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Aus der
Klinik für Anaesthesiologie und Intensivmedizin
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
Thionamide hemmen die Transkriptionsfaktoren NF-κB, AP-1 und
NFAT in T-Lymphozyten
INAUGURAL - DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
Vorgelegt 2009
von Hannah Dohrmann
geboren in Marburg
Dekan
Prof. Dr. C. Peters
1. Gutachter
PD Dr. R. Schmidt
2. Gutachter
Prof. Dr. I. Merfort
Jahr der Promotion 2009
Teile dieser Arbeit wurden in folgenden Publikationen veröffentlicht:
Humar M, Dohrmann H, Stein P, Andriopoulos N, Goebel U, Heimrich B,Roesslein M, Schmidt R,
Schwer CI, Hoetzel A, Loop T, Geiger KK, Pahl HL, Pannen BH.
Repression of T-cell function by thionamides is mediated by inhibition of the activator protein-1/
nuclear factor of activated T-cells pathway and is associated with a common structure.
Mol Pharmacol. 2007 Dec;72(6):1647-56.
Humar M, Dohrmann H, Stein P, Andriopoulos N, Goebel U, Roesslein M, Schmidt R, Schwer CI,
Loop T, Geiger KK, Pahl HL, Pannen BH.
Thionamides inhibit the transcription factor nuclear factor-kappaB by suppression of Rac1 and
inhibitor of kappaB kinase alpha.
J Pharmacol Exp Ther. 2008 Mar;324(3):1037-44.
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
1.1
1
Das Immunsystem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
1.1.1
Die Bestandteile des Immunsystem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
1.1.2
Prinzipien der Immunantwort . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2
1.1.3
Die intrazelluläre Signalkaskade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2
1.1.4
Aktivierte T-Lymphozyten exprimieren den Oberflächenmarker CD69 . . . . .
3
1.1.5
Die Interleukin-2 Produktion wird durch die Transkriptionsfaktoren NF-κB, AP1 und NFAT reguliert . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4
Essentielle Transkriptionsfaktoren der Immunantwort . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4
1.2.1
NF-κB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4
1.2.2
AP-1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7
1.2.3
NFAT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8
1.3
Immunsuppression durch heterozyklische Substanzen mit Schwefelgruppe . . . . . . .
10
1.4
Struktur, Pharmakologie und immunsuppressive Wirkung der Thionamide . . . . . . .
11
1.4.1
Struktur der Thionamide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11
1.4.2
Pharmakologie der Thionamide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11
1.4.3
Immunsuppressive Wirkung der Thionamide . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
13
Fragestellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
14
1.2
1.5
2 Material und Methodik
15
2.1
Isolation und Kultur primärer, humaner CD3-positiver Zellen . . . . . . . . . . . . . .
15
2.2
Behandlung mit Thionamiden und Aktivierung CD3-positiver Zellen . . . . . . . . . .
16
2.3
Durchflusszytometrie (FACS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
17
2.4
Enzyme linked Immunosorbent Assay (ELISA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
17
2.5
Luciferase Reportergen Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
18
2.6
Herstellung nukleärer Proteinextrakte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
18
2.7
Elektrophoretic Mobility Shift Assay(EMSA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
19
2.8
TransAM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
21
2.9
Immundetektion durch Western Blotting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
22
2.10 JNK Kinase Aktivitätsimmunoassay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
25
2.11 Detektion der Zytotoxizität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
26
2.12 Statistik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
26
3 Ergebnisse
3.1
27
Heterozyklische Thionamide hemmen humane T-Lymphozyten . . . . . . . . . . . . .
3.1.1
Carbimazol und Propylthiouracil inhibieren die Expression des T-ZellAktivierungsmarkers CD69 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
27
3.1.2
Die IL-2 Synthese wird durch einige Thionamide gehemmt . . . . . . . . . . . .
27
3.1.3
Carbimazol und Propylthiouracil hemmen die NF-κB-, AP-1-
und NFAT-
abhängige Luciferase-Genexpression . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2
28
Thionamide mit reaktiver Schwefelgruppe inhibieren die Aktivität des Transkriptionsfaktors NF-κB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.1
3.2.2
31
Die Phosphorylierung und Degradation des NF-κB-Regulatorproteins IκBα wird
durch Thionamide beeinflusst . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.3
31
Carbimazol und Propylthiouracil hemmen die DNA-Bindung von NF-κB in
CD3-positiven Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3
27
31
Durch heterozyklische Thionamide kommt es zu einer verminderten Synthese
der proinflammatorischen Zytokine INFγ und TNFα . . . . . . . . . . . . . . .
35
Thionamide inhibieren den Transkriptionsfaktor AP-1 . . . . . . . . . . . . . . . . . .
35
3.3.1
Carbimazol und Propylthiouracil supprimieren die DNA-Bindungsaktivität von
AP-1 in humanen Lymphozyten
3.3.2
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
35
Carbimazol und Propylthiouracil inhibieren die Phosphorylierung der MAPKinasen ERK1/2 und p38 sowie die Aktivität der c-Jun-NH2 -terminalen Kinase
(JNK) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.4
39
Der Transkriptionsfaktor NFAT wird in humanen T-Lymphozyten durch Thionamide
gehemmt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.4.1
39
Carbimazol und Propylthiouracil hemmen die DNA-Bindungsaktivität von
NFAT in humanen T-Lymphozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
41
3.4.2
Die Dephosphorylierung von NFAT in humanen T-Lymphozyten wird durch
Carbimazol inhibiert . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.4.3
Carbimazol hemmt die Autophosphorylierung der Calmodulinkinase II in CD3positiven Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.5
4 Diskussion
44
46
Die biologische Funktionalität von T-Zellen wird durch Thionamide mit reaktiver
Schwefelgruppe herabgesetzt
4.2
44
Die Inhibition von NF-κB, AP-1 und NFAT ist nicht auf toxische Effekte der Thionamide zurück zu führen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.1
41
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
46
Der thionamidinduzierten NF-κB-Suppression liegt wahrscheinlich eine reduzierte IKKAktivität zu Grunde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
47
4.3
Therapeutische Ansätze durch NF-κB-Blockade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
48
4.4
Der Suppression von AP-1 liegt eine Hemmung der Map-Kinasen zu Grunde . . . . . .
49
4.5
Carbimazol führt wahrscheinlich über eine Interaktion mit Calmodulin zu einer Inhibition von NFAT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.6
Durch die Interaktion der NF-κB-, AP-1- und NFAT-Signalkaskaden können inhibitorische Effekte verstärkt werden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.7
4.8
50
51
Heterozyklische, schwefelhaltige Substanzen führen strukturvermittelt zu einer Immunsuppression . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
52
Ausblick . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
53
5 Zusammenfassung
54
6 Literaturverzeichnis
55
7 Abkürzungsverzeichnis
63
8 Danksagung
66
9 Lebenslauf
67
1 Einleitung
1.1 Das Immunsystem
1.1.1 Die Bestandteile des Immunsystem
Das Immunsystem hat die Aufgabe, die Integrität des Organismus zu bewahren, indem es infektiöse
Erreger und entartete Zellen bekämpft. Für eine reibungslose Funktion dieses komplexen Systems ist
eine fein regulierte Abstimmung der einzelnen Komponenten unabdingbar.
Das Immunsystem wird in die angeborene und adaptive Immunität unterteilt, wobei letztere spezifisch
Antigene erkennt und Gedächniszellen generiert, die bei erneutem Kontakt mit diesem Antigen eine effiziente und schnelle Immunantwort herbeiführen können. Hingegen leistet die angeborene Immunität
mit ihren Komponenten eine erste Verteidigung des Organismus, indem sie allgemein vorkommende Merkmale von Krankheitserregern erkennt (Janeway, Travers, Walport, Shlomchik, 2001). Zu den
Komponenten der angeborenen Immunität gehören neben physikalischen und chemischen Barrieren
der Haut und Schleimhäute auch lösliche Faktoren wie Komplementfaktoren, Lysozyme und Zytokine
sowie zelluläre Bestandteile. Die Zellen des angeborenen Immunsystems sind Makrophagen, Monozyten, Granulozyten und natürliche Killerzellen (NK-Zellen); Dendritische Zellen werden sowohl der
angeborenen als auch der adaptiven Immunität zugeordnet. Besonders für die adaptive Immunität
nehmen Dendritische Zellen als antigenpräsentierende Zellen (APC) für die Stimulation von T-Zellen
eine Schlüsselrolle ein.
Grundlage der adaptiven Immunität sind die antigenspezifischen Lymphozyten, die anhand ihrer Antigenrezeptoren und ihrem Reifungsort in B- und T-Zellen unterteilt werden. B-Lymphozyten produzieren nach suffizienter Aktivierung des B-Zellrezeptors (BCR) Antikörper, die die humorale Komponente
der adaptiven Immunantwort darstellen. T- Lymphozyten exprimieren den T-Zell-Rezeptor (TCR),
einen membrangebundenen Komplex, bestehend aus einer α und einer β Kette mit jeweils einer konstanten und einer variablen Region, die über Disulfidbrücken verbunden sind. Mit dem TCR sind
Cofaktoren wie CD3 [cluster of differentiation] und ζ Ketten assoziert, welche für die intrazelluläre
Signalübertragung über ITAMs [immunoreceptor tyrosine-based activation motifs] sorgen. Das CD3
2
Oberflächenprotein wird in einem sehr frühen Differenzierungsstadium exprimiert, weshalb man bei
peripheren T-Lymphozyten von CD3-positiven Zellen spricht. Der TCR kann im Gegensatz zum BCR
keine löslichen Antigene erkennen, sondern ist auf die Präsentation von Antigenpeptiden über einen
MHC-Komplex [major histocompatibility complex; beim Menschen gleichbedeutend mit HLA, human leucocyte antigen] angewiesen. MHC-I exprimieren fast alle kernhaltigen Zellen des menschlichen
Körpers, wohingegen MHC-II nur auf APC vorkommt. Weitergehend unterteilt man die Population
der T-Lymphozyten in CD4-positive T-Helfer-Zellen und CD8-positive zytotoxische T-Zellen.
1.1.2 Prinzipien der Immunantwort
Aktivierung von Lymphozyten kann verschiedene Konsequenzen haben: sie können proliferieren, differenzieren, apoptotisch oder anerg werden. Alle Reaktionsformen sind für eine adäquate Immunreaktion unabdingdar, wobei das Schicksal des Lymphozyten durch die eingehenden Signale an den
Zellrezeptoren entschieden wird (Berridge, 1997). Zum Beispiel bewirkt die Bindung zwischen TCR,
CD8 und antigenpräsentierendem MHC-I die Differenzierung einer nativen T-Zelle zu einer zytotoxischen T-Effektorzelle. Die gleiche Funktion erfüllt CD4 bei der Bindung zwischen TCR und MHC-II,
doch können sich CD4-positive Zellen abhängig von Interleukin (IL)-12 Einfluss in inflammatorische TH 1-Zellen oder Helfer-TH 2-Zellen differenzieren. TH 1-Zellen stimulieren mit ihren Leitzytokinen Interferon-γ (IFN-γ) und Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) vor allem Makrophagen und sind somit
essentiell für die Bekämpfung intrazellulärer Pathogene. Für die Aktivierung von B-Zellen sind TH 2Zellen wichtig, die als Leitzytokine IL-4, -5 und -10 produzieren.
Für eine suffiziente Aktivierung von T-Zellen über den TCR ist neben der Aktivierung des CD3Rezeptors eine Kostimulation über CD28 notwendig (Kleinig, Sitte, 2003). CD28 unterstützt die vom
TCR ausgehende Aktivierung der PI3K [Phosphatidylinositol 3-Kinase]-Signalkaskade und verhindert
zugleich die Desensitivierung des TCR. Eine einseitige Stimulation des TCR führt zur klonalen Anergie
(Berridge, 1997).
1.1.3 Die intrazelluläre Signalkaskade
Die antigen-induzierte intrazelluläre Signalkaskade von T-Lymphozyten ist in Abb 1.1. dargestellt. Die
Interaktion des CD4- oder CD8-Rezeptors mit dem TCR/CD3/MHC-Komplex führt zur Aktivierung
einer assoziierten Tyrosinkinase (Lck). Lck phosporyliert die ITAMs und ZAP-70 [ ζ-associated protein
of 70 kD]. Die Kinase ZAP-70 ist in der Lage mit einer Vielzahl von Adaptorproteinen wie zum Beispiel
Phospholipase Cγ (PLCγ), Proteinkinase Cθ (PKCθ) und Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI 3-K) in
3
Abbildung 1.1: T-Zellaktivierung über TCR, CD3 und CD4. Aktivierung des TZellrezeptorkomplex’ führt über die assoziierte Tyrosinkinase Lck zur Phosporylierung der ITAMs
und ZAP-70, welche über eine Vielzahl von Adaptorproteinen Calcineurin und die Map-Kinasen ERK
und JNK, sowie die PKC aktivieren. Diese aktivieren die Transkriptionsfaktoren NF-κB, AP-1 und
NFAT. (aus Vollmar, Dingermann, 2005)
Wechselwirkung zu treten, wodurch Signale von der Zelloberfläche weitergeleitet und verstärkt werden
(Berridge, 1997; Vollmar, Dingermann, 2005). Die PLCγ generiert durch hydrolytische Spaltung aus
Phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphat (PIP2 ) Diacylglycerol (DAG) und Inositol-1,4,5-triphosphat
(IP3 ). DAG aktiviert die PKC sowie die Ras-Signalkaskade und folglich die Transkriptionsfaktoren
AP-1 [Aktivator-Protein-1] und NF-κB [Nuclear Factor κB]. Der zweite von der PLCγ gebildete
second messenger, IP3 , bindet an das Endoplasmatische Retikulum mit konsekutiver Ca2+ -Freisetzung.
Die Erhöhung der zytosolischen Ca2+ -Konzentration bedingt die Aktivierung der Proteinphosphatase
Calcineurin, die den Transkriptionsfaktor NFAT [Nuclear Factor of Activated T Cells] dephosphoryliert
und damit aktiviert.
1.1.4 Aktivierte T-Lymphozyten exprimieren den Oberflächenmarker CD69
Der Membranrezeptor CD69 gilt als ein früher Aktivierungsmarker von T-Lymphozyten und wird
bereits vier Stunden nach T-Zellaktivierung exprimiert. (Hara et al., 1988). Die höchste Expressionsdichte wird nach 18 bis 48 Stunden erreicht (Simms, Ellis, 1996).
4
CD69 kann auf allen aktivierten Leukozyten, Monozyten und Thrombozyten nachgewiesen werden
(Testi et al., 2003). Es ist ein homodimeres, phosphoryliertes Typ-II-integrales Membranglykoprotein,
bestehend aus zwei Untereinheiten (27 kD bzw. 33 kD), die über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind. Die Transkription des CD69-Gens wird unter anderem von den Transkriptionsfaktoren
NF-κB, NFAT und AP-1 reguliert (Testi et al., 2003). Die T-Zellaktivierung über den TCR und CD28
sowie PKC- und p21ras-Stimulantien gelten somit als potente Aktivatoren der CD69-Expression (De
Maria et al., 1999).
1.1.5 Die Interleukin-2 Produktion wird durch die Transkriptionsfaktoren NF-κB, AP-1
und NFAT reguliert
Eine Interaktion der Transkriptionsfaktoren NF-κB, AP-1 und NFAT ist für die Transkription des IL-2Gens von essentieller Bedeutung (Berridge, 1997). IL-2 ist ein autokriner Wachtumsfaktor für T-Zellen
und setzt als “immediate early” Protein der Immunantwort in T-Lymphozyten Proliferiationsprozesse
in Gang. Der IL-2 Rezeptor setzt sich bei nativen T-Zellen aus einer β und γ Untereinheit zusammen.
Kommt es zu einer T-Zellaktivierung über den TCR und CD28, wird zusätzlich eine α-Kette des
IL-2 Rezeptors exprimiert. Dadurch wechselt der IL-2 Rezeptor in einen hochaffinen Zustand und
gewährleistet so die von IL-2 getriggerte klonale Expansion. Die Induktion der α-Kette ist NF-κB,
AP-1 und NFAT abhängig (Vollmar, Dingermann, 2005).
Die Bedeutung der Interaktion aller drei Transkriptionsfaktoren wird durch eine Arbeit von Peng et
al. in 2001 gestützt, in der gezeigt wird, dass T-Zellen, die kein NFAT exprimieren, nach suffizienter
Stimulation kein IL-2 produzieren und folglich anerg werden (Peng et al., 2001). Selbiges gilt auch für
ein NFAT-Genkonstrukt, welches keine Interaktion mit AP-1 eingehen konnte (Macian et al., 2001).
Die beschriebenen Interaktionen werden durch Abb.1.2 verdeutlicht.
1.2 Essentielle Transkriptionsfaktoren der Immunantwort
1.2.1 NF-κB
NF-κB wurde als ein nukleärer Faktor identifiziert, der in B-Zellen an die Enhancerregion des Gens
für die κ-Kette des Immunglobulins bindet (Baltimore, Sen, 1986). Mittlerweile weiß man, dass er
als Homo- oder Heterodimer eine Vielzahl unterschiedlicher Gene reguliert (Pahl, 1999), indem er an
bestimmte DNA-Regulationsstellen (κB sites) bindet (Epinat, Gilmore 1999). Mitglieder der NF-κBFamilie sind die Untereinheiten p50, p52, p65 (RelA), RelB und c-Rel, charakterisiert durch die “Rel
homology Domäne”, in der sich Sequenzen für den nukleären Transport, für die Dimerisierung und
5
Abbildung 1.2: Induktion des IL-2 Promoters. Nach Aktivierung des T-Lymphozyten binden die
Transkriptionsfaktoren NF-κB, AP-1 und NFAT kooperativ an den IL-2 Promoter. (aus Berridge,
1997)
für die Aktivitätsregulation befinden. Transaktivierungsdomänen besitzen nur p65, RelB und c-Rel,
so dass p50 und p52 nur als Dimer mit erstgenannten als Transkriptionsaktivatoren dienen können
(Gilmore, 1999). Das Dimer p50/p65 wird am häufigsten in der NF-κB-Signalkaskade gefunden. Die
NF-κB vermittelte Signaltransduktionskaskade ist in Abb. 1.3 dargestellt.
NF-κB liegt als Komplex mit einem inhibitorischen Protein (IκBα) im Zytoplasma vor. Die Aktivierung von NF-κB erfolgt durch die IKK [IκB-Kinase] abhängige Phosphorylierung, Ubiquitinierung
und dem proteasomalen Abbau von IκBα (Karin, 2000). Dabei wird NF-κB freigesetzt und gelangt
über die nun exponierte nukleäre Lokalisationssequenz in den Zellkern. In diesem sogenannten klassischen Signalweg setzt sich die IKK als Dimer aus den Untereinheiten IKKα und IKKβ, sowie der
regulatorischen Untereinheit IKKγ/NEMO zusammen (Kwak, 2000). Die Aktivierung erfolgt z.B. über
Stimulation des TCR/CD28 Rezeptors, des TNF-Rezeptors oder des IL-1/TOLL-Rezeptors. Die IKK
gilt somit als Konvergenzpunkt der NF-κB-Aktivierung nach unterschiedlicher Stimulation (Verma,
2004). Im alternativen Signalweg wird IκBα durch nur zwei IKKα Untereinheiten phosphoryliert,
bevor es im Proteasom zu p52 prozessiert wird. Dies erfolgt z.B. nach CD40-Rezeptor-Stimulation
(Hayden, Gosh, 2004).
Interessanterweise wird die NF-κB-Expression sowohl durch eine positive, als auch durch eine negative Feedback-Schleife autoregulatorisch gesteuert. Zum einen aktivieren viele von NF-κB stimulierte
6
Abbildung 1.3: Die NF-κB-Aktivierung NF-κB liegt als Komplex mit dem inhibitorischen Protein
IκBα im Zytoplasma vor. Die Aktivierung von NF-κB erfolgt durch die IKK abhängige Phosphorylierung, Ubiquitinierung und dem proteasomalen Abbau von IκBα. Dabei wird NF-κB freigesetzt
und gelangt über die nun exponierte nukleäre Lokalisationssequenz in den Zellkern und induziert die
Transkription von Zielgenen.
Zytokine wie IL-1β und TNFα wiederum NF-κB, so dass eine Verstärkung der biologischen Antwort
erreicht wird. Andererseits ist das IκBα-Gen ein Zielgen von NF-κB, mit der Folge, dass neusynthetisiertes IκBα im Zellkern NF-κB bindet, und damit die Transkriptionsaktivierung beendet.
Zu den klassischen Induktoren für die NF-κB-Rekrutierung zählen inflammatorische Zytokine (z.B.
IL-1, IL-17, TNFα, IFNγ), PKC Aktivatoren, Viren (z.B. EBV, CMV, HBV, Influenzavirus), Bakterien (z.B. Salmonellen, Helicobacter pylori, Staphylococcus aureus), Oxidantien, UV-Strahlung und
physiologischer Stress (z.B. Ischämie, Hämorrhagie) (Pahl, 1999; Barnies, Karin, 1997). Ebenso vielseitig sind die Zielgene, die NF-κB kontrolliert, u.a. MHC I und MHC II (Pahl, 1999). Damit beeinflusst
NF-κB Immun- und Entzündungsantworten, Differenzierungs- und Zelladhäsionsprozesse, Apoptose
und Redoxmechanismen der Zelle (Pahl, 1999; Epinat, Gilmore, 1999; Hayden, Gosh, 2004).
7
1.2.2 AP-1
Der Transkriptionsfaktor AP-1 ist an zentralen Prozessen wie der Immunantwort, der Regulation
des Zellzyklus, der Proliferation und Differenzierung sowie der Apoptose und Onkogenese beteiligt
(Karin, 1995; Shaulin, Karin, 2001). Wegen der großen Variabilität bei der Regulation intrazellulärer
Prozesse ist es nicht verwunderlich, dass viele Stimuli, unter anderem proinflammatorische Zytokine,
Wachstumsfaktoren, UV-Strahlung, Ischämie oder osmotischer Stress zu einer Aktivierung von AP-1
führen können. Die Fähigkeit vielfältige, zum Teil gegensätzliche, Vorgänge in der Zelle zu steuern,
hängt partiell mit der Größe der AP-1 Familie zusammen. Die aktive Form von AP-1 liegt immer als
Homo- oder Heterodimer vor, bestehend aus den Subfamilien Jun (c-Jun, JunB, JunD), Fos (c-Fos,
FosB, Fra-1 [Fos related antigen], Fra-2), JDP-1 und JDP-2 [Jun dimerization partner], ATF [activating transcription factors](ATF2, ATF3, B-ATF)/CREB [cAMP response element-binding protein]
oder Maf (v-Maf, c-Maf, Nrl) (Foletta et al.,1997; Mechta-Grigoriou et al.,2001; Shaulin und Karin,
2001). Die Mitglieder der AP-1 Familie unterscheiden sich in der Fähigkeit, als Transaktivatoren oder
Repressoren der Transkription zu wirken, wodurch verschiedenartige Effekte auf die Zellproliferation,
-funktion und -differenzierung erzielt werden. Allerdings können Fos Mitglieder im Gegensatz zu der
Jun Familie keine Homodimere bilden, sondern sind auf einen Jun-Partner angewiesen mit dem sie,
verbunden über einen Leucin-Zipper, AP-1 Komplexe bilden können (Landschulz et al.,1988). Der
c-fos/c-jun Komplex besitzt in der AP-1 Familie das stärkste Transaktivierungspotential.
Oft komplexiert AP-1 mit anderen Transkriptionfaktoren, zum Beispiel mit NFAT, NF-κB (p65)
(Macian et al.,2001) oder dem Glukokortikoidrezeptor, wodurch sich weitere Regulationsmöglichkeiten
ergeben (Foletta et al.,1997).
AP-1 Familienmitglieder werden über Signalkaskaden der MAP Kinasen [Mitogen aktivierte Protein
Kinasen] aktiviert, welche als Bindeglieder in der Weitergabe der Information vom aktivierten TCR
an den Nukleus fungieren (Dong et al., 2002). Die AP-1 Untereinheiten werden durch die MAP Kinasen ERK1/2 [extracellular-signal-regulated kinase], p38 Kinase oder JNK [c-jun NH2 -terminal kinase]
phosphoryliert und somit aktiviert. Diese werden wiederum durch eine doppelte Phosphorylierung von
MAP Kinase-Kinasen (MAPKK) aktiviert. Häufig dient zur Signalübertragung extrazellulärer Stimuli
der Ras/Raf Signaltransduktionsweg, welcher eine Aktivierung von ERK1/2, JNK und p38 initiiert.
Darüberhinaus können JNK und p38 noch von GTPasen der Rho-Familie, Rac-1, RhoA und Cdc42
aktiviert werden (Lopez-Ilasaca,1998). Die kleinen GTPasen Ras und die Rho-Familie funktionieren
nach Art eines molekularen Schalters: In GTP-gebundener Form sind sie aktiv, rekrutieren ihre Interaktionspartner und werden anschließend, durch die Hydrolyse zu GDP, inaktiviert (Janeway, Travers,
8
Abbildung 1.4: Signaltransduktion der MAP Kinasen AP-1 wird durch die MAP Kinasen
ERK1/2, p38 Kinase oder JNK phosphoryliert und somit aktiviert. Die MAP Kinasen werden wiederum durch eine doppelte Phosphorylierung von MAP Kinase-Kinasen (MKK/MEK) aktiviert. Häufig
dient zur Signalübertragung extrazellulärer Stimuli der Signaltransduktionsweg über die kleinen GProteine Ras und Rac (aus Produktkatalog Cell Signaling).
Walport, Shlomchik, 2001).
Abb.1.4 gibt einen Überblick über zelluläre Mechanismen, die zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors AP-1 führen.
1.2.3 NFAT
Die Familie des Transkriptionsfaktors NFAT besteht aus fünf Mitgliedern: NFAT1 (auch bekannt als
NFATp oder NFATc2), NFAT2 (NFATc oder NFATc1), NFAT3 (NFATc4), NFAT4 (NFATx oder
NFATc3) und NFAT5 (Macian et al., 2001).
Die Expression von NFAT1, 2 und 4 wurde vor allem in Zellen des Immunsystems nachgewiesen (Rao
et al.). In stimulierten Lymphozyten aktivieren sie die Transkription früher Genprodukte der Immunantwort; unterstützt wird diese Beobachtung durch die Identifizierung von NFAT-Bindungsstellen
in den Promoterregionen vieler Zytokine (Martinez-Martinez et al., 1997). So reguliert NFAT die
Transkription von IL-2 (Shaw et al.,1988), IL-4, IL-8, IL-13, IFNγ, TNFα, GM-CSF, den Membranrezeptoren FasL, CD40L (Kiani et al., 2000), CD5, CD25, CD69, Igκ (Macian et al., 2001) und
dem regulatorischem Enzym COX-2 (Rao et al., 1997; Munoz et al., 2004). Auch in anderen Gewe-
9
Abbildung 1.5: Die NFAT -Aktivierung Durch Aktivierung des TCR kommt es über IP3 zu einem
Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration. Es bildet sich ein Calcium/Calmodulin-Komplex,
der die Phosphatase Calcineurin aktiviert. Calcineurin dephosphoryliert das im Zytoplasma vorliegende hyperphosphorylierte NFAT. Dadurch wird die Translokation von NFAT in den Zellkern ermöglicht.
ben wurden Mitglieder der NFAT-Familie gefunden, NFAT3 zum Beispiel im Muskel, Hoden, Herz
und Hippocampus. Zudem ist die Beteiligung von NFAT an der Differenzierung von Chondrozyten,
Myozyten und Adipozyten bekannt (Kiani et al., 2004). NFAT5 nimmt eine Sonderstellung unter den
NFAT-Familienmitgliedern ein, da es die Genexpression bei osmotischem Stress reguliert (Macian et
al., 2001).
Die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFAT ist in T-Lymphoyzyten gut untersucht (Loh et
al., 1996): Nach Stimulation von TCR und CD28 wird das zuvor im Zytoplasma vorliegende hyperphosphorylierte NFAT von der Phosphatase Calcineurin dephosphoryliert, wodurch die Translokation
von NFAT in den Zellkern ermöglicht wird. Calcineurin (auch Protein Phosphatase 2B,(PP2B)) ist
eine Calcium- und Calmodulin abhängige Phosphatase. Folglich dient für die NFAT-Rekrutierung
überwiegend Calcium als second messenger. Neben der Translokation von NFAT in den Zellkern stabilisiert Calcineurin auch dessen nukleären Verbleib (Loh et al., 1996). Ein negativer Feedbackmechanismus findet über die inhibitorischen Proteine MCIP [modulatory calcineurin-interacting proteins] statt
10
(Abbasi et al., 2006). Sie inhibieren Calcineurin, so dass eine weitere NFAT Aktivierung unterbunden
wird. Calcineurin wiederum reguliert die Transkription der MCIP‘s (Yang et al., 2000). Abb.1.5 gibt
einen Überblick über die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFAT.
Die Calmodulinkinase II (CamKII) ist ein wichtiger Regulator des intrazellulären Calciumspiegels.
Sie wird durch einen Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration aktiviert, indem Calcium und
Calmodulin an die regulatorische Untereinheit binden. Es kommt zur Konformationsänderung einer
autoinhibitorischen Domäne und damit zur Autophosphorylierung. Im aktivierten Zustand steuert die
CamKII in einem Feedbackmechanismus den weiteren Calcium-Einstrom über spannungsabhängige
Ca2+ -Kanäle (Yao et al., 2006).
Ein Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration ist für die Induktion von NFAT und damit auch
für die IL-2 Produktion kritisch. Diese Erkenntnisse werden in der Transplantationsmedizin und zur
Behandlung von schweren Autoimmunerkrankungen therapeutisch genutzt. Cyclosporin (CsA) und
Tacrolimus (FK 506) werden als Calcineurin-Inhibitoren eingesetzt und verhindern die Transkription von Schlüsselgenen der Immunantwort. CsA bindet dabei an Prolin-Isomerasen, die Cyclophilline;
Tacrolimus an das FK-Bindeprotein (FKBP), Mitglied der Immunophilin-Familie. In diesen Komplexen binden die Substanzen an Calcineurin und inhibieren dessen Phosphatase-Aktivität (Vollmar,
Dingermann, 2005).
1.3 Immunsuppression durch heterozyklische Substanzen mit
Schwefelgruppe
Viele in der Medizin verwendete Arzneimittel weisen eine heterozyklische, schwefelhaltige Struktur auf.
Dazu gehören unter anderem Thiobarbiturate (Thiopental, Thiamylal) und Thionamide (Methimazol,
Carbimazol und Propylthiouracil), eine Teilgruppe der Thyreostatika. Thiopental steht seit langem
im Verdacht, immunsupprimierende Eigenschaften zu haben. Es wurde beobachtet, dass die Inzidenz
nosokomialer Infektionen bei Patienten mit Schädelhirntrauma mit langandauernder, hochdosierter
Thiopentaltherapie deutlich anstieg (Eberhardt et al.,1992). Die molekularbiologischen Mechanismen
der thiopentalinduzierten Immunsuppression sind heute bekannt (Loop et al., 2002; Humar et al.,
2004): Thiopental supprimiert die immunrelevanten Transkriptionsfaktoren NF-κB, NFAT und AP1. Im Gegensatz dazu weisen analoge Oxoderivate keine entsprechenden Effekte auf. Dies legt die
Vermutung nahe, dass die resultierende Immunsuppression in der heterozyklischen, schwefelhaltigen
Ringstruktur des Thiopentals begründet liegt. Eine vergleichbare Reaktivität der Thiobarbiturate und
der Thionamide ist wahrscheinlich.
11
1.4 Struktur, Pharmakologie und immunsuppressive Wirkung der
Thionamide
1.4.1 Struktur der Thionamide
Thionamide besitzen wie die Thiobarbiturate eine heterozyklische, schwefelhaltige, mononukleäre
Ringstruktur. Klinisch werden heute die Thionamide Propylthiouracil, Methimazol und Carbimazol verwendet. Ihr Charakteristikum ist die Verbindung von heterozyklischem Grundgerüst und
Thioharnstoffrest (Mutschler, 2001). Dabei dienen Barbitursäure, Thiazol, Uracil oder Schwefelderivate des Imidazols als heterozyklisches Grundgerüst. Diese Grundgerüste unterscheiden sich
noch weitergehend. Methimazol und Carbimazol sind Derivate des Mercaptoimidazols. Methimazol
besteht aus einem fünfgliedrigen, aromatischen Gerüst mit substituierter Schwefelgruppe. Aufgrund
der aromatischen Struktur ist die biologische Aktivität der Schwefelgruppe von Methimazol als
gering einzustufen. Carbimazol besteht auch aus einem fünfgliedrigen, heterozyklischen Gerüst mit
Schwefelgruppe, weist aber im Gegensatz zu Methimazol keine aromatische Struktur auf, sondern als
Substituent eine Estergruppe. Durch die Veresterung ist die Reaktivität der Schwefelgruppe als hoch
anzusehen. Im Gegensatz dazu besteht Propylthiouracil aus einer stabileren hexameren Ringstruktur,
die sich vom Thiouracil ableitet und eine große Ähnlichkeit mit den Thiobarbituraten aufweist. Die
Reaktivität der Schwefelgruppe ist im Vergleich zu Carbimazol schwächer ausgeprägt.
Zwischen den Thiobarbituraten und den Thionamiden besteht eine Strukturanalogie. Um diese zu
zeigen, sind die Strukturformeln in Abb.1.6 abgebildet. Die Strukturanalogie wird durch Beobachtungen im Tierversuch verdeutlicht, in dem für Thiopental eine thyreostatische Wirkung gezeigt werden
konnte (Goodman, Gilman, 1998).
1.4.2 Pharmakologie der Thionamide
Thionamide werden zur Behandlung verschiedener Formen der Hyperthyreose eingesetzt. Zwei Wirkmechanismen sind bekannt: Sie hemmen über einen kompetitiven Mechanismus die Synthese der
Schilddrüsenhormone T3 und T4 , indem der Inkorporationsprozess des Jodids in die Tyrosylreste
des Thyreoglobulins unterbunden wird (Goodman, Gilman, 1998). Dabei dient das Thionamid der
jodierten Peroxidase als alternatives Substrat, so dass die Schwefelgruppe des Thionamid anstelle der
Tyrosinreste des Thyreoglobulins jodiert wird. Folglich wird der Thyroxinsynthese das Jodid entzogen
12
Abbildung 1.6: Strukturformeln der Thionamide und der Thiobarbiturate
(Cooper, 2005). Desweiteren hemmen Thionamide auch die Kopplungsreaktion der Jodtyrosine zu T3
und T4 (Taurog, 1991). Die resultierende Senkung der T3 - und T4 -Spiegel zeigt besonders bei der
Behandlung der Autoimmunkrankheit Morbus Basedow günstige Wirkungen und führt bei 40-50%
der Patienten zu einer Remission (Cooper, 2005; Wiersinga, 1996).
Zur Behandlung des Morbus Basedow werden als Anfangsdosen 60 mg/d Carbimazol (entspricht 12
µg/ml), 40 mg/d Methimazol (entspricht 8 µg/ml) oder 400mg/d Propylthiouracil (entspricht 80
µg/ml) verwendet. Die in dieser Arbeit verwendeten Konzentrationen überschreiten, bei einmaliger
Gabe, die erreichte Blutkonzentration der Standarddosierung um das 5 bis 10 fache (Karow, LangRoth, 2006). Allerdings ist zu beachten, dass es bei längerer Therapiedauer zu einer Akkumulation der
Wirkstoffe in der Schilddrüse kommt (Goodman, Gilman 1998). Für die Behandlung der autoimmunen
Hyperthyreose ist eine Behandlungsdauer von 12 bis 16 Monaten indiziert, um das Rezidivrisiko wirksam zu senken (Cooper, 2005). Die Halbwertszeiten betragen von Propylthiouracil 1,5-2 Stunden, von
Carbimazol und Methimazol 6-13 Stunden. Durch die Anreicherung der Substanzen in der Schilddrüse
wird eine Wirkdauer von 36-72 Stunden erreicht. Die Ausscheidung aller drei Substanzen erfolgt nach
S-Oxidation und Glucuronidierung biliär und renal.
13
1.4.3 Immunsuppressive Wirkung der Thionamide
Mehrere Hinweise deuten auf eine immunsuppressive Wirkung von Thionamiden. Die Thionamidbehandlung von Patienten mit Morbus Basedow führt neben der Senkung des T3 - und T4 -Spiegels auch
zu einer Abnahme der Konzentration der, für die Erkrankung verantwortlich gemachten, zirkulierenden
Antikörper gegen den TSH-Rezeptor (TRAK) (Goodman, Gilman, 1998). Zusätzlich werden zentrale immunologische Oberflächenmoleküle wie z.B. ICAM 1 (intracellular adhesion molecule 1), CD69,
der IL-2- und IL-6-Rezeptor sowie MHC II bei Thionamid behandelten Patienten vermindert exprimiert (Kim et al., 2001, Corrales et al., 1997, Cooper, 2005). Dies kann zu einer Einschränkung der
Adhäsionsfähigkeit und der Proliferation, sowie einer ungenügenden Antigenpräsentation der Immunzellen führen. Zudem ist bei diesen Patienten die Anzahl zirkulierender T-Helfer-Zellen und Natürlicher
Killerzellen erniedrigt (Cooper, 2005). Diese immunologischen Phänomene spiegeln sich in einer sehr
gefürchteten unerwünschten Arzneimittelwirkung der Thionamide wider: Unter Thionamidtherapie
kann es in 0,37% der Fälle zu einer Agranulozytose oder einer aplastischer Anämie kommen (Bircher,
Sommer, 1999; Bandyopadhyay et al., 2002).
Besonders kontrovers wird der Wirkmechanismus der Thionamide bei Behandlung der Autoimmunhyperthyreose diskutiert. Schon früh wurden immunsuppressive Eigenschaften bei Thionamidapplikation, wie eine Senkung der zirkulierenden TSH-Rezeptor-Autoantikörper und eine Reduktion der
Lymphozyteninfiltration der Schilddrüse (Corrales et al., 1997), beschrieben. Von Volpe et al. wurde die Immunsuppression als indirekt, über eine Reduktion der Hyperthyreose vermittelt, begründet
(Volpe, 1994). Doch viele Autoren vermuten eine direkte immunmodulatorische Wirkung, wurden
doch weniger lösliche IL-2-Rezeptoren, verminderte IgM und IgG-Titer sowie ein reduzierter Anteil
von CD4+ - und CD8+ - Zellen an der Gesamtlymphozytenpopulation gefunden (Wilson et al., 1988;
Weetman, 2004; Cooper, 2005). Von Weetman wird sogar vermutet, dass eine Heilung oder Besserung
der Autoimmunkrankheit Morbus Basedow durch immunsuppressive Wirkung der Thionamide und
nicht durch eine Reduktion der Thyroxinsynthese erreicht wird (Weetman, 1994). Mit den Ergebnissen dieser Arbeit, in der molekulare Angriffspunkte der Thionamid vermittelten Immunsuppression
untersucht werden sollen, könnte die Hypothese von Weetman unterstützt werden.
1.5 Fragestellung
Hervorgehend aus den Voruntersuchungen zu molekularen Mechanismen einer Thiopental induzierten
Immunsuppression von Humar et al. und Loop et al., soll in dieser Arbeit geklärt werden, ob sich bei
der Verwendung der strukturanalogen Thionamide ebenfalls direkte immunsuppressive Effekte zeigen,
die sich in Form einer biologischen Funktionalitätsminderung von T-Zellen, z.B. in einer reduzierten
Zytokinsynthese, widerspiegeln. Bisher sind in der Literatur immunsuppressive Wirkungen der
Thionamide zwar beschrieben, aber der Inhibitionsmechanismus wurde überwiegend als indirekt,
über thyreoidale Zellen vermittelt, gedeutet.
Im ersten Teil der Arbeit soll mittels Reportergenexperimenten und DNA-Bindungsassays untersucht werden, ob Thionamide die Transkriptionsfaktoren NF-κB,
AP-1 und NFAT hemmen.
Eine Inhibition dieser drei für das Immunsystem absolut essentiellen Faktoren würde eine direkte
Immunsuppression durch Thionamide nahelegen.
Im zweiten Teil der Arbeit soll der molekulare Wirkmechanismus der Immunsuppression innerhalb der T-Zell-Signaltransduktionskaskade identifiziert werden. Vergleiche mit Hemmmechanismen
der strukturanalogen Thiobarbiturate sollen mit einbezogen werden.
Bei vergleichbaren Angriffspunkten der Thionamide und der Thiobarbiturate in der T-ZellSignalkaskade ist ein allgemeingültiges Prinzip der Wirkung heterozyklischer Thioverbindungen
auf das Immunssystem wahrscheinlich. Mit dem Wissen über die molekularen Angriffspunkte einer
durch Thionamide vermittelten Immunsuppression könnten Konsequenzen für die Herstellung und
Verwendung heterozyklischer, schwefelhaltiger Substanzen als Therapeutika für eine gewünschte
und gesteuerte Immunsuppression, z.B. im Rahmen der Transplantationsmedizin gezogen werden.
Andererseits könnten schon bei der Therapeutikaentwicklung von heterozyklischen Schwefelderivaten
unerwünschte Arzneimittelwirkungen umgangen werden, indem die Reaktivität der Schwefelgruppe
gezielt modifiziert wird.
2 Material und Methodik
2.1 Isolation und Kultur primärer, humaner CD3-positiver Zellen
Die Isolation humaner CD3-positiver Zellen erfolgte aus einem mit Leuko- und Lymphozyten angereichertem Vollblut-Präparat (Buffy Coat), welches von der Klinik für Transfusionsmedizin des Universitätsklinikums Freiburg, Abteilung Fraktionierung, bereitgestellt wurde. Jeweils 12 ml Vollblut
R
wurden über 15 ml Ficoll-Hypaque
geschichtet, und anschließend für 45 Minuten bei 1800 U/min
ohne Bremse zentrifugiert. Nach der Dichtezentrifugation wurden die peripheren mononukleären Blutzellen (PMBZ) aus der Interphase mit einer sterilen Pipette abgesaugt. Die Anzahl mononukleärer Zellen konnte anhand einer Neubauer Zählkammer bestimmt werden. Die mononukleären Zellen wurden
R
mit CliniMACS
, dem 0,5% humanes Serumalbumin zugesetzt war, gewaschen und mit Antikörpern
gegen das CD3 Oberflächenantigen (CD3 Microbeads) für 30 Minuten inkubiert. Diese Antikörper
sind an Eisen-”Beads” gekoppelt, so dass die markierten CD3-positiven Zellen durch ein magnetisches
Feld von den restlichen mononukleären Zellen abgetrennt und isoliert werden können. Pro 107 Zellen
wurden 20µl Microbeads verwendet. Nicht gebundene Antikörper wurden durch einen Waschschritt
entfernt. Die CD3-positiven Zellen wurden mit CS+ Säulen (Miltenyi, AutoMACS Cell Sorter) laut
Herstellerangaben isoliert. Die Vitalität und Anzahl der Zellen wurde mittels Trypanblaufärbung bestimmt.
Isolierte CD3-positive Zellen wurden in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), dem 50µM βMercaptoethanol und 2 mM Glutamin zugesetzt worden war, bei 37◦ C und 5 % CO2 im Brutschrank
kultiviert.
Material:
R
NH4 -Heparin S-Monovette
R
Ficoll-Hypaque
R
Sarstedt
, Nümbrecht
Heraeus Megafuge 1.0
R
CliniMACS
Heraeus-Instruments, Hanau
Amersham-Pharmacia, Freiburg
Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach
16
Humanes Serumalbumin
Baxter, Unterschleiheim
Neubauer Zählkammer
Brand, Deutschland
CD3 Microbeads
Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach
AutoMACS
Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach
Trypanblaufärbung
0,4% Trypanblau
Falcon Blue Cap
Becton Dickinson, Heidelberg
Dulbeccos Mod Eagle Medium
R
AIM-V
Medium
GibcoT M , Karlsruhe
GibcoT M , Karlsruhe
2.2 Behandlung mit Thionamiden und Aktivierung CD3-positiver Zellen
Nachdem die CD3-positiven Zellen für 16 Stunden ohne Serum kultiviert worden waren, erfolgte die
Zugabe der Thionamide Propylthiouracil, Methimazol und Carbimazol. Methimazol wurde in ddH2 O,
alle anderen Thyreostatika in DMSO gelöst und anschließend dem Medium der CD3-positiven Zellen
so beigegeben, dass Endkonzentrationen von 0,1 bis 5 mM resultierten. Eine Stunde vor Aktivierung
wurde für die Immundetektion von Phospho-IκBα der Proteasom Inhibitor MG132 (10 µM), für die
Detektion von IκBα 5µg/ml Actinomycin D zugegeben.
Nach einer vierstündigen Inkubationsdauer mit Thionamiden wurden die CD3-positiven Zellen entweR
der mit CD3/CD28 Dynabeads
oder Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA, 15 ng/ml) und Ionomycin (1,5 µg/ml) aktiviert.
Material:
Propylthiouracil
Sigma, Steinheim
Methimazol
Sigma, Steinheim
Carbimazol
LKT Laboratories, Inc., USA
MG-132
Calbiochem, La Jolla, CA
Actinomycin D
Sigma, Steinheim
R
CD3/CD28 Dynabeads
Dynal, Hamburg
Ionomycin
Sigma, Steinheim
PMA
Phorbol 12-Myristat 13-Acetat, Sigma,
DMSO (Dimethylsulfoxid)
Deisenhofen
Roth, Karlsruhe
17
2.3 Durchflusszytometrie (FACS)
Die Analyse der CD69-Expression wurde mittels Durchflusszytometrie durchgeführt. Reaktionsansätze
zu jeweils 50 µl Vollblut wurden für eine Stunde mit Thionamiden vorinkubiert, und anschließend
R
mit 106 CD3/CD28 Dynabeads
aktiviert. Nach 24 Stunden wurde der Ansatz mit 8 µl des Fast
ImmuneT M CD4/CD69/CD3 Antikörpers für 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Erythrozytenlyse erfolgte in 450 µl FACS Lysierungs Lösung, gefolgt von einem fünfminütigen Zentrifugationsschritt bei 2800 U/min. Anschließend wurden die CD3-positiven Zellen in 300 µl Fixierungslösung
für die FACS (Fluorescent Activated Cell Sorting) Analyse fixiert. Die CD3-positive Population wurde
durch FSC (Forward Scatter) und einer CD3-PerCP-Färbung eingegrenzt und weiter auf CD4 durch
PE (Phycoerythrin) und CD69 durch FITC (Fluorescein) analysiert.
Material:
Fast Immune Cytokine System
Fast
ImmuneT M
CD4/CD69/CD3 An-
BD Biosciences, Heidelberg
Becton Dickinson, San Jose, Ca
tikörper
FACST M Lysing Solution
Becton Dickinson, San Jose, Ca
CellFIXT M
Becton Dickinson, San Jose, Ca
2.4 Enzyme linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Nach einer vierstündigen Vorinkubation von 1,5x106 CD3-positiven Zellen mit Thionamiden, wurden
R
diese für 16 Stunden mit 106 CD3/CD28 Dynabeads
aktiviert. Anschließend wurden die Zellen
geerntet und bei 2900 U/min für fünf Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde zur quantitatiR
ven IL-2, IFN-γ oder TNFα Analyse abgenommen und mittels dem Quantikine
ELISA gemäß des
Herstellerprotokolls analysiert.
Material:
R
Quantikine
IL-2 ELISA
R
and
D
Systems,
Wiesbaden-
D
Systems,
Wiesbaden-
D
Systems,
Wiesbaden-
Nordenstadt
R
Quantikine
IFN-γ ELISA
R
and
Nordenstadt
R
Quantikine
TNFα ELISA
R
and
Nordenstadt
18
2.5 Luciferase Reportergen Assay
Der Luciferase Reportergen Assay wurde mit der T-Zell Leukämie Zell-Linie, Jurkat, durchgeführt.
1,5x106 Jurkat-Zellen wurden in 1,5 ml RPMI 1640 Medium, dem 10% fetales Rinderserum und 2 mM
Glutamin zugesetzt worden war, bei 37◦ C und einer fünfprozentigen CO2 -Konzentration kultiviert.
Die Zellen wurden dann mit pAP-1 (PMA)-TA-Luc oder p NF-κB-TA-Luc Reportergenkonstrukt
transient transfiziert. Für die Messung der NFAT abhängigen Luciferase Expression wurden stabil
transfizierte Jurkat-Zellen (C4-NFAT) verwendet.
Für die Transfektionslösung wurden pro Transfektionsansatz 150 µl Medium mit 9 µl Lipofectamin,
in einem zweiten 150 µl Medium mit 3 µg Reportergenplasmid, welches das Reportergen enthielt,
versetzt. Nach zwanzigminütiger Inkubation wurde die Transfektionslösung tropfenweise auf die Zellen
gegeben und für 4 Stunden inkubiert. Die Zellen mehrerer Transfektionsansätze wurden gepoolt und
anschließend in einer Zelldichte von 106 Zellen pro well neu ausplatiert. Diese Zellen wurden für 2
Stunden mit Thionamiden vorinkubiert, bevor die Reportergenexpression mit PMA (15 ng/ml) und
Ionomycin (1,5 µg/ml) für weitere 13 Stunden induziert wurde (Geamtversuchsdauer 15 h). Die Zelllyse
erfolgte mit 100 µl Lysierungspuffer.
Die Expression des Luciferase Reportergens wurde anhand des enzymatischen Luminolumsatz im
Luminometer quantifiziert. Die Extinktionsraten wurden anhand des Proteingehalts normalisiert.
Material:
p NF-κB-Luc
BD Bioscience, Heidelberg
C4-NFAT
zur Verfügung gestellt von Prof. Baldari,
Italien
pAP-1-TA-Luc
Lipofectamin 2000
BD Bioscience, Heidelberg
Invitrogen, UK
Lysierungspuffer
Promega, Madison, WI
Luciferase Assay Substrat
Promega, Madison, WI
Microluminat Plus LB96P
Berthold Tchnologies, Bad Wilbach
Protein Assay
Bio-Rad Laboratories, München
2.6 Herstellung nukleärer Proteinextrakte
Nukleäre Proteinextrakte wurden nach der Extraktionsmethode, beschrieben von Schreiber (Schreiber
et al., 1989), gewonnen. Das Zellpellet wurde in 400 µl Puffer A resuspendiert und für 15 Minuten
19
auf Eis inkubiert. Der Zugabe von 25 µl NP40 folgte eine Homogenisierung durch Vortexen für 30
Sekunden und anschließend ein Zentrifugationsschritt von fünf Minuten bei 13.000 U/min. Nachdem
der Überstand abgegossen worden war, wurde das Pellet für 15 Minuten bei Raumtemperatur getrocknet. Zur Lyse der Kernmembran wurde das Pellet mit 50µl Puffer C versetzt und für 15 Minuten bei
4◦ C und 1800 U/min (Vortexrotationsaufsatz) geschüttelt, anschließend 10 Minuten bei 13.000 U/min
zentrifugiert. Die quantitative Proteinbestimmung aus dem Überstand (nukleärer Extrakt) erfolgte
nach Bradford.
Material:
Puffer A
10 mM Hepes, pH 7,9
10 mM KCl; 0,1 mM EDTA
0,1 mM EGTA
Puffer C
20 mM Hepes, pH 7,9
0,4 mM NaCl; 1 mM EDTA
1 mM EGTA
Aprotinin
Sigma, Steinheim
Leupeptin
Sigma, Steinheim (50mg/ml in ddH2 O)
Natriumfluorid
Sigma, Steinheim (1 M in ddH2 O)
Phenylmethylsulfonylfluorid
Sigma, Steinheim (100 mM in Isopropanol)
Natrium Pyrophosphat
Sigma, Steinheim (100 mM in ddH2 O)
Decahydrat
1,4-Dithithreitol
Roth, Karlsruhe
Phosphatase Inhibitor I
Sigma, Steinheim
Phosphatase Inhibitor II
Calbiochem, La Jolla, Ca
Nonidet P 40
Protein Assay
Roche, Mannheim
Bio-Rad Laboratories, München
2.7 Elektrophoretic Mobility Shift Assay(EMSA)
Für EMSA-Analysen wurden jeweils 1,5x106 CD3-positive Zellen verwendet. Die CD3-positiven Zellen wurden für 4 Stunden mit Thionamiden inkubiert und anschließend für 2 Stunden mit 107
20
R
CD3/CD28 Dynabeads
pro Ansatz aktiviert. Für das Labeling der Sonden wurden 50 µl Ansätze
pipettiert, bestehend aus 25 ng (1µl) unmarkiertem Oligonukleotid, 37µl ddH2 O, 5µl T4-PNK Puffer,
5µl [γ-32 P]-dATP und 2µl T4-Polynukleotid Kinase.
Das Reaktionsgemisch wurde 60 Minuten bei 37◦ C inkubiert. Zur Abtrennung von nicht inkorporierten Nukleotiden wurde der Reaktionsansatz auf eine Amersham G-25 Säule aufgetragen und bei
3000U/Min 3 Minuten zentrifugiert. Das Eluat enthielt die markierten Oligonukleotide, welche bei 4
◦C
gelagert wurden. Das Reaktionsvolumen für den EMSA betrug 20µl und beinhaltete 4-20µg Kern-
extrakt, 2µl 10xBindepuffer, 2µl Poly-dIdC, 1µl markierte DNA Sonde und 11µl ddH2 O. Die Ansätze
wurden für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, und anschließend mit 0,5xTBE Laufpuffer
versetzt. Die Auftrennung der Proteine erfolgte in einem 4,5% Polyacrylamid-Gel. Die Elektrophorese
wurde für zwei Stunden bei 200 V und 21 mA durchgeführt. Danach wurde das Gel auf ein 18cmx24cm
großes GB002 Papier abgelöst, die Gelseite mit Saran Folie bedeckt und im Vakuum-Geltrockner bei
80◦ C für ca. 30 Minuten getrocknet. Die Belichtung in einer Fuji-Film Kassette mit Kodak BioMax
Film dauerte 4-16 Stunden bei -80 ◦ C. Die Entwicklung und Fixierung des Films erfolgte im Agfa
Curix60.
Material:
[γ−32 ]-dATP
Amersham Biosciences, Schweden
3000 Ci/mmol
NF-κB Oligonukleotid
5’AGT TGA GGG GAC TTT CCC
AGG C; (Promega Mannheim)
NFAT Oligonukleotid
5’-TTT CTC ATG GAA AGA TGA
CAT A
AP-1
Oligonukleotid
5’-CGC TTG ATG AGT CAG CCG
GAA (Promega Mannheim)
T4 Kinase Puffer
NE Biolabs Inc., Beverly, USA
T4 Polynukleotid Kinase
NE Biolabs Inc., Beverly, USA
G-25 Microspin column
Amersham Biosciences, England
Heraeus Biofuge
Heraeus-Instruments, Hanau
4,5% Polaacrylamid-Gel
11,25 ml 30% Rotiphorese;
7 ml 5xTBE-Puffer; 55,25 ml ddH2 O;
400µl 10% APS; 40 µl TEMED
Rotiphorese
Roth, Karlsruhe
21
TBE-Puffer Laufpuffer
54g TRIS; 27,5g Borsäure;
20 ml 0,5M EDTA; 1l ddH2 O
Ammoniumperoxidsulfat (APS)
Merck, Darmstadt
N,N,N,N-Tetramethyl-
Roth, Karlsruhe
ethylendiamin (TEMED)
Bindepuffer
20 mM Tris/HCl; 10 mM MgCl2 ; 50 mM
Poly-dIdC
NaCl; 1 mM DTT
Roche Diagnostics, Penzberg
Marker
0,4% Bromphenolblau (Roth, Karlsruhe)
50% Glycerol (Sigma, Steinheim)
Vakuum Trockner
BioRad, München
Kodak BioMax Film
Kodak-Industrie, Frankreich
2.8 TransAM
Für die ELISA basierende DNA-Bindungsanalyse von AP-1 und NF-κB wurden nukleäre Extrakte
von 2x107 CD3-positiven Zellen verwendet, die für 4 Stunden mit Thionamiden inkubiert und anR
schließend für 30 Minuten mit 107 CD3/CD28 Dynabeads
pro Ansatz aktiviert wurden. Mit der
TransAM Methode wurde die Bindung von Transkriptionsfaktoren im 96-well Format quantifiziert.
Die Durchführung des Experiments erfolgte laut Herstellerangaben. Oligonukleotide mit einer Konsensussequenz für AP-1 oder NF-κB sind auf eine 96-well Flachbodenplatten gecoated. 2 µg nukleäres
Extrakt wurde pro Reaktionsansatz verwendet. Oligonukleotid-Transkriptionsfaktor-Komplexe wurden mittels Antikörper, die gegen die entsprechenden Untereinheiten der Transkriptionsfaktoren AP-1
oder NF-κB gerichtet waren, anhand eines peroxidasemarkierten Zweitantikörpers erkannt und im
Photospectrometer quantifiziert.
Material:
TransAM NF-κB Family Kit
Active Motif
TransAM AP-1 Family Kit
Active Motif
22
2.9 Immundetektion durch Western Blotting
Zur Western Blot Analyse wurden jeweils 1,5x106 CD3-positive Zellen verwendet und für 4 Stunden
mit Thionamiden inkubiert. Je nach zu detektierendem Protein wurden die Ansätze anschließend wie
folgt aktiviert:
Phospho-IκBα
IκBα
p38
R
20 Minuten mit CD3/CD28 Dynabeads
R
10 Minuten mit CD3/CD28 Dynabeads
R
10 Minuten mit CD3/CD28 Dynabeads
JNK Kinase Aktivität
R
10 Minuten mit CD3/CD28 Dynabeads
R
10 Minuten mit CD3/CD28 Dynabeads
Phospho-CaMKII
10 Minuten mit 1µg/ml Ionomycin
CaMKII
10 Minuten mit 1µg/ml Ionomycin
Calmodulin
10 Minuten mit 1µg/ml Ionomycin
NFATc2
10 Minuten mit 1µg/ml Ionomycin
TATA-BP
10 Minuten mit 1µg/ml Ionomycin
α/β Calcineurin
10 Minuten mit 1µg/ml Ionomycin
p42/44
Durch Zugabe von 35µl 5xSDS Probenpuffer und einer wiederholten Ultraschallbehandlung (5 Impulse, 15%) wurden die Proben aufgeschlossen, für fünf Minuten auf 95◦ C erwärmt und mittels einer
Pro-Rad Protean III Elektrophoresekammer in einem SDS-Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt. Das Molekulargewicht der aufgetrennten Proteine ließ sich anhand eines parallel aufgetragenen
SDS-PAGE Protein-Markers abschätzen. Zur Vorbereitung des Western Blots wurde die Membran für
zehn Minuten in Methanol, danach für 15 Minuten in ddH2 O äquilibriert. Zugleich wurden sechs
Whatmanpaper in AnodenpufferI, drei Whatmanpaper in AnodenpufferII und neun Whatmanpaper
in Kathodenpuffer getränkt. Der Elektrotransfer erfolgt bei 125 mA. Nach dem Transfer wurde die
Membran zum Abblocken unspezifischer Bindungsstellen in einer 5% milchpulverhaltigen (Detektion
auf Phospho-IκBα, IκBα) bzw. 0,1% caseinhaltigen Lösung (I-BlockT M ) (Detektion auf PhosphoCamKII, Calmodulin, Calcineurin NFAT und MAP-Kinasen) für eine Stunde bei Raumtemperatur
auf der Rotationsschaukel inkubiert und anschließend dreimal mit TBST gewaschen. Die Inkubation
mit dem Erstantikörper erfolgte über Nacht bei 4◦ C. Die Antikörper wurden gemäß den Angaben
des Herstellers eingesetzt. Nicht gebundener Erstantikörper wurde durch dreimaliges Waschen mit
TBST entfernt, bevor der peroxidase-markierte Zweitantikörper (1:2000 in Blockierlösung) für eine
Stunde bei Raumtemperatur auf die Membran gegeben wurde. Nach weiterem extensiven Waschen
23
R
mit TBST wurden die Immunkomplexe mittels einer Peroxidasereaktion (LumiGLO
) detektiert. Die
Filme wurden je nach Signalstärke zwischen einer und zehn Minuten belichtet.
Um eine gleichmässige Gesamt-Proteinbeladung nachzuweisen, folgte dem Western Blot eine Normalisierung gegen das jeweilige Grundprotein bzw. gegen β-Aktin oder das TATA Bindungsprotein. Die
Membran wurde hierfür 30 Minuten bei 50◦ C mit einer Stripping-Lösung inkubiert, anschließend intensiv mit TBST gewaschen, um dann erneut blockiert und mit Erst- und Zweitantikörper behandelt
zu werden.
Material:
5xSDS Probenpuffer (Laemmli)
1 M TRIS (pH 6,8); 1% SDS; 1,5% DTT;
0,1%
Bromphenolblau; 50% Glycerol
Phosphatase Inhibitor I
Sigma, Steinheim
Phosphatase Inhibitor II
Calbiochem, La Jolla, USA
Ultraschallgerät Sonorex RK 52
Bandelin
Ultraschallgerät Sonopuls Hp 2070
Bandelin
Sammelgel
0,65ml
30%
Acrylamid/0,8%
Bisa-
crylamid (Rotiphorese);
1,25 ml 4x TRISCl/SDS (pH6,8);
3,05 ml ddH2 O; 25 µl 10% Ammoniumpersulfat; 5 µl TEMED
10% SDS Trenngel
5ml 30% Acrylamid/0,8% Bisacrylamid
(Rotiphorese);
3,75 ml 4xTRISCl/SDS (pH8,8);
7,5 ml ddH2 O; 0,05 ml 10% APS; 0,01 ml
TEMED
Rotiphorese
Roth, Karlsruhe
Sodium Dodecyl Sulfat
Roth, Karlsruhe
= Natriumlaurylsulfat (SDS)
Ammoniumperoxidsulfat (APS)
Merck, Darmstadt
N,N,N,N-Tetramethyl-
Roth, Karlsruhe
ethylendiamin (TEMED)
Prestained SDS-PAGE
Standards (low range)
Bio-Rad, München
24
Elektrophoresekammer, III
Bio-Rad, München
5x SDS Laufpuffer
125 mM TRIS; 1 M Glycin; 0,5% SDS
Methanol
Merck, Darmstadt
Membran
ImmobilonT M
Kathodenpuffer (pH 9,4)
Millipore Corporation, Bedford, MA, USA
25
mM
TRIS;
40
mM
6-
Aminocapronsäure;
Anodenpuffer I (pH 10,4)
10% Methanol
300 mM TRIS; 10% Methanol
Anodenpuffer II (pH 10,4)
25 mM TRIS; 10% Methanol
Blotting Aparatur
LTF-Labortechnik,Waerburg
I-BlockT M
Tropix, Bedford, MA, USA
Magermilchpulver
Fluka Chemie, Buchs, CH
TBST
20 mM TRIS; 150 mM NaCl; 0,1% Tween
20
TBS
20 mM TRIS; 150 mM NaCl
Anti-humaner
Cell Signaling, Beverly, MA, USA
Phospho-IκBα (Ser32)
Antikörper
Anti-humaner
Cell Signaling, Beverly, MA, USA
IκBα
Antikörper
Anti-humaner-NF-AT-c2
Becton Dickinson, San Jose, Ca
Antikörper Clone 4G6-G5
Anti-humaner-Calcineurin
Becton Dickinson, San Jose, Ca
Antikörper
Anti-humaner-Calmodulin
Upstate, USA
Antikörper
Anti-humaner Phospho-CaMKII
New England Biolabs, USA
(Thr286) Antikörper
Anti-humaner CaMKII
New England Biolabs, USA
Antikörper
Anti-humaner p38(Thr180/Tyr182)
Antikörper
Cell Signaling, Beverly, MA, USA
Anti-humaner Phospho p44/42
Cell Signaling, Beverly, MA, USA
(Thr202/Tyr204) Antikörper
TATA binding protein TBP18
Abcam, Cambridge, UK
25
Peroxidase markierter
Cell Signaling, Beverly, MA, USA
Anti-Rabbit-IgG Antikörper
Peroxidase markierter
Amersham Pharmacia, Freiburg
Anti- Mouse IgG Antikörper
Anti-humaner
Santa Cruz Biotechnology
Actin(I-19) Antikörper
Peroxidase markierter
Anti- Goat IgG Antikörper
R
LumiGLO
Santa Cruz Biotechnology
Cell Signaling, Beverly, MA, USA
ECL Plus
Amersham Biosciences, UK
HyperfilmT M
ECL
Stripping Lösung
Amersham Biosciences, UK
100 mM 2-Mercaptoethanol; 2% SDS;
62,5 mM TRIS (pH 6,7)
2.10 JNK Kinase Aktivitätsimmunoassay
Die Aktivität der JNK-Kinase wurde mittels eines JNK Activity Immunoassay Kit bestimmt. Nach
R
Inkubation mit Thionamiden und zehnminütiger Aktivierung mit CD3/CD28 Dynabeads
wurden
107 CD3-positive Zellen in 200 µl Extraktionspuffer lysiert. Nach einer fünfminütigen Zentrifugation
bei 2700 U/min wurde der Überstand mit 2 µl eines polyklonalen JNK-Antiköpers für 5 h bei 4◦ C
inkubiert bevor 50 µl Proteinsepharose A zugegeben wurde. Nach einer Stunde wurden die Reaktionsansätze zweimal mit 0,5 ml Extraktionspuffer und einmal mit 0,5 ml Kinase Assay Puffer gewaschen.
Die Kinase-Reaktion erfolgte bei 30◦ C und enthielt immunpräzipitierte JNK-Antikörper-Beads, 50 µl
Kinase Assay Puffer, 2 µg c-jun Protein und 1 nM ATP. Nach 25 Minuten wurde die Kinase-Reaktion
mit 30µl SDS-Probenpuffer gestoppt. Die Analyse der JNK-Kinase Aktivität erfolgte anhand des
Nachweises der c-Jun Phosphorylierung im Western Blot Experiment.
Material:
JNK Activity Immunoassay Kit
Calbiochem, Schwalbach, Germany
Extraktionspuffer
20mM Tris, pH 7,5; 135mM NaCl;
25mM C3 H7 O6 P2 Na;
2mM EDTA; 2mM NaPO3 O7
2mM 1,4-ditiotreitol; 1mM Na3 VO4 ;
10% Glycerol; 1% Triton X-100;
1,5µg/ml Aprotinin
Kinase Assay Puffer
25mM Tris, pH 7,5; 5mM C3 H7 O6 P2 Na
12mM MgCl 2; 2mM 1,4-dithiotreitol
100µM Na 3VO 4
2.11 Detektion der Zytotoxizität
Zur Bestimmung der zytotoxischen Wirkung der Thionamide wurde die Laktatdehydrogenase Aktivität im Zellüberstand quantifiziert. 2x106 CD3-positive Zellen wurden mit 0,1-5 mM der Thionamide
für 4 Stunden im Inkubator bei 37◦ C inkubiert. Im Anschluss wurde die LDH-Aktivität im Überstand
mit Hilfe des Cytotoxicity Detection Kits (Roche) gemessen. Die Analyse erfolgte laut des Herstellerprotokolls. Als Positivkontrolle diente ein Ansatz mit totaler Membranolyse durch die Zugabe von
20% Tween.
Material:
Cytotoxicity Detection Kit
Roche Diagnostik GmbH, Mannheim
SPECTRAmax PLUS384
Molecular Devices, München
Photometer
2.12 Statistik
Die statistische Analyse wurde in einer “One Way Analysis of Variance”, gefolgt von einem multiplen
Vergleich mit Hilfe der “Student-Newman-Keuls” Methode, durchgeführt. Die Ergebnisse wurden als
signifikant angenommen, wenn p<0,001 war. Alle statistischen Berechnungen wurden mit dem Software
Paket “SigmaStat” (Jandel Scientific, San Rafael, CA, USA) durchgeführt.
3 Ergebnisse
3.1 Heterozyklische Thionamide hemmen humane T-Lymphozyten
Um die Auswirkung von heterozyklischen, schwefelhaltigen Substanzen auf die funktionelle Immunantwort zu untersuchen, wurden primäre humane T-Zellen mit den klinisch häufig verwendeten Thionamide Propylthiouracil, Carbimazol und Methimazol inkubiert.
3.1.1 Carbimazol und Propylthiouracil inhibieren die Expression des
T-Zell-Aktivierungsmarkers CD69
Die CD69-Expression auf T-Zellen wurde in Vollblut mittels Durchflusszytometrie analysiert. Nach
einstündiger Inkubation mit Thionamiden wurden die T-Zellen durch Crosslinking der CD3 und der
R
CD28 Oberflächenrezeptoren mittels anti-CD3 und anti-CD28 Antikörper behafteten Dynabeads
aktiviert. Propylthiouracil unterdrückte bei einer Konzentration von 5mM die CD69-Expression fast
vollständig (Abb. 3.1). Von den in äquimolaren Konzentrationen eingesetzten Mercaptoimidazolderivaten Carbimazol und Methimazol führte Carbimazol zu einer ähnlich starken Hemmung wie Propylthiouracil. Eine Vorbehandlung mit Methimazol zeigte hingegen keinen hemmenden Effekt. Eine
verminderte CD69-Expression war schon nach 0,1mM Carbimazol- und Propylthiouracilgabe ersichtlich, betraf jedoch hauptsächlich Zellen mit hoher CD69-Expressionsdichte (Daten nicht dargestellt).
3.1.2 Die IL-2 Synthese wird durch einige Thionamide gehemmt
Wir untersuchten den Effekt der Thionamide auf die Sekretion des autokrinen Wachstumsfaktor IL-2.
Es wurden primäre T-Lymphozyten mit Propylthiouracil , Carbimazol oder Methimazol vorbehandelt.
Die IL-2 Synthese wurde anschließend mittels CD3/CD28 Dynabeads induziert. Der Effekt der Thionamide auf die IL-2 Sekretion wurde mittels eines ELISA quantifiziert (Abb. 3.2). Die Aktivierung
der T-Zellen mit CD3/CD28 Dynabeads führte zu einer IL-2 Konzentration von 2800 pg/ml. Eine
signifikante Hemmung der IL-2 Sekretion wurde bereits bei 1mM Carbimazol und Propylthiouracil
festgestellt, während Methimazol die im Überstand gemessenen IL-2-Konzentration nicht wesentlich
28
Abbildung 3.1: Die Expression des T-Zell-Aktivierungsmarkers CD69 wird durch Propylthiouracil und Carbimazol unterdrückt. Die Effekte der Thionamide auf die CD69 Expression wurden mittels FACS-Analysen aus Vollblut ermittelt. Nach einstündiger Inkubation mit 5mM
R
Thionamid wurden die Blutproben mit 106 CD3/CD28 Dynabeads
für 15 h aktiviert. Die FACSAnalyse erfolgte mit anti-CD3-CD69-CD4 Antikörpern. Die CD3-positive Population wurde durch
den FSC (Forward Scatter) und einer CD3-PerCP-Färbung eingegrenzt und weiter durch anti-CD4
Phycoerythrin-konjugierte und anti-CD69 Fluorescein konjugierte Antikörper analysiert.
veränderte.
3.1.3 Carbimazol und Propylthiouracil hemmen die NF-κB-, AP-1- und
NFAT-abhängige Luciferase-Genexpression
Die CD69-Expression und IL-2 Synthese von T-Zellen können als funktionaler Endpunkt der Aktivierung der immunrelevanten Transkriptionsfaktoren NF-κB, AP-1 und NFAT betrachtet werden
(Macian et al., 2001). Um zu untersuchen, ob Thionamide die Aktivierung von NF-κB, AP-1 oder
NFAT supprimieren, wurden Jurkatzellen mit NF-κB, AP-1 oder NFAT-abhängigen Reportergenkonstrukten transfiziert und anschließend mit Thionamiden koinkubiert. Die Ergebnisse der Transfektionsexperimente sind in Abb. 3.3 dargestellt. Da Jurkatzellen keinen CD28 Rezeptor besitzen,
R
war die physiologische Stimulation über CD3/CD28 Dynabeads
nicht möglich. Stattdessen wurde
der Phorbolester PMA und das Calciumionophor Ionomycin zur Aktivierung der T-Zellen verwendet,
29
Abbildung 3.2: Carbimazol und Propylthiouracil hemmen die IL-2 Synthese in CD3positiven Zellen. CD3-positive Zellen, die aus Blut gesunder Spender isoliert worden waren, wurden
nach einer zweistündigen Vorinkubation mit Thionamiden in 1 bis 5 mM Konzentration für 16 StunR
den mit 106 CD3/CD28 Dynabeads
aktiviert. Die IL-2 Konzentration wurde aus dem Überstand
mittels eines ELISA bestimmt.*p<0,001 versus Positivkontrolle. Die Werte sind als Median von sechs
unabhängigen Experimenten ±SEM dargestellt.
um die CD3/CD28 induzierte Kaskade intrazellulär auszulösen. PMA und Ionomycin bewirkten eine
Induktion der NF-κB, AP-1 und NFAT abhängigen Reportergenexpression (Abb. 3.3A-C). Mit Propylthiouracil und Carbimazol behandelte Jurkatzellen zeigten für alle drei Transkriptionsfaktoren eine
dosisabhängige Suppression der Reportergenexpression. Bei dem NF-κB regulierten Reportergenkonstrukt lag die zur halbmaximalen Hemmung benötigte Konzentration (IC50) von Propylthiouracil bei
1mM, eine komplette Hemmung wurde bei einer 3mM Konzentration erzielt (Abb. 3.3A). Für AP-1
lagen diese Werte bei 2mM und 4mM (Abb. 3.3B). Bei dem NFAT abhängigen Reportergenkonstrukt
wurde eine komplette Hemmung bei 4mM erzielt (Abb.3.3C). Carbimazol zeigte wie in den bereits
unter 3.1.1 und 3.1.2. beschriebenen Experimenten die potenteste Hemmung und supprimierte in allen
Experimenten die Reportergenexpression bereits bei Konzentrationen von 0.5mM
30
Abbildung 3.3: Hemmung der NF-κB-, AP-1- und NFAT-abhängigen Reportergenexpression durch Thionamide. Für die NF-κB bzw. AP-1-abhängige Reportergenexpression wurden
Jurkat Zellen mit 3 µg des Plasmids p NF-κB-Luc respektive pAP-1-TA-Luc transfiziert (A-B). Um die
NFAT-abhängige Reportergenexpression zu analysieren, wurden stabil transfizierte C4-NFAT Jurkat
Zellen verwendet (C). Jurkat-Zellen wurden mit den angegebenen Konzentrationen des Thionamids für
2 h vorinkubiert, bevor sie mit 15 ng/ml PMA und 1 µg/ml Ionomycin für 13 h induziert wurden. Die
Luciferasereportergenaktivität wurde in Zelllysaten bestimmt; Messergebnisse sind auf die vorhandene
Proteinmenge hin normalisiert. Die Darstellung der Ergebnisse erfolgt als Prozentsatz der “relative
light units” (RLU) ausgehend von der Aktivität in stimulierten Zellen ohne Thionamidbehandlung
(100%). Werte sind als Mittelwerte von vier unabhängigen Experimenten ±SEM dargestellt.
(Abb.3.3A-C). Das analoge Imidazolderivat Methimazol führte nur zu einer geringfügigen Hemmung
der NF-κB-abhängigen Reportergenexpression (Abb. 3.3A). Hingegen führte Methimazol bei den
AP-1- und NFAT-abhängigen Reportergenkonstrukten zu keiner Hemmung der Luciferase Expression
(Abb. 3.3B und 3.3C).
31
3.2 Thionamide mit reaktiver Schwefelgruppe inhibieren die Aktivität
des Transkriptionsfaktors NF-κB
In den vorrausgegangenen Experimenten wurde eine Carbimazol und Propylthiouracil abhängige
Inhibition der
NF-κB abhängigen Reportergenexpression nachgewiesen. Nun sollten mit DNA-
Bindungsstudien und Western-Blot Analysen die Angriffsstellen der Thionamide in der
NF-κB-
Signalkaskade identifiziert werden.
3.2.1 Carbimazol und Propylthiouracil hemmen die DNA-Bindung von NF-κB in
CD3-positiven Zellen
Es wurde untersucht, ob Thionamide die Bindung von NF-κB an die entsprechende DNA-KonsensusSequenz unterbinden. Primäre T-Zellen wurden mit Thionamiden vorinkubiert und anschließend wurde
R
induziert. EMSA-Analysen zeigten,
der Transkriptionsfaktor NF-κB durch CD3/CD28 Dynabeads
dass Propylthiouracil und Carbimazol die DNA-Bindung von NF-κB konzentrationsabhängig unterdrückten (Abb. 3.4, Spuren 8-11). Methimazol hingegen führte auch in der 5mM Konzentration zu
keiner Abnahme der DNA-Bindungsaktivität (Abb. 3.4, Spur 5).
Die Quantifizierung der DNA-Bindung von NF-κB erfolgte mittels eines ELISA-basierenden DNABindungsassay (Trans Am Assay, Active Motif). Die DNA-Bindungsaktivität der NF-κB- Dimere
p50 und p65 an konsensuelle DNA-Sequenzen (5‘-GGGACTTTCG-3) konnte durch Stimulation der
CD3/CD28 Rezeptoren an der T-Zelloberfläche um ein 2 bis 4faches induziert werden (Abb. 3.5).
Die Behandlung mit Carbimazol und Propylthiouracil führte zu einer dosisabhängigen Reduktion der
DNA-Bindungsaktivität von p50 und p65.
3.2.2 Die Phosphorylierung und Degradation des NF-κB-Regulatorproteins IκBα wird
durch Thionamide beeinflusst
Es wurde mittels Western Blot Analysen überprüft, ob die verminderte
NF-κB DNA-
Bindungsaktivität durch Thionamide über Inhibition des NF-κB-Regulatorproteins IκBα vermittelt
wird. Im inaktiven Zustand ist NF-κB im Zytoplasma an das inhibitorische Regulatorprotein IκBα
gebunden. Aktivierung der T-Zelle führt über die Phosphorylierung von IκBα zur Freisetzung und
nukleären Translokation NF-κBs und damit zur Transkriptionsinitiation. Phosphoryliertes IκBα wird
ubiquitiniert und im Proteasom zur Degradation freigegeben (Karin, 2000).
Da die phosphorylierte Form von IκBα nur kurzzeitig stabil vorliegt und somit kaum nachweisbar ist,
wurde allen Ansätzen der Proteasominhibitor MG132 zugefügt. Damit wurde der proteasomale Abbau
32
Abbildung 3.4: Die DNA-Bindung von NF-κB wird duch Carbimazol und Propylthiouracil gehemmt. T-Zellen wurden mit Thionamiden in den angegebenen Konzentrationen für 4h
R
behandelt und anschließend mit 107 CD3/CD28 Dynabeads
pro Ansatz 30 min. stimuliert. Zur
Bestimmung der DNA-Bindung wurden nukleäre Extrakte hergestellt und 2 µg pro Reaktionsansatz
eingesetzt. Abgebildet ist eine repräsentative EMSA-Analyse, welche die DNA-Bindungs-Aktivität der
NF-κB-Untereinheiten p50 und p65 untersucht. NF-κB-Dimere p50/p65 und p50/p50, unspezifische
Bindungsaktivität der Probe (*), ungebundene Oligonukleotide (<).
33
Abbildung 3.5: Die DNA-Bindung von NF-κB wird duch Carbimazol und Propylthiouracil gehemmt. T-Zellen wurden mit Thionamiden in Konzentrationen von 1 und 5 mM für 4h
R
behandelt und anschließend mit 107 CD3/CD28 Dynabeads
pro Ansatz für 30 min. stimuliert.
Zur Bestimmung der DNA-Bindung wurden 2 µg nukleäres Extrakt eingesetzt. Abgebildet ist ein
ELISA-basierender NF-κB-DNA-Bindeassay. Die NF-κB-Untereinheiten p50 und p65 wurden mit
Hilfe eines anti-p50 oder anti-p65 Antikörpers detektiert. Die kolorimetrische Quantifizierung erfolgte
über einen sekundären HRP-konjugierten Antikörper. Ergebnisse sind als Prozentsatz der Induktion in
stimulierten Zellen ohne Thionamidbehandlung (100%) dargestellt. Gezeigt ist der Median von sechs
unabhängigen Experimenten ±SEM.
von IκBα unterbunden. Die Stimulation der CD3/CD28 Rezeptoren führte zu einer Phosphorylierung
von IκBα (Abb. 3.6A-C, Spuren 1,2). Methimazol zeigte keinen Effekt auf den Phosphorylisationsstatus von IκBα (Abb. 3.6A, Spuren 3-9). Propylthiouracil blockierte diese Phosphorylierung ab Konzentrationen von 2mM (Abb. 3.6B, Spuren 6-9). Ebenso konnte Carbimazol die Phosphorylierung ab
einer Konzentration von 1mM verhindern (Abb. 3.6C, Spuren 5-9). Eine gleichmäßige Proteinbeladung
wurde durch die Detektion des Gesamtproteins auf der selben Membran nachgewiesen (Abb. 3.6 A-C).
In Abwesenheit des Proteasominhibitors MG132 resultiert die Phosphorylierung von IκBα in dessen
Degradation. Dadurch konnte IκBα nach T-Zell-Stimulation wie in Abb.3.7, Spur 2 gezeigt, nicht mehr
nachgewiesen werden. Methimazol vermochte die Degradation von IκBα nicht zu verhindern (Abb.
3.7, Spuren 3,4). Die Behandlung mit Carbimazol und Propylthiouracil hingegen führte zu keiner Degradation von IκBα (Abb. 3.7, Spuren 5-10), so dass IκBα NF-κB weiterhin im inaktiven Zustand
34
Abbildung 3.6: Die Phosphorylierung von IκBα wird duch Carbimazol und Propylthiouracil gehemmt. 2x106 CD3-positive T-Zellen wurden aus Vollblut gereinigt und mit Thionamiden in
Konzentrationen von 0,1 bis 5 mM für 4h behandelt. Eine Stunde vor Aktivierung erfolgte die Zugabe
von 10µM des Proteasominhibitors MG 132. Die Aktivierung der Ansätze erfolgte mit jeweils 106
R
CD3/CD28 Dynabeads
für 20 min. Die Analyse auf phosphoryliertes IκBα erfolgte mittels Western
Blot aus Gesamtzellproteinextrakten (oberer Blot). Eine gleichmäßige IκBα-Proteinbeladung wurde
durch die Detektion des Gesamtproteins nachgewiesen (unterer Blot). Gezeigt ist ein Repräsentatives
von drei unabhängigen Experimenten.
Abbildung 3.7: Die Degradation von IκBα wird duch Carbimazol und Propylthiouracil
gehemmt. 2x106 CD3-positive T-Zellen wurden aus Vollblut gereinigt und mit Thionamiden in Konzentrationen von 0,1 bis 5 mM und 5µg/ml des Proteinsynthese-Inhibitors Actinomycin D für 4h
R
behandelt. Die Aktivierung der Ansätze erfolgte mit jeweils 106 CD3/CD28 Dynabeads
für 10 min.
IκBα wurde mittels Western Blot in Gesamtzellextrakten nachgewiesen (oberer Blot). Der Nachweis
von β-Aktin auf der selben Membran zeigte eine gleichmäßige Proteinbeladung (unterer Blot). Gezeigt
ist ein Repräsentatives von drei unabhängigen Experimenten.
35
hält und dadurch eine Transkriptionsinitiation im Zellkern verhindert. Die gleichmäßige Proteinbeladung im Gel wurde über einen β-Aktin-Antikörper auf der selben Membran nachgewiesen.
3.2.3 Durch heterozyklische Thionamide kommt es zu einer verminderten Synthese der
proinflammatorischen Zytokine INFγ und TNFα
NF-κB ist ein Transkriptionsfaktor, welcher nach Aktivierung pro-inflammatorische Prozesse initiieren
kann (Hayden, Gosh, 2004). Mittels eines ELISA wurde überprüft, ob Thionamide durch Suppression
von NF-κB der Inflammation entgegen wirken, indem sie die Synthese der pro-inflammatorischen
Zytokine TNFα- und IFNγ unterbinden.
Die bekannten NF-κB-Inhibitoren MG132 und Lactacystin (Epinat, Gilmore, 1999) supprimierten die
TNFα- und IFNγ-Synthese vollständig (Abb. 3.8A). Dies beweißt, dass INFγ- und TNFα maßgeblich
durch den Transkriptionsfaktor NF-κB reguliert werden. Auch in der Literatur ist beschrieben, dass
die INFγ- und TNFα-Synthese NF-κB-abhängig ist (Pahl, 1999).
Propylthiouracil und Carbimazol hemmten die TNFα- und IFNγ-Synthese dosisabhängig. Die IC50
von Propylthiouracil lag für INFγ und TNFα bei 2mM. Die IC50 von Carbimazol lag unter 0,1mM.
Dagegen hatte Methimazol keine Auswirkung auf die Zytokin-Produktion (Abb. 3.8B und 3.8C).
3.3 Thionamide inhibieren den Transkriptionsfaktor AP-1
In den vorausgehenden Experimenten wurde eine Suppression der AP-1-abhängigen Reportergenexpression und folglich eine Hemmung der Synthese AP-1 regulierter Markerproteine wie IL-2 und
CD69 gezeigt. Um herauszufinden, wie Thionamide mit AP-1 interagieren, wurden zunächst DNABindungsanalysen durchgeführt.
3.3.1 Carbimazol und Propylthiouracil supprimieren die DNA-Bindungsaktivität von
AP-1 in humanen Lymphozyten
Mittels EMSA wurde überprüft, ob Thionamide die DNA-Bindung von AP-1 beeinträchtigen. Dabei zeigte sich, dass Carbimazol bereits bei 1mM die AP-1 DNA-Bindung hemmte (Abb. 3.9, Spuren
9-11). Propylthiouracil reduzierte die DNA-Bindungsaktivität bei 5mM (Abb. 3.9, Spur 5). Für Methimazol konnte in keiner der eingesetzten Konzentrationen eine Hemmung von AP-1 beobachtet werden
(Abb. 3.9, Spuren 6-8). Ähnliche Ergebnisse wurden in Experimenten zur Quantifizierung der Bindung
der AP-1 Untereinheiten c-Jun und c-Fos an die konsensuelle DNA-Sequenz (5‘-TGACGTCA-3‘) mittels eines eines ELISA-basierenden DNA-Bindungsassay (Trans Am Assay, Active Motif) beobachtet.
36
Abbildung 3.8: Thionamide inhibieren die TNFα- und IFNγ-Sekretion in CD3-positiven
Zellen. Für den Zytokin ELISA wurden Überstände von Zellkulturen CD3-positiver Zellen verwendet,
die entweder mit ansteigenden Dosen Thionamiden oder mit MG132 bzw. Lactacystein als NFκB-Inhibitoren für 15 h vorinkubiert wurden. Als Positivkontrolle dienten unbehandelte Zellen. In
R
den letzten 13h in Kultur wurde die Zytokin-Synthese mit 106 CD3/CD28 Dynabeads
(0,5 Beads
pro Zelle) induziert. *p<0,001 versus Positivkontrolle. Die Werte sind als Median ±SEM von sechs
unabhängigen Experimenten dargestellt.
R
Durch Stimulation der Zellen mit CD3/CD28 Dynabeads
ergaben sich 4 bis 5-fache Induktionswerte
von c-Jun und c-Fos bezogen auf die Negativkontrolle (Abb. 3.10). Propylthiouracil und Carbimazol
bewirkten eine dosisabhängige Abnahme der c-Jun und c-Fos DNA-Bindung. Die durch eine 5 mM
Carbimazol- und Propylthiouracilkonzentration bewirkte Inhibition beider Untereinheiten lag auf dem
Niveau der Negativkontrolle. Die Koinkubation der Zelle mit Methimazol resultierte hingegen in keiner
Abnahme der AP-1- Bindungsaktivität.
37
Abbildung 3.9: Die DNA-Bindung von AP-1 wird duch Carbimazol und Propylthiouracil
gehemmt. T-Zellen wurden mit Thionamiden in Konzentrationen von 1 bis 5 mM für 4h behanR
delt und anschließend mit 107 CD3/CD28 Dynabeads
pro Ansatz für 30 min. inkubiert. Nukleäre
Extrakte wurden hergestellt. Die DNA-Bindung von AP-1 wurde anhand von EMSA-Experimenten
analysiert. AP-1-Komplexe, unspezifische Bindungsaktivität der Probe (*), ungebundene Oligonukleotide (<) sind abgebildet. Gezeigt ist ein Repräsentatives von vier unabhängigen Experimenten.
38
Abbildung 3.10: Die DNA-Bindung von AP-1 wird duch Carbimazol und Propylthiouracil gehemmt. T-Zellen wurden mit Thionamiden in Konzentrationen von 1 bis 5 mM für 4h
R
behandelt und anschließend mit 107 CD3/CD28 Dynabeads
pro Ansatz für 30 min. inkubiert. Nukleäre Extrakte wurden hergestellt, um daraus die DNA-Bindung von c-Jun und c-Fos anhand eines
Oligonukleotids, das die “ AP-1 binding site“ 5‘-TGAGTCA-3‘ beeinhaltete, zu analysieren. Die gebundenen AP-1-Untereinheiten wurden mittels eines anti-c-Jun (oberes Diagramm) oder anti-c-Fos
(unteres Diagramm) Antikörpers detektiert. Die kolorimetrische Quantifizierung erfolgte über einen sekundären HRP-konjugierten Antikörper. Ergebnisse sind als Prozentsatz der Induktion in stimulierten
Zellen ohne Thionamidbehandlung (100%) dargestellt. Gezeigt ist der Median von sechs unabhängigen
Experimenten ±SEM.
39
3.3.2 Carbimazol und Propylthiouracil inhibieren die Phosphorylierung der
MAP-Kinasen ERK1/2 und p38 sowie die Aktivität der c-Jun-NH2-terminalen
Kinase (JNK)
Die transkriptionelle und posttranslationale Aktivierung von AP-1 erfolgt durch Aktivierung der
MAP-Kinase-Kaskade (Dong et al., 2002). Deshalb wurden die aktivierenden Modifikationen der
ERK1/2, p38 und der JNK-Kinasen untersucht. Die CD3/CD28 spezifische Stimulation primärer
T-Zellen führte zur Phosphorylierung der MAP-Kinasen ERK1/2 und p38 (Abb. 3.11A, Spuren 1,2)
und damit zur Aktivierung der MAP-Kinase-Kaskade. Im Gegensatz dazu konnte die MAP-Kinase
JNK nicht in den Zelllysaten nachgewiesen werden, vermutlich da diese in nativen T-Zellen nur in
geringem Grade exprimiert wird (Weiss et al., 2000). Aufgrund der höheren Sensitivität wurde die
JNK-Aktivität durch einen in vitro-JNK-Kinaseaktivitäts-Assay bestimmt.
R
Wurden primäre T-Zellen vor Aktivierung mit CD3/CD28 Dynabeads
mit Propylthiouracil und
Carbimazol behandelt, zeigte sich, dass die aktivierende Phosphorylierung der ERK1/2 und p38 unterbunden wurde (Abb. 3.11A). Ebenfalls wurde die JNK-Kinase-Aktivität durch Propylthiouracil und
Carbimazol bei 2 mM bzw. 0,1 mM deutlich reduziert. Methimazol konnte keine der MAP-Kinasen
nach CD3/CD28 spezifischer Stimulation hemmen (Abb. 3.11A).
Eine Stimulation primärer T-Zellen mit dem PKC-Aktivator PMA und dem Calciumionophor Ionomycin führte ebenfalls zur Phosphorylierung der MAP-Kinasen ERK1/2 und p38 und zur Aktivierung
der JNK-Kinase (Abb. 3.11B, Spuren 1,2). Carbimazol konnte diesen Prozess unterbinden. (Abb.
3.11B). Im Gegensatz dazu ergaben sich für Propylthiouracil wesentliche Unterschiede im Vergleich
zu CD3/CD28 stimulierten T-Zellen (Abb. 3.11B). In diesem Experiment konnte keine Hemmung
der MAP-Kinasen durch Propylthiouracil beobachtet werden, obwohl AP-1 nach PMA/Ionomycin
Stimulation und Propylthiouracil-Koinkubation im Reportergen- und EMSA-Experiment gehemmt
worden war (Abb.3.3 und 3.9). Offensichtlich kann die Propylthiouracil-vermittelte Hemmung von
AP-1 unabhängig von den MAP-Kinasen erfolgen.
3.4 Der Transkriptionsfaktor NFAT wird in humanen T-Lymphozyten
durch Thionamide gehemmt
Zuvor durchgeführte NFAT-abhängige Reportergen-Experimente zeigten eine Inhibition des Transkriptionsfaktors NFAT durch Carbimazol und Propylthiouracil (3.1.3).
40
Abbildung 3.11: Carbimazol und Propylthiouracil hemmen die Phoshorylierung der MAPKinasen ERK1/2 und p38 sowie die Aktivität der JNK Kinasen. CD3-positive Zellen wurden
entweder unbehandelt belassen (Spur 1) oder mit Thionamiden in Konzentrationen von 0,1 bis 5 mM
für 4 h behandelt (Spur3-9). Um die Phosphorylierung bzw. Aktivierung der MAP-Kinasen zu induR
zieren, wurden die Ansätze mit (A) 106 CD3/CD28 Dynabeads
oder (B) 15 ng/ml PMA und 1
µg/ml Ionomycin für 10 min. inkubiert (Spuren 2-9). Die Aktivität der JNK Kinase wurde über einen
in vitro Kinase Assay mit c-Jun als Substrat für immunpräzipitierte JNK bestimmt. Die Position
der phosphorylierten ERK1/2 oder der p38 MAP-Kinase, sowie das von der JNK-Kinase phosphorylierten Substrats c-Jun sind angezeigt. Abgebildet ist ein Repräsentatives von drei unabhängigen
Experimenten.
41
3.4.1 Carbimazol und Propylthiouracil hemmen die DNA-Bindungsaktivität von NFAT
in humanen T-Lymphozyten
Mit EMSA-Studien sollten diese Effekte reproduziert werden. Da die Stimulation der CD3-positiven
R
Zellen mit CD3/CD28 Dynabeads
nur zu einer partiellen Dephosphorylierung und somit eingeschränkter Aktivierung von NFAT (Daten nicht dargestellt) führte, wurden die CD3-positiven Zellen
für alle weiteren Folge-Experimente mit Ionomycin stimuliert.
Abb. 3.12 zeigt die Ergebnisse der EMSA-Experimente. Ionomycin induzierte die NFAT DNABindungsaktivität (Abb. 3.12, Spur 2), welche durch Vorinkubation mit Methimazol nicht abgeschwächt wurde (Abb. 3.12, Spuren 3-5). Propylthiouracil hemmte die Bindung von NFAT bei einer
Konzentration von 5mM (Abb. 3.12, Spur 8). Carbimazol inhibierte die DNA-Bindung von NFAT
bereits bei Konzentrationen von 1mM (Abb. 3.12, Spuren 9-11).
Eine Quantifizierung der DNA-Bindungsaktivität von NFAT an seine konsensuelle DNA-Sequenz mittels eines ELISA basierten Assays wurde analog zu NF-κB und AP-1 auch für NFAT durchgeführt.
Allerdings konnte eine Beeinflussung der NFAT DNA-Bindung auf Grund schwacher Induktionswerte
und einer hohen Hintergrundaktivität nicht hinreichend untersucht werden (Daten nicht als Abbildung
dargestellt).
3.4.2 Die Dephosphorylierung von NFAT in humanen T-Lymphozyten wird durch
Carbimazol inhibiert
NFAT-abhängige Reportergen-Experimente und EMSA-Studien zeigten eine Carbimazol und
Propylthiouracil-vermittelte Hemmung von NFAT. Mit den folgenden Experimenten sollte der zugrundeliegende Mechanismus der NFAT-Inhibition aufgeklärt werden.
Inaktives, hyperphosphoryliertes NFAT wird durch die Phosphatase Calcineurin (PP2B) dephosphoryliert und kann in diesem Zustand in das nukleäre Kompartiment wandern und transaktivierend tätig
werden (Loh et al.,1996). Dabei wird die Aktivität der Phosphatase Calcineurin (PP2B) streng durch
Calcium und das regulatorische Protein Calmodulin kontrolliert.
Der Calciuminduktor Ionomycin induziert die aktivierende Dephosphorylierung von NFAT; dies stellt
sich nun als vollständiger Shift der spezifischen NFAT-Bande im Western Blot dar (Abb. 3.13, 5.Blot,
Spur 2 vs. Spur 1). Der Shift ist Folge der Reduktion des Molekulargewichts durch die Dephosphorylierung von NFAT. Propylthiouracil und Methimazol hatten keinen Einfluss auf die Dephosphorylierung,
erkennbar an der prominenten unteren Bande (Abb. 3.13, 1.Blot, Spuren 3-7), die sich von der Positivkontrolle nicht unterscheidet (Abb. 3.13, 1.Blot, Spur 2). Im Gegensatz dazu kam es durch die Zugabe
42
Abbildung 3.12: Die DNA-Bindung von NFAT wird durch Carbimazol und Propylthiouracil gehemmt. Die DNA-Bindung von NFAT wurde durch EMSA-Analysen untersucht. Nukleäre
Extrakte von CD3-positiven Zellen wurden untersucht. Spur 1: unbehandelte Zellen, Spuren 3-9: 2h
mit Thionamiden in Konzentrationen von 1 bis 5 mM behandelte Zellen. Die Aktivierung von NFAT
erfolgte in der letzten Stunde des Experimentes mit 1 µg/ml Ionomycin (Spuren 2-9). NFAT DNAKomplex, unspezifische Bindungsaktivität der Probe (*), ungebundene Oligonukleotide (<) sind angezeigt. Abgebildet ist ein Repräsentatives von vier unabhängigen Experimenten.
von Carbimazol zu einer deutlichen Hemmung der NFAT-Dephosphorylierung (Abb. 3.13, 1.Blot, Spuren 8-10). Um auszuschliessen, dass die beobachtete Hemmung der NFAT-Dephosphorylierung auf eine
reduzierte Proteinkonzentration von Calcineurin und Calmodulin zurückzuführen ist, wurden Western Blot-Analysen von Calcineurin und Calmodulin durchgeführt. Beide Proteine, welche die NFAT-
43
Abbildung 3.13: Carbimazol hemmt die NFAT-Dephosphorylierung. CD3-positive Zellen wurden entweder unbehandelt belassen (Spur 1) oder für 2h mit Thionamiden in Konzentrationen von 1
bis 5 mM behandelt (Spuren 3-10). Die Aktivierung erfolgte die letzten 10 min. des Experimentes mit
1 µg/ml Ionomycin (Spuren 2-10). Die Analyse der NFAT-Dephosphorylierung, von Calmodulin und
von α/βCalcineurin erfolgte aus Gesamtzellproteinextrakten. Abgebildet ist ein Repräsentatives von
drei unabhängigen Experimenten.
Abbildung 3.14: Carbimazol hemmt die nukleäre Translokation von NFAT. CD3-positive
Zellen wurden entweder unbehandelt belassen (Spur 1) oder für 2h mit Thionamiden in Konzentrationen von 1 bis 5 mM behandelt (Spuren 3-10). Die Aktivierung erfolgte die letzten 10 min. des
Experimentes mit 1 µg/ml Ionomycin (Spuren 2-10). Die Detektion des nukleären NFAT erfolgte aus
nukleären Extrakten primärer T-Zellen anhand von Western Blot Experimenten. Zum Nachweis einer
gleichmäßigen Proteinbeladung wurde das TATA Bindungsprotein 18 (TATA-BP18) detektiert.
Dephosphorylierung regulieren, waren in ihrer Proteinkonzentration auch in Anwesenheit der Thionamide unverändert (Abb. 3.13, 2.+3.Blot). Somit ist für die Abnahme der NFAT-Dephosphorylierung
eine reduzierte Enzymaktivität von Calcineurin ursächlich, nicht aber die Expression.
Im Anschluss wurde die nukleäre Translokation von NFAT überprüft (Abb. 3.14). Nukleäre Extrakte
wurden aus primären T-Zellen gewonnen, um nukleäres NFAT zu detektieren. In Ionomycin behandelten T-Zellen ließ sich nukleäres NFAT nachweisen (Abb. 3.14). Carbimazol verhinderte den nukleären
Transport von NFAT (Abb. 3.14, Spuren 8-10), während Propylthiouracil und Methimazol die Translokation von NFAT in den Zellkern nicht beeinflussten (Abb. 3.14, Spuren 3-7). Als Ladungskontrolle
wurde das TATA Bindungsprotein 18 (TATA-BP18) nachgewiesen.
44
Abbildung 3.15: Carbimazol hemmt die Autophosphorylierung der CamKII. CD3-positive
Zellen wurden entweder unbehandelt belassen (Spur 1) oder für 2h mit Thionamiden in Konzentrationen von 1 bis 5 mM behandelt (Spuren 3-10). Die Aktivierung erfolgte die letzten 10 min.
des Experimentes mit 1 µg/ml Ionomycin (Spuren 2-10). Gesamtzellextrakte wurden im Western
Blot-Experiment aufgetragen. Die Autophosphorylierung der CamKII wurde anhand der Position von
Threonin 286 bestimmt. Zum Nachweis einer gleichmäßigen Proteinbeladung wurden das Gesamtprotein der CamKII detektiert. Abgebildet ist ein Repräsentatives von drei unabhängigen Experimenten.
3.4.3 Carbimazol hemmt die Autophosphorylierung der Calmodulinkinase II in
CD3-positiven Zellen
Die Calmodulinkinase II (CamKII) und Calcineurin werden beide von Calmodulin-CalciumKomplexen reguliert. Eine Thionamid bedingte Hemmung von Calmodulin sollte sich somit sowohl auf
die CamKII als auch auf Calcineurin auswirken. Die Hemmung der CamKII-Aktiviät wurde anhand
des Autophosphorylierungsmusters der CamKII nachgewiesen. Ionomycin induziert die Autophosphorylierung der CamKII (Abb. 3.15, 1.Blot, Spur 2 vs. Spur 1). Der Einsatz der Thionamide resultierte
in einem zu NFAT vergleichbaren Inhibitionsmuster. Carbimazol hemmte die Autophosphorylierung
der CamKII bereits ab der geringsten, eingesetzten Konzentration (Abb. 3.15, 1.Blot, Spuren 8-10).
Im Gegensatz dazu wurde die Autophosphorylierung der CamKII weder durch Methimazol noch durch
Propylthiouracil gehemmt (Abb. 3.15, 1.Blot, Spuren 3-7). Während der Experimente blieb die Proteinkonzentration des Gesamtproteins der CamKII unverändert (Abb. 3.15, 2.Blot). Dies beweist, dass
eine reduzierte Kinase-Aktivität der CamKII ursächlich für die Carbimazol induzierte Hemmung ist,
nicht aber eine verringerte Menge des Gesamtproteins.
3.5 Die Inhibition von NF-κB, AP-1 und NFAT ist nicht auf toxische
Effekte der Thionamide zurück zu führen
Die Freisetzung des intrazellulären Enzyms Laktatdehydrogenase (LDH) in das Zellkulturmedium stellt einen unspezifischen Marker einer gestörten Membranintegrität infolge direkter Membranschädigung, Apoptose oder Nekrose dar. Um auszuschliessen, dass die zuvor beobachteten Ergebnisse auf eine erhöhte Toxizität der Thionamide zurückzuführen sind, wurde die LDH-Freisetzung von
Abbildung 3.16: Der Einfluß von Thionamiden auf die LDH-Freisetzung. 2x106 CD3-positive
Zellen wurden mit Thyreostatika in Konzentrationen von 0,1-5 mM für 4 Stunden inkubiert. Aus
dem Überstand wurde die LDH-Aktivität gemessen. Ergebnisse sind als Prozentsatz einer 100% LDHFreisetzung dargestellt, wobei die totale Membranolyse durch die Zugabe von 20% Tween erreicht
wurde (Positivkontrolle).
T-Zellen nach vierstündiger Thionamid-Inkubation bestimmt. Eine 100 % LDH-Freisetzung entsprach
in diesem experimentellen Aufbau einer totalen Membranolyse der CD3-positiven Zellen mit 20%
Tween. Die Inkubation mit Propylthiouracil, Carbimazol oder Methimazol verursachte keine erhöhte
LDH-Freisetzung der CD3-positiven Zellen verglichen mit der spontanen Freisetzung unbehandelter
Zellen, die der Schnittstelle der Ordinate entspricht (Abb. 3.16). Somit sind zuvor beschriebenen Ergebnisse einem molekularen, biochemischen Mechanismus zuzuordnen.
4 Diskussion
In experimentellen Studien wurde ein Einfluss von Thiobarbituraten auf Teile des Immunsystems,
insbesondere auf die zentralen Regulatoren des spezifischen Immunsystems, die T-Lymphozyten, gezeigt (Loop et al., 2002; Humar et al., 2004). Ähnliche Beobachtungen wurden in klinischen Studien
auch für eine Teilgruppe der Thyreostatika, die Thionamide, gemacht (Weetman, 1994; Cooper, 2005).
Thionamide bestehen ebenso wie Thiobarbiturate aus einem heterozyklischen, schwefelhaltigen Ringgerüst. Eine molekulare Einflussnahme auf intrazelluläre Immunregulatoren wurde bisher jedoch nur
für Thiobarbiturate gezeigt: Die thiopentalinduzierte Immunsuppression wird durch eine Hemmung
der immunrelevanten Transkriptionsfaktoren NF-κB, NFAT und AP-1 vermittelt (Loop et al.,2002;
Humar et al., 2004). Aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit der Thiobarbiturate und der Thionamide
bezog sich die Untersuchung der molekularen Angriffspunkte der thionamidinduzierten Immunsuppression in dieser Arbeit auf eine Inhibition der Transkriptionsfaktoren NF-κB, NFAT und AP-1. Der
Vergleich dieser beiden Arzneigruppen sollte zeigen, dass heterozyklische Substanzen mit reaktiver
Schwefelgruppe generell eine immunsuppressive Wirkung besitzen können.
4.1 Die biologische Funktionalität von T-Zellen wird durch Thionamide
mit reaktiver Schwefelgruppe herabgesetzt
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Thionamide Carbimazol und Propylthiouracil wichtige Effektorfunktionen des Immunsystems beeinträchtigen. So war in CD3-positiven Zellen
die Expression des Aktivierungsmarkers CD69 und die IL-2 Sekretion nach Propylthiouracil- und
Carbimazolbehandlung signifikant reduziert. Methimazol hingegen war nicht in der Lage, die CD69Expression und die IL-2 Sekretion zu supprimieren. Somit wird die biologische Funktionalität von
T-Zellen nur durch Thionamide mit reaktiver Schwefelgruppe herabgesetzt. Ursache für die Hemmung
der CD69-Expression und IL-2 Sekretion ist möglicherweise die Suppression der Transkriptionsfaktoren
NF-κB, AP-1 und NFAT.
47
4.2 Der thionamidinduzierten NF-κB-Suppression liegt wahrscheinlich
eine reduzierte IKK-Aktivität zu Grunde
NF-κB ist ein wichtiger Regulator von Entzündungs-, Apoptose- und Differenzierungsprozessen,
da er die Transkription proinflammatorischer Zytokine, Adhäsionsmoleküle, Chemokine, Enzyme,
Zellzyklusregulatorproteine und immunologischer Rezeptoren induziert (Gosh, 1998; Pahl, 1999). Im
inaktiven Zustand ist NF-κB im Zytoplasma an das inhibitorische Regulatorprotein IκBα gebunden.
Aktivierung der T-Zellen führt über die Phosphorylierung von IκBα durch die IKK zur Freisetzung
und nukleären Translokation NF-κBs und damit zur Transkriptionsinitiation. Phosphoryliertes IκBα
wird ubiquitiniert und im Proteasom degradatiert (Karin, 2000).
In den Analysen zum Wirkmechanismus von Thionamiden auf die NF-κB-Signaltransduktion konnten
hemmende Effekte von Carbimazol und Propylthiouracil auf ein NF-κB-abhängiges Reportergenkonstrukt gezeigt werden. Eine reduzierte DNA-Bindung durch Carbimazol und Propylthiouracil wurde
sowohl im EMSA-Experiment als auch in einem ELISA-basierenden DNA-Bindungsassay (Trans Am
Assay, Active Motif) reproduziert. Dies könnte die signifikante Reduktion der NF-κB-abhängigen
TNFα- und IFNγ-Synthese durch Thionamidbehandlung in ELISA-Experimenten erklären.
Eine plausible Erklärung für den beobachteten Hemmeffekt auf
NF-κB liefert die in dieser
Arbeit gezeigte dosisabhängige Hemmung der Phosphorylierung von IκBα durch Carbimazol und
Propylthiouracil. Die Hemmung der Phosphorylierung und Degradation von IκBα durch Thionamide
beruht dabei nicht auf einem Verlust an IκBα-Gesamtprotein. Das beweisen die Normalisierungen der
Immunoblots sowie die Zugabe des Proteasominhibitors MG132. Auch in Abwesenheit von MG132,
bei funktionellem proteolytischen Abbau von phosphoryliertem IκBα verhindern die Thionamide
Carbimazol und Propylthiouracil, dass IκBα abgebaut wird. Zytotoxische Effekte der Thionamide,
die eine Inhibition NF-κBs vortäuschen könnten, wurden durch einen LDH-Assay ausgeschlossen.
Ursächlich für die Hemmung der IκBα-Phosphorylierung durch Carbimazol und Propylthiouracil
könnte eine supprimierte IKK-Aktivität sein. Bestärkt wird diese Hypothese durch Vorarbeiten,
die eine Suppression der IKK als Grund für die
NF-κB-Hemmung durch die strukturanalogen,
hexazyklischen Thiobarbiturate auswiesen (Loop et al., 2003). Zusätzlich ist die Aktivität und
Regulation der IKK in der Literatur ein vieldiskutierter Ansatzpunkt für eine gezielte Suppression
der
NF-κB-Signalkaskade zur Behandlung entzündlicher Krankheiten (Verma, 2004; Kwak,2000;
Yamamoto, Gaynor, 2001; Kumar et al.,2004). Denn auch etablierte Therapeutika wie ASS, Leflunomid und Sulindac wirken neben einer COX-Inhibition zusätzlich über eine Hemmung der
48
IKK-Aktivität anti-inflammatorisch (Kwak et al., 2000; Kumar et al. 2004). In dem Aktiven Zentrum
der Untereinheiten IKKα und IKKβ spielen Cysteinketten eine wichtige Rolle (Rossi et al., 2000),
so dass Thionamide über ihre Schwefelgruppe die Aktivität der IKK beeinflussen könnten, indem sie
mit diesen Cysteinketten interagieren. Diese Möglichkeit wird durch Experimente mit Substanzen
mit reaktiver Thiolgruppe bestärkt, die die in vitro Aktivität beider Untereinheiten hemmen (Jeon et
al., 2000). Zum Beispiel hemmt Arsensulfid die IKK über Bindung des Cys-179 im Aktiven Zentrum
der IKKβ, was durch Zugabe des Antidots Dimercaptopropansulfonat oder eine Überexpression der
IKKβ reversibel ist (Kapahi, Karin, 2000).
4.3 Therapeutische Ansätze durch NF-κB-Blockade
Es gibt viele therapeutische Ansätze zur Behandlung inflammatorischer Erkrankungen wie Asthma,
Sepsis, Arthritis oder Multiple Sklerose, mit dem Ziel, die konstitutive NF-κB-Aktivierung zu durchbrechen (Verma, 2004). Zudem verspricht eine Blockade der NF-κB Signalkaskade neue Therapieoptionen in der Onkologie. Strategien zur selektiven NF-κB-Inhibition umfassen: 1.) eine Hemmung der
IKK Aktivität, 2.) eine Stabilisierung der inhibitorischen IκB-Proteine durch Proteasomblockade, 3.)
eine Blockade der nukleären Translokation der NF-κB-Dimere oder 4.) eine direkte Hemmung der
DNA-Bindungsaktivität über decoy Oligonukleotide oder small molecules (Verma, 2004; Kumar et al.,
2004).
Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse zur NF-κB Inhibiton durch heterozyklische, schwefelhaltige
Substanzen wären der ersten Strategie, Hemmung der IKK, hinzu zu rechnen. Therapeutisch wird
heute bereits der Proteasominhibitor Bortezomib bei der Behandlung des Multiplen Myeloms eingesetzt, der den antiapoptotischen Effekten von NF-κB entgegenwirkt (Richardson et al., 2003).
Obwohl die gezielte NF-κB-Blockade zu einem großen Fortschritt bei der Behandlung der genannten
Erkrankungen beitragen könnte, sind die schweren Nebenwirkungen einer langfristigen Therapie, die
auf Grund der zentralen Rolle NF-κBs bei entzündlichen und apoptotischen Prozessen sowie bei Differenzierungsvorgängen zu erwarten sind, zu bedenken. In Tiermodellen wurden schwere teratogene
Wirkungen und eine Anfälligkeit gegenüber opportunistischen Infektionen gezeigt (Lavon et al., 2000).
49
4.4 Der Suppression von AP-1 liegt eine Hemmung der Map-Kinasen zu
Grunde
Der Transkriptionsfaktor AP-1 spielt durch seine Beteiligung bei der Differenzierung von Lymphozyten und der Einleitung der Immunantwort, sowie der Apoptose eine wichtige Rolle im Immunsystem
(Dong et al., 2002). In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Thionamide die Aktivierung dieses
Transkriptionsfaktors unterbinden können. So waren Propylthiouracil und Carbimazol in der Lage
die DNA-Bindung im EMSA-Experiment und in quantifizierbaren DNA-Bindungsstudien zu unterdrücken. Auch Reportergenexperimente zeigten den EMSA-Ergebnissen entsprechend, eine reduzierte
Transkriptionsaktivität von AP-1 nach Propylthiouracil- und Carbimazol-Behandlung. Mögliche Ursachen wären zum einen eine direkte Interaktion zwischen den Thionamiden und dem AP-1 Dimer
oder zum anderen eine Hemmung der Aktivierung und posttranskriptionellen Modifikation, die zur
funktionellen Induktion des c-jun/c-fos Komplexes nötig ist (Foletta et al., 1998). Tatsächlich konnte
gezeigt werden, dass die proximal gelegenen Map-Kinasen p38, ERK und JNK, welche über Phosphorylierungsvorgänge zur transkriptionellen und posttranslationalen Induktion von AP-1 führen (Karin,
1995) durch Propylthiouracil und Carbimazol gehemmt werden. Dies betraf sowohl die Aktivierung
der p38 und ERK als auch die Kinaseaktivität der JNK. Für die Suppression der Map-Kinasen könnte
neben einer direkten Inhibition der Kinaseaktiviät auch eine Hemmung weiter proximal gelegener
Glieder der T-Zell-Signalkaskade verantwortlich sein. Das ähnliche Hemmmuster Propylthiouracils
und Carbimazols auf die AP-1-DNA-Bindung und auf die NF-κB-DNA-Bindung gibt einen Hinweis
auf einen ähnlichen Inhibitionsmechanismus: Womöglich ist ein sehr weit proximal gelegenes Glied der
T-Zell-Signalkaskade betroffen, das Informationen sowohl über die IKK als auch über die Map-Kinasen
vermittelt. Ein möglicher Angriffspunkt könnten die kleinen G-Proteine sein. In weiterführenden Arbeiten dieser Studie zeigten Experimente mit den kleinen G-Proteinen ras und raf, die Signale von
Zellmembranrezeptoren an intrazelluläre Signalmoleküle wie die Map-Kinasen weiterleiten, eine Hemmung ihrer Aktivität durch Thionamidbehandlung (Humar et al., 2007). Im Gegensatz dazu ist eine
direkte Interaktion zwischen den Thionamiden und dem AP-1 Dimer, welche die DNA-Interaktion
unterbindet eher unwahrscheinlich. Denn EMSA-Experimente mit strukturanalogen Thiobarbituraten
zeigten, dass eine Koinkubation von Thiopental mit bereits aktivierten nukleären Extrakten zu keiner reduzierten AP-1-Bindung im EMSA-Experiment (Humar et al., 2004) führte. Auf Grund der
Analogie in Struktur und Wirkung zwischen Thionamiden und Thiobarbituraten gilt diese Annahme vermutlich auch für Propylthiouracil und Carbimazol. Methimazol führte in EMSA-Analysen und
quantifizierbaren DNA-Bindungsstudien zu keiner AP-1 Hemmung, was die Integrität der biologischen
50
Effektorfunktionen, wie z.B. die CD69-Expression und IL-2-Synthese (3.1.1 und 3.1.2) erklärt.
4.5 Carbimazol führt wahrscheinlich über eine Interaktion mit
Calmodulin zu einer Inhibition von NFAT
Die NFAT-Aktivierung und Translokation in den Nukleus wird durch die Phosphatase Calcineurin
reguliert, indem sie durch Dephosphorylierung das nukleäre Translokationssignal von NFAT demaskiert. Die Phosphatase-Aktivität von Calcineurin ist in der Regel von einem TCR-abhängigen Ca2+ Einstrom und einer Komplexierung mit Calmodulin abhängig (Kiani et al., 2004). Desweiteren kommt
es nach TCR-Stimulation zu einer Aktivierung der CamKII, die spannungsabhängige Ca2+ -Kanäle reguliert und somit den Ca2+ -Einstrom verstärkt (Yao et al., 2006).
Unsere Untersuchungen zeigen, dass Carbimazol diese Prozesse unterbinden kann. Initial konnte beobachtet werden, dass Carbimazol die DNA-Bindung von NFAT im EMSA-Experiment bereits bei
geringen Konzentrationen hemmt. Dies könnte durch eine direkte Interaktion mit NFAT oder der DNABindungsdomäne vermittelt sein, indem die dreidimensionale Struktur von NFAT durch die starke oxidative Wirkung der Schwefelgruppe verändert wird (Kim et al., 2001). Dieser Wirkmechanismus wurde
für die strukturanalogen Thiobarbiturate überprüft und als unwahrscheinlich eingestuft (Humar et al.,
2004). Da Carbimazol und die Thiobarbiturate strukturell stark verwandt sind und sich ihre Wirkspektren überschneiden, erscheint dieser Wirkmechanismus auch für Carbimazol unwahrscheinlich.
Vielmehr konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass sich die Hemmung der NFAT-DNA-Bindung auf
eine Hemmung der Calcineurin abhängigen Dephosphorylierung von NFAT zurückführen lässt. Durch
die fehlende Dephosphorylierung wird das nukleäre Translokationssignal von NFAT nicht demaskiert
und folglich kann NFAT nicht in den Nukleus translozieren. Tatsächlich ließ sich NFAT in Anwesenheit von Carbimazol in nukleären Extrakten aktivierter T-Lymphozyten nicht nachweisen. Parallel
dazu wurde ebenfalls eine Inhibition der Autophosphorylierung der CamKII nachgewiesen. Diese Beobachtung lässt den Schluss zu, dass Carbimazol die Funktion von Calmodulin reprimiert, da sowohl
die Calcineurinaktivität als auch die CamKII-Autophosphorylierung von diesem Enzym abhängen.
Für einige heterozyklische Substanzen, z.B. Phenothiazine und Trifluoperazin, ist eine Inhibition der
Calmodulin-Funktion bereits nachgewiesen worden (Stavrovskaya et al, 2004). Eine Interaktion Carbimazols mit Cysteinseitenketten des Calmodulins über Ausbildung von Disulfidbrücken ist denkbar
(King, 1986; Tan, 1996). Strukturanalysen von Calmodulin zeigen, dass Cysteine an der Bildung eines EF-hand Motivs beteiligt sind und somit die durch Ca2+ induzierte Konformationsänderung des
Calmodulin beeinflussen. Inaktivierung dieser Cysteine durch Redoxreaktionen mit Schwefelgruppen
51
führt zu einer reduzierten Ca2+ -Bindung und damit zu einem verminderten Aktivierungspotential der
Calmodulin abhängigen Zielenzyme wie z.B. Calcineurin oder Phosphodiesterasen (Sokal et al., 2001).
Hingegen waren Propylthiouracil und Methimazol nicht in der Lage die Calcineurin vermitteltelte
NFAT-Dephosphorylierung, die Autophosphorylierung der CamKII und die nukleäre Translokation
von NFAT zu unterbinden. Dies steht im Widerspruch zu der Beobachtung, dass Propylthiouracil
die DNA-Bindung im EMSA-Experiment hemmen konnte, sowie die NFAT abhängige Reportergenexpression dosisabhängig reduzierte. Im Gegensatz zu AP-1 gibt es für NFAT keine Erkenntnisse über
eine Transkriptionsaktivierung durch posttranslationale Modifikation des Transkriptionsfaktors, die
nach der DNA-Bindung stattfindet (Wu et al., 2003). Dennoch scheinen Vorgänge im Zellkern durch
Propylthiouracil modifiziert zu werden, die die NFAT-Bindung regulieren, da NFAT in Anwesenheit
von Propylthiouracil in den Zellkern wandert. Der Mechanismus der Propylthiouracil vermittelten
Hemmung von NFAT ist nicht endgültig aufgeklärt. Offensichtlich inhibieren Carbimazol und Propylthiouracil über unterschiedliche Mechanismen die NFAT-abhängige Reportergenexpression.
4.6 Durch die Interaktion der NF-κB-, AP-1- und
NFAT-Signalkaskaden können inhibitorische Effekte verstärkt werden
In Anbetracht der fein abgestimmten und komplex regulierten Prozesse der Immunantwort müssen,
nach der Analyse der einzelnen Transkriptionsfaktoren, die Interaktionsmöglichkeiten der Signaltransduktionskaskaden diskutiert werden. Durch die Interaktion der
NF-κB-,
AP-1- und
NFAT-Signalkaskaden können inhibitorische Effekte verstärkt werden, denn erst die Interaktionen der
einzelnen Signaltransduktionskaskaden resultieren in der biologischen Auswirkung auf die Immunzelle.
Wie bereits im Zusammenhang mit dem IL-2 Promoter erwähnt, ist die kooperative Bindung der
Transkriptionsfaktoren NF-κB, AP-1 und NFAT eine wichtige Voraussetzung für eine geregelte
Transkriptionskontrolle. Vorallem AP-1 und NFAT binden an vielen Promotoren gemeinsam (Macian
et al., 2001). Zudem kann die p38 Map-Kinase NFAT direkt beeinflussen. Dies erfolgt über eine
p38 abhängige Aktivierung des NFAT-Promoters, Stabilisierung der NFAT-mRNA, Steigerung der
NFAT-Translation und einer Bindungsvermittlung mit Transkriptions-Koaktivatoren wie dem CREBbinding protein (CBP) (Avots et al., 1999; Wu et al., 2003). Eine Hemmung der p38 Map-Kinase
durch Thionamide könnte auch eine Aktivitätsminderung des Transkriptionsfaktors NFAT bewirken.
Die Signaltransduktion der Map-Kinasen-Kaskade ist auch für die
NF-κB-Aktivierung relevant,
so wird beispielsweise die IKK durch MEKK1 (MapERK Kinase Kinase) (Kwak 2000), MEKK3
(Hayden, Gosh, 2004)und NIK ( NF-κB inducing kinase)(Karin 2000) aktiviert.
52
Die Immunsuppressiva CsA und FK-506 führen neben einer Hemmung von NFAT zu einer reduzierten
NF-κB-DNA-Bindung. Dies weist darauf hin, dass die Calcineurin vermittelte Signaltransduktionskaskade sowohl NFAT als auch NF-κB beeinflussen kann (Yamamoto, Gaynor, 2001). CsA blockiert
die IκB-Degradation, wohingegen FK-506 die nukleäre Translokation von c-Rel, einem Mitglied
der NF-κB-Familie, verhindert. Somit wird die immunsuppressive Wirkung von CsA und FK-506
ebenfalls durch eine kooperative NFAT- und NF-κB-Inhibition erzielt.
4.7 Heterozyklische, schwefelhaltige Substanzen führen
strukturvermittelt zu einer Immunsuppression
Wir konnten in dieser Arbeit zeigen, dass die durch Thionamide induzierte Immunsuppression auf molekularen Mechanismen beruht. Zentrale Proteine der Immunantwort wie die IKK, die Map-Kinasen
und der Ca2+ -Sensor Calmodulin werden durch Thionamide gehemmt. Damit zeigen Thionamide ein
ähnliches Wirkspektrum wie die strukturanalogen Thiobarbiturate. Die Thionamide Carbimazol und
Propylthiouracil sind heterozyklische Substanzen mit einer assoziierten, biologisch reaktiven Schwefelgruppe. Die biologische Bedeutung dieser Schwefelgruppe wird durch Untersuchungen von Loop
et al. und Humar et al. verdeutlicht, die zeigten, dass im Gegensatz zu den Thiobarbituraten die
strukturanalogen Oxybarbiturate keinen nennenswerten Einfluss auf die immunrelevanten Transkriptionsfaktoren NF-κB und NFAT hatten (Loop et al., 2003; Humar et al., 2004). Zudem zeigt diese
Arbeit, dass das aromatische, wenig reaktive Thionamid Methimazol im Gegensatz zu Carbimazol die
Aktivität der Lymphozyten in vitro kaum beeinflusst. Carbimazol hat aufgrund einer weniger stabilen,
nicht aromatischen Struktur eine biologisch wesentlich reaktivere Schwefelgruppe.
Dennoch beobachtet man bei Patienten, die mit Methimazol behandelt werden, immunsuppressive
Effekte (Mizutani et al., 1999). Dies liegt vermutlich daran, dass Methimazol in vivo in der Leber
durch Oxidation der Schwefelgruppe aktiviert wird. Hier wandeln CYP-Monooxygenasen oder Flavinabhängige-Monooxygenasen Methimazol zu den reaktiven Zwischenprodukten Methyl-2-thiohydantoin
und N-methylthiourea um (Lee et al., 1978). Diese verursachten in GSH-depletierten Mäusen schwere,
toxische Leberschäden (Mizutani et al., 1999). Diese metabolische Aktivierung Methimazols konnte in
dem in dieser Arbeit verwendeten in vitro Versuchsaufbau in T-Zell Kulturen nicht vollzogen werden.
Eine immunmodulierende Wirkung der einzelnen Bestandteile des heterozyklischen Ringgerüsts (Imidazol, Thioharnstoff, Barbitursäure) oder der Seitenkette (Ethylcarbamat) der Thionamide wurde
in Transfektionsstudien mit Transkriptionsfaktor abhängigen Reportergenkonstrukten ausgeschlossen
(Ergebnisse nicht als Abbildung dargestellt).
4.8 Ausblick
Die sich ähnelnden Inhibitionsmuster der
NF-κB-,
AP-1- und NFAT-Signalkaskaden legen die
Möglichkeit der Hemmung eines weit proximal gelegenen Gliedes der T-Zell-Signalkaskade nahe. Die kleinen G-Proteine ras und raf, die Signale von Zellmembranrezeptoren an intrazelluläre
Signalmoleküle wie die Map-Kinasen und die IKK weiterleiten, und darüber hinaus mit der
Calcium/Calcineurin-abhängigen NFAT-Aktivierung interagieren, könnten einen potentiellen Angriffspunkt der heterozyklischen Schwefelharnstoffderivate darstellen. Für die strukturanalogen Thiobarbiturate ist eine Hemmung der G-Proteine bereits gezeigt worden (Humar et al., 2004). Weitere Untersuchungen an G-Proteinen könnten die vergleichbaren Effekte der Thionamide auf die drei Transkriptionsfaktoren erklären. Die gewonnenen Erkenntnisse über den Inhibitionsmechanismus heterozyklischer Thioderivate auf die Immunantwort in T-Zellen würden auch für die Entwicklung neuer
Pharmaka bzw. für die Ausweitung der Indikationsbereiche bereits zugelassener Therapeutika von
Bedeutung sein. Eine Ausweitung der Indikation für Thionamide wird bereits gefordert, da die immunsupprimierenden Effekte neue Therapiemöglichkeiten versprechen. So wurde die Anwendung von
Thionamiden auch für die Behandlung anderer Autoimmunerkrankungen wie z.B. dem Systemischen
Lupus erythematodes (SLE) erwogen (Singer et al., 1994). In Tiermodellen konnte gezeigt werden,
dass Thionamide SLE-Symptome wie Proteinurie in Folge von Immunkomplexablagerungen in der
Niere mildern (Mozes et al., 1998) und die Entstehung von Autoimmunkrankheiten durch Suppression von antigen-präsentierenden Zellen verhindern (Wang et al., 2003; Mozes et al., 1998). Diese
Beobachtungen veranlassten Goetz et al. im Frühjahr 2004 dazu, ein Patent auf die Verwendung von
Methimazol und zyklischen Thionen bei inflammatorischen Erkrankungen zu beantragen. Grundlage bildete die Erkenntnis, dass die Suppression von NF-κB durch Thionamide zu einer reduzierten
VCAM-1 Expression führt (Dagia et al., 2004). Desweiteren ergaben Analysen zur inhibitorischen
Potenz artifiziell synthetisierter Hemmstoffe der Glutaminyl Cyclase, dass Moleküle, bestehend aus
einem Thionamid und Thioharnstoff besonders effektiv sind (Buchholz et al., 2006). Abschließend
lässt sich auf Grundlage dieser Arbeit postulieren, dass heterozyklische, schwefelhaltige Substanzen
eine potentielle Hemmwirkung auf zentrale Schlüsselenzyme besitzen, welche essentielle Zellfunktionen
regulieren. Diese Erkenntnisse könnten für die Herstellung neuer Medikamente zur gezielten Inhibition von Enzymen, die bei der Immuntantwort oder entzündlichen Prozessen wichtige Funktionen
vermitteln, nützlich sein und neue Behandlungsmöglichkeiten erschliessen.
5 Zusammenfassung
Die Behandlung einer Hyperthyreose mit Thionamiden, einer Teilgruppe der Thyreostatika, ist mit
immunsupprimierenden und anti-inflammatorischen Effekten assoziiert. Voruntersuchungen zeigten,
dass strukturanaloge heterozyklische Thioderivate, die Thiobarbiturate, ebenfalls eine direkte immunsuppressive und anti-inflammatorische Wirkung vermitteln. Die Hypothese, dass heterozyklische
Thioverbindungen strukturbedingt potentiell eine immunsupprimierende Substanzklasse darstellen
können, wird mit der vorliegenden Arbeit gestützt: Sie erklärt die direkte immunsuppressive und antiinflammatorische Wirkung der Thionamide durch Inhibition der intrazellulären Induktion der Transkriptionsfaktoren NF-κB, AP-1 und NFAT. Untersuchungen an primären, humanen T-Lymphozyten
zeigen hemmende Effekte der heterozyklischen Thionamide auf NF-κB, AP-1 und NFAT-abhängige
transkriptionelle Vorgänge, wie die CD69-Expression, die IL-2, TNFα und IFNγ-Synthese. Dementsprechend wird eine Inhibition von NF-κB, AP-1 und NFAT-abhängigen Reportergenen und die
NF-κB, AP-1 und NFAT DNA-Bindung gezeigt. Die verminderte NF-κB DNA-Bindung und Gentransaktivierung konnte auf eine herabgesetzte Phosphorylierung und proteolytische Degradation von
IκBα zurück geführt werden. IκBα ist die inhibitorische Untereinheit des zytoplasmatischen NF-κBKomplexes. Ursächlich für die Inhibition des Transkriptionsfaktors AP-1 durch Thionamide ist eine
Hemmung der Aktivität der MAP-Kinasen ERK1/2, p38 und JNK. Die MAP-Kinasen ERK1/2, p38
und JNK aktivieren direkt AP-1 über Phosphorylierungsvorgänge. Die Aktivierung von NFAT wird
durch Carbimazol gehemmt, da es die Calcineurin/Calmodulin abhängige NFAT-Dephosphorylierung
und nukleäre Translokation von NFAT inhibiert. Das Inhibitionspotenzial der untersuchten Thionamide Carbimazol, Propylthiouracil und Methimazol korreliert mit der chemischen Reaktivität der
Schwefelgruppe der genannten Thionamide. Die Arbeit beschreibt und diskutiert anhand molekularer Angriffspunkte der Thionamide in der T-Zellsignalkaskade die direkte immunsuppressive Wirkung
heterozyklischer Schwefelharnstoffverbindungen. Sie bietet damit eine Erklärung für immunsupprimierende Effekte dieser Substanzen, z.B. die Remissionsinduktion der autoimmunen Hyperthyreose, und
eröffnet neue Ansatzpunkte für die Entwicklung anti-inflammatorischer Therapeutika und Immunsuppressiva.
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pathway in the treatment of inflammation and cancer.”J Clin Invest 107(2): 135-42.
7 Abkürzungsverzeichnis
Abb.
Abbildung
AP-1
Aktivatorprotein 1
ATP
Adenosintriphophat
APS
Ammoniumpersulfat
BSA
Bovines Serum Albumin
bzw.
beziehungsweise
◦C
Grad Celsius
ca.
circa
Ca2+
Kalzium
CaM
Calmodulin
CaMKII
Calmodulinkinase
cAMP
zyklisches Adenosinmonophosphat
CD
Cluster of differentiation
CD3+ -Zellen
CD3-positive-Zellen
Ci
Curie
CO2
Kohlendioxid
COX
Cyclooxigenase
CREB
cAMP Responsive Element Binding Protein
CsA
Cyclosporin A
DAG
Diazylglyzerin
ddH2 O
doppelt destiliertes Wasser
DNA
Desoxyribonucleic acid
EDTA
Ethylen-diamin-tetra-acetat
EGTA
Ethylenglykol-bisaminoethylether-N,N’Tetraessigsäure
ELISA
enzyme-linked immuno sorbent assay
64
EMSA
electrophoretic mobility shift assay
FACS
fluorescence-activated cell sorter
FCS
fetales Kälberserum
FK506
Makrolid Antibiotikum FK506
g
Gramm
GSH
Glutathion
GTP
h
Guanedintriphophat
Stunde
Hepes
N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2ethansulfat
HLA
Haupt-Histokompatibilitätskomplex
HSA
humanes Serumalbumin
IC50
halbmaximal inhibitorische Konzentration
IFN
Interferon
Ig
Immunglobulin
IKK
IκB Kinase
IL
Interleukin
IP3
1,4,5-Inositoltriphosphat
k
Kilo
l
Liter
LDH
Laktatdehydrogenase
m
milli
M
Molar
MAPK
mitogen aktivierende Proteinkinasen
µ
mikro
Min.
Minute
mRNA
messenger Ribonukleinsäure
n
nano
NFAT
nukleärer
Faktor
aktivierter
Lymphozyten
NF-κB
PBS
nukleärer Faktor-kappa B
phosphate buffered saline
PIP2
Phosphoinositolbiphosphat
PMA
Phorbol 12-Myristat 13-Acetat
PMBZ
periphere mononukleäre Blutzellen
T-
PP2B
Proteinphosphatase 2B
RT
Raumtemperatur
s.
siehe
Sek.
Sekunde
TEMED
N,N,N,N-Tetramethylethylendiamin
TH1-Zellen
T1-Helfer Zellen
TH2-Zellen
TNF
T2-Helfer Zellen
Tumornekrosefaktor
TRIS
Trimethylsilylsilan
T-Zellen
T-Lymphozyten
U
Units
U/Min.
Umdrehungen pro Minute
vergl.
vergleiche
z.B.
zum Beispiel
8 Danksagung
Meinem Doktorvater, Herrn PD Dr. med. René Schmidt, danke ich sehr für die Überlassung meines
Promotionsthemas und die Möglichkeit, bei ihm promovieren zu können.
Frau Professor Dr. Merfort danke ich für die freundliche Übernahme der Zweitkorrektur.
Frau Professor Dr. Heike Pahl danke ich als Leiterin der Abteilung für experimentelle Anästhesie.
Mein ganz besonderer Dank gilt Herrn Dr. Matjaz Humar für die hervorragende Betreuung dieser
Arbeit. Mit seiner fachlichen Expertise, weitreichenden Erfahrung und seiner unendlichen Geduld,
Sachverhalte zu erklären und zu diskutieren, hat er diese Arbeit maßgeblich unterstützt.
Herrn PD Dr. Torsten Loop und Philipp Stein danke ich für die technische Hilfe bei den EMSAs.
Ich danke den Mitarbeitern der Abteilung für ihre Hilfe und die vielen schönen gemeinsam verbrachten
Stunden.
Meinen Freunden und meiner Familie, im Besonderen meiner Mutter danke ich herzlich für die vorbehaltslose Unterstützung und Ermunterung während dem Verfassen dieser Arbeit sowie für die Durchsicht des Manuskripts.
Meinem Sohn Luis danke ich für die schöne Zeit, die er mich nicht an dieser Arbeit hat schreiben
lassen.
Besonderer Dank geht an meinen Mann Stefan, der mich immer bedingungslos unterstützt. Außerdem
sei ihm für den “technischen support” gedankt.
9 Lebenslauf
persönliche Daten
Geburtsdatum
14.07.1982
Geburtsort
Marburg
Familienstand
verheiratet, ein Kind (2 Jahre)
Staatsangehörigkeit
deutsch
Schulbildung
09/1988 - 06/1992
Geschwister-Scholl-Grundschule, Marburg
09/1992 - 05/2001
Gymnasium Philippinum, Marburg, Abschluss Abitur
08/1998 - 02/1999
Schulauslandsaufenthalt, Nashua, New Hampshire, USA
05/2001
Preisträgerin des Carl-Joachim-Friedrich-Preis für besondere Leistung in
sozialwissenschaftlichen Fächern und soziales Engagement in der Schule
68
Studium
09/2001 - 05/2009
Studium der Humanmedizin an der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
05/2002 - 05/2009
Stipendiatin der Stiftung der Deutschen Wirtschaft
09/2003
Ärztliche Vorprüfung, Gesamtnote “gut”
08/2007-06/2008
Praktisches Jahr:
St. Josefskrankenhaus, Freiburg im Breisgau/
Neurologische Universitätsklinik Freiburg im Breisgau
05/2009
Ärztliche Prüfung, Gesamtnote “gut”
Dissertation
07/2004-07/2009
Anfertigung dieser Arbeit in der Sektion Experimentelle Anästhesiologie,
Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
Thema: Thionamide hemmen die Transkriptionsfaktoren NF-κB, AP-1 und NFAT in T-Lymphozyten.
Doktorvater: PD Dr. med. R. Schmidt
Publikationen
Humar M, Dohrmann H, Stein P, Andriopoulos N, Goebel U, Heimrich B,Roesslein M, Schmidt R,
Schwer CI, Hoetzel A, Loop T, Geiger KK, Pahl HL, Pannen BH.
Repression of T-cell function by thionamides is mediated by inhibition of the activator protein-1/nuclear
factor of activated T-cells pathway and is associated with a common structure.
Mol Pharmacol. 2007 Dec;72(6):1647-56.
Humar M, Dohrmann H, Stein P, Andriopoulos N, Goebel U, Roesslein M, Schmidt R, Schwer CI,
Loop T, Geiger KK, Pahl HL, Pannen BH.
Thionamides inhibit the transcription factor nuclear factor-kappaB by suppression of Rac1 and inhibitor
of kappaB kinase alpha.
J Pharmacol Exp Ther. 2008 Mar;324(3):1037-44.
persönliche Kompetenzen
Weiterbildung
EKG-Kurs bei Prof. Zähringer, St. Josefskrankenhaus, Freiburg
(05-07/2007)
Fremdsprachen
Englisch (fließend), Latein (Latinum),
Spanisch und Französisch (Grundkenntnisse)
EDV
Microsoft office, LATEX, Linux
Soziales Engagement
stellvertretende Schulsprecherin (2000/2001)
Mitarbeit und Leitung im Deutschen Famulanten Austausch
(2002-2007)
Interessen
Skifahren, Basketball, Literatur, Reisen