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IOSENSOR
2. BSYMPOSIUM
TÜBINGEN 2001
http://barolo.ipc.uni-tuebingen.de/biosensor2001
Entwicklung eines Cyanid-Biosensors: Cyanidase aus bakteriellen Quellen
Michael Keusgen, Peter Milka und Ingo Krest
Institut für Pharmazeutische Biologie, Universität Bonn, Nussallee 6, D-53115 Bonn
Tel. +49-228-732676
[email protected]
http://www.uni-bonn.de/pharmbio/
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Poster
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Zahlreiche Nutz- und Arzneipflanzen sind auf Grund ihres Gehaltes an cyanogenen Glykosiden für
den Menschen giftig [1, 2]. Diese Substanzen sind typisch für die Pflanzen-Gattungen Prunus,
Sambucus, Linum, Carica, Phaseolus und Manihot. Neben einigen Insekten wurden bisher etwa 2500
Pflanzen gefunden, die cyanogene Glykoside enthalten. Wenn derartiges Pflanzenmaterial bei der
Verarbeitung
verletzt
wird,
entsteht
Blausäure.
Diese
Reaktion
wird
durch
verschiedene,
pflanzeneigene Enzyme katalysiert. Die Blausäure kann durch gründliches Erwärmen ausgetrieben
werden, was aber insbesondere in Entwicklungsländern nicht immer möglich ist (z. B. bei der
Herstellung von Lebensmitteln, die Maniok enthalten). Deshalb kommt es in diesen Ländern häufig zu
Vergiftungen durch Blausäure.
Da pflanzliches Nutzmaterial, aus dem Blausäure freigesetzt werden kann, eine akute Gefahr für
Mensch und Tier darstellt, erscheint die Entwicklung einer schnellen und präzisen analytischen
Methode zur Cyanid-Detektion sinnvoll. Ein biosensorisches System, welches aus einer AmmoniakElektrode und dem Enzym Cyanidase [EC 3.5.5.1] besteht, erfüllt diese Anforderungen und ist auf
Grund der hohen Spezifität eine sinnvolle Alternative zu einer cyanidsensitiven Elektrode [3]. Ein
solcher Cyanid-Biosensor kann sowohl zum Screening auf cyanogene Glykoside als auch zur
Qualitätskontrolle von Nutz- und Arzneipflanzen verwendet werden. Der Schlüsselschritt in der
Entwicklung eines derartigen Biosensors ist die Selektion einer geeigneten Cyanidase, wie sie für
einige Bakterien beschrieben wurde [4, 5].
Unter diesem Aspekt wurden Bakterienstämme der Gattungen Rhodococcus rhodochrous und
Alcanigenes xylosoxidans untersucht. Um die Cyanidase-Aktivität zu induzieren, wurden beide
Stämme sukzessive mit zunehmenden Mengen Kaliumcyanid gefüttert. Dieser Vorgang wurde
mehrfach wiederholt. Dadurch konnte eine Selektion besonders potenter Spezies erzielt werden.
Alcaligenes xylosoxidans zeigte nach drei Zyklen der Selektion bei Cyanid-Konzentrationen kleiner 2 ×
-3
10 M noch ein befriedigendes Wachstum. Im Gegensatz dazu konnte Rhodococcus rhodochrous bei
-2
einer deutlich höheren Konzentration von 1 × 10
M Cyanid kultiviert werden. Ebenfalls wuchs
Rhodococcus rhodochrous in einem cyanidhaltigen Stickstoff-Mangelmedium. Zusätzlich war bei
-2
diesem Stamm keine Wachstumshemmung nach der Zugabe von Isovaleronitril (2 × 10
M) zu
beobachten. Im nächsten Schritt der Untersuchungen sollen entweder intakte Zellen von
Rhodococcus rhodochrous oder das isolierte Enzym immobilisiert und mit der Ammoniak-Elektrode
kombiniert werden. Dieses ergibt den Cyanid-Biosensor (Abb. 1). Der Sensor gleicht dem analytischen
System, welches zur quantitativen Bestimmung von Alliin entwickelt wurde [6].
Das Messprinzip konnte bereits mit Cyanidase bestätigt werden, die von der Firma Novo Nordisk zur
Verfügung gestellt wurde (SP 379; Abb. 2). Dieses Enzym wurde ebenfalls aus Alcaligenes
xylosoxidans gewonnen. Die Messungen wurden mit einer kürzlich entwickelten DurchflussMessapparatur durchgeführt [6, 7, a]. Als Detektionslimit wurde 0,2 mg/l Cyanid ermittelt; der lineare
Bereich lag zwischen 0,6 mg/l und 30 mg/l Cyanid. Durch diese Versuche konnte bewiesen werden,
dass ein biosensorischer Nachweis von Cyanid möglich ist und die Sensitivität des Verfahrens nahezu
Pfla n ze n e ig e n e
En zym e
Poten tial [m V ]
Elektrode
Biose
Pflanz
Cyanogene
Glykoside
e nex t
r ak t
nsor
vergleichbar mit der von zeitintensiven konventionellen Verfahren ist (z.B. Methode nach DIN 38405).
H CN
Cyanidase
2 H2O
NH3
+
HCOOH
Abb. 1 Funktionsprinzip eines Biosensors zum
Nachweis von cyanogenen Glykosiden. Bei
Verletzung des Pflanzenmaterials wird durch
pflanzeneigene Enzyme Blausäure gebildet, die
wiederum durch die Cyanidase zu Ammoniak
und Blausäure hydrolisiert wird. Der enzymatisch
gebildete Ammoniak wird durch eine AmmoniakGaselektrode quantitativ erfasst.
-
C N [m g /l]
Abb. 2 Kalibrierkurve, die mit der Cyanidase
von Alcaligenes xylosoxidans erhalten wurde
(Novo Nordisk SP 379). Die Messungen
wurden mit einer Durchfluss-Messapparatur
durchgeführt [6, 7, a].
Literatur
[1]
Jones, D.A. (1998) Phytochemistry 47, 155.
[2]
Lechtenberg, M., Nahrstedt, A. (1999) in: Naturally Occurring Glycosides; R. Ikan (ed). Wiley, Seite 147.
[3]
Voldrich, M., Opatova, H., Kyzlink, V., Hrdlicka, J. (1989) Sbornik UVTIZ Potravinarske Vedy 7, 271.
[4]
Kobayashi, M., Nagasawa, T., Yamada, H. (1988) Eur. J. Biochem. 182, 349.
[5]
Ingvorsen, K., Hojer-Pedersen, B., Godfredsen, S.E. (1991) Appl. Environ. Microbiol., 57, 1783.
[6]
Milka, P., Krest, I., Keusgen, M. (1999) Pharmazie 54, 435.
[7]
Keusgen, M. (1999) Biosensorische Methoden zur quantitativen Bestimmung von Cysteinsulfoxiden, Shaker-Verlag
Aachen, 162 Seiten.
[a]
www.krest.de/promotion