Inhaltsangabe
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Muskelbiochemie Inhaltsangabe Inhaltsangabe..........................................................................................................................1 1. Einleitung .............................................................................................................................2 1.1 Theoretischer Hintergrund..........................................................................................2 1.1.1 Kohlenhydrate.........................................................................................................2 1.1.2 Fette ..........................................................................................................................3 1.1.3 Aminosäuren...........................................................................................................4 1.1.4 Glycolyse und Milchsäuregärung........................................................................4 1.1.5 Adenosintriphosphat .............................................................................................5 1.1.6 Muskeln....................................................................................................................6 1.2 Aufgabenstellung des Versuchs..............................................................................12 2. Material und Methoden ....................................................................................................12 2.1 Versuchsbeschreibung .............................................................................................12 2.2 Versuchsdurchführung ..............................................................................................13 2.2.1 Präparation des Frosches..................................................................................13 2.2.2 Reizung des Arbeitsmuskels.............................................................................13 2.2.3 Probenvorbereitung .............................................................................................14 2.2.4 Lactatbestimmung...............................................................................................14 2.2.5 Glykogenbestimmung.........................................................................................15 3. Ergebnisse ........................................................................................................................16 4. Diskussion.........................................................................................................................22 5. Quellenangaben...............................................................................................................23 1 Muskelbiochemie 1. Einleitung 1.1 Theoretischer Hintergrund 1.1.1 Kohlenhydrate Als Kohlenhydrate werden die Zucker und ihre Polymere bezeichnet. Man kann je nach Anzahl der verknüpften Monosaccharide verschiedene Kohlenhydrate unterscheiden: • Monosaccharide: Die Monosaccharide oder auch Einfachzucker sind in ihrer Summenformel meist ein Vielfaches von CH2O. Sie können direkt als Brennstoff benutzt werden, als Grundbaustein von Polymeren dienen oder in andere organische Moleküle umgebaut werden. Von großer Wichtigkeit sind Glucose (C6H12O6) und Ribose (C5H9O5). Liegen die Moleküle in linearer Form vor, so bestimmt sie Position der C=ODoppelbindung, ob es sich um eine Aldose oder eine Ketose handelt. Befindet sich die Doppelbindung an einem endständigen C-Atom, handelt es sich u m eine Aldose, ist die Doppelbindung an einem mittleren C-Atom, spricht man von einer Ketose. Auf Grund der Struktur der Moleküle entstehen asymmetrische C-Atome, die vier verschiedene Substituenten besitzen. Aus diesem Grund kann man trotz der frei drehbaren s-Bindungen zwei Formen ein- und derselben Molekülspezies nicht zur Deckung bringen. Befindet sich die OH-Gruppe des letzten asymmetrischen C-Atoms rechts, liegt das Molekül in der D-Form vor, steht die OH-Gruppe links, liegt das Molekül in der L-Form vor. In der Natur kommen Monosaccharide hauptsächlich als Ringe vor. Dabei schließt sich der Ring über ein O-Atom (Halbacetalbindung) und ein oder zwei C-Atome liegen außerhalb der Ringebene. Man kann die Monosaccharide in Verbindungen mit drei bis sieben C-Atomen untergliedern. Pentosen (5 CAtome) und Hexosen (6 C-Atome) kommen biologisch am häufigsten vor, außerdem kann man auch Furanosen (5-atomiger Ring) und Pyranosen (6atomiger Ring) unterscheiden. In der Regel bilden Ketohexosen und Pentosen in der Halbacetalform Furanosen, Aldohexosen dagegen bilden Pyranosen. Da auch das erste C-Atom (im Uhrzeigersinn vom O-Atom aus gezählt) durch die Ringschließung zu einem asymmetrischen Atom geworden ist, spielt hier wieder die Stellung seiner OH-Gruppe eine wichtige Rolle. Steht die OH-Gruppe auf der selben Seite wie die OH-Gruppe am nächsten C-Atom (in der HarworthProjektion unterhalb der Ringebene), so spricht man von einem a-Monosaccharid, steht sie auf der gegenüberliegenden Seite (oberhalb der Ringebene), wird das Molekül als b-Monosaccharid bezeichnet. In Lösung liegt die a- Form zu etwa 60%, die b- Form zu etwa 38% und die lineare Form zu ca. 2% vor. Zur Speicherung bzw. zur Nutzung von Kohlenhydraten entstehen aus Monosacchariden durch glykosidische Bindungen Di-, Oligo- oder Polysaccharide. Die Häufigste dieser Verknüpfungen ist die 1,4-glykosidische 2 Muskelbiochemie Bindung, d.h. zwei Ringe werden durch eine Sauerstoffbrücke am ersten CAtom des ersten und am vierten C-Atom des zweiten Bindungspartners verknüpft. Dabei stellt die OH-Gruppe am ersten C-Atom das Sauerstoffatom für die Brücke zur Verfügung. Auch hier kann man zwischen a- und bglykosidischen Verbindungen unterscheiden. Außerdem gibt es zahlreiche weitere Verknüpfungen, wie z.B. 1,6- oder 1,1-glykosidische Verbindungen. • Disaccharide: Disaccharide sind aus zwei Monosacchariden aufgebaut. Beispiele für Disaccharide sind Saccharose (Fructose und Glucose, 1,2glykosidisch verknüpft) und Maltose (2 Glucose-Moleküle, 1,4-glykosidisch verknüpft). Die Verbindung der beiden Monosaccharide kann nach zwei Prinzipien erfolgen: a) Die Verknüpfung erfolgt an den beiden halbacetalischen Hydroxylgruppen (1,1-Bindung, Trehalosetyp). b) Die glykosidische Verknüpfung erfolgt mit der Hydroxylgruppe des 4. CAtoms (1,4- Bindung, Maltosetyp). • Oligosaccharide: Ein Oligosaccharid ist aus drei bis zehn Monosacchariden aufgebaut. • Polysaccharide: Polysaccharide setzen sich aus mehreren hundert bis mehreren tausend Monosacchariden zusammen. Einige dieser Makromoleküle werden als Speichermaterial zur Versorgung der Zelle mit Zucker genutzt. Hierzu zählt zum Beispiel die Stärke, ein Speicherpolysaccharid der Pflanzen. Sie setzt sich zusammen aus Amylose, die unverzweigte Ketten aus 1,4glykosidisch verknüpfter a-D-Glucose bildet und Amylopektin, das verzweigte Ketten bildet, wobei hier auf 25 1,4-glykosidisch verknüpfte a-D-GlucoseMoleküle eine 1,6-Bindung als Abzweigestelle kommt. Ein weiteres Beispiel für ein Speicherpolysaccharid ist das Glycogen. Es hat strukturelle Ähnlichkeiten mit dem Amylopektin, hier kommt auf alle sechs 1,4-glykosidischen Bindungen eine 1,6-Bindung. Andere Polysaccharide können dem Organismus als Strukturpolysaccharide zum Aufbau von Stütz- und Schutzstrukturen dienen, wie z.B. die Cellulose in der Zellwand von Pflanzen. 1.1.2 Fette Fette haben einen großen Energiegehalt und sind kompakte Speichermoleküle. Sie sind aus Glycerin und Fettsäuren aufgebaut. Das Glycerin ist ein Alkohol mit je einer Hydroxygruppe an jedem seiner drei Kohlenstoffe. Die Fettsäure besteht aus einem langen Gerüst aus Kohlenstoffen (normalerweise 16-18 Stück), an dessen Ende sich eine Carboxylgruppe befindet, die den sogenannten Kopf bildet. Das Kohlenstoffgerüst wird als Schwanz bezeichnet und ist durch seine unpolaren C-HBindungen der Grund für das hydrophobe Verhalten der Fette. Jeweils drei Fettsäuren sind über eine Esterbindung mit einem Glycerinmolekül verbunden. Die Fettsäuren können die gleichen oder verschiedene sein. Man kann gesättigte und ungesättigte Fettsäuren unterscheiden. Bei den gesättigten Fettsäuren ist die Höchstzahl an Wasserstoffatomen an den Schwanz der Fettsäuren gebunden, sie tragen also keine Doppelbindungen. Die gesättigten 3 Muskelbiochemie Fettsäuren erstarren bei Raumtemperatur. Bei den ungesättigten Fettsäuren besitzt der Kohlenstoffschwanz eine oder mehrere Doppelbindungen, die durch das Entfernen von Wasserstoffatomen entstanden sind. Ungesättigte Fettsäuren sind bei Raumtemperatur flüssig, das liegt daran, dass die Moleküle durch die Knicke, die an den Stellen mit Doppelbindung auftreten, nicht so dicht „gepackt“ werden können. 1.1.3 Aminosäuren Aminosäuren (AS) tragen eine Amino- und eine Carboxylgruppe. Sie sind organische Moleküle und bilden die Grundeinheit der Polypeptide. Der Körper ist in der Lage aus nur 20 verschiedenen Aminosäuren mehrere tausend Proteine aufzubauen. Bis auf Glycin bestehen alle AS aus einem mit vier verschieden Partnern verbundenen, asymmetrischen Kohlenstoff. Der Wasserstoff, die Carboxylgruppe und die Aminogruppe sind bei allen AS gleich. Die Seitenkette (R-Gruppe), die den vierten Partner darstellt, bestimmt die Merkmale, auf Grund derer die AS in verschiedene Gruppen eingeteilt werden können. Die hydrophoben mit unpolaren Seitenketten, die hydrophilen mit polaren Seitenketten und elektrisch geladene AS, die aufgrund einer meist negativ geladenen Carboxylgruppe sauer oder aufgrund einer positiv geladenen Aminogruppe basisch sind. Sowohl basische, als auch saure AS sind aufgrund ihres Ionencharakters hydrophil. Mit Hilfe eines Enzyms kann eine Carboxylgruppe mit der Aminogruppe einer direkt danebenliegenden AS durch Kondensation kovalent verbunden werden. Diese Bindung wird Peptidbindung genannt. Ein Polypeptid besteht aus wenigen bis zu 1000 (auch mehr) durch Peptidbindungen verknüpften Aminosäuren. 1.1.4 Glycolyse und Milchsäuregärung Als Glycolyse (Zuckerspaltung) wird ein Vorgang bezeichnet, bei dem durch Oxidation von Glucose zu Pyruvat Energie freigesetzt wird. Hierbei wird ein Glucose-Molekül, welches aus den Glycogen-Speichern stammt, zu Pyruvat umgebaut. Der C6-Körper Glucose wird unter zweimaligem ATPVerbrauch zu Fructose-1,6-biphosphat umgewandelt. Letztere wird in zwei C3Körper, das Glycerinaldehyd-3-Phosphat und in Dihydroxyacetonphosphat, welches durch Enzymeinwirkung ebenfalls zu Glycerinaldehyd-3-Phosphat wird, gespalten. Beim Umbau eines dieser Moleküle zu Pyruvat entstehen 2 ATP und 1 NADH aus NAD+. Somit entstehen bei der Glycolyse pro Mol Glucose 2 Mol ATP und 2 Mol NADH. Um diesen Prozess in Gang zu halten, muss das NADH wieder zum Ausgangsstoff NAD+ oxidiert werden. Unter aeroben Bedingungen, wenn also Sauerstoff vorhanden ist, geschieht dies durch oxidative Phosphorylierung in den Mitochondrien. Insgesamt werden auf dem aeroben Weg durch Glycolyse, Citrat-Zyklus und Atmungskette aus 1 Mol Glucose 36 Mol ATP gewonnen. Ebenfalls wird das NADH aus der Glycolyse wieder zu NAD+ oxidiert. 4 Muskelbiochemie Unter Sauerstoffmangel können manche Zellen, z.B. Muskelzellen, durch Gärung trotzdem ATP bilden. Bei diesem Vorgang wird das Pyruvat vom NADH sofort zu Lactat (Anion der Milchsäure) reduziert. Man nennt dies Milchsäuregärung (siehe Abb.1). Die Milchsäuregärung setzt ein, wenn bei hoher Belastung der Energiebedarf größer ist, als mit der verfügbaren Sauerstoffmenge Glucose verarbeitet werden kann. In den meisten Fällen wird bei der anaeroben Glycolyse Glycogen anstelle von Glucose verwendet. Das Glycogen ist das tierische Äquivalent zum Speicherstoff der Pflanzen, der Stärke; es ist dem Amylopektin ähnlich, jedoch stärker verzweigt. Das sich ansammelnde Lactat, welches Muskelerschöpfung und zum Teil Muskelkater herbeiführt, wird nach und nach durch das Blut in die Leber geschafft und dort wieder zu Pyruvat umgesetzt. Abb.1: Die Milchsäuregärung (Glycolyse) (Campbell, Biologie, 2. korrigierter Nachdruck 2000, Spektrum Verlag) 1.1.5 Adenosintriphosphat Das Adenosintriphosphat, kurz ATP, besteht aus Ribose (Fünfkohlenstoffzucker), an die die stickstoffhaltige Base Adenin und eine Kette von 3 Phosphatgruppen gebunden sind (siehe Abb.2). Abb.2: Struktur von ATP (Campbell, Biologie, 2. korrigierter Nachdruck 2000, Spektrum Verlag) 5 Muskelbiochemie Es ermöglicht der Zelle, Arbeit zu verrichten, indem durch Hydrolyse die schwachen äußeren Phosphatbindungen gelöst werden. Hierdurch entstehen ADP (Adenosindiphosphat) und ein anorganisches Phosphat. Dieser Vorgang läuft spontan ab, ist also exergonisch und setzt pro Mol hydrolysiertem ATP ca. 30,5 kJ Energie frei. Die freie Phosphatgruppe kann enzymatisch auf andere Stoffe übertragen werden, wodurch phosphorylierte Zwischenprodukte entstehen, die reaktiver als die Ausgangsprodukte sind. Dadurch können endergonische Prozesse ablaufen, die es den Zellen ermöglichen, Arbeit (mechanisch, chemisch, beim Transport gelöster Stoffe durch Membranen) zu verrichten. Das ADP kann durch Phosphorylierung wieder in ATP umgewandelt werden. Die Energie für diesen endergonen Vorgang wird durch katabole Stoffwechselwege, wie z.B. die Zellatmung, bei der organische Moleküle abgebaut werden, geliefert. Der ATP-Zyklus stellt also eine Verbindung zwischen den Energie verbrauchenden und den Energie liefernden Vorgängen der Zelle dar. 1.1.6 Muskeln a) Aufbau Ein Muskel setzt sich aus Muskelfaserbündeln zusammen, die wiederum aus vielen Muskelfasern bestehen. Die Muskelfasern sind selten verzweigt (Ausnahme: Herzmuskulatur) und entstehen embryonal aus hintereinander liegenden und miteinander verschmelzenden Myoblasten; sie sind zusammengesetzt aus mehreren Myofibrillen. Je mehr Kerne eine Muskelfaser besitzt, umso mehr Myofibrillen enthält sie. Eine Myofibrille besteht aus mehreren Ketten parallel liegender Myofilamente, die in Actin- und Myosinfilamente unterschieden werden können. - Actinfilamente Actinfilamente (siehe Abb.3) sind aus dem Protein Actin aufgebaut. Sie haben einen durchschnittlichen Durchmesser von 6-8 nm. Abb.3: Aufbau eines Actinfilaments (Wehner/Gehring, Zoologie, 23. Auflage, 1995, Thieme Verlag) Sie sind zusammengesetzt aus zwei helicalen Strängen globulärer Actinmoleküle, die in einer Doppelhelix miteinander verwunden sind, und schnell auf- und abgebaut werden können. Die beiden Enden eines Actinfilaments unterscheiden sich strukturell und können auch verschiedene Proteine binden. In der Rinne der Actin-Doppelhelix finden sich fadenförmige TropomyosinMoleküle, an denen globuläre Troponin-Moleküle hängen. 6 Muskelbiochemie - Myosinfilamente Die Myosinfilamente (siehe Abb.4) sind aus dem Protein Myosin aufgebaut, sie haben einen durchschnittlichen Durchmesser von 10-15 nm. Abb.4: Aufbau eines Myosinfilaments (Wehner/Gehring, Zoologie, 23. Auflage, 1995, Thieme Verlag) Ein solches Filament besteht aus aneinander gelagerten Myosinmolekülen, diese setzen sich aus einem zweigeteilten Köpfchen sowie aus einem Hals und einem Schwanz zusammen. Die Schwanzregionen der einzelnen Moleküle sind miteinander verdrillt und bilden die Myosinkette, die Kopfregion hat Actin-bindende Funktion. Hierbei liegen die Myosinmoleküle so, dass ihre Köpfchen in Richtung der Filamentenden zeigen. b) Typen Beim Menschen lassen sich drei Arten von Muskulatur unterscheiden, die glatte, die quergestreifte und die Herzmuskulatur. - Die glatte Muskulatur Die Aktin- und Myosinfilamente liegen in einer ungleichmäßigen Anordnung vor, wobei die Aktinfilamente überwiegen. Das Muskelgewebe ist hier aus spindelförmigen, meist unverzweigten und einkernigen Muskelzellen aufgebaut, e s werden keine Syncytien gebildet. Die glatte Muskulatur kommt beispielsweise i m Magendarmtrakt, den Atmungsorganen und den Harn- und Geschlechtsorganen vor, auch der Schließmuskel der Muscheln besteht aus glatter Muskulatur. Unter dem Lichtmikroskop erscheinen die glatten Muskelzellen homogen („glatt"). Hauptaufgabe der glatten Muskeln sind langsame und langanhaltende Kontraktionen, die willentlich nicht zu steuern sind (Ausnahme: Harnblase). Ihre Aktivität wird durch Hormone und vom vegetativen Nervensystem bestimmt. Es kommt zu keiner Steuerung der Aktivität durch Troponin-Tropomyosin-Komplexe, sondern die Tätigkeit wird durch das Protein Calmodulin reguliert; ein T-TubuliSystem ist nicht vorhanden. Es werden zwei Zelltypen der glatten Muskulatur unterschieden. Single-unit-Zellen sind durch Gap-junctions verbunden und reagieren somit auf über die Zellen laufende elektrische Potentiale wie eine Einheit. Eine Depolaristation kann bei ihnen auch spontan stattfinden, was jeweils alle Zellen der Einheit ebenfalls zur 7 Muskelbiochemie Depolarisation veranlasst. Diesen Zelltyp findet man hauptsächlich in der Eingeweide-Muskulatur. Multi-unit-Zellen hängen nicht funktionell zusammen, sie werden einzeln innerviert. Somit ist eine extrem genaue neuronale Ansteuerung möglich. Sie finden sich z.B. in der Irismuskulatur, wo sie die Größe der Pupille regulieren. - Die quergestreifte Muskulatur Die quergestreifte Muskulatur kann schnelle Bewegungen ausführen und ist willentlich beeinflussbar (Ausnahme: Herzmuskel). Sie findet sich in der Herz- und Skelettmuskulatur der Wirbeltiere, sowie im Bewegungsapparat vieler Invertebraten. Hier liegen die Aktin- und Myosinfilamente in einer gleichmäßigen Anordnung vor, was zu einer sichtbaren Querbänderung führt. Die quergestreifte Muskelfaser ist in Sarkomere (siehe Abb. 5) unterteilt (Länge beim Warmblütermuskel ca. 2,2 mm). Abb.5: Aufbau eines Sarkomers (Campbell, Biologie, 2. korrigierter Nachdruck 2000, Spektrum Verlag) Ein Sarkomer wird auf beiden Seiten von je einer Z-Scheibe begrenzt, die rechtwinklig zur Myofibrillenlängsachse liegen. Die Bänderung entsteht durch die regelmäßig angeordneten, übereinander liegenden dünnen Aktin- und dicken Myosinfilamente. Die Aktinfilamente sind durch Strukturproteine an der Z-Scheibe befestigt, sie ragen also auf beiden Seiten der Z-Scheiben in das Innere je zweier benachbarter Sarkomere. Im mittleren Abschnitt des Sarkomers liegen die Myosinfilamente (A-Bande), die auf beiden 8 Muskelbiochemie Seiten mit den Aktinfilamenten überlappen. In den A-Banden treten also Aktin- und Myosinfilamente gleichzeitig auf, während die H-Bande in der Mitte des Sarkomers nur Myosinfilamente und die I-Bande an den Enden des Sarkomers nur Aktinfilamente enthält. In der Mitte der H-Bande findet man die M-Scheibe, an der die Myosinfilamente ansetzen. Auf dieser M-Scheibe sitzen für den Energiestoffwechsel wichtige Enzyme. Da die A-Bande Aktin- und Myosinfilamente enthalten, erscheinen sie dunkel, während die H-Bande hell wirkt. Durch diese Hell-Dunkelfärbung entsteht der Eindruck einer „quergestreiften“ Muskulatur. c) Funktion Nur wenn ein Motoneuron erregt wird, kommt es zur Kontraktion eines Skelettmuskels. Befindet sich ein Muskel in Ruhe, blockiert das regulatorische Protein Tropomyosin die Myosinbindungsstellen am Actin, die Position des Tropomyosins auf dem Actinfilament wird durch das Protein Troponin überwacht. Damit sich eine Muskelzelle zusammenziehen kann, müssen Ca2+ an das Troponin binden und so die Struktur des Tropomyosin-Troponin-Komplexes verändern. Dadurch werden die Myosinbindungsstellen frei, das heißt, die Myosinköpfchen können Querbrücken zum dünnen Filament bilden. Beendet wird die Kontraktion, indem die intrazelluläre Ca2+-Konzentration sinkt und die Bindungsstellen auf dem Actin blockiert werden. Die Ca2+-Konzentration im Intrazellulärraum der Muskelzelle wird durch das Sarkoplasmatische Retikulum (SR), das eine Sonderform des ER darstellt und die Myofibrillen umgibt, reguliert. Durch die Membran des SR gelangt Ca2+ aus dem Cytosol in das Lumen, das als intrazellulärer Ca2+-Speicher dient. Wird durch das Motoneuron an der neuromuskulären Endplatte Acetylcholin freigesetzt, entsteht in der postsynaptischen Muskelplatte ein AP, das als Signal zur Kontraktion dient. Das AP breitet sich entlang der T-Tubuli (transversale Tubuli, Einfaltungen der Plasmamembran) tief ins Innere der Muskelfaser aus. Durch ein AP an der Membran des T-Tubulus wird nun eine Konformationsänderung von in der Membran des T-Tubulus liegenden Dihydropyridin-Rezeptoren ausgelöst (siehe Abb. 6). Diesen gegenüber liegen auf der Membran des SR Ryanodin-Rezeptoren. Durch die Änderung der Struktur des Dihydropyridin-Rezeptors kommt es auch zu einer Konformationsänderung des Ryanodin-Rezeptors. Durch die Konformationsänderung des Ryanodin-Rezeptors werden großen Mengen von im SR gespeicherten Ca2+-Ionen aus den terminalen Zisternen durch die Ryanodin-Kanäle ausgeschüttet. Dadurch steigt die i m Sarcoplasma normalerweise vorherrschende Ca2+-Konzentration von unter 10-7 Mol auf über 10-6 Mol an. Das Ca2+ ist im SR an Calsequestrin gebunden. Dadurch wird die Zahl der freien Ionen herabgesetzt und eine hohe Zahl von gespeicherten Ionen im SR erreicht. 9 Muskelbiochemie Abb.6: Ca2+-Ausschüttung aus dem SR (Eckert, 4.Auflage, 2002, Thieme Verlag) Durch die Erhöhung der Ca2+-Konzentration binden je vier Ca2+-Ionen an den Troponin-Komplex, was eine Konformationsänderung dieses Komplexes bewirkt. Dadurch wird das Tropomyosin aus seiner blockierenden Stellung verschoben, das heißt, dass die Myosinköpfe an die Bindungsstellen im Actinfilament andocken können. Ein Myosinkopf hat vier Bindungsstellen, mit denen er am Actinfilament nacheinander entlang gleitet. Diese vier Bindungsstellen weisen jeweils eine steigende Affinität für Myosin auf. Bindet nun der Myosinkopf an der ersten Stelle an das Actin, so wird er durch die steigende Affinität der nächsten Bindungsstelle a m Actinmolekül entlang “gezogen”, d.h. er ändert seine Konformation. Durch diesen Effekt wird der Hals des Myosinmoleküls, also das Querbrückengelenk, gedehnt und es entsteht eine Spannung. Da sich das elastische Gelenk wieder in seine Ausgangslage zurückbewegt, wird das Aktinfilament ein kurzes Stück in Richtung der Sarcomermitte verschoben, das Sarcomer wird also verkürzt. Nur unter ATP-Einwirkung und Energieverbrauch kann die letzte Bindung gelöst werden. Dabei wird vom ATP Energie auf den Kopf übertragen, er löst sich vom Actin und ändert seine Konformation; das Myosinköpfchen geht von der energiereichen in die energiearme Konformation über. Es kann nun erneut an eine weiter hinten am Actinfilament gelegene Bindungsstelle andocken. Unter akutem Mangel an ATP wird ADP direkt vom Protein Kreatinphosphat zu ATP regeneriert. Dies geschieht durch die Weitergabe der Phosphatgruppe an das 10 Muskelbiochemie ADP. Da Kreatinphosphat im Sarcoplasma in hohen Mengen vorliegt, kann kurze Zeit auch einen enormen Energiebedarf der Muskeln decken, anderen Prozesse zur ATP-Erzeugung anlaufen. Beim Fehlen von ATP ist die Muskelfaser starr und die Myosinbrücken sind Actin gebunden (zum Beispiel bei der Totenstarre). Durch Erniedrigung der Ca2+-Konzentration wird die Bindungstelle im Filament wieder blockiert, die Ca2+-Ionen werden durch eine Ionenpumpe aktiv aufgenommen. es über bis die fest a m dünnen des SR d) Filamentgleiten Bei der Kontraktion eines Muskels wird jedes Sarkomer kürzer, das heißt, der Abstand von einer Z-Scheibe zur nächsten wird kleiner, die Länge der A-Banden bleibt unverändert, während die I-Banden verkürzt werden, dadurch verschwinden die H-Zonen ganz. Dieses Verhalten kann durch das „Filamentgleiten“ erklärt werden. Abb.7: Das Filamentgleiten (Campbell, Biologie, 2. korrigierter Nachdruck 2000, Spektrum Verlag) Während der Muskelkontraktion ändert sich weder die Länge der dicken (Myosinfilamente), noch die der dünnen (Actin-) Filamente. Die beiden Filamente gleiten in Längsrichtung aneinander vorbei, was zu einem Überlappen führt. Die Bereiche, in denen ausschließlich dicke (H-Bande) bzw. dünne (I-Bande) Filamente liegen, werden kleiner bzw. verschwinden vollständig, während die ABande, in der beide Filamenttypen vorkommen, gleich bleibt. Das Filamentgleiten liegt in einer Wechselwirkung zwischen den Actin- und den Myosinmolekülen begründet. Das Myosinmolekül ist, wie schon erwähnt, aus einem langen Schwanz und einem zweigeteilten Kopf, der seitlich absteht, zusammengesetzt. Die eigentliche Reaktion, bei der Energie freigesetzt wird, findet an den Myosinköpfchen statt, da diese ATP binden und in ADP und einen Phosphatrest umwandeln können (ATPase-Aktivität des Myosins). Ein Teil dieser 11 Muskelbiochemie Energie wird auf das Myosin übertragen, was dazu führt, dass dieses in eine energiereichere Konformation übergeht. Der energiereiche Myosinkopf ist gespannt und kann nun am Actin binden und eine Querbrücke zwischen Actin und Myosin ausbilden (Actin-Myosin-Komplex). Die gespeicherte Energie wird frei und das Myosinköpfchen wird wieder in die energieärmere Konformation überführt; dadurch ändert sich auch der Winkel zwischen Myosinköpfchen und Myosinschwanz. Durch das Umklappen des Myosinköpfchens wirkt eine Kraft auf das Actinfilament, die es in Richtung des Zentrums des Sarkomers zieht. Bei einer erneuten Bindung eines ATP-Moleküls am Myosinkopf („Weichmacherwirkung“ des ATP) kommt es zu einer Lösung der Bindung zwischen Actin und Myosin, der Zyklus kann von vorn beginnen: das neue ATP kann durch ein freies Myosinköpfchen gespalten werden, wodurch dieses in die energiereiche Konformation überführt wird und an ein anderes Actinmolekül binden kann. Die Filamente gleiten kontinuierlich aneinander vorbei (jedes der ca. 350 Köpfchen eines Myosinfilaments bildet und löst ca. 5 Querbrücken pro Sekunde). 1.2 Aufgabenstellung des Versuchs Anhand der Wadenmuskeln eines Frosches soll zunächst die Arbeitsleistung eines Muskels, also die Wegstrecke, die ein Muskel bei einer angelegten Spannung durch Kontraktion zurücklegt, gemessen werden. Außerdem sollen sowohl der Lactat- als auch der Glykogen-Gehalt des eingesetzten Muskels bestimmt werden und mit dem Lactat- bzw. Glykogen-Gehalt eines Ruhemuskels verglichen werden. Ziel des Versuches ist es, den durch die Arbeitsleistung des Muskels gewonnenen Lactat-Gehalt bzw. die umgesetzte Menge an Glycogen zu ermitteln und daraus den ATP-Verbrauch zu berechnen, wobei die entstandene Menge an Lactat zur verbrauchten Menge an Glycogen proportional sein muss, da die Muskelaktivität unter vollständig anaeroben Bedingungen abläuft. Da man weiß, dass bei der Milchsäuregärung pro Mol Glukose zunächst zwei Mol Pyruvat und daraus wiederum zwei Mol Lactat gebildet und dabei insgesamt zwei Mol ATP erzeugt werden, kann man aus der durch die Muskelaktivität gebildeten Lactat-Menge die entsprechend erzeugte und vom Muskel verbrauchte ATP-Menge berechnen. Diese soll nun mit der Arbeitsleistung des Muskels verglichen werden, woraus sich die tatsächlich in mechanische Arbeit umgewandelte Energie berechnen lässt. 2. Material und Methoden 2.1 Versuchsbeschreibung Bei unserem Versuch vergleichen wir die biochemischen Veränderungen die in einem Muskel stattfinden, wenn er Arbeit verrichtet. Für die Umsetzung von chemischer in mechanische Energie ist das ATP verantwortlich, denn das 12 Muskelbiochemie Ineinandergleiten der Aktin- und Myosinfilamente ist direkt an die Spaltung von ATP gekoppelt. Der wichtigste tierische Energiespeicher ist das Glycogen, welches sowohl aerob als auch anaerob abgebaut werden kann. Wir betrachten nur den anaeroben Abbauweg, da wir in vitro arbeiten. Das Endprodukt der Glycolyse ist die Milchsäure (Lactat), somit erhalten wir durch die Messung von Glycogenabbau und Lactatakkumulation ein Maß für die insgesamt verfügbar gewordene chemische Energie. Parallel beobachten wir die vom Muskel geleistete Arbeit, u m Berechnungen zum Nutzeffekt der Muskelarbeit durchzuführen, und die Frage nach dem Verhältnis der zur Verfügung stehenden chemischen Energie und der geleisteten Arbeit zu beantworten. Das Versuchsziel ist die Einführung in die Methodik der enzymatischen Bestimmung von Metabolitenkonzentrationen. Chemische Energie aus dem Glycogenabbau: Glycogen (n Einheiten) _ Glycogen (n-1 Einheiten) + Glucose kJ/mol Glucose _ 2 Lactat + 217 kJ kJ/mol (d.h. 119 kJ/mol Lactat; Molekulargewicht Lactat 89,1 g/mol) DG˚`=-21 DG˚`=-217 2.2 Versuchsdurchführung 2.2.1 Präparation des Frosches Wir verwenden in unserem Versuch die beiden Wadenmuskeln (Plantaris longus) eines Krallenfrosches. Einer der beiden Muskeln wird als „Ruhemuskel“ komplett freipräpariert, in eine mit feuchtem Filterpapier ausgelegte Petrischale gelegt und im Kühlschrank aufbewahrt. Den anderen Muskel (Arbeitsmuskel) präparieren wir so, dass er mit dem Femur verbunden bleibt und ein kleines Stück der vom Fuß abgetrennten Sehne behält. 2.2.2 Reizung des Arbeitsmuskels Zunächst verwenden wir den Arbeitsmuskel. Wir klemmen ihn am Femur fest, verbinden den Sehnenrest über eine Nylonschnur mit dem Wegumwandler und belasten den Muskel mit einem Gewichtsstück (20g). Mit einem elektrischen Reizgeber, der einen gerade übermaximalen Reiz auslöst, lösen wir einmal pro Sekunde eine Muskelkontraktion aus. Dabei zeichnet ein Schreiber den Hubweg des Muskels über den Wegumwandler auf. Während des Versuchs beträufeln wir ständig den Muskel mit Froschringer und saugen überschüssige Flüssigkeit mit Fließpapier ab. Falls die Leistung des Muskels deutlich abfällt, erhöhen wir die Reizstärke am Trafo. Zur Berechnung der mechanischen Arbeit verwenden wir die Formel W = F ⋅ s 13 † Muskelbiochemie W = mechanische Arbeit F = Kraft s = Kontraktionsweg des Muskels 2.2.3 Probenvorbereitung Nachdem wir vom Arbeitsmuskel die Knochen und Sehnen entfernt haben, werden dieser und der Ruhemuskel gewogen und die Gewichte ins Messprotokoll eingetragen. Beide Muskeln werden anschließend mit einer Schere zerkleinert und in je zwei beschriftete Zentrifugengläser gegeben, in die wir danach 2ml eisgekühlte HClO4 (Perchlorsäure) pipettieren. Mittels eines Homogenisators zerkleinern wir die Muskeln, und nachdem der Mixerstab mit je 4ml HClO4 gewaschen wurde, vereinigen wir die Suspensionen. Nachdem die Reagenzglaswände mit 1ml HClO4 abgespült werden, ergibt sich eine Gesamtmenge von 7ml je Zentrifugenglas. Anschließend zentrifugieren wir die Lösungen 5min bei 5000rpm und 0˚C. 2.2.4 Lactatbestimmung Nach dem Zentrifugieren pipettieren wir 1ml vom klaren Überstand in ein neues Zentrifugenglas. Es muss beachtet werden, dass der Bodensatz nicht aufgewirbelt wird. Jetzt neutralisieren wir die Lösung mit 100 ml K2CO3. 2 HClO4 + K2CO3 ’ 2 KClO4 + CO2 + H2O Anschließend zentrifugieren wir wieder (wie oben), und bestimmen mit dem Überstand das Lactat im enzymatischen Test. 2.2.4.1 Enzymtest L-Lactat wird durch NAD in Gegenwart von LDH (Lactatdehydrogenase) zu Pyruvat oxidiert. (I) L-Lactat + NAD ÷ Pyruvat + NADH2 Das Reaktionsgleichgewicht liegt auf der linken Seite (Lactat). Es kann aber nach rechts verschoben werden, indem das Pyruvat mit Hilfe einer Folgereaktion (II) mit dem Enzym GPT und in Gegenwart von L-Glutamat abgefangen wird. Folglich ist die bei (I) gebildete NADH-Menge der L-LactatMenge äquivalent. (II) Pyruvat + L-Glutamat ÷ L-Alanin + a-Ketoglutarat 2.2.4.2 Pipettierschema zur Lactatbestimmung Während des ganzen Versuchs ist darauf zu achten, dass die Pipettenspitzen nicht mit den Händen berührt werden dürfen, da der Handschweiß L-Milchsäure enthält, die die Versuchsergebnisse verfälschen kann. Die Probenansätze für Ruhe- und Arbeitsmuskel werden doppelt nach folgendem Pipettierschema angesetzt. 14 Muskelbiochemie In Reagenzgläser pipettieren Lösung 1-Puffer Lösung 2-NAD Lösung 3-GPT H2O bidest Probelösung (Überstand) Lösung 4-L-LDH Gesamtvolumen Leerwert Ruhemuskel Arbeitsmuskel 1000 ml 200 ml 20 ml 1000 ml 20 ml 2,24 ml 1000 ml 200 ml 20 m 980 ml 20 ml 20 ml 2,24 ml 1000 ml 200 ml 20 ml 980 ml 20 ml 20 ml 2,24 ml Die Ansätze werden auf dem Whirlmix durchmischt und 1h im 25° Wasserbad stehen gelassen. Während dieser Zeit findet die Reaktion statt. Nun wird die Extinktion bei 340 nm gegen den Leerwert gemessen und die Ergebnisse protokolliert. Der Extinktionskoeffizient e des NADH beträgt bei 340 n m 6,31/(mmol*cm). 2.2.5 Glykogenbestimmung Wir führen eine Doppelbestimmung durch: - wir pipettieren zu 1ml Muskelaufschluss 2ml Ethanol, durchmischen alles auf dem Whirlmix und bewahren alles 60min im Eisbad auf. Das in Ethanol unlösliche Glykogen fällt aus und kann abzentrifugiert werden - der Überstand (Ethanol) wird dekantiert und der Niederschlag (Glycogen) mit etwas H2O aufgelöst. Die entstehende Lösung wird quantitativ in einen 50ml-Meßzylinder überführt, und bis zur 50ml-Marke mit H2O aufgefüllt. Nun versetzen wir die Lösung mit Farbreagenz, wobei das Anthron mit dem Glycogen eine blaugrüne Farbe ergibt. Um eine photometrische Bestimmung durchführen zu können, benötigen wir einen Leerwert. Des Weiteren benötigen wir einen Glycogenstandard mit bekannter Konzentration, um die gemessene Extinktion der Lösung in Beziehung zur Konzentration setzen zu können. 2.4 Materialliste für den Versuch Wir verwenden folgende Geräte in unserem Versuch: Wegumwandler, Schreiber, Gewichtsstück 20g, Reizgerät mit Elektroden, Homogenisator Ultra-Turrax, Zentrifuge, Wasserbad (25˚C und 100˚C), Whirlmix, Photometer, 50ml Messkolben (4x), Zentrifugengläser, Bechergläser, Einmalhandschuhe, Wägepapier, Parafilm, Nylonschnur, Pipetten (20 ml, 200 ml, 500 ml, 1000 ml), 2 Petrischalen, Eppendorfpipetten, Photometerküvetten. Wir verwenden folgende Chemikalien in unserem Versuch: 6%ige Perchlorsäure (HClO4), 5 M K2CO3, Ethanol, 0,2% Anthron in H2SO4, Glykogen-Standard (25mg/ml), Lactat-Testansatz, Froschringer, H2O bidest, Eiswürfel. 15 Muskelbiochemie 3. Ergebnisse Reizstrom [V] Peakanzahl durchschnittlicher Ausschlag [mV] Peakanzahl x Höhe [mV] 0,5 43 59 44 140 144 45 72 65 122 52 41 22 55 10,5 12,2 8,2 38 48 42 32 20 20 18 14 16 10 451,5 719,8 360,8 5320 6912 1890 2304 1300 2440 936 574 352 550 1,5 5 10 904 288,9 24110,1 S Tab.1: Tabelle zur Bestimmung der geleisteten mechanischen Arbeit Zur Umrechnung des ermittelten Gesamtbetrags von 22110,1 mV in die vollbrachte Arbeit, benötigen wir die Formel: W= F⋅s Wobei F= m⋅g m= Gewicht [kg] g= 9,81 m/s2 Daraus ergibt sich für F: 0,02kg * 9,81m/s2 = 0,1962 Der Weg (s) errechnet sich folgendermaßen: Für den Wegumwandler gilt: 1mm = 20 mV Wir verwenden die Formel: SSkalenteile ⋅ 0,001m = Strecke S [m] 20 16 Muskelbiochemie Daraus ergibt sich : S = 24110,1 ⋅ 0,001m = 1205,505 ⋅ 0,001m = 1,2055m 20 Nun können wir Wges berechnen: Wges: 0,02kg⋅9,81m/s2⋅1,2055m = 0,24 J In Kalorien ausgedrückt: 1cal = 4,18 J fi 0,24J : 4,18 = 0,057 cal 1.Bestimmung des Lactatgehalts Extinktion bei 340 Ruhemuskel Arbeitsmuskel nm 1.Wert 0,111 0,271 2.Wert 0,073 0,271 Mittelwert 0,092 0,271 Tab.2:Daten zur Lactatbestimmung Lambert Beersches Gesetz: c= E e ⋅d E=Extinktion c=Konzentration d=Schichtdicke [cm] e=molarer Extinktionskoeffizient Wir benützen für den Arbeitsmuskel die Abkürzung AM und für den Ruhemuskel die Abkürzung RM 17 Muskelbiochemie C RM = C AM = • 0,092 = 0,015mmol / cm 3 = 0,015mmol / ml cm 2 6,3 ⋅ 1cm mmol 0,271 = 0,043mmol / cm 3 = 0,043mmol / ml 2 cm 6,3 ⋅ 1cm mmol Berechnung des Verdünnungsfaktors: Verdünnungsfaktor = • 2ml HclO4 + 4 ml HClO4 = 6ml V ges VPr obe *6 fi • 1ml Überstand + 0,1 ml K2CO3 =1,1ml fi • 2,24 ml gesamt; 0,02 ml Probe fi 2,24:0,02 fi *1,1 *112 = 739,2 Verdünnungsfaktor RM: 0,015 mmol/cm3 * 739,2 = 11,088 mmol/cm3 Verdünnungsfaktor AM: 0,043 mmol/cm3 * 739,2 = 31,786 mmol/cm3 Tatsächliche Lactatkonzentration pro g: RM= 8,201 mmol/g AM=28,99 mmol/g • Angabe des Lactatgehalts in [mg/g]: 1 Mol Lactat = 89,07g RM: 8,201 * 10-6 Mol = a a= 7,3 ⋅ 10-4g fi 0,73 mg/g Lactatgehalt AM: 28,99 * 10-6 Mol = a a= 2,58 ⋅ 10-3g fi 2,58 mg/gLactatgehalt 18 Muskelbiochemie • Prozentualer Anteil der chemischen Energie über gebildetes Lactat _ Lactat = aAM – aRM fi 28,99mmol –8,201mmol = 20,789 mmol/g 1 Mol Lactat = 28,5 kcal 20,789 * 10 –6 Mol= b cal fi 20,789 * 10 –6Mol * 28,5kcal = 0,592 cal (Echem.) Wpro g= 0,057cal = 0,052 cal/g 1,0963 g Nun kann der Wirkungsgrad h bestimmt werden: h= W E chem. fi h= 0,052cal = 0,088 0,592cal In Prozent ausgedrückt: 0,088 * 100% = 8,8% • Berechnung der Arbeitsaktivität bezogen auf die ATP Spaltung bei anaerobem Abbau Bei der Bildung von 1 Mol Lactat entsteht 1 Mol ATP, d.h. 1 Mol Lactat = 1 Mol ATP _ Lactat = d Mol ATP fi 20,789 * 10-6 Mol = d Es werden 2,079 * 10-5 Mol ATP benötigt. Da ein Mol ATP 7 kcal an chemischer Energie besitzt, ergibt sich für 20,789 * 10-6 Mol ATP ein Wert von 0,145 cal. Auch hier lässt sich der Wirkungsgrad über die Formel h= Es ergibt sich W E chem. h= 19 bestimmen. 0,057cal = 0,393 0,145cal Muskelbiochemie Der Wirkungsgrad, oder anders ausgedrückt, die Effektivität der ATP Spaltung zu geleisteter Arbeit, liegt in Prozent ausgedrückt bei 39,3 %. 2.Berechnung der Glykogen Konzentration Extinktion bei 650 Ruhemuskel Arbeitsmuskel Standard nm 1.Wert 0,347 0,179 0,131 2.Wert 0,393 0,14 Mittelwert 0,37 0,1559 Tab.3: Daten zur Glycogenbestimmung • Konzentrationsbestimmung Für die Glykogenbestimmung benötigt man die Formel c= E nach e aufgelöst e S tan dard ⋅ d e S tan dard = Extinktion der Standardprobe: 0,131 (EStandard) cStandard: 25mg/ml=0,025 mg/ml Schichtdicke: 1cm e S tan dard = 0,131 = 5,24cm2/mg 0,025mg / ml ⋅ 1cm c RM = 0,37 = 0,071mg / ml 5,24cm 2 /mg ⋅ 1cm c AM = 0,1559 = 0,0298mg / ml 5,24cm 2 /mg ⋅ 1cm • Berechnung des Verdünnungsfaktors Wir benötigen wieder die Formel: Verdünnungsfaktor = V ges VPr obe 20 E c⋅d Muskelbiochemie • 2ml HclO4 + 4 ml HClO4 = 6ml fi *6 • 1ml auf 100ml aufgefüllt = 100:1ml fi *50 = 300 Verdünnungsfaktor = 300 cRM=0,071 mg/ml * 300 = 21,3 mg/ml (gesamter Muskel) cAM=0,0298 mg/ml * 300 = 8,94 mg/ml (gesamter Muskel) • tatsächliche Glycogenkonzentration pro g: beim Ruhemuskel: 1,352 g = 21,3 mg 1g = f mg fi fRM= 15,75 mg/g beim Arbeitsmuskel: 1,0963 g = 8,94 mg 1g = f mg fi fAM=8,15 mg/g • Verbrauch von Glykogen fRM – fAM = _ Glykogen fi 15,75mg/g – 8,15 mg/g = 7,6 mg/g Berechnung der molaren Verhältnisse: 1 Mol Glucose = 180 g h =DGlucose=7,6*10-3 g fi 4,22 10-5 Mol Glucose • Verhältniss D Lactat : D Glucose D Lactat= 20,789 mmol/g D Glucose= 42,22 mmol/g D Lactat : D Glucose= 1:2 21 Muskelbiochemie 4. Diskussion Bei der Reizung mit 0,5 V lag die durchschnittliche Peakhöhe bei ca. 11 mV. Leichte Schwankungen der Peakhöhe im mittleren Bereich der 0,5 V-Reizungen lassen sich eventuell durch herabtropfende Ringerlösung, die zu einer Erhöhung des Gewichts geführt haben, erklären. Nach 102 Peaks ist ein Abfall der Peakhöhe erkennbar, bis nach 146 Peaks nur noch eine Höhe von etwa 5 mV erreicht wird. Die Reizstärke wird nun auf 1,5 V erhöht. Worauf die Peaks deutlich höher werden und auf 38 mV ansteigen und diese Höhe praktisch konstant über 329 Peaks beibehalten, was im Kurvenverlauf als Plateauphase sichtbar wird. Anschließend beginnt ein Abfall über 137 Peaks auf 13 mV. Die Reizstärke wird jetzt auf 5 V erhöht, was einen sprunghaften Anstieg der Peakhöhe auf 31 mV zur Folge hat. Die Peakhöhe nimmt über 122 Peaks kontinuierlich bis auf 10 mV ab, hier ist kein Plateau mehr erkennbar. Nun erhöhen wir die Reizstärke zum letzten Mal auf 10 V. Die Peakhöhe steigt sofort auf 25 mV an und fällt über 93 Peaks nahezu kontinuierlich auf 11 mV ab. Hier kommt es zu einem Ausreißersprung auf 25 mV, den wir uns nicht erklären können. Nach diesem Sprung sinkt die Peakhöhe über 77 Peaks auf 7 mV ab. An diesem Punkt beenden wir die Messung. Der Muskel wird nicht mit Sauerstoff versorgt, es erhält seine Energie also über anaerobe Milchsäuregärung. Da am Ende des Arbeitsversuchs noch Glycogen im Muskel vorhanden war kann man davon ausgehen, dass die Verringerung der durch den Muskel erzeugten Kraft nicht eine Folge mangelnden Energievorrats ist, sondern auf zunehmende Übersäuerung zurückzuführen ist. Die von uns ermittelte mechanische Arbeit die der Froschmuskel leistet liegt mit 0,24J im angegebenen durchschnittlichen Bereich von 0,1-1J. Unser Arbeitsmuskel enthält mit 2,58 mg/g über 3,5mal mehr Lactat als der Ruhemuskel mit 0,73 mg/g. Im Gegensatz dazu enthält der Ruhemuskel (15,75 mg/g) knapp doppelt so viel Glycogen (8,15 mg/g). Dies ist dadurch zu erklären, dass im anaeroben Stoffwechsel die vorliegende Energiereserve, das Glycogen, durch Glykolyse und Milchsäuregärung zu Lactat umgesetzt wird. Das von uns ermittelte Verhältnis von D Lactat: D Glucose liegt bei 1:2, sollte aber genau umgekehrt, nämlich 2:1 sein. Woran dies liegt können wir uns nicht erklären. 22 Muskelbiochemie 5. Quellenangaben - Wehner/Gehring, Zoologie; 23.Auflage 1995, Thieme Verlag Campbell, Biologie; 2.korrigierter Nachdruck 2000, Spektrum Akademischer Verlag Schmidt/Thews, Physiologie des Menschen; 26.Auflage 1993, Springer Verlag Klinke/Silbernagl, Lehrbuch der Physiologie; 2.Auflage 2000, Thieme Verlag Scherf, Wörterbuch Biologie; 1997, dtv Vogel/Angermann, Taschenatlas der Biologie, Band 2; 1990, Thieme Verlag Eckert: Tierphysiologie, 2. Auflage, 1993, Thieme Verlag 23
