shigatoxin-spezifische immunglobuline und
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Aus dem Institut für Hygiene und Infektionskrankheiten der Tiere Justus-Liebig-Universität Gießen Betreuer: PD Dr. med. vet. C. Menge SHIGATOXIN-SPEZIFISCHE IMMUNGLOBULINE UND AUSSCHEIDUNG VON SHIGATOXIN-BILDENDEN ESCHERICHIÄ COLI BEI KÄLBERN INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Dr. med. vet. beim Fachbereich Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen eingereicht von Julia Fröhlich Tierärztin aus Suhl Gießen 2009 I Inhalt I Inhalt I Inhalt I II Abkürzungsverzeichnis VI III Einleitung 1 IV Literaturübersicht 2 1 2 Definition und Wirtsspektrum Shigatoxin-bildender Escherichia coli (STEC) 2 Virulenzfaktaren der STEC 3 2.1 Shigatoxine (Stx) 3 2.2 Intimin und Typ III Sekretionssystem 8 2.3 Enterohämolysin 9 3 STEC-Infektionen beim Rind Prävalenz von STEC 10 3.2 Symptomatik boviner STEC-Infektionen 14 Epidemiologie der STEC in der Rinderpopulation 15 3.3 4 3.3.1 Erstinfektion und STEC-Ausscheidung in verschiedenen Lebensabschnitten 3.3.2 Intermittierende Ausscheidung von STEC und „Supershedder" 16 3.3.3 Dauer der STEC-Ausscheidung 18 3.3.4 Serotypen-spezifische STEC-Ausscheidung 20 STEC-spezifische Immunität beim Rind 4.1 Humorale Immunität 15 21 21 4.1.1 O-Antigene 28 4.1.2 Stx 30 4.1.3 Weitere STEC-Antigene 32 4.1.4 Protektivität einer humoralen STEC-Immunität 34 Zelluläre Immunität und ihre mögliche Bedeutung 35 4.2 5 V 10 3.1 Antigen-unspezifische Immunmodulation durch STEC-Faktoren 36 5.1 Lymphostatin 36 5.2 Stx 38 Material und Methoden 40 I Inhalt 1 Probengewinnung 40 1.1 Betriebsdaten 40 1.2 Entnahmezeitpunkte und Probenplan 41 1.2.1 Muttertiere 41 1.2.2 Kälber 41 1.2.3 Weitere Tiere 42 Probenentnahme 42 1.3 1.3.1 Blutproben zur Serumgewinnung 1.3.2 Kolostrum 43 1.3.3 Milch 43 1.3.4 1.4 2 Kot 43 Probenaufbereitung 43 1.4.1 Gewinnung von Serum aus Blutproben 43 1.4.2 Verarbeitung von Kolostrum- und Milchproben 43 Zellkulturmethoden 44 2.1 Zelllinien 44 2.2 Gewinnung und Kultivierung von primären, bovinen Kolonkryptenzellen 45 3 Nachweis von Stx-spezifischen Antikörpern in Serum-, Kolostrum- und Milchproben 3.1 Verozelltest 47 47 3.1.1 Prinzip des Neutralisationstestes 47 3.1.2 Prinzip des Zytotoxizitätstestes 49 3.1.3 Auswertung 50 3.1.4 Berechnung der verozytotoxischen/inhibitorischen Dosis 50 % 51 3.1.4.1 Berechnung der verozytotoxischen Dosis 50 % 3.1.4.2 Berechnung der inhibitorischen Dosis 50 % 54 3.1.4.3 Nachweisgrenze sowie Definition von Titerabfall und Titeranstieg 54 3.2 ELISA 51 55 3.2.1 Durchführung des Stx-ELISA 3.2.2 Herstellung von E. co//-Ultraschall-Lysaten 56 3.2.3 Überprüfung und Einstellung der Ultraschall-Lysate 57 Durchführung des kompetitiven ELISA 58 3.2.4 3.3 Western Blot und Immunofärbung 55 60 3.3.1 Tricine-SDS-PAGE 60 3.3.2 Überprüfung des verwendeten Stxl 61 3.3.3 Semi-Dry Western Blot 62 3.3.4 Immunofärbung 63 3.3.4.1 4 42 Einstellung der Primär- und Sekundärantikörper-Konzentrationen Nachweis der STEC-Ausscheidung 63 64 I Inhalt 4.1 Nachweis von Stx-Genen in Kotproben ~ 64 4.1.1 Probenaufbereitung 64 4.1.2 jte//jtr2-Multiplex-PCR 65 4.1.3 Bestimmung der Nachweisgrenze für die stxl/stx2-Mult\p]ex-PCR 66 4.1.4 jüc2-Typisierungs-PCRs 69 4.1.5 Bestimmung der Nachweisgrenze für die s£c2/sf;t.2c-Typisierungs-PCR 71 4.2 Nachweis von Stx im Kot 5 72 Isolierung und Charakterisierung von STEC-Stämmen 5.1 5.2 73 Anzuchtverfahren 73 Typisierung der STEC 73 5.2.1 5(x//ite2-Multiplex-PCR und itt2-Typisierungs-PCRs 73 5.2.2 Multiplex-PCR für stx, ehxA, eae 73 5.2.3 Intimin-Typisierungs-PCR 75 5.2.4 Wachstum auf Selektivagar 75 5.2.5 Überprüfung der in v/m>-Stx-Bildung 75 5.2.6 Pulsfeld-Gelelektrophorese(CHEF-PFGE) 76 5.3 Bindungsversuche im Zellkulturmodell (Adhäsionstests) Verwendetet. co//-Stämme 79 5.3.2 Anzucht der Bakterien 79 5.3.3 Fluorescence Actin Staining-Test (FAS-Test) 80 5.3.4 Giemsa-Test 82 5.3.5 Nachweis von Stx in Zellkulturüberständen 83 VI Ergebnisse 1 79 5.3.1 85 Nachweis von Stx-spezifischen Antikörpern in Serum-, Kolostrum- und Milchproben 1.1 Verozell-Neutralisationstest 1.1.1 Stx 1-spezifische Antikörper 1.1.1.1 85 85 85 Serum, Kolostrum und Milch der Muttertiere 85 1.1.1.2 Serum der Kälber 88 1.1.1.3 Serum weiterer Tiere 91 1.1.2 Stx2-spezifische Antikörper 92 1.1.2.1 Serum, Kolostrum und Milch der Muttertiere 92 1.1.2.2 Serum der Kälber 92 1.1.2.3 Serum weiterer Tiere 1.1.3 1.2 94 Stx2c-spezifische Antikörper 94 Kompetitiver ELISA 1.2.1 94 Stx 1-spezifische Antikörper 94 1.2.2 Stx2-spezifische Antikörper 95 1.2.3 Stx2c-spezifische Antikörper 96 III I Inhalt 1.3 Western Blot/Immunofärbung 1.3.1 2 97 Stx 1-spezifische Antikörper 97 Nachweis der STEC-Ausscheidung 2.1 100 Kotuntersuchungen mittels PCR 100 2.1.1 Jtt/Aft2-Multiplex-PCR 100 2.1.2 s«:2-Typisierungs-PCRs 104 2.2 3 Nachweis von Stx im Kot 109 Isolierung und Charakterisierung von bovinen STEC-Stämmen 3.1 Typisierung der isolierten Stämme 109 109 3.1.1 Charakterisierung des Makrorestriktionsmusters via PFGE-Analyse 112 3.1.2 Bestimmung des Intimin-Subtyps 113 3.2 Bindungsversuche im Zellkulturmodell 3.2.1 3.2.1.1 FAS-Test 3.2.1.2 Giemsa-Test 3.2.2 113 Bindungsversuche mit HEp2(Clone2b)-Zellen 114 114 115 Bindungsversuche mit bovinen Kolonkryptenzellen 117 3.2.2.1 FAS-Test 3.2.2.2 Giemsa-Adhäsionstest 117 118 3.2.2.3 Nachweis von Stx in Zellkulturüberständen 120 VII Diskussion 122 VIII Zusammenfassung 136 IX Summary 138 X Literaturverzeichnis 140 XI Anhang 161 1 Übersicht untersuchte Tiere 2 Stx-spezifische Antikörper, Verozell-Neutralisationstest und kompetitiver ELISA, einzelne 161 Titerwerte 165 3 172 Übersicht Über verwendete Geräte, Chemikalien und Verbrauchsmaterialien 4 Verwendete Puffer und Medien 4.1 179 Puffer, Lösungen und Medien für Zellkulturtechniken IV 179 I Inhalt 4.2 Puffer und Lösungen für den ELISA 183 4.3 Puffer und Lösungen für die Tricine-PAGE 184 4.4 Puffer und Lösungen lür Western Blot und Immmunofärbung 185 4.5 Puffer und Uisungen für CHEF-PFGE 187 4.6 Puffer und Lösungen für PCRs 189 4.7 Kulturmedien für die Bakterienanzucht 189 XII Abbildungsverzeichnis 191 1 Abbildungen 191 2 Tabellen 192 V
