Fragen zur Vorlesung „Hefegenetik“

Fragen zur Vorlesung „Hefegenetik“ (Sommersemester 2008)
Prof. G. Rödel/Dr. K. Ostermann
y Erklären Sie den Unterschied zwischen homo- und heterothallischen
Stämmen! Skizzieren Sie die jeweiligen Lebenszyklen!
y Korrelieren Sie die Morphologie von Saccharomyces cerevisiae Zellen
mit der jeweiligen Zellzyklusphase!
y Wie lässt sich das Alter einer Hefezelle grob abschätzen?
y Skizzieren Sie den Lebenszyklus von Schizosaccharomyces pombe!
Erläutern Sie den Unterschied zwischen zygotischen und azygotischen
Asci!
y Im Rahmen der Sequenzierung des Hefegenoms wurde eine systematische
Kennzeichnung aller Leserahmen durchgeführt. Erläutern Sie die
Bedeutung der Abkürzungen am Beispiel des Leserahmens YDL32w!
y Wie groß ist das Genom von S. cerevisiae? Aus wie vielen Chromosomen
setzt es sich zusammen? Für wie viele Gene codiert es etwa?
Vergleichen Sie die Anzahl der Gene mit jener bei E. coli, Drosophila
melanogaster, Arabidopsis thaliana und beim Menschen (geschätzt)!
y Welche repetitiven Sequenzen finden sich im Genom von S. cerevisiae?
y Wie viele Ursprungsorte der Replikation (ARS) finden sich im S.
cerevisiae Genom?
y Woran erkennt man einen Transmembranbereich eines Proteins? Wie hoch
ist der prozentuale Anteil des Hefeproteoms an Proteinen mit
Transmembranbereichen?
y Was sind „orphan families“ und „single orphan“-Gene?
y Nennen Sie die wichtigsten Unterschiede zwischen den Genomen von S.
pombe und S. cerevisiae!
y Wie groß ist die evolutionäre Distanz zwischen S. cerevisiae und S.
pombe?
y Erläutern sie „homologe“ und „heterologe Komplementation“!
y Was versteht man unter einem „Hefe-Integrationsvektor“ (Yeast
Integrating plasmid, YIp)? Aus welchen Modulen setzt er sich zusammen?
y Beschreiben Sie Aufbau eines ARS-Vektors! Welche Funktion besitzen
ARS-Sequenzen? Vergleichen Sie die ARS-Sequenzen von S. cerevisiae und
S. pombe!
y Beschreiben Sie die Struktur des 2µ-Plasmids! Welche Elemente des 2µPlasmids werden bei der Konstruktion von 2µ-Vektoren verwendet?
y Nennen Sie die Module eines ARS-CEN-Vektors und erläutern Sie Vorbzw. Nachteile gegenüber ARS-Vektoren!
y Welche Funktion besitzt ein Centromer? Wie sind die Centromere von S.
cerevisiae aufgebaut? Vergleichen Sie die Größe der Centromere von S.
cerevisiae und Mensch!
y Nennen Sie die Module eines künstlichen Hefechromosoms (YAC)!
y Welche Vorteile bieten YACs gegenüber ARS-CEN-Vektoren?
y Skizzieren Sie die Anlage einer Genbank unter Verwendung eines YACs!
Kommentieren Sie die Stabilität einer YAC-basierten Genbank!
y Beschreiben Sie das Problem der Replikation linearer DNAs und wie die
Telomerase dieses Problem löst! Wie ist eine Telomerase aufgebaut? In
welchen Zellen finden sich Telomerasen?
y Beschreiben Sie die Struktur eines Telomers bei S. cerevisiae!
(Skizze)
y Welche Histon-Modifikationen sind Ihnen bekannt? Warum finden sich
diese durchwegs im N-terminalen Bereich der Histone? Welche
Konsequenzen haben diese Modifikationen für die Genexpression? Welche
Modifikation von Histon H4 spielt für die Ausbildung von
Heterochromatin eine entscheidende Rolle?
y Skizzieren Sie die Integration eines zirkulären Plasmides in das
Hefegenom! Wo erfolgt die Integration in das Genom? Wie lässt sich die
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Effizienz der Integration steigern? Wie können Sie molekularbiologisch
die erfolgreiche Integration am gewünschten Locus nachweisen?
Skizzieren Sie die Folgen der Integration eines Mutantenallels mit
deletiertem 5’- und 3’-Genbereich in ein Wildtyp Genom!
Skizzieren Sie die Erzeugung einer Gendeletion durch „1-step gene
replacement“! Wodurch unterscheidet sich eine Gendeletion von einer
Gendisruption?
Beschreiben Sie den Einsatz von 5-FOA zur Selektion Uracil-auxotropher
Hefen am Beispiel eines „2-step gene replacement“!
Wie lässt sich bei S. cerevisiae ein essenzielles Gen nachweisen?
Erläutern Sie den Begriff „synthetic lethality“! Welche Aussage lässt
sich bei Vorliegen synthetischer Letalität bezüglich der betroffenen
Genprodukte treffen?
Beschreiben Sie den (gleichzeitigen) Einsatz von HSV-tk
(Thymidinkinase-Gen von Herpes simplex) und des neo-Gens
(Neomycinresistenz-Gen) als Selektionsmarker bei höheren Eukaryonten!
Beschreiben Sie das Cre/loxP-Rekombinationssystem und seinen Einsatz
zur gewebespezifischen Deletion eines Targetgens!
Beschreiben Sie das Prinzip einer cDNA-Microarray-Analyse! Vergleichen
Sie diese Methode mit der Northernblot-Hybridisierung!
Nennen Sie einige wichtige eukaryontischen Reportergene! Welche
Voraussetzungen muss ein Reportergen erfüllen?
Wodurch unterscheidet sich eine transkriptionelle von einer
translationalen Genfusion?
Nennen Sie die für die Transkription in eukaryotischen Zellen
zuständigen Enzyme! Für welche Aufgaben sind sie zuständig?
Beschreiben Sie die Grundelemente eukaryotischer PolII-Promotoren!
Welche besonderen DNA-Elemente finden sich in den Promotoren einiger
konstitutiv exprimierter Gene bei S. cerevisiae? Welche Funktion haben
diese DNA-Elemente?
Beschreiben Sie in Grundzügen, wie die Transkriptionsinitiation durch
die RNA-Polymerase II erfolgt! Welche Rolle spielt das TATA-BoxBindeprotein (TBP)?
Welche besondere Struktur weist der C-terminale Bereich der RNAPolymerase II von eukaryotischen Zellen auf? Welche Funktion hat
dieser Bereich?
Beschreiben Sie eine Methode zur Bestimmung von 5’-Enden von mRNAs!
Was versteht man unter Enhancer-Sequenzen? Wo können sie positioniert
sein?
Beschreiben Sie die wichtigsten Funktionen von transkriptionellen
Aktivatorproteinen bei der Transkriptionsinitiation!
Welche Rolle spielen Histon-Acetylasen für die Genexpression?
Nennen Sie die Schlüsselenzyme des Galactosemetabolismus bei S.
cerevisiae!
Welche cis-wirksamen DNA-Elemente spielen bei der Regulation der
Transkription eine Rolle? Welche Proteine agieren als positiver bzw.
negativer Regulator?
Wie lässt sich der modulartige Aufbau des Transkriptionsaktivators
Gal4p aus einem DNA-Bindebereich und einem aktivierenden Bereich
experimentell belegen? Wodurch zeichnet sich die aktivierende Domäne
von Gal4p aus? Wie wirkt sie?
Beschreiben Sie die Rolle von Gal80p und Gal3p bei der Regulation des
Galaktosemetabolismus!
Was versteht man unter „domain-swapping“-Experimenten? Welche Aussagen
erlauben sie?
Erläutern Sie das Prinzip des GAL4 Two-Hybridsystems! Wozu wird es
eingesetzt? Welche Limitierungen gibt es?
Wodurch ist das sog. „reverse Two-Hybrid-System“ gekennzeichnet?
Beschreiben Sie das „split-ubiquitin“-System zum Nachweis der
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Interaktion hydrophober Membranproteine!
y Beschreiben Sie das Prinzip des 1-Hybrid-Systems! Wozu wird es
genutzt?
Erläutern Sie das 3-Hybrid-System? Welche Fragestellungen lassen sich
damit beantworten?
y Nennen Sie die wichtigsten strukturellen Eigenschaften von
„Zinkfingerproteinen“!
Welche unterschiedlichen Typen von Zinkfingern sind Ihnen bekannt?
Nennen Sie ein Beispiel für ein Zinkfingerprotein!
y Erläutern Sie, wie Helix-Turn-Helix-Proteine ihre Zielsequenzen auf
der DNA erkennen!
y Beschreiben Sie die Charakteristika von Leucin-Zipper-Proteinen!
Welche Rolle spielt das sog. Coiled coil-Motiv? Nennen Sie ein
Beispiel für ein Leucin-Zipper-Protein!
y Erläutern Sie die Bedeutung der Wechselwirkung zwischen A- und B-ZipProteinen!
y Beschreiben Sie, wie die Interaktion von Interleukin 1 (IL-1) mit dem
IL-1-Rezeptor zur Translokation des Transkriptionsaktivators NFκB in
den Zellkern führt!
y Erläutern Sie die sauerstoffabhängige Aktivierung von Zielgenen durch
den Transkriptionsaktivator Hap1p bei S. cerevisiae! Aus welchen
Domänen ist Hap1p aufgebaut?
y Beschreiben Sie den Prozess der Translationsinitiation bei Eukaryonten
und vergleichen ihn mit jenem bei Prokaryonten! Wie beeinflusst der
poly(A)-Schwanz die Translationseffizienz? Welchen Einfluss kann der
5´-Leader einer mRNA auf die Translationseffizienz haben?
y Was versteht man unter einem „uORF“? Beschreiben Sie verschiedene
Möglichkeiten, die inhibitorische Wirkung von uORFs bei der
Translation zu umgehen!
y Was versteht man unter dem Begriff „leaky scanning“? Wie kommt es
zustande?
y Welche Funktion besitzt der Transkriptionsaktivator Gcn4p? Warum
spricht man von „general control“? Beschreiben Sie die translationale
Regulation der GCN4-Expression! Beschreiben Sie Struktur und Rolle des
5’-seitigen Leaderbereiches der GCN4-mRNA!
y Was versteht man unter „IRES“? Welchen Vorteil bietet eine IRES im
Kontext bicistronischer mRNAs?
y Bei der translationalen Regulation in eukaryontischen Zellen spielt
der Initiationsfaktor eIF2 eine zentrale Rolle. Welche Aufgabe besitzt
dieser Faktor? Wie kann er inhibiert werden? Welche Rolle spielt er im
Rahmen der translationalen Regulation bei (i) der GCN4-Expression (ii)
Häm-Mangel in Reticulozyten (iii) Virusinfektionen eukaryotischer
Zellen (iv) der „unfolded protein response“? Beschreiben Sie, wie die
jeweilige Rahmenbedingung zur Inaktivierung von eIF2 führt!
y Beschreiben Sie das Prinzip eines Pulse-Chase Experiments!
y Wie lässt sich die Halbwertszeit eines Proteins bzw. einer mRNA
ermitteln?
y Wie verläuft der mRNA-Abbau bei S. cerevisiae? Welcher Schritt ist
geschwindigkeitsbestimmend?
y Welche Rolle spielt der PolyA-Schwanz für die Stabilität einer mRNA?
y Beschreiben Sie den Eisenmetabolismus und die Rolle von Transferrin,
Transferrin-Rezeptor und Ferritin beim zellulären Eisenstoffwechsel
bei höheren Eukaryoten!
y Beschreiben Sie die Struktur von Ferritin!
y Was versteht man unter dem „iron responsive element“ (IRE)? In welchen
mRNAs und an welcher Position findet es sich? Welche Konsequenz hat
die Bindung von IRE durch das IRE-Bindeprotein für die jeweilige mRNA?
Welches Protein agiert als IRE-Bindeprotein?
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y Schildern Sie, wie es zum bevorzugten Abbau von mRNAs kommt, die (i)
innerhalb des Leserasters ein Nonsense Codon tragen („nonsense
mediated mRNA decay“), (ii) kein Stopcodon besitzen (non-stop mediated
mRNA decay“)!
y Begründen Sie die Notwendigkeit von Proteinabbau in lebenden Zellen!
Wo findet der intrazelluläre Abbau von Proteinen statt?
y Wie wird Ubiquitin in eukaryotischen Zellen codiert?
y Welche Rolle spielt Ubiquitin für den Abbau und für das Trafficking
von Proteinen in Eukaryonten? Welche Aminosäure dient als
Akzeptorstelle für Ubiquitin im Zielprotein?
y Beschreiben Sie die Aktivierung und Übertragung von Ubiquitin auf
Subtratproteine! Nennen Sie die beteiligten Enzyme! Welche Aminosäure
von Ubiquitin wird bevorzugt für den Aufbau von Multi-Ubiquitin-Ketten
verwendet?
y Beschreiben Sie den experimentellen Ansatz, mit dem die Bedeutung Nterminaler Aminosäuren auf die Halbwertszeit von Proteinen in Hefe
ermittelt wurde!
y Was besagt die „N-end-rule“? Was sind „sekundär“ und „tertiär“
destabilisierende Aminosäuren?
y Beschreiben Sie den Aufbau eines 26S-Proteasoms von Eukaryonten!
Nennen Sie die Bestandteile und die Funktion des 20S-Zylinders und der
19S-Kappen!
y Beschreiben Sie, wie es zum Auftreten des sog. unfolded protein
response (UPR) kommen kann! Schildern Sie, wie es dabei zu einer
Aktivierung des UPR-Genaktivators Hac1p kommt!
y Wie erfolgt die Qualitätskontrolle auf korrekte Proteinfaltung im ER?
y Wie werden Proteine des ER abgebaut(ER-assoziierte Degradation von
Proteinen, ERAD)?
y Was versteht man unter einem molekularen Chaperon? Welche Aufgabe
besitzen Chaperons? Warum zählen viele Chaperons zur Klasse der
Heatshock-Proteine (Hsp)?
y Nennen Sie die wichtigsten Chaperon-Klassen!
y In welchen Zellkompartimenten einer eukaryontischen Zelle finden sich
Hsp70 Proteine?
y Warum wirkt sich die Deletion einzelner Hsp70-Gene im Regelfall nicht
letal für die Zelle aus?
y Beschreiben Sie die Struktur und Funktion von Hsp60! Zu welchen
bakteriellen Proteinen ist Hsp60 homolog?
y Welche Bedeutung besitzen Chaperons für den Import von Proteinen in
die Mitochondrien?
y In welchen zellulären Kompartimenten einer eukaryontischen Zelle
finden sich Proteine, die in den sekretorischen Pathway eintreten?
Nennen Sie ein Beispiel eines Hefeproteins, das aus der Zelle ins
Medium sezerniert wird!
y Beschreiben Sie Lokalisierung, Aufbau und Funktion von sekretorischen
Signalpeptiden!
y Beschreiben Sie Aufbau und Funktion des eukaryontischen signal
recognition particle (SRP)!
y Beschreiben Sie die Sekretion des α-Faktors! Skizzieren Sie die
Struktur des Vorläuferproteins (Präpro-α-Faktor)!
X Dr. Ostermann
y Welcher Genort legt den individuellen Paarungstyp (PT) einer S.
cerevisiae Zelle fest?
y Beschreiben Sie die PT-spezifische Regulation der Transkription!
y Schildern Sie, wie es zur Paarung von Hefezellen unterschiedlichen PT
kommt!
y Beschreiben Sie, welche Rolle die Bindung eines Pheromons bei S.
cerevisiae bei der Paarung spielt. Wo sind die beteiligten Komponenten
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in der Zelle lokalisiert?
y Was versteht man unter Homothallie?
y Beschreiben Sie den Ablauf eines PT-Wechsels bei homothallischen
Stämmen von S. pombe!
y Nennen Sie die grundlegenden Unterschiede der PT-Systeme von S.
cerevisiae und S. pombe!
y Beschreiben Sie eine Strategie zu Isolierung von Genen, die an der
DNA-Reparatur beteiligt ist!
y Wie können Sie erkennen, ob der Phänotyp einer Mutante auf einer oder
auf mehreren Mutationen beruht?
y Wie testen Sie, ob zwei Mutationen im gleichen Gen oder in zwei
verschiedenen Genen lokalisiert sind?
y Welche drei Tetradentypen kommen bei einer Zwei-Faktor Kreuzung vor?
y Wie können Sie Doppelmutanten von Einzelmutanten gleichen Phänotyps
mit Hilfe der Tetradenanalyse identifizieren?
y Was versteht man unter den Begriffen "kumulativer Effekt" und
"epistatische Gruppen"?
y Nennen Sie zwei Hauptgruppen der DNA-Reparatur in S. pombe! Sind die
Gene der DNA-Reparatur evolutionär konserviert?
y Wie erfolgt die Erkennung und Reparatur von UV-Schäden der DNA während
der NER (nucleotide excision repair)?
y Nennen Sie verschiedene Möglichkeiten der Reparatur von Doppelstrangbrüchen (DSB) bei S. pombe (keine Details)! Welche Art der Reparatur
führt zum Verlust genetischen Materials?
y Was versteht man unter "Checkpoint-Kontrollen"? Welchen Zweck erfüllen
sie? Woran erkennt man Mutanten der "Checkpoint-Kontrolle"?
y Das cdc2p (S. pombe, Mensch) bzw. Cdc28p Protein (S. cerevisiae) gilt
als zentraler Regulator des Zellzyklus. Wie wird seine Spezifität
geregelt?
y Welche Rolle spielen Cdc25p und Wee1p im Zellzyklus von S. pombe?
Welchen Phänotyp weisen cdc25 und wee1 Mutanten auf?
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