Strukturelle und funktionelle Analyse des

A
Strukturelle und funktionelle Analyse des
fibronektinbindenden Serumopazitätsfaktors aus
Streptococcus pyogenes (Gruppe A Streptokokken)
Von der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Technischen Universität Carolo-Wilhelmina
zu Braunschweig
zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)
genehmigte
Dissertation
von
Bernd Kreikemeyer
aus Braunschweig
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung
1
A
Einleitung
3
1.
2.
3.
4.
Einordnung der Streptokokken in das System der Prokaryonten
Klassifizierung der Streptokokken
Gruppe A Streptokokken (GAS)
Von S. pyogenes verursachte Krankheiten
Extrazelluläre Pathogenitätsfaktoren
Zellwandassoziierte Pathogenitätsfaktoren
Adhärenz als Pathogenitätsmechanismus
Sfb Protein, dasfibronektinbindendeAdhäsin von S. pyogenes
Ziele der hier vorliegenden Promotionsarbeit
3
3
5
6
9
10
.14
16
18
B
Material und Methoden
19
Bakterien
Bakterienstämme
Stammhaltung
Wachstumsmedien
Anzucht, Induktion und Herstellung von Lysaten der Bakterien
M-Typisierung von S. pyogenes Isolaten
Eukaryontische Zellen
Zellinien
Medien für die Zellkultur
Anzucht und Kultivierung der Zellen
Plasmide und Bakteriophagen
Antibiotikakonzentrationen
Oligodesoxynukleotide (Primer)
Chemikalien, Enzyme, Kits und andere Biomoleküle
Puffer und andere Lösungen
Arbeiten mit k Phagen
Kultivierung der Phagen / Infektion von E. coli
Plaquelift
Herstellung von hochtitrigen X Lysaten
Extraktion von Phagen DNA
Arbeiten mit DNA
Restriktionsverdau
Ligation
Isolierung von Plasmid DNA mit alkalischer Lyse
Isolierung von DNA Fragmenten aus Agarosegelen
Isolierung chromosomaler DNA aus Streptokokken
PCR Amplifikation von DNA
DNA-Hybridisierungsexperimente
19
19
22
22
22
23
23
23
23
24
24
24
24
26
28
30
30
31
31
32
32
32
32
32
33
33
34
35
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
1.
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
2.
2.1
2.2
2.3
3.
4.
5.
6.
7.
8.
8.1
8.2
8.3
8.4
9.
9.1
9.2
9.3
9.4
9.5
9.6
10.
Inhaltsverzeichnis
10.1
10.2
10.3
11.
11.1
11.2
11.3
12.
12.1
12.2
13.
14.
14.1
14.1.1
14.2
14.2.1
14.3
15.
15.1
15.2
15.3
15.4
15.5
16.
16.1
16.2
16.2.1
16.2.2
16.2.3
16.2.4
16.3
17.
17.1
17.2
17.3
18.
18.1
18.1.1
18.1.2
18.1.3
18.2
19.
19.1
19.2
19.3
20.
Markierung der DNA mit Digoxygenin-dUTP
Southern Blotting
Hybridisierung und Entwicklung
DNA Sequenzierung
"Taq Cycle" Sequenzierung mit "Dye Deoxy" Terminatoren
Aufreinigung der Sequenzierproben
Auswertung der Daten
Elektrophoretische Methoden
Agarosegelelektrophorese
Elektrophorese in diskontinuierlichen SDS-Polyacrylamid-Gelen
Western-Blot
Nachweismethoden für Bindungsproteine
Immunologischer Nachweis membrangebundener Proteine
Radioautographischer Nachweis von Protein-Protein Wechselwirkungen
Schnelltest auf Expression rekombinanter Proteine in E. coli
Nachweis im Kolonielift/Plaquelift
"Enzyme linked immunosorbent assay" (ELISA)
Transformationen und kompetente Zellen
Herstellung kompetenter E. coli Zellen für die Transformation
Herstellung kompetenter £ coli Zellen für die Elektroporation
Herstellung kompetenter S. pyogenes Zellen für die Elektroporation
Transformation von E. coli mit Plasmid-DNA
Elektroporation
Proteinchemische Methoden
Bestimmung der Proteinkonzentration
Bindungsversuche mit radioaktiv markierten Proteinen
Radioaktive Markierung von Proteinen
Bestimmung der spezifischen Ativität
Bindungsversuch für I25I markierte Proteine
Kompetitive Hemmversuche
Proteinumpufferung durch Dialyse
Chromatographische Methoden
Reinigung von Fibronektin aus Humanplasma
Aufreinigung von Glutathion-S-Transferase Fusionsproteinen
Native Aufreinigung von His-Tag Fusionsproteinen
Adhärenzversuche
Adhärenzversuche mit gekoppelten Latexpartikeln
Kopplung von 3 um Latexpartikeln
Überprüfung der Kopplungseffizienz
Adhärenzversuch
Adhärenzversuche mit S. pyogenes A75
Test auf Serumopazitätsfaktoraktivität
Der Mikrotiterplatten-Test
SDS-PAGE "Overlay"-Test
"Serum agar slide inhibition" -Test
Herstellung von polyklonalen Seren
35
36
36
37
37
38
38
38
38
39
40
40
.40
.41
41
41
42
42
42
43
43
43
44
44
44
44
44
45
45
45
46
46
46
46
47
47
.47
47
48
48
48
49
49
49
49
50
Inhaltsverzeichnis
C
1.
1.1
1.2
2.
III
Ergebnisse
51
Charakterisierung der XA45 und XA75 Klone
Bestimmung der Spezifität der Fibronektinbindung
Bestimmung der moi
51
52
52
Strukturelle Untersuchung der Fibronektinbindungskomponente
aus S. pyogenes A75
53
2.1
2.1.1
2.1.2
Subklonierung des Inserts aus dem Phagenklon A.A75
SA
Kartierung der Restriktionsschnittstellen
55
Herstellung von Deletionsderivaten und Untersuchung ihrer Bindungseigenschaften
56
2.2
Differenzierung des sßll Gens vom sfl>\ Gen durch DNA-Hybridisierungen... 58
2.2.1 Southern Blot mit der sßl Gensonde
59
2.2.2 Southern Blot mit der sßll Gensonde
60
2.3
Bestimmung der Nukleotidsequenz des sfbll Gens
62
2.3.1 Aminosäuresequenz und Homologien zu anderen Proteinen
65
2.3.2 Die repetitive Sfbll Domäne und ihre Homologien zu anderen Fibronektinbindungsproteinen
68
3.
Funktionelle Untersuchung des Sfbll Proteins
3.1
Lokalisation der Fibronektinbindungsdomäne auf dem Sfbll Protein
3.1.1 Amplifikation und Expression rekombinanter sßll Bereiche
3.2
Nachweis der Oberflächenlokalisation und Funktionalität des Sfbll Proteins
beim S. pyogenes Stamm A75
3.2.1 Inhibition der Fibronektinbindung an S. pyogenes durch gereinigtes Sfbll
Fusionsprotein
3.2.2 Inhibition der Fibronektinbindung an S. pyogenes durch polyklonales
Anti-Sfbll Antiserum
3.3
Lokalisation der Sfbll Bindungsdomäne auf dem Fibronektinmolekül
3.4
Untersuchungen zur möglichen Funktion des Sfbll Proteins als Adhäsin
3.4.1 Adhärenz proteingekoppelter Latexpartikel an verschiedene Zellinien
3.4.2 Identifizierung der Adhärenz-vermittelnden Sfbll Proteindomäne
3.4.3 Adhärenz des S. pyogenes Stammes A75 an HEp2 Epithelzellen
3.5
Konstruktion einer sßll negativen Insertionsmutante
3.5.1 Überprüfung des Insertionsereignisses durch gezielte PCR und Southern
Blots
3.5.2 Die Mutante A75SfbII" hat einen Serumopazitätsfaktor (SOF) negativen
Phänotyp
3.6
Charakterisierung der SOF Aktivität
3.6.1 Identifizierung der für die SOF Aktivität verantwortlichen Sfbll
Proteindomäne
3.6.2 Die SOF Aktivität ist M-Typ spezifisch
69
69
69
72
73
74
76
.77
77
81
84
84
86
88
89
89
91
IV
4.
Inhaltsverzeichnis
Epidemiologische Untersuchungen
4.1
4.2
92
Untersuchungen zur Präsenz des sßll Gens in S. pyogenes Isolatgruppen
Das sßll Gen zeigt Variabilität in dem für den N-Terminus kodierenden
Genabschnitt
Amplifizierung und partielle Sequenzierung von sßll Genen aus einem
M2 und M13 Stamm
Sequenzvergleich aller bisher analysierten Sfbll Proteine
Test von Humanseren auf Präsenz von Anti-Sfbll Antikörpern
Reaktivität von Humanseren gegen verschiedene Sfbll Proteinepitope im
Western Blot
100
D
Diskussion
103
E
Literaturverzeichnis
120
F
Anhang
4.3
4.3.1
4.4
4.5
Abkürzungsverzeichnis
Lebenslauf
Danksagung
93
95
96
96
99