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Aus dem Institut für Anatomie und Zellbiologie (Lehrstuhl II)
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br.
- Eine Studie zur Entwicklung der Scapula-Klinge Ein neuer Pfad der Skelett-Entwicklung
beim Vogel-Embryo.
INAUGURAL -DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg i. Br.
Vorgelegt im Jahre 2003
von Florian Ehehalt
geboren in Ulm
Dekan
Prof. Dr. med. J. Zentner
1. Gutachter
Privatdozent Dr. med. R. Huang
2. Gutachter
Prof. Dr. med. R. Horch
Jahr der Promotion
2005
„Der menschliche Verstand vermag die Gesamtheit
der Ursachen der Erscheinungen nicht zu begreifen.
Aber das Bedürfnis, nach diesen Ursachen zu forschen,
liegt in der Seele des Menschen.“
Lew N. Tolstoj
Inhaltsverzeichnis
1.
Einleitung.......................................................................................................................1
1.1.
Vergleichende Anatomie des Skeletts der oberen Extremität.............................1
1.2.
Herkunft und Entwicklung des Flügelskeletts.....................................................3
1.3.
Umliegende Signalgeber legen das Zellschicksal der Somitenderivate fest.......5
1.4.
Positionsinformationen innerhalb des paraxialen Mesoderms legen die
Morphologie der Somitenderivate fest................................................................6
1.5.
Die Scapula entwickelt sich auch in Säugetieren
modular................................................................................................................7
1.6.
2.
Fragestellung und methodischer Zugang.............................................................9
Material und Methoden..............................................................................................10
2.1.
Tiere...................................................................................................................10
2.2.
Mikrochirurgische Technik...............................................................................10
2.2.1. Art und Herstellung des Instrumentariums..............................................10
2.2.2. Allgemeine Operationstechnik und Fixierung.........................................11
2.2.3. Spezielle Operationstechniken................................................................12
2.2.3.1. Implantation einer Barriere zwischen Achsenorgane und Somiten......12
2.2.3.2. Ektoderm-Entfernung...........................................................................12
2.2.3.3. Implantation einer Barriere zwischen Somatopleura und Somiten .....13
2.2.3.4. Herstellung von Wachtel-Huhn-Chimären...........................................13
2.3.
Analyse des Skelett-Musters.............................................................................14
2.3.1. Knorpel-Knochenfärbung mit Gewebe-Verdau....................................15
2.3.2. Knorpelfärbung für weitere histologische Aufarbeitung.......................15
2.4.
Histologie und Färbetechniken..........................................................................16
2.4.1. Whole-mount in situ-Hybridisierung....................................................16
2.4.2. Herstellung der Paraffinschnitte für die histologische
Untersuchung.........................................................................................17
2.4.3. Proliferationsdetektion mit BrdU-Assay...............................................17
2.4.4. Immunhistochemische Färbung an Hühnerembryonen und WachtelHuhn-Chimären.....................................................................................19
2.5.
Fotografie...........................................................................................................20
2.6.
Chemische Reagenzien und Zusammensetzung der verwendeten
Lösungen...........................................................................................................20
2.6.1. Lösungen für die Operation...................................................................20
2.6.2. Lösungen für die Skelett-Analyse.........................................................20
2.6.3. Lösungen für die whole-mount in situ-Hybridisierung und
Histologie...............................................................................................21
3.
Ergebnisse....................................................................................................................24
3.1.
Barrieren-Implantation zwischen den Achsenorganen und Somiten................24
3.2.
Ektoderm-Entfernung........................................................................................25
3.2.1. Entfernung des kompletten Ektoderms über den Somiten und der
zukünftigen Extremitätenregion............................................................25
3.2.2. Entfernung der zukünftigen AER..........................................................26
3.2.3. Ektoderm-Entfernung über den Somiten...............................................27
3.2.3.1. Ektoderm-Entfernung über den epithelialen Somiten..........................27
3.2.3.2. Ektoderm-Entfernung über den kompartimentierten Somiten.............28
3.2.3.3. Ektoderm-Entfernung über den epithelialen Somiten mit nachfolgender Entnahme der Goldfolie........................................................29
4.
3.3.
Barrieren-Implantation zwischen Somatopleura und Somiten..........................30
3.4.
Heterotope Transplantation von zukünftigen Dermomyotomen.......................31
Diskussion....................................................................................................................33
4.1.
Die Entwicklung der chondrogenen Zellen des Dermomyotoms hängt von
anderen Signalen ab als die der chondrogenen Zellen des Sklerotoms.............33
4.2.
Die Entwicklung der Scapula-Klinge ist unabhängig von der Entwicklung
des intrinsischen Flügelskeletts.........................................................................34
4.3.
Die chondrogenen Zellen des Dermomyotoms werden
während der Segmentierung des paraxialen Mesoderms spezifiziert................34
4.4.
Ektodermale Signale erhalten die chondrogene Zellpopulation im
Dermomyotom aufrecht.....................................................................................37
4.5.
Ektoderm und Somatopleura steuern die Differenzierung der ScapulaKlinge................................................................................................................38
5.
Zusammenfassung.......................................................................................................40
6.
Literatur.......................................................................................................................41
7.
Abbildungen.................................................................................................................47
8.
Lebenslauf....................................................................................................................64
9.
Danksagung..................................................................................................................66
10.
Eigene Vorträge und Publikationen..........................................................................67
11.
Erklärung.....................................................................................................................68
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1
1.
Einleitung
Die Extremität von Wirbeltieren besteht aus zwei funktionellen Hauptelementen, dem
knöchernen Skelett und der dazugehörigen Muskulatur. Das Skelett übernimmt die passive
Stützfunktion, während die Muskeln aktive Bewegungsarbeit verrichten. Die in allen drei
Raumdimensionen koordinierte Beweglichkeit der Extremität setzt unter anderem voraus,
dass die Skelett- und Muskelelemente während der embryonalen Entwicklung an der richtigen
Position ausgebildet werden.
Anatomisch unterscheidet man am post-kranialen Skelett (Skelett des Rumpfes) zwei
Hauptteile: das Achsenskelett, zu dem die Wirbelsäule und die Rippen gezählt werden und
das Skelett der oberen und unteren Extremität. Das Extremitätenskelett selbst wird in vier
Abschnitte eingeteilt: (1) Obere und untere Extremität werden durch sogenannte Gürtel
(Schulter- bzw. Beckengürtel) am Rumpf befestigt. (2) Daran schließt sich das Stylopodium
an, was dem Oberarm bzw. Oberschenkel und ihren Knochenelementen (Humerus bzw.
Femur) entspricht. (3) Der Unterarm bzw. Unterschenkel mit den Knochen Radius/Ulna bzw.
Tibia/Fibula wird allgemein als Zeugopodium bezeichnet. (4) Als letztes Element fasst man
alle weiter distal gelegenen Strukturen (Hand bzw. Fuß) unter dem Begriff Autopodium
zusammen. Die einzelnen Abschnitte stehen über Gelenke und den darüber hinwegziehenden
Muskeln in Verbindung.
Die bisher zur Extremitäten-Entwicklung angefertigten Studien konzentrieren sich fast
ausschließlich auf die Entwicklung der distalen Abschnitte der Extremität (Stylo-, Zeugo-,
Autopodium). Die Entwicklung der direkt an den Rumpf angrenzenden Gürtel-Regionen
wurden bisher kaum in die Betrachtungen einbezogen. Die hier vorliegende Arbeit beschäftigt
sich mit den Mechanismen, die an der Entwicklung der Hauptkomponente des proximalen
Flügelskeletts, der Scapula des Vogels, beteiligt sind.
1.1.
Vergleichende Anatomie des Skeletts der oberen Extremität
Während der anatomische Aufbau von Stylo-, Zeugo- und Autopodium zwischen
verschiedenen Spezies prinzipiell immer gleich ist, zeigt das Schultergürtelskelett eine große
morphologische Variationsbreite innerhalb des Wirbeltierreiches.
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2
Bei Säugetieren besteht das Schultergürtelskelett aus zwei Komponenten: (1) der Clavicula
(„Schlüsselbein“), die die knöcherne Verbindung der oberen Extremität mit dem ventralen
Rumpfskelett darstellt, und (2) der Scapula, die als flächige Rahmenkonstruktion
(„Schulterblatt“) über der kranialen Hälfte des dorsalen Thorax liegt. Sie steht an ihrem
kranialen Ende in einer gelenkigen Verbindung mit dem Humerus und der Clavicula. Der am
weitesten kranial gelegene Abschnitt der Scapula überdacht das Schultergelenk und wird als
Acromion („Schulterdach“) bezeichnet.
Das Schultergürtelskelett des Vogels besteht hingegen aus drei Skelettelementen: (1) das
Schlüsselbein endet ventral ohne Gelenkverbindung zum Achsenskelett direkt in der
Brustmuskulatur. Ein zusätzlicher Knochen, (2) der Procoracoid, übernimmt die Aufgabe der
ventralen knöchernen Fixierung. (3) Die Scapula überspannt als röhrenförmiger Knochen den
ganzen dorsalen Thorax und artikuliert an ihrem kranialen Ende mit Clavicula, Procoracoid
und Humerus.
Die Scapula lässt sich beim Vogel in drei Abschnitte einteilen: (1) Der Scapula-Kopf ist der
oberste Abschnitt, der die Gelenkflächen für die angrenzenden Knochen enthält. (2) Der
Scapula-Hals folgt kaudal und verbindet den Scapula-Kopf mit (3) der Scapula-Klinge, die
säbelförmig über dem Thorax zu liegen kommt (Abb.1). Ein flächiges „Schulterblatt“ findet
sich beim Vogel nicht.
Die morphologischen Unterschiede im Schultergürtelskelett verschiedener Spezies machen
einen Vergleich anhand der Anatomie schwierig, da über die Homologie der einzelnen
Schultergürtelelemente und Scapula-Abschnitte Unklarheit herrscht. Allerdings lassen sich
gemeinsame Bauprinzipien des Schultergürtels in allen Vertebraten, die einen Schultergürtel
ausbilden, finden: (1) Der Schultergürtel steht lediglich in der ventralen Mittellinie mit dem
Rumpfskelett in gelenkiger Verbindung, während (2) seine dorsale Komponente, die Scapula,
nur mit Muskelschlingen direkt am Rumpf befestigt ist. Dieses Bauprinzip erlaubt bei sicherer
Fixierung den großen Bewegungsumfang der oberen Extremität.
Dass der große Bewegungsumfang unter anderem auf die muskuläre und damit flexible
Befestigung der Scapula zurückzuführen ist, lässt sich durch einen Vergleich mit dem
Beckengürtel veranschaulichen. Das Os ilium („Darmbein“) stellt im Beckengürtel die dorsale
Komponente des Gürtelskeletts dar. Das Darmbein ist jedoch mit der Wirbelsäule über das
Iliosakral-Gelenk verbunden, was die Beweglichkeit des Beines gegen den Rumpf
einschränkt, dafür aber eine sehr sichere Fixierung erlaubt.
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3
1.2.
Herkunft und Entwicklung des Flügelskeletts
Die verschiedenen Anteile des Flügels entstehen aus unterschiedlichen Herkunftsgeweben.
Das Bindegewebe und das Skelett des Flügels (Stylo-, Zeugo- und Autopodium) stammen aus
der Somatopleura des Extremitätenfeldes. Die Muskeln wandern aus paraxialen Strukturen,
den Dermomyotomen in die Extremität ein (Christ et al., 1977; Chevallier et al., 1977a).
Chevallier et al. (1977b) haben gezeigt, dass die Scapula sich vom übrigen
Extremitätenskelett in ihrem Ursprung unterscheidet. Die Autoren konnten nachweisen, dass
die Scapula ihr Anlagematerial aus den Urwirbeln, den sogenannten Somiten, bezieht. Dieses
Bild wurde verifiziert und detaillierter untersucht. Huang et al. (2000b) kamen zu dem
Schluss, dass die Scapula aus zwei unterschiedlichen embryonalen Kompartimenten
hervorgeht. Ihr kranialer Abschnitt (Scapula-Kopf und -Hals) ist ein Derivat der
Somatopleura des Extremitätenfeldes, während der kaudale Abschnitt (Scapula-Klinge) sein
Zellmaterial aus den Somiten des zerviko-thorakalen Übergangsbereiches (Somiten 17-24)
bezieht. Der kraniale Abschnitt lässt sich seiner Herkunft nach dem Extremitätenskelett im
engeren Sinne zuordnen, da dieses ebenfalls aus der Somatopleura hervorgeht (Christ et al.,
1977). Das Flügelskelett besteht also nicht aus einem gemeinsamen Herkunftsgewebe,
sondern hat einen doppelten Ursprung. Es ist modular, aus einer somatopleuralen und einer
paraxialen Komponente, aufgebaut. Das Verhältnis zwischen der Entwicklung dieser beiden
Komponenten wurde bisher noch nicht schlüssig geklärt.
Die Arbeiten zur Entwicklung der distalen somatopleuralen Komponente der Extremität
(Stylo-, Zeugo-, Autopodium) an verschiedenen Wirbeltiermodellen, vor allem am Mäuse- und
am Hühnerembryo, haben in den letzten Jahrzehnten zu einer Vielzahl neuer Erkenntnisse
beigetragen. Die molekularen Mechanismen der Extremitäten-Entwicklung sind zu einem
beachtlichen Teil aufgeklärt. Man geht davon aus, dass der erste Schritt dieser
Entwicklungssequenz in der Festlegung eines „Extremitätenfeldes“ besteht, das die anteriorposteriore Ausdehnung der Extremitätenknospe innerhalb der Somatopleura festlegt. Die
Etablierung des somatopleuralen Extremitätenfeldes findet auf molekular-genetischer Ebene
ihren Niederschlag in der Expression von bestimmten Hox-Genen (Cohn et al., 1997, 1999).
Die Zellen des somatopleuralen Extremitätenfeldes sind kompetent, auf induktive
Signalmoleküle mit Ausknospung der Extremitätenanlage zu reagieren. Als induktives
Signalmolekül der oberen Extremität konnte Wnt2c identifiziert werden, das vom
intermediären Mesoderm sezerniert wird. Die Zellen des somatopleuralen Extremitätenfeldes
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werden dadurch instruiert, einen Wachstumsfaktor (FGF10) zu bilden (Kawakami et al.,
2001). Dieser Wachstumsfaktor induziert im darüber liegenden Ektoderm die Formierung
einer Ektoderm-Verdickung, die ihrerseits beginnt Wachstumsfaktoren (v.a. aus der FGF- und
BMP-Familie) zu produzieren. Diese Ektoderm-Verdickung wird als „apikale ektodermale
Randleiste“ (AER) bezeichnet und ist für das proximo-distale Auswachsen der Extremität
verantwortlich (Saunders, 1948). Im Zuge der weiteren Entwicklung steht die AER mit dem
Mesenchym der Extremitätenknospe in ständiger Interaktion und sorgt im Zusammenspiel mit
weiteren Signalzentren für die dreidimensional koordinierte Entwicklung der Extremität.
Die beschriebenen Signalnetzwerke bestehen sowohl in der oberen wie in der unteren
Extremitätenknospe. Die Morphologie der oberen bzw. unteren Extremität unterscheidet sich
jedoch erheblich. Die Spezifizierung einer Extremitätenknospe auf eine dieser beiden
Möglichkeiten
wird
durch
Tbx-Gene
(T-box-Gene)
entschieden.
Wenn
die
Extremitätenknospe Tbx5 exprimiert, entsteht eine obere Extremität, während die Tbx4Expression zur Entwicklung einer unteren Extremität führt (Gibson-Brown et al., 1996;
Rodriguez-Esteban et al., 1999; Übersichtsarbeiten zur Extremitäten-Entwicklung von
Johnson und Tabin, 1997; Ng et al., 1999; Capdevila et al., 2001).
Um sich der Entwicklung der paraxialen Komponente des Flügelskeletts, der Scapula-Klinge,
thematisch nähern zu können, ist es nötig, die Grundzüge der Somitenentwicklung
herauszuarbeiten.
Somiten
sind
aus
dem
unsegmentierten
paraxialen
Mesoderm
hervorgegangene epithelial organisierte Bälle, deren Binnenraum (Somitocoel) mit
mesenchymalen Zellen ausgefüllt ist. Die Somiten ordnen sich beidseits der primären
Achsenorgane
Chorda
dorsalis
und
Neuralrohr
an.
Die
mesenchymal-epitheliale
Transformation des paraxialen Mesoderms beginnt im Kopfbereich und schreitet in kraniokaudaler Richtung vor, so dass am Ende beim Huhn 52 Somitenpaare entlang der
Achsenorgane zu liegen kommen (zusammengefasst von Christ und Ordahl, 1995; Christ et
al., 1998).
Der ventrale Teil des epithelialen Somiten beginnt sich mesenchymal zu organisieren. Man
bezeichnet diesen Abschnitt des Somiten als „Sklerotom“. Aus dem Sklerotom geht in der
weiteren Entwicklung das Achsenskelett, d.h. die Wirbelsäule (zusammengefasst von Christ
et al., 2000) und die Rippen (Huang et al., 2000c), hervor.
Der dorsale Teil des Somiten bleibt nach der Abtrennung des Sklerotoms epithelial organisiert
und wird als „Dermomyotom“ bezeichnet. Direkt unterhalb dieser Epithelschicht formiert
sich in der weiteren Entwicklung das Myotom. Das Myotom stellt das Baumaterial für die
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post-kraniale quergestreifte Körperwandmuskulatur dar. Zahlreiche Untersuchungen haben
ergeben, dass die Zellen des Myotoms durch Proliferation und Abgliederung aus dem
dermomyotomalen Zellverband entstehen (zusammengefasst von Ordahl et al., 2000).
Während das mediale Drittel des Dermomyotoms die epaxiale Domäne, d.h. die spätere
autochthone Rückenmuskulatur, bildet, geben das mittlere und das laterale Drittel Zellen an
die hypaxiale Domäne, d.h. an die spätere ventro-laterale Rumpf- und an die
Extremitätenmuskulatur, ab (Huang und Christ, 2000a). Als nicht-myogene Derivate des
Dermomyotoms sind die Dermis des Rückens und Blutgefäße bekannt (zusammengefasst von
Brand-Saberi und Christ, 2000).
Überraschenderweise liegen die Vorläuferzellen der Scapula-Klinge in den Dermomyotomen
des zerviko-thorakalen Übergangsbereiches (Huang et al., 2000b). Somit ist die ScapulaKlinge der einzige bekannte Knochen, der seinen Ursprung im dermomyotomalen
Zellverband hat. Huang et al. (2000b) haben die Scapula-Klinge deshalb als „verknöcherten
Muskel“ bezeichnet.
Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass die Dermomyotome des zervikothorakalen Übergangsbereiches neben der myogenen, dermogenen und angiogenen auch eine
chondrogene
Potenz
aufweisen.
Die
Signal-Mechanismen,
die
diese
chondrogene
Subpopulation von dermomyotomalen Zellen zu ihrer Entwicklung benötigen, sind bislang
völlig unklar.
1.3.
Umliegende Signalgeber legen das Zellschicksal der Somitenderivate fest
Wie die Entwicklung der Extremität hängt auch die Somitenentwicklung von der
Spezifizierung und Aufrechterhaltung der räumlichen Polarität in bezug auf die Körperachsen
ab. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass die Kompartimentierung des epithelialen Somiten
in das dorsal gelegene Dermomyotom und in das ventral gelegene Sklerotom von
Signalmolekülen abhängt, die von den Achsenorganen, vom Ektoderm und vom
Seitenplattenmesoderm gebildet werden (zusammengefasst von Brand-Saberi et al., 1996;
Stockdale et al., 2000).
Die Achsenorgane Chorda dorsalis und Neuralrohr werden anhand ihrer Aufgaben während
der Embryonalentwicklung unterteilt in (1) den ventral gelegenen Chorda-BodenplattenKomplex und (2) den mittleren und dorsalen Teil des Neuralrohrs. Der Chorda-BodenplattenKomplex sezerniert die Signalmoleküle Sonic hedgehoc (Shh) und Noggin. Noggin ist ein
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Antagonist
einiger
BMP-Moleküle
(„Bone
Morphogenetic
Protein“).
Diese
zwei
Signalmoleküle scheinen für die Ventralisierung des Somiten verantwortlich zu sein und
steuern so die Etablierung des Sklerotoms und damit die Induktion des Achsenskeletts
(Johnson et al., 1994; Ebensperger et al., 1995; Balling et al., 1996; Müller et al., 1996;
McMahon et al., 1998; zusammengefasst von Dockter, 2000). Das mittlere und dorsale
Neuralrohr bildet eine Vielzahl von Signalmolekülen der Wnt-Familie und der TGFβSuperfamilie („Transforming Growth Factor“) und spielt für die Dorsalisierung (Ausbildung
des Dermomyotoms) und die Medialisierung (Ausbildung der epaxialen Muskulatur) des
Somiten eine wichtige Rolle (Marcelle et al., 1997; Ikeya und Takaya, 1998;
zusammengefasst von Borycki und Emerson, 2000). Das Ektoderm übernimmt, unter
anderem durch die Sekretion von Wnt-Proteinen, eine dorsalisierende und lateralisierende
Funktion und wirkt so positiv auf die Muskelentwicklung ein (Wagner et al., 2000; Dietrich et
al., 1998). Zudem konnte gezeigt werden, dass das Ektoderm für die Proliferation von
Muskelvorläuferzellen essentiell ist (Amthor et al., 1999). Das Seitenplattenmesoderm
produziert das Signalmolekül BMP-4 („bone morphogenetic protein 4“) und wirkt dadurch
lateralisierend auf den Somiten, was für die Entwicklung der hypaxialen Muskulatur von
Bedeutung ist (Pourquié et al., 1996).
Die bisherigen Arbeiten legen den Schluss nahe, dass umliegende Signalgeber darüber
entscheiden, ob Zellen des epithelialen Somiten an der Bildung des dorsalen Dermomyotoms
oder an der des ventralen Sklerotoms beteiligt werden. Mit dieser Entscheidung wird auch das
Zellschicksal festgelegt. Die Sklerotomzellen werden zu Knorpel-/Knochenzellen des
Achsenskeletts, während die dermomyotomalen Zellen hauptsächlich zu Muskelzellen
werden.
1.4.
Positionsinformationen
innerhalb
des
paraxialen
Mesoderms
legen
die
Morphologie der Somitenderivate fest
Die Somiten sind prinzipiell gleich aufgebaut, ebenso wie die Wirbelsäule, deren
Bewegungssegmente sich nicht in der Komposition ihrer Bauelemente, jedoch in der
Morphologie unterscheiden. Man bezeichnet die Abfolge prinzipiell gleicher Bauelemente
entlang der anterior-posterioren Achse als „Metamerie“ (Brand-Saberi und Christ, 2000).
Trotzdem entstehen Wirbel und Bewegungssegmente, die sich in ihrer Morphologie stark
unterscheiden. Als exemplarisches Beispiel können hier die Rippen dienen, die nur in Höhe
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der Brustwirbelsäule ausgebildet werden. Die anderen Abschnitte der Wirbelsäule entwickeln
keine Rippen, sondern nur kurze Rippenrudimente. Welche Mechanismen führen zu den
morphologischen Unterschieden zwischen den verschiedenen Segmenten des Achsenskeletts?
Die Somiten werden durch eine sogenannte „Segmentierungsuhr“ in Relation zur anteriorposterioren Achse des Embryos (dies entspricht der kranio-kaudalen Achse des adulten
Organismus) spezifiziert. Die Somiten erhalten auf diese Weise eine Positionsinformation zur
Spezifizierung ihrer Anlagehöhe (Dubrulle et al., 2001). Diese Positionsinformation findet auf
molekularer Ebene ihren Ausdruck in der Expression von Homöobox- (Hox-) Genen. HoxGene gehören zu einer Gen-Familie, die sich durch eine gemeinsame Konsensus-Sequenz (die
sogenannte „Homöobox“) auszeichnet und deren Produkte die Transkription zahlreicher
nachfolgender Gene während der Embryonalentwicklung regulieren. Hox-Gene werden
entlang der anterior-posterioren Achse in verschiedenen Kombinationen, dem sogenannten
Hox-Code, exprimiert. Zell-Verbände werden je nach ihrem Hox-Code z.B. zu Halswirbeln,
während eine andere Kombination der Hox-Gen-Expression den Zell-Verband z.B. die Form
von Brustwirbeln annehmen lässt. (Kessel et al., 1991; Krumlauf et al., 1993; Burke et al.,
1995; Nowicki et al., 2000).
Die Zellen des Sklerotoms scheinen ausnahmslos dieser Spezifizierung zu unterliegen,
während nicht alle Zellen des Dermomyotoms davon beeinflusst werden. Es wurde gezeigt,
dass sich die Muskelvorläuferzellen, die in die Somatopleura einwandern, gemäß ihren
Umgebungssignalen entwickeln, während die Muskelvorläuferzellen, die nicht mit der
Somatopleura in Kontakt kommen, schon sehr früh in ihrer späteren Morphologie festgelegt
sind und sich gemäß ihrer Anlagehöhe weiterentwickeln (Nowicki et al., 2000).
Die bisher an Mäuse- und Hühnerembryonen durchgeführten Arbeiten legen den Schluss
nahe, dass der Hox-Code innerhalb des paraxialen Mesoderms vor allem für die zukünftige
Form der Somitenderivate verantwortlich ist. Welche Rolle Positionsinformationen innerhalb
des paraxialen Mesoderms bei der Entwicklung der chondrogenen Dermomyotomzellen
spielen, ist bisher noch nicht untersucht worden.
1.5.
Die Scapula entwickelt sich auch in Säugetieren modular
Die detaillierten Untersuchungen zur Entwicklung der Somiten und ihrer Derivate wurden
erst durch die Identifikation von bestimmten Genen ermöglicht, die selektiv in einem der
Somitenkompartimente exprimiert werden. So kann das paired-box-Gen Pax1 als Marker für
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das Sklerotom benutzt werden, während sich das Dermomyotom durch die spezifische
Expression von Pax-3 auszeichnet (Brand-Saberi et al., 1993; Goulding et al., 1993; Love und
Tuan, 1993; Williams und Ordahl, 1994). Pax1 wird auch von den zukünftigen ScapulaZellen aus dem Dermomyotom exprimiert, nachdem sie ihren endgültigen Anlage-Ort in der
Schultergürtelregion erreicht haben (Hofmann et al., 1998; Healy et al., 1999; Huang et al.,
2000b). Diese Beobachtung führte zu der Hypothese, dass die Scapula-Zellen ihr
Muskelschicksal im Laufe ihrer Entwicklung hin zu einem Knorpelschicksal ändern (Huang
et al, 2000b).
An Mäusen, bei denen ein bestimmtes Gen durch Mutation seine Funktion eingebüßt hat,
kann man die Rolle dieses Gens in der Embryonalentwicklung untersuchen. Timmons und
Kollegen (1994) beschrieben für die Mutation des Pax1-Gens in der Maus-Mutante undulated
einen Defekt im kranialen Abschnitt der Scapula. In diesen Mäusen bleibt die Verknorpelung
des Acromions aus. Den gleichen Phänotyp im Acromion zeigen Mäuse, bei denen Pax1 und
Hoxa5 gleichzeitig ausgeschaltet wurden (Aubin et al., 2002).
Als ein weiterer Transkriptionsfaktor, der die Scapula-Entwicklung beeinflusst, konnte Emx-2
identifiziert werden. Emx-2 ist homolog zum Drosophila-Gen empty spiracles und spielt
während der Musterbildung im Endhirn eine entscheidende Rolle (zusammengefasst von
Cecchi et al., 2000). Außerdem wird es bei der Maus in der Anlage des Urogenitalsystems
exprimiert (Pellegrini et al., 1997). Homozygote Emx2-Mutanten zeigen überraschenderweise
sowohl einen Defekt in der Scapula als auch im Ilium (Pellegrini et al., 2001). Während sich
in der Maus die kranialen Abschnitte der Scapula, Acromion und Schultergelenksregion,
normal entwickeln, fehlt der kaudale Abschnitt, das „Schulterblatt“ im engeren Sinne,
komplett. Emx2 kommt also als Schlüsselregulator für die Scapula-Entwicklung bei
Säugetieren in Betracht. Diese Annahme kann erklären, warum es nur sehr wenige
Missbildungen des Schultergürtels beim Menschen gibt (Wolpert, 1999). Das Schlüssel-Gen
Emx2 wird nämlich auch für die Entwicklung von Großhirn und Nieren benötigt, ohne die der
Embryo nicht überlebensfähig ist.
Aufgrund der unterschiedlichen Morphologie der Scapula des Vogels und der Maus lassen
sich die beiden Spezies kaum vergleichen. Trotzdem deuten die zwei vorgestellten
Mausmutanten auf unterschiedliche Entwicklungsmechanismen bezüglich des kranialen und
kaudalen Scapula-Abschnitts hin. Pax1 scheint unabdingbar für die Ausbildung des kranialen
Abschnitts, während Emx2 eine wichtige Rolle bei der Formierung des kaudalen ScapulaAbschnitts einzunehmen scheint. Auch bei Säugetieren kann man also einen modularen,
zweigleisigen Entwicklungsmechanismus der Scapula beobachten.
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1.6.
Fragestellung und methodischer Zugang
Durch die Entdeckung des doppelten Ursprungs der Scapula beim Vogel wird eine Vielzahl
neuer Fragen aufgeworfen. Die vorliegende Arbeit will anhand der Ergebnisse nach
mikrochirurgischer Manipulation am Vogel-Embryo zur Klärung der folgenden Fragen
beitragen:
a)
Welches Verhältnis besteht zwischen den Entwicklungsmechanismen der
somatopleuralen und paraxialen Anteile des Flügelskeletts?
b)
Welche embryonalen, die Somiten umgebenden Gewebe kommen als
Signalgeber für die Entwicklung der Scapula in Betracht?
c)
Welche Mechanismen spezifizieren das Zellschicksal der chondrogenen
Zellpopulation
in
den
Dermomyotomen
des
zerviko-thorakalen
Übergangsbereiches?
Die Entfernung der zukünftigen AER verhindert das Auswachsen einer Extremitätenknospe.
Die Analyse des Schultergürtelskeletts nach dieser Operation wird in der vorliegenden Arbeit
vorgestellt. Aus den Ergebnissen werden Schlüsse über den Zusammenhang der Entwicklung
des somatopleuralen und des paraxialen Flügelskeletts gezogen.
Die Isolation von Scapula-bildenden Somiten von umliegenden, signalproduzierenden
Geweben mit anschließender Skelettanalyse erlaubte, den Einfluss dieser Gewebe auf die
Entwicklung des gesamten Extremitätenskeletts zu untersuchen. Daraus werden sich
Schlussfolgerungen sowohl hinsichtlich der Aufrechterhaltung dieser Zellpopulation im
Dermomyotom, als auch zu den Mechanismen ihrer Differenzierung ergeben.
Die Verfolgung des Schicksals der chondrogenen Dermomyotomzellen an ektopischer
Lokalisation gibt Auskunft über die intrinsische Fähigkeit der zerviko-thorakalen
Dermomyotome, eine chondrogene Subpopulation zu etablieren. Aus diesem Ergebnis wird
geschlossen, dass die Zellen der Scapula-Klinge segmental spezifiziert werden.
________________________________________________________Material
und Methoden
10
2.
Material und Methoden
2.1.
Tiere
Die befruchteten Hühner-Eier der Rasse „Weiße Leghorn“ (Gallus gallus) und von
japanischen Wachteln (Coturnix coturnix japonica) wurden vom Hühnerhof Bronner in
Freiburg/Tiengen bezogen und bei 18°C aufbewahrt. Die Eier wurden bei 37.8°C und 80%
Luftfeuchtigkeit in einem Brutschrank inkubiert, bis das angestrebte Entwicklungsstadium
erreicht war.
Das Entwicklungsstadium wurde vor der Operation und bei der Fixierung entsprechend den
Maßgaben von Hamburger und Hamilton (1951) bestimmt. Im folgenden wird das
Entwicklungsstadium mit der entsprechenden Nummer mit der Abkürzung „HH-Stadium Nr.“
angegeben.
2.2.
Mikrochirurgische Technik
2.2.1. Art und Herstellung des Instrumentariums
Zum Öffnen der Eierschale wurden Metallsägeblätter (Haushaltsbedarf) verwendet.
Die Operationen wurden unter binokularen Operations-Mikroskopen (Wild/Heerbrugg,
Schweiz M10 oder M3Z) durchgeführt.
Zur kontrastreicheren Darstellung unter dem Operationsmikroskop musste der Embryo in ovo
bei Bedarf mit speziell angefertigten Farbstiften angefärbt werden. Dazu wurden über dem
Bunsenbrenner aus Glasstäben feine Glaskugeln hergestellt, die mit einer blauen FarbstoffLösung beladen wurden.
Für die exakte Schnittführung im embryonalen Gewebe kam elektrolytisch geschärfter
Wolfram-Draht (Durchmesser 0,5 mm; Elektrolyse in gesättigter NaNO2-Lösung bei 12V
Spannung) zum Einsatz. Als Halterung und Griff für den Draht diente eine Glaspipette, in
deren schmales Ende der Draht eingeschmolzen wurde. Intraoperativ wurde die so
hergestellte Wolfram-Nadel in der Kerzenflamme gesäubert und nachgeschärft.
Die feinen, intraoperativ und zur Fixierung verwendeten Instrumente aus dem
ophtalmologischen Operationsbedarf (Federscheren, Sieblöffel) wurden von den Firmen
Aesculap und Geuder bezogen und sterilisiert verwendet.
Als Greifinstrumente kamen Dumont-Pinzetten (Schweiz) zur Anwendung.
________________________________________________________Material
und Methoden
11
Selbst hergestellte Saugkapillaren dienten bei Transplantationsoperationen zur schonenden
Entfernung von überstehendem Empfängergewebe, das mit der Wolfram-Nadel nicht entfernt
werden konnte, und zum Transfer des Spendergewebes zum Empfänger. Hierzu wurde eine
Pasteur-Pipette an ihrem schmalen Ende mit der Pinzette gegriffen und über der
Kerzenflamme zur Rotglut gebracht. Außerhalb der Flamme wurde das erhitzte Glas so
schnell wie möglich ausgezogen. Durch Brechen an verschiedenen Stellen der so
entstandenen Kapillare konnte der Durchmesser dem jeweiligen Bedarf angepasst werden.
Auf das unversehrte Ende der Pasteurpipette wurde ein ca. 40 cm langer Gummischlauch
aufgesteckt. Über den Gummischlauch wurde der Unterdruck innerhalb der Kapillare durch
Saugen mit dem Mund kontrolliert.
2.2.2. Allgemeine Operationstechnik und Fixierung
Die Operationen wurden in einem eigens dafür eingerichteten Raum vorgenommen, der mit
UV-Strahlen frei von Mikroorganismen gehalten wurde. Vor dem Operationsbeginn wurden
die Arbeitsoberflächen und die Hände mit 70%iger Ethanollösung desinfiziert. Die Position
des Embryos und der Luftblase konnte mit Hilfe von Durchlicht im geschlossenen Ei
festgestellt werden. Die Oberfläche der Eierschale wurde über dem Embryo und der Luftblase
mit 70%iger Ethanollösung desinfiziert. Mit der Metallsäge und einer Pinzette wurde ein
rechteckiges Fenster (ca. 5x5 mm) direkt über dem Embryo ausgeschnitten, so dass die der
Schale anliegende Eihaut unversehrt zum Vorschein kam. Die Schale über der Luftblase
wurde angesägt. Mit einer feinen Pinzette wurde die Eihaut im Operationsfenster entfernt. Ein
Pinzetten-Stich in die Luftblase durch die angesägte Eierschale führte dann zu einem
Absinken des Embryos im Ei. Eine physiologische Nährlösung (nach Locke und Rosenheim)
mit Antibiotikazusatz wurde in das Operationsfenster getropft, was zu einem Aufschwimmen
des Embryos führte. Die Oberflächenspannung der Nährlösung reichte aus, den Embryo an
den Rand des Operationsfensters in der Eierschale zu heben. Die Beleuchtung von der Seite
wurde nun so eingestellt, dass der bestmögliche Kontrast im Operationsfeld erreicht wurde.
Mit einer Wolfram-Nadel wurde die Vitellinmembran über dem Operationsgebiet entfernt,
was den Embryo für den eigentlichen Eingriff freilegte.
Nach abgeschlossener Operation wurden 1-2 ml Eiweiß mit einer großlumigen
Injektionskanüle (Braun Sterican Gr. 2) über das Loch zur ehemaligen Luftblase abgesaugt,
was zum Absinken des Embryos führte. Das Operationsfenster und die Öffnung zur Luftblase
________________________________________________________Material
und Methoden
12
wurden mit Klebeband (Leukosilk) abgedichtet, um die Austrocknung des Embryos zu
verhindern. So behandelt wurden die Eier in den Inkubator zurück gestellt.
Zur Fixierung wurden die Embryonen durch ein großzügiges Fenster in der Ei-Schale
entnommen und je nach weiterer Verarbeitung in PBT oder PBS präpariert. Die Ei-Häute, die
inneren Organe und der Kopf wurden je nach Bedarf entfernt, bevor das Exemplar in die
Fixier-Lösung gegeben wurde.
2.2.3. Spezielle Operationstechniken
2.2.3.1. Implantation einer Barriere zwischen Achsenorgane und Somiten
Um die Scapula-bildenden Somiten von Signalen der Achsenorgane abzuschirmen, wurde mit
einer Wolfram-Nadel der Embryo zwischen den Achsenorganen und den epithelialen Somiten
17-24 in den HH-Stadien 13/14 durchtrennt. In den entstandenen Schlitz wurde eine
Aluminiumfolie (Dicke: 20 µm) passender Größe implantiert, um den Austausch von
Signalmolekülen nachhaltig zu unterdrücken.
2.2.3.2. Ektoderm-Entfernung
Großer Wert musste auf die Festlegung der medio-lateralen und anterior-posterioren
Ausdehnung des entnommenen Ektoderms gelegt werden. Hierzu wurde das zu entnehmende
Ektoderm mit der Wolfram-Nadel entlang den angestrebten Grenzen perforiert, bevor es
entfernt
wurde.
Diese
Abgrenzung
erlaubte
eine
sehr
genaue
Bemessung
der
Exstirpationsgrenzen und sorgte für die Schonung des umliegenden Ektoderms. Weiterhin
wurde besonderes Augenmerk auf die Unversehrtheit der unter dem Ektoderm liegenden
Strukturen,
insbesondere
Somiten
bzw.
Dermomyotome,
gelegt.
Die
genauen
Exstirpationsgrenzen sind bei den entsprechenden Experimenten angegeben.
Das Ektoderm ließ sich bei 2 Tage bebrüteten Embryonen ohne Schaden an den darunter
gelegenen Strukturen abziehen. Nach 3 Tagen Inkubationszeit (ca. HH-Stadium 18) ist
allerdings die subektodermale extrazelluläre Matrix so stark, dass sie ein schadfreies
Abziehen behindert. Deshalb musste die extrazelluläre Matrix mit 0,1% Trypsin-Lösung
(Sigma, Deisenhofen) verdaut werden. Um den Embryo durch diese Behandlung nicht zu sehr
zu schädigen, wurde das Ei nach 10 – 30 Sekunden Einwirkzeit mindestens fünfmal mit
frischer Locke-Nährlösung ausgespült.
Das Ektoderm hat eine sehr hohe Proliferationsrate. Entfernt man es zum Beispiel von der
zukünftigen Extremitätenregion in 2 Tage bebrüteten Embryonen (HH-Stadium 14), so kann
________________________________________________________Material
und Methoden
13
man schon nach 6 Stunden eine nahezu vollständige Bedeckung der Wunde mit EktodermRegenerat beobachten. Man muss davon ausgehen, dass das regenerierte Ektoderm seine
physiologische Signalaktivität wieder aufnimmt. Wenn man die Embryonen länger als 6
Stunden reinkubieren möchte, muss die Regeneration deshalb unterbunden werden. Um
dieses Ziel zu erreichen, wurde die Ektodermläsion mit Blattgold bedeckt. Blattgold ist eine
wenige Atomschichten dicke Folie aus elementarem Gold. Wegen seiner chemisch edlen
Eigenschaften kann Gold keine Reaktion im Gewebe auslösen, isoliert die Dermomyotome
aber nachhaltig vom ektodermalen Einfluss. Das Blattgold wurde mit einer Federschere unter
dem Mikroskop passend zugeschnitten und auf das operierte Gebiet gelegt.
2.2.3.3. Implantation einer Barriere zwischen Somatopleura und Somiten
Zur Beantwortung der Fragestellung war es nötig, die Scapula-bildenden Somiten so spät wie
möglich vom Einfluss der lateral gelegenen Somatopleura zu isolieren. Hierzu sind zwei
Vorraussetzung zu erfüllen: (1) Die Anlage der Köperhöhlen, das Coelom muss vollständig
kavernisiert sein, und (2) die medio-laterale Abfaltung des Embryos darf nicht zu weit
fortgeschritten sein. Als geeignetes Stadium für diesen Eingriff erwies sich HH-Stadium
16/17. Mit einer Wolfram-Nadel wurden das Ektoderm und die Somatopleura durchstochen.
Die Nadelspitze lag dann im Coelom und erlaubte ein Vorpräparieren bis zur medialen
Umschlagfalte der Somatopleura in die Splanchnopleura. Von dieser Umschlagfalte aus
wurde in anteriorer Richtung entlang aller Scapula-bildenden Somiten (So. 24-17) die
Somatopleura vom paraxialen und intermediären Mesoderm getrennt.
Um den Austausch von Signalmolekülen und den Zell-Zell-Kontakt nachhaltig zu
unterdrücken, wurde in den so entstandenen Schlitz eine sterilisierte Aluminiumfolie
passender Größe implantiert.
2.2.3.4. Herstellung der Wachtel-Huhn-Chimären
Das Prinzip der Wachtel-Huhn-Chimärisierung besteht darin, dass dem Hühnerembryo eine
bestimmte Zellpopulation entnommen und durch eine Zellpopulation des Wachtelembryos
ersetzt wird. Der Hühnerembryo entwickelt sich mit dem implantierten Wachtelgewebe
normal weiter. Nach Fixierung können die implantierten Zellen mit einem spezifischen
Antikörper gegen Wachtelzellen im Hühnerembryo nachgewiesen werden. Die Verteilung
und Differenzierung der Wachtelzellen gibt Aufschluss über das Entwicklungsschicksal der
transplantierten Zellpopulation.
________________________________________________________Material
und Methoden
14
Vorraussetzung zur Beantwortung der Fragestellung war, dass nur dermomyotomales Gewebe
transplantiert wurde. Gleichzeitig sollte dies in möglichst jungen Stadien geschehen. Da
bekannt ist, dass die dorsale Hälfte von epithelialen Somiten das zukünftige Dermomyotom
darstellt, wurde diese transplantiert. Das Stadium von Spender (Wachtel) und Empfänger
(Huhn) wurde so gewählt, dass sich die Somiten-Hälften des Transplantats und die
entnommenen Somiten-Hälften des Empfängers (Huhn) in ihrem Reifegrad nicht
unterschieden. Man kann davon ausgehen, dass sich die Anlagehöhe und Anzahl der Scapulabildenden Somiten von Wachtel und Huhn entsprechen (Huang et al., 2000b).
Herstellung des Transplantats aus Wachtelembryonen:
Die Wachtelembryonen wurden bis HH-Stadium 14 inkubiert. In diesem Stadium sind die
Scapula-bildenden Somiten zum größten Teil in epithelialem Zustand. Das Ektoderm wurde
über den Somiten entfernt. Zwei bis drei epitheliale Somiten wurden als Transplantat
ausgewählt. Die dorsalen Hälften dieser Somiten wurden mit einer Wolfram-Nadel
ausgeschnitten ohne umliegendes Gewebe mit in das Transplantat aufzunehmen. Das
Transplantat wurde mit einer Saugkapillare zum präparierten Empfänger transportiert.
Präparation des Empfängers (Hühnerembryo):
Die Hühnerembryonen wurden bis zu den HH-Stadien 12/13 inkubiert. In diesen Stadien sind
die zervikalen Somiten in epithelialem Zustand. In Höhe der Somiten 9-12 wurde das
Ektoderm von medial her mobilisiert und auf die Seite geklappt. Die darunter gelegenen
dorsalen Hälften der epithelialen Somiten wurden mit einer Wolfram-Nadel entnommen.
Überstehendes Gewebe wurde mit einer Saugkapillare entfernt. Das Transplantat wurde in die
so präparierte Lücke eingebracht. Das Ektoderm wurde zurückgeklappt und diente als
Fixierung des Transplantates.
Das Ergebnis dieser Operation war ein Hühnerembryo, dessen zervikale Dermomyotome zum
Teil durch Scapula-bildende Dermomyotome der Wachtel ersetzt wurden.
2.3.
Analyse des Skelett-Musters
Um einen optimalen dreidimensionalen Überblick zu erhalten, wurde das Skelettsystem im
intakten Embryo angefärbt und unter dem Mikroskop beurteilt. Die Scapula, das distale
Extremitätenskelett und das Achsenskelett ossifizieren indirekt, d.h. eine knorpelige Anlage
dieser Knochen geht dem Umbau in endgültiges Knochengewebe voraus. Das hat zur Folge,
dass man den Skelett-Status eines Embryos durch Anfärben dieser Knorpelschablone sichtbar
machen kann. Die Scapula ist am 9. Entwicklungstag (HH-Stadium 35) fast vollständig
________________________________________________________Material
und Methoden
15
knorpelig angelegt. Die Embryonen wurden deshalb nach 8 bis 9 Tagen Inkubationszeit
fixiert.
Ein Farbstoff, der sich zur Anfärbung von Knorpel eignet, ist Alcian-Blau. Seine kationischen
Eigenschaften lassen Alcian-Blau an anionische Proteoglykane (z.B. HeparansulfatProteoglykan) binden, die in entsprechend großen Mengen nur im Knorpel vorkommen
(Rohrbach, 1999).
Um das in der Tiefe liegende Skelett darzustellen, muss nach der Färbung das umliegende
Gewebe durchsichtig gemacht werden. Zwei Methoden kamen je nach Fragestellung zur
Anwendung.
2.3.1. Knorpel-Knochenfärbung mit Gewebe-Verdau
-
Fixierung und Aufbewahrung bei 4°C in 100% Ethanol.
-
100%
Aceton
in
Raumtemperatur
für
24
Stunden
(Erhöhung
der
Gewebepermeabilität).
-
Färbung in Farblösung I (Herstellung der erwähnten Lösungen siehe Abschnitt
2.5.) für 3-4 Tage bei Raumtemperatur.
-
Gewebe-Verdau in KOH-Lösung bis das Skelett gut sichtbar ist.
-
Beurteilung, Fotografie und Lagerung in 100% Glycerin zur Stabilisierung des
Skeletts.
Durch den Verdau des Weichteilgewebes ergibt sich eine sehr gute Übersicht über das
Skelett-Muster. Die Weichteile gehen jedoch völlig verloren.
2.3.2. Knorpelfärbung für weitere histologische Aufarbeitung
-
Fixierung und Aufbewahrung in 100% Ethanol bei 4°C mit einmaligem
Lösungswechsel zur vollständigen Dehydrierung.
-
Färbung in Farblösung nach Kant und Goldstein (1999) für 7-9 Tage bei
Raumtemperatur.
-
Aufhellung, Weiterverarbeitung und Aufbewahrung in 100% Methylsalicylat
(Sigma).
Diese Methode erlaubt nach der dreidimensionalen Beurteilung des Skeletts die
immunhistologische Aufarbeitung des Exemplars. Nachteilig wirkt sich die schlechtere Sicht
auf das Skelett am ungeschnittenen Gesamtpräparat aus.
________________________________________________________Material
und Methoden
16
2.4.
Histologie und Färbetechniken
2.4.1. Whole-mount in situ-Hybridisierung
Die whole-mount in situ-Hybridisierung ermöglicht die Detektion von mRNA eines
bestimmten Gens in einem vollständig intakten Embryo. So lässt sich ein Bild über die
Expression dieses Gens in Relation zur Anatomie des untersuchten Embryos gewinnen. Die
Methode lässt auf zellbiologischer Ebene nur Schlüsse auf die Transkription eines Genes,
jedoch nicht auf die Translation zu.
Prinzipiell beruht die Methode auf der Eigenschaft von Nukleinsäuren doppelsträngige
Moleküle zu bilden, wenn die Nukleinsäure-Abfolge entsprechend zueinander passt. Die
mRNA liegt als Einzelstrang in der Zelle vor. Gibt man einen markierten gegensinnigen
Strang eines bestimmten Gens hinzu, bildet dieser mit der entsprechenden mRNA einen
Doppelstrang. Somit wird der markierte Strang in dieser Zelle fixiert, während er aus mRNAnegativen Zellen wieder ausgewaschen wird. Eine enzymatisch katalysierte Farbreaktion
macht die Bindung des markierten Gegenstrangs sichtbar.
Das hier verwendete Protokoll für die Pax1-in situ-Hybridisierung folgt -in einzelnen
Schritten modifiziert- dem Protokoll nach Nieto et al. (1996). Die folgende Tabelle fasst die
Arbeitsschritte zusammen.
Arbeitsschritte
Temp.
Anzahl/Zeit
I. Vorbehandlung der Embryonen
Präparation der Embryonen in PBT
4°C
Fixierung der Embryonen mit 4% PFA in PBT
über Nacht
4°C
Waschen in PBT
1x 15 min
4°C
Dehydrierung in 100% Methanol
2x 15 min
4°C
Rehydrierung in PBT
1x 15 min
4°C
Enzym-Verdau mit Proteinase K (20 µg/ml) in PBT
ca. 60 min
18°C
Waschen in PBT
1x 10 min
4°C
Fixierung in 0,25% Glutaraldehyd und 4% PFA in PBT
1x 20 min
4°C
Waschen in PBT
1x 10 min
4°C
Prähybridisieren in Hybridisierungspuffer
1x 2 h
65°C
(Aufbewahrung in Methanol bei –20°C möglich)
________________________________________________________Material
und Methoden
17
In frischem Hybridisierungspuffer
über Nacht
65°C
II. Hybridisierung
Hinzufügen der RNA-Sonde zum Hybridisierungspuffer
1x 2 d
65°C
III. Waschen
Waschen in 2fach SSC ohne CHAPS
1x 20 min
65°C
Waschen in 2fach SSC mit CHAPS (CHAPS:SSC = 1:50)
2x 20 min
65°C
Waschen in 0,2fach SSC mit CHAPS (CHAPS:SSC = 1:50)
2x 20 min
65°C
Wechsel in KTBT
1x 5 min
18°C
IV. Immunhistochemischer Sonden-Nachweis
Blockierung unspezifischer Bindungen mit 10% Pferdeserum in KTBT 1x 4 h
18°C
Inkubation mit Antikörper-Lösung (anti-DIG)
über Nacht
4°C
Waschen in KTBT
6x 2 h
18°C
Waschen in KTBT
über Nacht
4°C
Waschen in AP-Puffer
2x 15 min
18°C
Inkubation mit der Färbe-Lösung (vor Licht geschützt)
nach Bedarf 18°C
Waschen in AP-Puffer
über Nacht
4°C
Refixierung in 4% PFA in PBS
2.4.2. Herstellung der Paraffinschnitte für die histologische Untersuchung
Nach der Fixierung wurden die Embryonen in vollständig dehydriertem Zustand (100%
Ethanol) oder aus 100% Methylsalycilat in Rotihistol (Roth) überführt und in Paraffin
eingebettet. Mit einem Mikrotom wurden die interessierenden Abschnitte der Embryonen in
der Transversalebene lückenlos in 8 µm dicke Scheiben geschnitten. Die Serienschnitte
wurden auf Glycerin-Gelatine bedeckte Objektträger aufgezogen und in einem Wärmeschrank
(40°C) getrocknet.
2.4.3. Proliferationsdetektion mit BrdU-Assay
Die Embryonen wurden 24 Stunden nach der Ektoderm-Entfernung (HH-Stadium 20) aus
dem Inkubator entnommen, das Klebeband entfernt und durch das Fenster in der Ei-Schale
wurden 100 µl einer 40 mmol 5´Bromo-2-Desoxyuridin-Lösung (BrdU, Sigma) appliziert.
Die Embryonen wurden für 25 min im Brutschrank reinkubiert. In dieser Zeit wurde das BrdU
________________________________________________________Material
und Methoden
18
von sich teilenden Zellen in ihre DNA eingebaut. Das in die DNA eingebaute BrdU konnte
durch immunhistochemische Methoden nachgewiesen werden und gab somit Aufschluss über
die Proliferationsrate im Gewebe.
Die Embryonen wurden präpariert und nach Serra (1946) für mindestens 24 h fixiert. Nach
zweimaligem Waschen in 100% Ethanol wurden die Embryonen in Paraffin eingebettet und
geschnitten. Das Protokoll für die immunhistochemische Detektion der BrdU-markierten
DNA kann der folgenden Tabelle entnommen werden.
Arbeitsschritte
Anzahl / Zeit
I. Entparaffinierung/Blockierung der endogenen Peroxidase
Rotihistol (Roth)
4x 3 min
100% Ethanol
2x 3 min
Methanol und Wasserstoffperoxid (600 µl H2O2 in 200 ml MeOH)
1x 20 min
II. Brechen der Zell- und Kernmembran
2 N HCl
1x 30 min/ 37°C
0,1 M Na2B4O7 pH 8.5
1x 15 min
III. Immunreaktion
Waschen in PBS-Tween
1x 5 min
Waschen in PBS
1x 5 min
1% Rinderserumalbumin (BSA) zur Präinkubation
1x 20 min
anti-BrdU-Antikörper (Maus, Dako) 1:100 in PBS
1x 90 min
Waschen in PBS
2x 5 min
Ziegen-anti-Maus-Antikörper mit Peroxidase (GamPo, Sigma)
1x 60 min
1:250 in PBS
Waschen in PBS
1x 5 min
IV. Färbung
Farbreaktion in DAB-Lösung mit Ammoniumnickelsulfat
1x 10 min
Waschen in Aqua bidest.
2x 30s
Gegenfärbung der Kerne mit Kernecht-Rot-Lösung
1x 30s
V. Dehydrieren und Eindeckelung
Aufsteigende Alkoholreihe, von dort in Rotihistol
Deckgläser mit Entellan fixieren
________________________________________________________Material
und Methoden
19
2.4.4. Immunhistochemische Färbung an Hühnerembryonen und Wachtel-Huhn-Chimären
Nach der Beurteilung des Skelett-Musters an ganzen Embryonen wurden die mit
Methylsalicylat behandelten Exemplare in Paraffin eingebettet, um immunhistochemisch das
Muskelmuster und/oder den Verbleib der transplantierten Wachtelzellen aufzuklären.
Prinzipiell werden zur immunhistochemischen Detektion von bestimmten Zelltypen
Antikörper verwendet, die zelltypische Antigene binden und somit am Antigen fixiert werden.
Muskelzellen exprimieren das muskelspezifische Antigen Desmin. Gegen Desmin gibt es
sowohl monoklonale als auch polyklonale Antikörper zu kaufen. Wachtelzellen exprimieren
andere Kernmembran-Antigene als Hühnerzellen. Ein monoklonaler Antikörper steht gegen
diese wachtelspezifischen Proteine zur Verfügung.
Die Detektion von Antigenen, die vom untersuchten Gewebe selbst exprimiert werden, folgt
dem gleichen Prinzip wie die Detektion von BrdU mit dem Anti-BrdU-Antikörper. Ein erster
Antikörper bindet das betreffende Antigen (Desmin oder Kernmembranproteine von
Wachtelzellen). Dieser erste Antikörper wird von einem zweiten Antikörper erkannt, der mit
einem Enzym markiert ist. Diese Enzym kann eine Farbreaktion katalysieren und somit das
Antigen sichtbar machen. Hier werden nur die Unterschiede zur Immunhistochemie nach
BrdU-Behandlung (siehe 2.4.3.) angegeben:
Die Immunhistochemie mit Anti-Desmin- und QCPN-Antikörpern wurde ohne Brechen der
Zell- und Kernmembranen durchgeführt.
Die Schnitte von Hühnerembryonen wurden mit einem murinen, monoklonalen Anti-DesminAntikörper (Dako, Verdünnung 1:100 in PBS) inkubiert. Als zweiter Antikörper diente ein
Ziegen-anti-Maus-Antikörper mit Peroxidase-Konjugation (GamPo, Sigma). Die DABReaktion mit Ammoniumnickelsulfat ergab eine Braunfärbung der Desmin exprimierenden
Zellen.
Die
Schnitte
von
Wachtel-Huhn-Chimären
wurden
einer
Doppelmarkierung
von
Wachtelzellen und Muskelzellen unterzogen. Im ersten Inkubations-Schritt erkannte ein
polyklonaler,
aus
Kaninchenserum
gewonnener
Anti-Desmin-Antikörper
(Sigma,
Verdünnung 1:400) das Desmin, und ein muriner, monoklonaler QCPN-Antikörper (Quail
Cell Nuclei, Hybridoma Bank, Überstand der Zellkultur) die Zellkerne der Wachtelzellen. Im
zweiten Schritt erkannte ein Ziegen-anti-Kaninchen-Antikörper, mit Peroxidase konjugiert
(GarPo, Sigma, Verdünnung 1:250), den Anti-Desmin-Antikörper und ein Ziegen-anti-MausAntikörper, mit alkalischer Phosphatase konjugiert (GamAP, Dako, Verdünnung 1:100), den
________________________________________________________Material
und Methoden
20
QCPN-Antikörper. Zuerst wurde nun die Peroxidase-Reaktion mit DAB-Lösung ohne
Ammoniumnickelsulfat entwickelt. Danach wurden die Schnitte in AP-Puffer überführt und
die Alkalische-Phosphatase-Farbreaktion mit NBT/BCIP-Färbelösung bis zu 60 min
entwickelt. Aus dem AP-Puffer heraus erfolgte die Gegenfärbung mit Kernecht-Rot. Die
Desmin tragenden Muskelzellen wurden hellbraun, die Wachtelzellen blau angefärbt.
2.5.
Fotografie
Totalpräparate wurden mit einem Wild M10 Stereomikroskop fotografiert. An einem
Durchlichtmikroskop der Firma Leica wurden die Serienschnitte fotografiert. Als
Filmmaterial diente Kodak Ektachrom 64T. Die Diafilme wurden von der Firma Vario
(Freiburg) entwickelt. Mit handelsüblichen Dia-Scannern wurden die Diapositive digitalisiert.
Die
Zusammenstellung
und
Beschriftung
der
Abbildungen
erfolgte
mit
der
Bildbearbeitungssoftware „Adobe Photoshop 7.0“.
2.6.
Chemische Reagenzien und Zusammensetzung der verwendeten Lösungen
2.6.1. Lösungen für die Operation
• Farbstofflösung für Farbstifte:
1% Nil-Blau-Sulfat und 2,5% Agar in Aqua bidest. erhitzten und die Farbstifte mit der
entstandenen Flüssigkeit imprägnieren.
• Locke-Lösung:
Stammlösung A: 94,270 g NaCl auf 1000 ml Aqua bidest.
Stammlösung B: 12,0253 g KCl auf 1000 ml Aqua bidest.
Stammlösung C: 15,8092 CaCl*H2O auf 1000 ml Aqua bidest.
100 ml A auf 1000 ml mit Aqua bidest auffüllen + 37 ml B + 21 ml C + 0,03 g
Penicillin G Natriumsalz
2.6.2. Lösungen für die Skelett-Analyse
• Farblösung I für Knorpel-/Knochenfärbung:
________________________________________________________Material
und Methoden
21
0,017 g% Alcian-Blau (Sigma)
0,006 g% Alicarin-Rot (Sigma)
68 Vol% Ethanol
in Aqua dest.
5 Vol% Eisessig
• KOH-Lösung für Gewebe-Verdau bei Knorpel-/Knochenfärbung:
1 g% KOH-Tabletten
20 Vol% Glycerin
in Aqua dest.
• Farblösung nach Kant und Goldstein (1999):
0,015 g% Alcian-Blau (Sigma)
20 Vol% Eisessig
in reinem Ethanol
2.6.3. Lösungen für die whole-mount in situ-Hybridisierung und Histologie
• Paraformaldehyd (PFA) (Sigma)
10fach PBS-Stammlösung:
72 g NaCl, 4,3 g KH2HPO4, 14,8 g Na2HPO4*12H2O auf 2000 ml mit Aqua bidest
auffüllen.
• PBT: 0,1% Triton X-100 (Sigma) in PBS.
• Proteinase K-Stammlösung:
20 mg/ml Proteinase K (Sigma) in PBT.
• Glutaraldehyd-Stammlösung:
25 % Glutaraldehyd (Sigma)
• Hybridisierungspuffer:
2% Blockierungspulver (Boehringer)
0,1% Triton X-100
0,1% CHAPS (Sigma)
1 mg/ml tRNA
5mM EDTA
50 µg/ml Heparin
in 1:1
Formamid : 5fach SSC
________________________________________________________Material
und Methoden
22
• 20fache SSC-Stammlösung:
3M NaCl und 0,3M Natrium-Citrat; pH 7.0
• KTBT-Lösung:
50mM Tris-HCl, pH 7.5; 150mM NaCl; 10mM KCl, 1% Triton X-100
• Antikörper-Lösung:
Anti-Digoxigenin-Antikörper (Boehringer) und 10% Ziegen-Serum in KTBT werden
im Verhältnis 1:2000 verdünnt.
• AP-Puffer:
5 ml 1M Tris-Puffer pH 9,5
2,5 ml 1M MgCl2
mit destilliertem Wasser
1 ml 5M NaCl
auf 50 ml auffüllen
2 ml Triton X-100 (Firma)
• Färbe-Lösung:
4,5 µl/ml NBT (Boehringer)
3,5 µl/ml BCIP (Boehringer)
in AP-Puffer
• CHAPS-Lösung:
10 g Trockensubstanz in 100 ml Aqua bidest.
• 1 M Tris-Puffer-Stammlösung:
121,1 g Tris in 800 ml Aqua bidest. auflösen, pH-Einstellung mit konzentrierter HCl,
auf 1000 ml mit Aqua bidest. auffüllen
• Pax1-Sonde:
Die Pax1-Sonde ist als ein 1,5 kb Insert in den Vektor pBluescript II KS (Ebensperger
et al. 1995) einkloniert. Sie wurde durch in-vitro-Transkription mit Digoxigenin-UTP
nach dem Protokoll der Firma Roche (DIG RNA Labeling Mix, 10x konz., Best. Nr.
1277073) markiert.
• BrdU-Lösung 40mmol:
0,01228 g/ml BrdU (Sigma) in Locke-Lösung
• Serra-Fixierlösung 1l:
600 ml Ethanol, 300 ml Formol, 100 ml Eisessig
• PBS-Tween:
500 µl Tween in 1000 ml PBS
• BSA: Rinderserumalbumin (Serva)
________________________________________________________Material
und Methoden
23
• DAB-Lösung ohne Ammoniumnickelsulfatzusatz:
200 ml Tris-HCl Puffer pH 7.6 + 80 mg DAB + 40 µl H2O2
• DAB-Lösung mit Ammoniumnickelsulfatzusatz:
175 ml Tris-HCl pH 7.6 + 1% Ammoniumnickelsulfat in 25 ml Tris-HCl pH 7.6
+ 80 mg DAB + 40 µl H2O2
• 80 mg DAB-Portionen:
Diaminobenzidin (DAB) 5g in 62,5 ml Aqua bidest. lösen und in 1 ml portionieren
ergibt eine Endkonzentration von 80 mg/ml. Lagerung bei –20°C.
• Kernecht-Rot-Lösung:
1 g Kernecht-Rot in 1000 ml 5%iger Aluminiumsulfatlösung lösen und filtrieren.
__________________________________________________________________Ergebnisse
24
3.
Ergebnisse
3.1.
Barrieren-Implantation zwischen den Achsenorganen und Somiten
Die Entwicklung des Sklerotoms und damit des Achsenskeletts hängt hauptsächlich von der
Signalaktivität des Chorda-Bodenplatten-Komplexes ab. Dieser Komplex besteht aus der
Chorda dorsalis und dem ventralen Abschnitt des Neuralrohrs. Von ihm wird das
Signalmolekül Sonic hedgehog (Shh) gebildet. Shh induziert die Expression von Pax1 im
Somiten und spezifiziert so das Sklerotom (Johnson et al., 1994). Man geht davon aus, dass
die Pax1-Induktion den ersten Schritt zur Festlegung der Knorpelvorläuferzellen auf ihr
zukünftiges Zellschicksal darstellt (Christ et al., 2000). Somit ist der Chorda-BodenplattenKomplex ein Induktor des chondrogenen Zellschicksals während der Somitenentwicklung.
Der intermediäre und dorsale Teil des Neuralrohrs produziert zahlreiche Signalmoleküle, die
während der Entwicklung des Somiten eine medialisierende Funktion ausüben. Die
Entwicklung der epaxialen Muskulatur hängt essentiell von den Signalmolekülen aus den
dorsalen Abschnitten des Neuralrohrs ab (zusammengefasst von Borycki und Emerson, 2000).
Es stellt sich die Frage, ob die Achsenorgane für die Entwicklung der chondrogenen
Dermomyotomzellen ebenso eine induktive Rolle spielen.
Um den Einfluss des Chorda-Bodenplatten-Komplexes und der dorsalen Anteile des
Neuralrohrs auf die Scapula-Entwicklung zu untersuchen, wurde eine Aluminium-Barriere
zwischen die Achsenorgane, Neuralrohr und Chorda dorsalis, und die Scapula-bildenden
Somiten von zwei Tage alten Embryonen (HH-Stadium 14) implantiert (Abb. 2A). Bei sieben
Embryonen wurde der Skelett-Status analysiert. Alle Embryonen zeigten schwere
Entwicklungsstörungen im Achsenskelett und den Rippen. Die Wirbel, insbesondere die
Wirbelbögen, waren missgebildet, während die Rippen stark verkürzt oder nicht vorhanden
waren. Die Entwicklungsstörungen der Sklerotomderivate waren wegen des ausgeschalteten
Shh-Signals zu erwarten. Allerdings zeigte keiner der operierten Embryonen Störungen der
Scapula-Entwicklung (Abb. 2B und 2C). Länge und Breite der Scapula-Klinge waren auf der
Kontrollseite und der Operationsseite immer gleich.
Daraus kann geschlossen werden, dass Signale aus den Achsenorganen Neuralrohr und
Chorda dorsalis nicht für die Entwicklung der Scapula benötigt werden. Die Signale, die zur
Differenzierung der Knorpelvorläuferzellen im Dermomyotom führen, müssen sich also von
__________________________________________________________________Ergebnisse
25
den
Signalen,
die
auf
sklerotomale
Knorpelvorläuferzellen
wirken,
grundlegend
unterscheiden.
3.2.
Ektoderm-Entfernung
Das Ektoderm spielt während der embryonalen Entwicklung eine entscheidende Rolle. Am
besten untersucht ist die Rolle des Ektoderms bei der Entwicklung der Extremität. Das
Ektoderm bildet über der distalen Spitze der Extremitätenknospe eine Verdickung, die
sogenannte apikale ektodermale Randleiste (AER). Diese Struktur hält das darunter liegende
Mesenchym in einem proliferativen Status und sorgt so für das proximo-distale Auswachsen
der Extremität. Entfernt man die AER, so entwickelt sich eine verkürzte Extremität (Saunders,
1948).
Das über dem paraxialen Mesoderm liegende Ektoderm ist während der Reifung der Somiten
mitverantwortlich für: (1) die Epithelialisierung des paraxialen Mesoderms (Sosic et al.,
1997), (2) die Musterbildung innerhalb des epithelialen Somiten entlang seiner dorsoventralen Achse (Wagner et al., 2000), (3) die Musterbildung innerhalb des Dermomyotoms
entlang seiner medio-lateralen Achse (Dietrich et al., 1998) und (4) die Aufrechterhaltung
eines gut eingestellten Gleichgewichtes zwischen Proliferation und Differenzierung im sich
entwickelnden Dermomyotom (Amthor et al., 1999). Die essentielle Rolle des Ektoderms
während der Entwicklung der Muskelvorläuferzellen ist also zu einem beachtlichen Teil
bekannt. Fraglich ist die Rolle des ektodermalen Einflusses auf die Entwicklung der
knorpelbildenden Zellen des Dermomyotoms.
3.2.1. Entfernung des kompletten Ektoderms über den Somiten und der zukünftigen
Extremitätenregion
Das Ektoderm wurde bei zwei Tage bebrüteten Embryonen (HH-Stadien 13/14) über den
Somiten und der kompletten zukünftigen Flügelregion entfernt (Somiten-Höhe 15-20). In
medio-lateraler Ausdehnung reichte das Operationsgebiet von der Mitte des Neuralrohrs bis
an das extraembryonale Mesenchym heran (Abb. 3A). Zehn Embryonen wurden operiert und
ihr Skelett analysiert. Bei allen Embryonen war auf der Operationsseite keine Extremität
ausgebildet, da die zukünftige AER mit entfernt wurde. Die Ausbildung der Scapula war in
neun von zehn Embryonen ausgeblieben (Abb. 3B). Bei sieben von neun Embryonen war kein
Material der Scapula nachzuweisen, während zwei Embryonen Rudimente der kaudalen
__________________________________________________________________Ergebnisse
26
Scapula-Klinge aufwiesen. Der ventrale Teil des Schultergürtelskeletts (Procoracoid und
Clavicula) war in diesen Embryonen ebenfalls nicht ausgebildet. Bei einem von zehn
Embryonen war die Beurteilung des Schultergürtelskeletts nicht möglich, da das
Achsenskelett und die Rippen ebenfalls stark missgebildet waren.
Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass das Ektoderm der Extremitätenregion
als möglicher Produktionsort von Signalmolekülen, die für die Ausbildung der Scapula nötig
sind, in Betracht kommt. Ob das Ektoderm direkt auf die Scapula-bildenden Dermomyotome
wirkt oder ob sein Einfluss über die auswachsende Extremitätenknospe vermittelt wird, kann
mit diesem experimentellen Ansatz nicht beantwortet werden.
3.2.2. Entfernung der zukünftigen AER
Der Schultergürtel wird anatomisch als Teil des Anhangskeletts der oberen Extremität
betrachtet. Diese Sichtweise legt nahe, dass die Entwicklung des Schultergürtels den gleichen
Signaleinflüssen unterliegt wie die Entwicklung des restlichen Extremitätenskeletts. Eine
Möglichkeit diese Hypothese zu testen, ist die frühest mögliche Entfernung der AER, um ein
Auswachsen der Extremität und damit die Etablierung von Signalzentren innerhalb der
Extremitätenknospe zu unterdrücken.
Michaud et al. (1997) konnten an Wachtel-Huhn-Chimären das Ursprungsmaterial der AER
festlegen. Am zwei Tage alten Embryo (HH-Stadium 14) liegt das AER bildende Ektoderm in
einem 150 µm breiten Streifen über der medialen Somatopleura in Höhe der Somiten 15-20
(Abb. 3C). Die genau bekannte Lokalisation macht es möglich, die zukünftige AER lange vor
der Ausknospung der Extremitätenanlage zu entfernen und so ein Auswachsen des Flügels zu
verhindern. Damit kann die Frage beantwortet werden, ob das Ektoderm der
Extremitätenregion direkt auf die Scapula-Entwicklung wirkt oder ob sein Einfluss indirekt
über die auswachsende Extremitätenknospe vermittelt wird.
Die zukünftige AER wurde an fünf Embryonen in HH-Stadium 14 entfernt und das Skelett
untersucht. Skelettelemente distal des Schultergelenks (Stylo-, Zeugo-, Autopodium) waren in
keinem der Embryonen ausgebildet. Vier von fünf Embryonen hatten eine normal entwickelte
Scapula (Abb. 3D), während ein Embryo Knorpellücken im kranio-kaudalen Scapula-Verlauf
aufwies. In allen Fällen war der Scapula-Kopf mit dem Procoracoid verschmolzen, was auf
eine wichtige Rolle des Humerus bei der Ausbildung des Schultergelenks hindeutet.
__________________________________________________________________Ergebnisse
27
Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Entwicklung der Scapula nicht von Signalen aus der
Extremitätenknospe abhängig ist, und dass das ektodermale Signal über dem Extremitätenfeld
direkt auf die Scapula-Entwicklung einwirkt.
3.2.3. Ektoderm-Entfernung über den Somiten
Die oben beschriebenen Ergebnisse legen den Verdacht nahe, dass dem über den Somiten
liegenden Ektoderm eine induktive Rolle bei der Entwicklung der Scapula-Klinge zukommt.
Dieser Verdacht kann durch die Entfernung des Ektoderms über den Scapula-bildenden
Somiten geprüft werden. Um den zeitlichen Aspekt des ektodermalen Einflusses näher
ergründen zu können, wurden drei unterschiedliche experimentelle Ansätze gewählt: (1) Da
die Vorversuche an zwei Tage alten Embryonen (HH-Stadium 13/14) durchgeführt wurden
und die Ergebnisse einen ektodermalen Einfluss in diesem Stadium vermuten lassen, war es
sinnvoll in diesem Stadium das Ektoderm lediglich über den Somiten zu entfernen. Im HHStadium 13/14 sind die Scapula-bildenden Somiten epithelial organisiert (Abb. 4A). (2) Der
erste bekannte molekulare Marker der Scapula-Entwicklung, Pax1, wird allerdings erst im
HH-Stadium 21, d.h. nach 3,5 Tagen Inkubationszeit, angeschaltet. Die Scapula-bildenden
Somiten sind zu diesem Zeitpunkt schon in ihre Untereinheiten Sklerotom und Dermomyotom
kompartimentiert. Deshalb ist es interessant, das Ektoderm kurz vor der Aktivierung von
Pax1 in der Schultergürtelregion an drei Tage alten Embryonen (HH-Stadium 18) über den
kompartimentierten Somiten zu entfernen (Abb. 5A). (3) Da beide Experimente zu Effekten
an der Scapula-Klinge führten, sollte mit der dritten Versuchsreihe geklärt werden, ob es sich
bei einem der beiden Effekte um einen echten induktiven Vorgang handelt - d.h., dass zu
einem bestimmten Zeitpunkt ein Signal des Ektoderms gebraucht wird, um die ScapulaKlinge zu etablieren - oder ob das Ektoderm als permanenter Signalgeber für die ScapulaEntwicklung benötigt wird. Dazu wurde das Ektoderm in HH-Stadium 13/14 entfernt. Nach
20 Stunden Reinkubationszeit (HH-Stadium 17/18) wurde die Goldfolie wieder entnommen
(Abb. 6A). Diese Vorgehensweise lässt die Regeneration des Ektoderms nach Entnahme der
Goldfolie zu.
3.2.3.1. Ektoderm-Entfernung über den epithelialen Somiten
Sechs Embryonen wurden operiert und das Skelett des Thorax und des Flügels analysiert. Die
Scapula-Klinge war in drei von sechs Fällen komplett verschwunden (Abb. 4B). Die anderen
drei Embryonen bildeten lediglich kaudale Rudimente der Scapula-Klinge aus, während der
__________________________________________________________________Ergebnisse
28
von der Goldfolie abgedeckte kraniale Teil der Scapula-Klinge nicht verknorpelte. Alle
Exemplare entwickelten die Komponenten des somatopleuralen Skeletts (Scapula-Kopf/Hals, Stylo-, Zeugo-, Autopodium). Nur in einem von sechs Embryonen waren zusätzlich
Beeinträchtigungen der Wirbel- und Rippenentwicklung zu beobachten.
Anhand von histologischen Schnitten und immunhistochemischen Untersuchungen wurden
die Embryonen weiter untersucht. Es war von großem Interesse, ob weitere Derivate des
Dermomyotoms, insbesondere die hypaxiale Muskulatur, von der Operation betroffen waren.
Alle
Embryonen
zeigten
schwere
Defekte
in
der
Schultergürtelmuskulatur.
Die
Interkostalmuskulatur war ebenfalls stark in ihrer Ausbildung beeinträchtigt (Abb. 4C).
Dieses Ergebnis legt nahe, dass durch die Operation nicht nur die Entwicklung der ScapulaKlinge, sondern vielmehr die Entwicklung des gesamten Dermomyotoms beeinträchtigt
wurde. Um diese Annahme zu überprüfen, wurde an fünf Embryonen die Morphologie und
die Proliferation des Dermomyotoms nach 24 Stunden Reinkubationszeit untersucht. Die
Dermomyotome, denen das bedeckende Ektoderm fehlte, zeigten alle sowohl eine gestörte
Morphologie als auch ein ungeordnetes Proliferationsmuster, insbesondere in der hypaxialen
Domäne (Abb. 4D).
Dieses Ergebnis kann man als einen Hinweis darauf betrachten, dass das ektodermale Signal
ab HH-Stadium 13/14 von allen dermomyotomalen Zellen benötigt wird. Sowohl die
Muskelvorläufer- als auch Knorpelvorläuferzellen des Dermomyotoms sind in ihrer
Entwicklung vom Ektoderm abhängig.
3.2.3.2. Ektoderm-Entfernung über den kompartimentierten Somiten
Da das Ektoderm über den ausgereiften, kompartimentierten Somiten mit einer sehr soliden
extrazellulären Matrix an das darunter liegende Dermomyotom geheftet ist, wurde vor der
Operation ein kurzer Verdau mit dem Enzym Trypsin nötig, um die Integrität der
Dermomyotome zu erhalten. Diese Behandlung überlebten vier Embryonen, die alle den
gleichen Skelett-Phänotyp zeigten. Das Ektoderm wurde über den vier kranialen Scapulabildenden Somiten (17-20) in HH-Stadium 18 entfernt (Abb. 5A). Die Scapula-Klinge bildete
sich in keinem der untersuchten Embryonen aus. Der Rest des Flügelskeletts entwickelte sich
normal (Abb. 5B).
__________________________________________________________________Ergebnisse
29
Auf den ersten Blick ergab sich also ein Phänotyp der oberen Extremität wie nach der
Ektoderm-Entfernung über den epithelialen Somiten. Die histologischen Schnitte zeigten
jedoch signifikante Unterschiede in der Muskulatur unter dem Operationsfeld. So waren die
Interkostal-Muskeln normal ausgebildet. Die normalerweise in die Scapula inserierenden
Muskeln waren jedoch bei allen Embryonen stark in ihrer Masse reduziert bis hin zum
kompletten Verlust (Abb. 5C).
Das Experiment wurde an acht weiteren Embryonen durchgeführt, um den ektodermalen
Einfluss auf den einzigen bekannten molekularen Marker der Scapula-Vorläuferzellen, Pax1,
zu untersuchen. Die operierten Exemplare wurden für drei Tage bis zum HH-Stadium 29/30
reinkubiert, da während der normalen Entwicklung in diesem Stadium die Pax1-Expression in
dem größten Teil der Scapula-bildenden Zellen nachzuweisen ist. Alle acht Embryonen
zeigten eine deutliche Herunterregulierung bis hin zum kompletten Verlust der Pax1-mRNA
im Bereich der zukünftigen Scapula-Klinge (Abb. 5D).
Diese Experimente zeigen, dass die Formierung der Scapula-Klinge auch noch im spätem
Stadium von ektodermalen Signalen abhängt. Die Entwicklung der Scapula-Klinge konnte
durch die Ektoderm-Entfernung über dem reifen Somiten spezifischer unterdrückt werden als
durch die Ektoderm-Entfernung über den epithelialen Somiten, was an den weniger in
Mitleidenschaft gezogenen Muskeln der Thorax-Wand deutlich wird. Trotzdem muss gesagt
werden, dass in keinem Fall nur der Knorpel von der Operation betroffen war, sondern auch
die Schultergürtelmuskeln, die in die Scapula inserieren.
Weiterhin lassen die Ergebnisse den Schluss zu, dass die Knorpelvorläuferzellen des
Dermomyotoms ein ektodermales Signal benötigen, um die Pax1-Expression zu induzieren.
Eine fehlende Pax1-Expression mündet im Ausbleiben der Verknorpelung.
3.2.3.3. Ektoderm-Entfernung über den epithelialen Somiten mit nachfolgender Entnahme der
Goldfolie
Da das Ektoderm eine sehr gute Regenerationsfähigkeit besitzt, war es möglich, das zeitlich
limitierte Fehlen von ektodermalen Einflüssen auf die Entwicklung der Scapula-Klinge zu
untersuchen. Dazu wurde das Ektoderm in HH-Stadium 13/14 entfernt und mit Goldfolie
ersetzt. Die Goldfolie wurde bei einem Zweiteingriff nach 20 Stunden Reinkubationszeit im
HH-Stadium 17/18 entfernt (Abb. 6A). So konnte sich die entstandene Ektoderm-Wunde über
den Somiten wieder schließen. Drei Embryonen wurden operiert. In der Knorpel-Färbung
beobachtete man eine etwas schmälere Scapula-Klinge auf der Operationsseite als auf der
__________________________________________________________________Ergebnisse
30
Kontrollseite (Abb. 6B). Dieser Eindruck wurde durch die histologischen Schnitte bestätigt.
Die Knorpelanlage der Scapula-Klinge war in jedem Fall vorhanden, jedoch war die KnorpelMasse deutlich reduziert (Abb. 6C). Ein Effekt auf die Muskeln der Thorax-Wand war nicht
zu beobachten. Die Muskelmasse des Schultergürtels war nur leicht reduziert.
Der vorübergehende Verlust ektodermaler Signalaktivität führt also zu einer reduzierten
Anzahl von Knorpel-Zellen, jedoch nicht zu einem kompletten Fehlen der Scapula-Klinge.
Dieses Ergebnis zeigt, dass die ektodermale Signalaktivität über einen langen Zeitraum
benötigt wird. Zwischen HH-Stadium 13 und 18, d.h. während der SomitenKompartimentierung, ist das Ektoderm für die Aufrechterhaltung der Knorpel-Vorläuferzellen
verantwortlich, weil die unterbrochene Signalaktivität bis HH-Stadium 18 nicht zu einem
kompletten Verlust, sondern nur zur Reduktion des Scapula-Klingen-Knorpels führt. Somit
muss das ektodermale Signal, das zur endgültigen Differenzierung der Scapula-Zellen führt,
später als HH-Stadium 18 abgegeben werden.
3.3.
Barrieren-Implantation zwischen Somatopleura und Somiten
Um zu überprüfen, ob die dermomyotomale Subpopulation chondrogener Zellen von Signalen
aus der Somatopleura abhängig ist, wurde an Embryonen in HH-Stadium 16/17 die
Somatopleura von Scapula-bildenden Somiten durch die Implantation einer Aluminiumfolie
isoliert (Abb. 7A). Vier Embryonen haben diese Operation bis zum Ende der
Reinkubationszeit überlebt und wurden analysiert. Bei keinem der Embryonen konnte eine
Scapula-Klinge vorgefunden werden (Abb. 7B). Drei Embryonen zeigten eine normale
Entwicklung des somatopleuralen Flügelskeletts. Einer der vier Embryonen wies einen
verkürzten Flügel auf. Die Rippen waren in allen Embryonen im Operationsgebiet stark
verkürzt bis nicht vorhanden. Dies lässt sich damit erklären, dass die Entwicklung der distalen
Rippen-Anteile von Signalen aus der Somatopleura abhängt und die Rippen-Anlagen in die
Somatopleura einwachsen (Sudo et al., 2001).
In den histologischen Schnitten ließ sich am Anlage-Ort der Scapula-Klinge statt eines
Knorpels nur mesenchymales Gewebe beobachten, das von den Schultergürtelmuskeln
umgeben ist (Abb. 7C). Die normalerweise in die Scapula inserierenden Muskeln waren
angelegt und zum Teil differenziert. Weiter lateral gelegene Muskeln der ventro-lateralen
Körperwand waren nicht zu ausgebildet. Dies kann auf die implantierte Barriere
__________________________________________________________________Ergebnisse
31
zurückgeführt werden, die die Einwanderung der hypaxialen Muskelvorläuferzellen in die
Brustwand unterdrückt.
Dieses Experiment legt den Schluss nahe, dass Signale aus der Somatopleura für die
Entwicklung der Scapula-Klinge unabdingbar sind. Die Operation zeigte einen spezifischen
Einfluss auf die Chondrogenese der Scapula-Klinge. Dies kann man daraus ersehen, dass
nach Barrierenimplantation die Muskeln der Scapula-Region zum großen Teil angelegt und
differenziert sind.
3.4.
Heterotope Transplantation von zukünftigen Dermomyotomen
Es stellt sich die Frage, warum gerade die Dermomyotome des zerviko-thorakalen Übergangs
Knorpelzellen zur Entwicklung der Scapula-Klinge beisteuern und die weiter kranial und
kaudal gelegenen Dermomyotome dies nicht tun. Welche Mechanismen erlauben es den
Zellen, darüber Bescheid zu wissen, dass sie zu Knorpelzellen werden sollen?
Eine Möglichkeit ist, dass die vorhin beschriebenen Signale aus dem Ektoderm und der
Somatopleura diese Zellen spezifizieren. Ein anderer denkbarer Mechanismus wäre, dass die
Scapula-bildenden Dermomyotome schon früher über ihre Position entlang der anteriorposterioren Achse informiert werden und somit wissen, dass sie eine chondrogene
Subpopulation von Zellen enthalten müssen. Durch dieses Prinzip wird zum Beispiel die
unterschiedliche Form und Größe der Wirbel entlang der Wirbelsäule festgelegt (Kieny et al.,
1972; Dubrulle et al., 2001; zusammengefasst von Christ et al., 1998).
Um diese Hypothese für die Zellen der Scapula-Klinge zu verifizieren, wurde ihr Schicksal in
Wachtel-Huhn-Chimären in einer Region verfolgt, in der normalerweise keine chondrogenen
Zellen im Dermomyotom vorkommen. An Wachtelembryonen wurden dorsale Hälften von
Scapula-bildenden Somiten als Transplantat gewonnen. Im Hühnerembryo wurden im
zukünftigen Halsbereich dorsale Hälften von epithelialen Somiten entnommen und durch das
Transplantat aus der Wachtel ersetzt (Abb. 8A). Die dorsale Hälfte des epithelialen Somiten
stellt das zukünftige Dermomyotom dar.
Siebzehn Embryonen wurden operiert und das Skelett-Muster der Halsregion untersucht. Alle
siebzehn Embryonen zeigten ektopischen Knorpel. Vier von siebzehn Embryonen zeigten
einen einzelnen, kleinen ektopischen Knorpel direkt unter der Haut (Abb. 8B). Die
histologischen Schnitte bestätigten, dass der überzählige Knorpel aus Wachtelmaterial
aufgebaut war und die ihn umgebenden Muskeln eine Mischung aus Huhn- und WachtelZellen darstellten. Der Knorpel aus Wachtelmaterial stand nicht in Verbindung mit der
Wirbelsäule. Die Derivate des Sklerotoms, wie z.B. die Wirbel und die Hirnhäute, enthielten
__________________________________________________________________Ergebnisse
32
keine Wachtelzellen (Abb. 8C und 8C`). Aus diesen Beobachtungen kann geschlossen
werden, dass der ektopische Knorpel aus Wachtel-Zellen einen kurzen, im Hals wachsenden
(ektopischen) Abschnitt der Scapula-Klinge darstellt.
Die anderen dreizehn von siebzehn Embryonen zeigten mehr als einen ektopischen Knorpel
im Halsbereich. Bei den Operationen dieser Embryonen sind auch Anteile des Sklerotoms
mittransplantiert worden, weil in den histologischen Schnitten Sklerotomderivate aus
Wachtelzellen identifiziert werden konnten. In elf Embryonen konnte nach morphologischen
Kriterien davon ausgegangen werden, dass es sich bei dem zusätzlichen ektopischen Knorpel
um Rippen handelte. Zwei Embryonen zeigten mehr als ein Knorpel-Element ohne
Verbindung zur Wirbelsäule und waren somit nicht zu beurteilen.
Diese Beobachtung ist am ehesten auf die Schwierigkeiten bei der Operation zurückzuführen.
Es ist nicht möglich, am epithelialen Somiten das zukünftige Dermomyotom morphologisch
exakt gegen das zukünftige Sklerotom abzugrenzen.
Trotz dieser Schwierigkeiten zeigen vier Embryonen den oben beschriebenen eindeutigen
Phänotyp. Aus den transplantierten dorsalen Somiten-Hälften entwickelt sich im Halsbereich
ein ektopischer Knorpel, der aus Wachtel-Zellen besteht und deshalb als ektopischer Teil der
Scapula-Klinge interpretiert werden kann. Daraus lässt sich schließen, dass die
dermomyotomale Subpopulation chondrogener Zellen schon im epithelialen Somiten
hinsichtlich ihres Entwicklungsweges zu Knorpelzellen spezifiziert ist. Das Experiment zeigt
zudem, dass die Signale aus dem Ektoderm und der Somatopleura, die die weitere
Entwicklung der Scapula-Klinge steuern, auch im Hals-Bereich produziert werden.
__________________________________________________________________Diskussion
33
4.
Diskussion
Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass die Entwicklung der Scapula-Klinge des Vogels
prinzipiell anderen Mechanismen unterliegt als die Entwicklung des restlichen post-kranialen
Skeletts. Die Ergebnisse erlauben ein hypothetisches Modell der Entwicklung der ScapulaKlinge aufzustellen, das die Spezifizierung und Aufrechterhaltung ihrer dermomyotomalen
Vorläuferzellen und deren Ausdifferenzierung umfasst.
4.1.
Die Entwicklung der chondrogenen Zellen des Dermomyotoms hängt von
anderen Signalen ab als die der chondrogenen Zellen des Sklerotoms
Von den zahlreichen somitischen Zellpopulationen, war bisher nur eine einzelne dafür
bekannt, zu Knorpel und anschließend zu Knochen auszudifferenzieren. Diese Zellpopulation
hat ihren Ursprung im Sklerotom und bildet später das Achsenskelett. Man kann davon
ausgehen, dass die chondrogenen Zellen des Sklerotoms durch Signale aus den
Achsenorganen und insbesondere aus dem Chorda-Bodenplatten-Komplex auf ihr
Knorpelschicksal festgelegt werden. Auf molekularer Ebene wird dies durch das
Signalmolekül Shh vermittelt und findet in der Expression des Sklerotom-Markergens Pax1
seinen Ausdruck (zusammengefasst von Christ et al., 2000).
Die Scapula-bildenden Somiten des zerviko-thorakalen Übergangsbereiches besitzen
zusätzlich zu den sklerotomalen Knorpelvorläuferzellen des Achsenskeletts eine weitere
chondrogene Zellpopulation im Dermomyotom, die später die knöcherne Scapula-Klinge
bildet. Kurz vor der endgültigen Differenzierung in Knorpelzellen exprimieren auch diese
Zellen Pax1 (Huang et al., 2000b).
Diese Feststellung legt den Verdacht nahe, dass dermomyotomale Knorpelvorläuferzellen
ebenso wie Sklerotomzellen, durch Signale der Achsenorgane induziert werden könnten.
Wahrscheinlicher macht diesen Verdacht die Tatsache, dass der Chorda-BodenplattenKomplex die Gen-Expression im Dermomyotom über die Expression von Shh beeinflussen
kann (Huang et al., 2003).
Die vorliegenden Experimente zeigen jedoch, dass dieser Verdacht nicht zutreffend ist.
Isoliert man die Scapula-bildenden Somiten vollständig vom Einfluss der Achsenorgane, so
findet sich trotzdem eine normale Entwicklung der kompletten Scapula. Die chondrogenen
Zellen
des
Dermomyotoms
folgen
also
nicht
den
gleichen
Signalen
wie
ihre
__________________________________________________________________Diskussion
34
Schicksalsgenossen
im
Sklerotom,
sondern
müssen
von
einem
anderen
Entwicklungsmechanismus abhängig sein.
4.2.
Die Entwicklung der Scapula-Klinge ist unabhängig von der Entwicklung des
intrinsischen Flügelskeletts
Während der Extremitäten-Entwicklung wird am dorsalen Rand der Extremitätenknospe die
sogenannte Zone polarisierender Aktivität (ZPA) etabliert. Die ZPA produziert wie der
Chorda-Bodenplatten-Komplex das Signalmolekül Shh. Somit könnte die ZPA ein Induktor
der Pax1-Expression und somit der Knorpelzellen in der Scapula-Region sein. Dass dies
jedoch nicht der Fall ist, konnte durch die vorliegenden Ergebnisse gezeigt werden.
Verhindert man das Auswachsen einer Extremitätenknospe und somit die Bildung einer ZPA
durch die Entfernung der zukünftigen AER, dann entwickelt sich trotzdem ein vollständiges
Schultergürtelskelett. Ein sehr ähnlicher Phänotyp wurde von Carrington und Fallon (1988)
beschrieben. In dieser Arbeit wurde die sogenannte limbless-Mutante des Huhns untersucht.
Die limbless-Mutante ist nicht in der Lage, die dorso-ventrale Achse der Extremität und damit
die AER zu etablieren (Grieshammer et al., 1996). Dass Scapula-Kopf und -Hals und der
ventrale Schultergürtel sowohl nach AER-Entfernung als auch bei der limbless-Mutante trotz
ihres somatopleuralen Ursprungs immer zur Ausbildung kommen, könnte damit erklärt
werden, dass zwar das Auswachsen der Extremität verhindert wird, jedoch die ExtremitätenInduktion und -Ausknospung (engl.: budding) normal vonstatten gehen (Grieshammer et al.,
1996).
Alle weiteren Ergebnisse der hier vorliegenden Arbeit zeigen, dass sich die Entwicklung der
Scapula-Klinge ohne Beeinträchtigung der Entwicklung des restlichen Flügelskeletts
unterdrücken lässt. Hieraus kann man schließen, dass die Entwicklung des intrinsischen (aus
der Somatopleura hervorgegangenen) Flügelskeletts und die der aus dem paraxialen
Mesoderm hervorgegangenen Scapula-Klinge völlig unterschiedlichen Signalmechanismen
unterliegen.
4.3.
Die
chondrogenen
Zellen
des
Dermomyotoms
werden
während
der
Segmentierung des paraxialen Mesoderms spezifiziert
Prinzipiell kommen zwei mögliche Mechanismen der Spezifizierung der dermomyotomalen
chondrogenen Zellpopulation in Betracht:
__________________________________________________________________Diskussion
35
(1) Spezifizierung durch Signale aus den umliegenden Geweben oder
(2) frühe und autonome Spezifizierung innerhalb des paraxialen Mesoderms.
Die
heterotope
Transplantation
von
dorsalen
Somiten-Hälften,
den
zukünftigen
Dermomyotomen, aus der Scapula-bildenden Region in die Hals-Region führt zur Ausbildung
eines Abschnitts der Scapula-Klinge im Hals des Empfängers. Dieses Ergebnis legt nahe, dass
die dorsalen Hälften epithelialer Somiten der zerviko-thorakalen Übergangszone stabile und
autonome Information über ihre Position entlang der anterior-posterioren Achse besitzen.
Diese segmentspezifische Positionsinformation legt die zukünftigen Zellen der ScapulaKlinge auf ihr Knorpel- bzw. Knochenschicksal fest. Die Spezifizierung dieser Zellpopulation
muss somit während oder kurz nach der Segmentierung des paraxialen Mesoderms in
epitheliale Somiten erfolgen. Die benötigten Signale aus der Umgebung (Ektoderm und
Somatopleura) werden auch in der Halsregion und deshalb unspezifisch entlang der
Körperhauptachse produziert und spielen somit keine Rolle bei der Spezifizierung der
chondrogenen Zellen des Dermomyotoms.
Ein Mechanismus zur Festlegung von Positionsinformation entlang der anterior-posterioren
Achse wurde von Dubrulle et al. (2001) und Zákány et al. (2001) herausgearbeitet. Die
Arbeiten dieser Autoren zeigen, dass die segmentspezifische Identität von Somiten kurz vor
der Epithelialisierung des paraxialen Mesoderm festgelegt wird.
Verschiedene Wirbeltierspezies wurden bezüglich der Herkunft ihres Scapula-Materials
untersucht. Das Amphibium Ambyostoma maculatum bezieht kein Material aus den Somiten
in seinen Schultergürtel ein (Burke, 1991a), wohingegen Schildkröten (Yntema, 1970; Burke
1991b) und Vögel (Chevallier, 1977b; Huang et al., 2000b), beides Amnioten, somitisches
Material für bestimmte Abschnitte ihrer Scapula verwenden. Dementsprechend kommt Burke
(1991a) zu dem Schluss, dass die Beisteuerung somitischen Materials zur Scapula eine NeuEntwicklung darstellt, die während der Evolution der Amnioten aufgetreten ist.
Hox-Gene sind dafür bekannt, den Bauplan der Wirbeltiere entlang der anterior-posterioren
Achse festzulegen. Die anteriore Expressionsgrenze einiger Hox-Gene im Embryonalstadium
spiegelt die Grenzen verschiedener Wirbelsäulenabschnitte im erwachsenen Organismus
wieder. Im Laufe der Evolution scheinen Veränderungen der Hox-Gen-Expression gängige
Mechanismen zur Änderung des Körper-Bauplans zwischen den Tieren unterschiedlicher
evolutionärer Entwicklungsstufen zu sein (Burke et al., 1995; Cohn et al., 1997; Cohn et al.,
1999; Cohn, 2002; Ronshaugen et al., 2002).
__________________________________________________________________Diskussion
36
Die Einbeziehung dermomyotomaler
Zellen in die Vogel-Scapula kann man als streng
lokalisierten Zugewinn eines neuen Zellschicksals innerhalb der betreffenden Dermomyotome
betrachten. Nach heutigem Erkenntnisstand wird dieser evolutionäre Zugewinn, d.h. die
Änderung des generellen Bauplans entlang der anterior-posterioren Achse, am ehesten durch
die Veränderung der Hox-Gen-Expression im paraxialen Mesoderm hervorgerufen.
Interessanterweise hat Hoxc5 eine anteriore Expressionsgrenze in Höhe der kranialen
Scapula-bildenden Somiten (So. 17/18) (Burke et al., 1995), was eine Rolle von Hoxc5 in der
Spezifizierung der chondrogenen Zellpopulation impliziert. Die Mutation des paralogen
Hoxb5-Gens in der Maus führt allerdings nur zu einer Verschiebung des Schultergürtels in
anteriorer Richtung, jedoch nicht zum Ausbleiben der Scapula-Entwicklung (Rancourt et al.,
1995). Die Mutation eines anderen paralogen Hox-Gens (Hoxa5) führt nur in Kombination
mit der Pax1-Mutation zu regelmäßigen Defekten im Acromion (Aubin et al., 2002). Die
Hox-Gen-Expression lässt sich im Huhn durch die Implantation von Kunststoff-Kügelchen,
die mit Retinsäure beladen sind, unspezifisch ändern. So konnte gezeigt werden, dass die
Implantation von Retinsäure in die proximale Extremitätenknospe des Vogelembryos zu einer
Herunterregulierung von Hoxc6 im entsprechenden Bereich führt. Nachfolgend sind Defekte
im kranialen Abschnitt der Scapula zu beobachten (Oliver et al., 1990).
Bisher konnte keinem einzelnen der untersuchten Hox-Gene die führende Rolle bei der
Spezifizierung der dermomyotomalen chondrogenen Zellpopulation zugeschrieben werden.
Am ehesten könnte hierfür eine bisher unbekannte Kombination der Expression verschiedener
Steuerungsgene verantwortlich sein. Die Hypothese, dass die Positionsinformation der
chondrogenen Zellen des Dermomyotoms ihr molekular-genetisches Korrelat in der
Expression von Hox-Genen findet, muss mit anderen Methoden weiter untersucht werden.
Ein Hinweis darauf, dass heterotop transplantierte Dermomyotome ihre Hox-Gen-Expression
zum Teil beibehalten und sich entsprechend ihrer Herkunft entwickeln, lieferten Nowicki und
Burke (2000). Die Autoren zeigten, dass die Zellpopulation des Dermomyotoms, die nicht in
die Somatopleura einwandert, nach heterotoper Transplantation ihre Hox-Gen-Expression
beibehält und sich gemäß ihrem Ursprungsort entwickelt, während dermomyotomale Zellen,
die die Somatopleura penetrieren, ihre Morphologie entsprechend dem umliegenden Gewebe
der Körperwand und der Extremität annehmen. Die in dieser Arbeit gezeigten Ergebnisse
legen nahe, dass die Scapula-bildenden Zellen des Dermomyotoms nicht in die Somatopleura
__________________________________________________________________Diskussion
37
einwandern und sich deshalb nach Transplantation in die Hals-Region entsprechend ihrem
Herkunftsort ausdifferenzieren können.
Frühere Studien betonen vor allem die Auswirkungen von Positionsinformation auf die
Morphologie
der
Derivate
des
paraxialen
Mesoderms,
z.B.
Halswirbel-
vs.
Brustwirbelentwicklung. Am Achsenskelett konnte gezeigt werden, dass das aus dem
Sklerotom stammende Achsenskelett schon sehr früh in seiner Morphologie festgelegt wird.
Schon die anterioren Abschnitte der Segmentplatte verfügen über Informationen, ob sie sich
z.B. zu Brust- oder Halswirbeln entwickeln sollen (Kieny et al., 1972). Als Mechanismus für
die Ausbildung der unterschiedlichen Wirbel-Morphologie wurde von Duboule (1995) die
unterschiedliche Proliferationsrate innerhalb der verschiedenen Sklerotom-Abkömmlinge
entlang der anterior-posterioren Achse vorgeschlagen.
Die hier vorgelegten Ergebnisse geben allerdings erste Hinweise darauf, dass während der
Segmentierung des paraxialen Mesoderms entlang der anterior-posterioren Achse auch über
das Zellschicksal (Muskel- vs. Knochenentwicklung) entschieden werden kann. In den
Somiten des zerviko-thorakalen Übergangsbereiches wird ein embryonales Feld (sozusagen
das „Scapula-Klingen-Feld“) etabliert, das Ursprungsmaterial für die Scapula-Klinge zur
Verfügung stellt. Die Zellen dieses Feldes sind zwar noch undifferenziert, aber auf das
Knorpel- bzw. Knochenschicksal determiniert und kompetent, auf Umgebungssignale anders
zu reagieren als die restlichen dermomyotomalen Zellen. Ihnen ist ein bestimmtes
Entwicklungsprogramm vorgegeben. Die Signale aus benachbarten Strukturen ermöglichen
die Ausführung dieses zugrunde gelegten Entwicklungsprogramms.
4.4
Ektodermale Signale erhalten die chondrogene Zellpopulation im Dermomyotom
aufrecht
Zwei der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Experimente weisen auf die Rolle des
Ektoderms bei der Aufrechterhaltung der dermomyotomalen Knorpelvorläuferzellen im
Verband mit den Muskelvorläuferzellen hin. Die Entfernung des Ektoderms über den
epithelialen Somiten des zerviko-thorakalen Übergangs führt zu einem völligen Ausbleiben
der Entwicklung einer Scapula-Klinge sowie der hypaxialen Schultergürtel- und
Interkostalmuskulatur. Dieser Phänotyp kann dadurch erklärt werden, dass das Ektoderm eine
bestimmende Rolle bei der Spezifizierung der hypaxialen Muskulatur einnimmt (Dietrich et
__________________________________________________________________Diskussion
38
al., 1998). Unser Experiment zeigt, dass die Scapula-bildenden Zellen im Dermomyotom von
dieser Regel nicht ausgenommen sind.
Werden die Scapula-bildenden Somiten nur für 20 Stunden vom ektodermalen Einfluss
isoliert, führt dies zu einer deutlichen Verminderung der Knorpelmasse der Scapula-Klinge.
Das sich regenerierende Ektoderm nimmt nach 20 Stunden seine Signalaktivität wieder auf
und kann so einen Teil der Knorpelvorläuferzellen retten.
Diese Ergebnisse legen nahe, dass ein andauerndes Vorhandensein ektodermaler Signale
Grundvoraussetzung für eine ungestörte Entwicklung des Dermomyotoms ist. Die in das
Dermomyotom eingebetteten Knorpelvorläuferzellen sind von diesem Signal genauso
abhängig wie die Muskelvorläuferzellen.
Als einziges bekanntes Signalmolekül, dass das ektodermale Signal auf das Dermomyotom
vermitteln könnte, kommt Wnt-6 in Betracht. Wnt-6 ist ein sezerniertes Signalmolekül der
Wnt-Familie und wirkt über mehrere membranständige Rezeptoren der Frizzled-Familie
(Cauthen et al., 2001). In der Induktion von Neuralleistenzellen spielt Wnt-6 als ektodermales
Signal eine entscheidende Rolle (Garcia-Castro et al., 2002). Die Implantation von Wnt-6
produzierenden Zellen kann die Entwicklung der Scapula-Klinge bei fehlendem Ektoderm
jedoch nicht retten und beeinflusst bei Implantation ohne Ektoderm-Entfernung die
Entwicklung der Scapula-Klinge eher negativ als positiv (unpublizierte Daten M. RodriguézNiedenführ). Somit muss von einem oder mehreren unbekannten Signalmechanismen
ausgegangen werden, die den ektodermalen Einfluss auf die Entwicklung der Scapula-Klinge
vermitteln.
4.5.
Ektoderm und Somatopleura steuern die Differenzierung der Scapula-Klinge
Zwei experimentelle Ansätze beleuchten den Einfluss des Ektoderms und der Somatopleura
auf die Differenzierung der Scapula-Vorläuferzellen zu Knorpel. Die Entfernung des
Ektoderms über den reifen, kompartimentierten Somiten des zerviko-thorakalen Übergangs
führt zu einem Verlust der Pax1-Expression in den Scapula-Vorläuferzellen und nachfolgend
zum Verlust der Scapula-Klinge. Lediglich die hypaxiale Schultergürtelmuskulatur, die direkt
in die Scapula-Klinge inseriert, ist nach dieser Operation in ihrer Entwicklung beeinträchtigt.
Die ebenfalls hypaxialen Interkostalmuskeln entwickeln sich normal. Daraus lässt sich
__________________________________________________________________Diskussion
39
schließen, dass die Entwicklung des hypaxialen Dermomyotoms nicht komplett beeinträchtigt
wurde.
Die Isolierung Scapula-bildender Dermomyotome vom Einfluss der Somatopleura durch
Implantation einer Barriere zwischen diese beiden Gewebe führt zum Ausbleiben der
Scapula-Verknorpelung. Die umgebende hypaxiale Muskulatur (Schultergürtel- und
Interkostalmuskeln) zeigt nach dieser Operation prinzipiell keine Defekte.
Diese Ergebnisse zeigen, dass zur Differenzierung der Scapula-Klinge, d.h. zur endgültigen
Realisierung des chondrogenen Entwicklungsprogramms ektodermale und somatopleurale
Signale notwendig sind. Das ektodermale Signal wird für die Expressions-Initiation des
chondrogenen Regulatorgens Pax1 in dermomyotomalen Knorpelvorläuferzellen benötigt.
Diese Beobachtung ist deshalb sehr bemerkenswert, weil bisher nur bekannt war, dass der
Chorda-Bodenplatten-Komplex mit seinem Signalmolekül Shh für die Induktion der Pax1Expression in paraxialen Knorpelvorläuferzellen benötigt wird. Das vorliegende Ergebnis legt
einen neuen, ektodermalen Weg der Pax1-Induktion und Knorpelbildung nahe.
Monsoro-Burq und Le Douarin (2000) haben eine Art der Chondrogenese für die
Dornfortsätze der Wirbelbögen postuliert, die sich von der Chondrogenese des restlichen
Achsenskeletts
ebenfalls
grundlegend
unterscheidet.
Es
wurde
gezeigt,
dass
die
Verknorpelung der Dornfortsätze von einem ektodermalen Signalmolekül (BMP-4) abhängt.
Die enge Verknüpfung von ektodermalem Signal und Verknorpelung führte die Autoren zu
dem Konzept des „subektodermalen Knorpels“, der einem grundlegend anderen
Differenzierungsmodus folgt als der Rest des Achsenskeletts.
Die anatomische Lage der Scapula-Klinge direkt unter der Haut und die Abhängigkeit ihrer
Ausbildung vom Ektoderm legt nahe, auch dieses Skelettelement als „subektodermalen
Knorpel“ zu bezeichnen. Der molekulare Mechanismus der Differenzierung bleibt allerdings
trotz intensiver experimenteller Bemühungen unklar.
____________________________________________________________Zusammenfassung
40
5.
Zusammenfassung
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit lassen den Schluss zu, dass sich die Entwicklung der
Scapula-Klinge grundlegend von der Entwicklung des restlichen post-kranialen Skeletts
unterscheidet. Die Entwicklung der Scapula-Klinge scheint einen neuen Modus der
Chondrogenese bei Vertebraten aufzuzeigen.
Das post-kraniale Skelett besteht aus dem Achsenskelett (Wirbelsäule und Rippen) und dem
Extremitätenskelett. Das Achsenskelett hat seinen Ursprung im Sklerotom, das durch Shhvermittelte Induktion aus dem ventralen Abschnitt des epithelialen Somiten hervorgeht. Das
Sklerotom exprimiert Pax1, das die Sklerotomzellen als Knorpelvorläufer determiniert. Die
unterschiedliche Morphologie der Wirbelsäulenabschnitte wird vor der Segmentierung des
paraxialen Mesoderms festgelegt. Das distale Extremitätenskelett (Stylo-, Zeugo-, Autopodium) entsteht aus der Somatopleura, die im Bereich des Extremitätenfeldes als Knospe
auswächst. Im Zentrum der Extremitätenknospe kondensieren die Knorpelvorläuferzellen. Die
Morphogenese der einzelnen Knochenabschnitte wird durch zwei Signalzentren der
Extremitätenknospe entschieden.
Die Scapula-Klinge entsteht (im Gegensatz zu den restlichen, somatopleuralen Elementen des
Schultergürtels) aus den Dermomyotomen des zerviko-thorakalen Übergangsbereiches. Die
Chondrogenese der Dermomyotomzellen lässt sich in drei Phasen gliedern:
(1) Spezifizierung: Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass die Dermomyotomzellen durch
die Segmentierung des paraxialen Mesoderms instruiert werden, Knorpelvorläuferzellen zu
bilden. Die anterior-posteriore Begrenzung des so etablierten Scapula-Klingen-Feldes legt die
spätere Ausdehnung der Scapula-Klinge fest. Das Zellschicksal der chondrogenen
Dermomyotomzellen und die Morphologie der Scapula-Klinge müssen demnach auf dem
Erwerb spezifischer Positionsinformationen entlang der anterior-posterioren Achse beruhen.
(2) Aufrechterhaltung: Während der Kompartimentierung der Somiten (HH-Stadium 14-18)
unterliegen die chondrogenen Zellen des Dermomyotoms (ähnlich den Zellen der zukünftigen
hypaxialen Muskulatur) dem Einfluss des angrenzenden Ektoderms. Das Ektoderm ist für
eine regelhafte Proliferation und Musterbildung im Dermomyotom verantwortlich.
(3) Differenzierung: Nach der Ausreifung des Dermomyotoms (nach HH-Stadium 18) wird
eine Kombination aus ektodermalen und somatopleuralen Signalen benötigt, um die Zellen
der Scapula-Klinge zur Expression von Pax1 und damit zur endgültigen KnorpelzellDifferenzierung zu bringen.
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_________________________________________________________________Abbildungen
47
7.
Abbildungen
________________________________________________________________Abbildungen
48
Abbildung 1:
Makroskopische Anatomie der Scapula beim Vogel.
Das Bild zeigt eine dorso-laterale Aufsicht von rechts auf eine Skelettpräparation eines
adulten Huhns. Die weißen Pfeilspitzen markieren das kraniale und kaudale Ende der
Scapula. An ihrem kranialen Ende artikuliert die Scapula mit dem Humerus-Kopf (HK) und
dem Schlüsselbein (Sb). Das gemeinsame Gelenk von Scapula und Procoracoid schließt
sich medial daran an und kann aus dieser Perspektive nicht dargestellt werden. Der Abschnitt
der Scapula, der die Rippen (R) dorsal überzieht, wird als Scapula-Klinge (ScKl) bezeichnet.
Zur besseren Orientierung sind auf der Abbildung die Halswirbelsäule (HWS), die
Brustwirbelsäule (BWS) mit ihren Anhangsgebilden, den Rippen (R), das Darmbein (Db)
und der Femur-Kopf (FK) bezeichnet.
________________________________________________________________Abbildungen
49
Abb. 1
________________________________________________________________Abbildungen
50
Abbildung 2:
Barrieren-Implantation zwischen Achsenorgane und Somiten.
(A)
Operationsschema: Transversal-Schnitt durch einen zwei Tage bebrüteten Embryo
(HH-Stadium 14) in Höhe des zerviko-thorakalen Übergangsbereiches nach rechtsseitiger
Implantation einer Aluminiumfolien-Barriere (Alu) zwischen die Achsenorgane [Neuralrohr
(NR), Chorda dorsalis (CD)] und die epithelialen, Scapula-bildenden Somiten (So).
(B)+(C)
Skelett-Muster nach der in (A) beschriebenen Operation und sieben Tagen
Reinkubationszeit. Aufsicht von dorsal (B) und Aufsicht von rechts lateral (C).
Die schwarzen Pfeile markieren das kaudale Ende der Scapula (links: Kontrollseite; rechts:
Operationsseite). Die Scapula-Klinge ist links- und rechtsseitig normal entwickelt. Die
Defekte in Sklerotomderivaten versichern über den Erfolg der Operation. Die schwarzen
Pfeilspitzen markieren in (B) die missgebildeten Wirbelbögen und in (C) die nur rudimentäre
ausgebildeten Rippen.
________________________________________________________________Abbildungen
51
Abb. 2
________________________________________________________________Abbildungen
52
Abbildung 3:
Ektoderm-Entfernung I
(A)
Operationsschema: Transversal-Schnitt durch einen zwei Tage bebrüteten Embryo
(HH-Stadium 14) in Höhe des zerviko-thorakalen Übergangsbereiches zur Entfernung des
Ektoderms über dem gesamten Extremitätenfeld. Der schwarz hervorgehobene Abschnitt des
Ektoderms, vom Neuralrohr (NR) bis über die Somatopleura (SP) reichend, wurde entfernt
und durch Goldfolie ersetzt.
(B)
Skelett-Muster nach der in (A) beschriebenen Operation und sieben Tagen
Reinkubationszeit (links: Kontrollseite; rechts: Operationsseite). Die schwarzen Pfeilspitzen
markieren die kranio-kaudale Ausdehnung der Scapula auf der Kontrollseite. Auf der
Operationsseite bleibt die Entwicklung des Flügelskeletts, inklusive der Scapula-Klinge, aus.
Die Entwicklung des Achsenskeletts ist nicht beeinträchtigt (ein Wirbelkörper und eine Rippe
sind mit schwarzen Pfeilspitzen markiert).
(C)
Operationsschema: Transversal-Schnitt durch einen zwei Tage bebrüteten Embryo
(HH-Stadium
14)
in
Höhe
des
zerviko-thorakalen
Übergangsbereiches.
Schwarz
hervorgehoben ist das Ektoderm über der medialen Somatopleura (SP), das die zukünftige
AER darstellt. Dieser Bereich wurde entfernt und durch Goldfolie ersetzt.
(D)
Skelett-Muster nach der in (C) beschriebenen Operation und sieben Tagen
Reinkubationszeit (links: laterale Aufsicht auf die Kontrollseite; rechts: laterale Aufsicht auf
die
Operationsseite).
Die
Operation
verhindert
das
Auswachsen
des
distalen
Extremitätenskeletts komplett. Der beidseitige Vergleich des Schultergürtelskeletts zeigt
jedoch eine ungestörte Entwicklung der Scapula auf beiden Seiten (rote Pfeile). Auf der
Operationsseite bildet sich kein Humerus-Kopf (HK) aus. Das Gelenk von Procoracoid (Pc)
und Scapula-Kopf ist fusioniert (rote Pfeilspitzen). Das rote Sternchen markiert die
implantierte Goldfolie.
________________________________________________________________Abbildungen
53
Abb. 3
________________________________________________________________Abbildungen
54
Abbildung 4:
Ektoderm-Entfernung II
(A)
Operationsschema: Transversal-Schnitt durch einen zwei Tage bebrüteten Embryo
(HH-Stadium
14)
in
Höhe
des
zerviko-thorakalen
Übergangsbereiches.
Schwarz
hervorgehoben ist das Ektoderm, das den epithelialen Somiten (So) bedeckt. Dieser Bereich
wurde entfernt und durch Goldfolie ersetzt.
(B)
Skelett-Muster nach der in (A) beschriebenen Operation und sieben Tage
Reinkubationszeit (dorsale Aufsicht; links: Kontrollseite; rechts Operationsseite). Die roten
Pfeile markieren die kranio-kaudale Ausdehnung der Scapula. Auf der Operationsseite bildet
sich nur der kraniale Abschnitt der Scapula (-Kopf und -Hals) aus. Die Scapula-Klinge fehlt.
Das schwarze Sternchen markiert die implantierte Goldfolie.
(C)
Histologischer Transversal-Schnitt durch die kraniale Thorax-Region desselben
Embryos. Immunhistochemische Färbung des muskelspezifischen Proteins Desmin (braunes
Farbsignal)
zur
Beurteilung
der
Muskelentwicklung
(links:
Kontrollseite;
rechts:
Operationsseite). Die roten Pfeile markieren die Lage des Knorpels der Scapula-Klinge. Auf
der rechten Seite ist dieser nicht ausgebildet (kein hellblaues Farbsignal). Die schwarzen
Pfeilspitzen markieren die hypaxiale Interkostalmuskulatur, die rechts nicht ausgebildet ist
(kein braunes Farbsignal). Die epaxialen Muskeln (EM) entwickeln sich auf beiden Seiten
normal. (RM: Rückenmark; WK: Wirbelkörper; Oe: Oesophagus; L: Lunge)
(D)
BrdU-markierter (dunkelbraunes Farbsignal) Transversal-Schnitt durch die Thorax-
Region nach der in (A) beschriebenen Operation und 24 Stunden Reinkubationszeit zur
Beurteilung der Proliferation und Morphologie des Dermomyotoms (links: Kontrollseite;
rechts: Operationsseite). Die schwarze Umrandung hebt die Grenzen des nicht
beeinträchtigten hypaxialen Dermomyotoms hervor. Die schwarzen Pfeilspitzen markieren
die korrespondierende Stelle auf der Operationsseite. Sowohl das Proliferationsmuster als
auch die Morphologie des hypaxialen Dermomyotoms sind ohne den ektodermalen Einfluss
gestört. (rote Sternchen: Goldfolie; NR: Neuralrohr; CD: Chorda dorsalis; SG:
Spinalganglion)
________________________________________________________________Abbildungen
55
Abb. 4
________________________________________________________________Abbildungen
56
Abbildung 5:
Ektoderm-Entfernung III
(A)
Operationsschema: Transversal-Schnitt durch einen drei Tage bebrüteten Embryo
(HH-Stadium
18/19)
in
Höhe
des
zerviko-thorakalen
Übergangsbereiches.
Das
Dermomyotom (DM) ist ausgebildet, der Somit kompartimentiert. Schwarz hervorgehoben ist
der Abschnitt des Ektoderms, der nach Entfernung durch Goldfolie ersetzt wurde.
(B)
Skelett-Muster eines Embryos nach der in (A) beschriebenen Operation und sieben
Tagen Reinkubationszeit (links: Kontrollseite; rechts: Operationsseite). Die roten Pfeile
markieren die kranio-kaudale Ausdehnung der Scapula. Auf der Operationsseite bleibt die
Entwicklung der Scapula-Klinge aus. Der kraniale Scapula-Abschnitt (Kopf und Hals) und
das distale Extremitätenskelett (Stylo- (Sp), Zeugo- (Zp) und Autopodium) werden normal
ausgebildet. Das rote Sternchen markiert die implantierte Goldfolie.
(C)
Histologischer Transversal-Schnitt durch die Thorax-Region desselben Embryos nach
immunhistochemischer Färbung des Muskelproteins Desmin (braunes Farbsignal). Die roten
Pfeile markieren die Region der Scapula-Klinge und ihrer Muskulatur, die auf der
Operationsseite nicht ausgebildet sind. Die roten Pfeilspitzen markieren die InterkostalMuskulatur, die auch auf der Operationsseite normal entwickelt ist. (RM: Rückenmark; WK:
Wirbelkörper; Oe: Oesophagus)
(D)
Whole-mount in situ-Hybridisierung zur Darstellung der Pax1-Expression im
Schultergürtlebereich nach der in (A) beschriebenen Operation und drei Tagen
Reinkubationszeit (HH-Stadium 29; links: Kontrollseite; rechts: Operationsseite): Die roten
Pfeile
markieren
die
kranio-kaudale
Ausdehnung
der Pax1-Expression. Auf der
Operationsseite wird Pax1 nur im kranialen Abschnitt der Scapula-Region exprimiert. Der
kaudale Abschnitt (spätere Scapula-Klinge) bleibt Pax1-frei. Das rote Sternchen markiert die
implantierte Goldfolie.
________________________________________________________________Abbildungen
57
Abb. 5
________________________________________________________________Abbildungen
58
Abbildung 6:
Ektoderm-Entfernung IV
(A)
Mehrschritt-Operationsschema: (a) An einem zwei Tage bebrüteten Embryo (HH-
Stadium 14 wurde das Ektoderm über den epithelialen, Scapula-bildenden Somiten entfernt
(schwarz hervorgehoben) und durch Goldfolie ersetzt. (b) Nach zwanzig Stunden
Reinkubationszeit wurde die Goldfolie (gelb hervorgehoben) über den ausgereiften Somiten
entfernt.
(B)
Skelett-Muster eines Embryos nach der unter (A) beschriebenen Operation und sieben
Tagen Reinkubationszeit nach Ersteingriff (links: Kontrollseite; rechts: Operationsseite). Die
roten Pfeile markieren die kranio-kaudale Ausdehnung der Scapula. Auf der Operationsseite
ist die Scapula-Klinge leicht verkürzt und deutlich verschmälert.
(C)
Histologischer Transversal-Schnitt durch die Thorax-Region desselben Embryos mit
immunhistochemischer Färbung des Muskelproteins Desmin (braunes Farbsignal). Die roten
Pfeile markieren den Knorpel der Scapula-Klinge (hellblau). Auf der Operationsseite ist die
Knorpel-Masse deutlich reduziert (schwarze Umrandung in der Ausschnittsvergrößerung C´).
Die hypaxialen Muskeln des Schultergürtels und der Interkostalräume entwickeln sich auf
beiden Seiten normal. (RM: Rückenmark; WK: Wirbelkörper)
________________________________________________________________Abbildungen
59
Abb. 6
________________________________________________________________Abbildungen
60
Abbildung 7:
Implantation einer Barriere zwischen Somatopleura und Scapula-bildende Somiten
(A)
Operationsschema: Transversal-Schnitt durch einen drei Tage bebrüteten Embryo
(HH-Stadium 16/17) in Höhe des zerviko-thorakalen Übergangsbereiches nach Implantation
einer
Aluminiumfolien-Barriere
(Alu)
zwischen
die
Somatopleura
(SP)
und
die
kompartimentierten, Scapula-bildenden Somiten (SO).
(B)
Skelett-Muster eines Embryos nach der in (A) beschriebenen Operation und sieben
Tagen Reinkubationszeit (links: Kontrollseite; rechts: Operationsseite). Die roten Pfeile
markieren die kranio-kaudale Ausdehnung der Scapula. Auf der Operationsseite ist keine
Scapula-Klinge ausgebildet, während sich der kraniale Abschnitt der Scapula (Kopf und
Hals) normal entwickelt.
(C)
Histologischer Transversal-Schnitt durch die Thorax-Region desselben Embryos mit
immunhistochemischer Färbung des Muskelproteins Desmin (braunes Farbsignal). Die roten
Umrandungen fassen die Region der Scapula-Klinge ein. Die Ausschnittsvergrößerungen
zeigen, dass auf der Operationsseite nur eine mesenchymale Zellmasse angelegt ist (rote
Pfeile), während die Kontrollseite einen normal differenzierten Knorpel zeigt (gestrichelte
Umrandung). Die Muskulatur ist proximal der Barriere normal ausgebildet. (RM:
Rückenmark; WK: Wirbelkörper)
________________________________________________________________Abbildungen
61
Abb. 7
________________________________________________________________Abbildungen
62
Abbildung 8:
Heterotope Transplantation von zukünftigen, Scapula-bildenden Dermomyotomen
(A)
Mehrschritt-Operationsschema: (a) Herstellung des Transplantates durch Entnahme
von 2-3 dorsalen Hälften epithelialer, Scapula-bildender Somiten aus einem Wachtel-Embryo
(blau). (b) Präparation des Empfängers (Huhn; rot) durch Resektion von 3-4 dorsalen Hälften
epithelialer Somiten aus dem Hals-Bereich. (c) Transfer des Transplantates in den Empfänger.
(d) Zustand nach Fixierung des Transplantates im Empfänger: Die dorsalen Hälften der HalsSomiten sind durch Scapula-bildende, dorsale Somiten-Hälften aus der Wachtel ersetzt.
(B)
Skelett-Muster des Halsbereichs eines Embryos nach der in (A) beschriebenen
Operation und sieben Tagen Reinkubationszeit (Aufsicht von rechts, dorso-lateral). Der rote
Pfeil markiert einen einzelnen ektopischen Knorpel auf der Operationsseite. (A: Auge; HWS:
Halswirbelsäule)
(C)
Histologischer Transversal-Schnitt in Höhe des ektopischen Knorpels in (B) mit
immunhistochemischer Doppel-Färbung von Muskelprotein (Desmin; hellbraunes Farbsignal)
und Wachtelzellen (blaues Farbsignal). Der rote Rahmen markiert den Bereich des
ektopischen Knorpels und wird vergrößert in (C`) dargestellt. Der ektopische Knorpel liegt
direkt unter der Haut, ist in Halsmuskulatur eingebettet und hat keine Verbindung zur
Wirbelsäule. Die Derivate des Sklerotoms (z.B. Wirbelkörper, Hirnhäute) sind nicht mit dem
Anti-Wachtel-Antikörper (kein blaues Farbsignal) angefärbt. (WK: Wirbelkörper; RM:
Rückenmark)
(C`)
Ausschnittsvergrößerung aus (C). Der ektopische Knorpel (rote Pfeilspitzen) besteht
komplett aus Wachtelzellen (blaue Farbreaktion v.a. im perichondralen Bereich). Die
inserierenden Muskeln stellen ein Gemisch aus Wachtel- und Huhnmaterial dar.
________________________________________________________________Abbildungen
63
Abb. 8
__________________________________________________________________Lebenslauf
64
8.
Lebenslauf
Angaben zur Person
Name
Florian Ehehalt
Geburtstag
5. April 1978
Geburtsort
Ulm
Eltern
Peter Ehehalt (Vermessungstechniker)
Doris Ehehalt, geb. Haas (Bauzeichnerin)
Ausbildungsweg
Juni 97
Allgemeine Hochschulreife am „Hans und Sophie Scholl-Gymnasium“,
Ulm
Sept. 97-Sept. 98
Zivildienst als Pflegehelfer im Querschnittgelähmten-Zentrum des
Rehabilitationskrankenhauses Ulm
Okt. 98-Okt. 99
Medizinstudium an der Universität Ulm
seit Okt.99
Medizinstudium an der Universität Freiburg
Aug. 00
Ärztliche Vorprüfung
Aug. 01
Erstes Staatsexamen
Praktische Tätigkeiten im Rahmen der Ausbildung
Sept./Okt. 01
Aug. 02
Famulatur am Pathologischen Institut der Universität Freiburg als
Sektionsassistent
Famulatur am „Klinikum rechts der Isar“ der Technischen Universität
München im Fach Allgemein- und Viszeralchirurgie
Sept. 02
Mitarbeit im Labor von Martin J. Cohn, Department of Zoology,
Institute of Animal and Microbial Sciences, University of Reading, UK,
über die „Entwicklung und Evolution des äußeren Genitales beim
Vogel-Embryo“
März 03
Famulatur am „Klinikum der Barmherzigen Brüder“, Wien, im Fach
Urologie
__________________________________________________________________Lebenslauf
65
Nebentätigkeiten
bis Okt. 99
Pflegerische Aushilfe an der Zivildienststelle
seit Okt. 99
Sitzwachentätigkeit an der Uniklinik Freiburg
WS 01/02
Präparationsassistent im Rahmen des anatomischen Unterrichts
_________________________________________________________________Danksagung
66
9.
Danksagung
Mein tiefer Dank gilt Herrn PD Dr. Huang für die Überlassung des Themas und die Erstellung
des Erst-Gutachtens über die vorliegende Arbeit. Herrn PD Huangs Vorarbeiten legten den
Grundstein für meine wissenschaftliche Arbeit an diesem Thema. Unter seiner ständigen und
umfassenden Betreuung war es mir eine große Freude, Fragen zu stellen und diese
experimentell zu bearbeiten. Besonders hervorheben möchte ich, dass Herrn PD Huangs
operative Fertigkeiten mir immer Vorbild und Ansporn waren. Ebenso hat mich das geduldige
Engagement Herrn PD Huangs im Labor und beim Studentenunterricht begeistert und wird
mich nachhaltig prägen.
Für die Übernahme des Zweit-Gutachtens bedanke ich mich zutiefst bei Herrn Prof. Dr.
Horch.
Von ganzem Herzen möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Christ bedanken. Sein beständiges
Interesse am Fortgang der Arbeit und seine begleitenden Anregungen haben grundlegend das
Zustandekommen der Arbeit gefördert. Unter vielem anderen durfte ich von Herrn Prof. Dr.
Christ lernen, wie wissenschaftliches (Nach-) Fragen und Arbeiten vonstatten gehen soll.
Auf die hervorragende technische Assistenz von Herrn Frank, Frau Gimbel, Frau Koschny und
Frau Schüttoff baut ein wesentlicher Teil meiner methodischen Ausbildung im Labor auf.
Dafür bin ich allen Beteiligten sehr dankbar.
Herr Dr. Cohn hat viele Ideen und Anregungen in intensiven und umfassenden Diskussionen
zu dieser Arbeit beigesteuert, wofür ich ihm zu tiefem Dank verpflichtet bin. Ebenso
diskussionsfreudig waren Herr Dr. Rodriguez-Niedenführ und Herr Malashichev, die durch
ständiges Nachfragen und Kommentieren ihren Beitrag zu dieser Arbeit geleistet haben. Für
ihre Hilfsbereitschaft und das freundschaftliche Verhältnis im Labor bedanke ich mich bei
Marlyse Dieugié-Fomenou und Julia Schrägle.
Stefan Blaser und Stefanie Jellinghaus danke ich herzlich für die eingehende Durchsicht und
Korrektur des Manuskripts.
Meiner Familie danke ich aus vollem Herzen. Ohne die menschliche und die finanzielle
Unterstützung durch meine Familie wäre diese Arbeit nicht auszuführen gewesen.
______________________________________________Eigene
Vorträge und Publikationen
67
10. Eigene Vorträge und Publikationen
F. Ehehalt, R. Huang, B. Christ; „Die Skapula wird von der embryonalen Haut induziert”;
Verhandl. der Anat. Gesell., Supplement zum 184. Band des Anat. Anz.(Annals of Anatomy),
2001, S. 156 (Abstract)
F. Ehehalt, R. Huang, B. Christ; „Dermomyotomal contribution to scapula requires
ectodermal and somatopleural signals and is segmentally specified by positional values.“; 98.
Versammlung der Anatomischen Gesellschaft (Joint Meeting), März 2003, Dresden
Huang, R., Stolte, D., Kurz, H., Ehehalt, F., Cann, G. M., Stockdale, F. E., Patel, K. and
Christ, B. (2003). Ventral axial organs regulate expression of myotomal Fgf-8 that influences
rib development. Dev Biol 255, 30-47.
___________________________________________________________________Erklärung
68
11. Erklärung
Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne
Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Die aus anderen Quellen
direkt oder indirekt übernommenen Daten und Konzepte sind unter Angabe der Quelle
gekennzeichnet. Insbesondere habe ich hierfür nicht die entgeltliche Hilfe von Vermittlungsbzw. Beratungsdiensten in Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder
mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt
der vorgelegten Dissertation stehen.
Die Arbeit wurde bisher weder im In- noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer
anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.
.................................................
(Datum)
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(Unterschrift)