Fehlende Calciumsignale in der Retina führen zu

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Retinale Calciumkanäle
Fehlende Calciumsignale in der
Retina führen zu Nachtblindheit
CHRISTIAN WAHL -SCHOTT, HARTMUT CUNY, CHRISTIAN ECKERT,
KRISTINA GRIEßMEIER, MELANIE GEBHARD UND MARTIN BIEL
INSTITUT PHARMAKOLOGIE FÜR NATURWISSENSCHAFTEN, ZENTRUM FÜR PHARMAFORSCHUNG, LMU MÜNCHEN
Unsere Augen ermöglichen es uns, Licht unterschiedlicher Wellenlängen
und stark schwankender Intensitäten zuverlässig wahrzunehmen. Voraussetzung für diese von modernen Kameras noch bei weitem nicht erreichte
Leistungsfähigkeit ist die Anwesenheit eines einzigartigen Calciumkanalproteins in der Netzhaut des Auges, das darauf spezialisiert ist, ungewöhnlich langanhaltende Calciumsignale zu erzeugen. Wir konnten einen
molekularen Schalter in diesem Protein identifizieren, der diese spezifische Fähigkeit vermittelt. Fehlt dieser Schalter, entsteht eine angeborene
Form der Nachtblindheit.
ó Die Netzhaut (Retina) ist der Licht-aufnehmende Teil des Auges. Hier wandeln
Photorezeptoren Lichtreize in elektrische Signale um. Diese Signale werden in einem einfachen Netzwerk aus Neuronen weitergeleitet
(Abb. 1A). Besonders wichtig sind hierbei die
Synapsen von Photorezeptoren und Bipolarzellen. Sie unterscheiden sich von anderen
Synapsen im Nervensystem dadurch, dass sie
langanhaltende Calciumsignale für eine kontinuierliche Neurotransmitterfreisetzung nutzen. Diese Eigenschaft verdanken sie einzigartigen Calciumkanälen (Cav1.4), die einen
kontinuierlichen Einstrom von Calcium vermitteln[1] (Abb. 1B). Diese Besonderheit ist
Voraussetzung für die hohe Leistungsfähigkeit der Augen. Unsere Arbeitsgruppe interessiert sich dafür, welcher Mechanismus für
diese essentielle Eigenschaft verantwortlich
ist.
Ein Blick auf andere Calciumkanäle zeigt,
dass die Erzeugung langanhaltender Calciumsignale keineswegs weit verbreitet ist. Im
Gegensatz zum retinalen Kanal besitzen die
meisten anderen Calciumkanäle einen hochkonservierten Rückkopplungsmechanismus,
der den Calciumeinstrom zeitlich limitiert.
Dieser Mechanismus wird Calcium-abhängige Inaktivierung (engl. Calcium-dependent
inactivation, CDI) genannt.
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Viele Calciumkanäle können den
Calciumeinstrom limitieren
Werfen wir einen kurzen Blick auf den
Mechanismus, der im kardialen Calciumkanal
(Cav1.2), einem Protein, das strukturell nahe
mit Cav1.4 verwandt ist, CDI vermittelt.
Anders als Sehzellen benötigen Herzzellen
Calciumkanäle mit CDI, um die Aktionspotentialdauer zu limitieren und eine toxische
Überladung der Zelle mit Calcium zu verhindern. Die Schlüsselstrukturen für die CDI
befinden sich im proximalen C-Terminus von
Cav1.2 (Abb. 2)[2]. Drei Motive sind besonders
wichtig: Das IQ- und pre-IQ-Motiv vermitteln
die permanente Bindung des Calciumsensors
Calmodulin (CaM). CaM ist ein Protein mit
vier Calciumbindungsdomänen und funktioniert wie ein molekularer Schalter, der durch
Bindung und Abdissoziation von Calciumionen an- und ausgeschaltet werden kann.
Das dritte Motiv ist ein EF-Hand-Motiv mit
hoher Homologie zu klassischen Calcium-bindenden EF-Hand-Motiven. Dieses EF-HandMotiv kann jedoch selbst kein Calcium binden
und scheint eher eine wichtige allosterische
Domäne zu sein, die die CDI reguliert. Nach
gegenwärtiger Vorstellung läuft der Prozess
der CDI folgendermaßen ab: Nach dem Öffnen der Calciumkanäle strömt Ca2+ in die Zelle. Dadurch erhöht sich schlagartig die Ca2+Konzentration in der unmittelbaren Umgebung der intrazellulären Kanalöffnung. Das
am Kanal gebundene CaM kann jetzt Ca2+
binden und induziert dadurch eine Konformationsänderung im EF-Hand-Motiv. Zuvor
im Inneren des EF-Hand-Motivs verborgene
hydrophobe Aminosäuren gelangen an die
Oberfläche und können mit der Inaktivierungsmaschinerie (grauer Verschlussmechanismus in Abb. 2A, B) interagieren[3].
Durch diese produktive Interaktion wird die
Kanalinaktivierung beschleunigt (Abb. 2C).
¯ Abb. 1: Die retinalen Calciumkanäle
Cav1.4 ermöglichen
einen kontinuierlichen Calciumeinstrom in spezialisierte Synapsen (Bändersynapsen) von Photorezeptoren und Bipolarzellen. A, Lokalisation der Bändersynapsen. Ph (Photorezeptoren), BP (Bipolarzellen). B, Schema
einer Bändersynapse
(Vergrößerung aus A).
Die Cav1.4 Calciumkanäle sind in grau
dargestellt.
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WISSENSCHAFT
˚ Abb. 2: Mechanismus der Calcium-abhängigen Inaktivierung. A, Der
Calciumsensor Calmodulin (Orange) ist über das preIQ- und das IQMotiv (Blau) permanent mit dem proximalen C-Terminus assoziiert. B,
Die Bindung von Calcium (graue Kugeln) an Calmodulin führt zu einer
Konformationsänderung im C-Terminus. Das EF-Hand-Motiv (Grün)
kann jetzt mit der Inaktivierungsmaschinerie interagieren und die Inaktivierung des Kanals beschleunigen. C, Die Calcium-abhängige Inaktivierung wird spezifisch durch Ca2+ ausgelöst. Der Einstrom von Calcium (rote Spur) nicht aber der Einstrom von Barium, das nicht an Calmodulin bindet (schwarze Spur), löst Calcium-abhängige Inaktivierung
aus. Daher inaktiviert der Calciumstrom schneller als der Bariumstrom.
D, Zelle bei der Strommessung mit der patch clamp Methode.
Retinale Calciumkanäle
bleiben durch einen molekularen Schalter dauerhaft
geöffnet
Wie schafft es nun der retinale
Cav1.4 Kanal, die CDI „abzuschalten“? Zunächst könnte man
annehmen, dass der Kanal einfach keinen Sensor für Ca2+ enthält. Dies scheint jedoch nicht so
zu sein, denn ein Blick auf die
Primärsequenz von Cav1.4 zeigt,
dass alle essentiellen Motive für
die CDI auch in diesem Protein
prinzipiell vorhanden sind.
Zudem zeigte sich in biochemischen Experimenten, dass wie
beim kardialen Calciumkanal
CaM an den proximalen C-Terminus des Cav1.4 Kanals gebunden ist. Dieses Ergebnis spricht
dafür, dass Cav1.4 möglicherweise eine autoinhibitorische
Domäne besitzt, die in der Lage
ist, die CDI effektiv zu unterdrücken. Da die für die CDI wichti-
˚ Abb. 3: Modell des kompletten und des trunkierten Cav1.4 Kanals.
A, Die ICDI-Domäne bindet an das EF-Hand-Motiv und verhindert
dadurch die Calcium-abhängige Inaktivierung. B, Die Trunkation führt
zu einem Verlust der ICDI-Domäne, der Strom zeigt Calcium-abhängige
Inaktivierung.
gen Bereiche im vorderen Kanalabschnitt hoch konserviert sind,
lag die Vermutung nahe, dass diese Domäne weiter distal lokalisiert ist. Damit war die Strategie
klar. Der Kanal musste Schritt für
Schritt distal des IQ-Motivs verkürzt werden. Mit diesem Ansatz
gelang es, eine regulatorische
Domäne aus 23 Aminosäuren am
Ende des aus etwa 2000 Aminosäuren bestehenden Calciumkanalproteins zu identifizieren. Diese Domäne haben wir Inhibitor
der Calcium-abhängigen Inaktivierung (ICDI) genannt[4] (Abb.
3A). Wird diese Domäne entfernt,
verhalten sich die Calciumkanäle in der Retina wie ihre nahen
Verwandten und zeigen nunmehr
den negativen Rückkopplungsmechanismus der CDI (Abb. 3B).
Weitere biochemische Experimente konnten schließlich belegen, dass die ICDI an das EFHand-Motiv im proximalen C-Terminus bindet. Dadurch wird
wahrscheinlich der proximale CTerminus und die Inaktivierungsmaschinerie entkoppelt.
Die Inaktivierung wird somit
unabhängig von Calcium.
Vorzeitiges Schließen retinaler Calciumkanäle führt
zur Nachtblindheit
Unser Ergebnis hat eine große
pathophysiologische Relevanz.
¯ Abb. 4: Mutationen in Cav1.4
führen zur angeborenen Nachtblindheit CSNB2. Viele Mutationen
führen zu einem vorzeitigen
Abbruch des Cav1.4-Proteins. Die
meisten dieser Mutationen zerstören die Membrantopologie des
Kanalproteins, besonders wenn
die Transmembransegmente
betroffen sind. Es kommt dadurch
zu einem kompletten Verlust des
Proteins. Drei Mutationen sind
weiter distal lokalisiert. Sie verkürzen den C-Terminus von Cav1.4
mit einem Verlust der ICDI.
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Seit kurzem ist beim Menschen
eine „Cav1.4-Channelopathy“
bekannt, eine Erkrankung, die
durch Mutationen im Cav1.4kodierenden Gen verursacht
wird. Die Patienten leiden an
einer Form der Nachtblindheit,
der kongenitalen stationären
Nachtblindheit vom Typ II
(CSNB2). Eine Reihe von Mutationen im Cav1.4 können zu dieser Erkrankung führen (Abb. 4).
Die meisten verursachen durch
Trunkation den totalen Verlust
des Proteins. Drei Mutationen im
C-Terminus sind aber im Kontext
unserer Ergebnisse besonders
interessant. Sie haben gemeinsam, dass der proximale C-Terminus unversehrt bleibt, während die ICDI Domäne fehlt. Sollten diese trunkierten Calciumkanäle tatsächlich in die präsynaptische Membran der Photorezeptoren und Bipolarzellen eingebaut werden, würden diese
Kanäle CDI zeigen. Die Betroffenen könnten in der Dunkelheit
nichts sehen, weil sich die Kanäle selbst Calcium-abhängig inaktivieren und die für den Sehprozess notwendigen permanenten Calciumströme nicht entstehen.
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Literatur
[1] Baumann, L., Gerstner, A., Zong, X., Biel,
M. & Wahl-Schott, C. (2004): Functional characterization of the L-type Ca2+ channel
Cav1.4alpha1 from mouse retina. Invest
Ophthalmol Vis Sci 45: 708–13.
[2] Liang, H. et al. Unified mechanisms of
Ca2+ regulation across the Ca2+ channel
family. Neuron 39: 951–60 (2003).
[3] Peterson, B. Z., DeMaria, C. D., Adelman,
J. P. & Yue, D. T. (1999): Calmodulin is the
Ca2+ sensor for Ca2+ -dependent inactivation of L-type calcium channels. Neuron 22:
549–58.
[4] Wahl-Schott, C. et al. (2006): Switching
off calcium-dependent inactivation in L-type
calcium channels by an autoinhibitory
domain. Proc Natl Acad Sci USA 103: 15657–
62.
Korrespondenzadresse:
Dr. Christian Wahl-Schott
Institut Pharmakologie für Naturwissenschaften
Zentrum für Pharmaforschung der
LMU München
Butenandstraße 7, Haus C
D-81377 München
Tel.: 089-2180-77320
[email protected]
AUTOREN
Foto: (Hintere Reihe
v. l.) Dr. Christian
Eckert, Hartmut
Cuny. (Vordere Reihe
v. l.)
Dr. Christian WahlSchott, Kristina
Grießmeier, Institutsdirektor Prof. Dr.
Martin Biel,
Melanie Gebhard
Unser Ziel ist es nun, den molekularen Mechanismus näher zu charakterisieren, durch die die ICDI-Domäne die Calcium-abhängige Inaktivierung abstellt. Wir wollen die ICDI-Domäne systematisch verkürzen, um die Schlüssel-Aminosäuren für diesen Mechanismus zu identifizieren. Dieses Peptidfragment möchten wir als Modulator einsetzen, um die Calcium-abhängige
Inaktivierung auch in weiteren Calciumkanälen abzuschalten. Unsere Vorversuche haben bereits gezeigt, dass dies prinzipiell möglich ist.
Zweitens möchten wir die Bedeutung der ICDI-Domäne für die normale
Funktion der Retina aufklären. Um diese Fragestellung zu untersuchen, werden wir ein Fragment des C-Terminus von Cav1.4 mit einem lentivitalen
Gentransfer in die Retina der Maus einschleusen und dadurch die Interaktion der ICDI Domäne mit der EF Hand unterbrechen. Anschließend werden
wir den Phänotyp dieser Mäuse analysieren.
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