CD8-T-Zell-Differenzierung bei Patienten mit Common Variable

Aus der Medizinischen Universitätsklinik
Abteilung Innere Medizin II
(Gastroenterologie, Hepatologie, Endokrinologie und Infektiologie)
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
CD8-T-Zell-Differenzierung
bei Patienten mit Common Variable Immunodeficiency
INAUGURAL-DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
vorgelegt 2010
von Martin Kuntz,
geboren in Essen
Dekan:
Prof. Dr. med. Drs. h.c. mult. H. E. Blum
1. Gutachter:
Prof. Dr. med. R. Thimme
2. Gutachter:
Prof. Dr. med. H. H. Peter
Jahr der Promotion:
2011
–2–
Inhalt
Abkürzungen ........................................................................................................................5
Einleitung .............................................................................................................................6
Angeborenes vs. adaptives Immunsystem.......................................................................6
B-Zellen ........................................................................................................................7
CD8-T-Zellen ...............................................................................................................8
Oberflächenmarker..............................................................................................10
CD8-T-Zell-Differenzierung ...............................................................................12
Common Variable Immunodeficiency (CVID) ...........................................................13
Klassifikation.......................................................................................................15
Ätiologie..............................................................................................................16
T-Zell-Alterationen bei CVID.....................................................................................18
Virusspezifische CD8-T-Zellen bei CVID ...........................................................19
Funktion .............................................................................................................19
Ziele dieser Arbeit .......................................................................................................20
Material und Methoden ......................................................................................................22
Patienten .....................................................................................................................22
Durchflußzytometrie...................................................................................................22
Medien und Puffer ......................................................................................................23
Antikörper...................................................................................................................24
Peptide und Multimere ...............................................................................................25
Blutaufarbeitung .........................................................................................................26
Färbungen...................................................................................................................27
HLA-A2-Färbung................................................................................................27
Multimer-Färbung...............................................................................................27
Sonstige Färbungen .............................................................................................28
Interferon-gamma-Färbung .................................................................................28
Auswertung .................................................................................................................29
Durchflußzytometrie ...........................................................................................29
Statistik ...............................................................................................................31
Ergebnisse ...........................................................................................................................33
Patientenkollektiv........................................................................................................33
CD8-T-Zell-Differenzierung im Vergleich zwischen CVID- und Kontrollkohorte ......33
–3–
CVID-Klasse und CD8-T-Zell-Differenzierung ..........................................................35
Klinik und CD8-T-Zell-Differenzierung .....................................................................36
Virusspezifische CD8-T-Zellen ...................................................................................41
CMV, CD8-T-Zell-Differenzierung und Klinik ..........................................................42
Phänotyp virusspezifischer CD8-T-Zellen ...................................................................44
Subgruppen-Differenzierung .......................................................................................46
Virusspezifische CD8-T-Zellen während akuter CMV-Reaktivierung..........................48
Interferon-gamma-Produktion virusspezifischer CD8-T-Zellen ...................................50
Diskussion ..........................................................................................................................52
Zusammenfassung ..............................................................................................................57
Literatur..............................................................................................................................58
Danksagung........................................................................................................................65
Lebenslauf...........................................................................................................................66
Publikationen......................................................................................................................67
–4–
Abkürzungen
CD
Cluster of Differentiation
CMV
Cytomegalievirus
CT
Computertomographie
CVID
Common Variable Immunodeficiency
DMSO
Dimethylsulfoxid
EBV
Ebstein-Barr-Virus
FACS
Fluorescence Activated Cell Sorting
FCS
Fetal Calf Serum
Flu
Influenza-Virus
gGT
Gammaglutamyltransferase
GOT
Glutamatoxalacetattransaminase
GPT
Glutamatpyruvattransaminase
Hb
Hämoglobin
HHV
humanes Herpes-Virus
HLA
Humanes Leukozyten-Antigen
IFN
Interferon
Ig
Immunglobulin
IL
Interleukin
LCMV
Lymphocytic Choriomeningitis Virus
MHC
Major Histocompatibility Complex
Mio
Million(en)
MRT
Magnetresonanztomographie
PBMC
Peripheral Blood Mononuclear Cells
PBS
Phosphate Buffered Saline
PFA
Paraformaldehyd
PMA
Phorbol Myristate Acetate
RNS
Ribonukleinsäure
RPMI
Roswell-Park-Memorial-Institute-Medium
SB
Stain Buffer
TNF
Tumor-Nekrose-Faktor
U/min
Umdrehungen pro Minute
VSV
Vesicular Stomatitis Virus
–5–
Einleitung
Angeborenes vs. adaptives Immunsystem
Die Auseinandersetzung mit pathogenen und parasitären Erregern (Viren, Bakterien, einund mehrzellige Eukaryonten) hat im Laufe der Evolution bei allen bekannten Lebewesen
zur Entwicklung eines sehr effizienten und differenzierten Immunsystems geführt, das dazu
dient,
diese
Bedrohungen
abzuwehren.
So
besitzen
schon
Bakterien
basale
Abwehrmechanismen gegen eine Infektion mit Phagen, bei den Säugetieren findet sich ein
weitaus komplexeres System. Das Immunsystem der Säugetiere ist ein Netzwerk, das aus
verschiedenen zellulären und löslichen Faktoren besteht; es läßt sich in das angeborene und
das adaptive Immunsystem unterteilen. Das angeborene Immunsystem ist in der Lage, sehr
schnell, d.h. innerhalb weniger Stunden, auf eine Infektion zu reagieren, indem es Muster
erkennt, die einer großen Zahl von Erregern gemeinsam sind, wie zum Beispiel
Oberflächenmoleküle auf bakteriellen Membranen oder doppesträngige RNS, die bei der
viralen Replikation intrazellulär auftritt. Zum angeborenen Immunsystem werden zum
Beispiel
Granulozyten,
Makrophagen,
natürliche
Killer-Zellen
(NK-Zellen),
das
Komplement- und das Interferonsystem gerechnet.
Das adaptive Immunsystem auf der anderen Seite ist in der Lage, hochspezifisch einen
bestimmten Krankheitserreger zu erkennen und anzugreifen. Die Entwicklung einer solchen
adaptiven Immunantwort braucht jedoch einige Zeit (mindestens in der Größenordnung von
mehreren Tagen), sodaß es Situationen geben kann, in denen die Mechanismen des
angeborenen Immunsystems das Überleben des Organismus sichern müssen. Das adaptive
Immunsystem gliedert sich in einen zellulären und einen humoralen Teil. Den zellulären Teil
bilden B-Zellen und T-Zellen. Es werden ferner CD4- und CD8-T-Zellen unterschieden, die
jeweils unterschiedliche Funktionen haben.
Eine herausragende Funktion von B-Zellen ist die Produktion von Antikörpern. Diese
löslichen Proteine bilden den humoralen Teil des adaptiven Immunsystems und können
pathogene Organismen oder Moleküle (z.B. bestimmte Toxine) auf verschiedenen Wegen
unschädlich machen. Zum einen kann die Bindung von Antikörpern direkt dazu führen, daß
der Erreger oder das Toxin seine Pathogenität verliert (Neutralisation), beispielsweise indem
–6–
ein Virus durch Abschirmen eines Adhäsionsmoleküls daran gehindert wird, die Zellwand zu
überwinden. Zum anderen fördert eine Bindung von Antikörpern die Phagozytose der
Pathogene durch Makrophagen und Granulozyten (Opsonisierung). Ein weiterer
Mechanismus ist die antikörperabhängige Aktivierung des Komplementsystems. Dies führt
zu einer direkten Lyse der Pathogene oder wiederum zu einer beschleunigten Phagozytose
durch die opsonisierende Wirkung gebundener Bestandteile der Komplementkaskade.
Eine weitere wichtige Eigenschaft des adaptiven Immunsystems ist die Fähigkeit,
Gedächtnis-Zellen (Memory cells) hervorzubringen. Es handelt sich hierbei um langlebige Bund T-Zellen, die im Falle einer erneuten Konfrontation mit demselben Antigen sehr schnell
(binnen Stunden) für eine hochspezifische und effektive Immunantwort sorgen.
In der vorliegenden Arbeit wurden CD8-T-Zellen von Patienten mit Common Variable
Immunodeficiency (CVID) untersucht, ein Krankheitsbild, das durch einen B-Zell-Defekt
verursacht wird. Deshalb soll hier die Entwicklung und Funktion beider Zelltypen kurz
vorgestellt werden.
B-Zellen
Die Rolle der B-Zellen im Immunsystem besteht in der Produktion von Antikörpern, zudem
erfüllen sie eine wichtige Aufgabe als antigenpräsentierende Zellen (APC). Antikörper (auch
Immunglobuline genannt) sind Proteine, die spezifisch an
Moleküle, i.d.R. kurze
Peptitsequenzen von Proteinen oder Lipopolysaccharide von Krankheitserregern, binden
können. Die Bindungsstelle auf dem Fremdmolekül wird in diesem Zusammenhang auch
Epitop genannt, das gebundene Fremdmolekül allgemein auch Antigen.
B-Zellen entstehen im Knochenmark aus pluripotenten hämotopoetischen Stammzellen und
durchlaufen die ersten Schritte ihrer Differenzierung (oder Reifung) noch im Knochenmark.
Ein wichtiger Vorgang im Rahmen dieser Reifung sind Umlagerungen (Rearrangement)
innerhalb der Genabschnitte, die für die verschiedenen Anteile des B-Zell-Rezeptors (BCR)
codieren. Durch die zufällige Kombination der Genabschnitte wird eine außerordentlich
hohe Diversität des BCR erreicht, sodaß eine Vielzahl von potentiellen Krankheitserregern
erkannt werden kann. Die Spezifität des BCR entspricht derjenigen der Antikörper, welche
–7–
die jeweilige B-Zelle produzieren kann. Im Knochenmark gehen B-Zellen, deren BCR
körpereigene Strukturen erkennt, durch Apoptose zugrunde. Gegebenenfalls kann die BZelle der Apoptose entkommen, wenn durch weitere Veränderungen am BCR keine
Autoreaktivität mehr vorliegt (receptor editing). So wird sichergestellt, daß keine
autoreaktiven B-Zellen das Knochenmark verlassen. Nur ein kleiner Teil der B-Zellen besteht
diese Selektion und verläßt das Knochenmark.
Diese sog. naiven B-Zellen besiedeln anschließend die sekundären lymphatischen Organe wie
Lymphknoten und Milz. Von dort rezirkulieren die Zellen gelegentlich für einige Stunden in
das Blut. Wird eine B-Zellen mit ihrem Antigen konfrontiert, erfolgt durch Interaktion mit
einer CD4-T-Zelle die Induktion der Differenzierung zur Plasmazelle. Im Rahmen dieser
Differenzierung kommt es zu einer starken Proliferation und schließlich zur Produktion von
löslichen Antikörpern durch die Plasmazelle. Im Zuge der Proliferation treten Mutationen
auf, die die Bindungsaffinität des BCR bzw. der produzierten Antikörper verbessern
(somatische Hypermutation). Plasmazellen mit besser passendem BCR bekommen
Überlebenssignale, während bei solchen, deren Bindungsfähigkeit durch die Mutation
verloren geht, Apoptose induziert wird. Außerdem wird ein Antikörperklassenwechsel
induziert, d.h. die Plasmazelle produziert IgG, IgA oder IgE statt IgM. Die Spezifität bleibt
auch nach dem Klassenwechsel erhalten.
Parallel werden Gedächtniszellen generiert, die auf eine erneute Infektion mit dem gleichen
Erreger sehr schnell antworten können. Neben den ruhenden Gedächtniszellen entstehen
unter bestimmten Bedingungen auch langlebige Plasmazellen, die auch Jahre nach dem
letzten Kontakt mit dem Antigen noch meßbare Antikörperserumspiegel aufrechterhalten
können.
CD8-T-Zellen
CD8-T-Zellen erkennen mithilfe ihres T-Zell-Rezeptors (TCR) Peptide, die von allen
kernhaltigen Zellen auf HLA-I-Molekülen präsentiert werden. In der Regel bestehen die
Peptide aus Bruchstücken von zelleigenen Proteinen, gegen die CD8-T-Zellen eine Toleranz
aufweisen, d.h. nicht reagieren. Im Falle einer Virusinfektion werden auf HLA-I-Molekülen
auch Viruspeptide präsentiert, die als „fremd“ erkannt werden können. CD8-T-Zellen sind
–8–
in der Lage, bei infizierten Zellen Apoptose zu induzieren (deshalb auch zytotoxische TZellen genannt) oder die Virusreplikation über die Sekretion von Zytokinen zu hemmen.
CD8-T-Zellen entstehen wie alle Lymphozyten aus hämatopoetischen Stammzellen im
Knochenmark. Sie gelangen als Vorläuferzellen (Prä-T-Lymphozyten) in den Thymus, in dem
die weitere Reifung stattfindet. Die Zellen treten in die Thymusrinde ein, von wo sie weiter
in das Mark der Follikel wandern. Während dieser Wanderung finden die entscheidenden
Etappen der CD8-T-Zell-Reifung statt. Dazu gehören das Rearrangement der für den T-ZellRezeptor codierenden Gene, eine starke Proliferation und eine Positiv- und NegativSelektion. Im Rahmen dieser Selektion werden die T-Zellen mit peptidbeladenen HLA-IKomplexen konfrontiert. Ist die Bindung des TCR zu schwach, d.h. die T-Zelle ist nicht in
der Lage, mit dem körpereigenen HLA-I-Molekül zu interagieren, erhält sie keine
Überlebenssignale und geht zugrunde. Ist die Bindung des TCR an den Komplex aus
körpereigenem Peptid und HLA-I-Molekül so stark, daß die T-Zelle aktiviert werden könnte,
wird bei der (potentiell autoreaktiven) T-Zelle Apoptose induziert. Damit auch solche
Peptide abgedeckt werden, die Bruchstücke nicht universell exprimierter Proteine darstellen
(z.B. Insulin), werden von Stromazellen im Thymus auch solche Proteine gebildet, die für
ihre Funktion nicht unmittelbar erforderlich sind. Die überlebenden CD8-T-Zellen
(schätzungsweise 3% der ursprünglich gebildeten (Egerton 1990)) verlassen den Thymus und
besiedeln anschließend die sekundären lymphatischen Organe, patroullieren aber immer
wieder in der Blutbahn.
Erkennt eine CD8-T-Zelle ein passendes Antigen (z.B. im Rahmen einer Infektion),
proliferiert sie stark und differenziert zu einer Effektorzelle, die die obengenannten
antiviralen Funktionen ausführen kann. Außerdem werden Zytokine sezerniert, die eine
Modulation der restlichen Immunantwort bewirken. Bei chronischen Infektionen können oft
Effektorzellen gefunden werden, die in ihrer Funktionalität eingeschränkt sind. Die
Hintergründe dieser sog. „Erschöpfung“ (exhaustion) sind nicht vollständig geklärt.
Nach einer ausgeheilten Infektion können CD8-T-Gedächtniszellen gefunden werden, aus
denen im Falle einer Reinfektion sehr schnell wirksame Mengen an Effektorzellen gebildet
werden können.
–9–
In den vergangenen Jahren ist eine Fülle von Oberflächenmolekülen beschrieben worden, die
einzeln oder in Kombination charakteristisch für ein bestimmtes postthymisches
Differenzierungsstadium von CD8-T-Zellen sind. Die in dieser Studie verwendeten Marker
werden im Folgenden kurz vorgestellt.
Oberflächenmarker
CCR7
C-C-Motiv-Chemokin-Rezeptor 7 spielt eine wichtige Rolle für das sogenannte Homing,
also das „Nach-Hause-Finden“ in Lymphknoten. Es handelt sich um einen G-Proteingekoppelten Rezeptor mit sieben Transmembrandomänen. Seine Liganden, CCL19 und
CCL21, werden in den Hochendothel-Venolen von Lymphknoten exprimiert und bewirken
eine transmembranöse Migration der CD8-T-Zelle aus dem Blutgefäß in das Gewebe.
Werden CD8-T-Zellen durch Antigenkontakt aktiviert, wird CCR7 herunterreguliert, sodaß
das Molekül als Marker naiver und früh-differenzierter CD8-T-Zellen gilt (Förster 2008,
Campbell 2001).
CD127
IL-7 fördert die Proliferation von naiven CD8-T-Zellen und spielt über die Induktion des
antiapoptotischen Moleküls BCL-2 eine entscheidende Rolle für die Homöostase von
Gedächtniszellen. Die Alphakette des IL-7-Rezeptors wird auch als CD127 bezeichnet. In
Kombination mit anderen Markern können durch die Expression von CD127 GedächtnisCD8-T-Zellen identifiziert werden (Welch 1989, Kaech 2003, Böttler 2006).
CD57
CD57 ist eine Glucuronyltransferase, die auf terminal differenzierten CD8-T-Zellen
exprimiert wird. Diese Zellen sind, gemessen an ihrer Telomerlänge, seneszent, und sind in
ihrer Fähigkeit zur Proliferation eingeschränkt. Die antivirale Effektivität CD57-positiver
CD8-T-Zellen ist vermindert (Brenchley 2003).
CD38
Hierbei handelt es sich um ein Ektoenzym, das die Hydrolyse von zyklischer ADP-Ribose
katalysiert. Es wird auf (z.B. durch Antigenkontakt) aktivierten CD8-T-Zellen verstärkt
– 10 –
exprimiert. Gleichzeitig funktioniert das Molekül als Rezeptor und verstärkt die Proliferation
und Aktivierung und dient außerdem der Zelladhäsion. Die Kinetik der Expression an der
Zelloberfläche ist rasch (<24h nach unspezifischer Aktivierung), sodaß CD38 als Marker für
eine kürzliche Aktivierung dienen kann (Chadburn 1992, Deaglio 2001).
KLRG1
KLRG1 (Killer cell lectin-like receptor subfamily G member 1) ist ein Transmembranprotein
mit Rezeptoreigenschaften. Liganden sind unter anderem E-Cadherine, die praktisch
ubiquitär im gesunden Gewebe exprimiert werden (Gründemann 2006). CD8-T-Zellen, die
KLRG1 exprimieren, proliferieren schlecht, weisen aber gute Effektorfunktionen auf. Die
Expression von KLRG1 deutet auf persistierenden oder repetitiven Antigenkontakt hin
(Voehringer 2002, Thimme 2005).
PD-1
PD-1 (programmed death-1) ist ein inhibitorischer Rezeptor aus der CD28/CTLA4-Familie.
Im Rahmen der CD-Nomenklatur wird er als CD279 bezeichnet. Die Expression von PD-1
ist erhöht auf aktivierten T-Zellen und korreliert mit der Expression von CD38 (Sauce
2007). Sogenannte „erschöpfte“ CD8-T-Zellen mit stark eingeschränkter Funktion und
Proliferation exprimieren PD-1 in hoher Dichte. Dieser Zustand kann durch Blockade der
PD-1-Liganden teilweise aufgehoben werden (Barber 2006).
CD45RA
CD45RA ist eine Isoform der CD45-Familie, die Tyrosinphosphatasen darstellen und an der
Aktivierung von T-Zellen beteiligt sind. CD45RA wird von naiven CD8-T-Zellen exprimiert
und nach Antigenkontakt durch CD45RO ersetzt. Terminal differenzierte CD8-T-Zellen
können CD45RA reexprimieren (Clement 1992, Appay 2008).
CD27
CD27 gehört zur TNF-Rezeptor-Familie und wirkt nach Bindung seines Liganden CD70
kostimulatorisch auf CD8-T-Zellen. Naive und frühdifferenzierte CD8-T-Zellen exprimieren
diesen Rezeptor und verlieren ihn in späteren Stadien, sodaß er, in Kombination mit
weiteren Oberflächenmolekülen, als Differenzierungsmarker eingesetzt werden kann
(Hintzen 1993, Appay 2008).
– 11 –
CD8-T-Zell-Differenzierung
Naive CD8-T-Zellen differenzieren nach Antigenkontakt zu verschiedenen Effektor- und
Gedächtniszellen aus. Es ist nicht ganz klar, ob der Weg von naiven zu terminal
differenzierten CD8-T-Zellen linear oder verzweigt verläuft, und ob terminal differenzierte
CD8-T-Zellen wieder zu früheren Stadien zurückkehren können. Es spricht allerdings vieles
dafür, daß zumindest für den größten Teil der Population von einem linearen und nur in
einer Richtung verlaufenden Differenzierungsweg auszugehen ist (Appay 2008).
Mithilfe der obengenannten Marker lassen sich eine Reihe von CD8-T-Zell-Untergruppen
definieren, die verschiedene postthymische Differenzierungsstadien repräsentieren. Zwar sind
CD8-T-Zellen, die aus periphervenösem Blut isoliert werden können, im Phänotyp und in
ihrer Funktionalität außerordentlich heterogen; jedoch gibt es starke Korrelationen zwischen
Oberflächenmarkern einerseits und Funktionsparametern andererseits, sodaß man mithilfe
einer Kombination von Oberfächenmarkern eine überschaubare Anzahl von Gruppen
definieren kann, die den größten Teil der zirkulierenden CD8-T-Zellen abdecken.
Im Folgenden wird ein Schema vorgestellt, das Sauce et al. vorgeschlagen haben (Sauce 2007;
Abb. 1): Naive CD8-T-Zellen, die noch keinen Kontakt mit ihrem Antigen hatten,
exprimieren CD45RA, CCR7 und CD27 (Subset 1). Nach Antigenkontakt verlieren die
Zellen zunächst CD45RA, somit definiert die Expression von CCR7 und CD27 bei Fehlen
von CD45RA den frühesten antigenerfahrenen Phänotyp (Subset 2). Im Verlauf der weiteren
Differenzierung geht zuerst die Expression von CCR7 (Subset 3), dann von CD27 verloren
(Subset 4). Terminal differenzierte CD8-T-Zellen reexprimieren CD45RA, während CCR7
und CD27 nicht auf ihrer Oberfläche zu finden sind (Subset 5).
Interessanterweise weisen bestimmte virusspezifische CD8-T-Zellen nach einer akut
eliminierten bzw. während einer latenten oder chronischen Infektion einen für die jeweilige
Virusspezifität typischen Phänotyp auf (Abb. 1).
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Subset 1
Subset 2
Subset 3
Subset 4
Subset 5
CCR7+
CD45RA+
CD27+
CCR7+
CD45RA–
CD27+
CCR7–
CD45RA–
CD27+
CCR7–
CD45RA–
CD27–
CCR7–
CD45RA+
CD27–
Telomerlänge
relative Expression
hoch
CD127
CD38
PD-1
KLRG1
CD57
niedrig
Flu
EBV
CMV
Abb. 1: Gezeigt wird die relative Expression verschiedener Oberflächenmarker auf CD8-T-Zellen abhänging
von ihrem Differenzierungsstadium. Außerdem ist zu sehen, welchen Phänotyp bestimmte virusspezifische
CD8-T-Zellen typischerweise aufweisen. (adaptiert nach: Appay 2008)
Common Variable Immunodeficiency (CVID)
Die Common Variable Immunodeficiency (CVID) ist ein genetisch und klinisch heterogenes
Antikörpermangelsyndrom. Der Begriff wurde von Cooper et al. 1973 erstmalig gebraucht,
um diese Entität von anderen Antikörpermangelsyndromen abzugrenzen (Cooper 1973).
CVID ist mit einer Inzidenz von 1:75'000 Lebendgeburten der häufigste primäre
Immundefekt von klinischer Bedeutung. Die Prävalenz wird mit 1:50'000 bis 1:200'000
angegeben. Männer und Frauen sind gleich häufig betroffen. Die Mehrzahl der Fälle tritt
sporadisch auf, eine familiäre Häufung wird in 10 bis 25% der Fälle gefunden, meist liegt ein
autosomal-dominanter Erbgang mit unterschiedlicher Penetranz vor. Das Alter bei Beginn
der symptomatischen Erkrankung zeigt eine zweigipflige Verteilung; der erste Gipfel findet
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sich im mittleren Kindesalter, typisch ist jedoch der Beginn in der zweiten oder dritten
Lebensdekade.
Heute wird die Diagnose einer CVID nach den Empfehlungen der ESID basierend auf
folgenden Befunden gestellt: IgG-Mangel plus IgA- und/oder IgM-Mangel (mindestens zwei
Standardabweichungen unter dem altersadjustierten Normwert), Beginn der klinisch
manifesten Immundefizienz nach Beendigung des zweiten Lebensjahres, schwaches oder
fehlendes Ansprechen auf Impfungen, Abwesenheit von Isohämagglutininen, sowie der
Ausschluß anderer Ursachen des Antikörpermangels (www.esid.org).
Das typische klinische Bild einer CVID ist durch das gehäufte Auftreten bakterieller
Infektionen der oberen und unteren Atemwege gekennzeichnet. Sinusitiden, Bronchitiden
(und in der Folge Bronchiektasen) sowie Pneumonien sind außerordentlich häufig, als
Erreger dominieren bekapselte (Hämophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae) und
atypische Erreger (Mycoplasma spp.). Virale Infektionen sind weniger prominent, obwohl
CVID-Patienten insbesondere mit den Viren der Herpes-Gruppe überdurchschnittlich
häufige und schwere Reaktivierungen zeigen. Als Zeichen einer gegenüber dem Gesunden
eingeschränkten Kontrolle latenter Infektionen zeigen CVID-Patienten gelegentlich
chronisch aktive oder reaktivierende CMV-Infektionen.
Eine Untergruppe von Patienten leidet außerdem unter Autoimmunphänomenen, wie
Zytopenien, Autoimmunthyreoiditen, granulomatösen Erkrankungen und unspezifischer
Lymphoproliferation,
die
sich
klinisch
unter
anderem
als
Splenomegalie
und
Lymphadenopathie manifestieren. Außerdem ist ein erhöhtes Risiko für maligne
Erkrankungen beschrieben worden, insbesondere für Lymphome.
Die wichtigste Komponente der Behandlung der CVID besteht in der lebenslangen
Substitution von Immunglobulinen. Eine engmaschige Kontrolle der Serumspiegel ist
erforderlich, da ein nicht geringer Anteil der Patienten Immunglobuline hyperkatabolisiert,
sodaß die Infusionsmenge und -häufigkeit individuell angepaßt werden müssen. Die
Verabreichung kann intravenös oder subkutan erfolgen, wobei aufgrund neuerer
Untersuchungen die subkutane Gabe favorisiert wird. Im Bedarfsfall ist außerdem eine
großzügige antibakterielle, antivirale oder antimykotische Therapie erforderlich. Einige
Patienten benötigen eine kontinuierliche medikamentöse Infektionsprophylaxe. Die
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Behandlung autoimmuner Prozesse stellt insofern ein Problem dar, weil die nötige
immunsuppressive Therapie die Immundefizienz klinisch verschlechtern kann.
Die Lebenserwartung von CVID-Patienten ist reduziert, auch wenn die Fortschritte in der
Therapie, insbesondere die Substitution von Immunglobulinen zu einer erheblichen
Reduktion der Morbidität und Mortalität geführt haben.
(Park 2008, Warnatz 2008)
Klassifikation
Das außerordentlich heterogene klinische Bild der CVID führte schon früh zu Bestrebungen,
die Erkrankung in klinisch und prognostisch homogenere Gruppen zu unterteilen. Die erste
publizierte Klassifikation stammt von Dickler et al. aus dem Jahr 1974 und basierte auf der
Bestimmung des Anteils von Immunglobulin-tragenden B-Zellen mittels ImmunfluoreszenzMikroskopie (Dickler 1974). Diese Einteilung konnte sich allerdings nicht durchsetzen.
Bryant et al. schlugen 1990 eine funktionelle Klassifikation vor. Sie stimulierten B-Zellen
von CVID-Patienten in vitro mit IL-2 oder mit IL-2 und anti-IgM und maßen die
Produktion von IgM und IgG. Drei Gruppen konnten so unterschieden werden: Gruppe A
umfaßt Patienten, deren B-Zellen weder IgG noch IgM produzieren. B-Zellen von Patienten
aus Gruppe B produzieren ausschließlich IgM. Bei Gruppe C ist in Bezug auf die in-vitroAntikörper-Produktion kein Unterschied zu gesunden Kontrollen festzustellen, obwohl diese
Patienten in vivo reduzierte Antikörperserumspiegel zeigen (Bryant 1990). Diese
Klassifikation stellte sich als wissenschaftlich bedeutungsvoll heraus, allerdings erwies sie sich
für den klinischen Routineeinsatz als technisch zu aufwendig.
Das bessere Verständnis der B-Zell-Reifung und die breite Verfügbarkeit automatisierbarer BZell-Phänotypisierung mittels Durchflußzytometrie führten in den letzten Jahren zu einigen
weiter beachteten Klassifikationen, von denen zwei, die in dieser Arbeit verwendet werden,
hier kurz vorgestellt werden sollen:
– 15 –
Freiburg-Klassifikation
Diese 2002 von Warnatz et al. vorgeschlagene Klassifikation basiert auf dem Anteil an
klassengewechselten, reifen Gedächtnis-B-Zellen. Gruppe I hat weniger als 0,4%
CD27(+)IgM(–)IgD(–) B-Zellen (Gesunde: >0,5%). Die anderen Patienten fallen in Gruppe
II. Gruppe I wird weiter unterteilt in Gruppe Ia mit einem erhöhtem Anteil (>20%) und
Gruppe Ib mit einem normalen Anteil (<20%) von unreifen CD19(+)CD21(–) B-Zellen
(Warnatz 2002).
EUROclass
Diese von Wehr et al. 2008 vorgestellte Studie ist ein Versuch, vorbeschriebene
Klassifikationen zu vereinen und mithilfe von klinischen Befunden, wie Granulomen,
Autoimmunzytopenien und Splenomegalie, feinzujustieren. Die multivariate Korrelation von
B-Zell-Markern und klinischen Phänomenen führte zu einer relativ komplizierten
Einteilung, die in foldendem Schaubild dargestellt wird (Wehr 2008).
A
CVID
≤1% B-Zellen
>1% B-Zellen
B
Gruppe B–
>2% switched
memory B-Zellen
Gruppe B+
Gruppe B+
>2% switched
memory B-Zellen
≤2% switched
memory B-Zellen
≤2% switched
memory B-Zellen
Gruppe smB+
Gruppe smB+
Gruppe smB–
≥9% transitionale
B-Zellen
<9% transitionale
B-Zellen
Gruppe smB– Trhi
Gruppe smB– Trnorm
≥10% CD21low
B-Zellen
Gruppe smB–
<10% CD21low
B-Zellen
Gruppe smB+21lo
Gruppe smB+21norm
≥10% CD21low
B-Zellen
Gruppe smB–21lo
<10% CD21low
B-Zellen
Gruppe smB–21norm
Abb. 2: Diese Abbildung zeigt die Einteilung von CVID-Patienten anhand des EUROclass-Schemas nach
transitionalen B-Zellen (A), die Gruppen smB+/– werden parallel auch nach CD21low B-Zellen unterteilt
(B). (adaptiert nach: Wehr 2008).
Ätiologie
Die Ätiologie der Erkrankung ist bislang nur sehr unvollständig verstanden und spielt bislang
für die Diagnosestellung keine entscheidende Rolle. Fünf verschiedene genetische Defekte
konnten bislang als zugrundeliegend identifiziert werden. Interessanterweise zeigte sich, daß
bestimmte klinische Komplikationen und Veränderungen des B-Zell-Kompartiments mit
– 16 –
den jeweiligen Defekten assoziiert sind. Die beschriebenen genetischen Defekte sind im
einzelnen:
ICOS
ICOS (inducible costimulator) ist ein Mitglied der CD28-Rezeptor-Familie und wird
ausschließlich auf aktivierten T- und NK-Zellen gefunden. Das Fehlen dieses Rezeptors (bzw.
seines Liganden) verhindert die Entstehung von lymphatischen Keimzentren und somit die
Entstehung von Gedächtnis-B-Zellen. Beim Menschen scheint vor allem eine autosomalrezessiv erbliche Form mit einer genetischen Deletion der Exons 2 und 3 vorzukommen.
Etwa 2% aller Patienten mit CVID zeigen diesen genetischen Defekt. Klinisch apparent sind
eine
starke
Lymphoproliferation
Autoimmunphänomene.
Im
(bis
hin
zu
B-Zell-Kompartiment
malignen
Lymphomen)
fällt
komplettes
ein
und
Fehlen
klasssengewechselter Gedächtnis-B-Zellen auf. Dies war der erste genetische Defekt, der
kausal mit dem Auftreten von CVID in Verbindung gebracht werden konnte (Grimbacher
2003, Salzer 2004).
TACI
TACI (transmembrane activator and CAML interactor) gehört zur TNF-Rezeptor-Familie.
Der Rezeptor wird vor allem von peripheren B-Zellen exprimiert und scheint eine wichtige
Rolle bei der Reifung und Homöostase der Zellen zu spielen. 2005 beschrieben Salzer et al.
und Castigli et al. unabhängig voneinander Mutationen im für TACI codierenden Gen
(TNFRSF13), von denen mindestens einige auch bei heterozygotem Genotyp eine CVID
hervorrufen können. Mutationen wurden bei mehreren Familien nachgewiesen. Ein
eindeutiger klinischer Phänotyp scheint nicht zu bestehen (Castigli 2005, Salzer 2005).
BAFF-R
Der
BAFF-Rezeptor
gehört
ebenfalls
zur
TNF-Rezeptor-Familie
und
ist
ein
Transmembranprotein, welches BAFF (B-cell activating factor) bindet und von allen Igpositiven B-Zellen, aber nicht Plasmazellen exprimiert wird. Eine Mutation im codierenden
Gen konnte in zwei miteinander verwandten Individuen nachgewiesen werden, allerdings
zeigte nur einer der beiden Geschwister den klinischen Phänotyp einer CVID, trotz
ähnlicher immunologischer Veränderungen (Warnatz 2009).
– 17 –
CD19
Homozygote Mutationen im Gen für den B-Zell-Corezeptor CD19 konnten von van Zelm
et al. erstmals bei vier Patienten aus zwei Familien nachgewiesen und für das Vorliegen einer
CVID verantwortlich gemacht werden. Offenbar reifen die B-Zellen regulär aus, reagieren
aber schlecht auf Antigen-Stimulation (van Zelm 2006).
CD20
CD20 war einer der ersten beschriebenen B-Zell-spezifischen Differenzierungsmarker.
Inzwischen sind gegen CD20 gerichtete Antikörper für den klinischen Gebrauch verfügbar
und werden erfolgreich z.B. bei B-Zell-Neoplasien eingesetzt. Kürzlich konnte bei einer
CVID-Patientin mit drastischem funktionellen IgG-Mangel und ausgeprägter klinischer
Symptomatik eine homozygote CD20-Mutation nachgewiesen werden (Kuijpers 2010).
Insgesamt muß festgestellt werden, daß alle bislang bekannten Mutationen nur einen kleinen
Bruchteil der diagnostizierten Fälle von CVID erklären können. Die bisherigen Ergebnisse
deuten auf ein genetisch ausgesprochen heterogenes Krankheitsbild hin. Vor diesem
Hintergrund bleibt abzuwarten, ob sich eine genetische Einteilung der CVID etablieren
lassen wird.
T-Zell-Alterationen bei CVID
Auch wenn es sich bei CVID primär um einen B-Zell-Defekt handelt, konnten verschiedene
CD8-T-Zell-Alterationen bei Patienten mit CVID beschrieben werden. So wurden mehrfach
Hinweise gefunden, daß sich CD8-T-Zellen von CVID-Patienten vermehrt in einem
aktivierten Effektorstatus befinden und der Anteil von naiven CD8-T-Zellen vermindert ist.
Im einzelnen wurde beschrieben, daß der Anteil von CD28-positiven CD8-T-Zellen
vermindert ist (North 1998), daß außerdem der Anteil von naiven CD8-T-Zellen (basierend
auf der Expression von CD45RA und CD62L, bzw. CD45RA und CCR7) verringert
(Giovanetti 2007, Lanio 2009) und der Nachschub naiver T-Zellen aus dem Thymus
vermindert ist (Giovanetti 2007). Holm et al. beschrieben eine verringerte Expression des
CCR7-Gens, während das Expressionsmuster anderer Gene auf einen aktivierten
Effektorstatus hinwiesen (Holm 2004). Ein erhöhter Anteil aktivierter CD8-T-Zellen ist
auch von anderen Arbeitsgruppen beschrieben worden, gemessen anhand einer im Vergleich
– 18 –
zu Gesunden erhöhten Expression von CD38 (Carbone 2006) und HLA-DR (Giovanetti
2007).
Interessanterweise konnten einige dieser Beobachtungen mit dem Auftreten bestimmter
klinischer Parameter in Zusammenhang gebracht werden. Splenomegalie scheint mit einer
erhöhten Expression von CD57, CD38 und HLA-DR auf CD8-T-Zellen einherzugehen
(Wright 1990, Lanio 2009). Bei Patienten mit granulomatösen Erkrankungen konnten
CD57-positive CD8-T-Zellen in erhöhter Frequenz nachgewiesen werden (Mullighan 1997).
Insgesamt scheint ein klinisch schwerwiegender Verlauf der Erkrankung mit besonders
ausgeprägten Veränderungen des CD8-T-Zell-Kompartiments assoziiert zu sein.
Virusspezifische CD8-T-Zellen bei CVID
Über den Phänotyp und die Funktion virusspezifischer CD-8-T-Zellen bei CVID ist bislang
nur wenig bekannt. Bis zum jetzigen Zeitpunkt ist nur eine Arbeit publiziert worden, die
dieser Frage mithilfe von HLA-I-Multimeren nachgeht. So beschreiben Raeiszadeh et al., daß
ca. die Hälfte der 29 untersuchten CVID-Patienten Antworten gegen CMV- oder EBVEpitope zeigten. Dabei war der Anteil CMV-spezifischer CD8-T-Zellen bei Patienten mit
CVID gegenüber Gesunden erhöht. Außerdem beschrieben sie, daß CMV-spezifische CD8T-Zellen bei CVID-Patienten, basierend auf der Expression von CD27 und CD28, einen
weiter differenzierten Phänotyp aufwiesen als in der Kontrollkohorte, während dies bei EBVspezifischen T-Zellen nicht beobachtet wurde. Ferner wurde ein hoher Anteil CD57-positiver
CMV-spezifischer CD8-T-Zellen in der CVID-Kohorte nachgewiesen, allerdings lagen keine
Daten für die Kontrollkohorte vor (Raeiszadeh 2006).
Funktion
Insgesamt scheint die Funktion von CD8-T-Zellen bei CVID-Patienten nicht wesentlich
eingeschränkt zu sein. Nach unspezifischer Stimulation wurde sogar eine erhöhte Interferongamma-Produktion beschrieben (North 2008), CMV- und EBV-spezifische CD8-T-Zellen
scheinen bei CVID ebenfalls keinen schweren Defekt aufzuweisen (Raeiszadeh 2006). Eine
– 19 –
weitere Arbeit konnte kürzlich nachweisen, daß Proliferation und Zytokinproduktion von
CD8-T-Zellen gegen CMV, HHV-6B und Herpes-simplex-Virus intakt sind (Haveman
2010). Allerdings stellte eine Arbeit eine gestörte in-vitro-Antwort auf ein Neoantigen (HIV
env) bei CD8-T-Zellen von CVID-Patienten gegenüber gesunden Kontrollpersonen fest
(Stagg 1994).
Studien in B-Zell-defizienten Mäuse zeigten nach einer akuten Infektion mit LCMV ein
normales Priming und eine regelrechte Expansion von CD8-T-Zellen mit entsprechender
Spezifität. In der chronischen Phase der Infektion wurden LCMV-spezifische CD8-T-Zellen
je nach Wirtsgenotyp jedoch deletiert oder dysfunktional (Christensen 2003, Thimme
2005). In CD40-defizienten Mäusen gehen funktionale CD8-T-Zell-Antworten gegen
LCMV in der chronischen Phase der Infektion ebenfalls verloren, allerdings läßt sich dies
durch Injektion von LCMV-spezifischen Antikörpern verhindern (Bachmann 2004). Dies
könnte der Situation in mit Immunoglobulinen behandelten CVID-Patienten ähneln. Da
CVID jedoch ein heterogenes Krankheitsbild ist, gibt es kein einzelnes, verläßliches
Mausmodell, sodaß die in Mäusen gewonnenen Erkenntnisse nur sehr bedingt auf die
immunologische Situation in Patienten übertragbar sind.
Ziele dieser Arbeit
Viele der vorhergehenden Studien erfolgten nur an kleinen Kohorten und lieferten zum Teil
widersprüchliche Ergebnisse. Deshalb war es Ziel dieser Arbeit, in einer großen Kohorte zu
untersuchen, inwieweit sich der Phänotyp von CD8-T-Zellen zwischen CVID-Patienten und
immunokompetenten Kontrollpersonen unterscheidet. Besonderes Augenmerk gilt dabei
virusspezifischen Antworten gegen CMV, EBV und Influenza. Außerdem sollen eventuelle
Alterationen mit klinischen Parametern korreliert werden. Folgende zentrale Fragen wurden
untersucht:
1.
Unterscheiden sich die CD8-T-Zell-Populationen von CVID-Patienten und
Immunokompetenten hinsichtlich ihrer Differenzierung?
– 20 –
2.
Korrelieren
bestimmte
Alterationen
im
CD8-T-Zell-Differenzierungsstatus
innerhalb der CVID-Kohorte mit der B-Zell-Differenzierung, klinischen
Parametern oder dem Infektionsstatus mit CMV und EBV?
3.
Unterscheiden sich Anzahl oder Phänotyp virusspezifischer CD8-T-Zellen
zwischen den Studienkohorten?
4.
Sind virusspezifische CD8-T-Zellen von CVID-Patienten funktionell?
– 21 –
Material und Methoden
Patienten
Patienten mit der gesicherten Diagnose einer CVID, die sich zwischen Februar 2007 und
April
2008
zu
Routinekontrollen
in
der
immunologischen
Ambulanz
des
Universitätsklinikums Freiburg vorstellten, wurden nach vorhergehender Aufklärung und
Einwilligung für die Studie rekrutiert. Ein positives Votum der Freiburger Ethikkommission
lag vor (Ziffern 239/99 und 299/2001). Die Patienten wurden für HLA-A2-HaplotypExpression nach den unten beschriebenen Methoden getestet. HLA-A2-positive Patienten
wurden in die Studie eingeschlossen. Zum Zeitpunkt der Blutentnahme zeigte kein Patient
Anzeichen einer akuten Infektion. Ein Patient mit akuter CMV-Reaktivierung wird
gesondert behandelt.
Laborchemische und hämatologische Parameter wurden nach etablierten Standardmethoden
im Zentrallabor des Universitätsklinikums bestimmt. Die klinischen Angaben zur Diarrhö
stützen sich auf systematische Anamnese; Lymphadenopathie, Splenomegalie und
granulomatöse Erkrankung wurden durch klinische Untersuchung und/oder bildgebende
Verfahren wie Ultraschall, konventionelles Röntgen, CT oder MRT festgestellt.
Durchflußzytometrie
Ein wesentliches Verfahren dieser Arbeit ist die Durchflußzytometrie. Dabei werden
Oberflächenmoleküle oder (nach Permeabilisierung) intrazelluläre Strukturen der Zellen mit
spezifischen, Fluorochrom-gekoppelten Antikörpern angefärbt. Im Durchflußzytometer wird
die Einzelzellsuspension durch eine Meßkammer geleitet, in der Laser verschiedener
Wellenlänge auf die Zelle treffen. Mittels mehrerer Detektoren werden die Ablenkung der
Strahlen und das von den Fluoreszenzfarbstoffen emittierte Licht gemessen. Auf diese Weise
lassen sich Informationen über die Größe und Form der Zellen ableiten, Lymphozyten
können
von
Detritus
und
anderen
Zellen
unterschieden
werden.
Über
das
Fluoreszenzverhalten der Zellen können die gefärbten Marker indentifiziert und ihre
jeweiligen Expressionsdichten gemessen werden. Bei einer Messung werden mehrere
– 22 –
zehntausend bis wenige Millionen Zellen registriert und computergestützt ausgewertet.
Außerdem ist es mit diesem Verfahren möglich, antigenspezifische CD8-T-Zellen zu
detektieren. Man verwendet dazu Komplexe aus aneinander gekoppelten HLA-I-Molekülen,
die mit einem bestimmten Peptid beladen sind. Zusätzlich befindet sich in diesem Komplex
ein Fluoreszenzfarbstoff. Die Peptide werden so gewählt, daß ein immunodominantes Epitop
des gewünschten Virus abgedeckt wird. Die Multimere binden an T-Zell-Rezeptoren von
CD8-T-Zellen, die dieses Epitop spezifisch erkennen. Damit die Bindung stark genug für die
technische Auswertung ist, eignen sich Komplexe aus fünf beladenen MHC-I-Molekülen,
sog. Pentamere, besonders gut. Das gekoppelte Fluorochrom ermöglicht nun die
Detektierung epitopspezifischer CD8-T-Zellen in der Durchflußzytometrie. Werden
gleichzeitig, wie oben beschrieben, Oberflächenmoleküle markiert, erhält man ein
außerordentlich leistungsfähiges Verfahren, um den Phänotyp virusspezifischer CD8-TZellen zu analysieren.
Für diese Arbeit wurde ein FACS Canto II der Firma BD Bioscience (San Jose, CA, USA)
verwendet, die Erfassung und Speicherung der Daten erfolgte mit der dazugehörigen
Software (FACS Diva).
Medien und Puffer
Für die weiter unten beschriebenen Experimente wurden verschiedene Medien verwendet,
die teilweise fertig bezogen oder individuell gemischt wurden. Folgende Chemikalien und
Medien wurden verwendet:
– 23 –
Name
Hersteller
Dimethylsulfoxid (DMSO)
Sigma-Aldrich Chemie (Steinheim, D)
Trypan-Blau
Sigma-Aldrich Chemie (Steinheim, D)
Dulbeccos Phosphatgepufferte Saline (D-PBS)
Invitrogen Life Technologies (Karlsruhe, D)
fetales Kälberserum (FCS)
Biochrom (Berlin, D)
Hepes-Puffer (1M)
Biochrom (Berlin, D)
Pancoll Separationsmedium
PAN Biotech GmbH (Aidenbach, D)
RPMI-1640
Invitrogen Life Technologies (Karlsruhe, D)
Cytofix/Cytoperm-Puffer
BD Pharmingen, San Diego, CA, USA
Perm/Wash-Puffer
BD Pharmingen, San Diego, CA, USA
GolgiPlug
BD Pharmingen, San Diego, CA, USA
Tab. 1: In dieser Arbeit verwendete Fertigchemikalien mit den jeweiligen Herstellern.
Aus diesen Ausgangschemikalien und Mischungen wurden eine Reihe von Puffern
hergestellt.
Name
Zusammensetzung
Einfriermedium
80% FCS
10% DMSO
10% RPMI-1640
RPMI-Vollmedium (RPMI+++)
RPMI-1640 + 2 mM L-Glutamin
10% FCS
100 U/ml Penicillin
100 µg/ml Streptomycin
1,5% Hepes-Puffer (1 M)
Färbe-Puffer (Stain Buffer = SB)
D-PBS
1% FCS
Fixierpuffer
D-PBS
2% Paraformalinaldehyd (PFA)
Tab. 2: Zusammensetzung der in dieser Arbeit gebrauchten Pufferlösungen.
Antikörper
Für die Färbungen wurden eine Reihe von Antikörpern verwendet. Wenn Antikörper mit
verschiedenen Fluorochromen für die gleiche Spezifität verwendet wurden, wurden nach
– 24 –
Möglichkeit
Antikörper
der
gleichen
Klone
ausgewählt.
Sonst
wurde
durch
Vergleichsmessungen sichergestellt, daß die Klone äquivalente Ergebnisse zeigen.
Spezifität
Klon
Fluorochrom
Hersteller
CD8
SK1
AmCyan
BD Pharmingen, San Diego, CA, USA
CD8
SK1
PerCP
eBioscience, San Diego, CA, USA
CD27
O323
APC-Alexa 750
eBioscience, San Diego, CA, USA
CD38
HIT2
FITC
BD Pharmingen, San Diego, CA, USA
CD38
HIT2
PE
BD Pharmingen, San Diego, CA, USA
CD38
HIT2
PE-Cy7
BD Pharmingen, San Diego, CA, USA
CD45RA
HI100
PerCP-Cy5.5
eBioscience, San Diego, CA, USA
CD45RA
HI100
FITC
eBioscience, San Diego, CA, USA
CD57
HCD57
PE
BioLegend, San Diego, CA, USA
CD57
NC1
FITC
BeckmanCoulter, Brea, CA, USA
CD127
R34.34
PE
BeckmanCoulter, Brea, CA, USA
CD127
eBioRDR5
APC-Alexa 750
eBioscience, San Diego, CA, USA
CD127
eBioRDR5
PacificBlue
eBioscience, San Diego, CA, USA
CCR7
150503
FITC
R&D Systems, Minneapolis, MN, USA
CCR7
3D12
PE-Cy5.5
BD Pharmingen, San Diego, CA, USA
PD-1
MIH4
PE
eBioscience, San Diego, CA, USA
PD-1
MIH4
FITC
eBioscience, San Diego, CA, USA
KLRG1
13A2
PE
KLRG1
13A2
Alexa488
bereitgestellt durch: H. Pircher, Freiburg
(Referenz: Voehringer 2002)
Tab. 3: Diese Tabelle zeigt die benutzten Antikörper mit ihren jeweiligen Spezifitäten, Klonen und
Herstellern.
Peptide und Multimere
Es wurden vorbeschriebene, für HLA-A2 immunodominante Epitope von Influenza, CMV
und EBV ausgewählt. Entsprechende Peptide wurden mit freien NH2- und COOH-Termini
kommerziell bezogen. Die Peptide wurden zunächst in 100% DMSO gelöst und
anschließend mit RPMI+++ auf eine Konzentration von 1 mg/ml verdünnt. Entsprechende
HLA-A2-Multimere wurden ebenfalls kommerziell bezogen. Eine Aufstellung der Epitope
findet sich in folgender Tabelle.
– 25 –
Virus
Epitop
(Aminosäuresequenz)
Protein
Position
CMV
NLVPMVATV
pp65
495
EBV
GLCTLVAML
BMLF-1
259
Influenzavirus
GILGFVFTL
Matrix
58
Tab. 5: Eine Aufstellung der benutzten Epitope in Einbuchstaben-Schreibweise für die jeweiligen Viren.
Außerdem ist das das Epitop enthaltende Protein mit der Epitopposition angeben.
Blutaufarbeitung
Um Artefakte durch Zell- und Plasmabestandteile zu vermeiden, wurden aus dem Blut
mononukleäre Zellen (PBMC) angereichert. Das EDTA-antikoagulierte, am gleichen Tag
entnommene Blut wurde gepoolt, im Verhältnis 1:1 mit PBS verdünnt, portionsweise über
ein Lymphozyten-Separationsmedium geschichtet und anschließend für 20 min bei 2000 U/
min zentrifugiert (Ausschwingen ohne Bremse). Erythrozyten, Thrombozyten und
Zelldetritus sammeln sich am Boden des Gefäßes, Leukozyten werden von dem Medium
zurückgehalten und reichern sich auf der Grenzfläche zwischen Separationsmedium und
Plasma an. Von hier wurden diese vorsichtig mithilfe einer Pipette abgenommen und
zweimal gewaschen (Resuspendieren in PBS und Zentrifugieren für 10 min bei 1600 U/
min). Die Zellen wurden sofort verarbeitet oder kryokonserviert. Kleine Portionen des
Plasmas wurden für zukünftige Untersuchungen bei –20°C eingefroren. Um die
Zellkonzentration in der Suspension zu bestimmen, wurden 20 µl im Verhältnis von 1:4 mit
einer Trypan-Blau-Lösung gefärbt und in einer Neubauer-Zählkammer gegeben. Die Zahl
der typisch vital geformten Zellen in einem Quadranten des Zählfeldes multipliziert mit 0,5
* 106 ergab die Zahl der Zellen pro 1 ml der Suspension. Aus 50 ml Blut konnten auf diese
Weise typischerweise 80 bis 150 Mio PBMC isoliert werden.
– 26 –
Färbungen
HLA-A2-Färbung
Da HLA-I-Multimere jeweils nur für einen bestimmten HLA-Typ passen und die Zahl der
verfügbaren Multimere begrenzt ist, wurden für diese Arbeit nur Patienten mit HLA-A2,
einem in Europa sehr häufigen HLA-Typ, ausgewählt.
Aus der PBMC-Suspension wurde ein Volumen entsprechend 2 Mio PBMC entnommen
und für 10 min bei 1600 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das
Zellpellet in 200 µl SB resuspendiert und in zwei Kammern einer 96-Loch-Platte aufgeteilt.
Anschließend wurde dem einen Ansatz ein PE-konjugierter Isotyp-Antikörper zugegeben,
dem anderen ein PE-konjugierter Antikörper gegen HLA-A2. Die Ansätze wurden für 10
min bei 4°C inkubiert, anschließend bei 1600 U/min für 4 min abzentrifugiert, zweimal mit
SB gewaschen, um nicht gebundenen Antikörper zu entfernen, und anschließend in jeweils
150 µl 2% PFA fixiert. Für die Messung im Durchflußzytometer wurden die Ansätze jeweils
1:1 mit D-PBS verdünnt.
Multimer-Färbung
Das entsprechende Volumen für 4 Mio PBMC wurde aus der PBMC-Suspension
entnommen und für 10 min bei 1600 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen
und das Zell-Pellet in 400 µl SB resuspendiert. Anschließend wurden je 100 µl der
Suspension (entsprechend 1 Mio PBMC) in eine Kammer einer 96-Loch-Platte pipettiert, so
daß man vier Ansätze erhielt. Ab hier erfolgten alle Arbeitsschritte bei nur schwacher
Beleuchtung, um ein Ausbleichen der Fluorochrome zu verhindern. Die für die jeweilige
Charge austitrierte Menge Multimer-Lösung (in der Regel zwischen 0,5 und 1,5 µl) wurde
auf 50 µl verdünnt, und zwar je einmal für CMV-, EBV- und Flu-Multimere, plus eine
Negativ-Kontrolle ohne Multimer. In jeden Ansatz wurden nun 50 µl Multimer-Lösung
gegeben und die Platte für 15 min bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Es erfolgten zwei
Waschschritte: Zentrifugieren für 4 min bei 1600 U/min, Abkippen der Überstände und
Resuspendieren in 150 µl SB je Ansatz. Nach dem zweiten Schritt wurden die Zell-Pellets in
jeweils 95 µl SB resuspendiert und 5 µl einer Maus-IgG1-Lösung zugegeben und die Ansätze
– 27 –
für 10 min bei 4°C inkubiert, um unspezifische Bindungen abzusättigen. Anschließend
wurde die Platte wieder bei 1600 U/min für 4 min zentrifugiert, die Überstände abgekippt
und die Zell-Pellets in je 99 µl SB resuspendiert. Danach wurde in jeden Ansatz 1 µl einer
PE-konjugierten anti-CD8-Lösung gegeben und die Platte für 15 min bei Raumtemperatur
inkubiert. Dann erfolgten wiederum zwei Waschschritte: Abzentrifugieren bei 1600 U/min
für 4 min, Abkippen der Überstände und Resuspendieren in 150 µl SB. Nach dem zweiten
Schritt wurden die Ansätze statt in SB in 150 µl 2% PFA resuspendiert, um diese zu fixieren.
Vor der Messung im Durchflußzytometer wurden die Ansätze in die zum Gerät passenden
Reagenzgläser gefüllt und im Verhältnis 1:1 mit PBS verdünnt.
Sonstige Färbungen
Zunächst wurde so verfahren wie im vorigen Abschnitt beschrieben. Die Mengen wurden der
jeweiligen Zahl der Ansätze angepaßt. Nach dem Waschschritt, der sich an die Inkubation
mit Maus-IgG1 anschließt, wurde allerdings kein CD8-PE-Antikörper zugefügt, sondern ein
CD8-PerCP- oder CD8-AmCyan-Antikörper, sowie eine Kombination weiterer Antikörper
gegen ausgewählte Oberflächenmoleküle. Die Ansätze wurden jeweils mit SB auf 100 µl
verdünnt. Dann erfolgten eine 15-minütige Inkubation bei Raumtemperatur und zwei
Waschschritte wie oben beschrieben. Wurde ein CD8-PerCP-Antikörper verwendet, wurden
die Ansätze wie oben in 150 µl 2%-PFA-Lösung fixiert; wurde ein CD8-AmCyanAntikörper verwendet, wurde stattdessen reines PBS verwendet, weil bei den mit diesem
Antikörper verwendeten Fluorochrom-Kombinationen durch unerwünschte chemische
Reaktionen andernfalls Verfälschungen der Fluoreszenz auftreten können. Die Ansätze
wurden vor der Messung in passende Reagenzgläser überführt und mit PBS auf 450 µl
aufgefüllt.
Interferon-gamma-Färbung
Pro getestetem Peptid wurden 0,5 Mio PBMC verwendet, zusätzlich je 0,5 Mio PBMC für
eine Negativ- und eine Positivkontrolle. Das entsprechende Volumen wurde für 10 min bei
1600 U/min zentrifugiert und das entstandene Zellpellet in 200 µl streng sterilem RPMI pro
Ansatz gelöst. Die Ansätze wurden auf einer 96-Loch-Platte verteilt. Anschließend wurden in
– 28 –
jeden Ansatz 10 Einheiten Interleukin-2, 0,2 µl Brefeldin-A/GolgiPlug und in die TestAnsätze 3 µg des untersuchten Peptids gegeben. In die Positivkontrolle wurden 5 µl PMAund 5 µl Ionomycin-Lösung pipettiert. Die Platte wurde nun für 5 h bei 37°C und 5% CO2
inkubiert. Dann wurde die Platte für 4 min bei 1600 U/min zentrifugiert und die
Überstände wurden verworfen. Die Zellen wurden in 45 µl SB resuspendiert und in jeden
Ansatz 5 µl Maus-IgG1-Lösung gegeben. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei
Raumtemperatur wurde jeder Ansatz mit 90 µl SB verdünnt, die Platte wieder für 4 min bei
1600 U/min zentrifugiert und die Überstände wurden verworfen. Nun wurden die
Zellpellets in je 49 µl SB resuspendiert und jeweils 1 µl der Anti-CD8-PE-Lösung zugegeben.
Die Platte wurde für 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Jetzt erfolgten zwei
Waschschritte: Jeweils Verdünnen der Ansätze auf 150 µl mit SB und Zentrifugieren für 4
min bei 1600 U/min. Nach dem zweiten Waschschritt wurden die Ansätze in 100 µl Cytofix/
Cytoperm resuspendiert und für 15 min zwischen 0°C und 4°C inkubiert. Dann erfolgten
zwei Waschschritte, allerdings wurde hier statt SB jeweils 150 µl Permwash-Lösung
verwendet. Anschließend wurden die Zellen in 48 µl Permwash-Lösung resuspendiert, in
jeden Ansatz 2 µl Anti-Interferon-gamma pipettiert und die Platte für 20 min bei 4°C
inkubiert. Es erfolgten nun wiederum zwei Waschschritte mit Permwash-Lösung. Zuletzt
wurden die Zellpellets in je 100 µl Fixierpuffer resuspendiert und vor der Messung im
Durchflußzytometer in passende Reagenzgläser überführt und mit 150 µl PBS verdünnt.
Auswertung
Durchflußzytometrie
Die Auswertung der durchflußzytometrischen Daten erfolgte mit der Software FlowJo
(Version 8.7.3) der Firma Treestar Inc. (San Carlos, CA, USA). Lymphozyten wurden im
FSC/SSC-Gitter identifiziert, anschließend wurde ein Gate auf CD-8-hoch-positive Zellen
gesetzt, sodaß z.B. NK-Zellen ausgeschlossen wurden; an den so ermittelten CD8-T-Zellen
wurden die weiteren Analysen vorgenommen. Bei den verwendeten Oberflächenmarkern
grenzen sich positive und negative Populationen gut voneinander ab, sodaß die Gates visuell
ermittelt werden konnten, ohne Zuhilfenahme von Positiv- und Negativkontrollen (Abb. 4).
Es wurde jeweils der relative Anteil der CD8-T-Zellen ermittelt, die einen bestimmten
Marker exprimieren. Die Subpopulationen in der 8-Farben-Durchflußzytometrie wurden
– 29 –
durch sogenanntes Boolean Gating definiert, d.h. durch logische Verknüpfung der
definierten Parameter.
200K
<APC-A>: pent
10
SSC-A
150K
38.5
50K
10
4
20.8
10
100K
5
CMV
CMV
10
3
5
10
4
10
3
<APC-A>: pent
250K
0
3.64
0
0
0
50K
100K
150K
200K
0
250K
10
FSC-A
2
3
4
10
10
<AmCyan-A>: CD8
10
5
0
10
2
3
4
10
10
<AmCyan-A>: CD8
10
5
Abb. 3: Im Vorwärts-/Seitwärts-Gitter wird die Lymphozytenpopulation definiert. Anschließend wird ein
Gate auf die CD8-T-Zellen gelegt und zusätzlich die virusspezifische CD8-T-Zell-Population bestimmt.
10
3
10
4
10
3
0
CD45RA
3 4
10
4
10
3
3
4
0
10
10
<Pacific Blue-A>: CD127
10
46.2
44.6
10
4
10
3
2
3
4
0 10
10
10
10
<PerCP-Cy5-5-A>: CD45RA
5
3
4
3
4
0
10
10
10
<APC-Alex 750-A>: CD27
1500
1500
1000
1000
53.8
# Cells
400
55.6
44.4
500
500
100
200
26.5
0
0
3 4
0
45
3
0
5x10 10
5x1010
<PE-Cy7-A>: CCR7
10
3
2
0
5
10
4
10
3
3
10
10
<PE-A>: CD38
4
10
4
5
0
10
10
10
<APC-Alex 750-A>: CD27
KLRG1
0
0
3
0 10
10
10
10
<PerCP-Cy5-5-A>: CD45RA
10
5
10
4
10
3
0
5
0
3
10
10
<PE-A>: PD-1
4
10
5
0
3
4
10
10
<Alexa 488-A>: KLRG1
10
10
4
10
3
5
0
3
10
10
<PE-A>: CD57
4
10
5
600
900
400
90.5
89.7
10.3
0
3
10
10
<PE-A>: CD38
4
10
5
600
9.52
200
300
200
46
54
0
0
0
400
# Cells
400
600
# Cells
# Cells
# Cells
5
800
600
200
10
0
1200
800
5
CD57
<APC-A>: tet CMV
4
10
73.5
0
5
<APC-A>: tet CMV
10
10
PD-1
<APC-A>: tet CMV
<APC-A>: tet CMV
5
4
0
10
10
<Pacific Blue-A>: CD127
CD38
10
5
600
# Cells
200
5
0
5
800
55.4
CD27
10
0
45
400
# Cells
5
0
0
5x10 10
5x1010
<PE-Cy7-A>: CCR7
300
10
<APC-A>: tet CMV
4
5
# Cells
10
CD127
10
<APC-A>: tet CMV
5
<APC-A>: tet CMV
<APC-A>: tet CMV
CCR7
10
0
3
10
10
<PE-A>: PD-1
4
10
5
61.9
38.1
0
0
3
4
10
10
<Alexa 488-A>: KLRG1
10
5
0
3
10
10
<PE-A>: CD57
4
10
5
Abb. 4: Diese Abbildung zeigt exemplarische Gatings für alle in dieser Studie verwendeten
Oberflächenmarker.
– 30 –
Statistik
Statistische Analysen wurden mit dem Programm Prism (Version 5.0.3) von GraphPad
Software Inc. (San Diego, CA, USA) durchgeführt. Je nach Fragestellung wurden
verschiedene Tests durchgeführt, diese sind jeweils angegeben. Signifikanz wurde bei einem
p<0,05 angenommen.
– 31 –
Leukozyten
(Tsd/µl)
Thromboz.
(Tsd/µl)
Hb (g/dl)
GOT (U/l)
gamma-GT
(U/l)
GPT (U/l)
Diarrhoe
Splenomegaie
Lymphadenopathie
Granulome
CMV-pos.
EBV-pos.
Flu--pos.
nor nor
nor lo
n.v.
+
– nor lo
+
+ nor nor
+
– nor nor
+
– nor nor
+
+ nor nor
+
+ nor nor
+
–
hi
lo
+
– nor nor
+
–
hi
lo
+
+ nor nor
+
+ nor nor
+
+ nor nor
+
– nor nor
+
+ nor lo
+
–
hi
lo
+
– nor nor
+
– nor nor
+
+ nor lo
+
–
hi
lo
– n.v. n.v. n.v.
+
+ nor lo
– n.v. n.v. n.v.
+
+ nor lo
+
– nor lo
n.v. n.v. n.v. n.v.
Jahre seit
Diagnose
+
+
Alter bei
Diagnose
+
–
21
FreiburgKlasse
Ib
Ia
Ib
Ia
Ib
Ib
Ib
II
II
Ib
Ib
Ia
Ib
Ib
Ib
Ib
Ia
Ia
Ib
Ib
II/Ib
Ib
Ib
Ia
Ib
Ia
Ib
Ia
Trans
Geschlecht
m
w
w
w
m
m
w
w
w
w
m
m
m
m
m
m
m
w
m
w
w
w
m
m
m
m
w
m
SmB
Alter (Jahre)
38
37
47
48
38
45
40
58
30
26
20
48
54
31
20
35
51
48
38
39
55
32
35
42
46
40
47
53
B
Pat.-Ziffer
Tab. 6: Charakteristika der in die Studie eingeschlossenen Patienten. („n/v“: Diese Daten waren nicht
verfügbar.)
– 32 –
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
EuroClass
28
26
28
42
16
15
28
53
28
24
n.v.
35
50
n.v.
19
25
41
48
n.v.
20
49
20
12
41
32
39
26
31
10
11
18
6
22
30
11
5
2
2
n.v.
13
3
n.v.
1
10
10
0
n.v.
19
5
12
23
1
13
0
21
22
6,3
4,7
11,8
3,2
11,2
3,1
3,3
4,5
5,2
5,6
11,5
2,4
4,9
8,5
7,7
5,7
3,5
4,3
6,1
5,9
7,2
5,4
6,5
5,3
5,5
6,8
6,1
4,7
244
151
390
77
274
134
105
193
241
291
398
45
153
171
28
146
66
190
187
286
241
183
141
218
103
336
223
118
12,9
13,1
12,0
11,8
15,7
15,5
10,8
13,5
12,9
13,2
15,0
10,3
14,9
14,9
16,8
16,4
15,2
14,0
15,3
14,5
13,7
14,4
15,0
14,8
15,7
15,5
13,6
14,7
23
44
n.v.
34
29
32
41
30
20
23
39
38
22
30
n.v.
61
219
29
31
21
37
39
34
26
n.v.
21
n.v.
n.v.
40
15
n.v.
29
14
9
105
50
10
25
10
51
42
20
27
40
62
15
22
17
n.v.
21
12
13
13
26
21
n.v.
n.v.
26
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
37
n.v.
n.v.
12
n.v.
n.v.
n.v.
n.v.
26
n.v.
202
n.v.
n.v.
n.v.
33
n.v.
n.v.
n.v.
9
21
14
n.v.
n.v.
+
+
–
–
n.v.
–
–
–
–
–
–
–
–
–
+
n.v.
–
–
–
n.v.
n.v.
n.v.
+
–
+
–
+
–
+
–
+
–
+
+
n.v.
–
–
–
+
+
n.v.
–
+
+
+
+
+
–
+
–
–
+
n.v.
+
+
–
+
–
+
–
–
+
–
–
+
–
+
+
–
–
+
–
+
–
–
+
+
–
–
+
–
–
–
–
+
–
+
–
–
+
–
–
–
–
+
+
–
–
+
–
–
–
–
+
+
–
–
–
–
–
–
–
+
+
+
+
–
+
+
–
+
–
+
+
+
–
–
–
–
–
–
–
–
–
+
+
–
–
+
+
–
–
–
+
+
+
+
+
–
+
–
–
–
–
–
–
–
–
+
+
+
–
–
–
–
+
+
–
–
+
–
+
+
+
–
–
–
–
–
–
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
–
Ergebnisse
Patientenkollektiv
Es konnten 34 HLA-A2-positive CVID-Patienten rekrutiert werden. 28 dieser Patienten
zeigten signifikante Multimer-Antworten und wurden in die Detail-Analyse einbezogen. Von
diesen Patienten waren 12 weiblich und 16 männlich, das Alter reichte von 20 bis 58 Jahren
mit einem Mittelwert von 40,75 Jahren. Die Charakteristika der Patienten sind in Tab. 6
zusammengefaßt. Zusätzlich wurde ein CVID-Patient mit akuter CMV-Reaktivierung in die
Analyse eingeschlossen.
Als Ergänzung zu diesem Patientenkollektiv wurden 25 alters- und geschlechtsangepaßte
Kontrollpersonen mit nachweisbaren Multimer-Antworten untersucht (12 weiblich, 13
männlich; 19 bis 56 Jahre alt, im Mittel 39,00 Jahre). Diese Kohorte setzte sich aus fünf
Gesunden, drei Personen, die sich zur elektiven Tonsillektomie vorstellten, und einer Gruppe
von 17 Patienten mit einer chronischen Hepatitis C oder einer unklaren Hepatopathie
zusammen. Keine der Kontrollpersonen zeigte zum Zeitpunkt der Blutentnahme klinische
Zeichen einer akuten Infektion. In Bezug auf die erhobenen CD8-T-Zell-Parameter konnten
keine signifikanten Unterschiede zwischen den Untergruppen der Kontrollkohorte gefunden
werden, sodaß die Kontrollkohorte für alle weiteren Analysen zu einer Gruppe
zusammengefaßt wurde. Außerdem untersuchten wir 59 gesunde, HLA-A2-positive
Kontrollpersonen auf das Vorhandensein von Multimer-Antworten, um die jeweiligen
Häufigkeiten mit denen in der CVID-Kohorte zu vergleichen.
CD8-T-Zell-Differenzierung im Vergleich zwischen CVID- und Kontrollkohorte
In einem ersten Schritt wurde anhand der Expression von Oberflächenmarkern die
Differenzierung des gesamten CD8-T-Zell-Kompartiments untersucht. Die untersuchten
Marker waren: CCR7, CD127, CD38, PD-1, KLRG1 und CD57. Ein Vergleich zwischen
dem CVID- und dem Kontrollkollektiv zeigte einige interessante Unterschiede (Abb. 5). So
konnte in der CVID-Kohorte eine Verringerung von naiven CD8-T-Zellen beobachtet
werden, gemessen an der Expression von CCR7 (Median 23% vs. 38%, p=0,0112, Mann-
– 33 –
Whitney-Test), und von Gedächtnis-Zellen, gemessen an der Expression von CD127 (56%
vs. 70%, p=0,0495). Passend zu diesem Befund wurde in der CVID-Kohorte ein erhöhter
Anteil CD38-positiver, also aktivierter CD8-T-Zellen beobachtet (25% vs. 12%, p=0,0443).
Außerdem war der Anteil terminal differenzierter CD8-T-Zellen in der CVID-Kohorte
deutlich erhöht, mit einem deutlich größeren Anteil KLRG1-pos. (65% vs. 44%, p=0,0267)
bzw. CD57-pos. (46% vs. 24%, p=0,0007) Zellen. Die Expressionsdichte von PD-1, d.h. der
Anteil erschöpfter, dysfunktionaler CD8-T-Zellen unterschied sich zwischen den
Studienkohorten nur leicht (18% vs. 24%, n.s.).
Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, daß in der CVID-Kohorte eine Verlagerung der
Differenzierung von CD8-T-Zellen hin zu einem Antigen-erfahreneren Status vorliegt,
jedoch ohne daß vermehrt dysfunktionale (erschöpfte) Zellen nachweisbar waren.
– 34 –
Abb. 5: Vergleich der Anteile von CD8-T-Zellen, die bestimmte Oberflächenmarker exprimieren, zwischen
CVID- und Kontrollkohorte. Bei signifikanten Unterschieden ist der p-Wert fettgedruckt. (Mann-WhitneyTest)
CVID-Klasse und CD8-T-Zell-Differenzierung
Freiburg-Klasse
In einem nächsten Schritt wurde die CD8-T-Zell-Differenzierung innerhalb des CVIDKollektivs zwischen den verschiedenen Freiburg-Klassen verglichen. Hierbei konnten keine
signifikanten Unterschiede in der Expression der untersuchten Oberflächenmarker zwischen
den einzelnen CVID-Klassen feststellt werden. Auch wenn nur zwischen Klasse Ia und nonIa unterschieden wurde, konnten keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden
(Tab. 7).
– 35 –
CCR7
CD127
CD38
PD-1
KLRG1
CD57
32,69 %
48,86 %
22,68 %
20,95 %
56,66 %
46,79 %
Ib
29,46 %
59,39 %
22,94 %
18,68 %
61,57 %
41,55 %
II
17,50 %
66,67 %
24,67 %
36,00 %
59,00 %
41,00 %
p1
0,7171
0,4159
0,8965
0,2261
0,9671
0,8228
p2
0,9558
0,3670
0,8735
0,6314
0,6934
0,5798
Ia
Tab. 7: Anteil der CD8-T-Zellen, die einen bestimmten Oberflächenmarker exprimieren, in Abhängigkeit
von der Zugehörigkeit der Patienten zu den Freiburg-Klassen. Angegeben sind jeweils die geometrischen
Mittel der prozentualen Anteile aller jeweiligen Patienten. „p1“ bezeichnet den p-Wert (Kruskal-WallisTest), wenn alle Klassen voneinander unterschieden werden; „p2“ bezeichnet den p-Wert (Mann-WhitneyTest), wenn Klasse Ia mit non-Ia verglichen wurde.
EUROclass
Anschließend wurde das Differenzierungsmarkermuster der CD8-T-Zellen von CVIDPatienten mit ihrer Einteilung anhand der Parameter des EUROclass-Schemas korreliert;
auch bei dieser Klassifikation konnte kein signifikanter Zusammenhang gezeigt werden
(Tab. 8).
CCR7
CD127
CD38
PD-1
KLRG1
CD57
B
0,4508
0,0647
0,5529
0,6715
0,6865
0,1675
smB
0,6216
0,1654
0,0164
0,8245
0,2448
0,9509
trans
0,1433
0,1628
0,1781
0,1800
0,3497
0,8710
21
0,3390
0,2124
0,6979
0,5947
0,9485
0,6662
Tab. 8: Angegeben sind die p-Werte (Mann-Whitney-Test) beim Vergleich der OberflächenmarkerExpression jeweils zwischen den dichotomen Untergruppen der EUROclass-Parameter. Ein isolierter,
rechnerisch signifikanter p-Wert ist im Rahmen der p-Inflation bedeutungslos.
Vielmehr konnte in allen Subgruppen der gleiche Trend hin zu einem, im Vergleich zu
Kontrollen, Antigen-erfahreneren CD8-T-Zell-Phänotyp beobachtet werden.
Klinik und CD8-T-Zell-Differenzierung
Insbesondere für CD4-T-Zellen ist mehrfach gezeigt worden, daß bestimmte klinisch
schwere Manifestationen der Erkrankung mit größeren Abweichungen im CD4-T-ZellKompartiment einhergehen, insbesondere hinsichtlich der Frequenzen, der Funktion und der
Differenzierung der Zellen (Giovanetti 2007).
– 36 –
Für CD8-T-Zellen liegen weitaus weniger Daten vor. In unserer CVID-Kohorte wurden
daher routinemäßig zum Zeitpunkt der Blutentnahme folgende klinische Parameter erhoben:
Alter bei Erstdiagnose, die seit der Diagnose verstrichene Zeit, das Vorliegen von
Hepatopathie (Aminotransferasen im Serum), Zytopenie (Hämoglobin, Leukozytenzahl und
Thrombozytenzahl im periphervenösen Blut), Splenomegalie, Diarrhö, Lymphadenopathie
und Granulomen. Diese Parameter wurden mit den jeweiligen Expressionslevels der schon
oben beschriebenen Oberflächenmarker korreliert (Tab. 9 und 10).
CCR7
CD127
CD38
PD-1
KLRG1
CD57
Diarrhö
24 %
58 %
25 %
16 %
56 %
55,5 %
keine D.
23,5 %
54 %
26 %
18 %
68 %
46 %
p
0,8732
0,8807
0,9548
0,9375
1
0,3943
Splenomegalie
23,5 %
51,5 %
26 %
18 %
69 %
50,5 %
keine S.
23 %
56 %
26,5 %
16 %
54 %
45,5 %
p
0,7588
0,9098
0,9455
0,6087
0,5728
0,4434
Lymphadenopathie
14 %
43 %
25,5 %
26 %
70 %
53 %
keine L.
35,5 %
68 %
25 %
16 %
46,1 %
34,65 %
p
0,0008
0,0011
0,8896
0,009
0,1471
0,0118
Granulome
12,5 %
43,5 %
25 %
26 %
68 %
55 %
keine G.
29,3 %
60,15 %
25,5 %
16 %
51,7 %
36 %
p
0,0041
0,0065
0,6065
0,0109
0,554
0,0134
Tab. 9: Anteil der CD8-T-Zellen, die den jeweiligen Oberflächenmarker exprimieren, je nach
Vorhandensein klinischer Symptome. Signifikante p-Werte sind durch Fettdruck gekennzeichnet (MannWhitney-Test).
Für folgende Parameter konnte kein statistisch signifikanter Zusammenhang gefunden
werden:
Alter
bei
Erstdiagnose,
Zeit
seit
Erstdiagnose,
Thrombozytenzahl
im
periphervenösen Blut, Splenomegalie und Diarrhö.
Für einige andere Blutbildwerte konnte allerdings eine Korrelation mit bestimmten
Oberflächenmarkern nachgewiesen werden; so korrelierten Hämoglobinwerte positiv mit der
Expression von CCR7 und CD127, während die Leukozytenzahlen positiv mit der
Expression von CCR7 und negativ mit der Expression von CD57 korrelierten. Die GPTAktivität im Serum korrelierte positiv mit dem Expressionslevel von PD-1 auf CD8-T-Zellen
(als isolierte schwache Korrelation bei multiplen Tests jedoch wahrscheinlich ohne
Bedeutung).
– 37 –
CCR7
CD127
CD38
PD-1
KLRG1
CD57
0,134
-0,006557
0,09861
-0,4002
-0,1217
0,0759
Zeit seit Diagnose
Spearman r
95%-KI
p
-0,2965…0,5192 -0,4111…0,4001 -0,3488…0,5095 -0,7228…0,06552 -0,5795…0,3945 -0,3491…0,4750
0,5325
0,9752
0,6624
0,0804
0,6417
0,7245
-0,2007
-0,1152
-0,1659
0,1334
0,278
0,2813
Alter bei Diagnose
Spearman r
95%-KI
-0,5676…0,2326 -0,4975…0,3046 -0,5584…0,2873 -0,3411…0,5537 -0,2486…0,6777 -0,1502…0,6228
0,3469
0,5835
0,4606
0,5751
0,28
0,183
Spearman r
0,1824
-0,1768
0,1646
0,7857
-0,6
-0,09756
95%-KI
n/a
n/a
n/a
n/a
n/a
n/a
p
0,6073
0,6321
0,6567
0,048
0,35
0,785
-0,09265
-0,2758
0,271
0,3687
0,1103
0,1481
p
GPT
GOT
Spearman r
95%-KI
p
-0,4962…0,3438 -0,6191…0,1560 -0,1953…0,6373 -0,1712…0,7383 -0,4835…0,6346 -0,2932…0,5374
0,6742
0,192
0,2347
0,1599
0,7197
0,5
-0,0529
-0,09005
-0,3947
0,4241
0,147
-0,03141
gamma-GT
Spearman r
95%-KI
p
-0,4489…0,3604 -0,4709…0,3190 -0,7007…0,03396 -0,06834…0,7504 -0,4092…0,6235 -0,4315…0,3790
0,8017
0,6618
0,0623
0,0794
0,6012
0,8815
0,4949
0,4127
-0,03487
0,003402
-0,1639
-0,144
Hämoglobin
Spearman r
95%-KI
p
0,1299…0,7419 0,03518…0,6872 -0,4343…0,3760 -0,4298…0,4353 -0,5958…0,3415 -0,5058…0,2608
0,0087
0,0291
0,8686
0,988
0,5158
0,4736
0,4392
0,2353
0,1067
-0,2642
-0,594
-0,4023
Leukozytenzahl
Spearman r
95%-KI 0,05922…0,7081 -0,1624…0,5673 -0,3124…0,4911 -0,6253…0,1901 -0,8352…-0,1613 -0,6849…-0,01434
p
0,0219
0,2281
0,6116
0,2348
0,0093
0,0375
0,05477
0,1004
0,2338
-0,06062
-0,414
-0,2139
Thrombozytenzahl
Spearman r
95%-KI
p
-0,3427…0,4356 -0,2940…0,4656 -0,1898…0,5840 -0,4806…0,3820 -0,7450…0,08050 -0,5576…0,1923
0,7861
0,6113
0,2606
0,7887
0,0876
0,2839
Tab. 10: Korrelation zwischen Zeitspannen und Laborwerten mit der Expression von Oberflächenmarkern
auf CD8-T-Zellen. Angegeben ist neben dem r-Wert das 95%-Konfidentintervall und der p-Wert
(Spearman-Korrelation). („n/a“: diese Werte sind aufgrund von Limitationen der verwendeten Algorithmen
nicht zu berechnen.)
Besonders augenfällig waren die Unterschiede in der CD8-T-Zell-Differenzierung im
Vergleich zwischen Patienten mit und ohne Lymphadenopathie und Granulomen.
Tatsächlich fand sich in beiden Fällen, also bei Vorliegen einer Lymphadenopathie und
– 38 –
ebenso beim Vorliegen von Granulomen, eine signifikant verminderte Expression von CCR7
und CD127 bei einer erhöhten Expression von CD57 und PD-1. Insgesamt deuten diese
Befunde auf einen seneszenteren CD8-T-Zell-Phänotyp hin. Für CD38 und KLRG1
konnten jedoch keine signifikanten Unterschiede gezeigt werden.
Lymphadenopathie und Granulome traten als klinische Manifestationen sehr häufig
gemeinsam auf (p<0.0001, Fishers exakter Test): So hatten alle acht Patienten mit
Granulomen auch eine Lymphadenopathie, und nur drei von elf Patienten mit
Lymphadenopathie zeigten keine Granulome. Aus diesem Grund wurden für eine weitere
Analyse alle Patienten mit Granulomen und/oder Lymphadenopathie zu einer Gruppe
zusammengefaßt. Vergleicht man nun die Expression der Oberflächenmarker zwischen
Kontrollen und CVID-Patienten mit und ohne Lymphadenopathie/Granulomen, so stellt
man fest, daß CVID-Patienten mit Lymphadenopathie/Granulomen einen stärker
veränderten CD8-T-Zell-Phänotyp aufweisen als Patienten ohne diese Komplikationen, die
im Vergleich zu den Kontrollen aber immernoch einen etwas später differenzierten CD8-TZell-Phänotyp zeigen (Abb. 6).
– 39 –
Abb. 6: Vergleich der Oberflächenmarker-Expression auf CD8-T-Zellen von Kontrollpersonen, sowie CVIDPatienten ohne und mit Granulomen und/oder Lymphadenopathie. (Kruskal-Wallis-Test mit DunnNachtest).
Insgesamt zeigt sich also bei Vorliegen von Komplikationen wie Lymphadenopathie und
granulomatöser Erkrankung eine verminderte Expression von Markern, die typisch für naive
und Gedächtsniszellen sind, während Marker für Seneszenz und Erschöpfung stärker
exprimiert werden, insgesamt hinweisend auf einen weiter differenzierten CD8-T-ZellPhänotyp bei diesen Patienten. Diese Ergebnisse legen die Vermutung nahe, daß diese
klinischen Komplikationen und eine beschleunigte CD8-T-Zell-Differenzierung eine
gemeinsame Ursache haben.
– 40 –
Virusspezifische CD8-T-Zellen
Bislang ist nicht definitiv geklärt, ob CVID-Patienten antigenspezifische CD8-T-Zellen
ebenso effizient ausbilden wie Gesunde. Deshalb wurden in der hier untersuchten CVIDKohorte CD8-T-Zellen, die spezifisch CMV-, EBV- oder Influenza-Virus-Epitope
(Sequenzen siehe oben) erkennen, einer detaillierten Analyse unterzogen. Zunächst wurde die
Häufigkeit und relative Stärke der entsprechenden Multimer-Antworten erfasst und mit einer
Serie von gesunden Kontrollen verglichen. Von den 34 untersuchten Patienten mit CVID
zeigten 13 (38%) CMV-spezifische, 11 (32%) EBV-spezifische und 17 (50%) InfluenzaVirus-spezifische CD8-T-Zellen. Es konnte kein signifikanter Unterschied in der Frequenz
dieser T-Zellen im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen nachgewiesen werden (CMV:
16/59=27%, EBV: 32/59=54%, Flu: 17/59=29%) (Abb. 8).
Die relativen Anteile virusspezifischer CD8-T-Zellen am gesamten CD8-Kompartiment
unterschieden sich nicht signifikant zwischen den beiden Kohorten, auch wenn der Anteil
CMV-spezifischer CD8-T-Zellen bei CVID-Patienten deutlich höher lag als bei Kontrollen
(Mediane in der CVID- gegenüber der Kontrollkohorte und p-Werte aus dem MannWhitney-Test: CMV: 1,31% vs. 0,78%, p=0,2853; EBV: 0,26% vs. 0,20%, p=0,9378;
Influenza: 0,09% vs. 0,10%, p=0,9733) (Abb. 8).
– 41 –
Abb. 8: Links oben wird der Anteil der Individuen, die eine CD8-Multimer-Antwort gegen bestimmte
Epitope besitzen, zwischen den beiden Studienkohorten verglichen. Die Balken geben die 95%Konfidenzintervalle an. Der Rest der Abbildung zeigt die Anteile der jeweiligen virusspezifischen CD8-TZellen am gesamten CD8-T-Zell-Kompartiment in den beiden Studienkohorten. Angegeben sind die
Mediane. Die Unterschiede erreichten keine statistische Signifikanz im Mann-Whitney-Test.
CMV, CD8-T-Zell-Differenzierung und Klinik
Einige Patienten mit CVID leiden unter wiederkehrenden CMV-, seltener auch unter EBVReaktivierungen; ferner scheint eine latente CMV-Infektion auch bei Immunokompetenten
und klinisch Gesunden mit einer vorzeitigen Immunoseneszenz assoziiert zu sein (Koch
2007). Deshalb wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob die Anwesenheit von CMVoder EBV-spezifischen CD8-T-Zellen (als Indikator für eine Infektion) mit dem Vorliegen
von klinischen Symptomen und/oder dem CD8-T-Zell-Phänotyp zusammenhängt.
Tatsächlich stellte sich heraus, daß CVID-Patienten mit CMV-Multimer-Antwort signifikant
weniger CCR7-positive CD8-T-Zellen besitzen als CVID-Patienten ohne CMV-Antwort
(Median 18% vs. 31%, p=0,0069, Mann-Whitney-Test). Die Zahl CD57-positiver CD8-TZellen war in dieser Gruppe deutlich erhöht (58% vs. 37%, p=0,0087), während
– 42 –
interessanterweise der Anteil CD38-positiver CD8-T-Zellen vermindert war (17% vs. 28%,
p=0,0085), ebenso wie der Anteil PD-1-positiver CD8-T-Zellen (16% vs. 21%, p=0,0436).
Die Expressionshöhe der anderen untersuchten Oberflächenmarker unterschied sich
zwischen CMV-positiven und -negativen Patienten nicht signifikant (Abb. 7).
.
Abb. 7: Vergleich der Oberflächenmarker-Expression auf CD8-T-Zellen von CMV-negativen und -positiven
Individuen, jeweils für die CVID- und die Kontroll-Kohorte. Signifikante p-Werte sind angegeben (MannWhitney-Test).
In der Kontrollkohorte waren die Unterschiede weniger ausgeprägt. Zwar hatten
Kontrollpersonen mit CMV-Antwort weniger CCR7-positive (28% vs. 44%) und mehr
CD57-positive CD8-T-Zellen (32% vs. 12%) als Personen ohne CMV-Antwort, aber diese
– 43 –
Differenzen waren statistisch nicht signifikant (p=0,1618 bzw. p=0,0813). Das Vorliegen
einer CMV-Infektion bedingt also eine Tendenz zu einem seneszenteren CD8-T-ZellPhänotyp, die bei CVID-Patienten stärker ausgeprägt zu sein scheint als bei
immunokompetenten Kontrollen.
Ein Vergleich zwischen Individuen mit und ohne EBV-Antwort zeigte in beiden Kohorten
keine Unterschiede im CD8-T-Zell-Phänotyp.
Da die für CMV-positive Patienten beobachteten CD8-T-Zell-Veränderungen denen in der
Patientengruppe mit klinischen Komplikationen ähnelten, wurden die verfügbaren
klinischen Parameter mit dem Vorliegen oder Fehlen einer Multimer-Antwort gegen CMV
korreliert. Es konnte hierbei kein signifikanter Zusammenhang gefunden werden. Lediglich
das mittlere Alter war in der Patientengruppe mit CMV-Antworten etwas höher (44 vs. 38
Jahre), aber auch dieser Faktor erreichte keine statistische Signifikanz (p=0,2310, Student-tTest).
Zusammenfassend
ist
festzuhalten,
daß
in
der
CVID-Kohorte
CMV-induzierte
Veränderungen des CD8-T-Zell-Phänotyps beobachtet werden konnten, während diese
Effekte in der Kontrollkohorte wesentlich geringer ausgeprägt waren. Ferner konnte in der
CVID-Kohorte kein Zusammenhang zwischen klinischen Komplikationen und einer
Infektion mit CMV nachgewiesen werden.
Phänotyp virusspezifischer CD8-T-Zellen
Anschließend wurde der Differenzierungsstatus der virusspezifischen CD8-T-Zellen
paarweise für jeden Marker und jedes Epitop zwischen CVID-Patienten und
Kontrollpersonen verglichen (Abb. 9). Interessanterweise waren die dabei beobachteten
Unterschiede zwischen den virusspezifischen CD8-T-Zellen von CVID-Patienten und
Kontrollen wesentlich geringer als die Unterschiede auf Gesamt-CD8-Niveau (siehe oben).
In der CVID-Kohorte wurde eine Tendenz zu einer vermehrten Expression von CD38 auf
CMV- und EBV-spezifischen CD8-T-Zellen beobachtet. Für alle virusspezifischen Zellen
wurde in der CVID-Kohorte ferner eine geringere Expression von PD-1 gefunden, während
– 44 –
die Expressionsdichten von KLRG1 und CD57 leicht erhöht waren. Allerdings erreichte
keine dieser Beobachtungen statistische Signifikanz.
Während die Vergleiche zwischen den beiden Kohorten auf Epitop-Ebene nur geringe
Unterschiede zeigen konnten, ließen sich innerhalb der beiden Kohorten zwischen den
einzelnen virusspezifischen Populationen deutliche Unterschiede erkennen. So war der Anteil
CCR7-pos. und CD127-pos. CD8-T-Zellen bei CMV-spezifischen CD8-T-Zellen am
niedrigsten und auf Influenza-Virus-spezifischen Zellen am höchsten, während der Phänotyp
EBV-spezifischer Zellen dazwischen lag. Die PD-1-Expression war auf EBV-spezifischen
CD8-T-Zellen am höchsten, etwas schwächer auf CMV-spezifischen und am geringsten auf
Influenza-Virus-spezifischen Zellen. Der Anteil CD57-positiver CD8-T-Zellen war am
höchsten bei CMV-spezifischen, niedriger auf EBV-spezifischen und am geringsten auf
Influenza-Virus-spezifischen CD8-T-Zellen. Bei den anderen Oberflächenmarkern konnten
keine definitiven Unterschiede festgestellt werden. Zusammengenommen entsprechen diese
Beobachtungen dem von gesunden Kontrollpersonen bekannten und vorbeschriebenen
Differenzierungsmuster, dem virusspezifische CD8-T-Zellen folgen (Appay 2008). Diese
Muster konnten gleichermaßen in der Kontrollkohorte wie auch in der CVID-Kohorte
beobachtet werden.
– 45 –
Abb. 9: Oberflächenmarker-Expression auf virusspezifischen CD8-T-Zellen, jeweils im Vergleich zwischen
Kontrollpersonen und CVID-Patienten.
Subgruppen-Differenzierung
In den vorhergehenden Untersuchungen wurden die Oberflächenmarker nur einzeln
betrachtet, sodaß Veränderungen in den vielfältigen vorbeschriebenen Interkorrelationen
zwischen den einzelnen Markern möglicherweise nicht detektiert werden konnten. Um diese
Frage anzugehen, wurden zwei Patienten (Pat. 3 u. Pat. 28) für eine umfassendere Analyse
mittels 8-Farben-Durchflußzytometrie ausgewählt. Das CD8-T-Zell-Kompartiment wurde
nach dem weiter oben genauer beschriebenen Schema in fünf Subgruppen unterteilt.
Kurzgefaßt sind die Gruppen wie folgt definiert: Subset 1 [CCR7+, CD45RA+, CD27+],
– 46 –
Subset 2 [CCR7+, CD45RA–, CD27+], Subset 3 [CCR7–, CD45RA–, CD27+], Subset 4
[CCR7–, CD45RA–, CD27–], Subset 5 [CCR7–, CD45RA+, CD27–]. Die relativen
Anteile der Subgruppen und die jeweiligen Expressionsniveaus von CD127, PD-1, KLRG1
und CD57 wurden sowohl für die CD8-T-Zell-Subpopulationen als auch für virusspezifische
CD8-T-Zellen untersucht. Dabei zeigte sich, daß der größte Teil der im periphervenösen
Blut der untersuchten CVID-Patienten zirkulierenden CD8-T-Zellen in die Subsets 1 und 3,
sowie teilweise Subset 4 fielen. Die relativen Anteile der Subsets 2 und 5 waren entsprechend
geringer (Abb. 10).
CMV-spezifische CD8-T-Zellen fanden sich vornehmlich in Subset 4, während EBVspezifische CD8-T-Zellen sich zum größten Teil in Subset 3 befanden und Influenza-Virusspezifische CD8-T-Zellen in Subset 1 und 2 (Abb. 10).
100 %
80 %
nicht definiert
60 %
Subset 5
Subset 4
Subset 3
40 %
Subset 2
Subset 1
20 %
0%
Gesamt-CD8
(Pat. 3)
Gesamt-CD8
(Pat. 28)
CMV (Pat. 3)
CMV (Pat. 28)
EBV (Pat. 28)
Flu (Pat. 3)
Abb. 10: Relative Anteile der Subsets an der Gesamt-CD8-Population und an virusspezifischen CD8-TZellen.
Auf Gesamt-CD8-Niveau war die Expression von PD-1 am höchsten in den Subsets 3 und 4.
Die Expression von KLRG1 und CD57 wurde in den später differenzierten Subsets höher
gemessen, während für die Expression von CD127 ein umgekehrter Zusammenhang
beobachtet wurde (Abb. 11).
– 47 –
100
100
80
80
CD127
60
CD127
60
CD38
PD-1
40
KLRG1
PD-1
40
KLRG1
CD57
20
CD57
20
0
0
Subset 1
Subset 2
Subset 3
Subset 4
Subset 5
Subset 1
Subset 2
Subset 3
Subset 4
Subset 5
Abb. 11: Anteil der CD8-T-Zellen der verschiedenen Subsets, die die jeweiligen Oberflächenmarker
exprimieren (Angaben in Prozent). Links Pat. 3, rechts Pat. 28.
Insgesamt passen diese Befunden sehr gut in das Bild, das bei Gesunden beschrieben wurde
(Romero 2007, Appay 2007; vergl. auch Abb. 1), sodaß sich kein Hinweis auf eine
intrinsische Störung der CD8-T-Zell-Differenzierung bei Patienten mit CVID ergibt.
Virusspezifische CD8-T-Zellen während akuter CMV-Reaktivierung
Die bisher erhobenen Daten wurden während latenter bzw. ausgeheilter Infektion erhoben,
sodaß nur die statische Differenzierung der CD8-T-Zellen erfaßt wurde. Der Frage, ob CD8T-Zellen von CVID-Patienten dynamisch auf einen Antigen-Stimulus reagieren können,
konnte in einer CVID-Patientin nachgegangen werden, die unter immunsuppresiver
Therapie eine klinisch relevante CMV-Reaktivierung entwickelte. Mittels 8-FarbenDurchflußzytometrie konnte gezeigt werden, daß die Expression von CD38 während der
Reaktivierung deutlich erhöht war (Tab. 11), und zwar sowohl auf Gesamt-CD8-Niveau
(3,5-fach), als auch auf CMV-spezifischen CD8-T-Zellen (9,6-fach). Die anderen
Differenzierungsmarker zeigten keine auffälligen Unterschiede.
– 48 –
Gesamt-CD8
Viruslast CMV (Kopien/µl)
3840
CMV-spez.
62
3840
62
CCR7
11,20%
5,92%
3,18%
0,90%
CD127
10,50%
8,10%
2,92%
2,06%
CD45RA
14,80%
20,10%
1,87%
1,22%
CD27
8,40%
5,90%
3,13%
1,43%
CD28
10,30%
9,74%
1,16%
1,14%
CD38
12,40%
3,50%
22,20%
2,32%
PD-1
37,40%
31,40%
90,60%
85,90%
KLRG1
54,10%
51,60%
74,50%
75,40%
CD57
78,60%
81,50%
84,70%
87,90%
Tab. 11: Expression der Oberflächenmarker auf Gesamt-CD8-Niveau und auf CMV-spezifischen CD8-TZellen während CMV-Reaktivierung sowie nach Therapie und klinischer Gesundung sechs Wochen später.
Zu beiden Zeitpunkten herrschte bei CMV-spezifischen CD8-T-Zellen ein endständiger
Differenzierungstyp vor (Tab. 12). CD8-T-Zellen dieser CVID-Patientin zeigten also eine
Reaktion im Sinne einer Aktivierung auf eine Konfrontation mit ihrem Antigen.
Gesamt-CD8
Viruslast CMV (Kopien/µl)
3840
CMV-spez.
62
Anteil/CD8
3840
62
1,24 %
0,88 %
Subset 1
1,78 %
2,17 %
0,35 %
0,22 %
Subset 2
1,68 %
0,72 %
0,59 %
0,19 %
Subset 3
4,05 %
2,22 %
1,81 %
0,91 %
Subset 4
74,50 %
75,90 %
93,80 %
97,20 %
Subset 5
9,39 %
15,20 %
0,88 %
0,83 %
nicht definiert
8,60 %
3,79 %
2,57 %
0,65 %
Tab. 12: Relative Anteile der CD8-Subsets.
Bemerkenswert ist jedoch, daß das CD8-T-Zell-Kompartiment der Patientin insgesamt eine
ungewöhnliche Verteilung aufweist. So finden sich nur sehr wenige Zellen in Subset 1, der
Anteil naiver CD8-T-Zellen ist also gering. Außerdem waren zu beiden Zeitpunkten mehr
KLRG1-pos. als CD57-pos. CD8-T-Zellen nachweisbar, während in der Regel alle CD57pos. CD8-T-Zellen auch KLRG1 exprimieren (Ibegbu 2005).
– 49 –
Interferon-gamma-Produktion virusspezifischer CD8-T-Zellen
Um neben dem Differenzierungsmuster auch die Funktion von CD8-T-Zellen bei Patienten
mit CVID zu beurteilen, wurde die Interferon-gamma-Produktion von virusspezifischen
CD8-T-Zellen nach Stimulation mit dem jeweiligen Peptid-Antigen gemessen. Bei fünf von
acht Patienten mit einer CMV-Antwort auf Pentamer-Ebene konnte auch eine Interferongamma-Antwort nach Stimulation mit CMV-Peptid gemesssen werden (63%, 95%Konfidenzintervall: 24% bis 92%). Für EBV waren es acht von zehn (80%, 95%Konfidenzintervall: 44% bis 98%) und für Influenza-Virus, 15 von 16 (94%, 95%Konfidenzintervall: 69% bis >99%) Patienten.
Interessanterweise ließ sich nachweisen, daß diejenigen CVID-Patienten ohne meßbare
Interferon-gamma-Antwort relativ schwache Multimer-Antworten aufwiesen (Abb. 12). Es
kann also gefolgert werden, daß es sich bei diesen Patienten eher um einen Schwelleneffekt
des Nachweisverfahrens handelt als um einen funktionellen Defekt. Engstrand et al.
beobachteten bei gesunden Versuchspersonen einen ähnlichen Unterschied in der Sensitivität
der beiden Verfahren, CMV-spezifische CD8-T-Zellen nachzuweisen (Engstrand 2003).
CD8-T-Zellen von Patienten mit CVID sind also in der Tat funktionell, gemessen an ihrer
Fähigkeit, nach Antigenstimulation Interferon-gamma zu produzieren.
– 50 –
10
4
10
3
10
2
0.025
0.33
10
5
10
4
10
10
0
3.69e-3
0.1
<FITC-A>: IFNy
5
<FITC-A>: IFNy
IFN-g
<FITC-A>: IFNy
10
3
2
0
39.4
0
60.2
10
2
3
4
10
10
<PerCP-Cy5-5-A>: CD8
10
5
10
5
10
4
10
3
10
2
8.25e-3
0.048
0
67.8
0
32.1
10
2
3
4
10
10
<PerCP-Cy5-5-A>: CD8
10
5
74.8
0
25.2
10
2
3
4
10
10
<PerCP-Cy5-5-A>: CD8
10
5
CD8+
Abb. 12: Oben aufgetragen sind die jeweiligen Anteile virusspezifischer CD8-T-Zellen jeweils für Patienten
mit und ohne entsprechende Inferon-gamma-Antwort. Unten represäntative FACS-Plots von Interferongamma-Färbungen.
– 51 –
Diskussion
In dieser Arbeit wurden der Phänotyp und die Funktion von virus-spezifischen und
-unspezifischen CD8-T-Zellen bei CVID-Patienten untersucht. Diese Ergebnisse wurden mit
dem Vorliegen klinischer CVID-Manifestationen korreliert und mit Daten von
immunokompetenten Kontrollpersonen verglichen.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, daß CVID-Patienten einen geringeren Anteil CCR7positiver, also naiver, und CD127-pos., also Gedächtnis-CD8-T-Zellen besitzen. Gleichzeitig
war der Anteil aktivierter, d.h. CD38-pos., und terminal differenzierter, d.h. KLRG1-pos.
bzw. CD57-pos. CD8-T-Zellen erhöht. Der Anteil dysfunktionaler, „erschöpfter“ CD8-TZellen in der CVID-Kohorte war nicht erhöht, gemessen am relativen Anteil PD-1exprimierender Zellen. Insgesamt weisen diese CD8-T-Zell-Veränderungen auf eine
Verschiebung des vorherrschenden CD8-T-Zell-Phänotyps in Richtung eines seneszenten,
aber funktionalen Status bei CVID-Patienten hin. Diese Ergebnisse werden durch die
Befunde früherer, kleinerer Studien unterstützt und erweitern diese. So wurde bei CVIDPatienten eine geringere Frequenz CCR7-positiver (Lanio 2009, Holm 2004) und eine
höhere Frequenz CD38-pos. und CD57-pos. (Vlkova 2006) CD8-T-Zellen gefunden.
Die Frage nach den Mechanismen, die eine terminale CD8-T-Zell-Differenzierung bei
CVID-Patienten bedingen, ist bislang unbeantwortet. Man kann spekulieren, daß durch das
Fehlen einer funktionellen humoralen Immunantwort das Antigen länger persistiert und/
oder in größerer Menge vorliegt und CD8-T-Zellen auf diese Weise überstimuliert; es konnte
nämlich gezeigt werden, daß eine chronische Stimulation mit einem Antigen ausreicht, um
einen seneszenten CD8-T-Zell-Phänotyp zu induzieren (Bucks 2009). Inwiefern dieses
Szenario auf die in-vivo-Situation bei akuten oder chronisch latenten Infektionen übertragbar
ist, ist jedoch unklar. Ein weiterer Erklärungsansatz liegt in einem chronisch dysregulierten,
proinflammatorisch geprägten Zytokinmilieu. Proinflammatorische Zytokine wie TNF-alpha
und IL-12 sind in der Lage, die Differenzierung von CD8-T-Zellen zu forcieren (Joshi 2008,
Wiesel 2009). Bemerkenswerterweise wurden im Vergleich zu Gesunden erhöhte
Serumkonzentrationen dieser Zytokine bei CVID-Patienten nachgewiesen (Aukrust 1996,
Martinez-Pomar 2006), sodaß auch für diesen Erklärungsansatz experimentelle Hinweise
vorliegen. Da sich diese Konzepte keineswegs ausschließen und eine chronisch erhöhte
– 52 –
Antigenlast das Zytokinmilieu im Sinne einer inflammatorischen Prägung verschieben
könnte, liegt es nahe, daß in vivo beide Effekte zusammenwirken.
In Anbetracht des klinisch heterogenen Erscheinungsbildes der CVID wurden Patienten mit
einigem Erfolg nach dem Phänotyp der zirkulierenden B-Zellen in verschiedene Gruppen
unterteilt (Warnatz 2002, Piqueras 2003, Wehr 2008). In dieser Arbeit wurde untersucht, ob
der CD8-T-Zell-Phänotyp mit der Zugehörigkeit zu einer bestimmten CVID-Klasse
korreliert. Im Gegensatz zu den vorbeschriebenen Zusammenhängen zwischen massiv
verändertem B-Zell-Phänotyp und CD4-T-Zell-Dysregulation (Vlkova 2006, Giovanetti
2007) konnte hier keine Assoziation zwischen dem B-Zell- und CD8-T-Zell-Phänotyp
etabliert werden. Dieser Befund suggeriert, daß den B-Zell- und CD4-T-Zell-Alterationen
gemeinsame Ursachen zugrundeliegen, während die CD8-T-Zell-Alterationen bei CVIDPatienten auf andere, eventuell sekundäre Mechanismen zurückzuführen sind.
Zwischen klinischen Parametern und CD8-T-Zell-Differenzierung konnten einige
interessante Assoziationen gefunden werden. Insbesondere war eine starke Korrelation
zwischen dem Vorliegen einer Lymphadenopathie und/oder Granulomen und einer
terminalen CD8-T-Zell-Differenzierung in der untersuchten CVID-Kohorte zu beobachten.
Während schon Patienten ohne diese Komplikationen einen im Vergleich zur
Kontrollkohorte weiter fortgeschrittenen Differenzierungsphänotyp ihrer CD8-T-Zellen
zeigten, war dieser Effekt bei Patienten mit diesen Symptomen noch ausgeprägter.
Tendenziell unterstützen frühere Arbeiten die Idee, daß ein klinisch komplizierter Phänotyp
der Erkrankung mit einem stärker veränderten CD8-T-Zell-Kompartiment assoziiert ist.
Beispielsweise fanden zwei Studien einen Zusammenhang zwischen Splenomegalie und
einem erhöhten Anteil aktivierter (Lanio 2009) bzw. seneszenter (Wright 1990) CD8-TZellen.
In der Zusammenschau läßt sich ableiten, daß für die B-Zell- und CD4-T-ZellVeränderungen auf der einen Seite und für die CD8-T-Zell-Veränderungen auf der anderen
Seite unterschiedliche pathogenetische Mechanismen verantwortlich sind, und daß ein
klinisch schwerer Verlauf der CVID tatsächlich mit einer Verschiebung des CD8-T-ZellPhänotyps hin zu einem seneszenteren Status korreliert.
– 53 –
Eine Erklärung für diese Beobachtungen auf CD8-T-Zell- und auf klinischer Ebene könnte
ein infektiöses Agens als gemeinsam zugrundeliegende Ursache sein. In der vorliegenden
Arbeit konnte jedoch kein statistischer Zusammenhang zwischen einer Infektion mit CMV
oder EBV und einer Veränderung klinischer Parameter hergestellt werden. Eine Studie nennt
HHV-8 als möglichen Kandidaten für die beobachtete Immunpathologie (Wheat 2005), dies
scheint jedoch in europäischen CVID-Populationen nicht zuzutreffen (Daten noch nicht
veröffentlicht; persönliche Kommunikation mit Prof. Dr. med. K. Warnatz, Freiburg). Ein
anderer Erklärungsansatz könnte ein besonderer genetischer Hintergrund sein, der bei einer
Untergruppe der Patienten zu einer besonders ausgeprägten Immundysregulation führt, mit
Auswirkungen auf das CD8-T-Zell-Kompartiment und den klinischen Phänotyp.
Ein wichtiges Ergebnis dieser Arbeit ist die Beobachtung, daß eine Infektion mit CMV die
Gesamt-CD8-T-Zell-Differenzierung bei CVID-Patienten noch weiter in Richtung eines
seneszenten Phänotyps treibt als bei Kontrollpersonen. In den letzten Jahren wurde gezeigt,
daß eine Infektion mit CMV die Effekte des Alterns auf das Immunsystem beschleunigt.
Diese Effekte beinhalten bei CD8-T-Zellen unter anderem eine oligoklonale Expansion,
einen niedrigeren Anteil naiver und einen höheren Anteil terminal differenzierter CD8-TZellen (Koch 2007). Nicht alle CVID-Patienten zeigten jedoch diesen besonders starken
Zusammenhang zwischen CMV-Infektion und CD8-T-Zell-Alterationen. Mögliche
Erklärungen für diesen Befund liegen in der genetischen Heterogenität des Krankheitsbildes
oder in einer möglicherweise subklinisch insuffizienten Therapie einer Subgruppe der
Patienten.
Zur Frage, ob CVID-Patienten in gleichem Maße antigenspezifische CD8-T-Zellen
generieren können wie Gesunde, gibt es widersprüchliche Ergebnisse (Stagg 1994,
Raeiszadeh 2006). In diesem Zusammenhang ist es wichtig, anzumerken, daß die Individuen
in beiden Kohorten der vorliegenden Studie in vergleichbarer Häufigkeit CD8-T-Zellen
gegen CMV, EBV und das Influenza-Virus aufwiesen. Interessanterweise war der
durchschnittliche Anteil der CMV-spezifischen CD8-T-Zell-Population bei CVID-Patienten
etwa doppelt so groß wie in der Kontrollkohorte. Für EBV- und Influenza-Virus-spezifische
Zellen konnte jedoch kein Unterschied detektiert werden. Die einzige weitere Studie, die
virusspezifische CD8-T-Zellen bei CVID-Patienten untersucht hat, kommt in bezug auf
CMV- und EBV-spezifische CD8-T-Zellen zu ähnlichen Ergebnissen (Raeiszadeh 2006).
– 54 –
Insgesamt weisen die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, daß die Bildung virusspezifischer
CD8-T-Zellen bei Patienten mit CVID nicht gestört ist.
Bezüglich des Phänotyps virusspezifischer CD8-T-Zellen von CVID-Patienten konnte in
dieser Arbeit nur eine leichte Tendenz in Richtung eines seneszenteren Phänotyps
nachgewiesen werden, vor allem für CMV-spezifische Zellen, charakterisiert durch eine
vermehrte Expression von KLRG1 und CD57. EBV- und Influenza-Virus-spezifische CD8T-Zellen zeigten hingegen in beiden Kohorten nahezu denselben Phänotyp. Diese Ergebnisse
werden von einer früheren Studie unterstützt, die für CVID-Patienten ebenfalls einen im
Vergleich zu Gesunden etwas weiter differenzierten Phänotyp CMV-spezifischer CD8-TZellen beobachten konnte, während EBV-spezifische CD8-T-Zellen in beiden Kohorten den
gleichen Phänotyp zeigten. Eine wichtige Beobachtung der vorliegenden Arbeit ist, daß die
typischen Differenzierungsmuster der verschiedenen virusspezifischen Effektor-CD8-TZellen auch bei CVID-Patienten erhalten sind.
Zusammenfassend läßt sich sagen, daß CMV-spezifische CD8-T-Zellen von CVID-Patienten
im Vergleich zu Immunokompetenten eine leichte Tendenz hin zu einem Antigenerfahreneren Phänotyp aufweisen, während für EBV- und Influenza-Virus-spezifische Zellen
keine Unterschiede zu bestehen scheinen. Viel wichtiger ist jedoch die Beobachtung, daß die
typischen generellen Differenzierungsmuster der CD8-T-Zellen bei Patienten mit CVID
nicht gestört sind.
Auch die Funktion der virusspezifischen CD8-T-Zellen, hier gemessen an ihrer Fähigkeit,
nach Stimulation mit dem entsprechenden Antigen Interferon-gamma zu produzieren,
scheint bei CVID nicht gestört zu sein. Die Tatsache, daß CMV-spezifische CD8-T-Zellen in
vivo dynamisch auf eine Konfrontation mit ihrem Antigen reagieren, zeigt zusätzlich, daß die
Funktion virusspezifischer CD8-T-Zellen bei CVID-Patienten nicht prinzipiell eingeschränkt
ist. Diese Ergebnisse legen nahe, daß Impfungen, die auch eine zelluläre Immunantwort
auslösen, auch bei Patienten mit CVID als sinnvoll angesehen werden können.
Die Tatsache, daß virusspezifische CD8-T-Zellen bei CVID-Patienten so geringe
Veränderungen aufweisen, mag überraschen, in Anbetracht der auf Gesamt-CD8-Niveau
beobachteten
Unterschiede,
und
in
Anbetracht
der
Abwesenheit
humoraler
Immunantworten; eine Erklärung könnten Mausmodelle der B-Zell-Defizienz bieten: Die
– 55 –
„Erschöpfung“, also das Verschwinden, primär funktioneller CD8-T-Zell-Antworten gegen
LCMV und VSV konnte in B-Zell-defizienten Mäuse durch Injektion spezifischer
Immunglobuline verhindert werden (Thimme 2005, Christensen 2003, Bachmann 2004).
Da in der untersuchten CVID-Kohorte alle Patienten regelmäßige Gaben von
Immunglobulinen erhielten, könnte dies eine Erklärung für das Vorhandensein funktioneller
und regelrecht differenzierter virusspezifischer CD8-T-Zellen sein. Jedoch ist diese
Schlußfolgerung nur spekulativ zu sehen, denn es ist nicht geklärt, inwieweit solche
Mausmodelle auf die Situation im Menschen übertragbar sind. Außerdem versteht es sich,
daß die für die Klärung dieser Hypothese notwendige Studie, nämlich die Analyse
virusspezifischer CD8-T-Zellen bei CVID-Patienten ohne Immunglobulintherapie aus
ethischen Gründen nicht möglich ist.
Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, daß CVID-Patienten
im Vergleich zu Kontrollpersonen einen erhöhten Anteil terminal differenzierter CD8-TZellen aufweisen. Dieser Immunphänotyp ist mit einem schwereren klinischen Verlauf
assoziiert, insbesondere mit dem Vorliegen einer granulomatösen Erkrankung und
chronischer Lymphadenopathie, sowie mit dem Vorliegen einer CMV-Infektion, zumindest
in einer Untergruppe der Patienten. Die Infektion mit CMV konnte jedoch als primäre
Ursache dieser Veränderungen ausgeschlossen werden. Virusspezifische CD8-T-Zellen gegen
CMV, EBV und das Influenza-Virus sind regelrecht differenziert und reagieren dynamisch
auf Antigenkontakt trotz des Fehlens einer funktionalen B-Zell-Antwort.
Ausgehend von der vorliegenden Arbeit ergeben sich eine Fülle weiterer Fragen. So sind
weitere Schritte notwendig, um den Zusammenhang zwischen klinischen Komplikationen
und seneszentem CD8-T-Zell-Phänotyp aufzuklären und ebenso die Mechanismen zu
evaluieren, die dazu führen, daß einige Patienten trotz der Präsenz funktioneller, gegen CMV
gerichteter CD8-T-Zellen CMV-Reaktivierungen erleiden.
– 56 –
Zusammenfassung
Common variable immunodeficiency (CVID) ist ein ätiologisch und klinisch heterogenes
Antikörpermangel-Syndrom. Das Fehlen einer funktionellen B-Zell-Antwort führt zu
rezidivierenden akuten und Reaktivierungen latenter Infektionen. Klinisch sind insbesondere
bakterielle Atemwegsinfektionen relevant. Jedoch zeigen einige Patienten auch Zeichen von
Autoimmunität und unspezifischer Lymphoproliferation. Auf molekularer Ebene konnten
Auffälligkeiten fast aller lymphatischen Zellreihen beschrieben werden. So sind auch
Alterationen von CD8-T-Zell-Regulation und -Funktion beschrieben worden.
Für diese Arbeit wurden CD8-T-Zellen von 34 HLA-A2-positiven CVID-Patienten und
einer immunokompetenten Kontrollkohorte durchflußzytometrisch untersucht und die
Daten mit klinischen Parametern korreliert. Dabei wurden mithilfe von MHC-I-PentamerTechnologie auch virusspezifische CD8-T-Zellen für CMV, EBV und Influenza analysiert.
Es konnten folgende Ergebnisse gewonnen werden: In der CVID-Kohorte war eine
Verschiebung hin zu einem aktivierten und Antigen-erfahrenen CD8-T-Zell-Phänotyp
nachweisbar. Diese Tendenz war besonders ausgeprägt bei Patienten mit chronischer
Lymphadenopathie und granulomatöser Erkrankung. CMV-assoziierte Immunoseneszenz
war, bezogen auf den CD8-T-Zell-Phänotyp, in der CVID-Kohorte deutlich stärker
ausgeprägt als in der Kontrollkohorte. Dieser Effekt ist jedoch unabhängig von dem
Vorliegen von Lymphadenopathie und granulomatöser Erkrankung. Virusspezifische CD8-TZellen
(für
CMV,
EBV
und
Influenza)
von
CVID-Patienten
zeigten
ein
Differenzierungsmuster, das dem von Zellen immunkompetenter Kontrollen sehr ähnlich
war. Funktionell, gemessen an ihrer Fähigkeit zu dynamischer Differenzierung und
Interferon-gamma-Produktion, zeigten virusspezifische CD8-T-Zellen von CVID-Patienten
keine Defekte.
Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, daß ein gemeinsamer
Pathomechanismus für CD8-T-Zell-Alterationen und Lymphadenopathie/granulomatöse
Erkrankungen bei CVID-Patienten verantwortlich sein könnte. Eine Infektion mit CMV
scheint bei CVID-Patienten stärkere Auswirkungen auf das Immunsystem zu haben als bei
Gesunden. Virusspezifische CD8-T-Zell-Antworten gegen CMV, EBV und Influenza sind
jedoch auch bei diesen Patienten intakt.
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– 64 –
Danksagung
Herrn Prof. Dr. med. Drs. h.c. Hubert E. Blum danke ich für die Möglichkeit, meine
Promotionsarbeit in seiner Abteilung durchzuführen.
Für die freundliche Übernahme des Zweitgutachtens danke ich Herrn Prof. Dr. med. Hans
Hartmut Peter.
Besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. med Robert Thimme für die exzellente Betreuung und
Förderung.
Prof. Dr. med. Klaus Warnatz und Frau Dr. med. Sigune Goldacker danke ich für die
angenehme und fruchtbare Kooperation.
Vielen Dank an Herrn Prof. Dr. rer. nat. Hanspeter Pircher für die kritischen Diskussionen
und wertvollen Anregungen.
Bertram Bengsch gebührt besonderer Dank für die wissenschaftliche Unterstützung und die
kritische Durchsicht des Manuskripts.
Der ganzen Arbeitsgruppe mit Dr. rer. nat. Ulrike Aichele, Tayibe Altay, Dr. rer. nat Eva
Billerbeck, Dr. med. Tobias Böttler, Dr. rer. nat. Ekaterina Breous, Stefanie Grafmüller, Dr.
med. Daniel Grimm, Maximilian Heeg, Sandra Hild, Dr. rer. nat. Juandy Jo, Dr. med.
Michaela Neagu, Dr. med. Christoph Neumann-Haefelin, Katja Nitschke, Julia Schmidt, Dr.
med. Dr. rer. nat. Nasser Semmo, Prof. Dr. med. Hans Christian Spangenberg, Mario
Witkowski danke ich für die freundschaftliche Aufnahme und Hilfe in allen technischen und
wissenschaftlichen Fragen, ganz besonders hervorgehoben seien hier Nadine Kersting, Bianca
Seigel und Natalie Wischniowski, ohne deren Hilfe diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre.
Meiner Familie und meinen Freunden danke ich für ihre Geduld und Unterstützung.
– 65 –
Lebenslauf
Diese Seite enthält persönliche Daten und ist deshalb nicht Teil der elektronischen Publikation.
– 66 –
Publikationen
Bengsch B, Seigel B, Ruhl M, Timm J, Kuntz M, Blum HE, Pircher H, Thimme R (2010).
Coexpression of PD-1, 2B4, CD160 and KLRG1 on exhausted HCV-specific CD8+ T cells
is linked to antigen recognition and T cell differentiation., PLoS Pathog, 6(6), e1000947
Kuntz M, Goldacker S, Blum HE, Pircher H, Peter HH, Thimme R, Warnatz K (2011).
Analysis of bulk and virus-specific CD8+ T cells reveals advanced differentiation of CD8+ T
cells in Patients with Common Variable Immunodeficiency., Clin Immunol, 141(2), 177-86
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