Dokument_1. - OPUS Würzburg
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______________________________________________________________________ Aus dem Institut für Pathologie der Universität Würzburg Direktor: Professor Dr. med. H. K. Müller-Hermelink Apoptosemessungen bei Thymompatienten mit und ohne Myasthenia Gravis Inaugural - Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität zu Würzburg vorgelegt von Tobias Preisshofen aus Ravensburg Würzburg, Mai 2005 ______________________________________________________________________ Referent : Prof. Dr. med. Marx Koreferent : Prof. Dr. med. Rieckmann Dekan : Prof. Dr. med. Ertl Tag der mündlichen Prüfung : Der Promovend ist Arzt Meinen Eltern Heidi und Lutz gewidmet, als Dank für die Ermöglichung meines Studiums Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung _________________________________________________________ 1 1.1 Vorwort _____________________________________________________ 1 1.2 Fragestellungen und Zielsetzung der Arbeit _______________________ 6 2 Material und Methoden ______________________________________________ 7 2.1 Patientendaten und Gewebe ____________________________________ 7 2.2 Arbeitsgeräte und Hilfsmittel ___________________________________ 8 2.3 Lösungen ____________________________________________________ 9 2.4 Antikörper und Enzyme ______________________________________ 10 3 Methoden_________________________________________________________ 11 3.1 Thymus- und Thymomzellen ___________________________________ 11 3.1.1 Isolation von Lymphozyten aus Frischgewebe __________________ 11 3.1.2 Zellzahlbestimmung in der Neubauerzählkammer________________ 11 3.1.3 Einfrieren _______________________________________________ 12 3.1.4 Auftauen ________________________________________________ 12 3.1.5 FACS-Färbung ___________________________________________ 13 3.1.6 Fixation_________________________________________________ 13 3.1.7 TUNEL-Färbung _________________________________________ 14 3.2 FACS-Analysen______________________________________________ 16 3.2.1 Antikörperprofil __________________________________________ 18 3.2.2 Auswertung der Messdaten _________________________________ 18 3.3 Immunhistologie und Immunfluoreszenz_________________________ 21 3.3.1 Bilderfassungssystem ______________________________________ 21 3.3.2 Bildanalyse ______________________________________________ 22 3.3.3 Statistische Auswertung der Daten____________________________ 22 4 Ergebnisse ________________________________________________________ 23 4.1 Stabilität des Phänotyps_______________________________________ 23 4.1.1 Optimierung der Auftaumethode _____________________________ 23 4.1.2 Veränderung der Subpopulationen nach dem Auftauen____________ 25 4.1.3 Einfluss der Fixation und Permeabilisation auf die Subpopulationen _ 26 4.2 Unterschiede der einzelnen Reifungsstadien von Thymomen ________ 29 4.3 FACS-Apoptosemessungen ____________________________________ 31 4.4 Auswertung anhand der Farbdifferenzmethode ___________________ 37 4.5 TUNEL und DAPI-Immunfluoreszenz an Paraffinschnitten_________ 42 5 Diskussion ________________________________________________________ 43 5.1 Diskussion der Methodik ______________________________________ 43 5.1.1 Durchflusszytometrische TUNEL-Methode bei Thymozyten _______ 44 5.1.2 Immunhistochemische TUNEL-Methode bei Paraffinschnitten _____ 47 5.2 Untersuchung apoptotischer Thymozyten ________________________ 47 5.2.1 5.3 Diskussion der Reifungsstadien ______________________________ 48 Diskussion der Ergebnisse der Durchflusszytometrie und der Farbdifferenz-Methode zur Apoptose _________________________________ 49 6 Zusammenfassung _________________________________________________ 50 7 Anhang __________________________________________________________ 51 7.1 Eigene Publikationen _________________________________________ 51 7.2 Abbildungsverzeichnis ________________________________________ 52 7.3 Tabellenverzeichnis __________________________________________ 53 7.4 Literaturnachweis____________________________________________ 54 Abkürzungsverzeichnis CD cluster of differentiation DAPI 4',6-Diamidin-2-phenyl-indol DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure DP doppelt positive (CD4+CD8+) Thymozyten FACS fluorescence activated cellsorter FCS fötales Kälberserum FITC Fluoresceinisothiocyanat FL 1,2,3 Fluoreszenz 1,2,3 FSC forward scatter HP Humanplasma MG Myasthenia gravis MHC major histocompatibility complex NM Nanometer PBS phophate buffered saline PE Phycoerythrin RE Recent Thymic Emigrants RPMI Rosewell-Park-Memorial-Institute Medium RT Raumtemperatur SP single positive (CD4+CD8- oder CD4-CD8+)Thymozyten SSC side scatter TE Thymic Emigrants TdT terminale deoxynukleotidyl Transferase TRI Tricolor TUNEL Terminale Desoxynukleotidyltransferase mediated dUTP Nick End Label 1 1 1.1 Einleitung Vorwort Das Immunsystem des Menschen ist für die Abwehr gegen Bakterien, Viren und andere Eindringlinge verantwortlich. Es werden hierfür die allgemeine (angeborene) und die spezifische (erworbene) Immunantwort unterschieden. Die allgemeine Immunantwort besteht aus phagozytierenden Zellen (Makrophagen, Monozyten, Neutrophile), inflammatorischen Zellen (Mastzellen, Basophile, Eosinophile), und den natürlichen Killerzellen. Die spezifische (erworbene oder adaptive) Immunantwort wird über die Proliferation von Antigen-spezifischen B-und T-Lymphozyten vermittelt, wobei Ihnen das Antigen durch sogenannte spezialisierte Antigen präsentierende Zellen angeboten wird. Die BZellen werden nach Ihrer Differenzierung in verschiedene Subpopulationen unterteilt (Memoryzellen, Plasmazellen). Die Plasmazellen sezernieren antigenspezifische Antikörper, wodurch infizierte Zellen oder Mikroorganismen zerstört werden können. Bei den T-Lymphozyten werden als Hauptgruppen die zytotoxischen CD8+ T-Zellen und die CD4+ T-Zellen unterschieden. Die CD8+ T-Zellen erkennen Körperzellen , die mit Viren infiziert sind und töten diese ab, die CD4+ Zellen werden in Abhängigkeit von den Zytokinen, welche sie ausschütten, in TH1, TH2 und regulatorische T-Zellen eingeteilt (Janeway, Travers et al. 2002). Ein zentrales Element für die Entwicklung von T-Lymphozyten stellt der Thymus dar. Alle Immunzellen des menschlichen Körpers entwickeln sich aus einer pluripotenten Stammzelle in der fetalen Leber oder im Knochenmark. Die B-Zellen verbleiben bis zur Ausreifung im Knochenmark, während die T-Zellen ihre endgültige Reife im Thymus erlangen. (Delves and Roitt 2000). Im Laufe der T-Zell-Reifung im Thymus durchlaufen die T-Zellen verschiedene Entwicklungsstadien, worin sie sich durch Expression bestimmter T-Zell- 2 Oberflächenmarker unterscheiden lassen (Vanhecke, Leclercq et al. 1995). Abbildung 1 zeigt die Ausprägung der verschiedenen CD-Antigene der T-Zellen und die damit verbundene Zugehörigkeit zu einer Subpopulation. In der Thymusdrüse lernen die Lymphozyten körpereigene von körperfremden Antigenen zu unterscheiden. Dieser Vorgang erfolgt über zwei Schritte, die sogenannte positive und negative Selektion. Bei der positiven Selektion werden T-Zellen, die mit Ihrem T-Zellrezeptor körpereigene Haupthistokompatibilitätskomplexe (MHC) erkennen, selektioniert (Selbst-MHC- Restriktion). Somit wird in diesem ersten Schritt sichergestellt, dass alle reifen T-Zellen auf Fremdantigene antworten können, die von Selbst-MHC-Molekülen auf antigenpräsentierenden Zellen vorgezeigt werden. Ca. 95 % der Thymozyten überstehen diese positive Selektion nicht und sterben im Thymus ab (Surh and Sprent 1994; Delves and Roitt 2000). Als nächster Schritt folgt die negative Selektion, wobei hier diejenigen Lymphozyten, deren Rezeptoren eine zu hohe Affinität gegen körpereigene Peptide aufweisen, zerstört werden. In diesem zweiten Schritt werden somit autoreaktive T-Zellen eliminiert, und der Körper wird vor Angriffen durch das eigene Abwehrsystem bewahrt. Störungen in dem System der positiven und negativen Selektion können somit entweder zu einem Immundefektsyndrom mit Autoimmunkrankheit führen. inadäquater Immunantwort oder zu einer 3 SP-Immature CD4+ CD8CD3CD69CD1a+ CD27CD45RA- DP-Immature DP-prä-Selektion CD4+ CD8+ CD3CD69CD1a+ CD27CD45RA- CD4+ CD8+ CD3+ CD69CD1a+ CD27CD45RA- SP-Mature CD4+ CD8CD3+ CD69+ CD1aCD27+ CD45RA- Cortico-medulläre Grenzzone DP-post-Selektion Positive Selektion CD4+ CD8+ CD3+ CD69+ CD1a+ CD27CD45RA- Cortex Negative Selektion SP-thymic emigrant CD4+ CD8CD3+ CD69+ CD1aCD27+ CD45RA+ CD45RA+ Medulla Abbildung 1: Reifungstadien der Thymozyten in der menschlichen Thymusdrüse In den einzelnen Entwicklungsstadien der humanen Thymusdrüse exprimieren die Thymozyten jeweils spezifischen Oberflächenmarker (CD). Die einfach positiven Zellen (SP-Immature) entwickeln im Cortex der Thymusdrüse zunächst den Oberflächenmarker CD8 (DP=doppelt positive Zellen). Nach der Positiven Selektion wird unter den doppelt positiven Zellen (CD4+,CD8+) zusätzlich der Oberflächenmarker CD69 exprimiert (DP-post-Selektion). Nach der Negativen Selektion werden die einfach positiven Thymozyten (SP-Mature) durch das Vorhandensein von CD45RA unterschieden und sie verlassen als SP-thymic emigrant die Medulla des menschlichen Thymus SP: einfach positive Zellen (CD4 +), DP: doppelt positive Zellen (CD4+CD8+) (Darstellung verändert nach (Vanhecke, Leclercq et al. 1995)) 4 Ein klassisches Beispiel einer solchen Autoimmunkrankheit stellt die Myasthenia gravis (MG) dar. Dieser Krankheitsbegriff wurde 1895 von Jolly et al. geprägt und ist mit dem wesentlichen Merkmal einer raschen Ermüdbarkeit beschrieben worden. In zahlreichen Untersuchungen konnten in den Seren der Patienten Autoantikörper gegen den Acetylcholinrezeptor an der neuromuskulären Endplatte der quergestreiften Muskulatur nachgewiesen werden (Lindstrom, Shelton et al. 1988). Klinisch zeigt sich die MG als schwere generalisierte Muskelschwäche, die vor allem durch Beteiligung der Atemmuskulatur zu bedrohlichen Zuständen führen kann. Die Antikörperproduktion bei der MG ist ein T-Zell-abhängiger Prozess (Hohlfeld, Kalies et al. 1986), der wiederum insbesondere durch TH2-Zellen (T-Helferzellen) vermittelt wird (Marx, Wilisch et al. 1997). Bei der Mehrheit der Patienten mit MG (80-90%) geht die Krankheit mit pathologischen Thymusveränderungen einher, wobei die Art der Veränderungen mit klinischen und epidemiologischen Befunden assoziiert wird und eine äthiologische Bedeutung für diese Erkrankung besitzt (Marx, Wilisch et al. 1997). In Tabelle 1 werden folgende Thymusveränderungen unterschieden : Pathologische Häufigkeit innerhalb der Veränderungen MG-Patienten in % Rückbildung des Thymus 10-20 % (Atrophie) Entzündlich veränderter Thymus 70-80 % (Thymitis) Epithelialer Thymustumor (Thymom) Ca. 10 % Geschlecht / Alter Überwiegend Männer > 40 Jahre Überwiegend Frauen bis 40 Jahre Keine Geschlechtsprävalenz 30 70 Jahre Tabelle 1: Thymusveränderungen bei Myasthenia gravis (MG) (Vincent 2002). 5 Bei ca. 10% aller Patienten mit einer Myasthenia Gravis ist das Auftreten dieser Krankheit die Folge einer paraneoplastischen Manifestation von epithelialen Tumoren des Thymus (Thymome) (Müller-Hermelink, Engel et al. 2004). Thymome sind die einzigen Tumoren, die reife T-Zellen aus unreifen Vorläuferzellen produzieren können; diese Fähigkeit ist sehr wahrscheinlich auch ursächlich für die sehr häufig mit Thymomen assoziierten Autoimmunphänome. Tabelle 2 zeigt die histopathologische Einteilung von Thymomen nach der Klassifikation der Welt-Gesundheits-Organisation (WHO) (Müller-Hermelink, Engel et al. 2004) WHO-Typ Ältere, durch die WHO-Klassifikation abgelöste Synonyme A Medulläres Thymom AB Gemischtes Thymom B1 Prädominantes kortikales Thymom B2 Kortikales Thymom B3 Gut differenziertes thymisches Karzinom Thymuskarzinome Plattenepithelkarzinome Lymphoepitheliom-ähnliche Karzinome Sarkomatoide Karzinome etc. Tabelle 2: WHO-Klassifikation und Einteilung der Thymome nach WHO 2004 Bei der histopathologischen Einteilung können Thymome der WHO-Typen A, AB, und B1-3 als organotypische den nicht-organotypischen thymischen Karzinomen gegenübergestellt werden. Nur bei den organotypischen Thymomen sind wesentliche Eigenschaften des Thymus einschließlich der Fähigkeit zur T-Zell-Reifung erhalten. Praktisch alle Thymompatienten mit einer paraneoplastischen Myasthenia Gravis besitzen zudem nachweisbare Autoantikörper gegen Acetylcholinrezeptoren.. In Abhängigkeit von den untersuchten Patientenkollektiven sind einige Thymomsubtypen in bis zu 65 % der Fälle mit einer MG assoziiert (Okumura, Ohta et 6 al. 2002; Strobel, Bauer et al. 2004). Alle Myasthenie-assoziierten Thymome weisen als Gemeinsamkeit die Fähigkeit einer vollständigen T-Zell-Reifung in der Thymusdrüse auf und sind des weiteren in der Lage, die terminal reifen naiven T-Zellen in das periphere Blut zu exportieren (Hoffacker, Schultz et al. 2000; Buckley, Douek et al. 2001; Strobel, Helmreich et al. 2002). Ströbel et al. (2002) konnten in 22 Thymomen nachweisen, dass bei MG(-) Patienten im Vergleich zu MG(+) Patienten die Anzahl terminal reifer thymic emigrant CD45RA+CD4+ T-Zellen sowohl im Tumor als auch im peripheren Blut der Patienten deutlich vermindert waren. 1.2 Fragestellungen und Zielsetzung der Arbeit Vor dem Hintergrund, dass reife naive CD4+ T-Zellen in Thymomen mit großer Wahrscheinlichkeit an der Pathogenese der paraneoplastischen Myasthenia gravis beteiligt sind, wurden für diese Arbeit Apoptosemessungen der einzelnen Reifungsstadien der T-Zellen bei Thymompatienten mit MG und ohne MG durchgeführt. Basierend auf den Ergebnissen von Ströbel et al. 2002 (Strobel, Helmreich et al. 2002) soll in dieser Arbeit zunächst untersucht werden, in welchem Reifungsstadium die Entwicklung der CD4 T-Zellen bei Thymompatienten ohne MG gestört ist und ob MG(-) Thymome eine höhere Apoptoserate der T-Lymphozyten aufweisen als MG(+) Thymome. Da diese Störung in den späten T-Zell-Reifungsstadien zu vermuten ist, soll durch diese Untersuchungen die Frage beantwortet werden, ob die Myasthenia Gravis (MG) möglicherweise durch eine Störung der negativen Selektion verursacht wird. Durch die Apoptosemessungen soll weiterhin geklärt werden, ob der Verlust der terminalen Reifungsstufen in MG(-) Thymomen die Folge einer erhöhten Apoptoserate oder Folge eines vorzeitigen release unreifer T-Zellen in das periphere Blut im Sinne einer Schrankenstörung darstellt. Für die nachfolgenden Untersuchungen bei der Durchflusszytometrie wurden Lymphozyten aus Thymomgewebe mit und ohne MG miteinander verglichen. Aufgrund der Seltenheit dieser speziellen Untersuchungsgruppen konnte trotz der damit verbundenen technischen Probleme nur tiefgefrorenes Zellmaterial verwendet werden. 7 2 2.1 Material und Methoden Patientendaten und Gewebe Tabelle 3 zeigt eine Zusammenstellung der Patientendaten, deren T-Zellen für die Untersuchungen herangezogen wurden. Die Diagnose der MG beruhte auf klinischen Befunden, der Feststellung eines Dekrements bei einer Serienstimulation von 3 Hz elektromyographischen Untersuchungen, sowie auf der Bestimmung der Konzentration von Autoantikörpern gegen den nikotinischen Acetycholinrezeptor der motorischen Endplatte mittels eines Radioimmuno-Assays (Nenninger, Schultz et al. 1998). Die Thymome wurden entsprechend der WHO-Klassifikation eingeteilt (Müller-Hermelink, Engel et al. 2004). Es wurden ausschließlich Patientenfälle ohne Vorbehandlung mit Steroiden oder Immunsuppressiva verwendet. Pat.No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Case No 97/11704 97/4494 99/16725 02/21795 98/5633 00/28318 97/9669 00/25907 00/20223 99/3983 00/22717 99/13575 99/21994 01/4054 00/1495 00/1495 01/5447; H1492/01 98/5186 97/20308 00/3045; E00/16857 97/6335 MG Ja Ja Ja Ja Ja Ja Ja Ja Ja Ja Ja Ja Ja Nein Nein Nein Nein Nein Nein Nein Nein Alter 33 18 20 24 36 43 57 58 50 70 74 39 65 50 53 67 58 69 68 51 83 Geschl. m m w w m m w w w w w w m m w m m w w m w Diagnose Thymitis Thymitis Thymitis Thymitis AB AB AB B2 B2 B2 B2 B2 B2 AB AB AB B2 B2 B2 B2 B2 Die Diagnose der Thymome (AB, B2) richtet sich nach der WHO-Klassifikation 2004 m = männlich, w = weiblich Tabelle 3: Klinische Daten der untersuchten Thymom- und Thymitispatienten mit und ohne Myasthenia Gravis (MG) 8 2.2 Arbeitsgeräte und Hilfsmittel Für die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen wurden nachfolgende Arbeitsgeräte verwendet : Aquabidest-Anlage Milli-Q Plus PF Millipore Eismaschine Scotman AF-10 Genheimer, Hettstadt FACScan (488nm, Argonlaser) Becton Dickinson Lichtmikroskop 201529 Wilovert Lichtmikroskop Axioplan Zeiss, Oberkochen Fluoreszenzmikroskop Zeiss, Jena Lichtmikroskop 201529 Wilovert Pipettensatz Eppendorf Farbkamera NIKON, DXM 1200 Sterilbank Lamin Air Heraeus Vakuumpumpe VP 100 Two Stage Savant, Farmingdale, NY, USA Vortex Model g-560E Bender & Hobein AG Waage Satorius, Göttingen Wasserbad Kottermann, Labortechnik, Uetze-Hänigsen Zentrifuge Omnifuge 2.0 RS Heraeus, Sepatech, Osterode Tabelle 4: Verwendete Arbeitsgeräte 9 2.3 Lösungen Für die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen wurden nachfolgende Substanzen und Lösungen verwendet : CytofixTM 4% Paraformaldehyd Einfriermedium 80 % (v/v) FCS, 20 % (v/v) DMSO FACS-Puffer 0,5 % (w/v) BSA und 0,01 % Natriumazid in PBS gelöst PBS (10x) 72,0 g/l NaCl, 14,8 g/l Na2HPO4, 4,3 g/l KH2PO4 Perm/WashTM Saponin, FBS buffer TdT Terminale desoxynukleotidyl Transferase TRIS-Puffer Tris(hydroxymethyl)aminomethan Trypanblau-Lösung 5g/l Trypanblau, 9g/l NaCl gelöst in H2O Tabelle 5: Verwendete Lösungen 10 2.4 Antikörper und Enzyme In der nachfolgenden Tabelle 6 sind die verwendeten Antikörper und Enzyme für die durchflusszytometrischen Untersuchungen dargestellt. Antikörper Konjugat Spezies Verdünnung Bezugsquelle Maus IgG 1 FITC Isotyp 1:100 Sigma Maus IgG 1 PE Isotyp 1:200 Sigma Maus IgG 1 TRI Isotyp 1:100 Sigma Maus IgG 2a unkonjugiert Isotyp 1:200 Sigma Goat-anti-mouse TRI - 1:50 Sigma CD 3 PE Maus anti Human 1:50 Dako CD 3 TRI Maus anti Human 1:100 Dako CD 4 PE Maus anti Human 1:25 Sigma CD 4 TRI Maus anti Human 1:50 Sigma CD 8 PE Maus anti Human 1:100 Dako CD 8 TRI Maus anti Human 1:100 DAKO CD 27 unkonjugiert Maus anti Human 1:12,5 Sigma CD 45 RA PE Maus anti Human 1:50 Dianova CD 69 PE Maus anti Human 1:50 BD TUNEL FITC DNA-Markierung 50µl Roche DAPI - - - Eigene Herstellung Tabelle 6: Verwendete Antikörper und Enzyme Farbstoffe: FITC = Fluoresceinisothiocyanat, PE = Phycoerythrin, TRI = Tricolor, DAPI = 4',6-Diamidin-2-phenyl-indol, CD = Oberflächenmarker, DNA: Desoxyribonukleinsäure, IgG: Immunglobulin G 11 3 3.1 Methoden Thymus- und Thymomzellen Das Thymus und Thymommaterial wurde uns aus den Universitätskliniken Würzburg, Mainz und Regensburg in nativem Zustand zugesandt (in steriler 0,9% NaCl-Lösung und auf Eis gekühlt). 3.1.1 Isolation von Lymphozyten aus Frischgewebe Das native Thymomgewebe wurde von makroskopisch sichtbarem Fettgewebe und Blutgefässen befreit und in kleine Stückchen geschnitten. Anschließend wurden diese unter Zuhilfenahme eines Spritzenkolbens durch ein Stahlsieb gepresst, und die daraus resultierende Zellsuspension durch eine Ficoll-Dichtegradienten-Zentrifugation aufgereinigt. Etwa 0-15 ml Ficoll-Lösung (RT) wurden in ein Falcon-Röhrchen pippetiert und mit der maximal doppelten Menge einer Zellsuspension vorsichtig überschichtet und zentrifugiert (20 Minuten bei 1480 U/min, 20°C). Danach konnten die mononukleären Zellen (Thymozyten) als trüber Interphasering abpipettiert werden. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen (10min 1480 U/min), in RPMI + 3 % HP (Humanplasma) aufgenommen und auf Eis gestellt. 3.1.2 Zellzahlbestimmung in der Neubauerzählkammer Zur Bestimmung der Zellzahl wurden 10µl der Zellsuspension mit 90µl Trypanblau gemischt und in die Neubauerzählkammer pipettiert. Nach dem mikroskopischen Auszählen von 4 Großquadranten konnte der Zelltiter der Thymozyten anhand folgender Formel ermittelt werden : 12 (Zahl der gezählten Zellen) x 105 4 = Konzentration der Zellen pro Milliliter (ml) Der so ermittelte Wert stellt die Anzahl der Zellen pro Milliliter dar. 3.1.3 Einfrieren Die Thymuszellen wurden in RPMI + 5 % FCS auf Eis gekühlt und mit einem eisgekühlten Einfriermedium (80 % FCS + 20 % DMSO) 1:1 verdünnt. Danach wurden die Zellen mit verschiedenen Zellkonzentrationen von 2 x 106 bis 1 x 108 Zellen/ml in 2 ml Kryoröhrchen bei 80° C eingefroren. Nach 36 h wurden die Röhrchen in flüssigen Stickstoff überführt. 3.1.4 Auftauen Die Zellen wurden aus dem Stickstofftank genommen und im Wasserbad bei 37° C für ca. 2 Minuten aufgetaut. Danach wurde die Zellsuspension sofort vorsichtig in 10 ml ebenfalls auf 37° C vorgewärmtes PBS versetzt und 5 Minuten bei 1480 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und das Pellet mit einer Pipette und 10ml vorgewärmtem PBS behutsam resuspendiert. Die relativ starke Verklumpung, die auf den Auftauvorgang lysierter Zellen zurückzuführen ist, wurde abpipettiert, da es sich um ein nicht auflösbares Aggregat zerstörter Zellen und Epithelzelldetritus handelte. Dieser Vorgang wurde zweimal durchgeführt, so dass nach nochmaligem Zentrifugieren, Absaugen und Resuspendieren die Zellzahl im 1 ml PBS mit Hilfe der Neubauerzählkammer (siehe Abschnitt 3.1.2) nur 5 - 10 %, bezogen auf die Zahl der eingefrorenen Thymozyten, betrug. Die Anzahl der Lymphozyten konnte durch einige Modifikationen optimiert werden (siehe 4.1.1). 13 3.1.5 FACS-Färbung Für die jeweiligen Färbungen der Oberflächenmarker wurden 1x105 bis 2x105 Zellen in einem Volumen von 100 µl FACS- Puffer aufgenommen und mit 10µl der speziellen Antikörperverdünnung vermischt und für 15 Minuten im Dunkeln auf Eis inkubiert. Anschließend wurden nicht gebundene Antikörper durch einen Waschschritt entfernt. Dazu wurden 2ml FACS Puffer zu jedem Ansatz pipettiert, gevortext, und für 5 Minuten bei 1500 U/min und 4 °C zentrifugiert. Nach vorsichtigem Absaugen des Überstandes war das Sediment für den nächsten Färbevorgang bereit. Als Negativkontrollen wurden die entsprechenden Zellen mit den Isotypen der verwendeten Antikörper gefärbt. Da bei den Färbevorgängen der erste mit FITC-konjugierte Kanal durch die später folgende TUNEL-Färbung benötigt wurde, wurde mit denjenigen direkt konjugierten Antikörpern begonnen, die PE bzw. TRI-konjugiert waren. Die Antikörper wurden bei den Mehrfachfärbungen im selben Arbeitsschritt zu den Zellen hinzugefügt. Bei den Ansätzen, bei welchen ein unkonjugierter Antikörper zum Einsatz kam, wurden die Proben als erstes mit diesem konjugiert (CD 27). Danach wurde ein gegen den ersten gerichteten farbkonjugierter Antikörper (Goat-anti-Maus TRI konjugiert) der Probe zugegeben, und wiederum 15 Minuten auf Eis im Dunkeln inkubiert. Danach wurde den Proben mit unkonjugiertem Antikörper ein Maus-IgG-Antikörper als Blocker hinzugegeben. Nach nochmaliger Inkubation von 15 Minuten im Dunkeln auf Eis, folgte ein Waschschritt mit 2ml FACS Puffer, sowie die Färbung mit den restlichen direktfärbenden Antikörpern (siehe oben). 3.1.6 Fixation Nach dem letzten Waschschritt wurden zu jeder Probe jeweils 200 µl Cytofix pipettiert und 20 Minuten bei 4°C im Dunkeln inkubiert. Das CytofixTM diente der Fixierung und der Stabilisierung der Zellmembran Inkubationsschritte (siehe 3.1.7). der Thymozyten für die nächsten 14 Um das für die Zellen toxische Cytofix zu entfernen wurden die verschiedenen Proben mit jeweils 2ml Perm/WashTMbuffer (Detergens) gewaschen (1480 U/min, 4°C) und der Überstand mit einer Pipette abgesaugt. Dieser Vorgang wurde zweimal sorgfältig durchgeführt, um sicherzugehen, dass das CytofixTM gründlich entfernt wurde. 3.1.7 TUNEL-Färbung Das In Situ Cell Death Detektion Kit Fluorescein von Roche beinhaltet mehrere caps mit einer 50 µl Enzym-Lösung, die zum einen die TdT (Terminalen desoxynukleotidyl Transferase) und zum anderen die 550 µl Lösung mit markierten FITC gekoppelten Nukleotiden enthält. Die bei 25 °C aufbewahrten Lösungen werden vor jeder Versuchsreihe neu aufgetaut. Von der 550 µl Markierungslösung werden 450 µl abpipettiert und mit der 50 µl TdT-Lösung gemischt. Die restlichen 100 µl der Markierungslösung dienten den Negativkontrollen, die bei jeder Versuchsreihe zweimal mitgeführt wurden. Die bereits gefärbten und fixierten, in jeweils 100 µl Perm/WashTMbuffer befindlichen Zellen wurden nun mit 50 µl der jetzt neugemischten Lösung (TdT + markierte Nukleotide) pipettiert und für 30 Minuten bei 37 °C im Brutschrank inkubiert. Anschließend wurden die Zellen wiederum zweimal mit Perm/WashTMbuffer gewaschen (siehe oben) und in 100-200 µl FACS-Puffer überführt. Die für jede Versuchsreihe mitgeführte Positivkontrolle wurde ebenso mit CytofixTM behandelt und zusätzlich mit 10 µl DNAse versetzt und 20 Minuten inkubiert.Unmittelbar danach schloss sich die Analyse der Thymozyten mit Hilfe des FACScanTM an. Die einzelnen Zellen der Proben 1-6, sowie die Positiv-, und Negativkontrollen (siehe Versuchsprotokoll) befanden sich in einem Volumen von 50200 µl FACS Puffer. 15 Fluorescein markierte dUTP DNA-Fragment ( nicks ) TdT Abbildung 2: Prinzip der TUNEL-Färbung Das freie 3`OH-Ende der DNA-Fragmente (nicks) wird mit FITC-markierten Nukleotiden (dUTP) in Anwesenheit der terminalen Desoxyribonukleotidyltransferase (TdT) gekennzeichnet 16 3.2 FACS-Analysen In FACS-Röhrchen verteilt wurden die einzelnen Proben mit dem FACScanTM der Firma Becton und Dickinson aufgezeichnet. Dieses Gerät ist mit einem Argon-Laser (488 nm, 15 mW) ausgestattet und arbeitet mit der Lysis 2 -Software. Um die einzelnen Fluoreszenzen auf dem Monitor übersichtlich darzustellen, wurden insgesamt 7 verschiedene Diagramme als Dot plot (FSC-SSC, FL-1-FL-2, FL-1-FL-3, FL-2-FL-3) und als Histogramm (FL-1, FL-2, FL-3) gewählt. Die Aufnahmegeräteeinstellung des zweiten und dritten Fluoreszenzkanals erfolgte wie bei einer normalen Antikörperfärbung. Vor dem Einlesen der Proben wurde mit Hilfe der Isotypen und Kompensationsproben (siehe Versuchsprotokoll, Tabelle 4) anhand der Histogramme ein sogenannter Nullabgleich durchgeführt, so dass im Histogramm der jeweiligen Färbung die Thymozyten im Bereich von 101 der logarhythmischen Skala abgebildet waren. Für den ersten Fluoreszenzkanal wurden zuerst die Kontrollproben (1 Positiv-Kontrolle und 2 Negativ-Kontrollen) eingelesen, anhand derer bei der Auswertung mit PC-Lysis2TM die Marker gesetzt wurden. Danach wurden bei langsamer Durchflussgeschwindigkeit alle events aufgenommen, bis etwa 20 000 Zellen gezählt wurden. Um bei der Messung die größeren Zellfragmente und Verunreinigungen auszuschließen, wurde als Schwelle (Threshold) ein Wert von 60 eingestellt. Ein Gate wurde bei den Messungen nicht verwendet. 17 Proben 1.Antikörper 2. Antikörper 3.Antikörper Negativkontrolle - - - Isotyp Ig-G1-FITC IgG-1-PE IgG1-TRI Isotyp IgG-2a-unkonjugiert - G.a.M.-TRI Kompensation CD3-FITC - - Kompensation - CD3-PE - Kompensation - - CD3-TRI Probe 1 TUNEL CD4-PE CD8-TRI Probe 2 TUNEL CD4-PE CD3-TRI Probe 3 TUNEL CD69-PE CD3-TRI CD27 unkonjugiert Probe 4 TUNEL CD4-PE + G.a.M + Blocker CD27 unkonjugiert Probe 5 TUNEL CD8-PE + G.a.M + Blocker Probe 6 TUNEL CD45-RA CD4-TRI Probe 7 TUNEL CD45-RA CD8-TRI Positiv-Kontrolle TUNEL + 10µl DNAse - Negativ-Kontrolle TUNEL - - Negativ-Kontrolle TUNEL - - Farbstoffe: FITC = Fluoresceinisothiocyanat, PE = Phycoerythrin, TRI = Tricolor, G.a.M.: Goat-anti Maus, CD: Oberflächenmarker, DNAse: Enzym zur DNA Spaltung Tabelle 7: Versuchsprotokoll für TUNEL-Apoptosemessung 18 3.2.1 Antikörperprofil Die verwendeten Antikörper dienen der Erfassung der verschiedenen Reifestadien von Thymozyten. Zur Überprüfung dieser Reifestadien wurden Antikörper gegen folgende Antigene verwendet CD4 (Vanhecke, Verhasselt et al. 1995) CD8 (Vanhecke, Verhasselt et al. 1995) CD3 (Vanhecke, Leclercq et al. 1995) CD45 RA (Vanhecke, Leclercq et al. 1995) CD27 (Camerini, Walz et al. 1991; Vanhecke, Leclercq et al. 1995) CD69 (Vanhecke, Leclercq et al. 1995) 3.2.2 Auswertung der Messdaten Die Messdaten der Antikörpermessungen und der Apoptosemessungen wurden unter Zuhilfenahme eines PCs mit PC-LysisTM Software Version1.1 ausgewertet. Zuerst wurde ein Dot plot Fenster der FL3 (y-Achse) und FL2 (x-Achse) dargestellt und darin 4 verschiedene Gates entsprechend den jeweiligen Färbungen bestimmt (siehe Abbildung 3). Um die Apoptose mittels TUNEL im ersten Fluoreszenzkanal bestimmen zu können, war es notwendig, in jedem Histogramm einen definierten Marker (M1) für jedes Gate (R1-R4) zu setzen, ab welchem die Zellen als apoptotisch zu bezeichnen sind. Um diesen Marker für Fluoreszenz 1 möglichst objektiv zu bestimmen, wurde hierbei als Markerbeginn der Schnittpunkt der Negativkontrollen mit der Positivkontrolle gewählt. Jetzt wurden Fluoreszenz 1 aus den Gates R1-R4 zur besseren Übersicht in Histogrammen dargestellt, in welchen die Marker für Apoptose (M1) schon definiert waren. 19 Abbildung 3: Contour blot einer CD45 (FL-2) und CD8 (FL-3) Färbung Nachdem die Thymozyten anhand des Versuchsprotokolls markiert wurden, konnten sie in einem Contourblot entsprechend Ihrer Färbung im Fluoreszenzkanal (FL-3-FL-2) dargestellt werden. Die der Färbung entsprechend gesetzten Gates R1, R2, R3 und R4 beinhalten alle darin enthaltenen Zellen. Die Thymozyten stammen von einem cortikalen Thymom mit Myasthenia Gravis (MG) (00/20223) R1 = doppelt negative Zellen (CD45-, CD8-) R2 = einfach positive Zellen (CD45-, CD8+) R3 = doppelt positive Zellen (CD45+, CD8+) R4 = einfach positive Zellen (CD45+, CD8-) 20 Abbildung 4: Histogramm bei Aufnahme der Apoptosefärbung mit TUNEL Der Marker wurde am Schnittpunkt der Positivkontrolle mit der Negativkontrolle gesetzt. Abbildung 5: Darstellung der Apoptoseauswertung anhand von H istogram men Darstellung einer TUNEL-Färbung in FL-1. Die Histogramm e zeigen eine TUNEL-Färbung in FL1 m it definierten Gates R1-R4, die anhand eines Dotplots von FL2/FL3 gesetzt wurden. Der definierte M arker (M 1) wurde anhand des Schnittpunktes der Positivkontrolle (siehe Abbildung 4) m it der Negativkontrolle gesetzt. 21 3.3 Immunhistologie und Immunfluoreszenz Gemäß der Gebrauchsanleitung des In Situ Cell Death Detektion Kit Fluorescein von Roche wurde anhand von Paraffinschnitten eine TUNEL-Färbung durchgeführt. Diese Schnitte wurden danach mit einem Mikroskop einer digitalen Farbkamera aufgenommen und ausgewertet (siehe 3.3.1) Zusätzlich wurde bei manchen Paraffinschnitten noch eine Zellkernfärbung mit einer DAPI-Lösung (4',6-Diamidin-2-phenyl-indol) durchgeführt. Dazu wurden die Schnitte nach der Fixation durch Formaldehyd (10 Minuten bei RT) und Permeabilisation mit 0,2 % Triton X-100 in PBS(10 Minuten bei RT) mit 50µl einer DAPI-Färbelösung überschichtet und 45 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Danach folgte direkt die TUNEL-Färbung und die gefärbten Schnitte wurden danach mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop (Zeiss) bei einer Wellenlänge von 515-565 nm aufgenommen. Bei der Analyse der Bilder (siehe 3.3.2) konnte somit anhand der Überschneidung der TUNEL-Färbung mit der Zellkernfärbung bestimmt werden, welche Lymphozyten Apoptose aufweisen. 3.3.1 Bilderfassungssystem Die mit TUNEL-gefärbten corticalen Thymompräparate wurden in einem Mikroskop (Axioplan, Zeiss, Oberkochen) mit einer digitalen Farbkamera (Nikon, DXM 1200) erfasst und im Computer auf CD-ROMS gespeichert. Dem Betrachter waren jedoch zum Zeitpunkt der Untersuchung Einzelheiten der Präparate (MG(+), MG(-), Thymom oder Thymitis) nicht bekannt. Jeder der drei Farbkanäle (rot, grün, blau) hatte einen Dynamikbereich von acht bit (Wertebereich 0-255). Als Objektiv diente ein Ultrafluar (10x) mit einer numerischen Apertur (NA) von 0,2 und ein Kondensor mit einer maximalen NA von 0,63. Zur Beleuchtung wurde eine Halogenlampe (100 Watt) mit variabler Spannung verwendet. 22 Die digitalisierten Bildszenen hatten eine Größe von 2048 x 2560 Bildpunkten und in jeder Bildszene wurde eine Fläche von 1,295 mm2 auf dem Objektträger erfasst. 3.3.2 Bildanalyse Die zur Analyse der Bilder notwendigen Algorhythmen waren in FORTRAN programmiert. Die gescannten Bildszenen wurden auf der Workstation mit Hilfe einer Farbanalyse auf die verschiedenen Komponenten im gefärbten Schnitt untersucht. Die angewendete Farbdifferenz-Methode zur Zellsegmentierung wurde für die verschiedenen Arten von Farben entwickelt und hier in angepasster Form für die TUNEL-Färbung der Thymompräparate benutzt. Als erstes wurden die hellsten Stellen im Präparat ermittelt und dienten als Referenz (Weißpunkt) für die weiteren Farbanalysen. Alle Bildpunkte, die sich nur wenig von dem Weißpunkt unterschieden, gehörten zu Fettzellen oder waren zell- und gewebefreie Gebiete. Die Braunfärbung der Apoptosezellen unterschieden sich folglich in den drei Farbkanälen von dem umgebenen Gewebe, wobei ein Bildpunkt nur dann zu einer Apoptosezelle gehörte, wenn der Wert im Rotkanal um einen definierten Betrag (15-20) höher lag, als der im Grünkanal, und der Blauanteil eine ermittelte Schwelle nicht überschritt (Devijer). Anhand dieser vorgegebenen Definitionen wurden die apoptotischen Zellen bezogen auf nicht-gefärbte ( blaue ) Thymozytenzellkerne prozentual berechnet. 3.3.3 Statistische Auswertung der Daten Alle einzelnen statistischen Signifikanzen wurden mit Hilfe des Man-Whitney-U -Test (p < 0.05 falls nicht anders angegeben) und Chi-Square ermittelt. Die Signifikanzenanalysen wurden mit dem Computerprogramm SPSS (Version 2000, SPSS Inc., Chicago) geprüft. 23 4 4.1 Ergebnisse Stabilität des Phänotyps Für die FACS-Untersuchungen konnte aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit und der Seltenheit der Erkrankung ausschließlich in flüssigem Stickstoff asserviertes Material herangezogen werden. Dieses Material stammt aus einer Sammlung, die über Jahre hinweg aufgebaut wurde. Bei dieser Sammlung gehörte es zur Routinediagnostik, dass Lymphozyten von jedem Frischmaterial (Thymom und Thymitis) anhand eines Standardprotokolls gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert wurden. Anhand von Auswertungen dieser Standardprotokolle konnten somit die Messergebnisse zwischen Frischgewebe und aufgetautem Gewebe bezüglich der Stabilität des Phänotyps verglichen werden. Es sollte geklärt werden, ob sich der Immunphänotyp der aufgetauten Zellen in Bezug auf die Oberflächenmarker der einzelnen Reifungsstadien in irgendeiner Weise von Frischmaterial unterscheidet. Um diesen Sachverhalt zu klären, werden die dazu notwendigen Experimente und Ergebnisse geschildert. 4.1.1 Optimierung der Auftaumethode Die standardisierte Einfriermethode der Thymozytensuspensionen in Kryoröhrchen erfolgte immer in einer Zellzahlkonzentration von 2x106-1x108 Zellen /ml. Bei Beginn einer jeden Versuchsreihe wurden die Lymphozyten aus dem Stickstofftank herausgeholt und in einem Wasserbad bei 37 °C schnell erwärmt. Sobald sich der Inhalt verflüssigte (ca. 50 Sekunden), wurden die Thymozyten in ein 15 ml Falconröhrchen pipettiert, welches mit 15 ml eisgekühltem FACS-Puffer gefüllt war. Das Ziel dieser Auftaumethode war es, das auf die Zellen toxisch wirkende DMSO möglichst schnell zu verdünnen. Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand abgesaugt und das pellet wieder mit 15 ml eisgekühltem FACS-Puffer vorsichtig resuspendiert. Während dieses Vorganges konnte regelmäßig eine starke Verklumpung beobachtet werden, die auf eine Verklebung der Thymozyten mit der DNA von abgestorbenen und 24 lysierten Zellen zurückzuführen ist. Diese Zellaggregate wurden daraufhin abpipettiert, nach nochmaligem Zentrifugieren in 1 - 1,5 ml FACS-Puffer aufgenommen und die Zellzahl in der Neubauerzählkammer ermittelt (siehe 3.1.2). Die Zellausbeute, bezogen auf die Anzahl der anfangs eingefrorenen Thymozyten betrug im Durchschnitt nur 1-10% der ursprünglich eingefrorenen Zellpopulation. Da für die optimale Durchführung der Versuchsreihe eine Zellzahl von 2x105 Zellen je einzelne Probe notwendig war, musste diese Auftaumethode modifiziert und optimiert werden, um einen derart großen Verlust von Zellen so gering wie möglich zu halten. Im Verlauf der Versuchsreihen stellte sich heraus, dass die Einflussgrößen Temperatur des FACS-Puffers und Art des Auftaumediums eine große Rolle spielen im Bezug auf die Zellausbeute und Verklumpung der Lymphozyten. Bei einigen Versuchsreihen wurden jeweils zwei identische Proben des gleichen Ursprungsgewebe unter verschiedenen Auftaubedingungen aufgetaut, wodurch sich hinsichtlich der Zellausbeute deutliche Unterschiede aufzeigten. Es resultierte eine enorme Erhöhung der Zellausbeute, sobald die Mediumtemperatur von 4 °C auf 36 °C gesteigert wurde, unabhängig davon, welches Medium benutzt wurde. Eine weitere Steigerung der Zellzahl erbrachte die Erhöhung des prozentualen Anteils des FCS im FACS-Puffer. Als optimales Auftaumedium erwies sich im Parallelversuch zur herkömmlichen Methode die Verwendung von RPMI mit 10 % FCS als Auftaumedium. Demzufolge wurde für die folgenden Experimente das Auftauverfahren zu Gunsten der modifizierten Methode geändert. Die Kryoröhrchen wurden somit nach dem Übergang in die flüssige Phase in einem 15 ml Falconröhrchen mit im Wasserbad auf 36 °C vorgewärmten RPMI + 10 % FCS aufgenommen und mit einer Pipette vorsichtig vermischt und zentrifugiert. Nach dem Absaugen des Überstandes und dem Resuspendieren mit ebenfalls auf 37 °C vorgewärmtem Medium waren immer noch kleinere Zellklümpchen zu erkennen, die danach sofort entfernt wurden, um eine weitere Aggregation von Lymphozyten zu vermeiden. Das weitere Vorgehen entsprach dem zuvor beschriebenen Prozess mit Zentrifugieren, Absaugen und Zählen in der Neubauerzählkammer. Durch diese Optimierung konnte bei allen Gewebetypen eine Steigerung der durchschnittlichen Zellausbeute bis um den Faktor 10 gegenüber der herkömmlichen Methode erreicht werden. 25 4.1.2 Veränderung der Subpopulationen nach dem Auftauen Um Veränderungen in den Subpopulationen von aufgetauten Zellen im Vergleich zu Nativzellen erkennen zu können, wurden durchflusszytometrische Messungen an frisch aus dem Gewebe isolierten Thymozyten durchgeführt, und mit denjenigen nach dem Auftauen aus demselben Ursprungsgewebe verglichen. Hierzu Standardfärbungen CD4, CD8, CD45, und CD69 im FACScan wurden die analysiert und im Dotplot und Histogramm miteinander verglichen. Hier konnte gezeigt werden, dass sich die einzelnen Subpopulationen sowohl im nativen Zustand, als auch nach dem Auftauvorgang gut darstellen ließen und dass das eingefrorene Material durchaus ein gleiches Färbeverhalten in den einzelnen Subpopulationen aufweist. Somit ergeben sich durch die Prozedur des Einfrierens und anschließenden Auftauens zumindest keine schwerwiegenden Veränderungen in Bezug auf die quantitative Zusammensetzung der untersuchten Zellpopulationen. Folgende Patientenproben wurden jeweils im Nativzustand und nach dem Auftauen hinsichtlich Ihrer Anfärbbarkeit untersucht Pat.No Typ MG 97/4494 Thymitis Ja 00/1495 AB Nein 98/5186 B2 Nein 00/16857 B2 Nein 99/21994 B2 Ja 99/13575 B2 Ja Tabelle 8: Untersuchte Patientendaten mit und ohne Myasthenia Gravis (MG) 26 CD8-TRI CD8-TRI CD4-PE CD4-PE CD4-PE CD4-PE CD27-TRI CD27-TRI Abbildung 6: Dotplotdarstellung von Thymozyten Auswirkungen des Einfrier- und Auftauvorganges von Thymozyten in Bezug auf die Darstellung der Oberflächenmarker CD4, CD8 und CD27. Im Vergleich dazu native Thymozyten aus demselben Ursprungsgewebe bei Myasthenia Gravis (MG). 4.1.3 Einfluss der Fixation und Permeabilisation auf die Subpopulationen Aufgrund der Versuchsanordnung und der darin verwendeten intrazellulären DNAMarkierung durch das TUNEL-Reagenz mussten die Proben 1-7 (siehe Versuchsprotokoll 3.2) nach der Oberflächenmarkierung zuerst mit CytofixTM fixiert und anschließend mit Perm/WashTM-buffer permeabilisiert werden. Wegen einer Zerstörung der Oberflächenstruktur durch das Paraformaldehyd und infolgedessen einer Veränderung des Färbeverhaltens der Lymphozyten wurden zu Beginn der Versuchsreihen Parallelproben mitgeführt, die ohne CytofixTM behandelt wurden. Nach 27 der Analyse im FACScan® wurden die Zellen in einem Dotplot-Diagramm miteinander verglichen. Bei der Durchflusszytometrie stehen als Maß für die Größe der Parameter forward scatter (FSC) und für die Granularität der Parameter side scatter (SSC) zur Verfügung. Die Thymozyten stellen sich in einem Diagramm, bei welchem FSC gegen SSC aufgetragen wird, als zwei Populationen dar: eine Population mit geringer Zellgröße und eine mit größeren Zellen bei etwa gleicher Granularität (siehe Abbildung). Hier ist bei fast allen Proben zu erkennen, dass durch die Behandlung mit CytofixTM und Perm/WashTM-buffer eine Vergrößerung der Thymozytenpopulation mit geringer Zellgröße und etwa gleicher Granularität stattfindet (siehe Abbildung 7). Zur Quantifizierung dieser Population wurde im Dotplot-Diagramm der nicht fixierten Zellen ein definiertes Gate R3 gesetzt. Die mit CytofixTM behandelten Zellen wurden nun in dem gleichen Diagramm mit vorher festgelegtem Gate R3 dargestellt und die darin enthaltenen Zellen prozentual miteinander verglichen. Bei allen 10 untersuchten Patientenproben entsprach die prozentuale Zunahme dieser Subpopulation, bei welcher es sich wahrscheinlich um lysierte Zellen und Zelldetritus handelt, einem Betrag < 5 % bezogen auf alle aufgenommenen Zellen. 28 Abbildung 7: Einfluss der Fixation und Permeabilisation auf die Größe (FSC) und Granularität (SSC) der Thymozyten A-C: Thymozyten ohne Behandlung mit CytofixTM und Perm/WashTM A1-C1: Thymozyten nach 20 Minuten Inkubation in CytofixTM und anschließendem zweimaligem Waschen mit Perm/WashTMbuffer Definiertes Gate mit prozentual dargestellter Vermehrung in R3: diesem Gate bezogen auf die Gesamtzahl der Zellen 29 4.2 Unterschiede der einzelnen Reifungsstadien von Thymomen Bei den Untersuchungen bezüglich der speziellen T-Zellreifung von Thymozyten konnte gezeigt werden, dass es hinsichtlich der einzelnen Reifungsstadien deutliche Unterschiede innerhalb der MG(+) und MG(-) Thymome gibt. Im Vergleich mit den MG(+) Thymomen kommt es bei allen MG(-) Thymomen zu einem quantitativen Zellverlust innerhalb der Subpopulation der CD4+CD45RA+ Zellen (Strobel, Helmreich et al. 2002; Strobel, Preisshofen et al. 2003). Zusätzlich konnten auch noch unterschiedliche Reifungsstörungen in den einzelnen Thymom-Subtypen nachgewiesen werden. So kommt es bei den Typ AB Thymomen offenbar während der positiven Selektion (Acquisition von CD69) zu einem deutlichen quantitativen Zellverlust, während die T-Zell-Reifung bei den corticalen Thymomen im Vergleich zu Normalthymi keine signifikanten Veränderungen aufwies (Abb. 8). Interessanterweise zeigten MG(-) Typ B einen besonders deutlichen Verlust von CD27+ (CD45RA+/-) TZellen (Vanhecke, Verhasselt et al. 1997). 30 Positive Sel. CD4im Negative Sel. DP 1 DP 2 DP 3 CD4m RE CD3- CD3+ CD69+ CD27+ CD45RA+ 40 30 % 20 10 0 Thymus AB MG(+) AB MG(-) B MG(+) B MG(-) Abbildung 8 : Vergleich der Reifungsdaten von Thymozyten bei Normalthymus sowie WHO Typ AB und B Thymomen Diese Reifungsdaten lassen einen deutlichen Unterschied der prozentualen Anzahl der verschiedenen Zellpopulationen nach der positiven Selektion zwischen Thymomen mit und ohne Myasthenia Gravis (MG) erkennen. Vor allem bei den MG(-) kortikalen Thymomen B MG(-) sind die Subpopulationen CD4 mature (CD4m, gelb) und Recent Emigrants (RE, grün) mit dem dafür spezifischen Oberflächenmarker CD27 und CD45RA deutlich vermindert. (Darstellung verändert nach Ströbel, Preisshofen et al. 2003) 31 4.3 FACS-Apoptosemessungen Die unterschiedlichen Reifungsstörungen der einzelnen Thymomsubtypen und der damit verbundene Verlust von Lymphozyten in den letzten Reifungsstadien geht von einer erhöhten Apoptoseaktivität im Laufe der T-Zellreifung im Thymus aus. Um dem Hauptziel dieser Arbeit, der immunphänotypischen Charakterisierung der Thymozyten und Bestimmung ihrer Apoptoseaktivität in den einzelnen Reifungstadien näher zu kommen, musste eine Methode gefunden werden, die Apoptoserate jeder Subpopulation quantitativ zu bestimmen. Mit Hilfe der zur Verfügung stehenden Durchflusszytometrie bestand die Möglichkeit, drei Oberflächenantigene der Lymphozyten zu detektieren, und sie je nach der Ausprägung der Antigene einem Stadium zuzuordnen (Abbildung 9). CD4im DPim DPpräSel DPpostSel SPm RE 8- 8+ 8+ 8+ 4+/8- 4+/8- 3- 3- 3+ 3+ 3+ 3+ 69- 69- 69- 69+ 69+ 69+ 1a+ 1a+ 1a+ 1a+ 1+/- 1a- 27- 27- 27- 27- 27+ 27+ 45RA- 45RA- 45RA- 45RA- 45RA- 45RA+ Abbildung 9: Oberflächenantigene der Lymphozyten in verschiedenen Stadien Im Verlauf der Thymozytenreifung kommt es zur Ausbildung von spezifischen Oberflächenmarkern, die für das jeweilige Entwicklungsstadium charakteristisch sind und anhand derer eine Einteilung in verschiedene Reifungsstadien erfolgen kann. Die einzelnen Oberflächenmarker (CD) sind entweder positiv (+) oder negativ (-). CD4im: unreife (immature) CD4+ Zellen, DPim: unreife (immature) CD4+ CD8+ Zellen DPpräSel: doppelt positive Zellen vor der positiven Selektion DPpostSel: doppelt positive Zellen nach der positiven Selektion SPm: reife (mature)CD4+ Zellen RE: Recent emigrants 32 Nachdem die nach dem Versuchsprotokoll gefärbten Zellen mit Hilfe des FACScan® analysiert wurden, konnten bei der Auswertung der Daten die TUNEL-Färbung auf FL1 in einem Histogramm, sowie die beiden anderen Antikörperfärbungen auf FL-2 und FL-3 in einem Dotplot-Fenster dargestellt werden. In den jeweiligen Dot-plot Diagrammen wurden daraufhin 4 Regionen von R1-4 entsprechend der jeweiligen Färbung definiert, und die jeweils darin auftretende TUNEL-FITC-Färbung in einem Histogramm der FL-1 aufgezeigt. Anhand der bei jedem Versuch mitgeführten Positiv- und Negativkontrollen für die TUNEL-Färbung wurde der Punkt festgelegt, ab welchem die Thymozyten als apoptotisch zu betrachten sind. Dieser Punkt definierte den Beginn des Markers und wurde für alle Proben einer jeweiligen Versuchsreihe festgelegt. In der Statistik konnte danach der prozentuale Anteil der apoptotischen Zellen der einzelnen Regionen einer jeden Färbung bestimmt werden. Danach konnte für jede einzelne Subpopulation der Thymozyten eine Aussage über den prozentualen Anteil TUNEL-positiver Zellen gemacht werden (Tabelle 9). Unter den 20 untersuchten Fällen fanden sich 3 Fälle mit Thymitis, 8 MG(-)Thymome und 9 MG(+)Thymome. Abbildung 10 zeigt eine Zusammenfassung aller untersuchten Thymome und Thymitiden. Bei allen MG(-) Thymomen war im Vergleich zu MG(+) Thymomen eine signifikant (p< 0.5) erhöhte Anzahl TUNEL-positiver Zellen in der Population der CD4+CD27+CD45RA- Zellen nachweisbar. Um daraufhin noch genauere Angaben zu bekommen, wurden die einzelnen Thymome nach ihrer histogenetischen Einteilung untersucht und miteinander verglichen. Es sollte geklärt werden, inwiefern sich das Apoptoseverhalten bei gemischten und cortikalen Thymomen untereinander unterscheidet. Bei cortikalen Thymomen konnte wiederum eine deutlich signifikante Erhöhung der TUNEL-positiven Zellen in den Subpopulationen der CD4+CD27CD45+ und CD4+CD27+CD45- Thymozyten bei MG(+) Thymomen im Vergleich zu MG(-) Thymomen dargestellt werden (Abbildung 11). 33 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 WHO MG CD4im DPim DP CD4m CD4RE CD8m CD8RE Thymitis Thymitis Thymitis AB AB AB AB AB AB B2 B2 B2 B2 B2 B2 B2 B2 B2 B2 B2 Ja Ja Ja Ja Ja Ja Nein Nein Nein Ja Ja Ja Ja Ja Ja Nein Nein Nein Nein Nein 0 0 0,6 1,2 0,2 1,5 3,8 2,3 0,2 3,9 0,1 0 0,4 0 0 0,8 0,2 2,0 4,3 0 0 0 0 0 0 0 0 k.A. 0 0,5 0 0 0 0 0 0,5 0 0,3 0,5 0 0 1,0 1,0 1,0 0,4 1,1 1,3 3,3 2,2 2,8 1,0 0 0,3 0 0,3 1,6 1,2 1,8 9,7 0,6 0 0 1,0 0,2 0,7 0 0 0,7 2,4 0,8 0 0 0 0 0,2 0,6 0,3 1,3 4,8 0,2 0 1,5 0,4 0,1 3,7 4,0 1,9 1,3 1,5 1,4 2,7 0 5,4 0 0 2,5 0,1 1,8 5,1 0 0,9 0,4 0,8 0,1 2,6 7,2 4,1 2,1 1,1 2,5 2,0 0 3,9 0,3 0,2 2,5 0,1 2,9 9,4 0,2 0 0 1,5 k.A. 0 0 0 0,4 2,7 0 0 0 0,6 0 0,1 0 2,2 0,1 0 0,6 Tabelle 9: Prozentualer Anteil TUNEL-positiver (apoptotischer) Zellen in verschiedenen Thymozytenreifungsstufen bei Thymomen mit und ohne assoziierte Myasthenia gravis Anhand der durchflusszytometrisch analysierten Dotplot-Färbungen wurde die Apoptoserate für die unterschiedlichen Zellpopulationen ermittelt. Dargestellt ist der prozentuale Anteil apoptotischer Zellen bezogen auf die jeweilige Thymoztenpopulation. WHO: histologischer Thymom-Subtyp nach WHO-Klassifikation, MG: Myasthenia gravis; CD4im: unreife (CD3-4+8-) CD4+ Zellen, DPim: unreife doppelt positive (CD34+8+) Zellen, DP: doppelt positive (CD3+4+8+) Zellen, CD4m: reife (CD3+4+CD27+CD45RA-) CD4+ Zellen, CD4RE/CD8RE: CD4+/CD8+ Recent Emigrants (CD4 oder CD8+, CD27+CD45RA+), k.A.: keine Angaben möglich. % TUNEL-positiver Zellen in der jeweiligen Subpopulation 34 7 6 5 4 CD4im DPim CD4m CD4RE P < 0.05 P < 0.5 CD8m CD8RE 3 2 1 0 Thymitis MG(+) MG(-) Thymome Abbildung 10: Darstellung der TUNEL-Befunde bei allen untersuchten MG(+) und MG(-) Thymomen im Vergleich zu nicht-neoplastischen Thymi mit Entzündung (Thymitis). Beim Vergleich der Thymome mit und ohne Myasthenia Gravis (MG) erkennt man eine deutlich erhöhte Apoptoserate (p < 0.05, grün) der CD4(+)mature Population (CD4m). Der prozentuale Anteil der TUNEL-positiven Zellen ist bei den MG(-)-Thymomen gegenüber den MG(+)-Thymomen in allen Subpopulation erhöht. Im = immature, m = mature, RE = Recent Emigrants, DP = doppelt positive Zellen (CD4+, CD8+) % TUNEL-positiver Zellen in der jeweiligen Subpopulation 35 8 B MG+ B MG- 6 0.5 PP<<0.05 4 2 0 CD4im DPim CD4m CD4RE CD8m CD8RE Abbildung 11: Prozentualer Anteil Tunel positiver Zellen in den einzelnen Reifungsstadien bei MG(+) und MG(-) Typ B Thymomen. Hier zeigt sich eine signifikante (p < 0.05) Erhöhung apoptotischer Zellen in den Subpopulationen CD4mature und CD4RE bei MG(-) Thymomen im Vergleich zu MG(+) Thymomen. B = corticale Thymome WHO Typ B, im = immature, m = mature, RE = Recent Emigrants, MG: Myasthenia Gravis, CD: Oberflächenmarker Weiterhin wurden auch die gemischten Thymome (WHO-Typ AB) auf etwaige Unterschiede bezüglich der Apoptose untersucht. Hier konnte man im Gegensatz zu den cortikalen Thymomen keine statistisch signifikanten Unterschiede erkennen. Wie in der Abbildung 12 dargestellt, konnte man aber auch hier eine Erhöhung der apoptotischen Thymozyten bei der Subpopulation der DPim und CD4RE bei MG(-) im Vergleich zu MG(+) erkennen. % TUNEL-positiver Zellen in der jeweiligen Subpopulation 36 8 AB MG+ AB MG- 6 4 2 0 CD4im DPim CD4m CD4RE CD8m CD8RE Abbildung 12: Prozentualer Anteil TUNEL-positiver Zellen in den einzelnen Reifungsstadien bei MG(+) und MG(-) Typ AB Thymomen Keine signifikante Erhöhung, jedoch besteht die Tendenz einer vermehrten Anzahl apoptotischer Thymozyten bei MG(-)-Thymomen (blau). Reifungsdaten bei DPim und CD4RE bei MG(+) Thymomen konnten nicht eindeutig eruiert werden. MG: Myasthenia Gravis, AB = gemischte Thymome, im = immature, m = mature, RE = Recent Emigrants, CD: Oberflächenmarker Aus diesen mit Hilfe des FACScan® untersuchten Thymozyten wird anhand der obigen Ergebnisse deutlich, dass es bei den MG(-) Thymomen in den letzten beiden Reifungsstadien zu einer erhöhten Anzahl TUNEL-positiver Zellen kommt, was einer erhöhten Apoptoserate entspricht. Zusätzlich konnte auch noch aufgezeigt werden, dass bei den corticalen MG(-) und MG(+)Thymomen ein deutlicherer Unterschied hinsichtlich des Apoptoseverhaltens gegeben ist als bei den gemischten Thymomen. 37 Diese Befunde korrelierten sehr gut mit den quantitativen Messungen bezüglich der TZell-Reifung in Thymomen (s. Abb. 8). 4.4 Auswertung anhand der Farbdifferenzmethode Die Paraffinschnitte wurden gemäß des Protokolls gefärbt und im Dunkeln aufbewahrt, um sie vor Lichteinstrahlung zu schützen. Die einzelnen Präparate wurden in jeweils derselben Art und Weise untersucht. Zuerst wurden die Objektträger in einem verdunkelten Raum unter dem Mikroskop inspiziert und danach wurden die Bildszenen einmal vertikal von oben bis unten und einmal horizontal von rechts nach links eines jeden Präparates aufgenommen. Da in Typ AB Thymomen die lymphozytenreichen Areale sehr heterogen verteilt sind und somit eine standardisierte Aufnahmesequenz bei diesen Tumoren nicht möglich ist, wurden für diesen Teil der Studie ausschließlich Typ B Thymome verwendet. Bei den Typ B Thymomen wurden insgesamt 23,7 Bildszenen aufgenommen, wobei jedes Bild eine Präparatfläche von 1.295 mm² darstellt. Damit wurde also in jedem der Präparate eine Gesamtfläche von 3,07 cm² aufgenommen und anschließend mit der Farbdifferenz-Methode zur Zellsegmentierung analysiert und ausgewertet. Mit dieser Methode wurden an insgesamt 6 corticalen Thymompräparaten und drei Thymitiskontrollen eine TUNEL-Färbung durchgeführt. Es wurde nach Möglichkeit darauf geachtet, dass die Patientenproben denen der durchflusszytometrisch untersuchten Proben entsprachen, damit die Auswertungen miteinander verglichen werden konnten. 38 Abbildung 13: Thymitis-Paraffinschnitt, H.E-Färbung mit TUNEL-Färbung Apoptotische Zellen sind bei einem Thymitis-Paraffinschnitt im Vergleich zu ThymomParaffinschnitten deutlich reduziert und in diesem Präparat nicht vorhanden 39 Bei den einzelnen mikroskopischen Analysen stellte sich schon zu Beginn der Untersuchungen heraus, dass die TUNEL-positiven Zellen bei den Thymomen deutlich vermehrt vorkamen. Im Gegensatz dazu waren diese TUNEL gefärbten Zellen bei den Thymitiden nur in einer sehr geringen Anzahl vorhanden. Bezüglich der Aussagefähigkeit hinsichtlich des Apoptoseverhaltens jeder einzelnen Zelle wurde folgender Gesamtwert als Vergleichsparameter gewählt: Gesamtwert = Anzahl der markierten Lymphozytenkerne x 105 aufgenommene Gewebefläche Mit diesem Wert war es möglich, die TUNEL-positiven Zellen der einzelnen Bildszenen eines jeden Präparates objektiv auszurechnen und den daraus resultierenden durchschnittlichen Gesamtwert der einzelnen Präparate untereinander zu vergleichen. Das Ergebnis dieser Untersuchung ist in Abbildung 14 graphisch dargestellt. Die Graphik zeigt, dass die Anzahl der markierten Lymphozytenkerne pro Gewebefläche bei den MG (-)-Fällen größer ist als bei den MG(+)-Fällen (p<0.05). Im Vergleich zu den Thymitisfällen ist bei den Thymomem insgesamt eine deutlich vermehrte Anfärbbarkeit der Zellkerne mit dem TUNEL-Reagenz zu erkennen. Die daraus resultierende Signifikanz ergibt einen Wert von p<0.001. Insgesamt zeigen die Resultate der gefärbten Paraffinschnitte, dass es Unterschiede bei der Anfärbbarkeit der einzelnen Thymozyten mit dem TUNEL-Reagenz gibt. Anhand dieser Untersuchungen kann man die Vermutung aufstellen, dass bei den Thymomen, die nicht mit einer paraneoplastischen MG assoziiert sind, eine vermehrte apoptotische Aktivität der Lymphozyten vorhanden ist.Somit korreliert dieses Ergebnis auch mit den Ergebnissen der durchflusszytometrisch analysierten Thymozyten (siehe 4.2). TUNEL(+) Zellkerne x 105 / Gewebefläche 40 200 p < 0.05 100 P < 0,001 0 Thymitis MG+ MG- 3 Fälle, n = 30 HPF 3 Fälle, n = 74 HPF 3 Fälle, n = 70 HPF Abbildung 14:Vergleich von Tunel-Färbungen an Paraffinschnitten von Thymitis und Thymomen mit und ohne Myasthenia Gravis (MG) Insgesamt wurden 9 Fälle mit Hilfe der Farbanalyse im gefärbten Schnitt untersucht. Signifikante Erhöhung (p < 0.05) der TUNEL-positiven Zellkerne bei MG(-) im Vergleich zu MG(+), sowie im Vergleich der Thymome mit Thymitis (p < 0.001). HPF = High Power Field 41 Abbildung 15: TUNEL-Färbung an Paraffinschnitt, No. 28804, Thymom MG (-) Die schwarzen Pfeile markieren die TUNEL-positiven (braunen) Lymphozytenzellkerne an einem H.E.-gefärbten Paraffinschnitt eines Thymompräparates ohne Myasthenia Gravis (MG) 42 4.5 TUNEL und DAPI-Immunfluoreszenz an Paraffinschnitten Ein großer Vorteil der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie ist eine hohe Auflösung der optischen Schnitte von Gewebearten ohne eine allzu komplizierte Gewebeaufbereitung. Ziel dieser Methode war eine weitere qualitativ hochwertigere Darstellung von apoptotisch veränderten Zellen bei Paraffinschnitten von Thymomen und Thymitiden. Dazu wurde eine Zellkernfärbung mit DAPI durchgeführt, wodurch die einzelnen Lymphozyten per se schon zu identifizieren waren. Danach wurden die Zellen mit dem TUNEL-Farbstoff inkubiert und direkt mit dem Fluoreszenzmikroskop analysiert. Zwischen den einzelnen Arbeitsschritten wurden die Schnitte im Dunkeln aufbewahrt, so dass der Farbstoff nicht ausbleichen konnte. Um die apoptotischen Thymozyten letztendlich bestimmen zu können, sollten die einzelnen Zellkerne eine Blaufärbung (DAPI) aufweisen und zusätzlich noch mit dem FITC-gekoppelten TUNEL-Reagenz (grün) markiert sein. Abbildung 16: DAPI-Immunfluoreszenzfärbungen und TUNEL-Färbungen eines Paraffinschnittes, Thymom mit Myasthenia Gravis (MG+) Die mit dem grauen Pfeil markierten grünen Zellkerne sind TUNEL-positiv und gleichzeitig DAPI-positiv und können daher als apoptotisch bezeichnet werden. 43 5 Diskussion Basierend auf der Tatsache, dass im peripheren Blut von Patienten ohne MG eine signifikant verminderte Anzahl naiver CD4+-Zellen gefunden wurde (Hoffacker, Schultz et al. 2000; Buckley, Douek et al. 2001) besteht eine Assoziation zwischen dem Auftreten einer paraneoplastischen MG und der Effizienz von Thymomen, naive CD4+ T-Zellen zu produzieren und zu exportieren (Strobel, Helmreich et al. 2002). Vor diesem Hintergrund sollte die vorliegende Arbeit klären, ob es hinsichtlich der Apoptoserate zwischen MG(-) und MG(+) Thymomen einen quantitativen Unterschied gibt und in welchem Reifungstadium dieser programmierte Zelltod vonstatten geht. Da es sich bei den Thymomen um äußerst seltenene Krankheitsbilder handelt, waren die durchflusszytometrischen Untersuchungen von vorneherein auf die Verwendung eingefrorener, archivierter Thymozyten beschränkt. Um die Ergebnisse und die Spezifität der FACS-Analysen noch besser beurteilen zu können, wurden mit Hilfe der Immunhistologie und Immunfluoreszenz noch weitere Untersuchungen an Paraffinschnitten durchgeführt. Aufgrund der Komplexität der Versuchsanordnung und der Schwierigkeit einer Apoptosemessung werden nachfolgend die einzelnen Methoden diskutiert. 5.1 Diskussion der Methodik Einen Schwerpunkt der Diskussion über die Methodik stellt sicherlich die Art der Untersuchung und das Material selber dar. Bei der Verwendung von eingefrorenem Material lag die Zellausbeute nach dem Auftauvorgang zwischen 5-10 % der ursprünglichen Menge. Aufgrund dieses hohen Verlustanteils musste eine große Menge an eingefrorenen Thymozyten zur Verfügung stehen, um diese Ausfälle zu kompensieren. Durch einige Modifikationen bei dem Auftauvorgang konnte letztendlich die Zellausbeute an Thymozyten gesteigert werden, so dass sich keine Schwierigkeiten mit der archivierten Materialmenge ergaben. 44 5.1.1 Durchflusszytometrische TUNEL-Methode bei Thymozyten Die Art des Nachweises apoptotischer Zellen wird kontrovers diskutiert. Die TUNELFärbung ist eine der am häufigsten verwendeten und spezifischsten Nachweismethoden für apoptotische Zellen (Kelly, Sandoval et al. 2003; Prochazkova, Kylarova et al. 2003). In Kombination mit der Durchflusszytometrie können sowohl quantitative als auch qualitative Aussagen über den programmierten Zelltod gemacht werden (Afanasyev, Korol et al. 1993), jedoch muss die jeweilige Nachweismethode spezifische Anforderungen erfüllen. Um Lymphozyten, die sich im Stadium des programmierten Zelltodes befinden, nachzuweisen, müssen Apoptose-spezifische Eigenschaften und Merkmale dieser Zellen nachgewiesen werden. Diese Merkmale dienen vor allem dazu, eine Differenzierung gegenüber denjenigen Zellen zu erreichen, die durch den Vorgang der Nekrose zugrunde gegangen sind. Bei allen Nachweismethoden ist diese Unterscheidung ein wichtiges Kriterium hinsichtlich der Validität der einzelnen Methoden. Bei der Apoptose oder dem programmierten Zelltod aktiviert die Zelle ein internes Zerstörungsprogramm mit charakteristischem Abbau der Kern-DNA, der Degeneration und Kondensation von Zellkernen, sowie einer Phagozytose der Zellreste (Darzynkiewicz, Bruno et al. 1992). Zu Beginn schrumpfen die Zellen aufgrund von Wasserverlust und isoosmotischem Verlust von Ionen im Zytoplasma (Bortner and Cidlowski 2000), die Kern-DNA wird währenddessen in hoch-und niedermolekulare Fragmente ( nicks ) gespalten (Savill and Fadok 2000). Im Gegensatz dazu ist die Nekrose ein nicht-programmierter Zelltod aufgrund von chemischen oder physikalischen Schädigungen. Dieser Vorgang ist gekennzeichnet durch den Verlust der Membranintegrität und das Anschwellen von Zytoplasma und Mitochondrien. Dies ist auf die Unfähigkeit zur Aufrechterhaltung der Ionen-Hämostase zurückzuführen. Schließlich kommt es zur völligen Lyse der Zelle und die zytoplasmatischen Inhalte werden freigesetzt. Die DNA wird nach Lyse der Zellen nach dem Zufallsprinzip in Stücke verschiedener Größe abgebaut (Wyllie, Kerr et al. 1980) und im Gegensatz zur Apoptose entstehen hierbei große Mengen an Zelltrümmern, die von Phagozyten beseitigt werden müssen. 45 Für den Nachweis eines programmierten Zelltodes wird deshalb genau dieser spezielle Vorgang der Fragmentation bei der Apoptosemessung ausgenutzt und die dabei entstehenden apoptotic bodies können mit verschiedenen Methoden nachgewiesen werden (Walker and Quirke 2001). Die Schwierigkeit des Nachweises besteht jedoch in der exakten Quantifizierung, die für die Aussage bezüglich der Apoptoserate unabdingbar ist. Bei der TUNEL-Methode werden die 3´-Enden von den DNA-Fragmenten, die in apoptotischen Zellen entstehen (sogenannte nicks ) durch die Reaktion der terminalen Desoxynukleotidyltransferase (TdT) mit Fluorescein markiertem Uridin (dUTP) markiert. Anschließend können diese markierten Zellen entweder mit der Fluoreszenzmikroskopie oder mit der Durchflußzytometrie analysiert werden. Bei der in dieser Arbeit verwendeten Methode besteht der Vorteil, dass durch die Verwendung von direkt FITC-gekoppelten Nukleotiden der Zwischenschritt einer Enzym-gekoppelten Substratumwandlung entfällt. Mit Hilfe dieser Methode ist es gelungen, einen spezifischen Nachweis in Bezug auf die Quantität für apoptotische Zellen zu etablieren (Kelly, Sandoval et al. 2003). Somit kann aufgrund von diesen unterschiedlichen intrazellulären Vorgängen bei der Nekrose und Apoptose eine TUNEL-Färbung durchaus als eine spezifische Art des ApoptoseNachsweises betrachtet werden (Negoescu, Guillermet et al. 1998; Lawry 2004). Um das bei dieser Arbeit verwendete TUNEL-Reagenz für die intrazelluläre DNAMarkierung anwenden zu können, mussten die aufgetauten Zellen zuerst fixiert und anschließend permeabilisiert werden. Dieser Vorgang war notwendig, um sowohl die inneren als auch die äußeren Zellmembranen für die Antikörper durchlässig zu machen. Bei der Fixation (CytofixTM) wurden die Zellen durch das darin enthaltene Paraformaldehyd fixiert und anschließend mit einem Detergens (Perm/Wash bufferTM) permeabilisiert. Die Markierung der Oberflächenmarker, und damit die Zuordnung zu den einzelnen Reifestadien wurde jedoch aufgrund des Permeabilisationsvorganges vor einer jeden TUNEL-Färbung durchgeführt, weil hierbei eine gewisse Zerstörung der äußeren Zellmembran stattfindet. Da die spätere Auswertung der TUNEL-Färbung darüber Auskunft geben sollte, in welchem Stadium der Thymozytenentwicklung die höchste Apoptoserate stattfindet, wurde auf die Oberflächenmarkierung mittels Antikörper großen Wert gelegt. Deshalb wurde, wie in 4.1.3 beschrieben, ein 46 durchflusszytometrischer Vergleich derselben Proben zuerst vor und nach der Fixation/Permeabilisation durchgeführt. Somit konnte man den Einfluss dieser Detergenzien auf die bereits mit Antikörpern markierten Zellen direkt erkennen. Anhand der Darstellung der Zellen im Dot plot Diagramm ist bezüglich der Grösse und Granularität der Zellen eine leichte Verschiebung zugunsten der Zellen mit geringer Zellgröße und gleicher Granularität zu beobachten. Es zeigten sich aber keine Unterschiede hinsichtlich der Anfärbbarkeit und Darstellung der Subpopulationen bei fixierten/permeabilisierten Zellen gegenüber nativen Thymozyten, so dass der Einfluss darauf vernachlässigt werden konnte. Eine weitere Schwierigkeit bei der Anwendung dieser zytometrischen TUNEL-Methode bestand darin, dass durch die DNA-Markierung mit dem direkt FITC-gekoppelten dUTP der Fluoreszenzkanal 1 belegt war. Da aber für die Durchflusszytometrie nur ein 3-Farben FACS-Analysegerät zur Verfügung stand, waren für die übrigen Oberflächenantigen-Bestimmungen noch zwei Kanäle bereit (FL-2 und FL-3). Um jede einzelne Subpopulation der Thymozyten auf Ihre Apoptoserate untersuchen zu können, wurde deshalb im Vorfeld der Untersuchungen eruiert, ob mit Hilfe einer Depletion durch Trennsäulen die CD4+ T-Zellen von den CD4- T-Zellen getrennt werden könnten. Die Ergebnisse der CD4/CD8 Depletion an sich waren sehr gut, jedoch ergaben sich durch deren Zuhilfenahme weitere Schwierigkeiten. Zum einen kam es zu einer weiteren Verminderung der absoluten Zellzahl, zum anderen litt darunter die Qualität hinsichtlich der Apoptosemessung. Die Inkubationszeit der fixierten Thymozyten belief sich auf mehrere Stunden, und Untersuchungen hinsichtlich des Anfärbeverhaltens behandelter Zellen konnten zeigen, dass bei Zellen, die länger als 2 Stunden fixiert waren, verfälschte Ergebnisse bei der Apoptose-Messung herauskamen (Tateyama, Tada et al. 1998). Eine weitere Alternative bestand in der Verwendung eines fluoreszenzaktivierten Zellsorters. Jedoch erwies sich diese Methode aus technischen und logistischen Gründen als nicht durchführbar. Somit blieben für die Fortsetzung der TUNEL-Methode nur die Fluoreszenzkanäle FL-2 und FL-3 übrig, an welchen das Versuchsprotokoll so gestaltet wurde, dass man jede einzelne Subpopulation in den Dot plot Diagrammen darstellen und die quantitative Apoptoserate dazugehörigen Histogramme analysieren und errechnen konnte. anhand der 47 5.1.2 Immunhistochemische TUNEL-Methode bei Paraffinschnitten Die immunhistochemische TUNEL-Färbung von Gewebeschnitten ist eine weit verbreitete und validierte Methode für den Nachweis apoptotischer Zellen. Im Gegensatz zur Durchflusszytometrie können bei dieser Untersuchung die TUNELmarkierten Zellen zusätzlich noch lichtmikroskopisch auf ihre morphologischen Eigenschaften hin untersucht werden. Mit Hilfe von computerunterstützten Bildanalysen können anschliessend die einzelnen Bildserien anhand der typisch apoptotischen Zellmorphologie ausgewertet werden. Bei Untersuchungen von Prostatakarzinomen wurde ein Vergleich von immunhistochemischen Apoptosemarkern (Caspase 3 und Cytokeratin 18) und der TUNEL-Methode durchgeführt. Hier konnte gezeigt werden, dass bei der Entdeckung und Quantifizierung von apoptotischen Zellen eine gute Korrelation zwischen Caspase 3 Markern und der TUNEL-Färbung besteht (Duan, Garner et al. 2003). Trotzdem muss der Nachweis apoptotischer Zellen an Schnittpräparaten kritisch analysiert werden, da die Sensitivität doch erheblich variieren kann (Labat-Moleur, Guillermet et al. 1998). Als zusätzliches Kriterium wurde deshalb die optisch erkennbare Zellmorphologie und die DAPI-Zellkernfärbung verwendet, anhand derer lichtmikroskopisch bzw. fluoreszenzmikroskopisch weitere Hinweise für eine apoptotische Zelle zu erkennen waren. 5.2 Untersuchung apoptotischer Thymozyten Nachdem die technischen Fragen, also die Aussagefähigkeit und die Anwendbarkeit der TUNEL-Methode zur Darstellung und Quantifizierung apoptotischer Zellen, im ersten Teil dieser Arbeit geklärt worden ist, konnte sich der Hauptteil der Doktorarbeit mit der Fragestellung auseinandersetzen, ob bei MG(-) Thymomen eine höhere Apoptoserate zu verzeichnen ist , als bei den MG (+) Thymomen und, falls dies der Fall sein sollte, in welchem Stadium der T-Zellreifung dieser vermehrte Zelltod stattfindet. 48 5.2.1 Diskussion der Reifungsstadien Die Zusammensetzung der T-Zell-Populationen in Thymomen und Kontrollthymi wies signifikante Unterschiede auf. Hinsichtlich der T-Zellpopulation ist der Anteil an unreifen Thymozyten in Thymomen größer, der Anteil reifer T-Zellen geringer, als in nicht-neoplastischen Thymi (Nenninger, Schultz et al. 1998). Im Gegensatz zu den gut untersuchten frühen Reifungsstadien der Thymozytenreifung (Berg and Kang 2001; Hogquist 2001; MacDonald, Radtke et al. 2001) sind die Mechanismen der späten Phase der Thymopoese weniger genau untersucht und charakterisiert. Die entscheidende und äußerst wichtige Rolle der negativen Selektion im Hinblick auf die Prävention von Autoimmunkrankheiten ist ein immunologisches Paradigma welches anhand vieler wissenschaftlicher Modelle erörtert wurde (Laufer, DeKoning et al. 1996; Laufer, Fan et al. 1999; Naquet, Naspetti et al. 1999; Rubin and Kretz-Rommel 2001). In Übereinstimmung mit einer Reihe von früheren Untersuchungen zur Thymozytenreifung (Strobel, Helmreich et al. 2001; Strobel, Helmreich et al. 2002; Strobel, Preisshofen et al. 2003) konnte auch in dieser Arbeit gezeigt werden, dass unmittelbar vor und nach dem Erwerb von CD27 ein wichtiger negativer Selektionsprozess hinsichtlich der Entwicklung von reifen naiven CD4+ T-Zellen stattfindet. CD27 ist ein glykosyliertes Typ-1 Membranprotein und gehört zu der Tumornekrosefaktor-Rezeptor (TNFR) Superfamilie, zu der u.a. auch Fas/APO-1 (CD95) und CD40 zählen. Der Ligand von CD27 auf dem Thymusepithel ist CD70. Diese Rezeptoren spielen eine wichtige Rolle in Zellwachstum und differenzierung, aber auch bei der Apoptose (Sugita, Hirose et al. 1992; Hintzen, Lens et al. 1995). Die Aktivierung von CD27 z.B. durch Phytohämagglutinin oder agonistische anti-CD3 Antikörper resultiert in der Proliferation von T-Zellen. Daneben besitzt jedoch auch CD27 pro-apoptotische Wirkungen (Prasad, Ao et al. 1997). 49 5.3 Diskussion der Ergebnisse der Durchflusszytometrie und der FarbdifferenzMethode zur Apoptose MG(-) und MG(+) Thymome sind gute Anschauungsmodelle für die Erklärung des Mechanismus, der einerseits den Ablauf der Thymopoese reguliert, und andererseits die Autoimmunität und damit das Aufreten der paraneoplastischen MG unter normalen Bedingungen verhindert. Auch unter Berücksichtigung der jeweils limitierten Aussagekraft beider Methoden, Analyse in situ und per FACS, kamen beide Untersuchungsabschnitte zu einem vergleichbaren Ergebnis. Es konnte gezeigt werden, dass die Apoptoserate bei MG(-) Thymomen signifikant über der in MG(+) Thymomen liegt. In Übereinstimmung mit einer schon früher beschriebenen ineffizienten Thymopoiese (Strobel, Helmreich et al. 2001) lag die Apoptoserate bei allen Thymomen über der von Kontrollthymi. Die FACS-Daten zur Stadien-bezogenen Apoptose korrelierten sehr gut mit der Beobachtung, dass speziell die späten Reifungsstadien (gekennzeichnet durch den Erwerb von CD27) in Thymomen reduziert waren. In Übereinstimmung mit früheren Untersuchungen zur Anzahl reifer naiver T-Zellen im peripheren Blut von MG(+) und MG(-) Thymompatienten darf also als gesichert gelten, dass der Verlust terminaler Reifungsstadien in MG(-) Thymomen auf eine gesteigerte T-Zell-Apoptose im Tumor und nicht auf eine Schrankenstörung mit Ausschwemmung unreifer Vorstufen in das periphere Blut zurückzuführen ist. Nicht geklärt werden konnte die Frage, ob dieser Verlust Ausdruck einer aktiven Deletion autoreaktiver TZellen oder eines Neglectes durch Fehlen eines Überlebens- oder Reifungssignales (z.B. auch CD27) war. Die Klärung dieser interessanten Frage in zukünftigen Untersuchungen könnte zu genaueren Rückschlüssen über die noch weithin ungeklärten Toleranzmechnismen der terminalen T-Zell-Reifung in einem humanen System führen. Demzufolge sind weitere Untersuchungen hinsichtlich der Thymozyten in terminalen Reifungstadien notwendig, um eine weitere Aufklärung bezüglich des Auftretens von Myasthenia Gravis bei Thymomen zu ermöglichen. 50 6 Die Zusammenfassung Myasthenia gravis (MG) ist eine der am besten untersuchten Autoimmunerkrankungen des Menschen. Bei etwa 10 % der Patienten mit MG liegt dem Auftreten der Erkrankung ein Thymom zugrunde. Die Thymozytenreifung in Thymomen ist quantitativ in dem Sinne gestört, dass anteilig mehr unreife Stadien und weniger reife CD4+ T-Zellen gebildet werden als im Normalthymus, jedoch sind in MG-assoziierten Thymomen alle Reifungsstadien der T-Zellentwicklung nachweisbar. Aus früheren Untersuchungen war bekannt, dass Thymome ohne MG einen Defekt der terminalen Reifung von CD4+ Thymozyten aufweisen. In der hier vorliegenden Arbeit sollte geklärt werden, ob MG(+) und MG(-) Thymome einen Unterschied bezüglich der Apoptoserate intratumoröser T-Zellen aufweisen. Die Untersuchung ergab, dass Thymozyten in MG(-) Thymomen eine signifikant höhere Apoptoserate aufweisen als in MG(+) Thymomen. In guter Übereinstimmung mit Messungen zur intratumorösen T-Zell-Reifung fanden sich im FACS-analytischen Teil der Studie die größten Unterschiede bezüglich der Apoptoserate in den CD27+ CD45RA- und CD27+CD45RA+ terminalen Reifungsstadien. Ob der Verlust der terminalen Reifungsstadien in MG(-) Thymomen Ausdruck eines gesteigerten protektiven Mechanismus im Sinne einer vermehrten negativen Selektion oder Ausdruck eines Reifungsdefektes durch Verlust eines Überlebenssignals war, konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht geklärt werden. Ein möglicher Kandidat für ein solches fehlendes Überlebenssignal ist beziehungsweise sein Ligand CD70. der Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor CD27 51 7 7.1 Anhang Eigene Publikationen Teile dieser Arbeit wurden publiziert in: Pathomechanisms of paraneoplastic myasthenia gravis. Ströbel P, Preisshofen T, Helmreich M, Müller-Hermelink HK, Marx A., Clin Dev Immunol. 2003 Mar;10(1):7-12. Weiterhin wurden Teile der hier verwendeten Methoden auch bei einer anderen Fragestellung angewendet und publiziert: Apoptosis and proliferation in lungs of ventilated and oxygentreated preterm infants May M, Strobel P, Preisshofen T, Seidenspinner S, Marx A, Speer CP. Eur Respir J. 2004 Jan;23(1):113-21. 52 7.2 Abbildungsverzeichnis Abbildung 1 : Reifungstadien der Thymozyten 3 Abbildung 2 : Prinzip der TUNEL-Färbung 15 Abbildung 3 : Contour blot einer CD45 (FL-2) und CD8 (FL-3) Färbung 19 Abbildung 4 : Histogramm bei Aufnahme der Apoptosefärbung mit TUNEL 20 Abbildung 5 : Darstellung der Apoptoseauswertung anhand von Histogrammen 20 Abbildung 6 : Dotplot-Darstellungen von Thymozyten 26 Abbildung 7 : Einfluss der Fixation und Permeabilisation auf die Größe und Granularität der Thymozyten 28 Abbildung 8 :Vergleich der Reifungsdaten von Thymozyten bei Normalthymus sowie WHO Typ AB und B Thymomen Abbildung 9: Oberflächenantigene der Lymphozyten in verschiedenen Stadien 30 31 Abbildung 10: Graphische Darstellung der TUNEL-Befunde bei allen untersuchten MG(+) und MG(-) Thymomen im Vergleich zu nichtneoplastischen Thymi mit Entzündung (Thymitis) 34 Abbildung 11: Prozentualer Anteil TUNEL-positiver Zellen in den einzelnen Reifungsstadien bei MG(+) und MG(-) Typ B Thymomen 35 Abbildung 12: Prozentualer Anteil TUNEL-positiver Zellen in den einzelnen Reifungsstadien bei MG(+) und MG(-) Typ AB Thymomen Abbildung 13: Thymitis-Paraffinschnitt, H.E-Färbung mit TUNEL-Färbung 36 38 Abbildung 14: Vergleich von TUNEL-Färbungen an Paraffinschnitten von Thymitis und Thymomen mit und ohne Masthenia Gravis (MG) 40 Abbildung 15: TUNEL-Färbung an Paraffinschnitt, No.28804, Thymom MG(-) 43 Abbildung 16: DAPI-Immunfluoreszenzfärbungen und TUNEL-Färbungen eines Paraffinschnittes, Thymom mit Myasthenia Gravis (MG+) 42 53 7.3 Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Thymusveränderungen bei Myasthenia Gravis (MG) 4 Tabelle 2: WHO-Klassifikation und Einteilung der Thymome nach WHO 2004 (Vincent 2002) 5 Tabelle 3: Klinische Daten der untersuchten Thymom- und Thymitispatienten mit und ohne Myasthenia Gravis (MG) 7 Tabelle 4: Verwendete Arbeitsgeräte 8 Tabelle 5: Verwendete Lösungen 9 Tabelle 6: Verwendete Antikörper und Enzyme 10 Tabelle 7:Versuchsprotokoll für TUNEL-Apoptosemessung 17 Tabelle 8: Untersuchte Patientendaten mit und ohne Myasthenia Gravis (MG) 25 Tabelle 9:Auswertung der durchflusszytometrisch bestimmten Apoptoserate mittels TUNEL-Färbung 33 54 7.4 Literaturnachweis Afanasyev, V. 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Mein ganz spezieller Dank gebührt meinem Betreuer Dr. Philipp Ströbel, der mir in schwierigen Situationen immer mit Rat und Tat zur Seite stand und mich in jeglicher Hinsicht bei dem Zustandekommen dieser Promotion unterstützt hat. Bei Frau Andrea Homburger möchte ich mich ganz herzlich für die Einarbeitung in die große Welt der Durchflusszytometrie bedanken, sowie für die zahlreichen FACSFärbungen mit diversen Ausflügen nach Ulm bei Nichtfunktionieren des Zellsorters ! Außerdem möchte ich mich noch bei Herrn H. Harms für die nette Betreuung und die Hilfestellungen bezüglich der Bilderfassung und Bildanalysen der histologischen Präparate bedanken. Allen Mitarbeitern des Pathologischen Institutes sei für die gute Zusammenarbeit gedankt. Zum Schluss möchte ich mich noch bei meiner Familie und meiner Frau für die vielfältige Unterstützung beim Erstellen dieser Arbeit sowie beim Korrekturlesen bedanken. Lebenslauf Persönliche Daten Name : Geburtsdatum : Geburtsort : Tobias Robert Georg Preißhofen 24.09.1976 Friedrichshafen Ausbildung 1996 : 1996 : 1997 : Abschluss: Allgemeine Fachhochschulreife Rettungshelferausbildung, Deutsches Rotes Kreuz Ravensburg Rettungssanitäter-Ausbildung, Rotes Kreuz Ravensburg Hochschulausbildung 05/1998 : Julius-Maximilians-Universität Würzburg, Humanmedizin 03/2000 : Ärztliche Vorprüfung 03/2001 : Erster Abschnitt der ärztlichen Prüfung 03/2003 : Zweiter Abschnitt der ärztlichen Prüfung 06/2004 : Dritter Abschnitt der ärztlichen Prüfung Praktika 06/2000 - 07/2000 : 08/2001 - 09/2001 : 03/2002 - 04/2002 : 08/2002 - 09/2002 : 04/2003 - 08/2003 : 08/2003 - 12/2003 : 12/2003 - 04/2004 : 06/2004 - 07/2004: seit 10/04 Promotion 06/01-5/05 Orthopädie, Elisabethenkrankenhaus Ravensburg Pathologie, Julius-Maximilians-Universität Würzburg Pädiatrie, Kantonsspital Münsterlingen, Schweiz Allgemeinmedizin, Dr. med. L. Preisshofen, Ravensburg Innere Medizin, Kantonsspital Aarau, Schweiz Chirurgie, Whangarei-Area-Hospital, Neuseeland Orthopädie, Schulthess Klinik Zürich, Schweiz Erwerb der Zusatzbezeichnung Sportmedizin, Akademie Damp tätig als Assistenzarzt Abteilung Chirurgie des Krankenhauses 14 Nothelfer,Weingarten Apoptosemessung in verschiedenen Stadien der Thymozytenentwicklung im menschlichen Thymus und Thymomen an der Julius-Maximilians-Universität Würzburg, unter der Leitung von Prof. Dr. A. Marx Publikationen May M., Strobel P., Preisshofen T., Seidenspinner S., Marx A., Speer CP Apoptosis and proliferation in lungs of ventilated and oxygen-treated preterm infants. Eur. Respir. J. 2004 Jan; 23 (1):113-21 Strobel P., Preisshofen T., Helmreich M., Mueller-Hermelink HK., Marx A. Pathomechanism of paraneoplastik myasthenia gravis Clin Dev Immunolog. 2003 March;10(1):7-12 Ravensburg, Mai 2005
