebnisse nach Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests sowie des Dunn’s Multiple Comparison-Tests für IL-7R
(Interleukin-7-Rezeptor) unter Angabe des analysierten p-Wertes inkl. Eruierung des Signifikanzniveaus unter Angabe des HWertes dargestellt. Abschließend erfolgt die Auflistung deutlicher Unterschiede (wenn p < 0,05) beim Gruppenvergleich nach
Dunn's Multiple Comparison-Test.
Kruskal-Wallis-Test
p-Wert
p < 0,05?
H-Wert (Kruskal-Wallis statistic)
Dunn's Multiple Comparison-Test
p < 0,05?
Sepsis vs Tumor
Panel vs Tumor
0,0025
Ja
14,36
** Ja
* Ja
Die Bindung von IL-7 an den IL-7R führt zur T-Zell-Proliferation sowie Aktivierung
und hat antiapoptotische Wirkung.
Ergebnisse
41
Bei Betrachtung des „Gated“-Scatterdiagrammes ist eine starke Streuung der PanelWerte erkennbar - die Werte liegen zwischen 0,1 – 94,96%. Dahingegen konzentrieren
sich die Messwerte der HLH-Gruppe auf einen vergleichbar kleinen Bereich (0,13,08%). Auch die Tumor-Gruppe vertritt einen verhältnismäßig kleineren Bereich mit
Werten zwischen 0,1-16,09%. Hingegen weist die Sepsis-Gruppe wiederum neben
einer stärkeren Streuung (0,12-34,96%) auch den vergleichsweise höchsten Median auf.
Der relativ niedrige p-Wert (p = 0,0784) spiegelt dabei zwar keine bedeutenden
Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen wider, deutet jedoch auf tendenziell
kleinere Unterschiede hin.
Hingegen variieren die Mediane im „Mean“-Scatterdiagramm und damit die
Expressionsdichte zum Teil mit deutlicher Tendenz: Die Panel-Gruppe liegt mit
Werten zwischen 26,22 – 278,3 bis auf die zwei höchsten Werte in einem kleinen
Messwert-Fenster. Auch die Mean-Werte der Sepsis-Gruppe konzentrieren sich bis auf
einen höheren Wert in einem kleinen Mess-Bereich zwischen 9,47 und 392,4. Die
Tumor-Gruppe hingegen weist vor allem im Vergleich zur Panel- und Sepsis-Gruppe
aufgrund erhöhter Messwerte bemerkenswerte Differenzen auf (p = **0,0025),
während die HLH-Gruppe zwar erhöhte aber noch nicht als tendenziell deutlich
erhöht zu betrachtende Werte aufzeigt.
42
Prozentwert der gegateten =
IL-17R-exprimierenden Zellen
Ergebnisse
3.2.1.6
IL-17R
Abbildung 12 IL-17R (Interleukin-17-Rezeptor): Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten aus der Blutprobenanalyse: x-Achse:
Patienten-Gruppeneinteilung nach Haupt-Diagnose (Panel [=gesund], HLH [=Hämophagozytische Lymphohistiozytose],
Sepsis, Tumor); horizontale Balken: oberer Balken = 75% Percentile, mittlerer Balken = Median, unterer Balken = 25%
Percentile; y-Achse: Prozentwert der gegateten [= IL-17R-exprimierenden] Zellen
Tabelle 12: Ergebnisse nach Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests sowie des Dunn’s Multiple Comparison-Tests für IL-17R
(Interleukin-17-Rezeptor) unter Angabe des analysierten p-Wertes inkl. Eruierung des Signifikanzniveaus unter Angabe des HWertes dargestellt. Abschließend erfolgt die Auflistung deutlicher Unterschiede (wenn p < 0,05) beim Gruppenvergleich nach
Dunn's Multiple Comparison-Test.
Kruskal-Wallis-Test
p-Wert
p < 0,05?
H-Wert (Kruskal-Wallis statistic)
Dunn's Multiple Comparison-Test
p < 0,05?
Sepsis vs Tumor
0,0164
Ja
10,26
* Ja
43
Mean-Werte =
Expressionsdichte für IL-17R
Ergebnisse
Abbildung 13 IL-17R (Interleukin-17-Rezeptor): Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten aus der Blutprobenanalyse: x-Achse:
Patienten-Gruppeneinteilung nach Haupt-Diagnose (Panel [=gesund], HLH [=Hämophagozytische Lymphohistiozytose],
Sepsis, Tumor); horizontale Balken: oberer Balken = 75% Percentile, mittlerer Balken = Median, unterer Balken = 25%
Percentile; y-Achse: Mean-Werte = Expressionsdichte für IL-17R
Tabelle 13: Ergebnisse nach Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests sowie des Dunn’s Multiple Comparison-Tests für IL-17R
(Interleukin-17-Rezeptor) unter Angabe des analysierten p-Wertes inkl. Eruierung des Signifikanzniveaus unter Angabe des HWertes dargestellt. Abschließend erfolgt die Auflistung deutlicher Unterschiede (wenn p < 0,05) beim Gruppenvergleich nach
Dunn's Multiple Comparison-Test.
Kruskal-Wallis-Test
p-Wert
p < 0,05?
H-Wert (Kruskal-Wallis statistic)
Dunn's Multiple Comparison-Test
p < 0,05?
Panel vs Tumor
0,0106
Ja
11,21
** Ja
IL-17 bzw. IL-17R ist u.a. wichtig für eine gesteigerte effektive Antwort auf viele
extrazelluläre Mikroben – dies ergibt sich vor allem aus der Regulation der
neutrophilen Migration und Granulopoiese.
Ergebnisse
44
Wie dem „Gated“-Scatterdiagramm zu entnehmen ist, befinden sich die Messwerte der
Panel-Gruppe im Bereich 33,8 – 95,95%. Zu beobachten ist insgesamt eine mehr oder
weniger starke Streuung in allen vier Gruppen - die HLH-Gruppe weist hierbei neben
der Tumor-Gruppe die breiteste Streuung auf, während sich die Messwerte der SepsisGruppe eher im oberen Bereich ansammeln. Die Tumor-Gruppe unterscheidet sich
dabei tendenziell am stärksten (p = *0,0164) von der Sepsis-Gruppe.
Betrachtet man die Expressionsdichte, die das „Mean“-Scatterdiagramm widerspiegelt,
so unterscheidet sich erneut die Tumor-Gruppe - hier allerdings - von der PanelGruppe mit erhöhter Tendenz (p = **0,0106) hinsichtlich der Messwerte. Auch bei
Betrachtung weiterer analytischer Vergleiche kommt der Unterschied hinsichtlich der
Rangsummen-Differenz zum Tragen. Die HLH-Gruppe weist hier wiederum eine
vergleichsweise starke Streuung auf.
45
Prozentwert der gegateten =
TLR-2-exprimierenden Zellen
Ergebnisse
3.2.1.7
TLR-2
Abbildung 14 TLR-2 (TLR=Toll-like-Rezeptor): Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten aus der Blutprobenanalyse: x-Achse:
Patienten-Gruppeneinteilung nach Haupt-Diagnose (Panel [=gesund], HLH [=Hämophagozytische Lymphohistiozytose],
Sepsis, Tumor); horizontale Balken: oberer Balken = 75% Percentile, mittlerer Balken = Median, unterer Balken = 25%
Percentile; y-Achse: Prozentwert der gegateten [= TLR-2-exprimierenden] Zellen
Tabelle 14: Ergebnisse nach Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests sowie des Dunn’s Multiple Comparison-Tests für TLR-2
(TLR=Toll-like-Rezeptor) unter Angabe des analysierten p-Wertes inkl. Eruierung des Signifikanzniveaus unter Angabe des HWertes dargestellt. Abschließend erfolgt die Auflistung deutlicher Unterschiede (wenn p < 0,05) beim Gruppenvergleich nach
Dunn's Multiple Comparison-Test.
Kruskal-Wallis-Test
p-Wert
p < 0,05?
H-Wert (Kruskal-Wallis statistic)
Dunn's Multiple Comparison-Test
p < 0,05?
Panel vs Tumor
0,0173
Ja
10,15
* Ja
46
Mean-Werte =
Expressionsdichte für TLR-2
Ergebnisse
Abbildung 15 TLR-2 (TLR=Toll-like-Rezeptor): Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten aus der Blutprobenanalyse: x-Achse:
Patienten-Gruppeneinteilung nach Haupt-Diagnose (Panel [=gesund], HLH [=Hämophagozytische Lymphohistiozytose],
Sepsis, Tumor); horizontale Balken: oberer Balken = 75% Percentile, mittlerer Balken = Median, unterer Balken = 25%
Percentile; y-Achse: Mean-Werte = Expressionsdichte für TLR-2
Tabelle 15: Ergebnisse nach Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests sowie des Dunn’s Multiple Comparison-Tests für TLR-2
(TLR=Toll-like-Rezeptor) unter Angabe des analysierten p-Wertes inkl. Eruierung des Signifikanzniveaus unter Angabe des HWertes dargestellt. Abschließend erfolgt die Auflistung deutlicher Unterschiede (wenn p < 0,05) beim Gruppenvergleich nach
Dunn's Multiple Comparison-Test.
Kruskal-Wallis-Test
p-Wert
p < 0,05?
H-Wert (Kruskal-Wallis statistic)
Dunn's Multiple Comparison-Test
p < 0,05?
Panel vs Tumor
0,0002
Ja
19,38
*** Ja
TLR-2 als wichtiger Vertreter humaner TLR wird auf der Zelloberfläche von PMN
beim Gesunden exprimiert und nach Stimulation durch Gram-positive und
Mykobakterien hochreguliert.
Ergebnisse
47
Bei Betrachtung des „Gated“-Scatterdiagramms liegen die Werte der Panel-Gruppe
zwischen 0,01 und 2,14% bei einem Median von 1,06. Nach Durchführung der WerteAnalyse kann man bei einem mit der Panel-Gruppe verglichenen 8-fach erhöhten
Median-Wert der Tumor-Gruppe einen auffälligen Unterschied zwischen diesen zwei
Gruppen erkennen (p = *0,0173). Die anderen beiden Gruppen weisen im Vergleich
zur Panel-Gruppe einen ca. 5fach erhöhten Median-Wert auf. Die HLH-Gruppe zeigt
dabei im Vergleich den höchsten Maximal-Wert auf.
Während die Median-Werte im „Mean“-Scatterdiagramm bei Betrachtung der Sepsisund HLH-Gruppe eng beieinander liegen, zeigt die Panel-Gruppe den vergleichsweise
niedrigsten Median auf. Ein tatsächlich bemerkenswerter Unterschied ist jedoch
lediglich beim Vergleich der Tumor- mit der Panel-Gruppe festzustellen (p =
***0,0002). Die Werte der Panel-Gruppe finden sich dabei im Bereich zwischen 29,15
– 50,76 wieder, während die Tumor-Gruppe Messwerte im Bereich zwischen 42,60 –
954,1 aufweist und damit eine stark erhöhte Expressionsdichte verdeutlicht.
48
Prozentwert der gegateten =
TLR-4-exprimierenden Zellen
Ergebnisse
3.2.1.8
TLR-4
Abbildung 16 TLR-4 (TLR=Toll-like-Rezeptor): Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten aus der Blutprobenanalyse: x-Achse:
Patienten-Gruppeneinteilung nach Haupt-Diagnose (Panel [=gesund], HLH [=Hämophagozytische Lymphohistiozytose],
Sepsis, Tumor); horizontale Balken: oberer Balken = 75% Percentile, mittlerer Balken = Median, unterer Balken = 25%
Percentile; y-Achse: Prozentwert der gegateten [= TLR-4-exprimierenden] Zellen
Tabelle 16: Ergebnisse nach Durchführung Kruskal-Wallis-Tests sowie des Dunn’s Multiple Comparison-Tests für TLR-4
(TLR=Toll-like-Rezeptor) unter Angabe des analysierten p-Wertes inkl. Eruierung des Signifikanzniveaus unter Angabe des HWertes dargestellt. Abschließend erfolgt die Auflistung deutlicher Unterschiede (wenn p < 0,05) beim Gruppenvergleich nach
Dunn's Multiple Comparison-Test.
Kruskal-Wallis-Test
p-Wert
p < 0,05?
H-Wert (Kruskal-Wallis statistic)
Dunn's Multiple Comparison-Test
p < 0,05?
0,5459
2,130
49
Mean-Werte =
Expressionsdichte für TLR-4
Ergebnisse
Abbildung 17 TLR-4 (TLR=Toll-like-Rezeptor): Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten aus der Blutprobenanalyse: x-Achse:
Patienten-Gruppeneinteilung nach Haupt-Diagnose (Panel [=gesund], HLH [=Hämophagozytische Lymphohistiozytose],
Sepsis, Tumor); horizontale Balken: oberer Balken = 75% Percentile, mittlerer Balken = Median, unterer Balken = 25%
Percentile; y-Achse: Mean-Werte = Expressionsdichte für TLR-4
Tabelle 17: Ergebnisse nach Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests sowie des Dunn’s Multiple Comparison-Tests für TLR-4
(TLR=Toll-like-Rezeptor) unter Angabe des analysierten p-Wertes inkl. Eruierung des Signifikanzniveaus unter Angabe des HWertes dargestellt. Abschließend erfolgt die Auflistung deutlicher Unterschiede (wenn p < 0,05) beim Gruppenvergleich nach
Dunn's Multiple Comparison-Test.
Kruskal-Wallis-Test
p-Wert
p < 0,05?
H-Wert (Kruskal-Wallis statistic)
Dunn's Multiple Comparison-Test
p < 0,05?
Panel vs Tumor
0,0121
Ja
10,93
* Ja
TLR-4 als weiterer wichtiger Vertreter humaner TLR wird auf der Zelloberfläche von
PMN beim Gesunden exprimiert und nach Stimulation durch LPS (von Gramnegativen Bakterien ) oder GM-CSF hochreguliert.
Ergebnisse
50
Wie man dem „Gated“-Scatterdiagramm entnehmen kann, sind keine erheblichen
Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen erkennbar, wobei der MesswertBereich der Panel-Gruppe mit Werten zwischen 0,01 – 9,93% (und dabei auch dem
höchsten Median mit 1,435) den Werte-Bereich der drei restlichen Gruppen
einschließt.
Hingegen kann man dem „Mean“-Scatterdiagramm vor allem in der Tumor-Gruppe
erhöhte Werte entnehmen: sie liegen in einem Bereich zwischen 28,8 – 350,1. Die
Tumor-Gruppe vertritt damit neben der stärksten Streuung auch vergleichsweise hohe
Werte und unterscheidet sich somit vor allem von der Panel-Gruppe mit einem etwa
doppelt so hohen Median-Wert (bei einem p-Wert von *0,0076).
Ergebnisse
3.2.2
Ergebnisse für NK-Zellen
CD3
Prozentwert der gegateten =
CD3-exprimierenden Zellen
3.2.2.1
51
Abbildung 18 CD3 (CD = Cluster of Differentiation): Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten aus der Blutprobenanalyse: xAchse:
Patienten-Gruppeneinteilung
nach
Haupt-Diagnose
(Panel
[=gesund],
HLH
[=Hämophagozytische
Lymphohistiozytose], Sepsis, Tumor); horizontale Balken: oberer Balken = 75% Percentile, mittlerer Balken = Median, unterer
Balken = 25% Percentile; y-Achse: Prozentwert der gegateten [= CD3-exprimierenden] Zellen
Tabelle 18: Ergebnisse nach Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests sowie des Dunn’s Multiple Comparison-Tests für CD3 (CD
= Cluster of Differentiation) unter Angabe des analysierten p-Wertes inkl. Eruierung des Signifikanzniveaus unter Angabe des HWertes dargestellt. Abschließend erfolgt die Auflistung deutlicher Unterschiede (wenn p < 0,05) beim Gruppenvergleich nach
Dunn's Multiple Comparison-Test.
Kruskal-Wallis-Test
p-Wert
p < 0,05?
H-Wert (Kruskal-Wallis statistic)
0,1847
4,830
Dunn's Multiple Comparison-Test
p < 0,05?
Der CD3-Rezeptor wird als Erkennungsmolekül auf der Oberfläche aller TLymphozyten exprimiert und ist somit auch auf NK-T-Zellen vertreten.
Bei Betrachtung der vier Gruppen erscheint der Median-Wert der Tumor-Gruppe
(unwesentlich) höher im Vergleich zu den anderen drei Gruppen. Alles in allem liegen
die Werte aller vier Gruppen jedoch nahe beieinander, wobei die Panel-Gruppe mit
Abbildung 20 Ergebnisse
52
Werten zwischen 44,61 – 80,68% wenig unter- bzw. überschritten wird: Insgesamt
können keine Hinweis-starken Unterschiede festgestellt werden, was auch der p-Wert
von 0,3514 bestätigt.
30
20
10
or
m
Tu
Se
ps
is
H
LH
0
Pa
ne
l
Prozentwert der gegateten =
CD3-/CD56-exprimierenden
Gated % Zellen
CD3+/CD56+
Patientengruppe
Abbildung 19 CD3+/CD56+ (CD = Cluster of Differentiation): Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten aus der Blutprobenanalyse: xAchse: Patienten-Gruppeneinteilung nach Haupt-Diagnose (Panel [=gesund], HLH [=Hämophagozytische Lymphohistiozytose],
Sepsis, Tumor); horizontale Balken: oberer Balken = 75% Percentile, mittlerer Balken = Median, unterer Balken = 25% Percentile; yAchse: Prozentwert der gegateten [= CD3/CD56-exprimierenden] Zellen
53
Prozentwert der gegateten =
CD16-exprimierenden Zellen
Ergebnisse
3.2.2.2
CD16
Abbildung 21 CD16 (CD = Cluster of Differentiation): Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten aus der Blutprobenanalyse: xAchse:
Patienten-Gruppeneinteilung
nach
Haupt-Diagnose
(Panel
[=gesund],
HLH
[=Hämophagozytische
Lymphohistiozytose], Sepsis, Tumor); horizontale Balken: oberer Balken = 75% Percentile, mittlerer Balken = Median, unterer
Balken = 25% Percentile; y-Achse: Prozentwert der gegateten [= CD16-exprimierenden] Zellen
Tabelle 19: Ergebnisse nach Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests sowie des Dunn’s Multiple Comparison-Tests für CD16 (CD
= Cluster of Differentiation) unter Angabe des analysierten p-Wertes inkl. Eruierung des Signifikanzniveaus unter Angabe des HWertes dargestellt. Abschließend erfolgt die Auflistung deutlicher Unterschiede (wenn p < 0,05) beim Gruppenvergleich nach
Dunn's Multiple Comparison-Test.
Kruskal-Wallis-Test
p-Wert
p < 0,05?
H-Wert (Kruskal-Wallis statistic)
Dunn's Multiple Comparison-Test
p < 0,05?
Sepsis vs Tumor
0,0117
Ja
11,01
** Ja
CD16 wird auf allen FcR-Typ-III+ Zellen exprimiert und ist somit auch auf NK-Zellen
bzw. NK-T-Zellen (in der Regel CD56dim) zu finden.
Die Panel-Gruppe liegt bei der Untersuchung mit ihren Messwerten in einem Bereich
von 12,43 – 30,14% mit einem Median von 22,72%. Während die Tumor-Gruppe
hinsichtlich 25% Percentile, Median und 75% Percentile insgesamt niedrigere Werte im
Vergleich zu allen restlichen Gruppen aufzeigt, ist der Unterschied vor allem zur
Ergebnisse
54
Sepsis-Gruppe erheblich (p = **0,0117). Diese wiederum lässt neben dem höchsten
Median-Wert auch die breiteste Streuung mit Werten zwischen 1,05 – 88,29%
erkennen.
25
20
15
10
5
or
m
Tu
Se
ps
is
H
LH
0
Pa
ne
l
Prozentwert der gegateten =
Gated %
CD16-/CD56-exprimierenden
Zellen
CD16+/CD56+
Patientengruppe
Abbildung 22 CD16+/CD56+ (CD = Cluster of Differentiation): Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten aus der Blutprobenanalyse:
x-Achse: Patienten-Gruppeneinteilung nach Haupt-Diagnose (Panel [=gesund], HLH [=Hämophagozytische Lymphohistiozytose],
Sepsis, Tumor); horizontale Balken: oberer Balken = 75% Percentile, mittlerer Balken = Median, unterer Balken = 25% Percentile; yAchse: Prozentwert der gegateten [= CD16/CD56-exprimierenden] Zellen
55
Prozentwert der gegateten =
CD56-exprimierenden Zellen
Ergebnisse
3.2.2.3
CD56 FITC
Abbildung 23 CD56 FITC (CD = Cluster of Differentiation, FITC = Fluoresceinisothiocyanat): Scatterdiagramm mit
Einzelmesswerten aus der Blutprobenanalyse: x-Achse: Patienten-Gruppeneinteilung nach Haupt-Diagnose (Panel [=gesund],
HLH [=Hämophagozytische Lymphohistiozytose], Sepsis, Tumor); horizontale Balken: oberer Balken = 75% Percentile,
mittlerer Balken = Median, unterer Balken = 25% Percentile; y-Achse: Prozentwert der gegateten [= CD56-exprimierenden]
Zellen
Tabelle 20: Ergebnisse nach Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests sowie des Dunn’s Multiple Comparison-Tests für CD56
FITC (CD = Cluster of Differentiation, FITC = Fluoresceinisothiocyanat) unter Angabe des analysierten p-Wertes inkl.
Eruierung des Signifikanzniveaus unter Angabe des H-Wertes dargestellt. Abschließend erfolgt die Auflistung deutlicher
Unterschiede (wenn p < 0,05) beim Gruppenvergleich nach Dunn's Multiple Comparison-Test.
Kruskal-Wallis-Test
p-Wert
p < 0,05?
H-Wert (Kruskal-Wallis statistic)
0,2845
3,795
Dunn's Multiple Comparison-Test
p < 0,05?
Da CD56 FITC (mehrfach konjugiert) speziell zelloberflächennahe NCAMs erkennt,
werden bei der Immunphänotypisierung im Lymphozytenfenster vor allem NK-Zellen
markiert: sie besitzen nämlich nur sehr kurze NCAMs. CD56+CD161+ Zellen stehen
dabei für reife NK-Zellen.
Während die Gated-Werte der Panel-Gruppe den Bereich zwischen 6,08-32,44%
abdecken bei einem Median von 12,24%, so weist neben der Sepsis-Gruppe vor allem
die
HLH-Gruppe
einen
erhöhten
Median-Wert
auf.
Betrachtet
man
das
Ergebnisse
56
Scatterdiagramm, so fällt die Sepsis-Gruppe mit der breitesten Streuung auf. Die
Tumor-Gruppe hingegen lässt ein konzentrierteres Messwert-Ergebnis erkennen mit
dem niedrigsten Median-Wert im Vergleich der vier Gruppen.
57
Prozentwert der gegateten =
CD57-exprimierenden Zellen
Ergebnisse
3.2.2.4
CD57
Abbildung 24 CD57 (CD = Cluster of Differentiation): Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten aus der Blutprobenanalyse: xAchse:
Patienten-Gruppeneinteilung
nach
Haupt-Diagnose
(Panel
[=gesund],
HLH
[=Hämophagozytische
Lymphohistiozytose], Sepsis, Tumor); horizontale Balken: oberer Balken = 75% Percentile, mittlerer Balken = Median, unterer
Balken = 25% Percentile; y-Achse: Prozentwert der gegateten [= CD57-exprimierenden] Zellen
Tabelle 21: Ergebnisse nach Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests sowie des Dunn’s Multiple Comparison-Tests für CD57
(CD = Cluster of Differentiation)unter Angabe des analysierten p-Wertes inkl. Eruierung des Signifikanzniveaus unter Angabe
des H-Wertes dargestellt. Abschließend erfolgt die Auflistung deutlicher Unterschiede (wenn p < 0,05) beim Gruppenvergleich
nach Dunn's Multiple Comparison-Test.
Kruskal-Wallis-Test
p-Wert
p < 0,05?
H-Wert (Kruskal-Wallis statistic)
0,2720
3,904
Dunn's Multiple Comparison-Test
p < 0,05?
Eine CD57 (= NK-Zellmarker)-Expression findet man bei NK-Zellen, bei T-Zellen
sowie im Nervensystem. Sie erfolgt aber auch bei einigen soliden Tumoren wie z.B. bei
ausdifferenzierten Prostata-Tumoren und Melanomen.
Betrachtet man nun das Scatterdiagramm für CD57, so können bei einem p-Wert von
0,2720 im Vergleich zur Panel-Gruppe mit Werten zwischen 8,95 – 32,52% und einem
Median von 16,25% unerheblich niedrigere Werte in der HLH- und auch in der
Ergebnisse
58
Tumorgruppe beobachtet werden, während die Werte in der Sepsis-Gruppe tendenziell
unwesentlich erhöht sind und einer breiteren Streuung (6,41 – 50,69%) unterliegen.
Die Werteverteilung gibt dabei in der Sepsis- und in der Tumorgruppe jeweils zwei
Akkumulationen zu erkennen.
59
Prozentwert der gegateten =
CD69-exprimierenden Zellen
Ergebnisse
3.2.2.5
CD69
Abbildung 25 CD69 (CD = Cluster of Differentiation): Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten aus der Blutprobenanalyse: xAchse:
Patienten-Gruppeneinteilung
nach
Haupt-Diagnose
(Panel
[=gesund],
HLH
[=Hämophagozytische
Lymphohistiozytose], Sepsis, Tumor); horizontale Balken: oberer Balken = 75% Percentile, mittlerer Balken = Median, unterer
Balken = 25% Percentile; y-Achse: Prozentwert der gegateten [= CD69-exprimierenden] Zellen
Tabelle 22: Ergebnisse nach Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests sowie des Dunn’s Multiple Comparison-Tests für CD69 (CD
= Cluster of Differentiation) unter Angabe des analysierten p-Wertes inkl. Eruierung des Signifikanzniveaus unter Angabe des HWertes dargestellt. Abschließend erfolgt die Auflistung deutlicher Unterschiede (wenn p < 0,05) beim Gruppenvergleich nach
Dunn's Multiple Comparison-Test.
Kruskal-Wallis-Test
p-Wert
p < 0,05?
H-Wert (Kruskal-Wallis statistic)
0,0002
Ja
19,79
Dunn's Multiple Comparison-Test
p < 0,05?
Panel vs Sepsis
*** Ja
CD69 wird auf Stimulation durch proinflammatorische Zytokine hin (u.a. durch IL-2,
TFN-α sowie IFN-α) innerhalb von 1 Stunde auf NK-Zellen exprimiert und stellt
damit den ersten Vertreter der Zelloberfächenrezeptoren nach Aktivierung dar.
Der Prozentwert-Messbereich für CD69 bei Gesunden liegt zwischen 0,9 – 3,53%. Die
Einzelwerte
innerhalb
der
restlichen
drei
Gruppen
unterliegen
alle
einer
Ergebnisse
60
vergleichsweise größeren Streuung, wobei die größte Messbreite in der Sepsis-Gruppe
zu finden ist.
Nach genauer Betrachtung der Werte kann man bei einem p-Wert = ***0,0002 sehr
deutlich Unterschiede vor allem beim Vergleich der Sepsis- mit der Panel-Gruppe
feststellen. Hingegen sind die Werte der HLH- und der Tumor-Gruppe zwar erhöht,
wobei der Unterschied allerdings nicht von Bedeutung ist.
61
Prozentwert der gegateten =
CD161-exprimierenden Zellen
Ergebnisse
3.2.2.6
CD161
Abbildung 26 CD161 (CD = Cluster of Differentiation): Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten aus der Blutprobenanalyse: xAchse:
Patienten-Gruppeneinteilung
nach
Haupt-Diagnose
(Panel
[=gesund],
HLH
[=Hämophagozytische
Lymphohistiozytose], Sepsis, Tumor); horizontale Balken: oberer Balken = 75% Percentile, mittlerer Balken = Median, unterer
Balken = 25% Percentile; y-Achse: Prozentwert der gegateten [= CD161-exprimierenden] Zellen
Tabelle 23: Ergebnisse nach Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests sowie des Dunn’s Multiple Comparison-Tests für CD161
(CD = Cluster of Differentiation) unter Angabe des analysierten p-Wertes inkl. Eruierung des Signifikanzniveaus unter Angabe
des H-Wertes dargestellt. Abschließend erfolgt die Auflistung deutlicher Unterschiede (wenn p < 0,05) beim Gruppenvergleich
nach Dunn's Multiple Comparison-Test.
Kruskal-Wallis-Test
p-Wert
p < 0,05?
H-Wert (Kruskal-Wallis statistic)
0,2881
3,764
Dunn's Multiple Comparison-Test
p < 0,05?
CD161 wird hauptsächlich von NK-Zellen exprimiert, aber auch von T-Lymphozyten
und Gedächtniszellen.
Während die Prozentwerte der gesunden Panel-Gruppe bei einer starken Streuung (mit
drei Werteakkumulationen) im Bereich zwischen 10,25 – 42,38% liegen, befinden sich
im Vergleich dazu auch die Werte der anderen drei Gruppen zum großen Teil in
diesem Bereich oder aber darunter. Betrachtet man speziell die Mediane der vier
Gruppen, so fällt auf, dass die Panel-Gruppe den höchsten Median-Wert aufweist,
Ergebnisse
62
während die Mediane der restlichen Gruppen um ca. 50% darunterliegen. Bei einem pWert = 0,2881 kann man jedoch nicht von wesentlichen Unterschieden sprechen.
63
Prozentwert der gegateten =
CD244-exprimierenden Zellen
Ergebnisse
3.2.2.7
CD244 (Cytotox)
Abbildung 27 CD244 (CD = Cluster of Differentiation): Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten aus der Blutprobenanalyse: xAchse:
Patienten-Gruppeneinteilung
nach
Haupt-Diagnose
(Panel
[=gesund],
HLH
[=Hämophagozytische
Lymphohistiozytose], Sepsis, Tumor); horizontale Balken: oberer Balken = 75% Percentile, mittlerer Balken = Median, unterer
Balken = 25% Percentile; y-Achse: Prozentwert der gegateten [= CD244-exprimierenden] Zellen
Tabelle 24: Ergebnisse nach Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests sowie des Dunn’s Multiple Comparison-Tests für CD244
(CD = Cluster of Differentiation) unter Angabe des analysierten p-Wertes inkl. Eruierung des Signifikanzniveaus unter Angabe
des H-Wertes dargestellt. Abschließend erfolgt die Auflistung deutlicher Unterschiede (wenn p < 0,05) beim Gruppenvergleich
nach Dunn's Multiple Comparison-Test.
Kruskal-Wallis-Test
p-Wert
p < 0,05?
H-Wert (Kruskal-Wallis statistic)
0,9798
0,1859
Dunn's Multiple Comparison-Test
p < 0,05?
CD244 wird u.a. auf der Oberfläche von ruhenden sowie aktivierten NK-Zellen
exprimiert und spielt eine Rolle in der nicht-MHC-gebundenen zytotoxischen
Aktivität.
Bei unseren Untersuchungen fanden wir in der Panel-Gruppe Prozentwerte zwischen
13,83 - 47,18%. Während in der Tumorgruppe lediglich zwei Werte darunter liegen,
sind im Vergleich zur Panel-Gruppe in allen drei Gruppen 1-4 Werte zu finden, welche
Ergebnisse
64
über dem Panel-Maximalwert liegen. Die Analyse ergab keine bedeutsamen
Unterschieden (p = 0,9798).
65
Prozentwert der gegateten =
IL-7R-exprimierenden Zellen
Ergebnisse
3.2.2.8
IL-7R
Abbildung 28 IL-7R (Interleukin-7-Rezeptor): Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten aus der Blutprobenanalyse: x-Achse:
Patienten-Gruppeneinteilung nach Haupt-Diagnose (Panel [=gesund], HLH [=Hämophagozytische Lymphohistiozytose],
Sepsis, Tumor); horizontale Balken: oberer Balken = 75% Percentile, mittlerer Balken = Median, unterer Balken = 25%
Percentile; y-Achse: Prozentwert der gegateten [= IL-7R-exprimierenden] Zellen
Tabelle 25: Ergebnisse nach Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests sowie des Dunn’s Multiple Comparison-Tests für IL-7R
(Interleukin-7-Rezeptor) unter Angabe des analysierten p-Wertes inkl. Eruierung des Signifikanzniveaus unter Angabe des HWertes dargestellt. Abschließend erfolgt die Auflistung deutlicher Unterschiede (wenn p < 0,05) beim Gruppenvergleich nach
Dunn's Multiple Comparison-Test.
Kruskal-Wallis-Test
p-Wert
p < 0,05?
H-Wert (Kruskal-Wallis statistic)
0,9614
0,2926
Dunn's Multiple Comparison-Test
p < 0,05?
IL-7R-Expression konnte bislang auf humanen T-Zelllinien und Makrophagen
beobachtet werden, wobei sie während der T-Zell-Differenzierung und -Aktivierung
reguliert wird. IL-7R ist folglich auch interessant in Bezug auf NK-T-Zellen.
Betrachtet man die Panel-Gruppe, so finden sich bei einer starken Streuung Messwerte
zwischen 0,31 – 71,79%. Auch die Messwerte der anderen drei Gruppen befinden sich
Ergebnisse
66
in dieser Spannbreite – die HLH- und Sepsis-Gruppe mit einer ebenso starken
Streuung, während die Tumor-Gruppen-Messwerte sich (bis auf 3 darüberliegende
Werte) vorwiegend in einem Bereich zwischen 12 – 34% konzentrieren. Es fällt auf,
dass sich in der Panel- sowie in der HLH-Gruppe ein mittlerer Bereich ohne Werte
findet.
Der ermittelte p-Wert = 0,9614 bestätigt das Ausbleiben bedeutsamer Unterschiede in
dieser Messreihe.
67
Prozentwert der gegateten =
IL-17R-exprimierenden Zellen
Ergebnisse
3.2.2.9
IL-17R
Abbildung 29 IL-17R (Interleukin-17-Rezeptor): Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten aus der Blutprobenanalyse: x-Achse:
Patienten-Gruppeneinteilung nach Haupt-Diagnose (Panel [=gesund], HLH [=Hämophagozytische Lymphohistiozytose],
Sepsis, Tumor); horizontale Balken: oberer Balken = 75% Percentile, mittlerer Balken = Median, unterer Balken = 25%
Percentile; y-Achse: Prozentwert der gegateten [= IL-17R-exprimierenden] Zellen
Tabelle 26: Ergebnisse nach Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests sowie des Dunn’s Multiple Comparison-Tests für IL-17R
(Interleukin-17-Rezeptor) unter Angabe des analysierten p-Wertes inkl. Eruierung des Signifikanzniveaus unter Angabe des HWertes dargestellt. Abschließend erfolgt die Auflistung deutlicher Unterschiede (wenn p < 0,05) beim Gruppenvergleich nach
Dunn's Multiple Comparison-Test.
Kruskal-Wallis-Test
p-Wert
p < 0,05?
H-Wert (Kruskal-Wallis statistic)
Dunn's Multiple Comparison-Test
p < 0,05?
Panel vs Sepsis
Sepsis vs Tumor
0,0073
Ja
12,04
* Ja
* Ja
Binden IL-17A und IL-17F an den IL-17-Rezeptor, so führen entscheidende
Signalwege zur Immunreaktion gegen extrazelluläre Bakterien, indem gewisse
Chemokin-Gradienten und folglich die neutrophile Emigration in infizierte
Gewebebereiche sowie die Granulopoiese reguliert werden.
Ergebnisse
68
Die Messwerte der Panel-Gruppe befinden sich in einem Bereich zwischen 0,88 –
14,17%. Mit +/- 2-3% befinden sich auch die Messwerte der HLH- und TumorGruppe in diesem Bereich, während deren Mediane sehr nahe bei dem der PanelGruppe liegen. Im Gegensatz dazu hebt sich die Sepsis-Gruppe nicht nur durch einen
deutlich erhöhten Median-Wert gegenüber der Panel- und der Tumor-Gruppe ab (p =
*0,0073), sondern sie weist darüber hinaus auch die breiteste Streuung der
Einzelmesswerte innerhalb der Gruppe auf.
69
Prozentwert der gegateten =
Vα24-exprimierenden Zellen
Ergebnisse
3.2.2.10
Vα24
Abbildung 30 Vα24: Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten aus der Blutprobenanalyse: x-Achse: Patienten-Gruppeneinteilung
nach Haupt-Diagnose (Panel [=gesund], HLH [=Hämophagozytische Lymphohistiozytose], Sepsis, Tumor); horizontale
Balken: oberer Balken = 75% Percentile, mittlerer Balken = Median, unterer Balken = 25% Percentile; y-Achse: Prozentwert der
gegateten [= Vα24-exprimierenden] Zellen
Tabelle 27: Ergebnisse nach Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests sowie des Dunn’s Multiple Comparison-Tests für Vα24
unter Angabe des analysierten p-Wertes inkl. Eruierung des Signifikanzniveaus unter Angabe des H-Wertes dargestellt.
Abschließend erfolgt die Auflistung deutlicher Unterschiede (wenn p < 0,05) beim Gruppenvergleich nach Dunn's Multiple
Comparison-Test.
Kruskal-Wallis-Test
p-Wert
p < 0,05?
H-Wert (Kruskal-Wallis statistic)
0,0900
6,491
Dunn's Multiple Comparison-Test
p < 0,05?
Vα24 wird von NKT-Zellen mit monomorphem T-Zellrezeptor exprimiert.
Während sich die Messwerte der Panel-Gruppe im Bereich zwischen 0,08 – 0,75%
befinden, so weisen die anderen drei Gruppen bei einer vergleichsweise breiteren
Streuung durchaus auch Werte >1% auf, wobei die Sepsis-Gruppe mit ihrem MaximalWert von 3,23% die obere Messwert-Grenze angibt.
Ergebnisse
70
Insgesamt variieren die Mediane der vier Gruppen bei einem p-Wert von 0,0900 hier
mit tendenziell leichten Unterschieden in Richtung erhöhte Werte im Krankheitsfall.
Ergebnisse
3.3
71
Zusammenfassung der Ergebnisse
Für die vorliegende Arbeit konnten die Messwerte von 51 Patienten zur Auswertung
herangezogen werden. Die Patienten wurden dafür diagnosespezifisch in die vier
Gruppen „Panel“ (gesunde Kontrollgruppe), „HLH“, „Sepsis“ und „Tumor“
eingeteilt.
Im
Zuge
der
Immunphänotypisierung
wurden
zellspezifisch
Oberflächenmarker analysiert und statistisch getestet. Für die gleichzeitige
nichtparametrische Testung aller vier Gruppen fand der Kruskal-Wallis-Test in
Verbindung mit Dunn’s post test (Dunn's Multiple Comparison-Test) Anwendung.
Für die PMN-Zellpopulation ergaben sich dabei bedeutsame Unterschiede mit pWerten < 0,05 für
- CD64: Bei den „Gated“-Werten weist die Sepsis-Gruppe im Vergleich zur Panelund Tumorgruppe bei p < 0,0001 einen annähernd 5-fach erhöhten Median auf.
Bei Betrachtung der „Mean“-Werte liegen bedeutsam erhöhte Werte bei p =
0,0005 in der Sepsis- und der Tumor-Gruppe im Vergleich zur Panel-Gruppe
vor.
- CD39: Mit einem p-Wert = 0,0201 unterscheidet sich hauptsächlich die SepsisGruppe von der Panel-Gruppe bei Betrachtung der „Gated“-Werte durch einen
ca. 7fach erhöhten Median.
- IL-7R: Bei den „Mean“-Werten zeigt die Tumor-Gruppe im Vergleich zur Panelund Sepsis-Gruppe den stärksten Unterschied mit p = 0,0025 auf.
- IL-17R: Der „Gated“-p-Wert = 0,0164 macht einen Unterschied zwischen der
Sepsis- und der Tumorgruppe mit einem tendenziell erhöhten Sepsis-Median
deutlich (wobei die Panel-Gruppe zwar einen niedrigeren Median im Vergleich
zur Tumor-Gruppe aufweist, aber dafür einen höheren Mean). Bei der „Mean“Werte-Analyse kristallisiert sich der Unterschied zwischen der Tumor- und der
Panel-Gruppe bei einem p-Wert = 0,0106 klar heraus.
- TLR-2: Mit deutlich erhöhten Werten setzt sich die Tumor-Gruppe von der
Panel-Gruppe sowohl im „Gated“- als auch im „Mean“-Werte-Bereich mit pWerten von 0,0173 (Gated) bzw. 0,0002 (Mean) ab.
Ergebnisse
72
- TLR-4: Die Tumor-Gruppe fällt im „Mean“-Werte-Bereich mit tendenziell
erhöhten Werten verglichen mit der Panel-Gruppe bei einem p-Wert = 0,0121
auf.
Ein weiterer Hinweis auf Unterschiede innerhalb der untersuchten Gruppen bei p <
0,15 findet sich bei
- IL-7R: Bei Betrachtung der „Gated“-Messwerte fallen bei einem p-Wert =
0,0784 erhöhte Werte in der Sepsis- und auch Panel-Gruppe im Vergleich zur
Tumor- und HLH-Gruppe ins Auge.
Innerhalb der NK-Zellpopulation fallen bei Betrachtung der „Gated“-Werte deutliche
Unterschiede mit p < 0,05 auf für
- CD16: Mit deutlich erhöhten Werten und der breitesten Streuung hebt sich die
Sepsis-Gruppe mit p= 0,0117 vor allem von der Tumor-Gruppe ab.
- CD69: Während im Vergleich zur Panel-Gruppe alle drei restlichen Gruppen
erhöhte Werte aufweisen, sticht die Sepsis-Gruppe mit den höchsten Werten bei
einem p-Wert = 0,0002 im Vergleich zur Panel-Gruppe heraus.
- IL-17R: Bei einem p-Wert = 0,0073 hebt sich wiederum die Sepsis-Gruppe von
der Panel- und der Tumor-Gruppe mit erhöhten Werten ab.
Tendenz zu erhöhten Werten bei p < 0,15 findet sich auch bei
- Vα24: Der p-Wert = 0,0900 steht für erhöhte Werte – neben der HLH- und
Tumor-Gruppe - vor allem in der Sepsis-Gruppe im Vergleich zur Panel-Gruppe.
73 Diskussion
4
Diskussion
4.1
Methodische Aspekte
4.1.1
Statistik
Die für die vorliegende Arbeit bearbeiteten und untersuchten Patientenproben wurden
der Abteilung „Experimentelle Anästhesie Ulm“ von verschiedensten Kliniken bzw.
Behandlern zugesandt, um einer Immunphänotypisierung unterzogen zu werden. Nach
erfolgreicher Bearbeitung konnten schließlich 51 Blutprobensätze in die Bewertung
miteinbezogen werden. Da keine Alters-/Geschlechtslimitationen gesetzt wurden,
sondern nur diagnosenabhängig selektiert wurde, kann ein eventueller Selektionseffekt
nach Patientenalter, Geschlecht oder anderen Faktoren nicht ausgeschlossen werden.
Nach der Einteilung in diagnosespezifische Gruppen ergaben sich zwar relativ kleine
Stichprobenumfänge, welche allerdings hinsichtlich der Anzahl für eine explorative
Datenanalyse ausreichend waren. Auf die Anwendung exakter Tests konnte insofern
verzichtet werden, als die Analyse nicht auf beweisende statistische Auswertung abzielt.
Da bei kleinen Stichprobenumfängen Zufallsvariablen wie z.B. die Varianz oder
Verteilung in der Regel nicht bekannt sind, haben in der vorliegenden Arbeit nichtparametrische Testverfahren Anwendung gefunden. Sie beruhen im Gegensatz zu
parametrischen Tests wie z.B. dem t-Test (Lagetest zum Nachweis statistischer
Unterschiede zwischen max. 2 unterschiedlichen Stichproben: Zur Überprüfung
bestimmter Erwartungswerte bei bekannten Zufallsvariablen; gestützt auf strenge
Voraussetzungen; mit entsprechend großer Aussagekraft) auf dem RangsummenPrinzip. Bei dieser Art von Test wird keine Normalverteilung vorausgesetzt. Die
absoluten Werte werden hierbei charakteristischerweise durch Rangzahlen ersetzt,
welche schließlich basierend auf der Bildung der Rangsummen zur Errechnung der
Teststatistik herangezogen werden: Folglich werden nur die Ränge der Daten analysiert
und nicht die Originalwerte – eine Datenmanipulation bleibt hierbei ohne Folge,
solange sich dadurch die Rangfolge nicht verändert. Indem nun allerdings die
absoluten Beobachtungswerte selber nicht verwendet sondern durch die Rangzahlen
ersetzt werden, besteht die Gefahr, dass die gesamten Informationen der Daten nicht
vollständig ausgenutzt werden. Ein Rangsummentest besitzt folglich eine geringere
Diskussion
74
Testpower. Es besteht damit die Möglichkeit, dass eine doch bestehende Differenz
durch
einen
solchen
Rangsummentest
gegebenenfalls
verkannt
und
damit
fälschlicherweise die Nullhypothese (d.h. es gibt keine Unterschiede) angenommen
wird. In der Regel kommt dies aber nur vor, wenn ein Rangsummentest trotz
gegebener Voraussetzungen für einen t-Test angewendet wird - was bei den in dieser
Arbeit bearbeiteten Daten nicht der Fall ist.
Durch die Anwendung nicht-parametrischer Testverfahren bei kleinen Stichproben mit
Bewertung von Rangzahlen anstelle der Beobachtungswerte sinkt darüber hinaus auch
die Gefahr, dass die Ergebnisse bei Testung auf Signifikanz bzw. bedeutsame
Tendenzen durch extrem hohe oder niedrige Werte (= Ausreißer) verzerrt werden. So
genannte Ausreißer können dabei in Mess- oder Dokumentationsfehler oder aber auch
in besonderen pathologischen Patientenhintergründen begründet sein (Trampisch u. a.,
2000). Da die einzelnen Patientendaten unter strenger Einhaltung der Anonymität
behandelt wurden, können Vermutungen hinsichtlich besonderer pathologischer
Hintergründe klinisch nicht abgesichert werden. Auch Daten von Patienten, die
mehrmals als Ausreißerdaten auffielen (z.B. Patient 10342), konnten im weiteren
Verlauf nicht für sämtliche gemessenen Parameter ausgeschlossen werden. Zunächst
auffällige Werte eines Patienten wurden somit erst nach genauer Betrachtung der
Gesamtsituation zur Testung nach Grubb herangezogen – Ausreißersignifikanzen
konnten sodann durch den Grubb's Test untermauert werden. Eine isolierte Anwendung
des Ausreißertests ohne vorherige Beurteilung auffälliger Messwerte würde indes das
Risiko bergen, dass zu viele Werte zu Ausreißer erklärt würden.
4.1.2
Überlegungen zur experimentellen Methodik
In Zeiten fortschrittlicher Forschungsmethoden konnte das komplexe menschliche
Abwehrsystem bereits gut beleuchtet werden. Als hilfreich für zukunftsweisende
Untersuchungen kann unter anderem die Immunphänotypisierung gelten: Dieses
Verfahren macht es mittels monoklonaler Antikörper möglich, die Antigenexpression
bestimmter
Zellen
nachzuweisen.
Somit
lassen
sich
Rückschlüsse
auf
Zelllinienzugehörigkeit, Differenzierungsgrad der Zellen oder einen bestimmten Typ
ziehen. Besonderes Interesse galt in dieser Arbeit der Analyse bestimmter
Diskussion
75
krankheitsspezifischer Oberflächenmarker auf PMN, NK- und NK-T-Zellen, welche
gesunden Vergleichspersonen gegenübergestellt werden sollten.
Als Angehörige des angeborenen bzw. unspezifischen Immunsystems stehen PMN
und NK-Zellen an unmittelbarer Front der Abwehr. Mithilfe spezieller Rezeptoren
sind sie in der Lage, körperfremde Mikroorganismen bzw. auch körpereigene Proteine
und Strukturen, welche Gefahr für den Organismus bedeuten könnten, zu
identifizieren, um im weiteren Verlauf eine Abwehrreaktion zu beginnen bzw.
einzuleiten.
In diesem Zusammenhang ist mittels der Immunphänotypisierung eine genauere
Untersuchung der spezifischen Oberflächenrezeptoren auf PMN und NK-(T)-Zellen
vor allem bei immuninkompetenten Patienten (z.B. Patienten mit HLH, Sepsis oder
Tumoren) interessant, um deren Rolle genauer kennenlernen zu können.
Die Möglichkeit der computerunterstützten Eingrenzung (Setzen der „Regions of
interest“, „gaten“) der zu untersuchenden Proben auf die gewünschte Zellart nach
Markierung der Zellen mittels spezifischer monoklonaler farbkonjugierter Antikörper
macht eine entsprechende Fokussierung durchführbar.
4.2
Inhaltliche Aspekte/Diskussion der Ergebnisse
Die Fragestellung dieser Arbeit beschäftigt sich mit Hinweisen auf Immunsuppression
durch spezifische Oberflächenrezeptoren bei HLH-, Sepsis- und Tumor-Patienten und
somit im weiteren Sinne damit, welche Rolle PMN und NK-(T-)Zellen hierbei spielen.
4.2.1
Beeinflussung der Immunantwort durch Oberflächenmarker
Neutrophile Granulozyten als Vertreter des angeborenen Abwehrsystems sind durch
ihre Fähigkeit, über Rezeptoren zwischen „Selbst“ und „Fremd“ zu differenzieren,
eine der wichtigsten Zellkomponenten in der ersten Abwehrfront. Von Makrophagen
sezernierte Zytokine wie IL-1 und TNF-α
sind für die Entwicklung sowie die
Chemotaxis der PMN essentiell. Am „Infektionsort“ angekommen, erfolgt die
Fremdkörper-Phagozytose sowie -Opsonierung, wofür spezifische Rezeptoren
erforderlich sind. Dabei ist die Phagozytose-induzierte Apoptose der PMN und das
nachfolgende „Aufräumen“ durch Makrophagen die Voraussetzung für die Behebung
einer Infekt-assoziierten Entzündung – erfolgt hingegen keine Apoptose der PMN, so
Diskussion
76
entsteht eine pathologische Situation: Eine unbegrenzte Freisetzung toxischer und
proteolytischer Substanzen durch (der Apoptose entgangene) PMN kann eine
Entzündungsreaktion aufrechterhalten und den Übergang von einem akuten zu einem
chronischen Geschehen begünstigen, wie z.B. die Entwicklung einer Sepsis, MultiOrganversagen oder lokale Gewebezerstörung (Wagner u. a., 2006).
NK-Zellen als eine Untergruppe der Lymphozyten gelten auch als Vertreter der
angeborenen Immunabwehr und nehmen an der frühen Abwehr versus intrazelluläre
Pathogene, Viren sowie Tumoren teil. Darüber hinaus bestehen Verbindungen
zwischen NK-Zellen und dem adaptiven Immunsystem durch Interaktionen mit DC
und T-Zellen. Somit spielen NK-Zellen eine große Rolle bei der Koordination der
adaptiven Immunität sowie der Regulierung des Immungleichgewichts. Neben
zytolytischen Funktionen produzieren NK-Zellen Zytokine und Chemokine (wie z.B.
TNF-α und IFN-γ), welche die zelluläre Resistenz gegenüber Infektionen fördern und
die adaptive Immunität beeinflussen können.
NK-(T-)Zellen exprimieren wie Granulozyten diverse Rezeptoren, welche an der
Regulierung von Effektor-Funktionen teilhaben. Sie können aktivierend sowie
inhibitorisch aktiv sein.
Im Folgenden werden die spezifischen Oberflächenrezeptoren einzeln diskutiert:
4.2.1.1
CD64 (FCGR1)
CD64 wird IFN-γ-abhängig auf PMN exprimiert: Als Aktivierungsmarker bindet
CD64 mit hoher Affinität IgG und induziert im weiteren Verlauf die Phagozytose von
IgG-Antigen-Komplexen. Darüber hinaus dient CD64 der Antigenpräsentation für TZellen und löst die Freisetzung von weiteren Zytokinen und reaktiven O2-Mediatoren
einschließlich IL-1, IL-6 und TNF-α aus, was insgesamt gesehen die Immunantwort
ankurbelt (Buckle und Hogg, 1989; Qureshi u. a., 2001).
Wir konnten in unseren Untersuchungen Bezug nehmend auf CD64 im Vergleich zur
gesunden Panel-Gruppe erhöhte Werte vor allem mit Blick auf die Anzahl CD64positiver Zellen in der Sepsis-Gruppe feststellen. Darüber hinaus kann auch bei HLH(und anteilweise bei Tumor-) Patienten durchaus ein erhöhter Anteil CD64-positiver
Diskussion
77
PMN beobachtet werden. Speziell innerhalb der Tumor-Gruppe scheint es zwei Lager
zu geben: Hier kann der Medianwert nicht als aussagekräftig gewertet werden, da es
offensichtlich zwei Zellakkumulationen gibt (eine Ansammlung mit hohen Werten und
eine Ansammlung mit niedrigeren Werten).
Aber auch hinsichtlich der Expressionsdichte gibt es Unterschiede zwischen den
Krankheits-Gruppen und der Panel-Gruppe. Was die Expressionsdichte auf den PMN
anbelangt, so kann zwar bei allen drei Krankheits-Gruppen ein verstärktes CD64Aufkommen auf den Zellen konstatiert werden. Allerdings finden sich hier vielfach
erhöhte Maximalwerte bzw. annähernd dreifach erhöhte Mediane, wiederum mit
Fokus auf der Sepsis-Gruppe, dicht gefolgt von der Tumor-Gruppe. Bei beiden
Gruppen fallen extrem hohe Werte auf: In der Sepsis-Gruppe handelt es sich bei den
zwei Maximalwerten um Patienten mit einem septischen Schock. In der TumorGruppe ist bei zwei von vier Maximalwerten die Zusatzdiagnose MAS bekannt.
Qureshi et al. fanden zum Thema „septischer Formenkreis“ bereits heraus, dass der
Anteil der CD64-exprimierenden PMN vor allem bei Patienten mit dem systemic
inflammatory response syndrome (SIRS) gegenüber Gesunden erhöht ist. Auch hinsichtlich
der Expressionsdichte auf den PMN konnten bei SIRS-Patienten stark erhöhte Werte
beobachtet werden - insbesondere bei zusätzlichem Auftreten einer Sepsis (Qureshi u.
a., 2001).
Ferner konnten Wagner et al. eine Hochregulierung des aktivierungsassoziierten
Oberflächenrezeptors im Zuge bakterieller Infektionen beobachten. In dieser
Untersuchung wurde bereits konsequenterweise die Frage gestellt, warum trotz der
Anwesenheit hoch aktivierter PMN die Infektion persisitiert (Wagner u. a., 2006).
4.2.1.2
CD16 (FCGR3)
Durch CD16, das u.a. bei NK-Zellen und Granulozyten zu finden ist, kommt es neben
der Zuständigkeit für die ADCC bei NK-Zellen zur Antikörper-abhängigen
Stimulation von T-Zellen und damit zur Phagozytose opsonierter Bakterien. Darüber
hinaus hat CD16 auch Bedeutung für die Einleitung des Zelltodes.
Während Emminger et al. bei HLH-Patienten eine chronische Expansion
CD14dim/CD16bright inflammatorischer Monozyten (produzieren inflammatorische
Diskussion
78
Zytokine wie IL-1, IL-6 und TNF-α) entdeckten und aufgrund dessen die Annahme in
den Raum stellten, dass diese Monozyten den Entzündungsgrad in dieser seltenen und
tödlichen Krankheit repräsentieren (Emminger u. a., 2001), können wir eine mit Bezug
auf andere Zellpopulationen erhöhte Anzahl CD16-exprimierender NK-Zellen sowohl
in der HLH-Gruppe als auch in deutlicherem Maße in der Sepsis-Gruppe feststellen –
vor allem in Gegenüberstellung zur Tumor-Gruppe, welche im Vergleich der vier
Testgruppen mit niedrigeren Messwerten auffällt.
Bei den Granulozyten lassen sich in unseren Untersuchungen hinsichtlich der CD16Expressionsdichte keine Besonderheiten bei der Betrachtung der Medianwerte in den
drei Krankheitsgruppen im Vergleich zur Panel-Gruppe feststellen. Jedoch fällt eine
Werte-Zweiteilung sowohl in der Panel- als auch in der HLH-Gruppe auf.
Interessanterweise bestand bei zwei der drei HLH-Patienten mit den hohen Werten
der Verdacht auf eine zusätzliche unklare Infektion, während in der Panel-Gruppe die
zwiespältigen Werte bislang nicht erklärbar sind.
4.2.1.3
CD39 (NTPDase-1)
CD39 hydrolysiert extrazellulär Nukleotide - v.a. ATP/ADP
zu AMP – und
verhindert so inflammatorische Prozesse sowie (v.a. als „soluble CD39“) die ADPinduzierte Thrombozytenaggregation: Auf Gefäß-Schädigung hin oder z.B. durch LPS
ausgelöst, setzen Endothelzellen nämlich ATP und ADP frei, welche P2X- sowie P2YRezeptoren aktivieren, was schließlich zu pro-inflammatorischen, apoptotischen sowie
thrombotischen Veränderungen führt (Pulte u. a., 2007; Atkinson u. a., 2006).
Dieses CD39-Verständnis im protektiven Sinne passt durchaus zu unseren
Granulozyten-Untersuchungen: Deutliche Tendenz zu erhöhten Werten können vor
allem beim Vergleich der Sepsis-Gruppe mit der Panel-Gruppe beobachtet werden.
Aber auch die HLH- sowie die Tumor-Gruppe weisen vergleichsweise erhöhte Werte
auf. Eine zweischichtige Zellakkumulation in der Sepsis-Gruppe korreliert mit den
dazugehörigen Diagnosen: Die hohen Werte wurden bei Patienten mit Sepsis bzw.
septischem Schock festgestellt - die niedrigeren bei Patienten mit SIRS bzw.
beginnender Sepsis.
Diskussion
79
Es handelt sich bei CD39 um einen anti-inflammatorischen = protektiven Marker,
welcher in inflammatorischen Zuständen verstärkt in Aktion tritt. Der Anspruch, als
protektiver Marker angesehen zu werden, kann auch durch andere Untersuchungen
bestätigt werden: Lösliches CD39 reduziert ATP- und Ischämie-induzierte
Noradrenalin-Freisetzung im Herzen, womit fatale Arrhythmien verhindert werden.
Und nicht zuletzt hat die ATP-Metabolisierung durch CD39 im Nervensystem
Auswirkungen auf die Regulation der purinergischen Übertragungswege. Marcus et al.
beschreiben CD39 demzufolge nicht zuletzt als Repräsentant der nächsten Generation
cardio- und cerebroprotektiver Moleküle (Marcus u. a., 2005).
4.2.1.4
HLA-DR
Die HLA-DR-Expression auf Monozyten ist essenziell für die Aufbereitung und
Präsentation von Peptiden, welche von phagozytierten Mikroben stammen: Die HLADR-Funktion besteht darin, CD4+Zellen aufbereitete Antigene zu präsentieren und
folglich die T-Zell-spezifische Immunantwort zu initiieren. Für die vorliegende
Untersuchung spielt die Betrachtung von HLA-DR insofern eine Rolle, als dass es
durch seinen Zusammenhang mit GM-CSF gegebenenfalls Aufschluss im Sinne einer
Linksverschiebung im Granulozyten-Fenster geben kann – erniedrigte GM-CSF-Werte
korrelieren wohl mit beeinträchtigter Monozytenfunktion sowie mit verschlechterter
Prognose (vgl. unten).
Wir konnten in unserer Untersuchung im Vergleich zur Panel-Gruppe weder eine
verringerte
Anzahl
HLA-DR-exprimierender
Zellen
noch
eine
niedrigere
Expressionsdichte in der Sepsis-Gruppe sowie auch in den anderen zwei
Krankheitsgruppen konstatieren. Eher waren die Werte aller drei Krankheitsgruppen
erhöht, wobei jedoch nach statistischer Auswertung keine bedeutenden Hinweise auf
große Unterschiede resultierten. Die isoliert stehenden einzelnen Maximalwerte sind
allerdings unerklärbar, da es keine Auffälligkeiten hinsichtlich der Diagnose der
betroffenen
Patienten
gibt.
Hinweise
auf
veränderte
(erhöhte)
HLA-DR-
Expressionsdichte trotz Krankheit kann der Ansatz der Universität Greifswald geben,
wonach bekannt ist, dass ab einer Dauer von ca. 2 h nach der Blutabnahme regelmäßig
eine leichte, aber kontinuierliche Zunahme der Expressionsdichte beginnt, die durch
Diskussion
80
Kühlung zwar vermindert, aber nicht völlig blockiert werden kann. Da die Blutproben
teilweise auf dem Postweg zur Untersuchung eingesandt wurden, konnte diese 2h-Frist
für unsere Analysen nicht eingehalten werden. In diesem Sinne kann vielmehr davon
ausgegangen werden, dass erhöhte Messwerte in den Krankheitsgruppen tatsächlich
doch eher niedriger ausfallen würden.
In einigen Studien wurden Forschungen dahingehend angestellt, ob die HLAExpression durch Monozyten als prognostischer Marker bei Sepsis-Patienten
angesehen werden kann, wobei in manchen Studien eine verminderte Expression von
≤30% HLA-DR assoziiert wurde mit hoher Mortalität (Volk u. a., 1991; Döcke u. a.,
1997). Perry et al. konnten dieses Resultat in ihrer Studie 2003 allerdings nicht
bestätigen (Perry u. a., 2003). Es besteht hingegen die Möglichkeit, dass eine
verminderte Monozyten-HLA-DR-Expression mit der CARS-Phase assoziiert werden
könnte (Lechner u. a., 1994). In ihrer Studie beleuchteten Perry et al. darüber hinaus
den Aspekt, dass GM-CSF (ein Zytokin, das von Monozyten sezerniert wird) für die
Hochregulierung von HLA-DR zuständig sein könnte: Die CARS-Phase von SepsisMonozyten kann refraktär gegenüber proinflammatorischen Zytokinen sein - GM-CSF
hingegen kann das Aktivierungspotential von Monozyten wiederherstellen. In diesem
Zusammenhang konnte bereits gezeigt werden, dass Patienten mit einer schlechten
Prognose ein Defizit an zirkulierendem GM-CSF aufweisen (Perry u. a., 2002).
4.2.1.5
IL-7R
IL-7R-Expression konnte auf humanen T-Zelllinien und Makrophagen beobachtet
werden, wobei sie während der T-Zell-Differenzierung und -Aktivierung reguliert wird:
Bindet
der
Ligand
an
den
Rezeptor,
wird
die
Oberflächen-Expression
herunterreguliert. Die Bindung von IL-7 an den IL-7R führt schließlich zur T-ZellProliferation sowie Zell-Aktivierung und hat anti-apoptotische Wirkung (Beq u. a.,
2004). IL-7 ist demnach neben der Reifung entscheidend für das Überleben naiver TZellen und trägt so zum selbstregulierten Zirkulieren von naiven und Gedächtnis-TZellen bei (Fry u. a., 2005).
Das besondere Interesse gilt in dieser Arbeit der Betrachtung der IL-7R-Expression
auf NK-(T-)Zellen: Bei Betrachtung des Lymphozytenfensters mit nachfolgendem
Diskussion
81
Gruppenvergleich
können
wir
statistisch
keine
bedeutsamen
Unterschiede
konstatieren, da in jeder der einzelnen Gruppen eine relativ ähnlich starke Streuung
vorzufinden ist. Prinzipiell liegen zwar die Mediane in den Krankheitsgruppen
verglichen mit der Panel-Gruppe höher (wobei vor allem in der Tumorgruppe keine
Werte unter 12% zu finden sind). Jedoch finden sich - die Tumor-Gruppe
ausgenommen - in den restlichen 3 Gruppen jeweils zwei offensichtliche WerteGruppierungen (niedrige und hohe Werte). Dies reduziert die Gewichtung der
Medianwerte.
Was die genauere Betrachtung der Granulozytenpopulation anbelangt, so kann man in
der Tumor- sowie der HLH-Gruppe zwar eine geringere Anzahl IL-7R-exprimierender
Granulozyten vorfinden (die starke Streuung der Werte in der Panel-Gruppe könnte
auf typisch saisonale/winterliche Krankheitserscheinungen zurückzuführen sein, wobei
bei der Blutabnahme darauf geachtet wurde, dass zu diesem Zeitpunkt keine
merklichen Krankheitszustände herrschten), dafür ist aber die Expressionsdichte von
IL-7R in diesen beiden Gruppen – statistisch bedeutsam vor allem bei Betrachtung des
Median-Wertes der Tumor-Gruppe - erhöht. Wiederum bestehen einzelne deutlich
höhere Werte in allen Gruppen, welche den jeweiligen Medianwert verzerren. Da
jedoch in allen Gruppen 1 – max. 3 Werte betroffen sind, lassen sich die Ergebnisse
dennoch gleichgewichtig beurteilen.
Diese Ergebnisse lassen erkennen, dass die Rolle von IL-7R, wie bereits
wissenschaftlich bekannt, eher in der gesamten Immunabwehr gewichtet: IL-7R kann
als Krankheits-Marker sicherlich Aufschlüsse geben, was auch Gregory et al. bereits im
Jahre 2007 herausfanden: In ihrer Studie stellten sie fest, dass eine signifikante
Assoziation
zwischen
einem
Single-Nucleotide-Polymorphismus
(SNP)
in
der
transmembranären Domäne des IL-7R-Gens und einem erhöhten Risiko, an Multipler
Sklerose zu erkranken, besteht. Fazit: Ein reduzierter IL-7R-Anteil könnte mit AI
zusammenhängen (Gregory u. a., 2007), was zum derzeitigen Kenntnisstand
hinsichtlich dieses Oberflächenmarkers passt.
Schließlich konnte wissenschaftlich belegt werden, dass im Zuge des Rezeptor„Sharings“
IL-7R’s
γc-Kette
neben
IL-7
auch
IL-2
(hämatopoetischer
Wachstumsfaktor), IL-4 (anti-inflammatorisches Zytokin; stimuliert B-Zell-Antwort),
IL-9 (Apoptose-hemmend; stimuliert Zell-Proliferation), IL-15 (NK-Zell-Proliferation)
Diskussion
82
und IL-21 (Proliferation zytotoxischer Zellen) dient. Treten Mutationen in der γcKette auf, so kann dies zu massiv verminderter zellulärer und humoraler Immunität
mit reduzierter Anzahl peripherer T- sowie normaler Anzahl von NK-Zellen führen einer Form eines schweren, kombinierten Immundefekts (SCID = Severe Combined
ImmunoDefect) (Chapel u. a., 2003).
4.2.1.6
IL-17R
Strukturell weisen IL-17 und sein Rezeptor (IL-17R) wenig Ähnlichkeit im Vergleich
zu anderen gut erforschten Zytokin-Familien auf (Yao u. a., 1997). In Kulturversuchen
verhält sich IL-17 dabei ziemlich ähnlich wie TNF-α und IL-1β: Sie triggern die HochRegulierung von zum Teil identischen Transkriptionsfaktoren und nützen ähnliche
Signalwege. Jedoch – im Gegensatz zu TNF-α und IL1-β - wird IL-17 vorwiegend von
T-Zellen – aber auch von NK-T-Zellen (Coquet u. a., 2008) – produziert.
Bestätigend zur Literatur haben unsere Untersuchungen - bei tendenziell erhöhten
(Median-) Werten in allen Krankheits-Gruppen - eine deutlich erhöhte Anzahl IL-17Rexprimierender Lymphozyten sowie Granulozyten in der Sepsis-Gruppe ergeben,
wohingegen sich die Tumor-Gruppe hinsichtlich der IL-17R-Expressionsdichte auf
Granulozyten mit erhöhten Werten klar erkennbar (v.a. von der Panel-Gruppe) abhebt.
Betrachtet man das Granulozyten-Scatterdiagramm mit den „Gated“-Werten genauer,
so fallen zwei Werte-Akkumulationen (hohe Werte vs. niedrige Werte) innerhalb der
Tumor-Gruppe auf: Vier der sechs sehr niedrigen Werte gehören dabei zu Patienten
mit den Diagnosen „Glioblastom“ und „Prostata-CA“.
Bekanntermaßen bewirkt IL-23 eine IL-17-Expression bei einer einzigartigen CD4+TZell-Population, den sogenannten „TH17-Zellen“ (bei Mäusen wird die Entwicklung
von TH17-Zellen durch TGF-β und IL-6 gelenkt): TH17-Zellen produzieren neben
IL-17 auch IL-17F, TNF-α, Il-6, IL-22 und regulieren diverse Aspekte der
Inflammation und Autoimmunität (Yu u. a., 2007). IL-17 scheint somit ein Signal
(ausgehend vom adaptiven Immunsystem) zu sein, welches das angeborene
Immunsystem alarmiert, eine Inflammation zu verstärken und PMN zu mobilisieren.
IL-17 ist dabei in vielen autoimmunen und inflammatorischen Krankheitszuständen
erhöht, wie zum Beispiel bei der rheumatoiden/Kollagen-induzierten Arthritits,
Diskussion
83
Psoriasis, Multipler Sklerose, zystischer Fibrose, Morbus Crohn und hat zudem
negativen Einfluss auf bestimmte Infektionskrankheiten wie z.B. Helicobacter pylori
Infektionen. IL-17 ist aber auch wichtig für eine gesteigerte effektive Antwort auf viele
extrazelluläre Mikroben, v.a. durch Regulation der neutrophilen Migration und
Granulopoiese (Maitra u. a., 2007). So spielt IL-17 nicht nur eine pathogene Rolle bei
„sterilen“ inflammatorischen Umständen wie z.B. in der rheumatoiden Arthritisassoziierten Knochendestruktion, sondern hat auch einen Knochen-protektiven Effekt
bei bakteriellen Erkrankungen wie der Parodontitis: Besonders bei der Parodontitis
spielen PMN eine Abwehr-Schlüsselrolle. Menschen mit genetischen Defekten mit
Auswirkung auf
PMN-Chemotaxis oder –Adhäsion... etc. sind sehr anfällig für
Parodontitis und im weiteren Verlauf für frühzeitigen Zahnverlust, bedingt durch
Knochenverlust. Die duale und speziell bei bakteriellen Infektionen Knochenprotektive Rolle von IL-17 inklusive IL-17RA resultiert aus der IL-17-abhängigen
Regulierung der PMN während bakterieller Infektionen (Yu u. a., 2007).
4.2.1.7
TLR
TLR-2 und TLR-4 als wichtige Vertreter humaner TLRs werden auf der Zelloberfläche
von PMN beim Gesunden exprimiert und nach Stimulation durch LPS oder GM-CSF
hochreguliert.
Während TLR2 spezifisch mit Peptidoglykanen, Lipoteichonsäure von Gram-positiven
Bakterien und Lipoproteinen von Mykobakterien interagiert, erkennt TLR-4 LPS von
Gram-negativen Bakterien (Martins u. a., 2008).
Die Analyse unserer Granulozyten-Daten ergab bei Betrachtung von TLR-2 erhöhte
Werte hinsichtlich exprimierender Zell-Zahl sowie Expressionsdichte auf PMN in allen
drei Krankheitsgruppen verglichen zur Kontroll-Gruppe, wobei interessanterweise
speziell die Tumor-Gruppe mit tendenziell beachtlich erhöhten Werten im Vergleich
zur Kontroll-Gruppe hervorsticht.
Die Analyse von TLR-4 ergab hinsichtlich der exprimierenden Zellzahl keine
bedeutsamen Unterschiede im Gruppenvergleich. Hingegen fällt wiederum die TumorGruppe im Vergleich zur Kontroll-Gruppe mit beachtlich erhöhten Werten
hinsichtlich der TLR-4-Expressionsdichte auf.
Diskussion
84
Auch bei rein visueller Betrachtung des Lymphozyten-Fensters (ohne statistische
Analyse der Werte) können speziell in der Tumor-Gruppe erhöhte Anzahlen TLRexprimierender Zellen konstatiert werden, was mit Bezugnahme auf die bisherigen
Studienergebnisse darauf schließen lassen könnte, dass die Prognose dieser
Tumorpatienten entsprechend schlecht sein würde. Auf Anfrage bei den
Blutprobeneinsendern hin konnte diese Vermutung bestätigt werden.
Fokussiert man nämlich den Zusammenhang TLR-Tumorgeschehen, so bestehen
diverse Studien mit dem Ergebnis, dass TLR-vermittelte Inflammation durch
bakterielle oder virale Infektion eine Tumorentwicklung fördern kann: Paradoxerweise
geschieht dies über die Aktivierung des angeborenen Immunsystems (insbesondere
über den NF-κB-Signalweg) durch TLR-vermittelte Erkennung von Pathogenen abhängig vom Zytokinmilieu (stimuliert Rezeptorexpression) und dem Vorhandensein
bzw. Fehlen von Immunzellen (Wang u. a., 2008). Aber auch Antigen-unabhängige
Aktivierung einzelner TLR, welche virulente oder immuninvasive Mechanismen nicht
miteinbezieht, reicht aus, um Immunsuppression des angeborenen (NK-Zellen) sowie
adaptiven (T-Zellen) Immunsystems - assoziiert mit ζ-Ketten-Herunterregulierung
(und damit eingeschränkter T-Zell-Funktion) als Folge einer Akkumulation myeloider
Suppressor-Zellen (MSCs) – hervorzurufen. Dies wurde während chronischer
Infektionen, Krebs sowie autoimmuner Geschehnisse beobachtet (Vaknin u. a., 2008).
Härter et al. konnten in einer Studie nach ex vivo-Stimulation von PMN und
Monozyten bei Gesunden mit den für TLR-2 bzw. TLR-4-spezifischen Liganden
(MALP-2 bzw. LPS) weder einen Anstieg noch eine herabgesetzte TLR-Expression auf
PMN und Monozyten beobachten: Vorhergehender Kontakt alleinig mit Endotoxinen
– was speziell bei Sepsis-Patienten als fast gesichert angesehen werden kann – kann
nicht für eine Rezeptor-Hochregulierung verantwortlich sein. Härter et al. zeigten
darüber hinaus, dass TLR-2- sowie TLR-4-Expression auf frisch isolierten PMN bei
Sepsis-Patienten hochreguliert erschienen. Nicht nur dieses Ergebnis wird kontrovers
diskutiert. Es existieren dabei auch Unstimmigkeiten hinsichtlich reduzierter
Zytokinfreisetzung (v.a. TNF-α) bzw. leukozytärer Endotoxin-Toleranz aufgrund
TLR-Desensibilisierung (Lien u. a., 2002; Martins u. a., 2008; Härter u. a., 2004; Gao u.
a., 2008). Martins et al. konnten ihrerseits keine Unterschieden hinsichtlich der TLR-2Expression bei PMN beim Vergleich Kontroll- zur Sepsis-Patienten-Gruppe
Diskussion
85
(Patienten mit allen Formen des septischen Formenkreises) erkennen. Allerdings
konnten sie beim Einzelgruppen-Vergleich eine tendenziell erniedrigte TLR-2Expression in der Gruppe „Septischer Schock“ im Vergleich zur Kontrollgruppe,
Sepsis- sowie schwerer Sepsis-Gruppe aufzeigen – was auch zu unserer Analyse passt.
Die Analyse der TLR-4-Expression ergab keine Unterschiede beim Vergleich der vier
Gruppen (Martins u. a., 2008).
TLR im Allgemeinen sind für eine enorme Bandbreite infektiöser Mikroorganismen
zuständig, was im weiteren Verlauf zur Initiierung einer angeborenen Immunantwort
führt. Allerdings gibt es wohl einige infektiöse Organismen, welche Virulenzfaktoren
produzieren, die dieses Abwehrsystem spezifisch umgehen. Deshalb gilt das große
Interesse inhibitorischen Mitteln und Wegen, um eine exzessive inflammatorische
Immunantwort zu verhindern wie z.B beobachtet bei der schweren Sepsis, dem
septischen Schock oder beim Multiorganversagen. Derzeit scheint klinischer Erfolg auf
eine gesteigerte TLR-Antwort zurückzuführen zu sein, wie z.B. durch Vakzinierung
(Gao u. a., 2008).
4.2.1.8
CD56 (NCAM)
CD56 wurde immunhistologisch bei Thyreozyten entdeckt und wird gemäß der
Washington State University in vergleichsweise hohen Zahlen auf humanen NK-Zellen
exprimiert, daneben auch auf einer Untergruppe von CD4+ und CD8+ T-Zellen im
peripheren Blut, auf Nervenzellen im Cerebellum und Kortex sowie an
neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen, aber auch in typischerweise (sehr)
niedriger Anzahl auf Tumorzellen (Washington State University).
Da CD56 FITC (mehrfach konjugiert) speziell zelloberflächennahe NCAMs erkennt,
werden bei der Immunphänotypisierung im Lymphozytenfenster vor allem NK-Zellen
markiert: Sie besitzen nämlich nur sehr kurze NCAMs. CD56+CD161+ Zellen stehen
dabei für reife NK-Zellen. Dem bisherigen literarischen Erkenntnisstand entsprechend
konnten wir in unseren Untersuchungen mit nachfolgender statistischer Auswertung
eine schwache Tendenz zu eher niedrigeren exprimierenden Zellzahlen in der TumorGruppe im Vergleich zu den restlichen drei Gruppen aufzeigen. Insgesamt konnten
jedoch keine bedeutsamen Differenzen herauskristallisiert werden.
Diskussion
86
CD56PE (einfach konjugiert) erkennt im Gegensatz zu CD56FITC (mehrfach
konjugiert) in Verbindung mit CD3 NK-T-Zellen: In unseren Untersuchungen
konnten dabei keine Auffälligkeiten bei Betrachtung CD3+/CD56+ NK-T-Zellen
konstatiert werden.
Eine erhöhte CD56-Expression konnte in der Literatur in Verbindung mit IFN-γ und
TNF-α beobachtet werden (Vargas u. a., 1994), was zu unserem Ergebnis hinsichtlich
der Betrachtung doppelt-positiver Zellen im Lymphozytenfenster passt: Die SepsisGruppe zeigt dabei deutlich höhere Messwerte für CD16+/CD56+ (steht für NKZellen) - insbesondere im Vergleich zur Tumor-Gruppe, die noch niedrigere Werte als
die HLH-Gruppe aufweist (beide Gruppen liegen mit ihren Medianen unter der PanelGruppe). Betrachtet man die doppelt-positiven Messwerte für CD57+/CD56+ Zellen,
so fällt die HLH-Gruppe mit eher niedrigeren Messwerten auf.
4.2.1.9
CD57 (NK-1)
Eine CD57 (= NK-Zellmarker)-Expression findet man u.a. bei NK-Zellen. Sie erfolgt
aber auch bei einigen soliden Tumoren wie z.B. bei ausdifferenzierten ProstataTumoren und Melanomen. Bekanntermaßen wächst die humane CD57+-T-ZellAnzahl mit steigendem Alter. Bei CD57+T-Zellen handelt es sich meistens auch um
CD8+ Zellen, welche im Zuge des Alterungsprozesses immer größere Mengen an IFNγ produzieren und somit eine wichtige Rolle beim immunologischen Wandel im Alter
spielen: Sie beeinflussen dabei vor allem das Th1/Th2- Gleichgewicht (Shinomiya u. a.,
2005).
Nimmt man unsere Ergebnisse unter die Lupe, so fallen speziell in der Sepsis- und in
der Tumor-Gruppe jeweils zwei Werte-Gruppierungen auf: Die Werte sammeln sich
entweder im oberen oder im unteren Messwertebereich an. Dieses Bild ist typisch für
Patienten mit einer Reinfektion. Die untere Werteansammlung muss unter
Berücksichtigung der CD3-Analyse betrachtet werden: Vor allem in der TumorGruppe können tendenziell erhöhte CD3-Werte beobachtet werden, was wiederum
mit erhöhter Apoptose CD57+ (NK-)T-Zellen und damit niedrigen Messwerten
einhergehen könnte.
Studien zufolge töten CD57+ T-Zellen vom NK-Typ (aber auch andere Zelltypen wie
z.B. CD56+ NK-T-Zellen) wohl nicht nur Tumorzellen, sondern - durch Zytokine oder
Diskussion
87
bakterielle Antigene aktiviert - auch Gefäßendothelzellen, wobei sie zudem große
Mengen an FasL ( Apoptose) produzieren. Darüber hinaus sind diese NK-Typ-TZellen CD3-vermittelt anfälliger für Apoptose: Zusammenfassend konnten Shinomiya
et al. herausfinden, dass CD3-stimulierte CD57+ (NK)-T-Zellen eine erhöhte
Induktion pro-apoptotischer Moleküle sowie eine verringerte Expression antiapoptotischer Moleküle aufzeigen – vermutlich, um ihre Autoreaktivität zu begrenzen.
Aus dem Gleichgewicht geratene Expressionslevel hinsichtlich der CD3ζ-Kette und
der CD3ε-Kette sowie die Signalübertragungsmechanismen über ihre einzigartigen
CD3-Moleküle können genauso involviert sein in die Apoptose-Anfälligkeit CD57+
(NK-)T-Zellen nach CD3-Stimulation (Shinomiya u. a., 2005).
Akagi et al. fanden ihrerseits heraus, dass eine erhöhte Anzahl CD57+ T-Zellen im
peripheren Blut von Patienten mit fortgeschrittenem Magen-CA als Indikator für eine
schlechte Prognose angesehen werden könnte – CD57 definiert u.a. auch zirkulierende
Tumorstammzellen (Akagi und Baba, 2008).
4.2.1.10
CD3
CD3 spielt als Erkennungsoberflächenmolekül während der Thymozyten-Entwicklung
(Übergang von CD4-/CD8- doppelt-negativen unreifen Vorläuferzellen zum
CD4+/CD8+-doppelt positiven Stadium und schließlich zu CD4+/-CD8-/+ einfach
positiven T-Zellen) eine wichtige Rolle.
Mit Beachtung der Literatur-Recherche für CD57 ist die Betrachtung des
Lymphozytenfensters (in welchem insofern auch Anhaltspunkte zu NK-T-Zellen
ersichtlich sein könnten) für CD3 von Bedeutung.
Wir konnten in unserer Studie tatsächlich erhöhte Werte in der Tumor-Gruppe
messen, während hingegen in der HLH- sowie Sepsis-Gruppe eher niedrigere Werte
im Vergleich zur Panel-Gruppe ersichtlich sind - was zu der Beobachtung passt, dass
ein Zusammenhang zwischen CD3 und einer erhöhten Apoptoserate bei CD57+ NKT-Zellen bestehen könnte (wobei aber auch Tumorstammzellen CD57+ sein können).
Fehlt humanes CD3γ oder CD3ε, so führt dies zu teilweiser Stagnation der T-ZellReifung und zu moderater Immundefizienz. Ein Defekt im CD3δ-Gen konnte
mittlerweile in Zusammenhang mit einer Form eines schweren kombinierten
Immundefekts (SCID= severe combined immunodeficiency) gebracht werden, welche
Diskussion
88
durch das fast gänzliche Fehlen von zirkulierenden reifen T-Zellen charakterisiert ist
(Dadi u. a., 2003).
Darüber hinaus sind NK-T-Zellen CD3-vermittelt anfälliger für Apoptose: Aus dem
Gleichgewicht geratene Expressionslevel hinsichtlich der CD3ζ-Kette und der CD3εKette sowie die Signalübertragungsmechanismen über ihre einzigartigen CD3Moleküle können involviert sein in die Apoptose-Anfälligkeit CD57+ (NK-)T-Zellen
nach CD3-Stimulation (Shinomiya u. a., 2005).
4.2.1.11
CD69 (AIM)
CD69 wird auf Stimulation durch Zytokine hin innerhalb von 1 Stunde auf aktivierten
Leukozyten
exprimiert
und
stellt
somit
den
ersten
Vertreter
der
Zelloberflächenrezeptoren nach Aktivierung dar. Bei NK-Zellen wird die Expression
u.a. durch IL-2 (von TH-Zellen gebildet) und IFN-α (von Leukozyten gebildet;
immunstimulierende, vor allem antivirale und antitumorale Wirkung; JAK-STATSignalweg) induziert.
Bestätigend zur Literatur konnten wir in unserer Studie deutlich höhere Werte vor
allem in der Sepsis-Gruppe im Vergleich zur Panel-Gruppe vorfinden – die
Maximalwerte konnten dabei Patienten mit der Diagnose „Sepsis“ zugeordnet werden.
Generell haben jedoch auch die HLH- sowie die Tumor-Gruppe vergleichsweise
erhöhte Werte vorzuweisen, was insgesamt zu dem bisherigen wissenschaftlichen
Kenntnisstand passt. Zum Maximalwert der HLH-Gruppe gehört dabei die Diagnose
„HLH-MAS“.
Die Stimulation der aktivierten NK-Zellen mit anti-CD69-Antikörpern bewirkt
zytolytische Aktivität. Neben Thrombozyten, reifen Thymozyten, myeloiden
Knochenmarks- und lymphoiden Vorläuferzellen wird CD69 auch konstitutiv auf einer
kleinen Subpopulation von T- und B-Zellen im peripheren Lymphgewebe, auf
neutrophilen und auch eosinophilen Granulozyten exprimiert (Marzio u. a., 1999;
Esplugues u. a., 2003). Entsprechend wurden CD69+ T-Lymphozyten v.a. in
Zellinfiltraten bei verschiedenen chronischen Entzündungskrankheiten gefunden,
sowie u.a. auch bei autoimmunen (Schilddrüsen-) Erkrankungen sowie der
rheumatoiden Arthritis („CD69 downregulates autoimmune reactivity through active
transforming growth factor-β production in collagen-induced arthritis“)(Sancho u. a.,
Diskussion
89
2003). Bei LPS-behandelten Mäusen fand man CD69 auf aktivierten T-, B- und NKZellen. Nach Esplugues et al. weisen Tumorpatienten, die mit proinflammatorischen
Zytokinen behandelt werden, erhöhte Mengen an immunsupressiven Zytokinen (IL10, TGF-β...) sowie eine niedrigere Tumorinfiltration durch CD69+ Lymphozyten auf
(Esplugues u. a., 2003). In Ihrer Studie erörterten Esplugues et al. den Einfluss von
CD69-Abwesenheit auf die Anti-Tumor-Antwort bei Mäusen: Bei CD69-negativen
Mäusen fand man eine gesteigerte NK-Zell-abhängige Antwort, welche zu einer
umfangreicheren Unterdrückung von MHC-1-negativen Tumorzellen führt. Diese
starke Anti-Tumor-Antwort geht u.a. mit einer reduzierten TGF-β-Produktion und
einem Anstieg an proinflammatorischen Zytokinen und MCP-1 (Monozytenchemotaktisches Protein-1) einher. Sie ist darüber hinaus mit einer erhöhten
Rekrutierung von lymphoiden Effektozellen und verringerter Apoptoserate assoziiert
(Esplugues u. a., 2003). Im Gegenzug konnten Sun et al. zeigen, dass apopotische
Zellen die Expression von CD69 während der T-Zell-Aktivierung inhibieren können
(Sun und Shi).
Fazit: Je mehr proinflammatorische Zytokine, desto mehr CD69 (positive feed-backSchleife zwischen der CD69-Expression und der TNF-α-Produktion (López-Cabrera
u. a., 1995)), desto mehr immunsuppressive Zytokine im weiteren Verlauf (v.a. TGF-β)
und somit letztendlich umso weniger CD69.
4.2.1.12
CD161 (NKR-P1)
CD161 wird hauptsächlich von NK-Zellen exprimiert, aber auch von T-Lymphozyten
und Gedächtniszellen.
Nach enger Bindung des C-Lectin-artigen NK-Rezeptorproteins an bestimmte
Kohlenhydratstrukturen auf Seiten der schadhaften Zielzelle verursachen NK-Zellen
deren Lyse. Jedoch können nicht alle „fremdartigen“ Zellen so beseitigt werden: Einige
Tumorzellen erweisen sich als resistent gegenüber NK-Zellen, was darauf
zurückgeführt werden kann, dass sie auf ihrer Oberfläche keine Strukturen
präsentieren, die als Liganden für das die Anbindung vermittelnde Rezeptorprotein
NKR-P1 fungieren (Ljutic u. a., 2005).
In unseren Untersuchungen haben wir neben CD161+CD56- NK-Zellen (unreif,
Vorläufer) auch CD161+CD56+NK-Zellen (reif) analysiert und dabei festgestellt, dass
Diskussion
90
speziell in den drei Krankheitsgruppen eher niedrigere Messwerte für CD161
resultierten. Damit lässt sich mit Blick auf die Literatur-Recherche konstatieren, dass
CD161 durchaus als Krankheitsmarker gelten kann.
Indem CD161+Zellen auch als Vorläufer für TH17-Zellen gelten, korreliert dieses
Ergebnis wiederum mit den von uns gemessenen erhöhten Messwerten für IL-17R.
Kleinschek et al. haben in diesem Zusammenhang eine CD161-exprimierende
Subpopulation zirkulierender CD4-T-Gedächtniszellen identifiziert, versehen mit einer
einzigartigen
Fähigkeit,
auf
IL-23
anzusprechen
um
schließlich
zu
enddifferenzierten/aktivierten TH-17-Zellen zu werden. Darüber hinaus konnte
bereits gezeigt werden, dass IL-17-produzierende Zellen von CD161+ naiven CD4+ TZellen abstammen. Die Identifizierung von CD161 (C-Typ-Lectin-artiger Rezeptor,
homolog zu CD69) weist auf zusätzliche co-stimulatorische Signalwege in der TH17Antwort hin: Die Rolle von CD161 bei der Unterstützung der T-Zell-Expansion (auf
Aktivierung hin) zusammen mit der selektiven Expression auf TH17-Zellen könnte
diesen Marker zu einem interessanten therapeutischen Ziel z.B. bei Morbus Crohn
sowie ähnlichen Erkrankungen machen (Kleinschek u. a., 2009; Cosmi u. a., 2008).
CD161 oder NKR-P1 gehört dabei zu den inhibitorischen NK-Zell-Rezeptoren
(bindet an LLT1 über den ITIM-Signalweg) (Bryceson u. a., 2008a). Vor allem
hinsichtlich Tumor-Immunität spielen CD161+ Zellen funktionell eine bedeutende
Rolle. Besonders Vα24+CD161+ NK-T-Zellen zeigen starke zytotoxische Anti-TumorAktivität auf. Sie haben außerdem die Fähigkeit, große Mengen an IL-4 und IFN-γ zu
produzieren – es wird spekuliert, dass sie so Phänomene des Immunsystems wie
Autoimmunerkrankungen regulieren (IIAI u. a., 2002).
4.2.1.13
Vα24
Vα24+-NK-T-Zellen gelten als eine Subpopulation der NKR-P1A-exprimierenden
NK-T-Zellen mit einem unveränderlichen T-Zell-Rezeptor (TCR; Vα24-JαQ) (Nicol u.
a., 2000).
Unsere Ergebnisse zeigen erhöhte Werte in allen drei Krankheitsgruppen, was
wiederum bedeutet, dass das Immunsystem im Krankheitsfall über gesteigerte
zytotoxische/protektive Aktivität der NK-T-Zellen anzukämpfen versucht.
Diskussion
91
Derzeit können drei verschiedene Subpopulationstypen differenziert werden:
Vα24+ DN (doppelnegative) NK-T-Zellen (CD4-CD8-) exprimieren NK-Rezeptoren
(wie z.B. CD16, CD94), CD161 (NKR-P1A) sowie den TCR mit der Vα24-JαQ
unveränderlichen TCR-α-Kette.
Darüber hinaus sind neben Vα24+ CD161+ CD4+ NK-T-Zellen, welche bis auf
CD161 keine anderen NK-Oberflächenmarker exprimieren, noch Vα24+ CD161CD4+ bekannt.
Was die Zytotoxität gegenüber bestimmten Zelllinien anbelangt, so konnten
zytotoxische
Aktivitäten
der
Vα24+-NK-T-Zellen
gegenüber
Tumorzelllinien
aufgezeigt werden: Während sowohl Vα24+ DN NK-T-Zellen als auch Vα24+ CD4+
NK-T-Zellen perforin-abhängige (CD1d- & Vα11+ TCR-unabhängige) zytotoxische
Aktivitäten gegenüber U937-Zellen (Myelomonozyten-Zelllinie) aufweisen, gilt dies
nur in verminderter Art und Weise für Vα24+ CD161- CD4+ Zellen. Gegenüber den
NK-Zell-sensitiven erythroleukämischen K562-Zellen besteht jedoch so gut wie keine
zytotoxische Aktivität. Hinsichtlich der Zytokinproduktion konnte konstatiert werden,
dass humane Vα24+ NK-T-Zellen neben IFN-γ auch IL-4 produzieren (Takahashi u.
a., 2000).
4.2.1.14
CD244 (Cytotox/NK-Rezeptor 2B4)
In der Regel sollte bei Betrachtung der zytotoxischen Zellen ein erstes Augenmerk auf
CD244 geworfen werden, da CD244 auf der Oberfläche von ruhenden sowie
aktivierten NK-Zellen, aber auch auf T-Zellen (~50% der CD8+), auf einigen CD8+
Thymozyten und auf einem geringen Anteil CD4+ Zellen, Monozyten und basophiler
Granulozyten exprimiert wird.
In unseren Untersuchungen lässt sich im Schnitt eine leicht niedrigere Messquote in
den Krankheitsgruppen beobachten, wobei in allen Test-Gruppen eine ähnliche
Streuung der Messwerte einen deutlichen Unterschied gesund – krank nicht erkennen
lässt.
CD244 spielt eine Rolle in der nicht-MHC-gebundenen zytotoxischen Aktivität von
NK-Zellen und agiert als ein costimulatorischer Ligand sowohl für NK-Zellen als auch
für T-Zellen in vitro. Behandlung mit einem CD244-monoklonalen Antikörper
Diskussion
92
aktiviert diese Zellen, was die nicht-MHC-gebundene Zytotoxizität erhöht. CD244
moduliert
die
NK-Zell-Zytokinproduktion,
zytolytische
Funktionen
und
Extravasation. Außerdem kann dieses Oberflächenmolekül wohl auch andere
Rezeptor-Liganden-Interaktionen modulieren und damit Leukozyten-Aktivierung
verstärken. Während CD244-CD48-vermittelter homotypischer Interaktionen von TZellen und NK-Zellen oder NK-T-Zell-Interaktionen soll der CD244-Signalweg
optimale Aktivierung von T- und NK-Zellen induzieren und dazu dienen, die ZellZell-Adhäsion zu verstärken. Jedoch können Interaktionen mit anderen CD48+
Zielzellen wie z.B. Tumorzellen zu einer Inhibition von NK-Zell-Effektor-Funktionen
führen. Z.B. sind CD244- Mäuse zwar phänotypisch normal, können aber verstärkt
CD48+ Tumorzellen in vivo ausschalten. Defekte CD244-Signalgebung kann wohl
auch zu XLP (X-linked lymphoproliferative disorder) beitragen, was auf EBVInfektionen hin getriggert wird (Washington State University; Brown u. a., 1998; Boles
u. a., 1999).
Diskussion
4.2.2
Zusätzliche Fragestellung
93
Im Verlaufe unserer CellQuest-Auswertung stießen wir – im Besonderen innerhalb der
Tumor-Patientengruppe, jedoch auch in den anderen Gruppen - des Öfteren auf eine
zusätzliche „Zellwolke“, welche sich nicht mit den drei Haupt-Zellpopulationen
(Lymphozyten, Monozyten, Granulozyten) deckt. Im weiteren Analyseverlauf
entwickelte sich der Verdacht, dass es sich dabei um eine Granulozyten-ähnliche
Population handeln könnte. Diverse Publikationen zum Thema MDSC (myeloidderived suppressor cells) lenkten die Aufmerksamkeit dahingehend, einen eventuellen
Zusammenhang zwischen dieser neuen Zellpopulation und den MDSCs herzustellen.
4.2.2.1
Definition MDSC
Bei den MDSCs handelt es sich um eine heterogene Zellpopulation myeloiden
Ursprungs,
welche
myeloide
Vorläuferzellen
sowie
unreife
Makrophagen,
Granulozyten und DCs umfasst.
Beim Gesunden differenzieren unreife myeloide Zellen (Immature Myeloid Cells =
IMCs) aus dem Knochenmark sehr schnell zu reifen Granulozyten, Makrophagen oder
DCs.
Hingegen resultiert unter pathologischen Bedingungen (wie z.B. Tumorerkrankungen,
verschiedene
infektiöse
Erkrankungen,
Sepsis,
Trauma,
Knochenmarkstransplantationen und einige Autoimmunerkrankungen) eine partielle
Blockierung der Differenzierung von IMCs zu reifen myeloiden Zellen in der
Vermehrung
dieser
MDSC-Population:
Normalerweise
wandern
IMCs
zu
verschiedenen peripheren Organen, um dort zu Makrophagen, DCs oder
Granulozyten zu reifen. Jedoch fördern Faktoren, welche während akuter oder
chronischer Infektionen, Trauma oder Sepsis sowie in Tumorgebieten produziert
werden (z.B. G(/)M-CSF, IFN-γ, TGF-β, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13 etc.), lokal
eine Akkumulation von IMCs, verhindern deren Differenzierung und induzieren deren
Aktivierung.
Die Aktivierung dieser IMCs führt dazu, dass dieselben zum Einen vermehrt
immunsuppressive
Faktoren
wie
z.B.
Arginase
1
(ARG1),
induzierbare
Stickstoffmonoxid (NO)-Synthase (= nitric oxide synthase = iNos/NOS2)
exprimieren und zum Anderen verstärkt NO sowie ROS (= reactive oxygen species)
Diskussion
94
produzieren. Im weiteren Verlauf kommt es zur Expansion einer IMC-Population,
welche immunsuppressiv aktiv ist und unter MDSC zusammengefasst wird.
MDSCs fehlen Oberflächenmarker, welche speziell von Monozyten, Makrophagen
oder DCs exprimiert werden und zeigen die Morphologie von Granulozyten und
Monozyten auf.
Humane MDSCs werden im Allgemeinen meist als CD14- bzw. CD11b+Zellen
definiert, welche den allgemeinen myeloiden Marker CD33 exprimieren und denen das
MHC-Klasse-II-Molekül HLA-DR sowie Marker reifer myeloider und lymphoider
Zellen fehlen.
Bei weiteren Tumor-Modell-Analysen konnte festgestellt werden, dass sich zwar
sowohl die granulozytische als auch die monozytische Untergruppe vergrößern,
allerdings war die Expansion der granulozytischen MDSCs meist erheblicher als die der
monozytischen MDSCs. Darüber hinaus wenden die zwei MDSC-Untergruppen
verschiedene Mechanismen bei verschiedenen Krankheitsumständen an, um die TZellfunktion zu unterdrücken.
MDSC können in vitro- / in vivo-Studien zufolge NK-Zell-Zytotoxizität inhibieren
und NK-Zellen dazu veranlassen, sich hyporesponsiv zu verhalten und trotz
entsprechend gegensätzlicher Signale weniger IFN zu produzieren, was zu der
Annahme führt, dass MDSCs NK-Zell-Anergie induzieren können. Bisherige Daten
deuten darauf hin, dass sich in vivo-Depletion von MDSC durch darauffolgende
erhöhte NK-Zellaktivität positiv auf Tumorerkrankte auswirken kann (Rodriguez u. a.,
2009; Li u. a., 2009; Diaz-Montero u. a., 2009; Gabrilovich und Nagaraj, 2009)
4.3
Die
Schlussfolgerung und Ausblick
Immunphänotypisierung
als
Methode
zur
Analyse
der
verschiedenen
Expressionsmuster von Oberflächenrezeptoren kann durchaus Hinweise auf
Immunsuppression bei HLH-, Sepsis- sowie Tumor-Patienten (im Endstadium) geben.
Mit Fokus auf PMN sowie NK-(T-)Zellen konnten wir mit unseren Untersuchungen
spezifische Oberflächenrezeptoren ausmachen, welche hinweisend auf spezielle
immunpathologische Umstände bei Patienten mit evtl. anfänglich unklarer
Immunsituation sein können. Das (noch zu vertiefende) Wissen um die Spezifität
Diskussion
95
dieser Oberflächenrezeptoren soll es zukünftig möglich machen, schneller und
gezielter auf Immunsuppression jeglicher Genese reagieren zu können, wobei hierfür
jedoch noch größere Fallzahlen analysiert werden müssen. Vor allem mit Bezug auf die
im Untersuchungsverlauf entstandene Fragestellung „MDSC“ soll das Interesse
weiteren
spezifischen
Analysen
monoklonaler Antikörper gelten.
mit
Auswertung
bisher
nicht
verwendeter
Zusammenfassung
5
96
Zusammenfassung
Der
septische
Formenkreis,
Tumorerkrankungen
und
die
Hämophagozytische
Lymphohistiozytose (HLH) gehören nach wie vor zu den großen Herausforderungen im
Klinikalltag. Für die Zukunft gilt es, die Befunderhebung mit anschließender Diagnosestellung
sowie Therapieentscheid durch geeignete analytische Maßnahmen zu stützen bzw. zu
beschleunigen und abzusichern. Eine Möglichkeit kann die Immunphänotypisierung
darstellen: Die verschiedenen Zellen des Immunsystems exprimieren je nach Zelltyp und
Entwicklungsstand
bestimmte
Oberflächenrezeptoren/-antigene,
welche
mittels
monoklonaler Antikörper nachweisbar sind. Dadurch lassen sich Gesundheits- bzw.
Krankheitszustände oder vielmehr spezifische Immunantworten typisieren. Diese Thematik ist
Gegenstand der vorliegenden Arbeit: Es geht dabei um die Herauskristallisierung von
Hinweisen auf Immunsuppression hinsichtlich spezifischer Oberflächenrezeptoren bei HLH-,
Sepsis- sowie Tumor-Patienten (im Endstadium) bzw. im weiteren Sinne darum, welche Rolle
Neutrophile Granulozyten (PMN) sowie Natürliche Killer-(T-)Zellen (NK-(T-) Zellen)
spielen.
Für
die
vorliegende
Arbeit
wurden
nach
Ethylendiamintetraessigsäure(EDTA)-Blutproben
von
Plasmaabnahme
anonymisierten
51
eingesandte
Patienten
mit
Diagnosen aus „Septischer Formenkreis, HLH, Tumor sowie Panel (gesund)“ durch
entsprechende
Maßnahmen
unter
Zugabe
monoklonaler
Antikörper
für
die
Immunphänotypiserung präpariert.
Die so mit Antikörpern "angefärbten" Zellen in Suspension (basierend auf einer AntigenAntikörper-Reaktion) konnten mithilfe des optischen FACSCalibur-Messverfahrens einer
fluoreszenzaktivierten Zellanalyse unterzogen und immunzellpopulations-spezifisch (via
„Gaten“ = Setzen von „Regions of Interest“) typisiert werden. Im Fokus standen dabei PMN
sowie NK-(T-)Zellen.
Für die Auswertung der Daten wurden nach diagnosenabhängiger Gruppeneinteilung
(„Panel“, „Sepsis“, „HLH“ und „Tumor“) die einzelnen Zelloberflächenmarker-Ergebnisse in
Form einer explorativen Datenanalyse deskriptiv sowie statistisch ausgewertet. Die
„gegateten“ Werte stellen dabei den prozentualen Anteil der jeweils markerspezifisch (z.B.
CD16 [Cluster of Differentiation]) positiven Zellen in dem jeweiligen Zell-Fenster
(Granulozyten-Fenster oder Lymphozyten-Fenster), bezogen auf die Gesamtzellzahl in diesem
Fenster dar („Gated“-Werte). Die Betrachtung der „Mean“-Werte gibt Aufschlüsse über die
Expressionsdichte.
Zusammenfassung
97
Es ergaben sich dabei innerhalb der PMN-Zellpopulation deutlich erhöhte Werte bei pWerten < 0,05 für CD64 („Gated“-Werte: Sepsis-Gruppe vs. Panel- und Tumorgruppe;
„Mean“-Werte: Sepsis- und Tumor-Gruppe vs. Panel-Gruppe), CD39 („Gated“-Werte:
Sepsis-Gruppe vs. Panel-Gruppe), Interleukin (IL)-7R („Mean“-Werte: Tumor-Gruppe vs.
Panel- und Sepsis-Gruppe), IL-17R („Gated“-Wert: Sepsis- vs. Tumorgruppe; „Mean“-Werte:
Tumor- vs. Panel-Gruppe), Toll-like-Rezeptor (TLR)-2 („Gated“- und „Mean“-Werte:
Tumor-Gruppe vs. Panel-Gruppe), TLR-4 („Mean“-Werte: Tumor-Gruppe vs. PanelGruppe).
Ein Trend zeichnete sich bei p < 0,15 auch für IL-7R („Gated“-Werte: Sepsis- und PanelGruppe vs. Tumor- und HLH-Gruppe) ab.
Innerhalb der NK-Zellpopulation fallen bei Betrachtung der „Gated“-Werte deutliche
Unterschiede mit p < 0,05 auf für CD16 (Sepsis-Gruppe vs. Tumor-Gruppe), CD69 (SepsisGruppe vs. Panel-Gruppe), IL-17R (Sepsis-Gruppe vs. Panel- und Tumor-Gruppe).
Tendenz zu erhöhten Werten bei p < 0,15 findet sich auch bei Vα24 (neben HLH- und
Tumor-Gruppe vor allem Sepsis-Gruppe vs. Panel-Gruppe).
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen demnach auf, dass – je nach Erkrankung
bzw. Krankheitszustand – die oben genannten Marker auf PMN und NK-(T-)Zellen
verändert zu sein scheinen. Die Immunphänotypisierung bei PMN und NK-(T-)Zellen kann
somit sehr wohl verwendbare Hinweise auf Immunsuppression geben und folglich als
unterstützende diagnostische Maßnahme zur Klärung bestimmter Krankheitsumstände
dienen. Das zukünftige Interesse sollte dabei der Erprobung weiterer bisher nicht
angewandter monoklonaler Antikörper gelten, um eine bislang ungeklärte zusätzlich
auftretende Zellpopulation identifizieren zu können. Die Annahme, dass es sich um Myeloidderived suppressor cells (MDSC) handeln könnte, konnte in dieser Arbeit nicht geklärt werden und
muß durch weitere Forschungsaktivität unter Zuhilfenahme zusätzlicher spezifischer
Antikörper abgeklärt werden. Da es sich bei der Untersuchung in der vorliegenden Arbeit um
eine explorative Datenanalyse handelt, mit der prioritären Zielsetzung, Tendenzen mithilfe der
Immunphänotypisierung zu erarbeiten, können die hier analysierten Fallzahlen als zwar
repräsentativ angesehen werden, müssen jedoch zur Herauskristallisierung signifikanter
Unterschiede
mittels
höherer
Fallzahlen
untermauert
werden.
Literaturverzeichnis
6
98
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Anhang
106
Anhang
Tabelle 28: p-Werte bei Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests (nichtparametrischer statistischer Rangsummen-Test), Signifikanzniveau: p <
0,05.
Spalten: Auflistung der untersuchten Oberflächenmarker auf Neutrophilen Granulozyten(PMN) und Natürlichen Killerzellen
(NK-Zellen): CD (Cluster of Differentiation), HLA (Human Leukocyte Antigen), IL-...R (Interleukin-...Rezeptor), TLR (Toll-like-Rezeptor);
Art der untersuchten Werte (Gated-/ Mean-Ergebnisse);
Patientennummern der Ausreißer (wurden ausgeschlossen),
p-Wert aus dem statistischen Gruppenvergleich der Messwerte der vier untersuchten Gruppen (Panel [=gesund], HLH
[=Hämophagozytische Lymphohistiozytose], Sepsis, Tumor);
Ergebnis des Dunn’s post test (Wie groß sind die Unterschiede beim
Vergleich zweier Gruppen?). Signifikanzbezeichnungen: *p-Wert < 0,05, **p-Wert < 0,01, ***p-Wert < 0,001.
Ausreißer
PMN
CD64
Gated
9734
p -Wert
***< 0.0001
Mean
***0,0005
CD16
Gated
0,7131
CD39
HLA-DR
Gated
Gated
Mean
Gated
Mean
IL-7R
IL-17R
TLR-2
TLR-4
Gated
Mean
Gated
Mean
Gated
Mean
10342
9893, 9690
10342, 10341, 9719
10342, 9688, 9690
NK-Zellen
CD3
CD16
CD56 FITC
CD57
CD69
CD161
CD244
IL-7R
IL-17R
Gated
Gated
Gated
Gated
Gated
Gated
Gated
Gated
Gated
9506
Vα24
Gated
9793, 9612, 9556
9793
10083, 9560
9560
*0,0201
0,2099
0,1694
0,0784
**0,0025
*0,0164
*0,0106
*0,0173
***0,0002
0,5459
*0,0121
0,1847
*0,0117
0,2845
0,2720
***0,0002
0,2881
0,9798
0,9614
**0,0073
0,0900
Dunn’s post test:
p < 0,05 für
Panel vs Sepsis***
Sepsis vs Tumor***
Panel vs Sepsis**
Panel vs Tumor***
Panel vs Sepsis*
Sepsis vs Tumor**
Panel vs Tumor*
Sepsis vs Tumor*
Panel vs Tumor**
Panel vs Tumor*
Panel vs Tumor***
Panel vs Tumor*
Sepsis vs Tumor**
Panel vs Sepsis***
Panel vs Sepsis*
Sepsis vs Tumor*
Danksagung
107
Danksagung
An erster Stelle bedanke ich mich bei Frau Prof. Dr. Marion Schneider, die es mir
ermöglichte, in der Abteilung Experimentelle Anästhesie meine Doktorarbeit
anzufertigen. Mein besonderer Dank gilt an dieser Stelle auch für die allzeit sehr gute
Betreuung. Danke, dass Sie immer ein offenes Ohr hatten und mir mit Rat und Tat zur
Seite standen!
Bei Prof. Dr. Marion Schneider und Dr. Harald Hohmann bedanke ich mich zudem
für die Begutachtung und Korrektur dieser Arbeit.
Ein weiterer großer Dank geht an Dr. Harald Hohmann für die Anleitung und
Betreuung bei den Laborarbeiten und die Einführung und Hilfestellungen bei der
Arbeit mit dem FACSCalibur-Gerät.
Auch Helena und Clemens möchte ich für die unvergessliche Teamarbeit bei diesem
Themenkomplex der Immunphänotypisierung danken.
Bei der Abteilung von PD Dr. Rainer Muche bedanke ich mich für die Begutachtung
und Hilfestellung in puncto Statistik.
Bei Frau Mihr möchte ich mich für die Begutachtung der Form bedanken.
Außerdem danke ich meiner Mutter, meinem Patenonkel und Markus, die diese Arbeit
korrigiert haben und mir mit technischen Ratschlägen und Motivation zur Seite
gestanden haben.
Zuletzt möchte ich mich ganz herzlich bei meiner gesamten Familie bedanken, die mir
durch ihre Unterstützung in jeglicher Art und Weise nicht zuletzt die Absolvierung
meines Studiums ermöglicht haben.