Bestimmung von Autoantikörpern gegen Schilddrüsenhormone im
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Tierärztliche Hochschule Hannover Zentrum für Lebensmittelwissenschaften Institut für Lebensmitteltoxikologie und Chemische Analytik -Chemische Analytik und Endokrinologie- Bestimmung von Autoantikörpern gegen Schilddrüsenhormone im Serum von Hunden und deren Einfluss auf die Schilddrüsendiagnostik INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae(Dr. med. vet.) Vorgelegt von Marion Piechotta (Hattingen) Hannover 2007 Tierärztliche Hochschule Hannover Zentrum für Lebensmittelwissenschaften Institut für Lebensmitteltoxikologie und Chemische Analytik -Chemische Analytik und Endokrinologie- Bestimmung von Autoantikörpern gegen Schilddrüsenhormone im Serum von Hunden und deren Einfluss auf die Schilddrüsendiagnostik INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae(Dr. med. vet.) Vorgelegt von Marion Piechotta (Hattingen) Hannover 2007 Wissenschaftliche Betreuung: Universitäts- Professor Dr. Hans-Otto Hoppen 1. Gutachter: Professor Dr. Hans-Otto Hoppen 2. Gutachter: Professor Dr. Reinhard Mischke Tag der mündlichen Prüfung: 20.11.2007 Für Kirsten I Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis .........................................................................................................I Abbildungsverzeichnis ............................................................................................... IV Tabellenverzeichnis.................................................................................................... V Abkürzungsverzeichnis............................................................................................. VII 1 Einleitung ..............................................................................................................1 2 Literatur.................................................................................................................3 2.1 Canine Hypothyreose...................................................................................3 2.1.1 Vorkommen und Prävalenz der caninen Hypothyreose....................3 2.1.2 Ätiologie ............................................................................................5 2.1.3 Klinik ...............................................................................................8 2.1.4 Diagnostik .......................................................................................10 2.2 Autoimmunthyreoiditis (Lymphozytäre Thyreoiditis) ...................................12 2.3 Autoantikörper der autoimmunen Thyreoiditis ............................................16 2.3.1 Einführung ......................................................................................16 2.3.2 Thyreoglobulin Autoantikörper ........................................................17 2.3.3 Thyroxin-Peroxidase Autoantikörper...............................................27 2.4 Immunoassays ...........................................................................................29 3 2.4.1 Einführung ......................................................................................29 2.4.2 Interferenzen in Immunoassays......................................................30 2.4.3 Einfluss von THAA auf die TT4- und T3-Konzentrationsbestimmung im Serum ........................................................................................31 Material und Methoden .......................................................................................33 3.1 Material.......................................................................................................33 3.1.1 Patienten.........................................................................................33 3.2 Methoden ...................................................................................................38 3.2.1 Endokrinologische Untersuchungen ...............................................38 3.2.2 TT4-und TT3-Radioimmunoassay....................................................40 II 3.2.3 Bestimmung der TT4-Konzentration durch High-performance-liquid-Chromatographie.....................................42 3.3 Autoantikörper-Bestimmung .......................................................................43 3.3.1 Radiometrischer Test zum Nachweis von T3AA und T4AA ............43 3.4 Statistische Methoden ................................................................................46 4 Ergebnisse..........................................................................................................47 4.1 Validierung des radiometrischen Autoantikörpertests ................................47 4.2 Prävalenz der Autoantikörper gegen Schilddrüsenhormone (THAA) .........50 4.2.1 Ergebnisse der THAA-Bestimmung bei Hunden mit einem klinischen Verdacht auf eine Hypothyreose.....................................................50 4.2.2 TT4- und TSH-Konzentrationen THAA-positiver Hunde ..................55 4.2.3 TRH-Teste bei T3AA-positiven Hunden..........................................57 4.2.4 THAA-Prävalenz bei Hunden mit primärer Hypothyreose, die bereits mit L-Thyroxin substituiert wurden ..................................................58 4.2.5 Folgemessungen bei THAA-positiven Hunden (zum Teil unter Substitutionstherapie) .....................................................................59 4.2.6 THAA Prävalenz bei gesunden Hunden (Gruppe 6) .......................60 4.3 Zusammenhang zwischen dem Auftreten von THAA und der TT4- bzw. T3-Konzentration........................................................................................61 4.3.1 T4AA-positive Hunde ......................................................................61 4.3.2 Bestimmung der TT4-Konzentration durch einen CIA und RIA bei autoantikörperpositiven Serumproben ............................................62 4.3.3 Bestimmung der TT4-Konzentration durch einen CIA und RIA bei autoantikörpernegativen Serumproben...........................................64 4.3.4 TT4-Bestimmung zusätzlicher T4AA-positiver Proben mit dem CIA65 4.3.5 TT3-Messungen autoantikörperpositiver und -negativer Tiere ........67 4.4 Vergleichsmessungen mit HPLC................................................................68 5 Diskussion ..........................................................................................................69 5.1 THAA im Serum von Hunden mit klinischem Verdacht auf eine Hypothyreose ............................................................................................69 5.1.1 THAA bei bereits substituierten Hunden .........................................76 5.1.2 Nachweis von THAA bei klinisch gesunden Hunden ......................77 5.2 Vergleichsmessungen mit autoantikörperpositiven Serumproben..............78 5.3 Ausblick ......................................................................................................81 III 6 Zusammenfassung .............................................................................................82 7 Summary ............................................................................................................84 8 Literaturverzeichnis.............................................................................................86 9 Tabellenanhang ................................................................................................102 IV Abbildungsverzeichnis Abbildung 1. Darstellung der TT4-Konzentrationen von T3AA- und T4AA-positiven hypothyreoten, fraglich hypothyreoten und euthyreoten Hunden 55 Abbildung 2. Darstellung der TSH-Konzentrationen bei autoantikörperpositiven Hunden in den Gruppe 1 – 4 56 Abbildung 3. Verlaufskontrolle des Serumspiegels an Autoantikörpern gegen Trijodthyronin (T3AA) in %-Bindung (%-Bdg.)bei einer Rhodesian Ridgeback Hündin über 9 Monate Substitutionstherapie mit L-Thyroxin und TT4-Konzentrationen 4 – 6 Stunden nach Tabletteneingabe 59 Abbildung 4. Lineare Regressionsbeziehung zwischen der mit einem Chemilumineszenzimmunoassay (CIA) und einem Radioimmunoassay ( RIA) gemessenen TT4-Konzentration bei 16 autoantikörperpositiven Hunden und das errechnete Bestimmtheitsmaß (R2) 63 Abbildung 5. Lineare Regressionsbeziehung zwischen der mit einem Chemilumineszenzimmunoassay (CIA) und einem Radioimmunoassay (RIA) gemessenen TT4-Konzentration bei 31 klinisch gesunden, autoantikörpernegativen Hunden und das errechnete Bestimmtheitsmaß (R2) 64 Abbildung 6. Lineare Regressionsbeziehung zwischen der mit einem Chemilumineszenzimmunoassay (CIA) und einem Radioimmunoassay (RIA*-Daten der Arbeitsgruppe von Prof. Nachreiner) gemessenen 66 TT4-Konzentration in zehn T4AA-positiven Serumproben Abbildung 7. T3-Konzentrationen 16 T3AA-positiver und 31 T3AA-negativer Hunde (T3AA = Autoantikörper gegen T3) 67 V Tabellenverzeichnis Tabelle 1. Ermittelter Prozentsatz TgAA-positiver Hunde unter hypothyreoten und gesunden Hunden aus verschienden Studien zwischen 1980 und 2006 19 Tabelle 2. Ermittelter prozentualer Anteil an T3AA- und T4AA-positiven Hunden aus verschiendenen Studien zwischen 1985 und 2003, und die entsprechenden Auswahlkriterien für die Autoantikörperbestimmung 24 Tabelle 3. Verteilung von klinisch hypothyreoten Hunden auf Grundlage der TT4und TSH-Konzentration in die Gruppen: „hypothyreot“, „fraglich hypothyreot (erhöhte TSH-Konz.)“, „fraglich hypothyreot (erniedrigte TT4-Konz.)“ und „euthyreot“ 33 Tabelle 4. Herstellerangaben des Chemilumineszenzimmunoassays und Radioimmunoassays zu Nachweisgrenzen und Intra- bzw. InterassayVariationskoeffizienten der Bestimmung von T4, T3 und caninem TSH 41 Tabelle 5. %-Bindung (%-Bdg.) einer T3AA- und einer T4AA-positiven Serumprobe zur Ermittlung der Intraassaypräzision des radiometrischen Autoantikörpertestes und errechnete Mittelwerte, Standardabweichungen und Variationskoeffizienten 47 %-Bindung einer T3AA-positiven und -negativen, sowie einer T4AA-positiven und -negativen Kontrolle an 20 aufeinanderfolgenden Tagen zur Ermittlung der Interassaypräzision des radiometrischen Autoantikörpertestes, sowie errechnete Mittelwerte, Standardabweichungen und Variationskoeffizienten 49 Tabelle 6. Tabelle 7. Anzahl [und Prozentsatz] T3AA- und T4AA-positiver klinisch hypothyreoseverdächtiger Hunde, die anhand der ermittelten TT4- und TSH-Konzentrationen in die Gruppen „hypothyreot“, „fraglich hypothyreot mit erhöhter TSH-Konz.“, „fraglich hypothyreot mit erniedrigter TT4-Konz.“ und „euthyreot“ eingeteilt wurden 50 Tabelle 8. Rasse, Serumspiegel an Autoantikörpern gegen Trijodthyronin (T3AA) und Thyroxin (T4AA) in %-Bindung (%-Bdg.) und Geschlecht hypothyreoter Hunde (Gruppe 1) 51 Tabelle 9. Rasse, Serumspiegel an Autoantikörpern gegen Trijodthyronin (T3AA) und Thyroxin (T4AA) in %-Bindung (%-Bdg.), sowie Geschlecht fraglich hypothyreoter Hunden mit erniedrigter TT4-Konzentration (Gruppe 3) 53 VI Tabelle 10. Rasse, Serumspiegel an Autoantikörpern gegen Trijodthyronin (T3AA) in %-Bindung (%-Bdg.) und Geschlecht euthyreoter Hunde (Gruppe 4) 54 Tabelle 11. Basale TT4- und TSH-Konzentration (0 Minuten) sowie TSH-Konzentration 20 Minuten nach Injektion von TRH (im Rahmen eines TRH-Testes zur Abklärung einer Hypothyreose) und TT4-Konzentration 120 Minuten und 180 Minuten nach TRH-Gabe bei T3AA-positiven Hunden 57 Tabelle 12. Rasse, Serumspiegel an Autoantikörpern gegen Trijodthyronin (T3AA) in %-Bindung (%-Bdg.), Geschlecht und TT4- sowie TSH-Konzentrationen acht T3AA-positiver Hunde, die bereits sechs Wochen mit L-Thyroxin substituiert wurden (Gruppe 5) 58 Tabelle 13. Rasse, Geschlecht, Alter und Serumspiegel an Autoantikörpern gegen Thyroxin (T4AA) in %-Bindung (%-Bdg.), sowie TT4- und TSH-Konzentrationen von fünf T4AA-positiven Hunden 61 Tabelle 14. Mittels Chemilumineszenzimmunoassay und Radioimmunoassay ermittelte TT4-Konzentrationen sowie die TSH-Konzentrationen 16 T3AA- bzw. T4AA-positiver Hunde 62 TT4-Konzentrationen zehn T4AA-positiver Serumproben, die mittels Chemilumineszenzimmunoassay und Radioimmunoassay ermittelt wurden 65 TT4-Konzentrationen fünf klinisch gesunder T4AA-negativer und zwei T4AA-positiver Hunde, die mittels High-performance-liquid chromatografie (HPLC) und einem Chemilumineszenzimmunoassay (CIA) bestimmt wurden 68 Tabelle 17. Rassenverteilung der hypothyreoten Hunde (Gruppe 1) 102 Tabelle 18. Rassenverteilung der fraglich hypothyreoten Hunde mit erhöhter TSH-Konzentration (Gruppe 2) 103 Rassenverteilung der fraglich hypothyreoten Hunde mit erniedrigter TT4-Konzentration (Gruppe 3) 103 Tabelle 20. Rassenverteilung der euthyreoten Hunde (Gruppe 4) 105 Tabelle 21. Rassenverteilung der bereits mit L-Thyroxin vorbehandelten Hunde (Gruppe 5) 106 Tabelle 15. Tabelle 16. Tabelle 19. VII Abkürzungsverzeichnis AG AIT AK ANS Bdg. CIA EDTA EIA ELISA HPLC i.v. Konz. m MHC NaCl NK-Zellen Nr. RIA rT3 T3 T3AA T4 T4AA TFA TgAA THAA TPO TPOAA TRH TSH TT3 TT4 VK WHWT Antigen Autoimmunthyreoiditis Antikörper Anilinio-Naphthalensulfonsäure Bindung im Autoantikörpertest Chemilumineszenzimmunoassay Ethylendiamintetraacetat Enzymimmunoassay Enzyme-linked Immunosorbent Assay High-performance-liquid chromatographie intravenös Konzentration Mittelwert major histocompatibility complex Natriumchlorid natürliche Killerzellen Nummer Radioimmunoassay reverses Trijodthyronin Trijodthyronin Trijodthyronin-Autoantikörper Thyroxin Thyroxin-Autoantikörper Trifluoressigsäure Thyreoglobulin-Autoantikörper Schilddrüsenhormon-Autoantikörper schilddrüsenspezifische-Peroxidase (Thyroid-Peroxidase) Thyroxinperoxidase-Autoantikörper Thyreotropin Releasing Hormone Thyroidea stimulierendes Hormon Total-T3, Gesamttrijodthyroninkonzentration Total-T4, Gesamtthyroxinkonzentration Variationskoeffizient West Highland White Terrier Einleitung 1 1 Einleitung Die canine Hypothyreose zählt, neben dem Hyperadrenocortizismus und dem Diabetes mellitus, zu den häufigsten Endokrinopathien des Hundes. Bei ungefähr der Hälfte der adulten Hunde wird die Hypothyreose durch eine Autoimmunthyreoiditis (AIT) verursacht (Feldman und Nelson 2004). Durch eine lymphozytäre Entzündung kommt es zu einer progressiven Zerstörung des Schilddrüsengewebes (Gosselin et al. 1981a). Ein bekanntes Autoantigen der AIT beim Hund ist das Thyreoglobulin, welches das Speicherprotein für die Schilddrüsenhormone Thyroxin (T4) und Triiodthyronin (T3) ist. Die Autoantikörper gegen Thyreoglobulin (TgAA) binden zum Teil auch T4 und T3 (Pearce et al. 1981). In der Literatur ist beschrieben, dass Autoantikörper gegen T4 (T4AA) und T3 (T3AA) keinen klinisch bedeutsamen Effekt haben (Mooney und Peterson 2004). Auch bei gesunden Hunden konnten TgAA, T3AA und T4AA nachgewiesen werden (Patzl und Möstl 2003). Bei Hunden, die zum Zeitpunkt der Untersuchungen bereits hypothyreot waren oder klinische Anzeichen einer Schilddrüsenunterfunktion zeigten, konnten Patzl und Möstl (2003) signifikant mehr T4AA und T3AA nachweisen. Diese Schilddrüsenhormonautoantikörper (THAA) können aber in immunologischen Messmethoden zur Bestimmung der T4- und T3-Konzentration kreuzreagieren und je nach Testmethode zu falsch hohen oder falsch niedrigen Werten führen (Feldman und Nelson 2004). Es ist bekannt, dass THAA in Festphasen-Radioimmunoassays zu falsch hohen Werten führen (Nachreiner et al. 2002). Dies kann in seltenen Fällen zu einer Fehlinterpretation des T4-Wertes führen und die Hypothyreosediagnostik erschweren. Unterschiedliche Angaben über die Prävalenzen von Schilddrüsenhormonautoantikörpern (THAA) beim Hund sind vor allem aus dem amerikanischen Raum bekannt. Eine erhöhte Prävalenz an T3AA konnte in Serumproben mit hoher TgAA-Aktivität nachgewiesen werden. T3AA werden als weiterer aussagekräftiger Indikator für die lymphozytäre Thyreoiditis des Hundes diskutiert (Gaschen et al. 1993). 2 Einleitung Auf der Basis dieser Problematik ist die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit, die Häufigkeit von T3AA und T4AA in Serumproben von Hunden zu ermitteln, die aufgrund klinischer Symptome zur Diagnostik einer Hypothyreose in die Endokrinologie der Tierärztlichen Hochschule eingesandt wurden. Ein weiteres Ziel ist die Beurteilung der Gesamtthyroxinkonzentration im Zusammenhang mit der Konzentration des Thyroidea stimulierenden Hormons (TSH) im Serum der autoantikörperpositiven und -negativen Hunde im Hinblick auf die diagnostische Wertigkeit von THAA im Hinblick auf die Diagnostik einer Hypothyreose. Im Vordergrund stehen hierbei möglicherweise falsch erhöhte TT4-Werte, die durch eine Autoantikörper-Interferenz im Chemilumineszenzimmunoassay (CIA) denkbar sind. Hierzu soll diese immunologische Messmethode mit anderen immunologischen und nicht-immunologischen Messmethoden zur Bestimmung der TT4-Konzentration verglichen werden. Literatur 2 2.1 2.1.1 3 Literatur Canine Hypothyreose Vorkommen und Prävalenz der caninen Hypothyreose Die Hypothyreose gehört zu den häufigsten Endokrinopathien des Hundes (Feldman und Nelson 2004). Chastain (1982) beschrieb in einer Übersichtsarbeit, dass die canine Hypothyreose bei mittelgroßen und großen Hunden häufiger auftritt als bei kleinen Hunderassen. Dies konnten neuere Untersuchungen von Boretti et al. (2003) bestätigten. Das durchschnittliche Alter der Hunde, bei denen eine Hypothyreose diagnostiziert wurde, lag je nach Literaturangaben zwischen 6,4 (Vollset und Larsen 1987) und 7,2 Jahren (Panciera 1994). Ein erhöhtes Risiko an einer Hypothyreose zu erkranken, wurde für einige Rassen von Milne und Hayes (1981) beobachtet. Die Autoren untersuchten die epidemiologischen Charakteristika von 3206 hypothyreoten Hunden, ausgehend von 1,1 Million Hunden, die in 15 tierärztlichen Kliniken zwischen 1964 und 1978 vorgestellt wurden. Zu den neun Rassen, die nach dieser Untersuchung ein erhöhtes Risiko für eine Hypothyreose hatten, zählten Golden Retriever, Dobermann Pinscher, Dackel, Sheltie, Irisch Setter, Pomeranier, Schnauzer, Cocker Spaniel und Airedale Terrier. Ein geringeres Risiko bestand, laut Milne und Hayes (1981) bei Deutschen Schäferhunden und Mischlingen. Die Autoren verzeichneten außerdem ein erhöhtes Risiko bei jungen Hunden der oben genannten prädisponierten Rassen. 4 Literatur Wohingegen das relative Risiko an Hypothyreose zu erkranken, bei den Rassen die nicht zu den prädisponierten gehörten, mit höherem Alter stieg. In anderen Untersuchungen wurde die Hypothyreose bei folgenden Hunderassen vermehrt beobachtet: Golden Retriever (18 %), Dobermann Pinscher (17 %), Labrador Retriever (6 %) und Cocker Spaniel (5 %), sowie Deutschen Schäferhund (5 %), ebenso bei 5 % Mischlingshunden (Feldman und Nelson 2004). Bei Dixon et al. (1999) gehörten Retriever, Terrier und Spaniel (speziell Cocker Spaniel), sowie Mischlinge zu den überrepräsentierten Rassen. Bei dieser Studie fand keine statistische Auswertung auf Basis der Hunderassenverteilung statt. Nesbitt et al. (1980) untersuchten 108 hypothyreote Hunde, von denen 50 % zu den Rassen Dobermann Pinscher, Doggen, Pudel, Schnauzer, Irish Setter und Boxer gehörten. Nach Untersuchungen von Panciera (1994) bestand für die canine Hypothyreose keine Geschlechtsdisposition. Auch Feldman und Nelson (2004) gaben keine erhöhte Empfänglichkeit für die Hypothyreose bei einem Geschlecht an. Milne und Hayes (1981) beschrieben aber für kastrierte Hündinnen ein höheres Risiko an Hypothyreose zu erkranken, verglichen mit unkastrierten Hündinnen. Die Schilddrüsenunterfunktion des Hundes wurde, je nach Literaturangabe, mit einer Prävalenz von 0,2 % (Panciera 1994) bzw. 0,6 % (Milne und Hayes 1981) beobachtet. In erstgenannter Studie wurden 66 Hypothyreosen bei 30336 Hunden in einem Zeitraum von fünf Jahren diagnostiziert. Literatur 2.1.2 5 Ätiologie 2.1.2.1 Primäre canine Hypothyreose Die primäre Hypothyreose ist die am häufigsten beobachtete Form der Schilddrüsenunterfunktion beim Hund (Feldman und Nelson 2004). In der Literatur werden beim Hund vor allem zwei Ursachen beschrieben: die Autoimmunthyreoiditis (AIT) und die idiopathische Atrophie (Feldmann und Nelson 2004). Die autoimmunbedingte Thyreoiditis trat in einer Studie von Beale et al. (1990) bei der Hälfte der Hunde als Ursache einer primären Hypothyreose auf. Die Autoren machten dies vor allem an hohen TgAA-Titern der untersuchten hypothyreoten Hunde fest, die von Beale et al. (1990) als hinweisend für eine AIT angenommen wurden. Von Tucker (1962) wurde die erste Schilddrüsenentzündung mit lymphozytär geprägtem Entzündungscharakter bei Beageln beschrieben. Das Auftreten von Autoantikörpern im Zusammenhang mit der lymphozytären Thyreoiditis wurde erstmals 1980 von Gosselin et al. (1981) beim Hund dokumentiert. Diese Form der caninen Hypothyreose ist Bestandteil der vorliegenden Arbeit und soll im nächsten Kapitel ausführlicher behandelt werden. Als zweite Ursache der primären Hypothyreose des Hundes wird die idiopathische Atrophie genannt (Feldman und Nelson 2004). Gosselin et al. (1981) untersuchten die Schilddrüsen von 16 hypothyreoten Hunden histologisch. Bei sieben Hunden konnten Infiltrationen mit Lymphozyten und Plasmazellen nachgewiesen werden, die auf eine AIT hindeuteten. Eine idiopathische Follikelatrophie fanden die Autoren bei neun der untersuchten Hunde. Histologisch betrachtet, fehlten entzündliche Infiltrate. 6 Stattdessen Literatur beschrieben Gosselin et al. (1981a) den Ersatz von Schilddrüsenparenchym durch Binde- und Fettgewebe. In frühen Stadien konnten vor allem degenerative Veränderungen an den Follikeln beobachtet werden, die mit erweitertem rauen Endoplasmatischem Retikulum, großen Golgi-Vesikeln und intrazytoplasmatischen Mikrofollikeln einhergingen. Bisher konnten bei dieser Form der Schilddrüsenatrophie, die histologisch ohne ein entzündliches Geschehen einhergeht, laut Feldman und Nelson (2004) keine Autoantikörper nachgewiesen werden. Graham et al. (2001) vermuteten allerdings, dass es sich um ein Endstadium der lymphozytären Thyreoiditis handeln könne. Benjamin et al. (1996) untersuchten eine Beagle-Kolonie mit 276 Hunden. 26,3 % der untersuchten Hunde wiesen eine progressive lymphozytäre Thyreoiditis auf. Die Autoren untersuchten den Zusammenhang zwischen einer lymphozytären Thyreoiditis und der Atrophie der Schilddrüse. Die gewonnenen Ergebnisse zeigten, dass unter allen 68 Hunden mit lymphozytärer Thyreoiditis 60 Hunde auch eine Follikelatrophie zeigten. Die acht Hunde, welche keine Anzeichen für eine Atrophie der Schilddrüse aufwiesen, hatten lediglich milde Anzeichen einer lymphozytären Infiltration. Der Zusammenhang zwischen der lymphozytären Thyreoiditis und Schilddrüsenatrophie war laut Benjamin et al. (1996) statistisch hoch signifikant. In tierexperimentellen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass Selenmangel zu einer atrophischen fibrosierenden Thyreoiditis führt. Während der physiologischen Hormonbiosynthese in der Schilddrüse entstehendes H2O2, kann bei Selenmangel wegen verminderter Aktivität der cytosolischen Gluthationperoxidase in der Schilddrüsenzelle nicht mehr in ausreichendem Maße reduziert werden (Contempre et al. 1996). Die cytosolische Gluthationperoxidase gehört zu einer Familie von Proteinen, die Biomembranen und Lipide der Zellen vor Sauerstoffradikalen schützen. Ob es beim Hund auch einen Zusammenhang zwischen Selenmangel und atrophischer Thyreoiditis gibt, ist bisher nicht ausreichend untersucht worden. Literatur Eine Follikelzellhyperplasie 7 wurde ebenfalls als Ätiologie einer primären Hypothyreose beschrieben (Feldman und Nelson 2004). Histologisch sind bei der Follikelzellhyperplasie laut Feldman und Nelson (2004) kleine Schilddrüsenfollikel mit wenig Kolloid zu erkennen, welche aber eine deutliche Hyperplasie der Zellen zeigen. Diese histologischen Veränderungen wurden auch bei Jodmangel und bei jungen Hunden mit Defekten der Schilddrüsenhormonbiosynthese geschildert (Chastain et al. 1983; Fyfe et al. 2003). Pettigrew et al. (2007) untersuchten einen neun Wochen alten Welpen mit Entwicklungsstörungen und neurologischen Symptomen. Das Tier zeigte niedrige TT4-Werte und erhöhte TSH-Werte, sowie eine Hyperplasie des Follikelepithels. Pettigrew und Mitarbeiter wiesen bei diesen Hunden eine homozygote Mutation im Thyroxin Peroxidase-Gen nach, die in diesem Fall zu einer Follikelzellhyperplasie und damit mit einer primären Hypothyreose einherging. 2.1.2.2 Sekundäre canine Hypothyreose Bei der sekundären Hypothyreose ist nicht die Schilddrüse selbst, sondern eine fehlende Stimulation durch TSH für eine Unterfunktion des Organs verantwortlich. Die Ursache eines solchen Funktionsverlusts der Adenohypophyse können laut Feldman und Nelson (2004) angeborene Störungen, wie eine hypophysäre Hypoplasie, sein. In der Literatur gibt es vereinzelte Berichte über kongenitale Hypothyreosen verschiedener Hunderassen, bei denen eine hypophysäre Störung für die Schilddrüsenunterfunktion diskutiert wird (Robinson et al. 1988). Eine seltene erworbene Ursache einer verminderten TSH-Sekretion können laut Feldman und Nelson (2004) Neoplasien sein. Weit häufiger konnte die sekundäre Hypothyreose auf eine Suppression der TSH-Konzentration durch Hormone oder Medikamente zurückgeführt werden. Eine bedeutende Rolle spielten, laut Feldman und Nelson (2004), hierbei Glukokorticoide. Schwere kongenitale Hypothyreosen wurden beim Menschen durch Mutationen im TSH-Gen beschrieben (Partsch et al. 2006). Histologisch konnte man bei der sekundären Hypothyreose in der Schilddrüse eine Follikelatrophie beobachten (Feldman und Nelson 2004). 8 Literatur 2.1.2.3 Tertiäre canine Hypothyreose Wenn eine Störung auf der Ebene des Hypothalamus vorliegt, entwickelt sich durch unzureichende Stimulation der Schilddrüse über die Hypothylamus-HypophysenSchilddrüsen-Achse eine Unterfunktion. Neoplasien, Traumata oder Entzündungen konnten laut Feldman und Nelson (2004) zu einem TRH-Mangel führen. In Folge einer fehlenden Stimulation der Schilddrüse kam es zu einer Atrophie des Organs. Es fehlen Untersuchungen darüber, ob bei der primären idiopathischen Atrophie womöglich ein übergeschalteter Funktionsverlust zugrunde liegt. Es ist bisher kein Fall einer tertiären Hypothyreose beim Hund beschrieben worden (Feldman und Nelson 2004; Mooney und Peterson 2004). 2.1.3 Die Klinik Hormone der Schilddrüse stoffwechselphysiologische Proteinstoffwechsels, spielen Vorgänge sowie des eine des wichtige Rolle Kohlenhydrat-, Wärmehaushaltes. für viele Fett- und Verminderte Hormonkonzentrationen bewirken demnach in vielen Organsystemen metabolische Funktionsstörungen. Klinische Symptome zeigten hypothyreote Hunde meist zwischen 2 und 6 Jahren (Feldman und Nelson 2004). Panciera (1994) untersuchten klinische Symptome, die bei 66 hypothyreoten Hunden auftraten. Als häufigste klinische Veränderungen beschrieben die Autoren Adipositas bei 41 % der untersuchten Hunde. Seborrhoe und Alopezie konnte Panciera (1994) bei 39 % bzw. 26 % der betrachteten Hunde verzeichnen. Eine generelle Schwäche zeigten 21 % und Lethargie 20 % der beobachteten Hunde. Bei 14 % der Hunde trat eine Bradycardie auf. 58 % der bradycarden Hunde zeigten eine Hypovoltage der R-Zacke im EKG. 11 % der Tiere wiesen zudem eine Pyodermie auf (Panciera 1994). Literatur 9 Dixon et al. (1999) fanden bei 50 hypothyreoten Hunden vor allem klinische Symptome, die auf metabolische Störungen zurückzuführen waren (84 % der untersuchten Hunde). Zu metabolischen Symptomen zählten die Autoren Lethargie, Adipositias, Trägheit und Kälteintoleranz. 80 % der untersuchten Hunde zeigten dermatologische Symptome wie Haarausfall, Hyperpigmentation, Pyodermie. Neuere Untersuchungen von Boretti et al. (2003) an 32 hypothyreoten Hunden zeigten ebenfalls, dass vor allem Trägheit, Adipositas sowie dermatologische aber auch neurologische und gastrointestinale Störungen auftraten. 19 der 32 hypothyreoten Hunde zeigten Hautveränderungen. Am häufigsten konnte eine Seborrhoe bei 11 Tieren und bei 8 Hunden eine Alopezie beobachtet werden. Neurologische Symptome traten bei 16,1% der hypothyreoten Hunde in Form von Krampfanfällen, Fazialisparese, peripheres Vestibulärsyndrom und Megaoesophagus auf. Als gastrointestinale Probleme berichteten Boretti et al. (2003) von akutem und chronischem Durchfall, akutem Erbrechen und Anorexie. Infertilität, unregelmäßige Läufigkeiten, sowie verlängerte Läufigkeitintervalle bei Hündinnen werden ebenfalls als typische klinische Symptome bei der caninen Hypothyreose beschrieben (Feldman und Nelson 2004), treten aber seltener auf. Bei den Untersuchungen von Dixon et al. (1999) wies lediglich eine Hündin unregelmäßige Interöstrus-Intervalle auf. Stephan et al. (2003) untersuchten zehn hypothyreote Hunde kardiologisch. Bei sechs Hunden konnte vor einer Substitutionstherapie mit L-Thyroxin eine reduzierte Intensität des Herzens bei der Auskultation festgestellt werden. Fünf Hunde zeigten unter Therapie mit Schilddrüsenhormonen eine Steigerung der Herzfrequenz. Labordiagnostisch trat bei den untersuchten Hunden in der Studie von Panciera et al. (1994) die Hypercholesterinämie bei 32 % Tieren und eine normochrome normozytäre Anämie bei ebenfalls 32 % Hunden auf. Boretti et al. (2003) fanden bei 72 % der untersuchten Hunde erhöhte Serumcholesterinwerte und bei 53 % erhöhte Triglyzeridwerte. Bei 28 % der untersuchten Hunde in dieser Studie war die alkalische Phosphatase erhöht. 10 Literatur Dixon et al. (1999) stellten bei 88 % der 50 untersuchten hypothyreoten Hunde erhöhte Triglyzeridkonzentrationen fest. Bei 78 % wurden erhöhte Cholesterolkonzentrationen, bei 49 % erhöhte Glukosekonzentrationen sowie bei 34 % der untersuchten Hunde, ein erhöhter Fruktosaminwert festgestellt. Seltener war auch die Kreatininkinase, Aspartat-Aminotransferase (AST) und die γ-Glutamyltransferase erhöht. Reusch et al. (2002) untersuchten elf hypothyreote Hunde und stellten fest, dass neun dieser Hunde erhöhte Fruktosaminwerte aufwiesen. Eine Verhaltensproblematik, vor allem extreme Ängstlichkeit und Aggressivität, wurde ebenfalls immer wieder im Zusammenhang mit der caninen Hypothreose erwähnt (Beaver und Haug 2003; Fatjo et al. 2002; Jochle 1998). 2.1.4 Diagnostik Die Diagnostik der Hypothyreose des Hundes stützt sich neben der Interpretation klinischer Symptome, labormedizinisch oft vor allem auf eine endokrinologische Untersuchung. Hierbei wird der TT4-Wert im Zusammenhang mit dem TSH-Wert interpretiert. Laut Dixon und Mooney (1999) bestand eine 100 %ige Sensitivität hinsichtlich der Diagnostik einer Hypothyreose, wenn der TT4-Wert niedrig war. Wurde der TT4-Wert im Zusammenhang mit dem TSH-Wert interpretiert, lag nach Mooney und Peterson (2004) eine Sensitivität von 87 % und eine Spezifität von 92 % vor. Zu 97 % spezifisch konnte man die Hypothyreose laut Dixon und Mooney (1999) diagnostizieren, wenn der TSH-Wert zusammen mit freiem T4 (fT4) interpretiert wurde. Die Schwierigkeit bei der Interpretation dieser Messwerte besteht generell darin, dass eine Vielzahl anderer Erkrankungen und Medikamente den TT4-Wert senken können. So konnte beispielsweise gezeigt werden, dass die Gabe von 1 mg/kg Prednisolon T3-Konzentration (Torres et al. 1991). um zweimal bis zu täglich über 61,3 % 10 Tage bzw. die 57,4 % basale verringern T 4- und konnte Literatur 11 Bei einigen Hunderassen, vor allem Windhunden war die TT4-Konzentration niedriger als bei anderen Rassen. Geffen et al. (2006) untersuchten untrainierte und trainierte Whippets und stellten fest, dass die TT4-Konzentration bei Whippets signifikant niedriger war, als bei anderen Rassen. Sie stellten aber keinen Unterschied hinsichtlich der TT4-Konzentration zwischen der trainierten und untrainierten Gruppe fest. Zu tageszeitlichen Schwankungen der Thyroxinkonzentration gibt es unterschiedliche Literaturangaben. Miller und Kollegen (1992) konnten keine tageszeitliche Schwankung für Thyroxin nachweisen. Im Gegensatz dazu gibt es Studien, die eine Diurnalität für T4 nachgewiesen haben. Laut Hoh und Oh (2006) sollte eine Messung der TT4-Konzentration zur Diagnostik einer Hypothyreose zwischen 11:00 Uhr und 14:00 Uhr erfolgen. In dieser Zeit war die TT4-Konzentration der untersuchten Hunde am höchsten (Hoh und Oh 2006). Miller et al. (1992) untersuchten alle drei Stunden die TT4-Konzentration bei gesunden, hypothyreoten Hunden und Hunden mit atopischer Dermatitis. Die Autoren fanden keinen signifikanten Unterschied der TT4-Konzentration zwischen diesen drei Gruppen. Eine solche physiologische Schwankungsbreite kann ebenfalls Einfluss auf die Interpretation des TT4-Wertes nehmen. Zu bedenken ist außerdem, dass TSH zum Teil auch bei nicht hypothyreoten Hunden erhöht sein kann. In einer Studie mit 103 Tieren hatten sechs offensichtlich euthyreote Tiere einen erhöhten TSH-Wert (Hoppen et al. 1997). Die Messung von T3 zur Feststellung des Schilddrüsenfunktionsstatus wurde in der Endokrinologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover nicht routinemäßig durchgeführt. MILLER et al. (1992) konnten keinen signifikanten Unterschied zwischen der T3-Konzentration hypothyreoter und euthyreoter Hunde feststellen. In einer Studie mit 108 hypothyreoten Hunden hatten 26 % normale T3-Konzentrationen (Nesbitt et al. 1980). 12 2.2 Literatur Autoimmunthyreoiditis (Lymphozytäre Thyreoiditis) Bei circa 50 % der primären Hypothyreosen des Hundes ist die Ursache ein immunvermittelter Untergang des Schilddrüsenparenchyms (Beale et al. 1990). Die genaue Ätiologie der caninen lymphozytären Thyreoiditis ist bisher immer noch weitgehend unbekannt. Normalerweise entwickelt der Körper eine Toleranz gegenüber körpereigenen Antigenen. Diese sogenannte Selbsttoleranz wird während der Embryonalzeit im Thymus geprägt und lebenslänglich in Gedächtniszellen aufrechterhalten. Bei Verlust der Selbsttoleranz entwickelt sich eine Autoimmunerkrankung, jedoch nur unter der Voraussetzung einer genetischen Disposition. Die autoimmune Reaktion kann durch B- oder T-Zellen vermittelt sein. Es treten Antikörper gegen körpereigenes Gewebe (Autoantikörper) auf oder eine durch T-Lymphozyten vermittelte Entzündungsreaktion. Für die autoimmunbedingte Schilddrüsenerkrankungen des Menschen wurden genetische Komponenten, zum Teil mit komplexem genetischen Hintergrund nachgewiesen (Vaidya et al. 2002). Die Krankheit selbst entsteht laut Aktas et al. 1993 erst im Zusammenspiel mit zusätzlichen Faktoren. Beim Menschen konnte beispielsweise gezeigt werden, dass vermehrt TgAA bei Personen auftraten, die mit dem Eppstein-Barr-Virus infiziert waren (Aktas et al. 1993). Autoantigene werden über den Haupt-Histokompatibilitäts-Komplex (major histocompatibility complex, MHC) präsentiert. Bei der Autoimmunthyreoiditis übernehmen die Thyreozyten auf ihrer eigenen Oberfläche die Antigenpräsentation mit MHC Klasse-II-Molekülen. Dies geschieht allerdings nur nach vorheriger Stimulation der Schilddrüsenzellen durch Interferon (IFN)-γ, welches von aktivierten dendritischen Zellen ausgeschüttet wird (Weetman 1994). Nach der MHC Klasse-II Präsentation werden laut Weetman (1994) CD-4-T-Zellen durch weitere Faktoren (ICAM-1, LFA-1, Kofaktoren B7, CD 28, CTLA-4) aktiviert. Literatur 13 Diese T-Zellen und natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) binden an die Thyreozyten und aktivieren das Komplement-System. Zytokine werden gebildet. Hierdurch werden die Schilddrüsenzellen direkt geschädigt. Durch dendritische Zellen und aktivierte T-Lymphozyten als auch durch die Zytokine Interleukin-6 und Interleukin-13, werden B-Zellen aktiviert. Polyklonale B-Zellen bilden Antikörper unter anderem gegen die Schilddrüsenperoxidase und das Protein Thyreoglobulin. Diese B-Zellen findet man im Verlauf der AIT nicht nur in der Schilddrüse, sondern auch in den Lymphknoten und im Knochenmark (Weetman1994). Beim Hund wurde ebenfalls eine genetische Komponente beschrieben. Eine signifikant erhöhte Prävalenz für eine lymphozytäre Thyreoidits konnte bei den Rassen Dobermann, Old English Sheepdogs und Irish Settern beobachtetet werden (Beale et al. 1990; Haines et al. 1984). Eine familiäre Komponente konnte bei Doggen und Borzois nachgewiesen werden (Conaway et al. 1985). Einen autosomal rezessiven Erbgang beschrieben Conaway et al. (1985) für Borzois. Es gibt beim Hund aber keine Studien darüber, welche Umweltfaktoren eine Rolle bei der Pathogenese einer lymphozytären Thyreoiditis spielen. In Untersuchungen an Versuchshunden der Rasse Beagle konnte ein signifikanter Anstieg von Antikörpern gegen bovines und canines Thyreoglobulin nach Routineimpfungen festgestellt werden (Scott-Moncrieff et al. 2002). Inwieweit Impfungen in einem direkten Zusammenhang mit der Entwicklung einer Autoimmunthyreoiditis gebracht werden können, ist aber nicht bekannt. Frauen erkranken etwa 8 – 10 mal häufiger an einer AIT als Männer. Beim Hund konnte bisher keine Geschlechtsdisposition für die AIT nachgewiesen werden (Feldman und Nelson 2004). Nachreiner et al. (2002) konnten aber signifikant mehr THAA bei Hündinnen nachweisen. 14 Literatur Im Biopsiematerial von Beaglen wurde die lymphozytäre Thyreoiditis in den 70iger Jahren erstmals beim Hund beschrieben. Tucker et al. (1962) verzeichnen eine Prävalenz von 16,2 %. Bei 13 % der männlichen und 11 % der weiblichen Laborbeagle konnten Musser und Graham (1968) eine lymphozytäre Thyreoiditis nachweisen. Ebenfalls 1968 wurde eine Studie an 4500 Hunden verschiedener Rassen durchgeführt. Hierbei lag eine lymphozytäre Thyreoiditis bei 0,4 % der untersuchten Hunde vor (Mawdesley-Thomas 1968). Das Alter der Hunde, bei der eine Hypothyreose nachgewiesen wurde, lag nach Mooney und Peterson (2004) im Mittel bei sieben Jahren. Dagegen fanden Graham et al. (2001) die höchste Prävalenz bei Hunden im Alter zwischen 1 und 2 Jahren. Milne und Hayes (1981) verzeichneten im Alter zwischen 4 und 6 Jahren bei 32 % eine Hypothyreose, im Alter zwischen 2 und 3 Jahren bei 22 % der Hunde und im Alter von 7 bis 9 Jahren ebenfalls bei 22 % der untersuchten 3206 Hunde eine Hypothyreose. Laut Mooney und Peterson (2004) erkrankten Hunde großer Rassen früher, wohingegen kleinrassige Hunde älter waren. Die lymphozytäre Thyreoiditis tritt auch im Zusammenhang mit anderen Autoimmunerkrankungen auf. Wenn mehr als drei endokrine Organe betroffen sind, spricht man in der Humanmedizin von einer autoimmunen Polyendokrinopathie. Meist sind die Nebenniere, das Pancreas und die Schilddrüse betroffen. Ford et al. (1993) untersuchten drei Hunde mit Diabetes mellitus, die eine Insulinresistenz aufwiesen. Bei diesen Tieren konnte ebenfalls eine Hypothyreose diagnostiziert werden. Das Auftreten einer Schilddrüsenunterfunktion im Zusammenhang mit einem Hypoadrenokortizismus wurde von Kooistra et al. (1995) dokumentiert. Histologisch wurde die AIT durch diffuse Infiltration mit Lymphozyten, Plasmazellen und Makrophagen charakterisiert, wobei die Lymphoyzyten in Keimzentren (Nestern) angeordnet sind. Gosselin et al. (1981a) Basalmembranen um die Schilddrüsenfollikel. beschrieben zudem verdickte Literatur 15 Die autoimmunen Entzündungsprozesse sind langsam fortscheitend. So lang noch circa 25 % des Schilddrüsengewebes funktionell ist, treten weder labordiagnostische noch klinische Veränderungen auf. Bis die TT4-Konzentration, bzw. das freie T4 erniedrigt, die TSH-Konzentration kompensatorisch erhöht ist und der Hund eine klinische Manifestation der Erkrankung zeigt, vergehen zwischen 1 – 3 Jahre (Nachreiner et al. 2002). Graham et al. (2001) dokumentieren in einer Übersichtsarbeit mehrere histopathologische und funktionelle Stadien, die im Verlauf einer lymphozytären Thyreoiditis beim Hund unterschieden werden konnten. Zu Beginn der Erkrankung fanden sich histologisch nur fokale Entzündungszellinfiltrationen. Bei dieser, von Graham et al. (2001) umschriebenen subklinischen Thyreoiditis konnten aber bereits Autoantikörper im Serum der Hunde nachgewiesen werden. Zu diesem Zeitpunkt waren die untersuchten Hunde aber klinisch unauffällig und die TT4- und TSH-Konzentrationen lagen im Normbereich. Waren mehr als 50 % des Schilddrüsengewebes zerstört, kam es nach Graham et al. (2001) zu einer kompensatorischen TSH-Erhöhung. Die TT4-Werte lagen zu diesem Zeitpunkt noch im Referenzbereich. Umfangreiche entzündliche Infiltrate, bestehend aus Lymphozyten, Plasmazellen und Makrophagen prägten das histologische Bild der subklinischen Hypothyreose. Dieses Stadium ging nach Graham et al. (2001) nur mit geringen klinischen Anzeichen einher. Autoantikörper waren aber weiterhin nachweisbar. War mehr als 75 % der Schilddrüse zerstört, lagen klinische Symptome einer Hypothyreose vor. Zu diesem Zeitpunkt war auch die TT4-Konzentration deutlich erniedrigt und die TSH-Konzentration erhöht. Autoantikörper konnten bei der klinisch manifesten Hypothyreose ebenfalls nachgewiesen werden. Die atrophische Hypothyreose wird von Graham et al. (2001) als letztes Stadium beschrieben. Als Endzustand des autoimmunen Prozesses zeigte sich histologisch ein Ersatz des Schilddrüsenparenchyms durch Binde- und Fettgewebe. Funktionelle Follikel waren selten. Entzündliche Infiltrate, Lymphozytennester oder Plasmazellen, fehlten im histologischen Bild gänzlich. wie 16 Literatur Bei der atrophischen Hypothyreose war die TT4-Konzentration stark erniedrigt und die TSH-Konzentration deutlich erhöht. Graham et al. (2001) gehen davon aus, dass in diesem Stadium keine Autoantikörper mehr nachgewiesen werden können, da kein antigener Stimulus mehr präsent ist. Der Verlauf einer autoimmunen Thyreoiditis konnte bereits detailliert im Tiermodell verfolgt werden. OS-Hühner (Obese Strain Chicken) entwickeln in den ersten Lebenswochen spontan eine autoimmune Thyreoiditis. Die Schilddrüse wurde bei diesen Tieren innerhalb von drei bis fünf Wochen zerstört. Ab der zweiten Woche konnten in Studien TgAA nachgewiesen werden (Wick et al. 2006). Der höchste Autoantikörpertiter konnte beobachtet werden, wenn die deutlichste Entzündung in der Schilddrüse zu erkennen war. In dieser Zeit konnten Wick et al. (2006) eine geringe Größenzunahme des Organs verzeichnen. Histologisch fanden die Autoren auch hier eine Infiltration von großen und kleinen Lymphozyten, Plasmazellen und Makrophagen. Mit Fortschreiten des Prozesses wurde die Schilddrüse wieder kleiner und atrophierte (Wick et al. 2006). 2.3 Autoantikörper der autoimmunen Thyreoiditis 2.3.1 Einführung Als Autoantikörper versteht man Antikörper, die gegen Epitope des eigenen Körpergewebes gerichtet sind. Wenn eine Kreuzreaktivität zwischen beispielsweise Infektionserregern und körpereigenem Antigen besteht (molekulare Mimikry), kann sich eine autoimmune Erkrankung entwickeln. Bei der autoimmunen Thyreoidtis des Hundes wurden als Autoantigene das Thyreoglobulin und die schilddrüsenspezifische Peroxidase beschrieben (Deeg et al. 1997; Skopek et al. 2006). Subpopulationen der TgAA können ebenfalls Thyroxin (T4) und Triiodthyronin (T3) binden (Pearce et al. 1981). Bei den TgAA handelt es sich nach Untersuchungen von Day (1996) in erster Linie um Immunglobuline der Klasse G (IgG). Bei sechs hypothyreoten Hunden konnten TgAA der Subklassen IgG1, IgG2 and IgG4 nachgewiesen werden. Ein Hund hatte erhebliche Mengen IgG3-TgAA (Day 1996). Literatur 17 Beim Menschen konnte gezeigt werden, dass es nach einer Feinnadelaspiration der Schilddrüse zu einer vermehrten Freisetzung von Thyreoglobulin kam. Bei Patienten, die TgAA aufwiesen, konnte nach einer Feinnadelaspiration eine primäre Immunantwort mit der Freisetzung von IgM und anschließender sekundärer IgG-Immunantwort verfolgt werden (Benvenga et al. 1997). 2.3.2 Thyreoglobulin Autoantikörper 2.3.2.1 Vorkommen und Bedeutung Thyreoglobulin ist das Hauptprotein in den Schilddrüsenfollikeln und ist entscheidend für die Speicherung und Synthese der Schilddrüsenhormone. Thyreoglobulin ist ein 670 kDa großes Glykoprotein, bestehend aus zwei Homodimeren. T4 und T3 werden im Thyreoglobulinmolekül gespeichert. 1971 wurden erstmals TgAA beim Hund nachgewiesen und im Zusammenhang mit der lymphozytären Thyreoiditis beschrieben (Mizejewski et al. 1971). Iversen et al. (1998) konnten bei zehn von elf Hunden, die eine lymphozytäre Thyreoiditis aufwiesen, TgAA bestimmen. Durch die Untersuchung von Biopsien bei TgAA positiven Hunden konnte gezeigt werden, dass sechs von sieben Hunden mit TgAA auch histologisch eine lymphozytäre Thyreoditis aufwiesen (Feldman und Nelson 2004). Somit wurde ein direkter Zusammenhang zwischen den Autoantikörpern und einem pathologischen Prozess in der Thyreoidea gezeigt. Immunkomplexe aus Thyreoglobulin und TgAA sind in der Basalmembran der Schilddrüsenfollikel beim Menschen mit AIT nachgewiesen worden (McLachlan et al. 1986). Nach Untersuchungen von Beale et al. (1990) und Thacker et al. (1992) kamen TgAA signifikant häufiger in Seren mit niedriger TT4-Konzentration vor. Im Umkehrschluss haben Gosselin et al. (1981b) mit der intrathyroidalen Injektion von 0,5 ml caninem Serum, welches TgAA enthielt, nach einem Monat multifokale Infiltrationen von Lymphozyten und Makrophagen beobachten können. Laut der Autoren war dies ein klarer Hinweis darauf, dass TgAA eine bedeutende Rolle bei der Pathogenese der AIT des Hundes spielten. 18 Literatur Bei circa der Hälfte der hypothyreoten Hunde ließen sich TgAA nachweisen (Feldman und Nelson 2004). Allerdings wurden nicht nur bei hypothyreoten Hunden TgAA nachgewiesen. Bei klinisch gesunden Hunden und bei Hunden mit anderen, nicht thyroidalen Erkrankungen, konnte ebenfalls das Auftreten von TgAA beobachtet werden (Haube 1999, Nachreiner et al. 1998). In einer umfangreichen Untersuchung von Breyer et al. (2004) an 118 hypothyreoten und 2496 anderweitig erkrankten Hunden, wurden bei 58,6 % der hypothyreoten und 6,25 % der euthyreoten Tiere TgAA nachgewiesen. Allerdings wurde von Breyer et al. (2004) auch bei 19 von 156 (12,2 %) TgAA-positiven Hunden, mit anderen Erkrankungen, eine vorher nicht diagnostizierte Hypothyreose festgestellt. 16 der 156 Hunde (10,3 %) mit TgAA entwickelten innerhalb von zwei Jahren eine klinisch manifeste Schilddrüsenunterfunktion. Breyer et al. (2004) kamen zu dem Schluss, dass die TgAA-Bestimmung eine sinnvolle Ergänzung der Schilddrüsendiagnostik darstellte. Dixon und Mooney (1999) fanden bei 43 % der hypothyreoten Hunde mit normalem TSH-Wert Autoantikörper. In der Studie von Dixon und Mooney (1999) war keiner der 77 anderweitig erkrankten Hunden TgAA-positiv. Dagegen wiesen Deeg et al. (1997) bei 25 % der Hunde mit anderen internistischen, nicht thyroidalen Erkrankungen, einen positiven TgAA-Titer nach. Haines et al. (1984) dokumentierten bei 43 % der untersuchten Hunde mit nichtthyroidalen, aber anderen endokrinen Erkrankungen, das Vorkommen von TgAA. Unter längerer Substitutionstherapie oder in fortgeschrittenen Stadien der AIT waren bei Untersuchungen von Haube (1999) keine TgAA mehr nachweisbar. Der TgAA-Titer fiel bei hypothyreoten Hunden im Laufe von 2,5 Jahren unter die Nachweisgrenze ab (Haube 1999). Die in der Literatur veröffentlichten Prävalenzen von TgAA bei hypothyreoten Hunden schwankten zwischen 19,5 % und 95 %. Die TgAA-Prävalenzen gesunder Hunde bewegen sich je nach Literaturangabe zwischen 3,0 % und 46,9 %. Der Nachweis von TgAA wurde mit einer Ausnahme* in allen Studien mit einem Enzymimmunoassay (EIA) durchgeführt (Tabelle 1). Literatur Tabelle 1. 19 Ermittelter Prozentsatz TgAA-positiver Hunde unter hypothyreoten und gesunden Hunden aus verschienden Studien zwischen 1980 und 2006 Hypothyreote Hunde Autor Gosselin et al. Haines et al. Beale et al. Thacker et al. Deeg et al. Nachreiner et al. Iversen et al. Dixon und Mooney Patzl und Möstl Hiroyuki Lee et al. Breyer et al. Geffen et al. Jahr TgAA-positive Hunde (%) 1980 1984 1990 1992 1997 1998 1998 1999 2003 2003 2004 2004 2006 48 * 58,8 50 *** 48,7 38,0 38,2 95,0 36,0 19,5 38,0 50,0 58,6 - Gesunde Hunde Anzahl TgAA-positive Hunde (%) Anzahl 25 34 470 119 39 131 11 42 31 7 19 111 - 46,9 ** 3,3 14,3 3,3 6,0 6,0 3,0 14,0 5,0 16,3 8 64 30 21 91 132 70 168 4 52 80 25 * = TgAA Nachweis mit passiver Hämagglutination, alle übrigen TgAA-Nachweise mittels ELISA, ** = Haines et al. untersuchten zwar gesunde Hunde, aber solche, die eng mit TgAA-positiven Hunden verwandt waren, *** = Beale et al. (1990) wiesen TgAA in Serumproben nach, die zur Laboruntersuchung auf T3 bzw. TT4 eingesandt wurden, TgAA = Antikörper gegen Thyreoglobulin, - = nicht untersucht In der umfangreichsten Studie von Beale et al. (1990) an 470 Hunden, wurden Serumproben untersucht, die zur Bestimmung der T4- und T3-Konzentration in die University of Florida (J.Hillis Miller Health Center) eingesandt wurden. Von den 470 Hunden, hatten 108 erniedrigte T4-Werte von <1,2 µg/dl. Von diesen Hunden waren lediglich 23 % TgAA-positiv. TgAA konnten Beale et al. (1990) in allen eingeteilten Gruppen (T4 = >1,5 µg/dl, T4 = 1,2 – 1,5 µg/dl, T4 = <1,2 µg/dl und T3 = >250 ng/dl) finden. 20 Literatur Die aktuellsten Daten zur Prävalenz von TgAA wurden von Breyer et al. (2004) erhoben. Bei 111 Hunden mit primärer Hypothyreose waren 58,6 % TgAA-positiv. Das durchschnittliche Alter der Hunde betrug 6,1 Jahre. Das durchschnittliche Alter der Tiere, die TgAA-positiv waren, lag bei 5,6 Jahren. Die TgAA-positiven Hunde waren nach Breyer et al. (2004) signifikant jünger und bei jüngeren Tieren wurden durchschnittlich höhere Autoantikörpertiter festgestellt. Breyer et al. (2004) konnten hinsichtlich des TgAA-Nachweises keine Geschlechtsdisposition feststellen. Am häufigsten wurden TgAA bei Mischlingen nachgewiesen. Die am häufigsten vertretenen Rassen waren Hovawart und Riesenschnauzer. Die aktuellsten Daten zu Prävalenz von TgAA bei klinisch gesunden Tieren wurden von Geffen et al. (2006) bei 30 trainierten und 25 untrainierten gesunden Whippets erhoben. In beiden Gruppen konnten bei je 2 Tieren TgAA nachgewiesen werden. Dies entsprach in der gesunden und untrainierten Kontrollgruppe 8 % und bei den trainierten gesunden Tieren 2 %. Dieser Unterschied war nach Geffen et al. (2006) statistisch nicht signifikant. Thyreoglobulin konnte auch bei gesunden Individuen im Blut nachgewiesen werden. Hier führt es aber nicht zwangsläufig zur Bildung von Autoantikörpern oder einer lymphozytären Thyreoiditis. Verschiedene Untersuchungen wurden zu den antigenen Epitopen im Thyreoglobulinmolekül durchgeführt. Durch tryptische Aufspaltung von caninem Thyreoglobulin und anschließendem Westernblot untersuchten Tani et al. (2003) Erkennungsmuster der TgAA für Thyreoglobulin. Die Seren der TgAA-positiven Hunde reagierten mit verschiedenen Peptiden, die durch die tryptische Aufspaltung entstanden. Die Bindungsmuster der TgAA für die Peptide aus dem tryptischen Verdau variierten von Probe zu Probe, so dass Tani et al. (2003) diskutierten, ob die Epitope, die von TgAA erkannt wurden, individuell unterschiedlich waren, bzw. sind. In einer anderen Studie reagierten TgAA ebenfalls mit verschieden großen Peptidfragmenten nach tryptischem Verdau. Unter anderem konnte gezeigt werden, dass mehrere Autoantikörper ein 25 kDa Peptidfragment banden (Lee et al. 2004). Inwieweit die unterschiedlichen Bindungsmuster einen Einfluss auf die Ätiologie oder den Verlauf einer AIT haben, oder ob sie als diagnostischer Marker genutzt werden können, konnte bisher nicht geklärt werden. Literatur 21 2.3.2.2 Autoantikörper gegen Schilddrüsenhormone Die Schilddrüsenhormone 3’,5’,3,5-Tetrajodthyronin (T4) und 3’,3,5-Trijodthyronin (T3) bilden sich aus Reaktion zweier jodierter Tyrosine im Thyreoglobulinmolekül. Schilddrüsenhormone sind Haptene und können alleine keine Immunantwort auslösen. Als Haptene werden kleine Moleküle (<1000 Da) bezeichnet, die dem Immunsystem nur in Verbindung mit einem größeren Molekül präsentiert werden. In diesem größeren Trägermolekül stellen sie ein neues Epitop dar, gegen das Antikörper gebildet werden können. Bei den Autoantikörpern, die T4 bzw. T3 binden, handelt es sich laut Literatur um TgAA, die mit den Schilddrüsenhormonen kreuz reagieren (Feldman und Nelson 2004). In einer Studie von Pearce et al. (1981) wurde gezeigt, dass Autoantikörper sowohl radioaktiv markiertes Thyreoglobulin, als auch T4, T3 und reverses T3 (rT3) banden. Das sahen die Autoren als ersten direkten Beweis dafür, dass beim Menschen mit Jod-Thyroninen reagierende Autoantikörper, gegen Thyreoglobulin gerichtet sind (Pearce et al. 1981). Beim Hund werden THAA ebenfalls als Subsets der TgAA angesehen (Feldman und Nelson 2004). Von Gaschen et al. (1993) konnte gezeigt werden, dass die mittlere TgAA-Konzentration in Serumproben mit niedrigem T3AA-Titer signifikant geringer war, als in Proben mit hohem T3AA-Titer. Außerdem verringerte die Zugabe von freiem T3 die Aktivität an nachweisbaren TgAA. Diese Ergebnisse deuteten die Autoren als Hinweis darauf, dass eine Fraktion der TgAA ein Epitop im Thyreoglobulinmolekül erkannten, welches T3 enthielt. Zudem fanden Gaschen et al. (1993) eine erhöhte Prävalenz an T3AA in Serumproben mit hoher TgAA-Aktivität und schlussfolgerten, dass ein positives T3AA-Ergebnis ein weiterer aussagekräftiger Indikator für eine lymphozytäre Thyreoiditis des Hundes sein könnte. Auch Graham et al. (2001) beobachteten eine höhere Prävalenz der THAA bei hypothyreoten TgAA-positiven Hunden als bei klinisch gesunden TgAA-positiven Tieren. 22 Literatur Dagegen wiesen Thacker et al. (1992) in Serumproben von Hunden auch T3AA bzw. T4AA nach, ohne dass sie ein positives Ergebnis für TgAA ermitteln konnten. In dieser Studie wurde das Vorkommen von TgAA und THAA bei 119 Hunden mit klinischen Symptomen einer Hypothyreose untersucht. In 58 Serumproben wurden Autoantikörper nachgewiesen. Häufiger fanden die Autoren TgAA zusammen mit T3AA (25,9 % von autoantikörperpositiven Proben). Dagegen konnten in 1,7 % der Proben nur T3AA nachgewiesen werden. Die Autoren vermuteten, dass Thyreoglobulin nicht der einzige immunogene Stimulus für die Bildung von THAA sein könne. Das Vorkommen von THAA konnte ebenfalls in Zusammenhang mit der lymphozytären Thyreoiditis des Hundes gebracht werden. Chastain et al. (1989) wiesen bei einer fünf Jahre alten Sheltie Hündin mit sehr niedrigem TT4- aber erhöhtem T3-Wert histologisch eine lymphozytäre Thyreoiditis und Atrophie der Schilddrüsenfollikel nach. Bei dieser Hündin konnten die Autoren T3AA nachweisen und beschrieben die erhöhte T3-Konzentration als Folge einer Interferenz der T3AA mit der T3-Messmethode. Auch beim Menschen wurden THAA im Zusammenhang mit der Hashimoto Thyreoiditis dokumentiert (Ikekubo et al. 1978). Allerdings sind THAA in der Humanmedizin auch bei diversen anderen Schilddrüsenerkrankungen beobachtet worden. Mehrere Arbeitsgruppen konnten THAA bei Patienten mit einer autoimmun bedingten Hyperthyreose, einer „Grave’s Disease“ nachweisen (Sakata et al. 1990; Takuno et al. 1990). Sakata et al. (1990) verfolgten zwei Patienten mit THAA. Bei einem der hier untersuchten Patienten waren T3AA auch nach einer Thyreodektomie persistent. Sakata et al. (1990) konnten gereinigtes Thyreoglobulin aus der entfernten Schilddrüse des Patienten gewinnen. Die Autoren untersuchten zur Feststellung der immunologischen Aktivität, die Bindung von vier monoklonalen AK an dem Thyreoglobulin aus der entfernten Schilddrüse und verglichen die Bindung mit Thyreoglobulin gesunder Individuen. Das gewonnene Thyreoglobulin zeigte eine unterschiedliche immunologische Aktivität, im Vergleich zu normalem Thyreoglobulin gesunder Menschen. Die Autoren nannten diesen Unterschied als mögliche Ursache für die Persistenz der T3AA nach der Thyreodektomie. Literatur 23 Sowohl TgAA als auch THAA konnten auch bei klinisch gesunden Individuen nachgewiesen werden. In einer Studie von Sakata et al. (1994) wurden bei drei von 880 untersuchten gesunden Personen T4AA nachgewiesen. Keiner der untersuchten Patienten war T3AA-positiv. Ebenfalls konnte bei keinem der untersuchten Patienten T3AA zusammen mit T4AA nachgewiesen werden. Unter 186 gesunden Hunden konnten bei zwei Hunden TgAA und THAA (T3AA und T4AA) nachgewiesen werden, sowie bei einem Hund TgAA und T4AA. Weiterhin berichteten Patzl und Möstl (2003) von fünf T3AA-positiven Hunden unter den 186 untersuchten Tieren. In der letztgenannten Studie konnten die THAA-positiven Hunde im Hinblick auf die mögliche Entwicklung einer Hypothyreose nicht weiter verfolgt werden. Unter den Hunden, die zum Zeitpunkt der Untersuchungen bereits hypothyreot waren, oder klinische Anzeichen einer Schilddrüsenunterfunktion zeigten, konnten Patzl und Möstl signifikant mehr THAA nachweisen. Die in der Literatur veröffentlichten Prävalenzen für T3AA und T4AA sind zum Teil sehr unterschiedlich. Für T3AA sind Prävalenzen zwischen 0,3 % und 38 % bei hypothyreoten Hunden angegeben. Die Prävalenzen für T4AA schwanken je nach Literaturangabe zwischen 0,6 % und 4,0 %. In den Studien variiert allerdings die Anzahl der untersuchten Hunde deutlich. Außerdem variieren von Studie zu Studie die Auswahlkriterien der Hunde, bei denen THAA bestimmt worden sind (Tabelle 2). 24 Literatur Tabelle 2. Ermittelter prozentualer Anteil an T3AA- und T4AA-positiven Hunden aus verschiendenen Studien zwischen 1985 und 2003, und die entsprechenden Auswahlkriterien für die Autoantikörperbestimmung Autor Jahr T3AApositive Hunde (%) Young et al. Thacker et al. Gaschen et al. Nachreiner et al. Patzl und Möstl Patzl und Möstl 1985 1992 1993 2002 2003 2003 0,3 0,8 38,0 4,6 3,0 6,5 T4AApositive Anzahl der Hunde untersuchten (%) Hunde 2,5 0,6 0 4,0 6000 119 45 18135 31 76 Auswahlkriterien Einsendungen * Klinische Symptome TgAA-pos. Hunde Einsendungen Hypothyreote Hunde Klinische Symptome T3AA = Autoantikörper gegen T3, T4AA = Autoantikörper gegen T4, TgAA = Autoantikörper gegen Thyreoglobulin, - = nicht untersucht, * = Einsendungen von Serumproben hypothyreoseverdächtiger Hunde in einem bestimmten Zeitraum in ein endokrinologisches Labor. Bei 287948 Hunden mit klinischen Anzeichen einer Hypothyreose haben Nachreiner et al. (2002) in 18135 (6,3 %) Serumproben positive THAA-Ergebnisse dokumentieren können. Zu den Rassen mit der höchsten THAA-Prävalenz in dieser Studie gehörten Pointer, English Setter und English Pointer, Skye Terrier, Deutsch Drahthaar, Bobtails, Boxer, Malteser, Kuvasz und Petit Basset Griffon Vendeen. Die meisten Hunde mit THAA waren zwischen zwei und vier Jahren alt (Nachreiner et al. 2002). Die aktuellsten Ergebnisse für das Vorkommen von T3AA und T4AA sind von Patzl und Möstl (2003) veröffentlicht worden. In dieser Studie wurde zwischen Hunden unterschieden, die sowohl klinische Symptome aufwiesen und anhand einer niedrigen TT4-Konzentration und einer erhöhten TSH-Konzentration als hypothyreot eingestuft wurden, als auch Hunden, die zwar klinische Symptome zeigten (vor allem Lethargie, Adipositas, Hyperlipädemie, dermatologische Symptome und Bradykardie) aber biochemisch kein Nachweis einer Hypothyreose festgestellt werden konnte. Literatur 25 Bei diesen, mittels klinischer Symptome als hypothyreot eingestuften Hunden, konnten signifikant mehr TgAA und THAA nachgewiesen werden, als bei Hunden mit anderen Erkrankungen und gesunden Tieren. Unter 47 anderweitig erkrankten Hunden wiesen Patzl und Möstl (2003) bei drei Hunden T3AA und unter 186 gesunden Hunden bei fünf Hunden T3AA und bei einem Hund T4AA nach. Bei den gesunden Hunden handelte es sich vor allem um Hunde der Rassen Beagle und Rottweiler. Beagle zählen zu denen, für die Entwicklung einer Hypothyreose, prädisponierten Rassen (Feldman und Nelson 2004). T3AA waren bei hypothyreoten Hunden häufiger anzutreffen als T4AA (Graham et al. 2001; Nachreiner et al. 2002). Thacker et al. (1992) zeigten, dass TgAA signifikant häufiger in Serumproben mit niedrigen TT3- bzw. TT4-Werten auftreten. Allerdings konnte dieser signifikante Zusammenhang von den Autoren nicht nachgewiesen werden, wenn man Proben betrachtete, die T3AA und T4AA positiv waren. Dies führten Thacker und Mitarbeiter auf eine Interferenz der Autoantikörper in dem verwendeten Immunoassay zur Messung der Hormonkonzentrationen zurück. Der Nachweis von THAA im Serum von Hunden deutet auf einen pathologischen Prozess der Schilddrüse hin, ließ aber nach Feldman und Nelson (2004) keine Aussage über die Schwere oder Ausdehnung einer entzündlichen Reaktion in der Schilddrüse zu. Weder die Progressivität des Krankheitsgeschehens, noch der funktionelle Status der Schilddrüse konnte, laut Feldman und Nelson (2004) mit Hilfe des Nachweises von THAA eingeschätzt werden. Im Gegensatz dazu fanden Gaschen et al. (1993) T3AA vornehmlich in Serumproben mit einem hohen TgAA-Titer. Laut Feldman und Nelson (2004) diente der Nachweis von THAA der Sicherung der Diagnose AIT und muss im Zusammenhang mit der Klinik des Tieres und gemeinsam mit anderen Laborergebnissen beurteilt werden. Die Bedeutung der Bestimmung von THAA lag, nach Meinung mehrerer Autoren, vor allem in der möglichen Beeinflussung von Immunoassays, die zur Messung der TT4oder T3-Konzentration verwendet wurden (Heyma und Harrison 1986; Kemppainen et al. 1996; Rajatanavin et al. 1989; Feldman und Nelson 2004). 26 Literatur Young et al. (1985) untersuchten 6000 Serumproben auf das Vorhandensein von T3AA. 18 dieser Serumproben wiesen einen sogenannten. „T3-bindenden Faktor“ auf. In diesen Serumproben beobachteten die Autoren eine deutlich hohe T3-Konzentration (>500 ng/dl) und kamen zu dem Schluss, dass eine Interferenz des „T3-bindenden Faktors“ mit dem verwendeten Immunoassay zu falsch hohen T3-Konzentrationen führte. Später konnte gezeigt werden, dass es sich bei dem „T3bindenden Faktor“ um T3AA handelte, die bei der Bestimmung der TT3-Konzentration im Serum von Hunden zu falsch hohen Werten führten (Young et al. 1991). Kemppainen et al. (1996) untersuchten einen Golden Retriever mit klinischen Anzeichen einer Hypothyreose, dessen TT3-, TT4- und fT4-Werte „scheinbar“ hoch waren. Die Ermittlung des fT4-Wertes durch Gleichgewichtsdialyse ergab jedoch eine sehr niedrige fT4-Konzentration. Bei diesem Hund lagen T3AA und T4AA vor. Diese erschwerten, so Kemppainen et al. (1996), die diagnostische Beurteilung der Hypothyreose bei diesem Patienten. Bei Hunden mit THAA, die mit L-Thyroxin substituiert wurden, war eine routinemäßige Substitutionskontrolle der TT4-Konzentration laut Ferguson (1994) schwierig, da weiterhin T4AA im Serum persistierten und zu falschen Ergebnissen im Immunoassay führten. Beim Menschen konnte in einer Studie gezeigt werden, dass es unter Substitutionstherapie zu einem Anstieg der Anzahl an T4AA-positiven Patienten kam (Biukovic et al. 1993). Dieser Anstieg an T4AA-positiven Patienten war laut Biukovic et al. (1993) ohne statistische Signifikanz. Literatur In mehreren 27 humanmedizinischen Studien über THAA sind auch die Affinitätskonstanten von T3AA bestimmt worden. Sie lagen je nach Literaturstelle zwischen KA = 4,1 × 108 – 9,7 × 109 L/mol (Wu und Green 1976; Beck-Peccoz et al. 1983; Heyma und Harrison 1986; Muratsugu et al. 1988). Beck-Peccoz et al. (1983) stellten eine Bindungskapazität der Autoantikörper zwischen 1,1 ng/ml und 2,1 ng/ml Serum fest. In einer Studie wurde die im Serum von Hunden vorkommende mittlere Affinitätskonstante für T3AA ermittelt. Diese lag bei 2,24 ± 1,78 × 1010 L/mol. Die mittlere Bindungskapazität der T3AA betrug 639,3 ± 666,5 ng/dl. Weiterhin wurde die Kreuzreaktivität von T3AA und T4AA untersucht. Diese betrug weniger als 1 % (Young et al. 1988). 2.3.3 Thyroxin-Peroxidase Autoantikörper Die in der Schilddrüse spezifisch vorkommende Peroxidase (Thyroid-Peroxidase, TPO) ist ein transmembranes Protein mit Häm als prosthetische Gruppe. Das Enzym liegt als Dimer an der apikalen Oberfläche der Schilddrüsenfollikelzellen (Skopek et al. 2006). Die TPO hat eine zentrale Bedeutung bei der Biosynthese der Schilddrüsenhormone. Nach aktivem Transport von Jodid in die Follikelzelle wird dieses aufgenommene Jodid durch die TPO zu Jod oxidiert, welches Tyrosinreste des Thyreoglobulins jodiert. Zudem katalysiert die TPO zweier Jod-Thyrosylreste zu T3 bzw. T4 (Skopek et al. 2006). 28 Literatur Beim Menschen spielt die TPO, neben dem Thyreoglobulin als Autoantigen, eine bedeutende Rolle. Es konnte gezeigt werden, dass die TPO die Bildung von hoch affinen IgG-Antikörpern und TPO-spezifischen T-Zellen bewirkt. Diese infiltrieren die Schilddrüse und zerstören das thyoidale Gewebe (McLachan und Rapoport 2007). Bei Mäusen konnte durch die Immunisierung mit porciner-TPO eine Thyreoiditis induziert werden (Kotani und Ohtaki 1990). Beim Hund sind bisher wenige Studien zum Nachweis von Thyroxinperoxidase-Autoantikörpern (TPOAA) veröffentlicht worden. 1984 untersuchten Haines et al. hypothyreote Hunde auf das Vorhandensein von Autoantikörpern gegen Antigene der Schilddrüse und fanden bei 29 % der Hunde TPOAA. Thacker et al. (1995) untersuchten zehn Serumproben auf TPOAA mit einem ELISA und 50 Serumproben mit einer Immunoblottechnik. Bei keinem der von Thacker et al. (1995) untersuchten Hunde konnten TPOAA nachgewiesen werden und die Autoren folgerten daraus, dass eine andere Pathogenese für die AIT beim Hund, im Vergleich zum Menschen, die Ursache dafür sein könne. In einer aktuellen Studie von Skopek et al. (2006) sind 365 Serumproben von hypothyreoten Hunden untersucht worden. Der Nachweis der Autoantikörper gelang mit einem Immunoblot. Bei 33 Hunden (17 %) konnten TPOAA nachgewiesen werden. Allen diesen TPOAA-positiven Hunden war gemeinsam, dass sie auch TgAA aufwiesen. Inwieweit der Nachweis von TPOAA als früher diagnostischer Indikator für eine Hypothyreose dienen könnte, müsse so Skopek et al. (2006), in weiteren Studien überprüft werden. Literatur 2.4 2.4.1 29 Immunoassays Einführung Als Immunoassays werden Nachweismethoden bezeichnet, deren Grundprinzip auf der Antigen-Antikörper-Reaktion beruht und entweder zum Nachweis von spezifischem Antigen (AG) oder Antikörpern (AK) Verwendung finden. Bei den Immunoassays unterscheidet man direkte und indirekte Testsysteme. In direkten Nachweismethoden ist bereits der AK gegen das gesuchte AG markiert. Bei indirekten Assays erfolgt der Nachweis über einen sekundären AK, der seinerseits gegen den spezifischen AK gerichtet ist (Raem und Rauch 2007). Weiterhin unterscheidet man kompetitive und nicht kompetitive Immunoassays. Bei kompetitiven Assays konkurriert das zu bestimmende AG mit einem markierten AG. Die Analytkonzentration ist umgekehrt proportional zu dem markierten AG. Im nicht kompetitiven Test bindet ein spezifischer AK das gesuchte AG und ein zweiter Anti-Immunglobulin-AK ist markiert. Das in dem Testsytem gemessene Signal ist proportional zu dem gebundenen Analyten (Raem und Rauch 2007). Um an AK gebundenes markiertes und nicht markiertes AG zu trennen, gibt es unterschiedliche Möglichkeiten. Bei einem so genannten Festphasen-Test („solid phase“ Assays) ist der AK an einer Kunststoffoberfläche gebunden (Kavitäten von Mikrotiterplatten oder Kunststoffkugeln). Eine andere Trennmöglichkeit zwischen gebundenem und ungebundenem AG, stellt die Trennung mit Aktivkohle dar. Die quantitative Bestimmung der AG-AK-Bindung kann mit Hilfe von radioaktiven Isotopen erfolgen (Radioimmunoassay, RIA). Im RIA wird eine bekannte Menge radioaktiv markiertes Antigen eingesetzt. Isotope, die häufig für die Markierung verwendet werden, sind 125 I und 3H. Laut Feldman und Nelson (2004) ist der RIA für die Messung der TT4-Konzentration der „Goldstandard“ und allgemein als Referenzmethode anerkannt. 30 Literatur Beim EIA wird durch die enzymatische Umsetzung entweder ein Farbstoff quantifiziert (ELISA) oder nach Umsetzung eines chemilumineszierenden Moleküls Licht gemessen (Chemilumineszenzassay, CIA). Grundlage der CIA’s sind chemische Substanzen, die durch enzymatische Umsetzung Licht emittieren. Vorteil der CIA’s ist laut Kricka (1991) eine hohe Sensitivität, Schnelligkeit der Messung und ungefährliche Reagenzien sowie einfache Handhabung. 2.4.2 Interferenzen in Immunoassays Eine Interferenz in dem hier verstandenen Sinne bedeutet den Effekt einer Substanz, die im analytischen System präsent ist und eine Abweichung des gemessenen Wertes vom wahren Wert erzeugt. Die Interferenz im Immunoassay kann vom Analyten abhängen oder vom Analyten unabhängig sein (Selby 1999). Die Prävalenz für Immunoassay-Interferenzen lag, abhängig von Assay und untersuchtem Analyten, zwischen 0,05 % – >6 % (Tate und Ward 2004). Polyklonale Test-AK konnten laut Selby (1999) außer dem AG auch Fragmente oder Metabolite in der Serumprobe binden und führten so zu falschen Ergebnissen. Untersuchungen über heterophile AK in der zu untersuchenden Serumprobe zeigten, dass diese ebenfalls zu Interferenzen in Immunoassays führten. Hetrophile AK sind häufig antiisotypisch, also gegen die konstante Region eines Immunglobulins gerichtet. Falsch positive Werte ergaben sich, wenn die heterophilen AK (wie das zu bestimmende AG) an den im Immunoassay eingesetzten AK banden, bzw. an den markierten AK. Blockierten sie die Signalantikörper und konnte das gesuchte AG in Folge nicht binden, ergaben sich falsch niedrige Werte. Die Spezifität der Testmethode wurde dadurch verringert (Tate und Ward 2004). Für die TSH-Messung zeigten Tate und Ward (2004), dass 10 von 249 untersuchten Serumproben aufgrund einer Interferenz mit heterophilen AK, falsch hohe TSH-Werte aufwiesen. Ebenso fiel der Nachweis von TgAA bei zwei von 19 untersuchten Serumproben durch heterophile AK falsch positiv aus. Hormon-bindende Proteine, wie beispielsweise das Cortisol-bindende Protein, konnten nach Tate und Ward (2004) die freie Analytenkonzentration durch Bindung von Cortisol erniedrigen. Literatur 31 Ergeben sich bei der Interpretation von Laborergebnissen im Zusammenhang mit der Klinik Diskrepanzen, sollte nach Selby (1999) an eine Interferenz im Immunoassay gedacht werden. Bei der Beurteilung von TT4- und TSH-Werten besteht nach Selby (1999) die Möglichkeit, physiologisch in Zusammenhang stehende Werte zu interpretieren. Interferenzen Normalwerten Zusätzlich können geben, wozu oder auch Vergleichsmessungen mit unplausible deutliche Abweichungen gemittelten anderen Testergebnisse von pathologischen Analysemethoden, Hinweise auf durchschnittlichen Werten vor zählen. allem mit Referenzmethoden, können signifikante Unterschiede ergeben und hinweisend für eine Interferenz sein (Selby 1999). 2.4.3 Einfluss von THAA auf die TT4- und T3-Konzentrationsbestimmung im Serum Die Fehlmessung der TT4- bzw. T3-Konzentration durch Autoantikörper im RIA ist bekannt. Vor allem in der humanmedizinischen Literatur finden sich viele Fallberichte über falsch hohe oder falsch niedrige T4- oder T3-Werte, die im Zusammenhang mit THAA interpretiert wurden (Beckett et al. 1983; Herrmann et al. 1976; Heyma und Harrison 1986; John et al. 1990; Pryds et al. 1987). Nachreiner et al. (2002) bestimmten in 287948 Serumproben von Hunden mit Verdacht auf eine Hypothyreose T3AA und T4AA. T3AA führten in dem, von den Autoren verwendeten RIA (coat-a-count RIA, DSL), zu falsch erhöhten T3-Werten und T4AA zu falsch erhöhten T4-Werten. Bei 57 von 1000 Hunden mit Hypothyreose kam es, laut Nachreiner et al. (2002), zu falsch hohen T3-Werten bei positivem T3AA-Nachweis. Zu falsch erhöhten TT4-Konzentrationen, die im Zusammenhang mit T4AA gemessen wurden, kam es bei den Untersuchungen von Nachreiner et al. (2004) bei 17 von 1000 hypothyreoten Hunden. Bei einem Golden Retriever konnte eine sehr hohe T3-Konzentration, die mittels eines „solid-phase“ Immunoassays bestimmt wurde, mit T3AA in Verbindung gebracht werden (Chastain et al. 1989). 32 Literatur Gaschen und Mitarbeiter (1993) fanden eine direkte lineare Korrelation zwischen der T3AA-Konzentration und der scheinbaren T3-Konzentration im Serum von Hunden. Serumproben mit wenig T3AA hatten signifikant niedrigere T3-Konzentrationen als solche mit hohen T3AA-Titern (Gaschen et al. 1993). Die Interferenz der T3AA und T4AA im RIA, bei dem spezifische AK gegen T3 oder T4 an der Wand des Röhrchens immobilisiert sind, kann man sich laut Feldman und Nelson (2004) theoretisch wie folgt vorstellen: Radioaktiv markiertes und natives Hormon konkurrieren um die konstante Anzahl Antikörperbindungsstellen. Im Serum vorkommende Autoantikörper binden ihrerseits einen Teil des Radioliganden. Im Gammazähler gemessen wird nur der nach einem Dekantierungsschritt verbleibende Anteil an Radioaktivität. Ein Teil des radioaktiv markierten T3 oder T4 wird an Autoantikörper gebunden und dekantiert. Da die Hormonkonzentration im Serum umgekehrt proportional zu der ermittelten Radioaktivität ist, erhält man hier falsch hohe Hormonwerte. Je nach Trennungsmethodik des Testes ist auch der Fall denkbar, dass durch Zugabe von Aktivkohle der ungebundene Anteil des Radioliganden an der Kohle absorbiert wird. Der Anteil an AK und Autoantikörper gebundene radioaktiv markierte Anteil Hormone wird im Gammazähler gemessen und führt zu falsch niedrigen Werten (Young et al. 1985). Nach Feldman und Nelson (2004) sind ELISA weniger störanfällig für eine Autoantikörperinterferenz. Als Ursache dafür geben die Autoren an, dass in RIA’s meist polyklonale AK eingesetzt werden. Im Gegensatz dazu sind die, in ELISA verwendeten AK, oftmals spezifische monoklonale AK mit hohen Affinitätskonstanten, die vermutlich wenig Kreuzreaktivität mit Autoantikörpern haben (Feldman und Nelson 2004). Material und Methoden 3 3.1 3.1.1 33 Material und Methoden Material Patienten Die Bestimmung von T3AA und T4AA wurde in Serumproben, die zu diagnostischen Zwecken in die Endokrinologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover eingesandt wurden durchgeführt. In dem Zeitraum von Januar 2006 bis August 2006 konnten insgesamt 1339 Serumproben von Hunden untersucht werden. Die untersuchten Hunde, die einen klinischen Verdacht auf eine Hypothyreose hatten, wurden anhand der TT4- und TSH-Wertekombination in vier Gruppe eingeteilt (Tabelle 3). Als Grundlage der Gruppeneinteilung wurden folgende Referenzbereiche als Grundlage verwendet (Feldman und Nelson 2004; Hoppen et al. 1997): Tabelle 3. Normbereich: TT4 1,7 – 4,5 µg/dl Graubereich: TT4 1,1 – 1,6 µg/dl Normbereich: TSH <0,5 ng/ml Verteilung von klinisch hypothyreoten Hunden auf Grundlage der TT4und TSH-Konzentration in die Gruppen: „hypothyreot“, „fraglich hypothyreot (erhöhte TSH-Konz.)“, „fraglich hypothyreot (erniedrigte TT4-Konz.)“ und „euthyreot“ Gruppe 1 hypothyreot 2 fraglich hypothyreot (erhöhte TSH-Konz.) 3 fraglich hypothyreot (erniedrigte TT4-Konz.) 4 euthyreot TT4-Wert (µg/dl) TSH-Wert (ng/ml) Anzahl der Hunde <1,1 >0,5 149 >1,1 >0,5 110 <1,7 <0,5 691 >1,7 <0,5 138 TT4 = Gesamtthyroxinkonzentration, TSH = Thyroidea stimulierendes Hormon 34 Material und Methoden Bei einigen der untersuchten Hunde wurde nicht nur die TT4- und TSH-Messung zur Abklärung des Vorliegens einer Hypothyreose durchgeführt, sondern ein TRH-Stimulationstest durchgeführt. Nach Entnahme einer Basalblutprobe bei den hypothyreoseverdächtigen Hunden, wurde von den behandelnden Tierärzten jeweils 0,01 mg/kg TRH i.v. injiziert. Nach 20 Minuten sowie 120 Minuten und 180 Minuten nach der TRH-Injektion Endokrinologischen Labor erfolgte der jeweils eine Tierärztlichen weitere Blutentnahme. Hochschule wurde in Im der Basalblutprobe die TT4- und TSH-Konzentration bestimmt. Zwanzig Minuten nach TRH-Injektion wurde in der eingesandten Serumprobe der TSH-Wert gemessen. Nach 120 Minuten und 180 Minuten wurde erneut die TT4-Konzentration in der Serumprobe bestimmt. Zur Auswertung in dieser Arbeit gelangten sechs TRH-Teste, die bei autoantikörperpositiven Hunden durchgeführt wurden. 3.1.1.1 Hypothyreote Hunde (Gruppe 1) Aufgrund einer TT4-Konzentration von <1,1 µg/dl und einem TSH-Wert >0,5 ng/ml wurden 149 Hunde in die Gruppe „hypothyreot“ eingeteilt. Bei diesen Hunden lagen klinische Symptome vor, die auf eine Hypothyreose hingedeutet haben. Das Alter dieser Hunde lag zwischen 2 Jahren und 15½ Jahre (gemitteltes Alter: 8 Jahre). Am häufigsten waren Mischlinge (n = 30) in Gruppe 1 vertreten, Riesenschnauzer (n = 11), Hovawart (n = 9) und Deutscher Schäferhund (n = 8) (Tabelle 17, Tabellenanhang). 3.1.1.2 Fraglich hypothyreote Hunde mit erhöhter TSH-Konzentration (Gruppe 2) Patienten in dieser Gruppe zeigten eine normale TT4-Konzentration (>1,7 µg/dl) (n = 82) bzw. TT4 im unteren Grenzbereich der Norm (>1,1 µg/dl – 1,6 µg/dl) (n = 28). TSH lag bei diesen Hunden oberhalb von 0,5 ng/ml. In dieser Gruppe wurden insgesamt 110 Hunde auf Autoantikörper untersucht. Das durchschnittliche Alter lag bei 7 Jahren (½ Jahr – 15 Jahre). Mischlinge (n = 11) und Golden Retriever (n = 9) waren die am häufigsten vertretenen Rassen aller untersuchten Hunde in dieser Gruppe (Tabelle 18, Tabellenanhang). Material und Methoden 35 3.1.1.3 Fraglich hypothyreote Hunde mit erniedrigtem TT4 (Gruppe 3) In dieser Gruppe befanden sich Hunde, bei denen die TT4-Konzentration zwischen 1,1 µg/dl und 1,7 µg/dl lag, TSH aber im Referenzbereich von <0,5 ng/ml (Gruppe 3a) bzw. TT4 erniedrigt war (<1,1 µg/dl) und TSH im Referenzbereich lag (Gruppe 3b). In der gesamten Gruppe 3 konnten 691 Hunde untersucht werden. Das mittlere Alter betrug 7 Jahre, wobei der jüngste erfasste Hund ½ Jahr alt war und der älteste 17 Jahre). Mischlinge (n = 120), Golden Retriever (n = 113), Deutsche Schäferhunde (n = 54) und Labrador Retriever (n = 45) waren in Gruppe 3 am häufigsten vertreten (Tabelle 19, Tabellenanhang). 3.1.1.4 Euthyreote Hunde (Gruppe 4) In Gruppe 4 wurden 138 Hunde zusammengefasst, bei denen der behandelnde Tierarzt aufgrund klinischer Symptome einen Verdacht auf eine Hypothyreose hatte. Die ermittelten Werte für TT4 (1,7 – 4,5 µg/dl) und TSH (<0,5 ng/ml) lagen bei diesen Hunden im Referenzbereich und sprachen für eine euthyreote Stoffwechsellage. Der jüngste Hund war ein Jahr, der älteste zwölf Jahre alt. Das durchschnittliche Alter in dieser Gruppe lag bei sechs Jahren. Mischlinge (n = 26), Labrador Retriever (n = 15), sowie Golden Retriever und Hovawart (n = 8) wurden als häufigste Rasse beobachtet (Tabelle 20, Tabellenanhang) 36 Material und Methoden 3.1.1.5 Substituierte Hunde (Gruppe 5) In Gruppe 5 wurden 141 Hunde eingeteilt. Bei diesen Tieren war aufgrund des klinischen Erscheinungsbildes und entsprechender TT4- und TSH-Wertekombination vom behandelnden Tierarzt bereits eine Substitutionstherapie mit Schilddrüsenhormonen eingeleitet worden. In dieser Gruppe waren am häufigsten Mischlinge (n = 28), Golden Retriever (n = 25) und Hovawarte (n = 8) vertreten (Tabelle 21, Tabellenanhang). Zusätzlich konnten bei fünf dieser Hunde auch noch zwei bis drei weitere Kontrolluntersuchungen der TT4-Konzentration unter Substitutionstherapie durchgeführt werden. Der erste Patient (Patient 1) war eine Rhodesian Ridgebackhündin, bei der im Februar 2005 eine Hypothyreose diagnostiziert wurde. Die TT4-Konzentration dieser Hündin lag zu dem Zeitpunkt bei 0,11 µg/dl und TSH 3,8 ng/ml. Zum Zeitpunkt der Diagnosestellung wurden keine Autoantikörper untersucht. Nach zwei Monaten Substitutionstherapie mit L-Thyroxin konnten noch T3AA nachgewiesen werden. Nach fünf bzw. neun Monaten wurden Autoantikörper bestimmt. Bei dem zweiten Patient (2) handelte es sich um einen sieben Jahre alten, kastrierten Briardrüden. Im Mai 2005 hatte dieser Hund einen TT4-Wert von 0,17 µg/dl. TSH lag bei 1,2 ng/ml. Zu diesem Zeitpunkt konnten weder T4AA noch T3AA bei dem Hund nachgewiesen werden. Einen Monat später wurde von diesem Hund ein TRH-Stimulationstest durchgeführt. Der Basalthyroxinwert lag bei 0,17 µg/dl und TSH 1,5 ng/ml. TSH ließ sich nach zwanzig Minuten auf 1,8 ng/ml stimulieren. Thyroxin ließ sich nicht stimulieren (0,2 µg/dl, 0,1 µg/dl). In dieser Folgeprobe wurden Autoantikörper untersucht. Material und Methoden 37 Weiterhin wurden T4AA-Werte bei zwei Hunden nach einigen Monaten wiederholt bestimmt. Bei Patient 3, einem drei Jahre alten Golden Retriever Rüden konnte bei der ersten Autoantikörperbestimmung T4AA = 35 %-Bindung und T3AA = 81 %-Bindung nachgewiesen werden. TT4 lag bei 0,05 µg/dl und TSH bei 1,5 g/ml. Eine Wiederholungsmessung des Autoantikörperstatus konnte nach sechs Monaten unter Substitutionstherapie mit L-Thyroxin durchgeführt werden. Bei Patient 4, einem acht Jahre alten Cairn Terrier Rüden mit THAA (T4AA = 20 % und T3AA = 10 %, TT4 = 1,3 µg/dl, TSH = 0,09 ng/ml), konnte ebenfalls nach fünf Monaten der Autoantikörperstatus wiederholt überprüft werden. 3.1.1.6 Klinisch gesunde, euthyreote Hunde (Gruppe 6) Aus demselben Zeitraum wurden 110 Proben klinisch gesunder Hunde auf T3AA und T4AA untersucht. Die Serumproben wurden zur Abklärung anderer Fragestellungen in die Endokrinologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover eingesandt. Es handelte sich vor allem um gesunde Hündinnen, bei denen Progesteron zur Deckzeitpunktbestimmung ermittelt wurde. 38 Material und Methoden 3.1.1.7 HPLC Proben Bei fünf gesunden Hunden und sechs Serumproben mit T4AA wurde die TT4-Konzentration mittels HPLC gemessen. Die HPLC wurde nur bei einigen Serumproben durchgeführt, da für die Probenaufarbeitung mit anschließender Extraktion ein Serumvolumen von 1 ml benötigt wurde. Bei drei T4AA-positiven Proben der Arbeitsgruppe von Prof. Nachreiner, USA stand ausreichend Serum zur Verfügung. In den Proben wurden folgende TT4-Werte (CIA) und die %-Bindung zuvor ermittelt: 0,05 µg/dl mit T4AA 24 %-Bindung, 0,47 µg/dl mit T4AA 36 %-Bindung und 0,05 µg/dl mit T4AA 23 %-Bindung. Außerdem wurden zwei autoantikörperpositive Proben aus je einem TRH-Test (TT4 im CIA 1,7 µg/dl mit 21 %-Bindung 0,13 µg/dl mit 22 %-Bindung) und das im radiometrischen Test auf Autoantikörper verwendete gemischte Kontrollserum zur TT4 Messung mit der HPLC herangezogen (TT4 2,1 mit 26 %-Bindung). 3.2 3.2.1 Methoden Endokrinologische Untersuchungen 3.2.1.1 Chemilumineszenzimmunoassay Die TT4- und TSH-Messungen wurden mit dem Immulite®-Testsystem (Immulite® DPC Biermann, Bad Nauheim) durchgeführt (Tabelle 4). Hierbei handelt es sich um einen Chemilumineszenzimmunoassay (CIA). Das Testprinzip beruht auf einer AG-AK-Reaktion, die mit Hilfe einer enzymatischen Substratumsetzung zu einem lumineszierenden Produkt quantifiziert wird. Mit alkalischer Phosphatase markiertes Antigen (T4) oder markierter Antikörper (TSH) und die Serumprobe wurde von dem Analyseautomaten in ein Reaktionsgefäß pipettiert. In diesem befand sich eine freibewegliche Kugel, die mit AK gegen das zu bestimmende Hormon beschichtet war. Reagenz und Probe wurden mit dem immobilisierten AK im Reaktionsgefäß bei 37 °C 30 – 60 Min unter vorsichtigem Schütteln inkubiert. Material und Methoden 39 Nach einem Waschschritt wurde das Substrat Adamantyl-1, 2-Dioxetanarylphosphat [ADPP] hinzu gegeben. Es handelt sich um ein sensitives Substrat für alkalische Phosphatase. Durch enzymatische Abspaltung einer Phosphatgruppe durch das Enzym entstand ein unstabiles Anion [Adamantyldioxetan], dessen Zerfall zu einer anhaltenden Lichtemission führte. Hierdurch konnten mehrere Messungen hintereinander im Luminometer durchgeführt werden. Ein Mittelwert aus diesen Luminometermesswerten wurde mit einem Kurvenanpassungswert korrigiert und aus einer Masterkurve das Ergebnis berechnet. Die Masterkurve ermittelt der Hersteller durch Messung von Kalibrationsstandards in einem Mastergerät für jede Charge. Der sogenannte Kurvenanpassungswert wurde durch Kalibration des hier verwendeten Gerätes ermittelt. 3.2.1.2 Bestimmung von Gesamtthyroxin (TT4) Für Haptene wie Thyroxin erfolgte die Bestimmung mit dem Immulite® kompetitiv. Auf der Kugel des Reaktionsgefäßes war ein monoklonaler AK aus der Maus gegen T4 gebunden. Das Reagenz enthielt T4, markiert mit alkalischer Phosphatase. Um keine sterische Behinderung der AG-AK-Bindung zu verursachen, wurde Thyroxin vom Hersteller durch einen „Abstandshalter“ an das Enzym gebunden. T4 aus der Serumprobe konkurrierte mit dem markierten T4 um eine konstante Anzahl AK-Bindungsstellen auf der Kugel. Die Inkubationszeit betrug 30 Minuten. Je mehr T4 in der Serumprobe vorhanden war, desto weniger markiertes Thyroxin band an den AK auf der Kugel und desto weniger Lumineszenz entstand. Die Konzentration an Hormon in der Serumprobe ist umgekehrt proportional zu der Menge des lumineszierenden Adamantyldioxetan. 40 Material und Methoden 3.2.1.3 Bestimmung von caninem TSH Für größere Moleküle wurde eine Doppelantikörpermethode verwendet. Die Kugel war mit einem monoklonalen AK gegen TSH beschichtet. Während einer ersten Inkubationszeit konnte canines TSH aus der Serumprobe an die AK auf der Kugel binden. In einer weiteren Inkubation banden polyklonale AK gegen TSH aus dem Reagenz an das canine TSH, welches sich am ersten AK gebunden auf der Kugel befand. Der zweite AK war mit alkalischer Phosphatase markiert. Nach Substratumsetzung war die ermittelte Lichtemission proportional zu der Konzentration an TSH im Serum. 3.2.2 TT4-und TT3-Radioimmunoassay Die Vergleichsmessungen mit dem RIA von 16 autoantikörperpositiven Tieren und 31 Serumproben gesunder Tiere, wurden mit dem Thyroxine (T4) RIA DSL-3200 und dem Triiodothyronine (T3) RIA DSL-3100 (Diagnostic Systems Laboratories, Inc.; Western Texas USA) durchgeführt (Tabelle 4). Der T3-RIA ist für den Hund validiert (Herstellerangabe). Bei dem T4-RIA handelt es sich um einen für humanes T4 entwickelten RIA, der laut Hersteller ebenfalls beim Hund funktioniert. Bei dem T4-RIA war der AK gegen T4 an die Wand des Röhrchens gebunden. Nach Zugabe von 25 µl Serumprobe, sowie Standards und Kontrollserum wurden 200 µl mit 125 I markiertes T4-Reagenz in die Röhrchen gegeben. In der Inkubationszeit von einer Stunde bei Raumtemperatur konkurrierten nicht markiertes und markiertes AG um die immobilisierten AK. Die Trennung von freiem und gebundenem AG wurde durch Dekantieren des Überstandes und einem Waschschritt gewährleistet. Die an den Antikörper gebundene Menge des radioaktiv markierten T4 war umgekehrt proportional zu der Menge an Hormon in der Serumprobe. Material und Methoden 41 Im T3-RIA waren die Röhrchen mit Ziegen-anti-Maus-Gammaglobulin beschichtet. In diesem Test wurden 50 µl der Probe eingesetzt. Nach Zugabe von ebenfalls 200 µl 125 I-T3 Reagens und einem monoklonalen T3-AK aus der Maus, konkurrierte das T3 aus dem Serum mit 125 I-T3 um eine konstante Anzahl Anti-T3-AK. Die monoklonalen T3-AK aus der Maus banden an die AK gegen Maus-Immunglobulin an der Wand des Röhrchens. Durch Dekantieren des Überstandes nach der Inkubation und einem Waschschritt wurde nur gebundenes markiertes Antigen im Gammazähler gemessen. Die an den Antikörper gebundene Menge T3 war ebenfalls umgekehrt proportional zu der Konzentration des Hormons in der Probe. Die Auswertung der Konzentration erfolgte über eine mitgeführte Standardreihe. Die entsprechenden T4-Standards waren ebenfalls im Lieferumfang enthalten. Die Konzentrationen der T4-Standards lagen bei 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 25,0 und 50,0 µg/dl in Serum, die der T3-Standardkurve bei 25,0; 50,0; 100,0; 250,0; 500,0; 1000,0 ng/dl in Humanserum. Tabelle 4. Herstellerangaben des Chemilumineszenzimmunoassays und Radioimmunoassays zu Nachweisgrenzen und Intra- bzw. InterassayVariationskoeffizienten der Bestimmung von T4, T3 und caninem TSH Methode/ Hormon Hersteller/ Produkt CIA/ TT4 CIA/ TSH RIA/ T4 RIA/ T3 DPC */ LKCT5 DPC */ LKKT5 DSL **/ DSL-3200 DSL **/ DSL-3100 Untere Nachweisgrenze Obere Nachweisgrenze Intraassay VK (%) Interassay VK (%) 0,05 (µg/dl) 15,0 (µg/dl) 3,9 – 10,8 5,2 – 13,8 0,01 (ng/ml) 12 (ng/ml) 3,8 – 5,0 6,3 – 8,2 2,9 – 5,1 7,1 – 7,4 5,0 – 6,5 4,2 – 6,0 0,4 (µg/dl) 4,3 (ng/dl) - * = DPC Biermann Bad Nauheim, Angabe für die Messung von caninem T4, ** = DSL (Diagnostic Systems Laboratories, Inc.; Western Texas USA), Angabe für die Messung von humanem T4, CIA = Chemilumineszenzimmunoassay, RIA = Radioimmunoassay, TT4 = Gesamtthyroxinkonzentration, TSH = Thyroidea stimulierendes Hormon, VK = Variationskoeffizient, - = keine Herstellerangabe 42 Material und Methoden 3.2.3 Bestimmung der TT4-Konzentration durch High-performance-liquid-Chromatographie Die Bestimmung von TT4 mit Hilfe von einer High-performance-liquid-chromatografie (HPLC) im Serum von Hunden wurde von Dr. M. Arndt durchgeführt (Arndt 2007). Die für die Probenaufarbeitung und die HPLC-Durchführung verwendeten Chemikalien wurden, soweit nicht anders beschrieben, wurden von der Firma Sigma Aldrich bezogen. 3.2.3.1 Probenaufarbeitung Die Aufarbeitung Deproteinierung der mit Serumproben anschließender zur HPLC-Messung umfasste flüssig-flüssig-Extraktion und eine einer Festphasenextraktion (Solid-Phase-Extraction, SPE) mit SPE-Kartuschen Strata-XC der Firma Phenomenex, Aschaffenburg. Die Deproteinierung wurde mit 50 % Trifluoressigsäure (TFA) durchgeführt. Danach erfolgte eine fünffache Extraktion mit Essigsäureethylester. Das Extrakt wurde in einer Vakuumzentrifuge (Hetovac VR1, High Technology of Scandinavia) bei 45 °C auf ca. 200 µl eingeengt. Nach Zugabe von 2 ml 20 % Methanol in 0,02 N Salzsäure konnte die Festphasen-Extraktion durchgeführt werden. Die SPE-Kartuschen wurden mit Methylenchlorid/2-Propanol/Methanol, Methanol und Salzsäure konditioniert. Nach Aufgeben der Proben schlossen sich vier Waschschritte mit Wasser, Salzsäure, Methanol und Methylenchlorid/2-Propanol/Methanol an. Eluiert wurde die Probe mit Methylenechlorid/2-Propanol/Methanol/25% Ammoniumhydroxid (35:30:30:5). Nach vorsichtigem Eindampfen unter Stickstoff wurde die Probe in der Vakuumzentrifuge komplett getrocknet und danach mit 100 µl 90 % Methanol resuspendiert. Die so aufgearbeitete Serumprobe konnte mit der HPLC gemessen werden. Material und Methoden 43 3.2.3.2 HPLC-Methode Die HPLC wurde mit der Shimadzu-Prominence-HPLC Anlage (Hersteller Shimadzu, Europa GmbH) und die Datenauswertung mit der Shimadzu LC Solution Software durchgeführt. Die dazu verwendete Säule war eine Jupiter 4 µ Proteo 90 Å der Firma Phenomenex. Als mobile Phase wurde ein Wasser-Acetonitril mit 0,025 % TFA [A] und Wasser-Acetonitril (20:80) mit 0,02 % TFA [B] Gemisch eingesetzt. 20 µl der resuspendierten Probe wurde auf die Säule gegeben. Für eine Minute wurde die HPLC-Säule mit Gemisch [A] gespült. Anschließend stieg der Gradient mit Gemisch [B] auf 44 % innerhalb von 50 Minuten. Der Gradient wurde bei einer Flussrate von 0,22 ml/min betrieben. Nach 42 Minuten eluierte T4 von der Säule und konnte mit einem UV-Detektor bei 228 nm detektiert werden. Für die Konzentrationsbestimmung wurden externe Standards (8 ng, 10 ng und 13 ng) verwendet. 3.3 3.3.1 Autoantikörper-Bestimmung Radiometrischer Test zum Nachweis von T3AA und T4AA Der verwendete radiometrische Test zur Bestimmung von mit T3 bzw. T4 kreuzreagierenden TgAA wurde von Nachreiner et al. (2002) beschrieben und ist als Routinetest etabliert. Das Prinzip beruht auf einer Bindung von radioaktiv markiertem T4 bzw. T3 an Autoantikörper im Serum. Der freie Anteil an radioaktiv markiertem Hormon wurde durch Aktivkohle absorbiert. Die Radioaktivität in der durch Zentrifugation sedimentierten Kohle wurde bestimmt. Banden Autoantikörper im Serum radioaktiv markiertes Hormon, war der Anteil der messbaren Radioaktivität in der Kohle verringert. Der Prozentsatz, um den die Gesamtbindung reduziert war, ist als Prozent Bindung durch Autoantikörper definiert (%-Bindung). 44 Material und Methoden 3.3.1.1 Materialien Soweit nicht anders erwähnt, wurden Chemikalien der Firma Sigma Aldrich eingesetzt. 125 I markiertes T4 und T3 125 I-Thyroxin: 100 µCi (3,7 MBq), Spezifische Aktivität 5700 µCi/µg Aktivität 3300 µCi/µg (210 MBq/µg) der Firma Perkin Elmer 125 I-Triiodthyronin: 100 µCi (3,7 MBq), Spezifische (122 MBq/µg) der Firma Perkin Elmer Proteinpuffer 13.92 g Dinatriumphosphat 2.76 g Natriumphosphat 8.6 g NaCl 3.8 g EDTA 2.5 g Gelatine (Fa. Becton Dickinson, USA) 0.2 g Natriumazid ad 1 L destilliertes Wasser Aktivkohle 13.92 g Dinatriumphosphat 2.76 g Natriumphosphat 8.6 g NaCl 3.8 g EDTA 0.2 g Natriumazid ad 1 L destilliertes Wasser und Zugabe von 30 g Aktivkohle Tracer Stammlösung 100 µCi (3,7 MBq) 125 I T4 bzw. 100 µCi (3,7 MBq) 125 I T3 in 5,0 mL 50 % Propylenglycol Gebrauchslösung 0,50 g 8-Anilino-1-Naphthalinsulfonsäure in 1 L Proteinpuffer und Zugabe von 2 mL 125I T4- bzw. 125I T3-Stammlösung Material und Methoden 45 3.3.1.2 Methodendurchführung Für 500 µl im Autoantikörpertest eingesetzten Tracer ergeben sich 0,02 µCi (entspricht 4pg 125 I-T4) bzw. 0,02 µCi 125 125 I-T3 (entspricht 6 pg I-T3) 125 I-T4 pro 100 µl Serumprobe. 8-Anilino-1-Naphthalensulfonsäure (ANS) wurde eingesetzt, um die Bindung des radioaktiv markierten T4 bzw. T3 an Transportproteine zu verhindern, damit eine Bindung an Immunglobuline erfolgen konnte. Es wurde 100 µl Serum in Röhrchen pipettiert. Bei jedem Testansatz wurde in ein Röhrchen nur Tracer gegeben. In diesem konnte die Gesamtradioaktivität („total counts“), die sich durch die Kohle absorbieren ließ, gemessen werden. Nach Zugabe von 500 µl 125 bei 4 °C 37 °C, dann bei I-Tracer inkubierte man den Testansatz für eine Stunde für eine weitere Stunde. Nach Zugabe von dextranbeschichteter Aktivkohle (4 °C) zu Serum und Tracer wurde der Ansatz 10 Minuten zentrifugiert und der Überstand dekantiert. Die Radioaktivität der Kohle wurde im Gamma Counter (1272 Clinigamma, LKB-Wallac, Finland) für eine Minute gemessen und gab den nicht an AK gebundenen Anteil 125 I-T4 bzw. 125 I-T3 wieder. Im „total counts“ Röhrchen wurde der gesamte Teil des Tracers von der Kohle gebunden und gab die Gesamtradioaktivität an. 125 I-T4 bzw. 125 I-T3, welches in 100 µl Serum an AK gebunden hat, reduziert die Menge 125I-T4 bzw. 125I-T3, die von der Aktivkohle adsorbiert wurde. Der Anteil, um den die Gesamtradioaktivität (100 %) des Tracers reduziert war, ist definiert als Bindung des Radioliganden durch Autoantikörper. Im Kohlerückstand wurde die gemessene Menge 125 I verringert. Das Autoantikörperergebnis wurde als %-Bindung ausgehend von der Gesamtradioaktivität angegeben: 46 Material und Methoden Die unspezifische Bindung des Tracers an Kohle wurde von Nachreiner et al. (2002) in einer umfangreichen Studie an 562060 Serumproben von Hunden festgelegt und für die vorliegende Arbeit übernommen. Laut Nachreiner et al. (2002) liegen T3AA im Serum vor, wenn ≥10 %-Bindung im Kohlerückstand vorliegt. Eine Probe ist T4AA positiv, wenn ≥20 %-Bindung in der Kohle zu messen ist. Als Kontrollen wurden zwei gemischte Kontrollseren angefertigt. Es handelte sich jeweils um eine T3AA- bzw. T4AA-negative Kontrolle und eine T3AA- bzw. T4AA-positive Kontrolle. Die dazu verwendeten T3AA- bzw. T4AA-positiven Proben waren aus dem Bestand der Arbeitsgruppe von Prof. Nachreiner, Michigan State University. Zur Bestimmung der Interassay-Präzision wurde an zwanzig Tagen jeweils die gleiche Kontrolle gemessen. Bei den Proben zur Ermittlung der Intraassay-Präzision handelte es sich ebenfalls um eigens gemischte autoantikörpernegative und autoantikörperpositive Seren aus dem Bestand der Arbeitsgruppe von Prof. Nachreiner, die zur Überprüfung der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zehnmal innerhalb einer Testroutine gemessen wurden. 3.4 Statistische Methoden Für die statistische Auswertung wurde das SAS 9.1. Statistikprogramm verwendet. Zum Vergleich der Signifikanzunterschiede der einzelnen Gruppen wurde ein Signifikanzniveau von p <0,05 gewählt und ein Chi-Quadrat Test durchgeführt. Die graphische Darstellung erfolgte mit Microsoft® Excel®, das Berechnen und Einzeichnen der Trendlinien wurde von dem Programm automatisch durchgeführt. Der Pearsonsche Korrelationskoeffizient bzw. das Bestimmtheitsmaß (R2) wurde ebenfalls mit Excel® errechet. Ergebnisse 4 4.1 47 Ergebnisse Validierung des radiometrischen Autoantikörpertests Die zehnfache Messung einer T3AA- und einer T4AA-positiven Kontrolle, des von Nachreiner et al. (2002) beschrieben radiometrische Testes, ergab eine gute Übereinstimmung. Für die T3AA-positive Kontrolle wurde ein Variationskoeffizient von 0,78 % ermittelt und für die T4AA-positive Kontrolle ein Variationskoeffizient von 3,26 %. Die Standardabweichung lag bei beiden Kontrollen unter 1 % (Tabelle 5). Tabelle 5. %-Bindung (%-Bdg.) einer T3AA- und einer T4AA-positiven Serumprobe zur Ermittlung der Intraassaypräzision des radiometrischen Autoantikörpertestes und errechnete Mittelwerte, Standardabweichungen und Variationskoeffizienten Messung Nr. T3AA-positiv (%-Bdg.) T4AA-positiv (%-Bdg.) 1 86 30 2 86 29 3 86 31 4 86 29 5 87 31 6 87 29 7 87 29 8 86 28 9 87 30 10 85 30 m (%-Bdg.) 86,3 29,6 Stab (%-Bdg.) 0,67 0,97 VK (%) 0,78 3,26 m = Mittelwert, Stab = Standardabweichung, VK = Variationskoeffizient, T3AA = Antikörper gegen T3, T4AA = Antikörper gegen T4 48 Ergebnisse Die Messung einer T3AA- und einer T4AA-positiven Kontrolle an zwanzig aufeinanderfolgenden Tagen ergab eine gute Interassay-Präzision. Die Standardabweichung lag für T3AA bei 4,5 %-Bindung und für T4AA bei nur 2,3 %-Bindung. Bei den negativen Kontrollen war der errechnete Variationskoeffizient sehr hoch. Dies liegt vor allem an jeweils zwei Messwerten, die sehr abweichen. Es wurde allerdings bei keiner Messung ein falsch positives Ergebnis erzielt (Tabelle 6). Ergebnisse Tabelle 6. 49 %-Bindung einer T3AA-positiven und -negativen, sowie einer T4AA-positiven und -negativen Kontrolle an 20 aufeinanderfolgenden Tagen zur Ermittlung der Interassaypräzision des radiometrischen Autoantikörpertestes, sowie errechnete Mittelwerte, Standardabweichungen und Variationskoeffizienten Negative Kontrolle Positive Kontrolle Tag T3AA (%-Bdg.) T4AA (%-Bdg.) T3AA (%-Bdg.) T4AA (%-Bdg.) 1 2 3 4 4 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 0 0 0 1 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 11 17 9 6 7 7 9 7 7 8 6 7 5 9 4 7 6 6 5 65 64 69 75 67 67 63 64 60 63 67 62 65 63 59 55 56 68 66 63 24 26 26 28 25 22 25 24 26 22 27 22 22 21 27 21 23 21 22 22 m (%-Bdg.) 0,15 7,65 64,05 23,8 Stab (%-Bdg.) 0,49 2,81 4,52 2,28 326,24 36,80 7,06 9,60 VK (%) T3AA = Antikörper gegen T3, T4AA = Antikörper gegen T4, m = Mittelwert, Stab = Standardabweichung, VK = Variationskoeffizient, %-Bdg. = %-Bindung 50 4.2 Ergebnisse Prävalenz der Autoantikörper gegen Schilddrüsenhormone (THAA) Bei insgesamt 1088 untersuchten Serumproben von Hunden mit einem klinischen Verdacht auf eine Hypothyreose, wurden fünf T4AA-positive Hunde (0,46 %) ermittelt. 41 der gemessenen Serumproben wiesen T3AA auf (3,77 %). Insgesamt konnten in 42 Proben THAA nachgewiesen werden, dies entspricht 3,86 % THAA. Zudem wurden bei acht von 141 bereits substituierten Hunden (Gruppe 5) THAA festgestellt (5,67 %). Bei 110 gesunden Hunden konnten keine THAA nachgewiesen werden. 4.2.1 Ergebnisse der THAA-Bestimmung bei Hunden mit einem klinischen Verdacht auf eine Hypothyreose In den einzelnen Gruppen ergab die Autoantikörperbestimmung für T4AA zwischen 0,1 % und 2,7 % und für T3AA zwischen 2,6 % und 9,4 % (0). Bei hypothyreoten Hunden konnten signifikant mehr Autoantikörper nachgewiesen werden, als bei den Hunden in den anderen eingeteilten Gruppen (p = <0,0001). 21 der autoantikörperpositiven Hunde waren männlich und 20 weiblich. In bezug auf die Geschlechtsverteilung ergab sich keine statistische Signifikanz (p = 0,9912). Tabelle 7. Anzahl [und Prozentsatz] T3AA- und T4AA-positiver klinisch hypothyreoseverdächtiger Hunde, die anhand der ermittelten TT4- und TSH-Konzentrationen in die Gruppen „hypothyreot“, „fraglich hypothyreot mit erhöhter TSH-Konz.“, „fraglich hypothyreot mit erniedrigter TT4-Konz.“ und „euthyreot“ eingeteilt wurden Anzahl der insgesamt. untersuchten Hunde Anzahl der T4AA-positiven Hunde Anzahl der T3AA-positiven Hunde Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 3 Gruppe 4 Gesamt 149 110 691 138 1088 4 [2,7 %] 0 [0 %] 1 [0,1 %] 0 [0 %] 5 [0,5 %] 14 [9,4 %] 3 [2,7 %] 18 [2,6 %] 6 [4,4 %] 41 [3,8 %] Gruppe 1 = hypothyreot, Gruppe 2 = fraglich hypothyreot mit erhöhter TSH-Konzentration, Gruppe 2 = fraglich hypothyreot mit erniedrigter TT4-Konzentration, Gruppe 4 = euthyreot Ergebnisse 51 4.2.1.1 Häufigkeit an Autoantikörpern gegen Schilddrüsenhormone bei hypothyreoten Hunden (Gruppe 1) 149 Serumproben von klinisch hypothyreoseverdächtigen Hunden wiesen eine TT4und TSH-Wertekombination auf, die deutlich für eine primäre Hypothyreose sprach (TT4 <1,1 µg/dl und TSH >0,5 ng/ml). Vierzehn dieser Hunde hatten T3AA (9,4 %) und vier T4AA (2,7 %). Drei der vier Hunde, die T4AA hatten, waren ebenfalls für T3AA positiv. Lediglich eine drei Jahre alte Samojeden Hündin wies nur T4AA auf. Es bestand ein ausgewogenes Geschlechterverhältnis. Vier der fünfzehn hypothyreoten Hunde waren Mischlinge und zwei gehörten der Rasse Pudelpointer an. Alle anderen Rassen waren nur einmal vertreten (Tabelle 8). Tabelle 8. Rasse, Serumspiegel an Autoantikörpern gegen Trijodthyronin (T3AA) und Thyroxin (T4AA) in %-Bindung (%-Bdg.) und Geschlecht hypothyreoter Hunde (Gruppe 1) Rasse Mischling Mischling Mischling Mischling Pudelpointer Pudelpointer Basset Briard Entlebucher Sennenhund Golden Retriever Rhodesian Ridgeback Riesenschnauzer Samojede Tibet Terrier keine Angabe T3AA (%-Bdg.) T4AA (%-Bdg.) 34 18 15 14 11 75 11 10 10 81 66 25 15 25 24 21 35 22 - männlich weiblich x x x x x x x x x x x x x x x T4AA = Autoantikörper gegen T4, (positiv ab ≥20 %-Bindung), T3AA = Autoantikörper gegen T3 (positiv ≥10 %-Bindung) , - = nicht nachgewiesen 52 Ergebnisse Die Autoantikörperprävalenz der klinisch hypothyreoseverdächtigen Hunde mit erniedrigtem TT4-Wert und erhöhtem TSH-Wert ist, verglichen mit der Autoantikörperprävalenz in den anderen Gruppen, signifikant höher (p = <0,0001). 4.2.1.2 Häufigkeit an Autoantikörpern gegen Schilddrüsenhormone bei fraglich hypothyreoten Hunden mit erhöhter TSH-Konzentration (Gruppe 2) In Gruppe 2 (TT4 >1,7 µg/dl, TSH >0,5 ng/ml) waren drei von insgesamt 110 Hunden T3AA-positiv. In dieser Gruppe konnte kein Hund mit T4AA ermittelt werden. Dies sind mit p = 0,0322 statistisch signifikant weniger T3AA-positive Hunde, verglichen mit hypothyreoten Hunden (Gruppe 1). Bei den T3AA-positiven Hunden handelte es sich um einen männlichen zwei Jahre alten Teckel, der 46 %-Bindung im Autoantikörpertest zeigte. Ein Eurasierrüde, der 6,5 Jahre alt war, hatte 35 %-Bindung im Autoantikörpertest. Bei einer einjährigen Amerikan-Staffordshire-Terrier Hündin konnten 10 %-Bindung für T3AA nachgewiesen werden. 4.2.1.3 Häufigkeit an Autoantikörpern gegen Schilddrüsenhormone bei fraglich hypothyreoten Hunden mit erniedrigter TT4-Konzentration (Gruppe 3) Unter den 691 untersuchten, fraglich hypothyreoten Hunden mit erniedrigter TT4-Konzentration, lag bei 395 Hunden der TT4-Wert im Graubereich (1,1 – 1,7 µg/dl) und bei 296 Hunden unterhalb des Normbereiches (<1,1 µg/dl). Bei 18 Hunden wurden T3AA nachgewiesen, dies entsprach einer Häufigkeit von 2,6 %. Ein Hund hatte auch T4AA (0,14 %). Bei den 18 autoantikörperpositiven Hunden bestand ein ausgewogenes Geschlechterverhältnis (Tabelle 9). Ergebnisse Tabelle 9. 53 Rasse, Serumspiegel an Autoantikörpern gegen Trijodthyronin (T3AA) und Thyroxin (T4AA) in %-Bindung (%-Bdg.), sowie Geschlecht fraglich hypothyreoter Hunden mit erniedrigter TT4-Konzentration (Gruppe 3) Rasse Golden Retriever Golden Retriever Golden Retriever Golden Retriever Mischling Mischling Yorkshire Terrier Yorkshire Terrier Airedale Terrier Cairn Terrier Deutscher Schäferhund Englisch Setter Flat Coated Retriever Germanischer Bärenhund Labrador Retriever Teckel keine Angabe keine Angabe T4AA (%-Bdg.) T3AA (%-Bdg.) 20 - 12 10 10 11 10 11 12 10 10 12 12 10 10 22 15 15 11 10 männlich weiblich x x x x x x x x x x x x x x x x x x T4AA = Autoantikörper gegen T4 (positiv ≥20 %-Bindung), T3AA = Autoantikörper gegen T3 (positiv ≥10 %-Bindung), - = nicht nachgewiesen Sieben der 18 THAA-positiven Hunde waren in Gruppe 3a, die restlichen 11 in Gruppe 3b. In der gesamten Gruppe 3 waren 2,6 % der untersuchten Hunde T3AA-positiv und 0,14 % der Tiere wiesen T4AA auf. In Gruppe 3 waren demnach signifikant weniger THAA-positive Hunde verglichen mit der Häufigkeit hypothyreoter Hunde (p = <0,001). 54 Ergebnisse Allerdings befanden sich in Gruppe 3b zwei Hunde, bei denen kein TSH-Wert gemessen werden konnte. Diese Hunde sind bei der ermittelten Häufigkeit der einzelnen Gruppe 3a und 3b nicht berücksichtigt worden. In Gruppe 3a waren sieben von 395 Tieren THAA-positiv (1,8 %). Gruppe 3b wies eine Häufigkeit von 3,0 % an THAA-positiven Hunden auf. Es waren nicht signifikant mehr (p = 0,1224) Hunde THAA-positiv, die eine erniedrigte TT4-Konzentration im Zusammenhang mit einem normalen TSH Wert (Gruppe 3b) hatten, als Hunde mit normaler TSH-Konzentration und einer TT4-Konzentration im Grenzbereich der Norm. 4.2.1.4 Häufigkeit an Autoantikörpern gegen Schilddrüsenhormone bei euthyreoten Hunden (Gruppe 4) In sechs Serumproben von Hunden, die einen klinischen Verdacht auf eine Hypothyreose aufwiesen, sind Autoantikörper nachgewiesen worden (4,3 % T3AA). Zwischen hypothyreoten und euthyreoten Hunden bestand hinsichtlich der Autoantikörperprävalenz kein signifikanter Unterschied (p = 0,0902). Zwei der sechs T3AA-positiven Hunde hatten ein grenzwertiges Ergebnis für T3AA von 10 %-Bindung im Autoantikörpertest (Tabelle 10). Tabelle 10. Rasse, Serumspiegel an Autoantikörpern gegen Trijodthyronin (T3AA) in %-Bindung (%-Bdg.) und Geschlecht euthyreoter Hunde (Gruppe 4) Rasse Dalmatiner Havaneser Kleiner Münsterländer Labrador Retriever Mischling Mittelschnauzer T3AA (%-Bdg.) 15 10 11 10 20 12 männlich weiblich x x x x T3AA = Autoantikörper gegen T3 (positiv ≥10 %-Bindung) x x Ergebnisse 4.2.2 55 TT4- und TSH-Konzentrationen THAA-positiver Hunde Die TT4-Konzentrationen der T3AA- und T4AA-positiven Hunde waren in den eingeteilten TT4-Wertebereichen (Gruppe 1 – 4) über die gesamte Reichweite gestreut (Abbildung 1). 3 TT4 (µg/dl) 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 Abbildung 1. 1 Gruppe 1 2 Gruppe 2 3 Gruppe 3 4 Gruppe 4 5 Darstellung der TT4-Konzentrationen von T3AA- und T4AA-positiven hypothyreoten, fraglich hypothyreoten und euthyreoten Hunden T3AA = Autoantikörper gegen T3, T4AA = Autoantikörper gegen T4, Gruppe 1 = hypothyreot, Gruppe 2 = fraglich hypothyreot mit erhöhter TSH-Konzentration, Gruppe 3 = fraglich hypothyreot mit erniedrigter TT4-Konzentration, Gruppe 4 = euthyreot Die TSH-Konzentrationen der T3AA- und T4AA-positiven Hunde waren in den Gruppen 3 und 4 im Normbereich (<0,5 ng/ml) und bei Hunden aus den Gruppen mit erhöhtem TSH-Wert (Gruppe 1 und 2), waren die TSH-Konzentrationen von 0,55 ng/ml bis 10 ng/ml über den gesamten Konzentrationsbereich gestreut (Abbildung 2). 56 Ergebnisse 12 TSH (ng/ml) 10 8 6 4 2 0 0 Abbildung 2. 1 Gruppe 1 2 Gruppe 2 3 Gruppe 3 4 Gruppe 4 5 Darstellung der TSH-Konzentrationen bei autoantikörperpositiven Hunden in den Gruppe 1 – 4 Gruppe 1 = hypothyreot, Gruppe 2 = fraglich hypothyreot mit erhöhter TSH-Konzentration Gruppe 3 = fraglich hypothyreot mit erniedrigter TT4-Konzentration, Gruppe 4 = euthyreot Ergebnisse 4.2.3 57 TRH-Teste bei T3AA-positiven Hunden Die TRH-Teste, die bei T3AA-positiven Hunden durchgeführt wurden, zeigten keinen übereinstimmenden Verlauf (Tabelle 11). Tabelle 11. Basale TT4- und TSH-Konzentration (0 Minuten) sowie TSH-Konzentration 20 Minuten nach Injektion von TRH (im Rahmen eines TRH-Testes zur Abklärung einer Hypothyreose) und TT4-Konzentration 120 Minuten und 180 Minuten nach TRH-Gabe bei T3AA-positiven Hunden TT4 (µg/dl) 1) Mischling, w, 8J. T3AA = 35 %-Bindung 2) Labrador Retriever, mk, 6J. T3AA = 15 %-Bindung 3) Mittelschnauzer, w, 2J. T3AA = 12 %-Bindung 4) Mischling, wk, 2J. T3AA = 10 %-Bindung 5) Flat coated Retriever, w, T3AA = 10 %-Bindung 6) Briard, m, 7J. T3AA = 10 %-Bindung TSH (ng/ml) 0 Min. 120 Min. 180 Min. 0 Min. 20 Min. 0,16 0,15 0,09 3,3 4,1 1,0 1,2 1,2 0,22 0,18 1,9 3,8 3,4 0,07 0,4 1,4 2,4 2,4 0,26 0,66 1,7 2,7 2,8 0,15 0,61 0,17 0,2 0,1 1,5 1,8 T3AA = Autoantikörper gegen T3, J = Jahre, m = männlich, w = weiblich, k = kastriert, Min. = Minuten, TT4 = Gesamtthyroxinkonzentration, TSH = Thyroidea stimulierendes Hormon Die TT4-Konzentration ließ sich bei drei Hunden (1, 2, 6) nicht stimulieren. TSH war bei zwei dieser Hunde (1 und 6) deutlich erhöht und zeigte bei 1 eine Stimulation um 0,8 ng/ml nach TRH-Gabe. Der TRH-Test des Patienten 1 und 6 konnte die Diagnose der Hypothyreose bestätigen. Wohingegen die TRH-Teste der Patienten 2, 3, 4, 5 keine klare diagnostische Aussage im Bezug auf eine Schilddrüsenunterfunktion zuließen (Interpretation nach Mooney und Peterson (2004)). 58 4.2.4 Ergebnisse THAA-Prävalenz bei Hunden mit primärer Hypothyreose, die bereits mit L-Thyroxin substituiert wurden Von insgesamt 141 Hunden, die bereits mit Schilddrüsenhormonen substituiert worden waren, wiesen acht Hunde T3AA auf. Das Geschlechterverhältnis war ausgeglichen. Die TT4-Konzentration vier bis sechs Stunden nach Eingabe der L-Thyroxin Tabletten lag zwischen 0,92 – 6,6 µg/dl. Drei Hunde zeigten eine TT4-Konzentration im Referenzbereich und bei zwei Substitutionspatienten lag die TT4-Konzentration im Grenzbereich der Norm. Bei zwei bereits substituierten Hunden war die TT4-Konzentration erniedrigt und bei einem Hund deutlich erhöht. Auf eine statistische Auswertung wurde aufgrund zu weniger Messdaten verzichtet. (Tabelle 12). Tabelle 12. Rasse, Serumspiegel an Autoantikörpern gegen Trijodthyronin (T3AA) in %-Bindung (%-Bdg.), Geschlecht und TT4- sowie TSH-Konzentrationen acht T3AA-positiver Hunde, die bereits sechs Wochen mit L-Thyroxin substituiert wurden (Gruppe 5) Rasse T3AA (%-Bdg.) Golden Retriever Golden Retriever Dobermann Hovawart Irish Setter Mischling Rhodesian Ridgeback keine Angabe 64 12 11 10 29 86 37 14 männlich weiblich x x x x x x x x TT4 * (µg/dl) TSH * (ng/ml) 1,9 1,0 0,9 6,6 1,4 1,6 2,3 2,4 0,03 0,05 2,5 2,1 - T3AA = Autoantikörper gegen T3, TT4 = Gesamtthyroxinkonzentration, TSH = Thyroidea stimulierendes Hormon, * = 4 – 6 Stunden nach Tabletteneingabe, - = nicht untersucht Ergebnisse 4.2.5 59 Folgemessungen bei THAA-positiven Hunden (zum Teil unter Substitutionstherapie) Die Folgemessung fünf autoantikörperpositiver Hunde ergab einen Abfall der im Serum nachweisbaren Autoantikörperkonzentration im beobachteten Zeitraum. Bei einer Rhodesian Ridgeback Hündin zeigten zwei Kontrolluntersuchungen nach fünf bzw. neun Monaten Substitutionstherapie, einen Abfall der gemessen T3AA auf 19 %-Bindung. Die ermittelten TT4-Konzentrationen vier bis sechs Stunden nach Tabletteneingabe lagen zwischen 3,1 – 2,7 µg/dl (Abbildung 3). T3AA (%-Bdg.) T3AA 40 35 30 25 20 15 10 5 0 37 TT4 = 3,1 µg/dl 26 19 TT4 = 3,4 µg/dl TT4 = 2,7 µg/dl 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Monate Abbildung 3. Verlaufskontrolle des Serumspiegels an Autoantikörpern gegen Trijodthyronin (T3AA) in %-Bindung (%-Bdg.)bei einer Rhodesian Ridgeback Hündin über 9 Monate Substitutionstherapie mit L-Thyroxin und TT4-Konzentrationen 4 – 6 Stunden nach Tabletteneingabe 60 Ergebnisse Bei Patient 2 wurden in einer Kontrolluntersuchung einen Monat nach negativem Autoantikörperergebnis in der Basalblutprobe des durchgeführten TRH-Testes T4AA (21 %-Bindung) und T3AA (10 %-Bindung) nachgewiesen. Die Autoantikörperbestimmung bei Patient 3, nach sechs Monaten unter Substitutionstherapie, ergab ein negatives Ergebnis für T4AA. Bei Patient 4 konnten ebenfalls nach fünf Monaten keine T4AA mehr nachgewiesen werden. 4.2.6 THAA Prävalenz bei gesunden Hunden (Gruppe 6) Bei 110 gesunden Hunden konnten weder T4AA noch T3AA nachgewiesen werden. Es handelte sich bei diesen Tieren vor allem um Hündinnen (n = 109), die klinisch allgemeingesund waren und bei denen die Einsendung einer Serumprobe im Hinblick auf eine Deckzeitpunktbestimmung erfolgte. Ergebnisse 4.3 4.3.1 61 Zusammenhang zwischen dem Auftreten von THAA und der TT4- bzw. T3-Konzentration T4AA-positive Hunde Unter den insgesamt 1088 untersuchten Serumproben hypothyreoseverdächtiger Hunde, konnten bei fünf Hunden T4AA nachgewiesen werden. Dabei handelte es sich um vier Rüden und eine Hündin. Der Autoantikörperspiegel der T4AA-positiven Hunde lag zwischen 20 – 35 %-Bindung. Vier der fünf T4AA-positiven Hunde war auch für T3AA positiv. Das Alter der Hunde betrug zwischen 3 und 9 Jahre (Median 7 Jahre). Bei vier der fünf Hunde lag die TT4-Konzentration deutlich unter dem Referenzbereich und TSH war erhöht (Tabelle 13). Tabelle 13. Rasse, Geschlecht, Alter und Serumspiegel an Autoantikörpern gegen Thyroxin (T4AA) in %-Bindung (%-Bdg.), sowie TT4- und TSH-Konzentrationen von fünf T4AA-positiven Hunden Rasse Golden Retriever Pudelpointer Briard Samojede Cairn Terrier Geschl. Alter (Jahre) m m m w m 3 9 7 3 8 T4AA T3AA (%-Bdg.) (%-Bdg.) 35 24 21 22 20 81 75 10 10 m = männlich, w = weiblich, %-Bdg.= %-Bindung, - = nicht nachgewiesen TT4 (µg/dl) TSH (ng/ml) 0,05 0,29 0,17 0,05 1,3 1,5 6,4 1,5 1,8 0,09 62 Ergebnisse 4.3.2 Bestimmung der TT4-Konzentration durch einen CIA und RIA bei autoantikörperpositiven Serumproben Bei 16 autoantikörperpositiven Serumproben aus den eigenen Antikörperuntersuchungen, war die TT4-Konzentration, die mit einem RIA gemessen wurde, deutlich höher, als die TT4-Konzentrationen, die mit Hilfe des CIAs bestimmt wurden. Im CIA befanden sich die TT4-Konzentrationen zwischen 0,05 µg/dl und 2,0 µg/dl. Die durchschnittliche TT4-Konzentration im CIA lag bei 0,67 µg/dl. Die im RIA bestimmten TT4-Konzentrationen befanden sich zwischen 1,6 µg/dl und 3,1 µg/dl. Die durchschnittliche TT4-Konzentration im RIA lag bei 2,22 µg/dl (Tabelle 14). Tabelle 14. Mittels Chemilumineszenzimmunoassay und Radioimmunoassay ermittelte TT4-Konzentrationen sowie die TSH-Konzentrationen 16 T3AA- bzw. T4AA-positiver Hunde TT4 CIA (µg/dl) TT4 RIA (µg/dl) TSH (ng/ml) T3AA (%-Bdg.) T4AA (%-Bdg.) 0,15 0,24 0,32 0,29 0,29 0,05 0,17 0,30 0,05 0,35 1,4 1,0 1,6 1,4 1,1 2,0 2,0 1,9 1,8 1,9 1,8 2,5 1,6 2,1 2,1 1,7 3,1 2,5 2,7 2,2 2,8 2,8 4,0 9,5 5,3 6,4 5,3 1,5 1,5 2,6 1,3 3,2 2,5 10,0 5,6 3,0 0,62 0,4 34 25 10 75 18 81 10 25 15 66 29 14 46 85 35 10 24 35 21 20 - CIA = Chemilumineszenz-Immunoassay, RIA = Radioimmunoassay, T3AA = Autoantikörper gegen T3, T4AA = Autoantikörper gegen T4, TT4 = Gesamtthyroxinkonzentration, TSH = Thyroidea stimulierendes Hormon %-Bdg. = %-Bindung, - = nicht nachgewiesen Ergebnisse 63 Zwölf Hunde hatten im CIA einen deutlich erniedrigte TT4-Konzentration. Drei Hunde zeigten eine TT4-Konzentration im unteren Grenzbereich der Norm (1,1 – 1,7 µg/dl) im Zusammenhang mit einer erhöhten TSH-Konzentration. Bei einem Hund mit T3AA lag sowohl der TT4-Wert als auch der TSH-Wert im Referenzbereich. Die mit dem RIA ermittelten TT4-Konzentrationen lagen insgesamt deutlich höher, als die im CIA ermittelten Werte. Die lineare Regressionsbeziehung beider Methoden ergab ein Bestimmtheitsmaß von R² = 0,579. Dies bedeutet eine nicht befriedigende Korrelation beider TT4-Messmethoden (Abbildung 4). Es zeigte sich in beiden Methoden kein Unterschied hinsichtlich der TT4-Konzentration bei T4AA-positiven und T4AA-negativen Proben. Auf eine statistische Auswertung wurde aufgrund der geringen Probenanzahl und der geringen Korrelation beider Methoden verzichtet. 5 4,5 TT4 (µg/dl) RIA 4 R² = 0,579 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 TT4 (µg/dl) CIA TT4 (µg/dl) RIA = 0,5341 TT4 (µg/dl) CIA + 1,8791µg/dl Abbildung 4. Lineare Regressionsbeziehung zwischen der mit einem Chemilumineszenzimmunoassay (CIA) und einem Radioimmunoassay ( RIA) gemessenen TT4-Konzentration bei 16 autoantikörperpositiven Hunden und das errechnete Bestimmtheitsmaß (R2) 64 Ergebnisse 4.3.3 Bestimmung der TT4-Konzentration durch einen CIA und RIA bei autoantikörpernegativen Serumproben Die lineare Regressionsbeziehung der mit Hilfe des CIAs und RIAs gemessenen TT4-Konzentrationen von 31 Serumproben klinisch gesunder, autoantikörpernegativer Hunde, ergab ein Bestimmtheitsmaß von R2 = 0,5807. Dies deutet auch bei den autoantikörpernegativen Tieren auf eine nicht befriedigende Korrelation beider Methoden hin. Die mit dem RIA gemessenen TT4-Konzentrationen lagen ebenfalls deutlich höher, als die Konzentrationen, die mit dem CIA ermittelt wurden. 5 TT4 (µg/dl) RIA 4 3 2 1 R² = 0,5807 0 0 1 2 3 4 TT4 (µg/dl) CIA TT4 (µg/dl) RIA = 0,6413 TT4 (µg/dl) CIA + 1,7533µg/dl Abbildung 5. Lineare Regressionsbeziehung zwischen der mit einem Chemilumineszenzimmunoassay (CIA) und einem Radioimmunoassay (RIA) gemessenen TT4-Konzentration bei 31 klinisch gesunden, autoantikörpernegativen Hunden und das errechnete Bestimmtheitsmaß (R2) Ergebnisse 4.3.4 65 TT4-Bestimmung zusätzlicher T4AA-positiver Proben mit dem CIA Die TT4-Konzentrationen zehn T4AA-positiver Serumproben aus der Arbeitsgruppe von Prof. Nachreiner zeigten zum Teil deutlich niedrigere Werte im CIA, verglichen mit den RIA-Daten, die von der Arbeitsgruppe von Prof. Nachreiner ermittelt wurden. Bei der T4AA-positiven Probe mit der höchsten Bindung im Autoantikörpertest bestand kein Unterschied zwischen der TT4-Konzentration im CIA und im RIA (Tabelle 15). Tabelle 15. TT4-Konzentrationen zehn T4AA-positiver Serumproben, die mittels Chemilumineszenzimmunoassay und Radioimmunoassay ermittelt wurden T4AA (%-Bdg.) TT4 CIA (µg/dl) TT4 RIA (µg/dl) Differenz RIA–CIA 22 53 30 25 23 23 26 32 20 25 0,81 1,9 1,3 2,0 2,5 4,0 0,05 0,73 1,8 2,6 1,09 1,95 1,17 2,96 3,12 5,62 0,86 2,11 2,42 3,12 + 0,28 + 0,05 – 0,13 + 0,96 + 0,62 + 1,62 + 0,81 + 1,38 + 0,62 + 0,52 CIA = Chemilumineszenz-Immunoassay, RIA = Radioimmunoassay, T4AA = Autoantikörper gegen T4, TT4 = Gesamtthyroxinkonzentration, %-Bdg. = %-Bindung Die lineare Regressionsbeziehung und das ermittelte Bestimmtheitsmaß R² = 0,8608 deuten auf eine gute Korrelation der beiden Methoden hin (Abbildung 6). Die im RIA ermittelten TT4-Konzentrationen lagen um 0,05 µg/dl bis 1,62 µg/dl höher, als die Konzentrationen, die im CIA gemessenen wurden. 66 Ergebnisse 6 TT4 (µg/dl) RIA* 5 4 3 2 R² = 0,8608 1 0 0 1 2 3 4 5 TT4 (µg/dl) CIA TT4 (µg/dl) CIA = 1,1495 TT4 (µg/dl) RIA + 0,408µg/dl Abbildung 6. Lineare Regressionsbeziehung zwischen der mit einem Chemilumineszenzimmunoassay (CIA) und einem Radioimmunoassay (RIA*-Daten der Arbeitsgruppe von Prof. Nachreiner) gemessenen TT4-Konzentration in zehn T4AA-positiven Serumproben Ergebnisse 4.3.5 67 TT3-Messungen autoantikörperpositiver und -negativer Tiere Die T3-Konzentrationen bei Hunden mit T3AA lagen zum Teil erheblich höher, als die T3-Konzentrationen der T3AA-negativen Tiere (Abbildung 7). TT3 (ng/dl) 1451 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0 Abbildung 7. T3AA-pos. 0,5 1 T3AA-neg.2 1,5 2,5 T3-Konzentrationen 16 T3AA-positiver und 31 T3AA-negativer Hunde (T3AA = Autoantikörper gegen T3) Sechs der 16 T3AA-positiven Hunde wiesen eine T3-Konzentrationen von über 150 ng/dl auf. Bei fünf der sechs Hunde mit einer erhöhten TT3-Konzentration, lag diese über 300 ng/dl. Die T3-Kozentrationen lagen bei 31 gesunden, autoantikörpernegativen Hunden, mit einer Ausnahme, im Normbereich, wohingegen ein Hund eine leicht erhöhte TT3-Konzentration von 154,1 ng/dl aufwies. Bei den gesunden, T3AA-negativen Tieren, wurde kein deutlich über dem Normbereich gelegener Wert für T3 gemessen. 68 4.4 Ergebnisse Vergleichsmessungen mit HPLC Bei fünf frischen, nicht lipämischen und nicht hämolytischen Serumproben von klinisch gesunden und autoantikörpernegativen Hunden konnte die T4-Konzentration nach Extraktion und Messung mit der HPLC anhand gut aufgelöster Peaks nach 42 Minuten Retentionszeit ermittelt werden (Tabelle 16). Der Vergleich dieser fünf TT4-Konzentrationen gemessen mit der HPLC und dem CIA, zeigte in beiden Methoden eine gute Übereinstimmung. Auf eine statistische Auswertung wurde verzichtet, da zu wenige Messdaten vorlagen. Tabelle 16. TT4-Konzentrationen fünf klinisch gesunder T4AA-negativer und zwei T4AA-positiver Hunde, die mittels High-performance-liquid chromatografie (HPLC) und einem Chemilumineszenzimmunoassay (CIA) bestimmt wurden T4AA-negativ T4AA-positiv TT4 CIA (µg/dl) TT4 HPLC (µg/dl) TT4 CIA (µg/dl) TT4 HPLC (µg/dl) 2,0 2,0 1,3 2,9 2,2 1,8 2,1 1,3 3,1 2,2 2,1 1,7 1,8 1,7 T4AA = Autoantikörper gegen T4, TT4 = Gesamtthyroxinkonzentration Bei zwei T4AA-positiven Proben konnte eine TT4-Konzentration anhand eines deutlich aufgelösten Peaks mit der HPLC bestimmt werden (Tabelle 16) und diese zeigte eine gute Übereinstimmung mit der im CIA gemessenen TT4-Konzentration. Vier Proben, bei denen mit dem CIA eine sehr geringe TT4-Konzentration (0,05; 0,13, 0,05 und 0,47 µg/dl) gemessen wurde, zeigten übereinstimmend in der HPLC keinen deutlichen auswertbaren T4-Peak. In der Probe, die im CIA eine TT4-Konzentration von 0,47 µg/dl hatte und in der HPLC kein T4-Wert aufgrund geringer Konzentration ermittelt werden konnte, ergab mit dem RIA (Daten aus der Arbeitsgruppe von Prof. Nachreiner) eine TT4-Konzentration von 3,1 µg/dl. Diskussion 5 69 Diskussion TgAA stehen in direktem Zusammenhang mit der AIT des Hundes und werden im Hinblick auf die Diagnostik einer Schilddrüsenunterfunktion beim Hund als sinnvolle Ergänzung angesehen (Breyer et al. 2004). THAA werden laut Literatur vor allem vor dem Hintergrund einer möglichen Beeinflussung der TT4- und T3-Konzentrationsbestimmung in Immunoassays diskutiert (Rajata et al. 1989; Chastain et al. 1989; Thacker et al. 1992; Nachreiner et al. 2002). Die Diagnostik der Hypothyreose beim Hund ist zum Teil aufgrund der unspezifischen Symptomatik und vieler Einflussfaktoren auf den TT4-Wert schwierig. In der vorliegenden Arbeit wurde die Prävalenz von THAA unter hypothyreoseverdächtigen Hunden bestimmt und im Hinblick auf eine möglich Beeinflussung des Immunoassays zur Bestimmung der TT4-Konzentration untersucht. 5.1 THAA im Serum von Hunden mit klinischem Verdacht auf eine Hypothyreose Die in der vorliegenden Arbeit ermittelte Prävalenz von 3,9 % für THAA bei hypothyreoseverdächtigen Hunden war geringer, als die Angaben zur Autoantikörperprävalenz der vergleichbaren Studie von Nachreiner et al. (2002), in der 6,3 % der Proben THAA positiv waren. Die Literaturangaben hinsichtlich der Prävalenzen von THAA weichen deutlich voneinander ab und die Angaben zum Vorkommen von T3AA im Verhältnis zu T4AA sind widersprüchlich. Die nachgewiesene Prävalenz für T3AA von 3,7% lag im Mittel zwischen den, in der Literatur angegebenen 0,3 % bis 38 % (Young et al. 1985; Gaschen et al. 1993). Für T4AA wurde eine Prävalenz von 0,5% nachgewiesen. Die Literaturangaben schwanken zwischen 0 % und 4,0 % (Patzl und Möstl 2003; Thacker et al. 1992). Die Unterschiede bei den Prävalenzen für THAA könnten sowohl in der nicht vergleichbaren Anzahl und Auswahl der untersuchten Tiere, als auch in der unterschiedlichen Nachweismethodik der einzelnen Studien begründet sein. 70 Diskussion Eine direkte Vergleichbarkeit zwischen den Prävalenzen für T3AA und T4AA bei Hunden mit einem klinischen Verdacht auf eine Schilddrüsenunterfunktion bestand zu der umfangreichsten Studie von Nachreiner et al. (2002). In der vorliegenden Arbeit, als auch in der Studie von Nachreiner et al. (2002), wurden die gleichen Auswahlkriterien und die gleiche Nachweismethode verwendet. Nachreiner et al. (2002) wiesen bei Hunden mit einem klinischen Verdacht auf eine Hypothyreose mehr T3AA (4,6 %) als T4AA (0,6 %) nach. In Übereinstimmung konnten auch in der vorliegenden Arbeit mehr T3AA- (3,7 %) als T4AA-positive (0,5 %) Tiere ermittelt werden. Im Gegensatz dazu stehen die Ergebnisse von Thacker et al. (1992). Die Autoren fanden nur bei 0,8 % der Proben T3AA, aber bei 2,5 % T4AA. Hierbei gilt zu bedenken, dass die Grundgesamtheit der Studie von Thacker et al. (1992) wesentlich geringer war, als die von Nachreiner et al. (2002) und auch als die in der vorliegenden Arbeit. Zudem sind die T3AA und T4AA von Thacker und Kollegen mit einer anderen Methode (Gelelektrophorese) nachgewiesen worden und können somit nicht direkt verglichen werden. Aus anderen, humanmedizinischen Arbeiten geht hervor, dass T3AA und T4AA vergleichbar häufig nachgewiesen wurden (Sakata et al. 1994). Ein Erklärungsversuch für das häufigere Auftreten von T3AA beim Hund in der überwiegenden Anzahl der durchgeführten Studien könnte darin begründet sein, dass Thyroxin enthaltene Bereiche im Thyreoglobulinmolekül des Hundes nicht in gleichem Maße ein antigenes Epitop darstellen, wie es beim Menschen der Fall ist. Von fünf T4AA-positiven Hunden, wies nur ein Patient T4AA ohne einen positiven T3AA-Befund auf (0,09 %). Dieses Ergebnis bestätigt die Beobachtungen von Patzl und Möstl (2003), die Autoren konnten T4AA seltener als T3AA alleine nachweisen. Bei den Angaben zu den Prävalenzen für THAA ist kritisch zu bemerken, dass die Auswahl der hypothyreoseverdächtigen Tiere weder in der vorliegenden Arbeit, noch in der Studie von Nachreiner et al. (2002), standardisiert stattfand. Die überwiegende Anzahl der veröffentlichten Untersuchungen, wurde weder mit vergleichbarem Patientengut, noch mit vergleichbaren Methoden durchgeführt. Diskussion 71 Bei den, in der vorliegenden Arbeit untersuchten hypothyreoseverdächtigen Hunden, als auch bei den von Nachreiner et al. (2002) untersuchten Serumproben, waren Patienten, die schon alle klassischen Anzeichen einer Hypothyreose zeigten und bei denen der Krankheitsprozess fortgeschritten war. Daneben befanden sich Tiere, bei denen vermutlich erst ein frühes Stadium der AIT erreicht war. In fortgeschrittenen Stadien der AIT konnten nach Graham et al. (2001) keine Autoantikörper mehr nachgewiesen werden. Bei den THAA-positiven Hunden dieser Studie, handelte es sich in erster Linie um Mischlinge (n = 7) und Golden Retriever (n = 5) sowie je zwei Pudelpointer, Labrador Retriever, Yorkshire Terrier und Teckel. Alle anderen Rassen waren nur je einmal vertreten. Im Vergleich zu den zehn Rassen, die Nachreiner et al. (2002) mit höchster Prävalenz Übereinstimmungen. an T3AA Diese und T4AA Beobachtung angaben, könnte zeigten ebenfalls auf sich keine einer nicht vergleichbaren Grundgesamtheit beider Studien beruhen. Da sowohl bei Nachreiner et al. (2002), als auch in der vorliegenden Arbeit, keine Vergleichspopulation zur statistischen Auswertung vorlag, war die Bestimmung tatsächlich überrepräsentierter Rassen nicht durchzuführen. Im Gegensatz zu den Literaturangaben von Nachreiner und Kollegen (2002), die signifikant mehr THAA bei Hündinnen als bei Rüden nachgewiesen haben, zeigte sich in der vorliegenden Arbeit keine statistische Signifikanz hinsichtlich der Geschlechtsverteilung. Diese eigenen Ergebnisse bestätigen die Beobachtungen von anderen Autoren zur fehlenden Geschlechtsprädisposition im Bezug auf das Vorkommen von TgAA beim Hund (Breyer et al. 2004; Haube 1999, Haines et al. 1984). 72 Diskussion Es wurden signifikant (p = <0,0001) mehr T4AA und T3AA bei hypothyreoten Hunden, verglichen mit klinisch hypothyreoseverdächtigen, aber labordiagnostisch fraglich hypothyreoten und euthyreoten Hunden, nachgewiesen. Bei 10,1 % der Hunde, deren TT4- und TSH-Konzentration hinweisend auf eine primäre Hypothyreose war, konnten THAA nachgewiesen werden. Diese eigenen Ergebnisse können die Beobachtungen von Thacker et al. (1992) nicht bestätigen. Thacker und Mitarbeiter beschrieben, dass das Auftreten von T4AA und T3AA nicht signifikant mit niedrigen TT4-Konzentrationen assoziiert war und führten dies auf eine Interferenz der Autoantikörper im RIA zurück. Wohingegen Refsal und Nachreiner (1996) ebenfalls eine höhere Prävalenz an THAA bei Hunden nachweisen konnten, die weitere labordiagnostische Hinweise auf eine Hypothyreose zeigten, wie erniedrigte TT4-Konzentration und ein erhöhte TSH-Konzentration. T3AA werden als weiterer diagnostischer Indikator für eine lymphozytäre Thyreoiditis beschrieben (Gaschen et al. 1993). In der vorliegenden Arbeit wurden signifikant mehr T3AA bei Hunden mit niedriger TT4-Konzentration und erhöhtem TSH-Wert nachgewiesen, also bei Hunden, bei denen auch labordiagnostisch eine Hypothyreose bestätigt werden konnte. Zusammen mit den von Gaschen et al. (1993) gemachten Beobachtungen über deutlich höhere Prävalenzen von T3AA im Serum, welches auch hohe Titer für TgAA aufwies, zeigten die Ergebnisse, dass T3AA häufiger bei sicher hypothyreoten Hunden nachgewiesen wurden. Dies unterstützt die von Gaschen et al. (1993) gemachte Vermutung, dass T3AA ein sicherer Indikator für eine manifeste primäre Hypothyreose des Hundes zu sein scheint. Im Hinblick auf die Diagnostik der caninen Hypothyreose ergibt sich daraus aber keine Verbesserung. Da bei diesen Tieren die Hypothyreose auch anhand der TT4- und TSH-Werte diagnostiziert werden konnte, ist eine weitere Bestimmung von THAA im Bezug auf die Diagnostik fraglich. Inwieweit der Nachweis von T3AA eine Aussage zu Verlauf oder Progressivität der Erkrankung zuließe, müssten weitere Untersuchungen klären. Diskussion 73 Die Bestimmung von TSH im Hinblick auf die Diagnose der Hypothyreose hat laut Feldman und Nelson (2004) und Mooney und Peterson (2004) eine hohe Spezifität. 15% der Hypothyreosen gehen allerdings ohne TSH-Erhöhung einher und führen so zu einer geringeren Sensitivität des Parameters TSH (Feldman und Nelson 2004). Die eigenen Untersuchungen zeigten, dass in Serumproben mit einer erhöhten TSH-Konzentration signifikant mehr THAA nachgewiesen werden konnten, als in Proben mit normalem TSH-Wert und konnten damit die Ergebnisse von Refsal und Nachreiner (1996) bestätigen. Diese Ergebnisse könnten darauf hindeuten, dass eine TSH-Konzentrationserhöhung vor allem bei der AIT des Hundes zu verzeichnen ist. Nach Graham et al. (2001) kam es im Stadium der subklinischen Hypothyreose zu einem kompensatorischen TSH-Anstieg. Bei den T3AA-positiven Hunden mit erhöhtem TSH-Wert und einer TT4-Konzentration im Normbereich ist es wahrscheinlich, dass es sich um Tiere mit einer subklinischen Hypothyreose handelte. Dieser Befund ließe sich aber nur mit einer histopathologischen Untersuchung eines Schilddrüsenbioptates endgültig bestätigen. Nachreiner et al. (2002) fanden bei 17 von 1000 Hunden mit T4AA hohe TT4-Konzentrationen, die die Autoren mit einer Immunoassay-Interferenz der Autoantikörper in Verbindung brachten. Die eigenen Untersuchungen konnten dieses Ergebnis nicht bestätigen. Unter den fraglich hypothyreoten Hunden mit erhöhtem TSH-Wert aber ohne TT4-Konzentrationserniedrigung wurden keine T4AA nachgewiesen. Die Vermutung, dass eine Interferenz von T4AA bei diesen Hunden im CIA zu falsch hohen TT4-Konzentrationen führte, konnte nicht bestätigt werden. 74 Diskussion Die eigenen Ergebnisse hinsichtlich des Vorkommens von THAA in Serumproben mit normal hohem TT4-Wert aber erhöhtem TSH-Wert bestätigen auch die von Refsal und Nachreiner (1996) gemachten Beobachtungen, dass THAA sowohl in Serumproben mit niedriger TT4-Konzentration als auch in Serumproben mit erhöhter TT4-Konzentration gleich häufig vorkamen, in Serumproben mit normaler TT4-Konzentration aber weniger THAA nachgewiesen wurden. Es ist zu bedenken, dass in der Gruppe fraglich hypothyreoter Hunde mit erhöhter TSH-Konzentration auch Hunde eingeteilt sein könnten, bei denen andere Ursachen zu einer TSH-Konzentrationserhöhung geführt haben. Neben euthyreoten Hunden, bei denen vorübergehende TSH-Erhöhungen von Hoppen et al. (1997) beobachtet worden sind, kann es auch medikamentös induziert (Sulfonamide) zu einem erhöhten TSH-Spiegel kommen. Wiliamson et al. (2002) zeigten bei Hunden, dass die Gabe einer Kombination von Trimethoprim und Sulfonamid den TT4-Wert deutlich erniedrigte und den TSH-Wert erhöhte. Von den Hunden mit erhöhtem TSH-Wert lagen keine Verlaufskontrollen vor, die zur weiteren Interpretation der TSH-Ergebnisse von Nutzen wären. 2,6 % der fraglich hypothyreoten Hunde mit einer erniedrigter TT4-Konzentration aber einem normalen TSH-Wert wiesen T3AA auf, 0,14 % waren T4AA-positiv . Diese Ergebnisse bestätigen die Untersuchungen von Dixon und Mooney (1999) über das Vorkommen von TgAA bei hypothyreoten Hunden mit einer normalen TSH-Konzentration. Bei den fraglich hypothyreoten Hunden mit erniedrigter TT4-Konzentration wurden signifikant weniger Autoantikörper nachgewiesen, als bei hypothyreoten Hunden. Damit konnten die Ergebnisse von Refsal und Nachreiner (1996) bestätigt werden. Die Beobachtungen von anderen Autoren im Hinblick auf ein erhöhtes Vorkommen von TgAA in Serumproben mit niedriger TT4-Konzentration konnte auch für THAA gezeigt werden (Thacker et al. 1992). Diskussion Bei den 75 THAA-positiven fraglich hypothyreoten Hunden mit erniedrigter TT4-Konzentration liegt der Verdacht nahe, dass es sich um klinisch hypothyreote Hunde handelte, bei denen keine TSH-Konzentrationserhöhung zu beobachten war, oder dass verabreichte Medikamente zu einem erniedrigten TT4-Wert geführt haben könnten. Da keine Daten über Medikamentengaben oder andere Grunderkrankungen dieser Tiere vorlagen, kann kein Rückschluss auf die in der Literatur angegebenen 15 % hypothyreoten Hunde ohne TSH-Konzentrationserhöhung gezogen werden. Der Prozentsatz autoantikörperpositiver Tiere dieser Gruppe erlaubt ebenfalls keinen Rückschluss auf die tatsächliche Anzahl Hunde mit primärer Hypothyreose und THAA und somit konnte in diesem Fall kein Zusammenhang zwischen dem Auftreten von THAA und deren Einflussnahme auf die Diagnostik einer Hypothyreose diskutiert werden. 4,3 % der euthyreoten Hunde waren T3AA-positiv. Bei diesen Hunden könnte es sich um Tiere handeln, die bereits an einer AIT erkrankt waren, aber die Schilddrüse noch nicht soweit funktionsgemindert war, dass sich eine hypothyreote Stoffwechsellage ergab. Diese Beobachtungen würden zu dem von Graham et al. (2002) beschriebene Stadium einer subklinischen Thyreoiditis passen, in dem Autoantikörper nachgewiesen wurden, aber die TT4- und TSH-Konzentrationen im Normbereich lagen. Es ergab sich kein signifikanter Unterschied zwischen dem Auftreten von THAA bei hypothyreoten und euthyreoten Hunden. Diese Ergebnisse ähneln den Beobachtungen von Breyer et al. (2004) zu TgAA bei euthyreoten Hunden beziehungsweise TgAA-positiven Hunden mit anderen Erkrankungen. Die Autoren konnten innerhalb des Untersuchungszeitraumes bei 22,5 % die Entwicklung einer klinisch manifesten Hypothyreose beobachten. Es liegt der Verdacht nahe, dass es sich bei den THAA-positiven euthyreoten Hunden dieser Arbeit um Hunde handelt, die sich in einem Anfangsstadium einer AIT befanden. Da keine Folgeproben der euthyreoten autoantikörperpositiven Hunde vorlagen, konnte über die weitere Entwicklung des Schilddrüsenstatus keine Aussage getroffen werden. 76 Die Diskussion TRH-Teste von sechs T3AA-positiven Hunden zeigten keinerlei Vergleichbarkeiten, die auf das Vorhandensein von Autoantikörpern zurückzuführen wären. Bei drei dieser Hunde konnte anhand des TRH-Testes keine Hypothyreose diagnostiziert werden. Von Nachreiner et al. (2002) wurde ab 10 %-Bindung im radiometrischen Test ein positives T3AA-Ergebnis angenommen. Bei drei der sechs betrachteten Hunde lag das T3AA-Ergebnis bei 10 %. Der nicht nachzuweisende Einfluss von T3AA auf den TRH-Test könnte darauf beruhen, dass nur geringe Mengen Autoantikörper im Serum nachzuweisen waren. Bei diesen Tieren brachte sowohl der TRH-Test, als auch die THAA-Bestimmung keine eindeutige Diagnose. 5.1.1 THAA bei bereits substituierten Hunden Der Grund für die Analyse von Serumproben, die von bereits substituierten Tieren stammten, war eine denkbare Immunoassay-Interferenz, welche von Ferguson (1994) bei T4AA-positiven Proben und einer TT4-Bestimmung im RIA berichtet wurde. Bei keinem der bereits substituierten Hunde aus der vorliegenden Arbeit konnten T4AA nachgewiesen werden. Beim Menschen konnte in einer Studie gezeigt werden, dass es unter Substitutionstherapie zu einem Anstieg der Anzahl an T4AA-positiven Patienten kam (Biukovic et al. 1993). Diese Aussage konnte in den eigenen Untersuchungen ebenfalls nicht bestätigt werden. Es stellt sich die Frage, ob THAA auch in vivo einen Einfluss auf den Schilddrüsenhormonstoffwechsel Festzuhalten ist, dass keiner unter der Substitutionstherapie substituierten Hunde haben mit könnten. T3AA eine T4-Konzentration im empfohlenen oberen Normbereich aufwies (Mooney und Peterson 2004). Sieben Hunde zeigten eine zu geringe TT4-Konzentrationen und einer eine deutlich zu hohe. Diskussion 77 In Übereinstimmung mit Untersuchungen über TgAA-Titer von Haube (1999), konnte auch in dieser Studie ein Abfall der THAA unter Substitutionstherapie mit Schilddrüsenhormonen gezeigt werden. Die von Haube (1999) verfolgten Titerverläufe hypothyreoter Hunde nach sechs Monaten bis zu drei Jahren nach der ersten TgAA-Titerbestimmung zeigten, dass mit einer Ausnahme alle Hunde nach diesem Zeitraum TgAA-negativ waren. In der vorliegenden Arbeit konnte bei einem Tier ein Abfall der %-Bindung im radiometrischen Antikörpertest von 37 % auf 19 % T3AA während einer neun monatigen Substitutionstherapie mit L-Thyroxin beobachtet werden. Zwei weitere Hunde mit T4AA waren nach sechs bzw. fünf Monaten unter Substitutionstherapie mit Schilddrüsenhormonen T4AA-negativ. 5.1.2 Nachweis von THAA bei klinisch gesunden Hunden Die Angaben zu THAA-positiven klinisch gesunden euthyreoten Hunden von Patzl und Möstl (2002) konnten nicht bestätigt werden. Patzl und Möstl (2002) fanden bei 2,5 % der 186 untersuchten klinisch gesunden Hunde T3AA und bei 0,5 % T4AA. Die eigenen Ergebnisse zeigten, dass keiner der untersuchten gesunden Hunde THAA aufwies. Zu bedenken gilt hierbei aber, dass die insgesamt 110 untersuchten Hunde in der vorliegenden Arbeit eine homogene Gruppe darstellten, da es sich vor allem um gesunde Hündinnen, die zur Zucht eingesetzt wurden handelte. 78 5.2 Diskussion Vergleichsmessungen mit autoantikörperpositiven Serumproben Laut Literatur haben THAA vor allem einen Einfluss auf die Diagnostik der caninen Hypothyreose, weil sie in Immunoassays zur Bestimmung der TT4 und TT3 kreuzreagieren können (Thacker et al. 1992, Feldman und Nelson 2004; Nachreiner et al. 2002). Die Beeinflussung der TT4-Messung durch T4AA im CIA war theoretisch vorstellbar. Es handelt sich um einen Festphasen-Test. Die AK gegen T4 sind an die Kunststoffkugel des Reagenzgefäßes gebunden. Markiertes und nicht markiertes T4 konkurrieren um die konstante Anzahl an AK-Bindungsstellen auf der Kugel. Je mehr mit alkalischer Phosphatase markiertes Hormon gebunden wird, desto mehr Substrat wird umgesetzt. Das heißt, je weniger Hormon in der Serumprobe ist, desto mehr Substrat wird zum lumineszierenden Produkt umgesetzt und schließlich detektiert. Wären T4AA im Serum vorhanden, so könnten diese auch einen Anteil markiertes T4 binden. Hierdurch verändert sich die kompetitive Situation am AK. Ist wenig T4 im Serum eines hypothyreoten Hundes vorhanden, könnte verhältnismäßig mehr nicht markiertes T4 binden. Entsprechend weniger Substrat würde umgesetzt und der TT4-Wert wäre falsch hoch. Denkbar war weiterhin, dass Autoantikörper keinen Einfluss auf die Bestimmung der TT4-Konzentration bei Serumproben hätten, in denen nur geringste Mengen an nativem Hormon nachzuweisen waren, sprich die TT4-Konzentration unter der Nachweisgrenze des Testes lag (<0,05 µg/dl). Hier würde viel markiertes Hormon am AK auf der Kugel binden und kein bis wenig endogenes T4. Die kompetitive Situation würde nicht durch Autoantikörper gestört. Weiterhin ist die Affinität des im Test verwendeten monoklonalen AK entscheidend für eine Beeinflussung durch Autoantikörper. Liegt die Affinitätskonstante des im Test verwendeten AK weit höher als die der Autoantikörper, so kann davon ausgegangen werden, dass keine Interferenz durch Autoantikörper möglich ist. Nachreiner et. al. (2002) konnten bei 17 von 1000 T4AA-positiven Proben eine falsch hohe TT4-Konzentration im verwendeten RIA nachweisen. Diskussion 79 Im Gegensatz zu diesen Erkenntnissen, konnte das in den eigenen Untersuchungen nicht gezeigt werden. Im Gegenteil hatten vier der fünf T4AA-positiven Hunde deutlich erniedrigte TT4-Werte und einen erhöhten TSH-Wert. Bei zwei Hunden lag die TT4-Konzentration unter der Nachweisgrenze des CIA von <0,05 µg/dl. TSH lag bei diesen Hunden deutlich über dem Referenzbereich. Diese Ergebnisse deuten nicht auf eine falsch erhöhte TT4-Konzentration hin, die auf eine Interferenz der Autoantikörper hinweisen würde. Allerdings konnten Nachreiner et al. (2002) nur in 17 von 1000 T4AA-positiven Serumproben auch falsch erhöhte TT4-Werte nachweisen. Die Vergleichsmessung zehn T4AA-positiver Serumproben der Arbeitsgruppe von Prof. Nachreiner zeigte, dass die im CIA gemessenen TT4-Werte zum Teil deutlich niedriger waren, als die mit dem RIA ermittelten Werte bei einer relativ guten Korrelation beider Messmethoden. Im Gegensatz zu den Erkenntnissen von Gaschen et al. (1993) konnte keine Korrelation zwischen der T4AA-Konzentration und den TT4-Werten nachgewiesen werden. In der Serumprobe mit der höchsten T4AA-Konzentration, sowohl im CIA als auch im RIA, wurden in beiden Methoden vergleichbare Ergebnisse erzielt. Diese Ergebnisse könnten auf einer unterschiedlicher Bindungscharakteristik der Autoantikörper beruhen. Beim Menschen nachgewiesene THAA hatten, je nach Literaturstelle eine Affinitätskonstante zwischen KA = 4,1 × 108 – 9,7 × 109 L/mol (Wu und Green 1976; Beck-Peccoz et al. 1983; Heyma und Harrison 1986; Muratsugu et al. 1988). Auch die von Beck-Peccoz et al. (1983) ermittelte Bindungskapazität der Autoantikörper variierte zwischen 1,1 und 2,1 ng/ml Serum. Um den Einfluss der Autoantikörper noch genauer untersuchen, müssten zu einer TT4-Konzentrationsbestimmung in unterschiedlichen Methoden auch jeweils die Bindungscharakteristika der einzelnen individuellen Autoantikörper bestimmt werden. 80 Diskussion Die TT4-Vergleichsmessungen gesunder Hunde und T4AA-positiver Hunde mit der HPLC ergaben eine gute Übereinstimmung der TT4-Konzentrationen. Die Ergebnisse, die mit einer nicht immunologischen Messmethoden ermittelt wurden, deuten an, dass es nicht zu falsch hohen TT4-Werten durch eine Interferenz mit T4AA im CIA kam. Problematisch war die Bestimmung der TT4-Werte mit der HPLC Methode nach Arndt (2007) in Konzentrationsbereichen <0,5 µg/dl. Da die untersuchten autoantikörperpositiven Proben in diesem Konzentrationsbereich lagen, kann nur die Aussage getroffen werden, dass keine deutlich höhere Thyroxinkonzentration im Serum vorhanden war. Zwar konnten in den eigenen Untersuchungen keine falsch hohen TT4-Werte durch Interferenz mit T4AA nachgewiesen werden, dennoch kann diese weiterhin nicht ausgeschlossen werden. Nachreiner et al. (2002) haben nur bei 1,7 % der T4AA-Proben auch falsch hohe TT4-Werte beobachten können. Selbst wenn T4AA im Einzelfall zu artifiziell hohen TT4-Werten führen sollten, wäre das vor dem Hintergrund der geringen Inzidenz positiver T4AA Proben, ohne diagnostische Relevanz. In der vorliegenden Arbeit konnte in Übereinstimmung mit den in der Literatur veröffentlichten Daten von Young et al. (1985) und Kemppainen et al. (1996) gezeigt werden, dass einige Hunde mit T3AA deutlich erhöhte TT3-Konzentrationen im Serum aufwiesen. Bei diesen Hunden lag mit hoher Wahrscheinlichkeit die beschriebene Interferenz mit dem verwendeten RIA vor. Da zur Routinediagnostik der Endokrinologie in der Tierärztlichen Hochschule Hannover keine TT3-Konzentrationsbestimmung gehört, bestand aus diesem Grund kein Einfluss durch T3AA auf die Schilddrüsendiagnostik. Die Kreuzreaktivität zwischen T3AA und T4AA betrug laut Literaturangaben weniger als 1 % (Young et al. 1985). Somit kann auch davon ausgegangen werden, dass die TT4-Konzentrationsbestimmung nicht von T3AA beeinflusst wurde. Diskussion 5.3 81 Ausblick In der vorliegenden Arbeit konnte bestätigt werden, dass das Vorkommen von THAA beim Hund sehr selten ist. Allerdings konnte aufgrund von zu wenigen, speziell T4AA-positiven Proben, nicht statistisch gesichert werden, dass T4AA keinen Einfluss auf die Messung der TT4-Konzentration mit dem CIA haben. Für die statistische Prüfung dieser Ergebnisse müssten weitere Messungen der TT4-Konzentration in Gegenwart von T4AA durchgeführt werden, die idealerweise mit einer nicht immunologischen Messmethode durchgeführt werden. THAA konnten signifikant häufiger bei Hunden nachgewiesen werden, deren TT4-Wert niedrig und deren TSH-Wert hoch war. Im Hinblick der in dieser Arbeit gewonnenen Daten erscheint es sinnvoll zu prüfen, ob das Auftreten von THAA als ein früher Indikator für die Progressivität einer AIT herangezogen werden könnte. Zur Beantwortung dieser Frage müssten umfangreiche Untersuchungen an großen Hundepopulationen prädisponierter Rassen durchgeführt werden, Hypothyreosepatienten gezielt verfolgen zu können. um möglichst beginnende 82 6 Zusammenfassung Zusammenfassung Marion Piechotta (2007) Bestimmung von Autoantikörpern gegen Schilddrüsenhormone im Serum von Hunden und deren Einfluss auf die Schilddrüsendiagnostik Die Hypothyreose zählt zu den häufigsten endokrinen Erkrankungen des Hundes. Als Ursache einer primären Hypothyreose wird die autoimmune Thyreoiditis oder eine idiopathische Atrophie der Schilddrüse beschrieben. Autoantikörper gegen Thyreoglobulin (TgAA) treten im Zusammenhang mit einer autoimmunen Thyreoiditis auf und können auch diagnostisch als früher Indikator für eine autoimmune Thyreoiditis genutzt werden. Autoantikörper gegen Schilddrüsenhormone kommen als Subsets der TgAA vor. Es war vorstellbar, dass Autoantikörper gegen Thyroxin im Chemilumineszenzimmunoassay zur Messung der TT4-Konzentration interferieren und zu falsch hohen Thyroxinwerten führen. In der vorliegenden Arbeit wurden bei 1088 Hunden, mit einem klinischen Verdacht auf eine Schilddrüsenunterfunktion, Autoantikörper gegen Schilddrüsenhormone bestimmt. Zusätzlich wurden 110 gesunde Hunde auf das Vorhandensein von Autoantikörpern untersucht. Bei keinem der klinisch gesunden Tiere konnten THAA nachgewiesen werden. Dagegen wurden bei 3,8 % Hunden mit einem klinischen Verdacht auf eine Hypothyreose Autoantikörper gegen T3 und bei 0,5 % Autoantikörper gegen T4 nachgewiesen. Die vorliegenden Untersuchungen und die Literaturrecherche zeigten, dass THAA selten vorkommen. Im Gegensatz zu veröffentlichten Studien, konnte in der vorliegenden Arbeit keine Geschlechtsdisposition für THAA gezeigt werden. Zusammenfassung 83 Die Autoantikörperergebnisse wurden im Zusammenhang mit den TT4- und TSH-Konzentrationen der hypothyreoseverdächtigen Hunde beurteilt. Mit statistischer Signifikanz wurden mehr Autoantikörper gegen Schilddrüsenhormone (THAA) bei Hunden mit niedrigen TT4-Konzentrationen und einer deutlich erhöhten TSH-Konzentration nachgewiesen. Zudem konnten signifikant mehr THAA bei Hunden mit einer erhöhten TSH-Konzentration nachgewiesen werden, unabhängig von der TT4-Konzentration. Besonders häufig wurden THAA bei Mischlingen nachgewiesen. Zu den häufigsten Rassen mit THAA gehörten Golden Retriever, Pointer, Labrador Retriever, Yorkshire Terrier und Teckel. Unter Substitutionstherapie autoantikörperpositiver Hunde konnte gezeigt werden, dass es zu einem Absinken des Serumspiegels an Autoantikörpern im Verlauf der Substitutionstherapie mit Schilddrüsenhormonen kam. TRH-Teste autoantikörperpositiver Hunde zeigten keinen übereinstimmenden Verlauf, der einen Einfluss der Autoantikörper auf Stimulationsteste vermuten ließe. Die zusätzliche TT4-Konzentrationsbestimmung mit einem Radioimmunoassay (RIA) und einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) bei T4AA-positiven Hunden und einer klinisch gesunden Kontrollgruppe zeigte keinen Hinweis auf falsch hohe TT4-Werte im CIA. Fünf der 1088 untersuchten Hunde waren T4AA-positiv. Vier der fünf Hunde hatten niedrige TT4-Konzentrationen und deutlich erhöhte TSH-Konzentrationen. Diese Befunde deuten darauf hin, dass der diagnostische Nutzen einer zusätzlichen Bestimmung von Autoantikörpern gegen Schilddrüsenhormone bei hypothyreoten Hunden als gering zu beurteilen ist. Die erhobenen Daten zeigen aber auch, dass bei einigen Hunden mit klinischen Anzeichen einer Hypothyreose und fraglichen Laborwerten eine Bestimmung von THAA bei der Diagnose einer autoimmunen Hypothyreose hilfreich war. 84 7 Summary Summary Marion Piechotta (2007) Determination of autoantibodies against thyroid hormones and their influence on diagnosis of canine hypothyoidism Hypothyroidism is one of the common endocrine disorders in dogs. Primary hypothyroidism is caused by autoimmune thyroiditis and idiopathic atrophy. Autoantibodies against Thyreoglobulin (TgAA) occur in dogs with autoimmune thyroiditis and are used as an early screening test for hypothyroidism. Autoantibodies Thyreoglobulin against thyroid autoantibodies. hormones If these (THAA) appear autoantibodies together interfere with with chemiluminescent-immunoassay used to measure T4-concentration, in which case falsly elevated T4 levels would occur. In this study thyroid hormone autoantibodies were measured in 1088 dogs with clinical signs of hypothyroidism and in a group of 110 clinically healthy dogs. THAA were not detected in any of the healthy dogs. However in the dogs with clinical signs of hypothyroidism, autoantibodies against T3 (T3AA) were found in 3.8 % of cases and autoantibodies against T4 (T4AA) in 0.5 % of cases, suggesting that the occurrence of THAA is rare. In contrast to another publication there was no significant difference in presence of THAA in female and male dogs. When the THAA results were evaluated with T4-and TSH-values, THAA were found more frequently in dogs with low T4 and elevated TSH. THAA correlated significantly with increased TSH levels, independent of the thyroxin concentration. THAA were more common in mongrel dogs. However Golden Retriever, Pointer, Labrador Retriever, Yorkshire Terrier and Dachshund are breeds which are more likely to have THAA. In autoantibody positive dogs, a decrease in autoantibody concentrations during substitution therapy with levo-thyroxin could clearly be demonstrated. Furthermore, there was no effect on TRH-stimulation tests in dogs with THAA. Summary 85 To investigate if the chemiluminescent immunoassay (CIA) for T4-measurement is affected by T4AA, T4-concentrations were measured by radioimmuno assay (RIA) and high performance liquid chromatografie (HPLC) in T4AA positive serum and in serum from control dogs. There was no evidence of falsely elevated T4-levels when comparing results measured by HPLC and chemiluminescent assay. In this study T4AA was found only in five of the 1088 investigated dogs. Four of these dogs had very low T4-levels together with increased TSH. These results indicate that an additional test for THAA is not required in hypothyroid dogs. But that additional autoantibody testing in those dogs with clinical signs of hypothyroidism and nonspecific T4- and TSH-values could help to diagnose autoimmune thyroiditis. 86 8 Literaturverzeichnis Literaturverzeichnis AKTAS, M., D. AUGUSTE, H. P. LEFEBVRE, P. L. TOUTAIN and J. P. BRAUN (1993): Creatine kinase in the dog: A review. Vet Res Commun 17, 353-369 ARNDT, M. (2007): Measurement of total thyroxine concentration in canine serum using HPLC and UVdetection In Vorbereitung zur Publikation BEALE, K. M., R. E. HALLIWELL and C. L. CHEN (1990): Prevalence of antithyroglobulin antibodies detected by enzyme-linked immunosorbent assay of canine serum. J Am Vet Med Assoc 196, 745-748 BEAVER, B. V. and L. I. HAUG (2003): Canine behaviors associated with hypothyroidism. J Am Anim Hosp Assoc, 39, 431-4 BECK-PECCOZ, P., P. B. ROMELLI, G. 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Rassenverteilung der hypothyreoten Hunde (Gruppe 1) Rasse Mischling Riesenschnauzer Deutscher Schäferhund Hovawart Golden Retriever Rhodesian Ridgeback Boxer Eurasier Airedale Terrier Labrador Retriever Collie Dobermann Beagle Bearded Collie Deutsche Dogge Pudelpointer Rauhaardackel Zwergschnauzer American Bulldog American Cocker Spaniel Azawakh Basset Berner Sennenhund Bouvier de Flandres Bretoner Anzahl 30 11 8 8 7 7 5 5 4 4 3 3 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 Rasse Anzahl Briard Dackel Dalmatiner Entlebucher Sennenhund Flat Coated Retriever Foxterrier Greyhound Irish Setter Jack Russel Terrier Kleiner Münsterländer Langhaarteckel Mittelschnauzer Petit Basset Griffon Russisch Terrier Samojede Schlittenhund Sheltie Terrier Tibet Terrier Welsh Corgi West Highland White Terrier Wolfsspitz Yorkshire Terrier 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Keine Angabe 7 Tabellenanhang 103 Tabelle 18. Rassenverteilung der fraglich hypothyreoten Hunde mit erhöhter TSH-Konzentration (Gruppe 2) Rasse Anzahl Mischling Golden Retriever Airedale Terrier Deutscher Schäferhund Dobermann West Highland White Terrier Boxer Rhodesian Ridgeback Collie Dalmatiner Labrador Retriever Riesenschnauzer Bearded Colli Berner Sennenhund Cocker Spaniel Dackel Hovawart Langhaardackel Pudel Rauhaardackel Staffordshire Terrier Yorkshire Terrier Afgahne 11 9 5 5 5 5 4 4 3 3 3 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 Rasse Anzahl American Staffordshire Australian Shephard Basset Beagle Chow Chow Deutsche Dogge Englische Bulldogge Entlebucher Sennenhund Eurasier Flat Coated Retriever Gordon Setter Irish Terrier Kurzhaarteckel Leonberger Mittelschnauzer Ogar Polski Russisch Terrier Saluki Schnauzer Shi Tzu Teckel Tibet Terrier keine Angabe 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 Tabelle 19. Rassenverteilung der fraglich hypothyreoten Hunde mit erniedrigter TT4-Konzentration (Gruppe 3) Rasse Mischling Golden Retriever Dt. Schäferhund Labrador Retriever Hovawart Cocker Spaniel Anzahl 120 113 54 45 18 16 Rassen Bernhardiner Briard Dt. Drahthaar Greyhound Irish Setter Mittelschnauzer Anzahl 3 3 3 3 3 3 Rassen Beauceron Berger Bobtail Bulldogge Bullmastiff Burbull Anzahl 1 1 1 1 1 1 104 Tabellenanhang Rasse Anzahl Rhod. Ridgeback West Highland White Terrier Airedale Terrier 15 Rassen Anzahl Rassen Anzahl 3 9 Samojede Staffordshire Terrier Teckel Boxer 9 Wolfsspitz 3 Collie 9 Akita Inu 2 Dobermann 9 Belgischer Schäferhund 2 Rottweiler 9 Chihuahua 2 Jack Russel Terrier Berner Sennenhund Riesenschnauzer Foxterrier Bearded Collie Bouvier des Flandres Dt. Kurzhaar Dt. Dogge 8 7 7 6 5 5 5 5 2 2 2 2 2 2 2 2 Flat Coated Retriever 5 Englisch Setter Groenedal Husky Kuvasz Langhaardackel Magyar Vizsla Malteser Münsterländer PyrenäenBerghund Germanischer Bärenhund Gordon Setter Irish Terrier Irish Wolfshound Jagd Terrier Kl. Münsterländer Kooijker Leonberger Malinois 2 Pommeraner Neufundländer 5 Rauhaardackel 2 Pudel Yorkshire Terrier Bordeaux Dogge Bullterrier 5 5 4 4 2 2 2 1 Cairn Terrier 4 1 Spitz 1 Eurasier 4 1 Springer Spaniel 1 Schnauzer 4 1 Terrier 2 Weimeraner Bayr. Gebirgsschweisshund Beagle 4 Russisch Terrier Zwergpudel Zwergschnauzer Afgahne Amerik. Cocker Spaniel Appenzeller Sennenhund Australian Shephard Barsoi Australian Shephard Barsoi Schweizer Sennenhund Scottisch Terrier Sheltie Shi Tzu Shiba Inu 1 Zwergspitz 1 Keine Angabe 53 15 3 3 3 3 Deerhound Drahthaar Foxterrier Engl. Bulldogge Engl. Springerspaniel Entlebucher Sennenhund 1 Fila Brasileiro 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Tabellenanhang 105 Tabelle 20. Rassenverteilung der euthyreoten Hunde (Gruppe 4) Rasse Mischling Labrador Retriever Golden Retriever Hovawart Zwergschnauzer Bouvier des Flandres Boxer Cavalier King Charles Cocker Spaniel Deutscher Schäferhund Sheltie West Highland White Terrier Airedale Terrier Beagle Berner Sennenhund Chihuahua Dackel Flat Coated Retriever Gordon Setter Pon Akita Inu American Stafforfshire Appenzeller Sennenhund Bearded Colli Bobtail Bolonka Briard Bullterrier Anzahl 26 15 8 8 4 3 3 3 3 3 3 3 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 Rasse Anzahl Collie Dalmatiner Dandie Großer Schweizer Havaneser Irish Setter Irish Terrier Jack Russel Terrier Kleiner Münsterländer Kooijker Kurzhaarteckel Langhaardackel Mittelschnauzer Mops Neufundländer NSDT Retriever Pomeranze Pudel Rauhaardackel Rottweiler Teckel Stafford Terrier Yorkshire Terrier 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 keine Angabe 9 106 Tabellenanhang Tabelle 21. Rassenverteilung der bereits mit L-Thyroxin vorbehandelten Hunde (Gruppe 5) Rassen Mischling Golden Retriever Hovawart Labrador Retriever Deutscher Schäferhund Rhodesian Ridgeback Dobermann Bearded Collie Boxer Irish Setter Riesenschnauzer West Highland W. Terrier Afgahne Australian Shephard Kleiner Münsterländer Russisch Terrier Tibetdogge Wolfsspitz Airedale Terrier Azawakh Berner Sennenhund Bernhardiner Bobtail Briard Anzahl 28 25 8 6 5 5 4 3 3 3 3 3 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 Rassen Cairn Terrier Cocker Spaniel Dackel Foxterrier Gordon Setter Gr. Münsterländer Husky Jack Russel Terrier Langhaardackel Leonberger Mittelschnauzer Neufundländer Pudel Pyrenäen-Berghund Rauhaardackel Samojede Schweizer Laufhund Scotch Terrier Shelti Sibirian Husky Spinone Italiano Teckel Zwergschnauzer Keine Angabe Anzahl 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 4 Danksagung An erster Stelle möchte ich mich bei Herrn Prof. H.-O. Hoppen für die vertrauensvolle Überlassung des Themas und die immer nette und fachliche Anleitung bedanken, sowie für die Möglichkeit des eigenständigen wissenschaftlichen Arbeitens. Weiterhin gilt mein nachdrücklicher Dank meinen Kolleginnen der Endokrinologie. Angela Jordan danke ich für ihr offenes Ohr und ihre moralische Unterstützung in allen Lebenslagen. Hedwig Niederstucke für Ihre herzliche Hilfe bei Fragen und Problemen. Michael Arndt für die HPLC Messungen und Annett Rotermund für die nette Einarbeitung in endokrinologische Fragestellungen. Ein besonderer Dank gebührt Andreas Mietze, der mir während der Dissertationszeit oft als Zuhörer zur Seite stand und trotz Gebrechen sich meiner geistigen Ergüsse gewidmet hat. Für die freundliche Überlassung von autoantikörperpositiven Proben möchte ich mich bei Prof. R. F. Nachreiner, P.A. Schenck und K. R. Refsal aus der Endokrinologie der Michigan State University (USA) bedanken und besonders herzlich danke ich Markus Rick für die liebenswürdige Einarbeitung in den Assay und die tolle Zeit in Amerika. Außerdem möchte ich Herrn Dr. H. Claussen und dem Praxisteam Dres. A. Schütz und S. Bona für die Überlassung von Serumproben und die Hilfe danken. Besonders herzlich danke ich meiner Familie für die fortwährende Hilfe und Unterstützung während der Doktorandenzeit. Zu guter Letzt möchte ich meinem Schatz für die große Hilfe bei allen WordProblemen und der Planung meiner neuen Wohnung danken.
