Protein engineeringof antibody-interleukin 12 - ETH E
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Diss. ETH No. 16165 Protein engineering of antibody-interleukin 12 fusion proteins A dissertation submitted to the SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZÜRICH for the degree of DOCTOR OF NATURAL SCIENCES presented by VERENACHRISTINE GAFNER Eidg. Dipl. Pharm. ETH ETH Zürich February11, 1966 Citizen of Beatenberg, BE born on recommendationof Prof. Dr. Dario Neri, examiner Prof. Dr. Pius August Schubiger, co-examiner aeeepted on the July 2005 1 SUMMARY Monoclonal antibodies and their derivatives biopharmaceuticalproduets. are engineered represent a major segment of Over 30% of biopharmaceuticalsin clinical trials Therapeutic antibodies antibodies. importantin the field now today have become more and more of Cancer therapy, due to their lower toxicity compared to the less specific chemotherapeutic agents and radio therapy. However, spite in of these relatively proven to be promising developments, resistant to antibody based therapy. antibody based therapy of solid tumours, may pressure, solid tumours have often irregulär vasculature and the poor include the penetration Factors high hampering tumour interstitial of the antibodies into the tumour tissue. Considering these obstacles, the selective delivery of therapeutic agents to the blood vessels, is a promising alternative. Targeting the tumour vasculature is very attractivefor a number of reasons: tumour neo-vasculature, while • Angiogenesis, is a sparing the mature and healthy characteristic feature of the most of aggressive solid tumours. • The tumour neo-vasculature administeredtherapeutic • Markers of angiogenesis is better accessible to intravenously agents than the tumour cells. are typically produced by endothelial cells and/or fibroblastsand are genetically more stable than tumour cells. • There is a growing evidence that the selective damage of tumour vasculature may lead to massivedeath of tumour cells, which vessels for they supply of nutrients and oxygen to satisfy rely on neo- blood their metabolic 10 needs. It is estimated that more than 100 tumour cells rely on one endothelial cell for survival. Recently the tumour targeting properties antibody fragment specific a which the p40 and p35 and with FLAG tag, a Is it possible marker of therapeutic strategies pursued, Does sequentially effect of the in this thesis: both the scFv(L19) and the IL12 moieties? a more potent therapeutic IL12-scFv(L19)fusion protein in tumour bearing mice? in a protein experiment that fusions of TNF-a to scFv(L19) significantly enhanced tumour uptake of the and in enhanced an therapeutic effect. construeted two different dimeric antibody cytokine fusion scFv(L19) moieties), which displayed a compared scFv(L19) improve the targeting properties of an IL12-scFv(L19)fusion We first showed in co-administration antibody resulted fused with following issues have been addressed better tumour targeting correlate with a FLAG fusion protein IL12-scFv(L19)-FLAGin relatively modest. were to of the fusion subunits of IL12 were proteins containing vitro a (IL12) exhibited particularly potent anti-tumoureffects. Based on these findings, the two human monoclonal for the ED-B domain of fibronectin, However, the targeting properties • a high affinity anti-ED-B antibodyfragment scFv(L19) as a targeting agent, the fusion with interleukin 12 • scFv(L19), described. Among the angiogenesis, have been using of to the monomeric more stable IL12-scFv(L19)Furthermore we proteins (both bearing binding to the antigen /n IL12-scFv(L19)-FLAGprotein. Surprisingly the 11 smaller heterodimer named tumour uptake while the "p40-scFv(L19)/scFv(L19)-p35" larger homodimer "IL12-SIP(L19)" showed excellent failed to accumulate at the tumour site. The fusion protein p40-scFv(L19)/scFv(L19)-p35exhibited 9 %ID/g tumounorgan ratio of 10:1 - 20:1. In scFv(L19)/scFv(L19)-p35 performed investigation and take a closer look schedules. on a preliminary therapy experiments p40- better than the difference in the therapeutic action and was IL12-scFv(L19)-FLAG, however, not dramatic. We different therapeutic are continuing our doses and application 12 ZUSAMMENFASSUNG 13 Monoklonale Antikörper und ihre Derivate stellen heute ein Produkte dar. Über 30% der biopharmazeutischen klinischen Studien befinden, sind mehr an Wichtigkeit gewonnen, unspezifische Chemotherapeutika biotechnologisch da sie eine der Biopharmazeutika, die sich in auf dem Gebiet der Therapeutische Antikörper haben Hauptsegment veränderte Antikörper. Krebstherapie mehr und geringere Toxizität zeigen als und Strahlentherapie. Trotz diesen vielversprechenden Entwicklungen haben sich solide Tumoren immer wieder verhältnismässig resistent gegen Antikörpertherapiengezeigt. interstitielle Druck im Tumor, sein Der hohe unregelmässiges Gefässsystem und die Tatsache, dass Antikörper kaum in das Tumorgewebe gelangen, sind Faktoren, die eine Antikörpertherapie Angesichts dieser neuen, von soliden Tumoren erschwerenkönnen. Hindernisse ist der gezielte Transport von tumoreigenen Blutgefässen, gesunden Gefässe, eine unter Therapeutika zu den Umgehung der ausgewachsenen, vielversprechende Alternative. Die Tumorblutgefässe als Angrifffspunkt zu benutzen, ist aus den folgenden Gründen sehr attraktiv: • Die Neuentstehung von Blutgefässen bösartigen • Die ist charakteristisch für die meisten soliden Tumoren. Blutgefässe des Tumors sind für ein intravenös verabreichtes Medikament besser erreichbar als die Tumorzellen selbst. • Die mit von neuen Blutgefässen assoziierten Antigene werden hauptsächlich Endothelzellen und Fibroblasten produziert. Diese beiden besitzen eine höhere genetische Stabilität als Tumorzellen. Zelltypen 14 Neuste Daten bestätigen, dass die selektive Zerstörung von • Tumoren zum Tod von hunderten benötigen für die Sauerstoffvon von Tumorzellen führen kann. Letztere und Nährstoffzufuhrund für den für einen Angiogenese-Marker entwickelt. Von den verschiedenen ED-B Abtransport Abfallproduktenintakte Blutgefässe. Kürzlich wurde ein humanes monoklonales spezifisch Blutgefässen in - Antikörper-Fragment, scFv(L19), die ED-B Domäne von Fibronektin Therapiekonzepten Antikörper-Fragment scFv(L19) zeigte mit dem hochaffinen anti- das Fusionieren mit Interleukin 12 eine besonders starke Antitumor-Aktivität. Obwohl das in welchem die scFv(L19)-FLAG, FLAG-Tag sequenziell an - Fusionsprotein p40 und die p35 Untereinheiten scFv(L19) gehängt wurden, von eine hohe IL12- IL12 und ein therapeutische Aktivität zeigte, akkumuliertees in relativ geringem Mass im Tumorgewebe. diesen Ausgehend von Ergebnissen, wurden in der vorgelegten Dissertation folgende zwei Fragestellungen untersucht: • Kann die gezielte Akkumulation eines Fusionsproteins, das scFv(L19) und IL12 enthält, verbessert werden? • Korreliert eine verbesserte Akkumulation eines Fusionsproteins im Tumor Maus Tumor Modell? IL12scFv(L19) mit einem stärkeren therapeutischen Effekt im 15 Zuerst konnte in einem Co-Applikationsexperiment gezeigt werden, dass Fusionierungvon TNF-a mit dem scFv(L19) Antikörperdie Akkumulation scFv(L19)-FLAG im Tumor therapeutischeAktivität um erhöht. Weiter haben wir zwei dimere Bindung zum Antigen aufwiesen Antikörper-Zytokin- welche beide in vitro eine verglichen mit dem scFv(L19)-FLAG. Überraschenderweisezeigte monomeren Das Fusionsprotein TumorOrgan Ratio von keine Akkumulation während das zeigte. p40-scFv(L19)/scFv(L19)-p35 erreichte Tumorakkumulation von 9 %ID/g (injizierte 10:1 - IL12- das kleinere Heterodimer "p40- scFv(L19)/scFv(L19)-p35"eine ausgezeichnete Tumorakkumulation, grössere Homodimer"IL12-SIP(L19)" IL12- ein vielfaches verstärkt und auch die Fusionsproteinekonstruiert (dimer bezüglich scFv(L19)), stabilere von die eine Dosis/Gramm Gewebe) und eine 20:1. In den ersten Therapieexperimenten zeigte p40-scFv(L19)/scFv(L19)-p35 bessere therapeutische Effekte als IL12-scFv(L19)FLAG, der Unterschied in der therapeutischen Aktivität ausserordentlich gross. Zur Zeit werden in weiterführenden war jedoch nicht Untersuchungen des p40-scFv(L19)/scFv(L19)-p35Experimente mit therapeutischen Effekts von unterschiedlichen therapeutischenDosen und Applikationschemen durchgeführt.
