Helicobacter pylori - Clarithromycin-Resistenz
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Institut für medizinische & molekulare Diagnostik AG 14 · CH-8008 Zürich · Telefon 0041 44 497 Falkenstrasse 30 60 Helicobacter pylori - Clarithromycin-Resistenz Nachweis mittels PCR und Sequenzierung 1. Bedeutung Die Australier J.R. Warren und B.J. Marshall wurden 2005 "for their discovery of the bacterium Helicobacter pylori and its role in gastritis and peptic ulcer disease" mit dem Nobelpreis geehrt [1]. Sie haben 1983 den Mikroorganismus als erste kultiviert [1]. 1994 empfahl das NIH, alle Patienten mit peptischen Ulcera und gesicherter Helicobacter pylori Infektion antibiotisch zu behandeln [3] und die International Agency for Research on Cancer Working Group der WHO erklärte Helicobacter pylori zum Karzinogen [4]. Die kulturellen Ansprüche des Erregers erschweren die für eine gezielte antibakterielle Therapie wünschenswerte Resistenzprüfung, so wird denn eine empirische, auf der klinischen Erfolgsrate basierende empfohlen. Primär soll blind mit Amoxicillin und Clarithromycin, kombiniert mit einem Protonenpumpenhemmer behandelt werden. Dabei sei die regionale Resistenzlage mit zu berücksichtigen [5]. Die zahlreichen Studien erlauben aber höchstens eine Einschätzung der epidemiologischen Situation [Übersicht in 6], denn systematische Resistenzprüfungen mit einheitlichen Methoden an einer grossen Zahl von Isolaten sind sehr selten. Im Rahmen einer solchen Studie wurden 1998 in 17 europäischen Ländern an 22 Zentren 1274 Isolate mit dem Epsilon-Test untersucht. Man fand bei Erwachsenen durchschnittlich 9.9% primär R Clarithromycin resistente (Cla ) Stämme mit signifikanten Unterschieden in der Prävalenz zwischen Nord- (4.2%), Zentral-/Ost- (9.3%) und Südeuropa (18%) [7]. Für die Schweiz sind auch einige Zahlen bekannt: am Kantonsspital Basel erwiesen sich 1994 3% und im Jahr 2000 R 7.5% der Kulturen als Cla [8,9], im Kanton Tessin 12% im Jahr 2000 [10] und in der 2005 R publizierten Arbeit aus dem Raum Zürich ist von 22% Cla die Rede [11]. Seitdem die Experten die sogenannt "nicht invasiven Teste" als dem diagnostischen Goldstandard ebenbürtig erklärt haben [5], erfolgt die Behandlung der Infektion oft nicht mehr durch den Spezialisten, der die Diagnose mittels Gastroduodenoskopie und Biopsie stellt, sondern beim Hausarzt. Die Frage, ob dadurch nicht etwas grosszügig Eradikationstherapien verordnet werden, ist berechtigt [10]. Jedenfalls werden zunehmend klinische Misserfolge R beobachtet. Dazu trägt zur Hauptsache die primäre Cla bei, deren Prävalenz tendenziell R ansteigt. Es ist erwiesen, dass der Prozentsatz an Cla Stämmen bei Patienten, die ein- oder mehrmals behandelt wurden, signifikant höher liegt als bei nicht behandelten, nämlich bei 50 bis >80% [6,7,10,12]. R 1996 wurde bekannt, dass Punktmutationen im 23S rRNA Gen mit Cla assoziiert sind [13]. R Inzwischen sind diverse Protokolle publiziert, die es ermöglichen, die Cla molekularbiologisch direkt an der Probe zu bestimmen [Referenzen in 6]. 2. Nachweismethoden R Die bis heute beschriebenen, für Cla verantwortlichen Mutationen liegen im 23S rRNA Gen, das für die 50S Untereinheit der Ribosomen in der Nähe des Peptidyltransferase-Zentrums codiert, dem Angriffspunkt von Clarithromycin. Die Punktmutationen führen zur verminderten Bindung des Makrolids und damit zur Resistenz. Institut für medizinische & molekulare Diagnostik AG 14 · CH-8008 Zürich · Telefon 0041 44 497 Falkenstrasse 30 60 Auf der Basis publizierter Daten haben wir im Rahmen einer Diplomarbeit eine PCR entwickelt, mit der der betreffende Abschnitt in dieser Region amplifiziert wird. Der Nachweis der Mutationen erfolgt danach durch Sequenzierung des Produkts und Vergleich der Sequenz mit der Referenzsequenz U27270 [13,14,15,16]. 66 asservierte, für DNA von Helicobacter pylori bekannt positive Proben wurden auf R Cla untersucht, 26 Biopsien und 40 Stuhlproben. Ob sie von nicht oder (erfolglos) therapierten Patienten stammten, war nicht bekannt. 25 der 26 Biopsien ergaben ein mit Erfolg sequenzierbares Amplifikat (Sensitivität 96%). Von den lediglich 24 aus 40 Stuhlproben erzielten PCR Produkten waren dann nur 17 Sequenzen R auswertbar. Demnach ist diese Methode zum Nachweis von Cla in Stuhlproben nicht geeignet, da in weniger als 50% mit einem brauchbaren Resultat gerechnet werden kann. Die R Spezifität liegt bei 100%, weil nur Proben auf Cla getestet werden, in denen vorgängig Helicobacter pylori DNA nachgewiesen wurde. R In 12 der schliesslich 42 verwertbaren Proben wurden Cla Mutationen gefunden (28%), und zwar in 5 (12%) die weltweit häufigsten in Position 2143 und 2142 (A→G) und in 6 die Mutation T2182C (14%). In 1 Probe (2%) lagen zwei Mutationen vor, nämlich A2143G und T2182C. T2182C wurde erst kürzlich in Korea entdeckt [17]. Diese wurde mit den in der westlichen Welt bislang verwendeten PCR Protokollen nicht erfasst, ihre Bedeutung wird noch diskutiert [18]. R Davon abgesehen, enthalten noch immer 14% unserer Proben Cla Stämme. Bei einer kürzlich im Kanton Aargau mit molekularbiologischen Methoden durchgeführten Untersuchung, die nicht R auf den Nachweis von T2182C angelegt waren, wurden von 130 Magenbiopsien Cla Mutationen in 9% der Proben von unbehandelten und in 90% von behandelten Patienten mit persistierender Infektion gefunden [19]. Was die anderen für die empirische Therapie vorgeschlagenen Antibiotica anbetrifft: die Resistenz gegenüber Amoxicillin liegt weltweit bei 0 bis <1%. Metronidazol resistent sind in Europa 30 bis >50% der Stämme [12, Übersicht in 6]. In unserem Land sind 25 bis 31% primär resistent [8,9,10], Metronidazol sollte daher nicht zur Therapie von Helicobacter pylori Infektionen eingesetzt werden [19]. R Unsere Methode beansprucht 1-2 Tage. Cla Populationen werden erfasst, auch wenn sie in der Probe mit sensiblen gemischt vorliegen. Die Koexistenz von mutanten und WildtypStämmen ist bekannt und nicht selten, was auch die Aargauer Forscher wieder bestätigten [19]. Es ist zu hoffen, dass die bereits verfügbaren und bestimmt noch zu erwartenden Möglichkeiten der molekularen Resistenzprüfung dazu führen werden, die derzeit gängige "Test und Therapie"-Strategie zu überarbeiten, damit die Infektion gezielt behandelt wird, wie dies den Regeln der medizinisch mikrobiologischen Kunst entspricht. 3. Untersuchungsmaterialien R Folgende Materialien sind für die Untersuchung auf Cla geeignet: • Biopsien der Schleimhaut von Magen und Duodenum • Isolate Institut für medizinische & molekulare Diagnostik AG 14 · CH-8008 Zürich · Telefon 0041 44 497 Falkenstrasse 30 60 _______________________________________________________________________________________________ Literatur: [1] http://www.nobelprize.org/medicine/laureates/2005/ [2] J.R. Warren, B.J. Marshall. Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis. Lancet 1983, 1:1273-1275. [3] National Institute of Health 1994. NIH Consensus Conference. Helicobacter pylori in peptic ulcer disease. NIH Consensus Development Panel on Helicobacter pylori in Peptic Ulcer Disease. JAMA 1994, 272:65-69. [4] http://www.inchem.org/documents/iarc/vol61/m61-3.html [5] P. Malfertheiner, F. Mégraud, C. O’Morain et al. Current concepts in the management of Helicobacter pylori infection - The Maastricht 2-2000 Consensus Report. 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